KR20230004737A - 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 사용한 피막 바이러스를 억제하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 사용한 피막 바이러스를 억제하기 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 바이러스를 포함할 수도 있는 감염 가능한 또는 섭취 가능한 표면에 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 함유하는 조성물을 도포하는 것을 수반하는 피막 바이러스의 전파를 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물에는 HLB가 약 12 초과인 계면활성제가 실질적으로 없다.
Description
본 발명의 방법은 "피막(enveloped)" 바이러스로 알려진 바이러스의 전파(transmission)를 억제하기 위한 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 바이러스의 전파를 억제할 수 있는 상기 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
피막 바이러스로 인한 감염은 단순포진(herpes simplex), HIV/AIDS, B형 간염, 인플루엔자, 수두(chicken pox), 대상포진(shingles), 두창(small pox) 및 호흡기 감염과 같은 일반적인 질환을 야기한다. 이러한 질환의 중증도는 어느 정도의 불편감에서 생명을 위협할 정도까지 다양할 수 있는 동시에, 이러한 감염은 이의 숙주의 삶의 질과 우리 사회의 개인적, 제도적 및 경제적 영역에 악영향을 미친다. 그 결과, 바이러스 감염과 그 확산을 예방하기 위한 수단을 개발하려는 실질적인 노력이 있어왔다. 이러한 노력은 바이러스의 다양성과, 직접 접촉, 체액 교환(예를 들어, 타액, 성접촉으로 인한 전파, 모유 수유) 및 에어로졸 전파(예를 들어, 기침, 재채기 등)를 포함하는 바이러스가 전파되는 다양한 방법뿐만이 아니라, 바이러스가 숙주에 의한 검출 및/또는 제거를 피하는 고도로 진화된 방법으로 인해 복잡해진다. 바이러스에 감염된 사람들에게 투여되는 항바이러스 제제의 발견과 상업화에 많은 성과가 있었다. 그러나, 이러한 치료제는 종종 의료 처방전을 요구하고/하거나, 원치 않는 부작용이 있으며/있거나, 한정된 범위의 바이러스 유형/균주(strain)에만 작용하고/하거나, 효능이 제한적이다. 또한 국소적으로 전달되는 항바이러스 치료제는 치료된 조직에 자극적이지 않아야 하며, 그렇지 않으면 감염 위험을 증가시킬 위험이 있다.
따라서, 바이러스 전파를 유의적으로 감소시킬 수 있는 강력하고 광범위한 항바이러스 활성을 갖는 비용 효과적이며 부드러운 제제는, 특히 이러한 제제의 순한 특성이, 피부, 눈 및 다른 점막과의 우수한 상용성으로 인해 광범위하고 빈번한 사용을 허용하고 권장할 수 있는 경우에, 항바이러스 의료품에서 충족되지 못한 요구를 채우고 바이러스 감염의 확산을 예방하는 데 도움이 될 것이다.
바이러스는 돌연변이율과 복제율이 높으며, 이러한 특성은 외부의 선택적 압박(즉, 약물)에 반응하여 빠른 진화를 가능하게 하고, 종종 치료 내성과 재발을 야기한다. 내성에 대한 우려는 항바이러스 화합물이 비리온(virion) 상의 특정 에피토프를 표적으로 할 때 특히 두드러진다. 높은 수준의 바이러스의 유전학적 다양성으로 인해, 보통 이러한 한정된 특이성은 화합물에 대한 바이러스 민감성의 범위를 또한 제한한다. 대안적으로, 계면활성제와 같은 다른 국소적 항바이러스 처치는 비특이적 바이러스 부위를 표적으로 하고, 다양한 바이러스를 중화시키는데 전반적으로 효과적이나, 이들은 종종 인간 세포에 자극적이고 독성이 있다. 조직을 자극하는 처치는 감염률 증가를 야기할 수 있는데, 세포막을 손상시키면 일부 유형의 바이러스 입자의 투과성을 증가시킨다. 따라서, 바이러스를 근절하고 이의 전파 가능성을 유의적으로 감소시키기 위한 자극적이지 않지만 매우 효과적인 수단이 크게 요구될 것이다.
대부분의 바이러스(예를 들어, HIV 및 많은 동물 바이러스)는 숙주 세포 사이에 존재하는 생활사의 단계에서 외부 층으로서 바이러스 피막을 가지고 있다. 문헌[Robertson et al. (March 1995). "Recombination in AIDS viruses." Journal of Molecular Evolution. 40(3): 249-59]. 또한 일부 피막 바이러스는 피막과 게놈 사이에 캡시드(capsid)로 불리는 단백질 층을 갖는다. Id. 피막은 전형적으로 숙주의 세포막(인지질 및 단백질)의 일부로부터 유래되나, 몇몇 바이러스 당단백질을 포함한다. 피막은 바이러스가 숙주의 면역 체계를 피하는 것을 돕는다. 피막의 표면 상의 당단백질은 숙주의 막 상의 수용체 부위를 식별하고 이에 결합하는 역할을 한다. 이어서, 바이러스 피막은 숙주의 막과 융합하여 캡시드 및 바이러스 게놈이 숙주에 진입하여 숙주를 감염시키도록 한다.
바이러스 자체가 분리되어(budding) 나온 세포는 종종 사멸하거나 약화되어, 장기간 동안 더 많은 바이러스 입자를 방출할 것이다. 이러한 바이러스의 이중 지질층(lipid bilayer) 피막은 건조, 열 및 세제에 비교적 민감하며, 그리하여 이러한 바이러스는 비-피막 바이러스보다 멸균이 더 용이하고, 숙주 환경 외부에서 생존이 제한되며, 일반적으로 숙주로부터 숙주로 직접 이동한다. 피막 바이러스는 적응력이 커서 면역 체계를 피하기 위해 단기간에 변화할 수 있다. 피막 바이러스는 지속 감염(persistent infection)을 야기할 수 있다.
인간 병원체를 함유하는 피막 바이러스의 부류에는, 예를 들어, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스(Poxvirus), 헤파드나바이러스(Hepadnavirus), 아스파바이러스과(Asfarviridae)와 같은 DNA 바이러스; 플라비바이러스(Flavivirus), 알파바이러스(Alphavirus), 토가바이러스(Togavirus), 코로나바이러스, D형 간염 바이러스, 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 라브도바이러스(Rhabdovirus), 분야바이러스(Bunyavirus), 필로바이러스(Filovirus)와 같은 RNA 바이러스; 및 HIV와 같은 레트로바이러스(Retrovirus)가 포함된다.
COVID-19
코로나바이러스(CoV)는 외피막(membrane envelope) 내에 캡슐화된 단일 가닥의 포지티브 센스 RNA 게놈을 함유하는 비교적 거대한 바이러스이다. 바이러스 막에는 코로나바이러스에 왕관과 같은 외양을 부여하는 당단백질 돌기(glycoprotein spike)가 박혀있다 (문헌[Liu et al., Research and Development on Therapeutic Agents and Vaccines for COVID-19 and Related Human Coronavirus Diseases, ACS Cent. Sci., 2020, 6 (5), 315-331]에서 발췌한, 도 1 참조). 코로나바이러스는 인간과 동물 둘 모두를 감염시키지만, 가장 다양한 코로나바이러스의 숙주인 박쥐와 같은 특정 유형의 동물은 코로나바이러스로 인한 질병에 면역이 있는 것으로 보인다. 알파, 베타, 감마 및 델타로 지정된 4가지 뷰류의 코로나바이러스가 존재한다. 베타코로나바이러스 부류에는 중증급성호흡기증후군(SARS) 바이러스(SARS-CoV), 중동호흡기증후군(MERS) 바이러스(MERS-CoV) 및 COVID-19 병원체(causative agent) SARS-CoV-2가 포함된다. SARS-CoV 및 MERS-CoV와 유사하게, SARS-CoV-2는 하부 호흡기계(lower respiratory system)를 공격하여 바이러스성 폐렴을 유발하지만, 이는 소화기계, 심장, 신장, 간 및 중추신경계에도 영향을 주어 다발성 장기부전을 유발할 수 있다. 현재의 정보에 의하면 SARSCoV-2는 SARS-CoV보다 더 큰 전파력/전염성이 있는 것으로 나타났다.
많은 연구가 바이러스 구조, 바이러스 전파 기전/역학의 설명 및 항바이러스 제제의 식별 및 바이러스 검출을 위한 정확한 진단에 집중하고 있다. 이러한 경향은 이러한 전염병의 진행을 저지하고 향후 감염과 전파를 예방하기 위해 새로운 방법을 찾기 위한, 학계와 산업계뿐만 아니라 의료진 모두를 포함한 과학계의 막대한 관심과 열망을 반영한다.
COVID-19는 SARS-CoV 및 MERS-CoV와 동일한 속(genus)인 새로운 유형의 코로나바이러스인 SARS-CoV-2에 기인한다. 숙주 세포 내로의 SARS-CoV-2의 진입과 복제를 담당하는 바이러스 단백질은 SARS-CoV와 관련된 바이러스 단백질과 구조적으로 유사하다. 따라서, SARS 및 MERS에 대한 연구와 개발이 COVID-19에 대한 치료적이고 예방적인 제제의 개발에 유익할 통찰력을 제공할 수 있다.
S 단백질/ACE2를 표적으로 하는 Arbidol(CAS 등록번호 131707-23-8)은 바이러스 피막 단백질이 숙주 세포에 결합하는 것을 방해하고 표적 세포로 바이러스가 진입하는 것을 막을 수 있는 억제제로 COVID-19의 치료를 위한 임상 시험에 들어갔다. 상기 Liu 등과 문헌[Blaising et al., Arbidol as a broad-spectrum antiviral: An update, Antiviral Research, 107 (2014) 84-94]에서 발췌한 하기 도 2를 참조한다. 또한, 문헌[Kadam et al., Structural basis of influenza virus fusion inhibition by the antiviral drug Arbidol, PNAS January 10, 2017 114 (2) 206-214]을 참조한다.
중증급성호흡기질환 코로나바이러스(SARS-CoV)의 2003년 출현은 CoV가 인간에서 중증 감염의 발병을 야기할 수 있다는 것을 입증하였다. 두 번째 중증 CoV인 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 2012년에 사우디아라비아에서 나타났다. 더 최근에 2019년 12월 중국 우한에서 발견된 COVID-19는 특히 유해한 것으로 입증되었다.
본 발명의 중합체가 피막 바이러스에 대하여 활성을 나타내는 것을 고려하면, 본 발명의 중합체는 또한 숙주 세포에서 바이러스의 진입을 억제함으로써 COVID-19 대한 활성을 나타낼 수 있을 것으로 예상된다. 도 3을 참조한다.
RetroVirox(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)는 SARS-CoV-2를 포함하는 코로나바이러스에 대한 실험적 치료를 평가하기 위해 사용될 수 있는 세포-기반 검정을 개발하였다. 이 회사는 COVID-19의 신종 코로나바이러스 병원체에 대한 진입 억제제를 평가하기 위해 SARS-CoV-2 가짜 바이러스(pseudovirus)를 이용한 시험을 제공한다. 가짜 바이러스 검정은 SARS-CoV-2(우한 분리주)의 바이러스 돌기 (S) 단백질로 코팅된 HIV 가짜 바이러스를 이용한다. 신종 코로나바이러스의 진입 방식을 개괄하는 검정은, 예를 들어, S 바이러스 단백질, ACE-2 바이러스 수용체 또는 숙주 프로테아제 및 SARS-CoV-2 바이러스 진입에 관여된 다른 표적물을 표적으로 하는 소분자 진입 억제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
Johnson & Johnson Consumer Inc.의 미국 특허 제7,803,403호 및 제8,025,902호는 저분자량의 비-가교결합된 선형 아크릴 공중합체 및 적어도 하나의 계면활성제를 함유하는 개인 케어 조성물, 및 상기 개인 케어 조성물을 사용하여 세정하는 방법을 개시한다.
Johnson & Johnson Consumer Inc.의 미국 특허 제8,343,902호 및 제8,329,626호는 저분자량의 비-가교결합된 선형 아크릴 공중합체 및 비-에톡실화된 음이온성 계면활성제를 포함하는 피부 세정 조성물을 개시한다.
Johnson & Johnson Consumer Inc.의 미국 특허 제8,329,627호는 저분자량의 비-가교결합된 선형 아크릴 공중합체 및 둘 이상의 양쪽성 계면활성제의 블렌드를 포함하는 클리어(clear) 피부 세정 조성물을 개시한다.
Lubrizol Corp.의 미국 특허 제8,293,845호는 선형의 소수성으로 개질된 (메트)아크릴 중합체를 상기 조성물 내에 포함하는 계면활성제 조성물의 임계 미셸 농도(critical micelle concentration)를 증가시키는 방법을 개시한다.
Lubrizol Advanced Materials, Inc.의 미국 특허 제7,892,525호는 소수성으로 개질된 양이온성 중합체 겔화제 및 산성 발한억제제 화합물을 포함하는 발한억제제 조성물을 개시한다.
Lubrizol Advanced Materials, Inc.의 미국 특허 제9,068,148호는 하나 이상의 가교결합된 아크릴 공중합체 및 하나 이상의 비-가교결합된 선형 아크릴 중합체를 포함하는 아크릴 중합체 블렌드; 상기 아크릴 중합체 블렌드를 제조하는 방법; 및 상기 아크릴 중합체 블렌드를 포함하는 수성 조성물을 증점화(thickening)하는 방법을 개시한다.
Lubrizol Advanced Materials, Inc.의 미국 특허 제9,931,290호는 계면활성제 및 가교결합된 아크릴 공중합체를 포함하는 계면활성제 조성물; 및 상기 계면활성제 조성물을 포함하는 개인 케어 세정 조성물을 개시한다.
Ecolab USA Inc.의 미국 특허 제10,517,806호는 양이온성 활성 성분; 양이온성 호환성 계면활성제; 거품 증진제(foam boosting agent); 거품 구조 강화제(foam structure enhancing agent); 피부 컨디셔닝제; 및 물을 포함하는 항균성 포밍 피부 클렌저(foaming antimicrobial dermal cleanser)에 대한 권리를 주장한다. 이 참고 문헌은 피부 조직을 항균성 포밍 피부 클렌저와 접촉시키는 단계를 포함하는, 포유동물의 피부 조직 상의 박테리아, 미생물, 진균 또는 바이러스 개체군을 감소시키는 방법에 대한 권리를 주장한다. 이 참고 문헌은 또한 양이온성 활성 성분이 본 발명에 유용한 항균성 제제이고 거품 구조 강화제가 폴리에틸렌글리콜일 수 있다는 것을 개시한다. 이 참고 문헌은 그 안의 제형의 미생물 효능을 시험하기 위해 시험 미생물 배양물로 S. 아우레우스(S. aureus) 및 대장균(Escherichia coli)을 사용하는 것을 개시한다.
Ecolab USA, Inc.의 미국 특허 제10,435,308호는 결합 증점제(associative thickener); 소르비탄 에스테르를 포함하는 계면활성제; 및 베타인, 아민 옥사이드 및/또는 에톡실화 지방 아민인 점탄성(viscoelastic) 계면활성제를 포함하는, 거품 분획(fractionation)에 의해 오일/수성 상 용액으로부터 오일의 제거를 개선하기 위한 조성물 에 대한 권리를 주장한다. 이 참고 문헌은 조성물이 예를 들어, 세정제, 화장품, 피클, 수성 안료 페이스트, 자동차 마감재, 공업용 코팅, 인쇄 잉크, 윤활 그리스(lubricating grease), 석고 페인트(plaster paint) 및 월 페인트(wall paint), 직물 코팅, 약제학적 제제, 작물 보호 제형, 충전제 분산제, 접착제, 세제, 왁스 분산제, 광택제, 3차 광유 생산을 위한 보조제 등에 사용될 수 있다는 것을 개시한다.
Ecolab USA, Inc.의 미국 공개 특허 제20160262999호는 양이온성 활성 성분; 거품 증진 계면활성제; 거품 증진 공중합체; 거품 안정화 구조체(foam stabilizing structure); 및 물을 포함하는 항균성 피부 농축물(dermal concentrate)에 대하여 권리를 주장한다. 이 참고 문헌은 농축물이 포유동물의 피부 조직 상의 박테리아, 미생물, 진균 또는 바이러스 개체군을 감소시키기 위해 사용될 수 있다고 주장한다. 이 참고 문헌은 양이온성 활성이 항균 활성을 제공하는 성분이라는 것을 개시한다. 이 참고 문헌은 농축물이 폴리에틸렌 글리콜과 같은 피부 컨디셔너를 함유할 수 있다는 것을 개시한다.
문헌[Menachery et al., Pathogenic Influenza Viruses and Coronaviruses Utilize Similar and Contrasting Approaches To Control Interferon-Stimulated Gene Responses, American Society of Microbiology, 2014, 5(3): 1-11]은 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스가 복제, 면역 자극 및 전체 치사율 측면에서 차이를 보인다고 개시한다.
문헌[Li, Structure, Function and Evolution of Coronavirus Spike Proteins, Annu. Rev. Virul. 2016, 3(1):237-261]은 다른 바이러스와 숙주 세포로부터 상응하는 기능의 맥락에서, 코로나바이러스 돌기 단백질의 두 가지 중요한 기능인 수용체 인식 및 막 융합의 진화를 개시한다.
Neutrogena Corp.(미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재)는 점도 증가제로서 칼륨 아크릴레이트 공중합체의 사용을 포함하는 Neutrogena® Ultra Gentle Daily Cleanser 제품을 시판 및 판매한다.
Johnson & Johnson Consumer Inc.는 Johnson's Head to Toe Baby Wash; Johnson's Baby Moisture Wash; 및 Johnson's Baby Wipes를 포함하는 제품을 시판 및 판매하며, 이들 제품은 점도 증가제로서 칼륨 아크릴레이트 공중합체의 사용을 포함한다.
손소독제는 일반적으로 손에 있는 감염원(infectious agent)을 감소시키기 위해 사용된다. 이는 액체, 겔 및 거품 형태로서 이용가능하다. 알코올계 버전 및 무알코올계 버전이 이용가능하다. 알코올계 버전은 전형적으로 아이소프로필 알코올, 에탄올(에틸 알코올) 또는 n -프로판올의 일부 조합을 함유하고, 60% 내지 95% 알코올을 함유하는 버전이 가장 효과적이다. 이는 가연성이기 때문에 주의가 필요하다. 알코올계 손소독제는 매우 다양한 미생물에 대해 작용한다. 전형적으로 벤즈알코늄 클로라이드 또는 트라이클로산을 함유하는 무알코올계 버전은 알코올계 버전보다 덜 효과적이다.
2020년에 BlueWillow Biologics, Inc.는 OTC 공정서(monograph) 벤즈알코늄 클로라이드를 함유하는 NanoBio Project 비강 살균액을 출시하였다. 이 제품은 비공 각각의 내측 피부를 철저히 스왑(swabbing)함으로써 도포된다.
본 발명은 세포 내로의 피막 바이러스의 진입을 억제하기 위한 유효량의 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 적어도 하나 포함하는 항바이러스 조성물과 상기 바이러스를 접촉시키는 단계를 포함하고, 이러한 단계로 본질적으로 이루어지고, 이러한 단계로 이루어진, 세포 내로의 피막 바이러스의 진입을 억제하는 방법에 관한 것으로, 상기 조성물에는 친수성-친유성 밸런스(hydrophilic-lipophilic balance)(이하, "HLB")가 12 초과인 계면활성제가 실질적으로 없다.
놀랍게도, 본 발명자들은 순한 특성으로 알려진 특정 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체의 낮은 농도가 숙주 내로의 피막 파이러스의 진입을 성공적으로 억제하여 숙주로의 바이러스의 전파를 억제할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 이러한 중합체가 약제 내성, 한정된 범주의 중화 및 숙주 세포 독성과 같은 항바이러스 치료의 일부 과거 문제점을 직면하거나 이를 일으키지 않을 것이라고 생각한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체는 몇몇 바이러스 유형에 대하여 그리고 다수의 바이러스 균주에 대해 광범위하게 활성을 나타낸다. 추가적으로 이들 중합체는 진입 억제의 비특이적 기전을 통해 작용하여, 억제 성공의 가능성을 증가시키고 내성의 가능성을 감소시킨다. 게다가, 이들 중합체는 점막 조직에 월등히 순하게 작용하기 때문에, 인체 조직에 거의 또는 전혀 독성이 없다.
신체는 매일 바이러스의 공격을 받고 있으며, 피부 장벽을 포함한 면역계는 감염 가능한 표면에 도달하는 바이러스의 수를 최소화하도록 설계되었다. 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체는 바이러스가 세포에 결합하고/하거나 진입하는 능력을 차단함으로써 감염성 바이러스가 표적 세포에 도달하여 전신 감염(systemic infection)을 유발할 수 있는 가능성을 감소시킨다. 바이러스 감염은 부분적으로 확률적 과정(stochastic process)의 결과이므로- 즉, 감염 가능한 세포와 접촉하는 바이러스가 많을수록, 조직은 더욱 감염되기 쉬움 -, 감염 가능한 바이러스를 차단하는 이들 중합체의 사용은 면역계에 유익하고, 추가로 감염의 가능성을 감소시키며, 전반적으로 건강을 양호하게 증진시킨다. 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 사용한 본 발명의 방법 및 조성물은 놀랍게도 인체 조직에 순하고 자극을 주지 않으면서, 광범위한 바이러스 유형 및 균주에 걸쳐 감염성 비리온의 수를 감소시키는 데 효과적이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "감염 가능한 표면"은 인간과 같은 포유동물을 포함하여 바이러스에 의해 세포가 감염될 수 있는 살아있는 동물의 표면을 의미한다. 이러한 감염 가능한 표면의 예는 외부 피부 조직 및 점막 조직이다. 점막 조직은 구강, 안구, 비강, 질 및 직장 조직을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "섭취 가능한 표면(ingestible surface)"은 과일 및 채소의 표면을 포함한 식품의 표면을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "경질 표면"은 피부 및/또는 점막 조직이 접촉할 수 있고 바이러스가 잔류할 수 있는 탁자, 의자, 벽 및 다른 무생물 표면과 같은 주변 환경에서 발견되는 표면을 지칭한다. 용어 "내부 표면"은 살아있는 유기체의 신체 내의 유체 및 내부 기관 표면 및 내부 조직을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스"는 살아있는 세포 또는 유기체 내부에서만 복제할 수 있는 작은 감염원을 의미한다. 바이러스 입자는 RNA 또는 DNA로 만들어진 유전 물질 및 유전 물질을 보호하는 단백질 외피(protein coat) 부분을 포함한다. 일부 경우에는, 바이러스 입자가 세포 외부에 있을 경우, 바이러스 입자는 단백질 외피 주위에 지질 피막으로 둘러싸여 있다. 이러한 지질 피막을 포함하는 바이러스 입자는 본 명세서에서 "피막 바이러스"로 지칭된다. 피막 바이러스는 하기 유기체를 포함할 수 있다: 전염성 연속종(molloscum contagiosum), 수두, 두창 및 기타 폭스 바이러스를 포함하지만 이로 제한되지 않는 폭스바이러스과(poxviridae); 코로나바이러스과(Coronaviridae); 플라비바이러스과(Flaviviridae); 단순포진 바이러스 1형 및 단순포진 바이러스 2형을 포함하는 헤르페스바이러스과(Herpesviridae); 인간 면역결핍 바이러스를 포함하는 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스과(Retroviridae).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "계면활성제"는 물 또는 수용액에 용해되어 있을 때, 물과 다른 액체 사이의 표면 장력 또는 계면 장력을 감소시키는 물질 또는 표면 활성제이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "전파 억제"는 하기 중 하나 이상을 의미한다: (i) 숙주 세포 내로 바이러스의 진입을 방해함; (ii) 하나의 개체, 감염 가능한 표면 또는 접촉 표면으로부터 다른 개체, 감염 가능한 표면 또는 접촉 표면으로의 바이러스의 도입을 실질적으로 중단시킴; 및/또는 (iii) 점막이 그 완전성을 유지하고 바이러스에 의한 감염으로부터 보호하도록 점막 손상을 감소시킴.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 친수성-친유성 밸런스("HLB")는 당업자에게 공지된 방법에 따라 계면활성제 분자의 상이한 영역에 대한 값을 계산하여 결정되는 바와 같이, 계면활성제의 친수성 또는 친유성 정도의 척도이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 세포 내로의 바이러스의 진입을 억제하기 위한 유효량의 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체 적어도 하나를 포함하고, 이로 본질적으로 이루어지고, 이로 이루어진 항바이러스 조성물과 피막 바이러스를 접촉시키는 단계를 포함하고, 이러한 단계로 본질적으로 이루어지고, 이러한 단계로 이루어진, 세포 내로의 상기 바이러스의 진입을 억제하는 방법에 관한 것이며, 상기 조성물에는 HLB가 12 초과인 계면활성제가 실질적으로 없다. 본 발명의 방법은 감염 가능한 표면 상으로 뿐만 아니라 섭취 가능한 표면 상으로 본 명세서에 기재된 조성물을 도포하는 것을 추가로 포함한다. 본 방법은 본 발명의 항바이러스 조성물과 바이러스를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 식품과 같은 섭취 가능한 표면뿐만 아니라 피부 및 점막 조직이 접촉할 수 있는 경질 표면에 본 발명의 조성물을 도포하는 것을 포함한다. 이와 같이, 본 발명의 조성물의 존재는 섭취 가능한 표면 및 경질 표면 상에 존재하는 바이러스가 피부 및 점막, 내부 조직 및 체액에 함유된 세포로 진입하는 것을 억제하도록 작용한다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 적어도 약 50% 그리고 바람직하게는 적어도 약 55%의 물을 함유한다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 물, 글리세린, 우레아, 알칸올, 아세트산, 포름산 등의 용매로부터 선택될 수 있는 적어도 50%의 양성자성 용매를 함유할 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 유용한 양성자성 용매에는 포름산, 아세트산, n-부탄올, 아이소프로판올, n-프로판올, 에탄올, 메탄올 등이 포함된다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물에는 HLB가 약 12 초과인 계면활성제가 실질적으로 없다. 전술한 것에도 불구하고, 본 발명의 조성물은 HLB가 12 미만인 계면활성제를 추가적으로 함유할 수 있다. HLB가 12 초과인 계면활성제는 감염 가능한 표면의 세포막을 파괴하여, 바이러스가 세포로 진입하여 세포를 감염시키는 능력을 용이하게 할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 방법에 유용한 조성물은 후술되는 바와 같이, 6 이상의 상피 투과성(이하, TEP)을 갖는다.
본 발명의 조성물은 포유류, 파충류, 조류, 어류, 박테리아 등을 포함하는 살아있는 개체의 감염 가능한 표면에 도포될 수 있다. 이들 살아있는 개체의 감염 가능한 표면은 피부, 점막 및 내부 조직을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 점막 조직은 구강 조직, 안구 조직, 비강 조직, 질 조직 및 직장 조직과 이들의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 중요한 것은, 본 발명의 조성물 및 방법은 이들 생물학적 표면을 파괴하거나 이들 표면에 유의한 자극을 야기하지 않는다.
중합체 물질
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 중합체 물질의 예에는 저분자량의 아크릴, 다른 에틸렌계-불포화 중합체, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 폴리무수물, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리우레아, 폴리이미드, 폴리설폰, 폴리설파이드 및 이들의 둘 이상의 조합 등이 포함된다. 적합한 저분자량의 아크릴 중합체의 예에는 소수성으로 개질된 아크릴, 다당류, 셀룰로스, 전분 중합체, 이들의 둘 이상의 조합 등이 포함된다. 적합한 저분자량의 아크릴 중합체에는 소수성으로 개질된 아크릴 중합체뿐만 아니라 다른 아크릴 중합체가 포함되며, 이들 중 하나는 용액, 현탁, 침전, 분산, 에멀젼, 역에멀젼(inverse emulsion), 마이크로에멀젼, 미셀 중합 방법, 및 이들의 둘 이상의 조합을 통해 형성될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 아크릴 중합체는 (메트)아크릴레이트, (메트)아크릴아미드, 비닐 에테르, 에스테르, 및 아미드, 알릴 에테르, 에스테르, 아민, 및 아미드, 이타코네이트, 크로토네이트, 스티렌계 물질 및 올레핀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 단량체로부터 유도될 수 있다. 아크릴 중합체는 비이온성 친수성, 비이온성 소수성, 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성, 비회합적 거대단량체성, 회합적 거대단량체성, 또는 다작용성/가교결합성일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "저분자량" 중합체는 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 표준물질을 사용하여 보정된 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정될 때 수평균 분자량(Mn)이 약 100,000 이하인 중합체를 지칭한다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 저분자량 중합체는 분자량 범위가 약 5,000 내지 약 80,000 Mn, 더 바람직하게는 약 10,000 내지 약 50,000 Mn, 그리고 더 바람직하게는 약 15,000 내지 40,000 Mn인 것들이다.
소정의 소수성으로 개질된 중합체 및 이러한 중합체의 제조 방법은, Marchant 등에게 허여되고 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 제6,433,061호에 기재되어 있다. 본 발명의 조성물에 유용한 중합체 물질은, 피부 및 점막에 매우 순하고, 바람직하게는 비-가교결합된 선형 아크릴 공중합체이다. 이들 비-가교결합된 선형 중합체는 바람직하게는, 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 표준물질을 사용하여 보정된 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 측정될 때 수평균 분자량이 100,000 이하인 저분자량 중합체이다(본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 모든 수평균 분자량(Mn)은 이러한 방식으로 측정된 분자량을 지칭함). 따라서, 중합체 물질은 공중합체 화합물로서 작용한다. 공중합체 화합물은 적어도 2개의 단량체 성분으로부터 중합된다. 제1 단량체 성분은 적어도 하나의 카르복실산 기를 함유하는 하나 이상의 α,β-에틸렌계 불포화 단량체로부터 선택된다. 이러한 산 기는 일산(monoacid) 또는 이산(diacid), 다이카르복실산의 무수물, 이산의 모노에스테르 및 이들의 염으로부터 유도될 수 있다. 제2 단량체 성분은 (제1 단량체 성분에 대하여) 소수성으로 개질되고, (메트)아크릴산의 선형 및 분지형 C1 내지 C9 알킬 에스테르, 선형 및 분지형 C1 내지 C10 카르복실산의 비닐 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함하는, C1 내지 C9 알킬기를 함유하는 하나 이상의 α,β-에틸렌계 불포화 비-산성 단량체로부터 선택된다. 본 발명의 일 태양에서, 제2 단량체 성분은 하기 화학식으로 나타낸다:
CH2=CRX
(상기 식에서, R은 수소 또는 메틸이고; X는 -C(O)OR1 또는 -OC(O)R2이고; R1은 선형 또는 분지형 C1 내지 C9 알킬이고; R2는 수소 또는 선형 또는 분지형 C1 내지 C9 알킬임). 본 발명의 다른 태양에서, R1 및 R2는 선형 또는 분지형 C1 내지 C8 알킬이고, 다른 태양에서 R1 및 R2는 선형 또는 분지형 C2 내지 C5 알킬이다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 소수성으로 개질된 중합체는 (메트)아크릴산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 단량체 성분 및 하나 이상의 C1 내지 C9 알킬 (메트)아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 단량체 성분으로부터 유도된 저분자량의 비-가교결합된 선형 아크릴 공중합체를 포함하고, 이로 본질적으로 이루어지고, 이로 이루어지며, 저분자량 공중합체는 수평균 분자량이 약 100,000 이하이다.
예시적인 제1 단량체 성분은 (메트)아크릴산, 이타콘산, 시트라콘산, 말레산, 푸마르산, 크로톤산, 아코니트산, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 예시적인 제2 단량체 성분은 에틸 (메트)아크릴레이트, 부틸 (메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실 (메트)아크릴레이트, 비닐 포르메이트, 비닐 아세테이트, 1-메틸비닐 아세테이트, 비닐 프로피오네이트, 비닐 부티레이트, 비닐 2-에틸헥사노에이트, 비닐 피발레이트, 비닐 네오데카노에이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "(메트)아크릴"산 및 "(메트)아크릴레이트"는 상응하는 아크릴산의 메틸 유도체 및 상응하는 알킬 아크릴레이트를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "(메트)아크릴"산은 아크릴산 및/또는 메타크릴산을 지칭하고 "(메트)아크릴레이트"는 알킬 아크릴레이트 및/또는 알킬 메타크릴레이트를 지칭한다.
더 바람직하게는, 상기 제1 단량체 성분은 (메트)아크릴산으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 제2 단량체 성분은 적어도 하나의 C1 내지 C9 알킬 (메트)아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 비-가교결합된 선형 아크릴 공중합체 화합물은 당업계에 공지된 자유 라디칼 중합 기법을 통해 합성될 수 있다. 본 발명의 일 태양에서, 사용되는 제1 단량체 성분 대 제2 단량체 성분의 양은 중합 매질 중 모든 단량체의 총 중량을 기준으로, 약 20:80 중량% 내지 약 50:50 중량%의 범위이다. 다른 태양에서, 중합 매질 중 모든 단량체의 총 중량을 기준으로, 제1 단량체 성분 대 제2 단량체 성분의 중량비는 약 35:65 중량%이며, 추가의 태양에서 제1 단량체 성분 대 제2 단량체 성분의 중량비는 약 25:75 중량%이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 중합체를 합성하는 방법은 미국 특허 제6,433,061호에서 찾아볼 수 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 선형 공중합체 물질은 바람직하게는 탈이온수 중 5 중량% 중합체 고형물 농도에서 점도가 500 mPa·s 이하(Brookfield RVT, 20 rpm, 스핀들 번호 1)이고, 18 중량% NaOH 용액을 사용하여 pH 7로 중화된다. 점도는 다른 태양에서 약 1 내지 약 500 mPa·s, 추가의 태양에서는 약 10 내지 약 250 mPa·s, 그리고 또 다른 추가의 태양에서는 약 15 내지 약 150 mPa·s의 범위일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물 및 방법에 존재하는 저분자량의 비-가교결합된 선형 아크릴 공중합체는 칼륨 아크릴레이트 공중합체이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체는 바람직하게는, 세포 내로의 피막 바이러스의 진입을 실질적으로 억제하고/하거나 세포로의 바이러스 전파를 억제하는 데 유효한 양으로 상기 조성물에 존재한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 상기 세포 내로의 바이러스 진입을 억제하므로 결과적으로 바이러스 감염 가능성이 감소된다. 바람직하게는, 이들은 조성물의 중량을 기준으로, 약 0.00005% 내지 약 10%의 양으로 본 발명의 조성물에 존재해야 한다. 더욱 더 바람직하게는, 이들은 조성물의 중량을 기준으로 약 0.00005% 내지 약 3%의 양으로 존재해야 한다. 더 바람직하게는, 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체는 조성물의 중량을 기준으로 약 0.00005% 내지 약 0.5%의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는, 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체는 조성물의 중량을 기준으로 약 0.00005% 내지 약 0.01%의 양으로 존재한다.
본 발명의 조성물은 바이러스 또는 박테리아를 함유할 수 있는 피부 표면 상에 또는 무생물 표면 상에 도포될 수 있는 로션 또는 액체 형태일 수 있다. 이는 또한 비강 또는 질 내강의 표면과 같은 점막 표면에 도포되어 질 살균제로서 사용될 수 있는 조성물일 수 있다. 이러한 유형의 조성물은 더 점성일 수 있고 겔 제형 기반일 수 있다. 본 발명의 조성물은 이러한 생물학적 환경에서 바이러스를 억제하기 위해 점막 표면과 접촉하여 배치하기 위한 질용 또는 비강용 탐폰과 같은 흡수성 용품 상에 코팅될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 내부 표면 상에 바이러스가 잔류할 수 있는, 적절한 부위에서 신체 내로 주입될 수 있는 전달 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 액체, 로션, 크림, 겔, 스틱, 스프레이, 면도용 크림, 연고, 세정용 액체 워시 및 고체 바, 샴푸, 페이스트, 분말, 무스, 물티슈(wipe), 패치, 상처 드레싱 및 접착 밴드, 하이드로겔 및 필름을 포함하지만 이로 제한되지 않는 매우 다양한 제품 유형으로 만들어질 수 있다. 이들 제품 유형은 용액, 에멀젼(예를 들어, 마이크로에멀젼 및 나노에멀젼), 겔, 고형물 및 리포좀을 포함하지만 이로 제한되지 않는 몇몇 유형의 화장용으로 허용 가능한 국소 담체를 포함할 수 있다. 하기는 이러한 담체의 비제한적인 예이다. 다른 담체는 이러한 제품 유형을 제형화하는 당업자에 의해 제형화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 조성물은 중합체 함유 겔; 예를 들어, 점안액을 포함하는 중합체 함유 드롭(drop); 중합체 함유 콘택트 렌즈 용액; 예를 들어, 얼굴/바디 스프레이, 비강 스프레이, 및 구강 및 목 스프레이와 같은 중합체 함유 스프레이; 및 중합체 함유 흡입제를 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 개인 보호 장비 상에 또는 개인 보호 장비에 코팅으로서 사용될 수 있다. 개인 보호 장비(통상적으로 "PPE"로 지칭됨)는 다양한 위험에 대한 노출을 최소화하기 위해 착용하는 임의의 장비이다. PPE의 예에는 전신 수트(full body suit), 장갑, 가운, 마스크, 호흡기보호구(respirator) 및 눈과 발 보호구가 포함된다.
본 발명의 방법에 유용한 국소 조성물은 용액으로서 제형화될 수 있다. 용액은 바람직하게는 수성 용매(예를 들어, 약 50% 내지 약 99.99% 또는 약 90% 내지 약 99%의 화장용으로 허용 가능한 수성 용매)를 함유한다.
본 발명의 방법에 유용한 국소 조성물은 연화제를 함유하는 용액으로서 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 바람직하게는 약 2% 내지 약 50%의 연화제(들)를 함유한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "연화제"는 건조함의 예방 또는 완화뿐만 아니라 피부 보호를 위해 사용되는 물질을 지칭한다. 매우 다양한 적합한 연화제가 알려져 있으며, 본 명세서에서 사용될 수 있다. 문헌[Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 32-43 (1972)] 및 문헌[International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, eds. Wenninger and McEwen, pp. 1656-61, 1626, and 1654-55 (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Assoc., Washington, D.C., 7th Edition, 1997) (이하 "ICI Handbook")]은 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 물질의 많은 예를 포함한다.
이러한 용액으로부터 로션이 제조될 수 있다. 로션은 바람직하게는 약 1% 내지 약 20%(더 바람직하게는, 약 5% 내지 약 10%)의 연화제(들) 및 약 50% 내지 약 90%(더 바람직하게는, 약 60% 내지 약 80%)의 물을 함유한다.
용액으로부터 제형화될 수 있는 다른 유형의 제품은 크림이다. 크림은 바람직하게는 약 5% 내지 약 50%(더 바람직하게는, 약 10% 내지 약 20%)의 연화제(들) 및 약 45% 내지 약 85%(더 바람직하게는, 약 50% 내지 약 75%)의 물을 함유한다.
용액으로부터 제형화될 수 있는 또 다른 유형의 제품은 연고이다. 연고는 동물유 또는 식물유 또는 반고체 탄화수소의 단순 베이스(simple base)를 포함할 수 있다. 연고는 바람직하게는 약 2% 내지 약 10%의 연화제(들) 및 약 0.1% 내지 약 2%의 증점제(들)를 함유할 수 있다. 본 명세서에 유용한 증점제 또는 점도 증가제의 더 완전한 개시내용은 문헌[Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 72-73 (1972)] 및 문헌[ICI Handbook pp. 1693-1697]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 국소 조성물은 또한 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 담체가 에멀젼일 경우, 바람직하게는 담체의 약 1% 내지 약 10%(예를 들어, 약 2% 내지 약 5%)가 유화제(들)를 함유한다. 유화제는 비이온성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다. 적합한 유화제가, 예를 들어, 미국 특허 제3,755,560호, 미국 특허 제4,421,769호, 문헌[McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition, pp. 317-324 (1986)] 및 문헌[ICI Handbook, pp.1673-1686]에 개시되며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
로션 및 크림은 또한 에멀젼으로서 제형화될 수 있다. 바람직하게는 이러한 로션은 0.5% 내지 약 5%의 유화제(들)를 함유한다. 이러한 크림은 바람직하게는 약 1% 내지 약 20%(더 바람직하게는, 약 5% 내지 약 10%)의 연화제(들); 약 20% 내지 약 80%(더 바람직하게는, 30% 내지 약 70%)의 물; 및 약 1% 내지 약 10%(더 바람직하게는, 약 2% 내지 약 5%)의 유화제(들)를 함유할 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 다른 조성물은 바이러스 전파를 억제하기 위해 점막 표면에 도포될 수 있는 겔 및 액체 조성물을 포함한다. 점막 표면은 질, 직장, 비도(nasal passage), 구강 및 목을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 이러한 조성물은, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 이들의 조합을 포함하는, 하나 이상의 다가 알코올을 포함해야 한다. 당업자에게 공지된 다른 다가 알코올이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있으며, 분자량이 약 300 내지 약 1450 범위인 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 바람직하게는, 약 0.1 내지 약 50 중량%의 글리세린 및 약 2 내지 약 40 중량%의 프로필렌 글리콜이 있어야 한다.
본 발명의 점막 조성물은 또한 하나 이상의 수용성 셀룰로스-유래 중합체를 함유해야 한다. 바람직하게는, 이러한 중합체는 하나 이상의 하이드록시알킬셀룰로스 중합체와 같은 셀룰로스 검이어야 한다. 더 바람직하게는, 하이드록시알킬셀룰로스 중합체는 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 등 중 하나 이상이어야 한다. 바람직하게는, 셀룰로스-유래 중합체는 조성물의 중량을 기준으로 약 0.1 내지 약 2%의 양으로 본 발명의 조성물에 존재해야 한다.
질 사용을 위한 본 발명의 조성물은 또한 노녹시놀-9 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 살정제를 함유할 수 있다. 이러한 살정제는 계면활성제로서 분류될 수 있지만, 이는 일반적으로 HLB가 16 미만이고, 세정 조성물로서 또는 세정 조성물에는 유용하지 않으며, 거품을 만들지 않는다.
바람직하게는, 무기 염기를 사용하여 질, 구강 또는 직장 점막에 상용성이 되도록 조성물의 pH를 조정할 수 있다. 수산화칼륨 또는 다른 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염기는 적절한 pH를 제공하는데 유용할 수 있다. 물론 임의의 다른 생리학적으로 허용 가능한 염기가 또한 이러한 방식으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 약 0.05 내지 약 5 중량%의 무기 염기가 사용된다.
본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 이러한 방법 및 절차에 따라, 또는 본 발명의 제조 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 무기 염기, 보존제 등과 같은 수용성 성분이 물에 용해될 수 있고, 그 조합물에 셀룰로스-유래 중합체가 첨가될 수 있다. 다른 제조 방법은 물 없이 슬러리 내로 모든 성분을 혼합한 다음 슬러리에 물을 첨가하는 것이다.
바람직하게 조성물에는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 계면활성제를 포함하는 계면활성제가 실질적으로 없다.
물, 오일, 보존제, 유화제, 점도 강화제, 연화제, 전해질, 향료, 완충제, pH 조절제, 피부 보호제, 금속 이온 격리제(sequestrant) 등이 조성물의 액체 또는 로션 제형에 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 핸드 및/또는 바디 워시, 과일 및/또는 채소 워시, 섭취 가능한 조성물, 좌제, 비강 스프레이, 수술-후(post-surgical) 탐폰 등을 제형화하는데 유용할 수 있으며, 이는 바이러스의 전파를 억제하기 위해 표면에 도포되거나 신체 내에 배치될 수 있다. 본 발명의 조성물은 이러한 생물학적 환경에서 바이러스를 억제하기 위해 점막 표면과 접촉하여 배치하기 위한 질용 탐폰 또는 비강 스왑과 같은 흡수성 용품 상에 코팅될 수 있다.
방법
본 발명의 방법 및 조성물의 상이한 태양 및 본 발명의 조성물에 노출될 때 피부, 점막 및 바이러스에 미치는 영향을 평가하기 위해 본 명세서에서 이용되는 다양한 시험 방법이 존재한다. 상피 투과성("TEP") 검사는 본 발명의 방법 및 하기 실시예에서 사용된다. TEP 검사는 조성물이 피부 또는 점막에 자극을 야기하는 정도를 결정하기 위해 사용된다.
상피 투과성 검사("TEP 검사"):
주어진 제형에 대하여 예상되는 눈 및/또는 피부에 대한 자극은 문헌[Invittox Protocol Number 86 (May 1994)], 문헌["Trans-epithelial Permeability (TEP) Assay"] 및 미국 특허 제7,157,414호에 기재되어 있는 바에 따라 측정되고, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 일반적으로, 제품이 눈 및/또는 피부를 자극할 가능성은 세포 층을 통한 플루오레세인의 누출에 의해 평가될 때, 그 층의 투과성에 미치는 영향을 결정하여 평가될 수 있다. 하부 웰(lower well)에 배지 또는 검정 완충액을 함유하는 24-웰 플레이트의 미세다공성 삽입물(insert) 상에 매딘-다비 개 신장(Madin-Darby canine kidney; MDCK) 세포의 단층을 컨플루언스(confluence) 상태가 되도록 성장시킨다. 제품의 자극 가능성은 제품의 희석물에 15분간 노출된 후 세포 단층의 투과성 장벽에 대한 손상을 측정하여 평가될 수 있다. 장벽 손상은 분광광도법으로 결정되는 바와 같은, 30분 후 하부 웰로 누출되는 플루오레세인 나트륨의 양에 의해 평가된다. 플루오레세인 누출을 검사 물질의 농도를 도표화하여 EC50(최대 염료 누출의 50%, 즉, 투과성 장벽에 대하여 50% 손상을 야기하는 시험 물질의 농도)를 결정한다. 더 높은 점수는 더 순한 제형을 나타낸다.
미세다공성 막 상에서 성장한 MDCK 세포 층을 검사 샘플에 노출시키는 것은 자극제가 눈에 접촉할 때 발생하는 첫 번째 사례(event)에 대한 모델이 된다. 생체 내에서, 각막 상피의 최외층은 세포 사이의 밀착 연접(tight junction)의 존재로 인해 선택적 투과성 장벽을 형성한다. 자극에 노출시, 밀착 연접은 분리되어 투과성 장벽이 제거된다. 유체는 상피 밑에 있는 층과 기질(stroma)로 흡수되어, 콜라겐 라멜라의 분리를 유발하며, 이로 인해 불투명해진다. TEP 검정은 미세다공성 삽입물 상에서 성장한 MDCK 세포 층의 세포 사이의 밀착 연접의 파괴에 미치는 자극제의 영향을 측정한다. 손상은 세포 층 및 미세다공성 막을 통해 하부 웰로 누출되는 표지 염료(플루오레세인 나트륨)의 양을 측정함으로써 분광광도법으로 평가된다.
바이러스살멸성 현탁액 시험(Virucidal Suspension Test):
실험 개요: 바이러스살멸성 현탁액 시험(시험관내 시간-사멸 방법)은 단순포진 바이러스 1형(HSV-1) 균주 HF(ATCC#VR-260)로 공격(challenged) 받았을 때, 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 소수성으로 개질된 중합체의 바이러스살멸 특성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 칼륨 아크릴레이트 공중합체와 같은 원료는 30% 스톡 용액(stock solution)으로 공급업체로부터 공급받을 수 있다. HSV-1에 대한 시험을 위한 공격 바이러스 균주는 단순포진 바이러스 1형 균주 HF(ATCC#VR-260)이다. 숙주 세포는 하기와 같이 준비해야 한다: Vero 세포(ATCC#CCL-81)를 일회용 세포 배양 실험 기구(labware)에서 단층으로 유지하고 HSV-1 균주 HF의 바이러스살멸성 현탁액 시험에 사용한다. 검사 전, 숙주 세포의 배양물을 적절한 세포 배양 플레이트에 시딩한다. 세포 단층은 100% 컨플루언스 상태여야 하고 바이러스 접종 전 48시간 미만이여야 한다. 성장 배지(GM) 및 보존 배지(maintenance medium, MM)는 적절한 보충물을 함유한 1X 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium, MEM)이었다.
시험 바이러스는 하기와 같이 준비한다: BSL1 고역가 바이러스 스톡으로부터의 HSV-1 균주 HF를 본 연구에 사용할 수 있다. 사용 당일, 바이러스 스톡의 분취량을 -70℃의 냉동고에서 꺼내 시험에 사용하기 전에 해동시킨다. 본 발명의 시험 제품 조성물은 하기와 같이 제조될 수 있다: 5.0 ml의 시험 제품 30% 용액을 0.5 ml의 수산화나트륨 용액과 함께 4.5 ml의 포스페이트 완충 식염수에 첨가한다. 혼합물을 와류(vortex)시키고 pH 스트립을 사용하여 pH를 측정한다. 용액(시험 제품의 15% v/v)의 pH는 6.0 내지 6.5가 되어야 한다. 시험 제품은 바이러스 접종물 및 바이러스 접종물의 모의실험으로 인해 90%(v/v) 농도로 희석된다. 시험 제품은 13.5%(v/v) 농도에서 평가된다. 15분, 30분 및 1시간 동안 시험 제품에 노출된 후 바이러스 균주의 초기 개체군으로부터의 백분율 및 log10 감소를 결정한다. 플레이팅을 4회 반복 수행한다. 비임상관리기준시험해설서[Good Laboratory Practices, as specified in 21 CFR Part 58]에 따라 시험을 수행한다.
중화 시험:
중화 시험은 바이러스살멸성 현탁액 시험 전에 수행될 수 있다. 바이러스 접종물의 모의실험에서, 보존 배지(이하 "MM")를 시험 제품의 샘플에 첨가하여 시험 제품의 90%(v/v) 농도를 달성한다. 혼합물을 적절한 양의 중화제에 첨가하고 완전히 혼합한다. 중화제/MM/제품의 분취량을 폐기하고 시험 바이러스로 대체한다. 후속하여 중화된 제품의 10배 희석물을 MM에서 준비한다. 희석물을 4회 반복실험에 플레이팅한다.
세포독성 시험을 수행하기 위해, 바이러스 접종물의 모의실험에서, MM을 시험 제품의 샘플에 첨가한다. 혼합물을 적절한 양의 중화제에 첨가하고 완전히 혼합한다. 후속하여 중화된 제품의 10배 희석물을 MM에서 준비한다. 희석물을 4회 반복실험에 플레이팅한다.
시험 바이러스에 대한 중화제 독성의 평가를 하기와 같이 수행할 수 있다:
바이러스 대조군 #1은 중화제가 시험 바이러스에 대해 유의한 억제 효과를 갖는지를 결정하고 중화 시험에서와 같이 중화제로 처리된 시험 바이러스의 역가를 정의하기 위해 사용된다. 시험 바이러스를 중화제에서 희석시키고 후속 희석을 MM에서 수행한다. 각각의 희석물을 4회 반복실험에 플레이팅한다. 바이러스 대조군 #2는 중화제로 처리되지 않았을 때 시험 바이러스의 역가를 결정하기 위해 사용된다. 시험 바이러스의 10배 희석물을 MM에서 준비한다. 각각의 희석물을 4회 반복실험에 플레이팅한다. 세포 배양 대조군: 온전한 세포 배양 단층은 세포 배양 생존능(viability)의 대조군으로서의 역할을 한다. 모든 세포 배양 대조군 웰에서 GM은 MM으로 대체된다.
플레이트를 CO2 인큐베이터에서 5 내지 14일 동안 37℃ ± 2℃에서 인큐베이션한다. 세포변성/세포독성 효과는 도립 복합 현미경(Inverted Compound Microscope)을 사용하여 모니터링된다.
바이러스살멸성 시험: 시험 제품의 농도가 90%(v/v)가 되도록 시험 제품의 샘플에 적절한 양의 시험 바이러스를 첨가하고 완전히 혼합한다. 시험 바이러스를 보정된 분/초 타이머를 사용하여 시간을 맞추어, 15분, 30분 및 1시간 동안 시험 제품에 노출시킨다. 각각의 노출 직후에, 시험 바이러스/제품 현탁액은 중화되고 MM에서 1:10으로 희석된다. 각각의 희석물을 4회 반복실험에 플레이팅한다.
바이러스 대조군: 적절한 양의 시험 바이러스는 바이러스살멸성 검사에서와 같이 동일한 방식으로 중화제로 처리된 후 MM에서 1:10으로 희석된다. 각각의 희석물을 4회 반복실험에 플레이팅한다.
세포독성 대조군: MM의 분취량을 시험 제품의 샘플에 첨가하여 바이러스 접종물을 모의실험한다. MM/제품 혼합물을 중화하고 MM에서 1:10으로 희석한다. 각각의 희석물을 4회 반복실험에 플레이팅한다.
중화 대조군: MM의 분취량을 각각의 시험 샘플 및 비교 제품에 첨가하여 바이러스 접종물을 모의실험한다. MM/제품 혼합물을 중화하고 MM에서 1:10으로 희석한다. 대략적으로 100 내지 1000 감염 단위의 바이러스를 중화된 제품의 샘플에 첨가한다. 희석물을 4회 반복실험에 플레이팅한다.
세포 배양 대조군: 온전한 세포 배양 단층은 세포 배양 생존능의 대조군으로서의 역할을 한다. 모든 세포 배양 대조군 웰에서 GM은 MM으로 대체된다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 5 내지 14일 동안 37℃ ± 2℃에서 인큐베이션한다. 세포변성/세포독성 효과는 도립 복합 현미경을 사용하여 모니터링된다.
검사 허용 기준
유효 검사에는 하기가 요구된다: 1) 적어도 4 log10의 TCID50(조직 배양 감염 용량)가 바이러스 대조군으로부터 회수되고; 2) 세포 배양 대조군 웰의 세포는 살아있는 상태로 웰의 바닥에 부착된 채로 남아있고; 3) 배지는 플레이트의 모든 웰에서 오염되지 않은 상태로 유지되고; 4) 세포 독성이 명백할 때, 역가에서 적어도 3 log10 감소는 세포 독성 수준을 넘어서는 것을 입증하고, 5) 정해진 시간 노출 직후 시험 제품을 완전히 중화하여 바이러스 감염성이 영향을 받지 않도록 하였다.
하기의 프로토콜이 HIV-1, B형 감염, 인플루엔자, 아데노바이러스 및 리노바이러스 프로토콜에 대하여 본 실시 형태의 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
CEM-SS 세포에서 HIV-1
IIIB
에 대한 활성의 평가
10% 완전 RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium)-1640(1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 10% FBS, 미국 캘리포니아주, 칼스배드 소재의 Invitrogen으로부터 구매 가능) 배지에서 2.5x103개의 세포/웰 밀도로 50 마이크로리터(50μL)의 CEM-SS 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅한다. 6가지 농도에서 100 마이크로리터(100 μL)의 각각의 중합체를 3중 반복실험으로(in triplicate) 첨가한 후, 미리 결정된 역가로 50 μL의 HIV-1IIIB를 첨가한다. 배양액을 6일 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 하기와 같이 화합물의 효능 및 세포의 독성을 평가하기 위해 세포를 XTT로 염색한다. AZT를 검정 양성 대조군 화합물로서 동시에(in parallel) 평가한다.
세포 생존능 및 화합물 세포독성을 위한 XTT 염색:
시험 물질의 TC50 값은 테트라졸륨 염료 XTT (2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-[(페닐아미노)카르보닐]-2H-테트라졸륨 하이드록사이드)의 환원을 측정함으로써 유도된다. 대사적으로 활성인 세포에서 XTT는 미토콘드리아 효소인 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트 옥시다아제("NADPH")에 의해 가용성 포마잔 생성물로 대사된다. XTT 용액을 첨가제 없이 RPMI-1640에서 1 mg/ml의 스톡으로 매일 준비한다. 페나진 메토설페이트(Phenazine methosulfate, PMS) 용액을 DPBS에서 0.15 mg/ml로 준비하고 -20℃에서 암실에서 저장한다. XTT/PMS 스톡을 XTT 용액 1ml 당 40 μL의 PMS를 첨가함으로써 사용 직전에 준비한다. 50 마이크로리터(50 μL)의 XTT/PMS를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 4시간의 인큐베이션은 각각의 검정에 대해 표지된 세포의 수와 XTT 염료 환원에 대하여 선형 반응 범위 내에 있는 것으로 실험적으로 결정되었다. 플레이트를 밀봉하고, 여러 번 뒤집어 가용성 포마잔 생성물을 혼합하고, 플레이트를 분자 장비 SpectraMax 및 384 96 웰 플레이트(Molecular Devices SpectraMax Plus 384 96 well plate) 형식 분광광도계로 450 nm(650 nm 기준 파장)에서 판독한다.
인간 말초 혈액 단핵 세포("PBMC")에서 HIV-1 활성의 평가:
백혈구를 제거한(leukophoresed) 혈액 세포를 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline; DPBS)로 여러 번 세정한다. 세정 후, 백혈구를 제거한 혈액을 DPBS로 1:1 희석시키고, 50 ml의 원뿔형 원심분리 튜브에서 15 ml의 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배로 층화시킨다. 이어서, 이러한 튜브를 600 X g에서 30분 동안 원심분리한다. 밴드형성된 PBMC를 생성된 계면으로부터 조심스럽게 흡입하고 후속하여 저속 원심분리에 의해 DPBS로 3회 세정한다. 최종 세정 후, 세포를 트리판 블루 염료 배제법(Trypan Blue dye exclusion)에 의해 나열하고, 15% 우 태아 혈청(FBS), 2 mmol/L L-글루타민, 2 ㎍/ml PHA-P, 100 유닛/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640에서 1 x 106개의 세포/ml로 재현탁시키고, 48 내지 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, PBMC를 다시 원심분리하고, 조직 배양 배지(15% FBS, 2 mmol/L L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 3.6 ng/ml 재조합 인간 Il-2를 포함한 RPMI 1640)에서 재현탁하였다. 이어서, 배양액을 배양액 부피의 절반을 3일마다 새로운 IL-2 함유 조직 배양 배지로 교환함으로써 사용할 때까지 유지한다. 72시간 동안 PHA-P와 함께 증식하도록 유도된 PBMC를 사용하여 검정을 개시한다. PBMC 검정의 경우, 개별 기증자의 세포를 사용할 때 발생하는 가변성을 최소화하기 위해 2명의 기증자로부터의 PHA-P 자극된 PBMC를 함께 풀링(pooled)하고, 1 x 106개의 세포/ml로 새로운 조직 배양 배지에 재현탁하고, 50 μL/웰로 96-웰 둥근 바닥 미세적정 플레이트의 내부 웰에 플레이팅한다. 100 마이크로리터(100 μL)의 2배 농도의 중합체 함유 배지를, 3중 반복 실험으로 세포를 함유한 둥근 바닥 96-웰 플레이트의 지정된 웰로 옮긴다. 웰에 중합체를 첨가한 직후에, 50 μL의 미리 결정된 바이러스의 희석물을 첨가하고 잘 혼합한다. 5% CO2/37℃에서 배양 7일 후, 후술되는 바와 같이 조직 배양 상청액에서 무세포 HIV-1 RT 활성을 측정함으로써 HIV-1 복제를 정량화한다. 세포독성을 전술한 바와 같이 테트라졸륨 염료 XTT를 사용하여 평가한다.
만성 HIV-1 복제 억제의 평가:
HIV-1IIIB로 만성적으로 감염된 CEM-SS 세포를 100 μL 부피에서 웰 당 2.5x103개의 세포의 밀도로 96 웰 미세적정 플레이트에 첨가한다. 화합물(들)을 연속적으로 희석하여, 총 6가지 농도를 평가한다. 각각의 농도의 100 마이크로리터(100 mL)를 3중 실험으로 세포에 첨가한다. 플레이트를 37℃/5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 무세포 상청액 샘플을 96 웰 플레이트의 각각의 웰로부터 수집하여 역전사효소(reverse transcriptase, RT) 활성에 대하여 분석한다. 세포 생존능을 측정하기 위해 플레이트를 XTT 테트라졸륨 염료로 염색한다.
역전사효소 활성 검정:
역전사효소를 표준 방사성 포함 중합 분석법(standard radioactive incorporation polymerization assay)을 사용하여 무세포 상청액에서 측정한다. 삼중수소화 티미딘 트라이포스페이트(Tritiated thymidine triphosphate, TTP)를 1 Ci/ml로 구매하고 효소 반응당 1 μL를 사용하였다. 폴리 rA 및 올리고 dT를 -20℃로 유지한 스톡 용액으로부터 각각 0.5 mg/ml 및 1.7 유닛/ml의 농도로 준비한다. RT 반응 완충액은 매일 새로 준비되고, 이는 125 μL의 1M EGTA, 125 μL의 dH2O, 125 μL의 20% Triton X-100, 50 μL의 1M Tris(pH 7.4), 50 μL의 1M DTT 및 40 μL의 1M MgCl2로 이루어진다. 각각의 반응에 대해, 1 μL의 TTP, 4 μL의 dH2O, 2.5 μL의 rAdT 및 2.5 μL의 반응 완충액이 혼합된다. 10 마이크로리터(10 μL)의 이러한 반응 혼합물을 15 μL의 바이러스 함유 상청액을 포함하는 둥근 바닥 미세적정 플레이트에 넣는다. 플레이트를 습식 인큐베이터에서 60 내지 90분 동안 37℃로 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 10 μL의 반응 부피를 적절한 플레이트 형식의 DEAE 필터 매트 상에 스폿팅(spotted)하고, 5% 인산나트륨 완충액에서 각각 5분 동안 5회, 증류수에서 각각 1분 동안 2회, 70% 시약 알코올에서 각각 1분 동안 2회 세정한 후 공기 건조시킨다. 건조된 필터매트를 플라스틱 슬리브에 놓고, 4 ml의 Opti-Fluor O를 각각의 슬리브에 첨가한다. 포함된 방사능은 Wallac 1450 Microbeta Trilux 액체 섬광 계수기를 사용하여 정량화된다.
세포 간(Cell to Cell) 바이러스 전파 억제의 평가
감염되지 않은 CEM-SS 세포를 50 μL의 총 부피에서 웰 당 1x105개의 세포의 밀도로 96-웰 평평한(flat) 바닥 플레이트에 플레이팅한다. 만성적으로 HIV-1IIIB 감염된 CEM-SS 세포를 50 μL의 부피에서 웰 당 1x105개의 세포 내지 웰 당 1x100개의 세포 범위의 세포 밀도로 첨가한다. 시험 화합물을 연속적으로 희석하여 시험 농도를 달성하고, 3중 반복 실험으로 100 μL의 부피의 웰에 첨가한다. 플레이트를 5% CO2/37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 웰 당 합포체(syncytia)의 수를 카운트한다. 추가로 24시간 인큐베이션 후에, 96 웰 플레이트의 각각의 웰로부터 무세포 상청액 샘플을 전술한 바와 같이 역전사효소(RT) 활성에 대하여 분석한다.
TZM-bl-FcRI 세포에서 HIV-1
BaL
진입 억제의 평가
화합물 노출 24시간 전에, TZM-bl- FcRI 세포를 100 μL의 웰 당 1x104개의 세포로 96-웰 평평한 바닥 플레이트에 플레이팅한다. 5% CO2/37℃에서 인큐베이션 후에, 연속적으로 희석된 50 μL의 화합물을 HIV-1BaL를 추가하기 10 내지 15분 전에 3중 반복 실험으로 세포에 첨가한다. HIV-1BaL를 미리 결정된 역가로 희석하고 50 μL 부피의 효능 플레이트(efficacy plate)에 첨가한다. 배지를 동일한 부피로 독성 플레이트에 첨가한다. 5% CO2/37℃에서 2시간의 인큐베이션 후에, 배양액을 세정하여 잔류 바이러스 및 화합물을 제거한다. 추가로 48시간 동안 플레이트를 5%CO2/37℃에서 인큐베이션하고, 이때 화학발광 기질(Gal Screen, Tropix)을 사용하여 효능 플레이트를 평가하고 독성을 전술한 바와 같이 XTT를 사용하여 평가한다.
화학발광 검출을 사용한 화합물 효능의 평가
모든 배지를 효능 플레이트로부터 제거하고 50 mL의 DPBS로 대체한다. Gal Screen 완충액에서 1:25로 희석된 50 마이크로리터(50 μL)의 Gal-Screen 기질을 플레이트의 모든 웰에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 웰의 내용물을 투명 바닥 플레이트로 옮긴다. 플레이트를 덮고 Microbeta 섬광 계수기를 사용하여 화학발광을 검출한다.
TZM-bl-FcRI 세포에서 세포간 융합 억제의 평가
HeLa-CD4-LTR-β-Gal 세포를 37℃/5% CO2에서 1시간 동안 3중 반복 실험으로 화합물의 6개의 ½-log10 연속 희석물 50 μL과 함께 50 μL의 부피의 웰당 5x103개의 세포의 밀도로 플레이팅한다. 인큐베이션 후에, 100 μL의 HL2/3 세포를 플레이트에 첨가한다. 배양액을 37℃/5% CO2에서 추가 48시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 화학발광 기질을 사용하여 β-갈락토시다아제 생성에 대해 효능 플레이트를 평가하고, 전술한 바와 같이 XTT로 독성 플레이트를 염색하여 세포 생존능을 평가한다.
HIV-1 효소 억제의 평가
HIV-1 역전사효소 억제의 평가
HIV-1 역전사효소(RT) 억제 검정은 ChimerX에서 제공한 HIV-1 역전사효소(RT) 효소를 사용한다. 물에 로그함수적으로 연속 희석된 6가지 농도를 2M Tris-HCl, pH 8.0, 3M KCl, 1M MgCl2, 2M DTT, 10 mM dGTP, 25U/mL rC:dG 템플릿, 10 μL [32P]-α-dGTP(800 Ci/mMol), 및 5 μL의 HIV-1 역전사 효소, BSA 및 Triton X-100을 함유한 20 μL의 효소 반응 혼합물을 함유한 50 μL의 반응 혼합물을 포함하는 96-웰 U-바닥 플레이트에 첨가하였다. 반응 플레이트를 37° C에서 50분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, DNA 침전 및 회수를 돕기 위해 10 ㎍/mL의 초음파처리된 연어 정자 DNA 및 150 μL의 10% TCA를 웰에 첨가하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이션하도록 두었다. 이어서, 웰의 내용물을 DEAE 음이온 교환지로 옮기고 진공 매니폴드를 사용하여 필터를 통해 흡인함으로써 세정하였다. 이어서, 플레이트를 위와 같이 200 μL의 10% TCA로 1회 세정하였다. 15 마이크로리터(15 μL)의 Wallac Supermix 섬광체를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 Wallac MicroBeta 섬광 계수기를 사용하여 판독한다.
HIV-1 프로테아제 억제의 평가
HIV-1 프로테아제 활성을 Hilyte Fluor™ 488/QXLTM520 FRET 펩티드를 포함한 Sensolyte® 520 HIV-1 프로테아제 검정 키트를 사용하여 결정한다. FRET 펩티드에서, 이러한 펩티드가 HIV-1 프로테아제에 의해 2개의 개별 단편으로 절단될 때까지, HiLyte FlourTM488의 형광물질을 QXLTM520으로 켄칭한다. 절단시, Hilyte FluorTM488의 형광물질을 회수하고, 여기/방출 = 490 nm /520 nm에서 모니터링한다. 재조합 HIV-1 프로테아제를 프로테아제 검정 완충액에서 2.5 ng/mL의 농도로 희석하고, 40 μL의 희석된 프로테아제를 NUNC 96-웰 평평한 바닥 검정 형광 플레이트의 2개를 제외한 모든 웰에 첨가한다. 시험 화합물 및 사키나비르(Saquinavir; 양성 대조군 화합물)의 6개의 ½-log10 연속 희석물을 프로테아제 검정 완충액에서 최종 웰 농도의 10배로 준비한다. 10 마이크로리터(10 μL)의 희석된 화합물을 프로테아제를 함유한 검정 플레이트의 3중 반복 실험 웰에 넣는다. 또한 10 마이크로리터(10 μL)의 완충액을 단독으로 프로테아제를 함유한 6개의 웰에 넣어 화합물이 없는 양성 대조군을 만든다. 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한다. 50 마이크로리터(50 μL)의 형광물질 프로테아제 기질(검정 완충액에서 1:500으로 희석됨)을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 60분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 50 마이크로리터(50 μL)의 정지액(stop solution)을 각 웰에 첨가한다. 형광물질의 강도를 여기/발광=490 nm/520 nm를 사용하여 측정한다. EC50을 각각의 화합물에 대한 종점 형광 데이터로부터 계산한다.
HIV-1 인테그라아제 억제의 평가
HIV-1 프로테아제 활성은 HIV-1 인테그라아제 검정 키트 (XpressBio Life Science)를 사용하여 평가된다. 스트렙타비딘 코팅된 96-웰 플레이트를 말단-표지된 비오틴을 함유하는 이중가닥 HIV-1 LTR U5 도너 기질(donor substrate, DS) DNA로 코팅한다. 100 마이크로리터(100 μL)의 1X DS DNA 용액을 지정된 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 세정 완충액으로 3회 세정하고 200 μL의 블록 완충액(blocking buffer)을 각각의 웰에 첨가하여, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 100 마이크로리터(100 μL)의 반응 완충액(음성 대조군) 또는 인테그라아제 효소 용액(양성 대조군)을 지정된 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 위와 같이 세정하고, 반응 완충액(양성 및 음성 대조군에 대해 반응 완충액 단독)에 희석한 각 시험 물품 50 μL를 지정된 웰에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 50 마이크로리터(50 μL)의 1X TS DNA 용액을 플레이트에 첨가하고, 혼합하여, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세정 완충액으로 플레이트를 5회 세정한 후에, 100 μL의 HRP 항체 용액을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 추가의 5회 세정 후에, 100 μL의 TMB 퍼옥시다아제 기질 용액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 100 마이크로리터(100 μL)의 TMB 정지액을 TMB 기질을 함유한 웰에 직접 첨가한다. 플레이트를 450 nM 흡광도에서 판독한다.
HeLa-CD4-LTR-β-Gal 세포에서 화합물 첨가 시간의 평가
HeLa-CD4-LTR-ß-Gal 세포를 검정 개시 24시간 전에 100 μL의 부피에 1x104개의 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 37℃/5% CO2에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 화합물을 명시된 농도로 연속적으로 희석하고, 100 μL의 부피로 바이러스 첨가 전 또는 첨가 후 -30분, 0, 1, 2, 4, 8 및 24시간의 시점에 3중 반복 실험으로 세포에 첨가하였다. HIV-1IIIB를 미리 결정된 역가로 세포에 첨가한다. 배양액을 37℃/5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 이때 화학발광 기질(Gal Screen)을 사용하여 효능을 평가하고, 독성을 테트라졸륨 염료 XTT를 사용하여 (0, 4 및 24시간의 3번의 시점에) 평가한다.
AD38 세포에서 HBV에 대한 활성의 평가:
AD38 세포는 tet 오페론의 전사 제어 하에 안정적으로 형질주입된 HBV 게놈을 함유한다. 세포가 테트라사이클린의 존재 하에 배양될 때 HBV의 발현이 억제되고, 배양 배지로부터 테트라사이클린을 제거하여 발현을 유도할 수 있다. AD38 세포를 웰 당 1x105개의 세포의 밀도로 96-웰 평평한 바닥 플레이트에 시딩하고, 37℃/5% CO2에서 2일 동안 0.3 ㎍/ml 테트라사이클린의 존재 하에 배양한다. 인큐베이션 후에, 배지를 제거하고, 세포를 세정하여 잔류 테트라사이클린을 제거한다. 6가지 농도의 연속적으로 희석된 중합체(1/2 log 증분)를 세포에 첨가하고, 3일 차에 배지를 교체(중합체가 다시 첨가됨)하면서 37℃/5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션한다. 6일 차에, 100 μL의 상층액을 qPCR에 의한 바이러스의 DNA를 분석하기 위해 각 웰에서 수집하고, 세포 단층을 XTT로 다시 염색하여 전술한 바와 같이 세포독성을 평가한다.
qPCR 방법론:
100 마이크로리터(100 μL)의 세포 배양 상청액을 10 μM Tris 및 40 ㎍/ml의 연어 DNA를 함유한 90 μL의 희석 완충액으로 희석한다. 샘플을 15분 동안 102℃로 가열한다. 이어서, 6 마이크로리터(6 μL)의 샘플을 ROX, 0.5 μL의 HBV 정방향 프라이머(10 μM AD38 qF1), 0.5 μL의 HBV 역방향 프라이머(10 μM AD38qR1), 0.5 μL의 Taqman 프로브(AD38 qP1) 및 6 μL의 분자 등급수(molecular grade water)를 포함하는 12.5 μL의 2X 플래티늄 PCR 슈퍼 믹스(2X Platinum PCR super mix)와 혼합한다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 95℃에서 15초 동안 뒤이어 60℃에서 1분 동안, 50 사이클의 조건 하에 수행한다.
인플루엔자 A형 및 인플루엔자 B형 바이러스에 대한 활성의 평가:
10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨 및 0.1 mM NEAA로 보충된 DMEM에서 배양된 MDCK 세포를 100 μL의 부피에서 웰 당 1x104개의 세포의 세포 밀도로 96-웰 평평한-바닥 플레이트에 시딩한다. 플레이트를 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 중합체를 1/2 로그함수적 증분(총 6가지 농도)으로 연속적으로 희석하고, 100 μL의 각각의 농도를 세포에 3중 반복 실험으로 첨가한다. 인플루엔자 ACA/27/07 또는 인플루엔자 BAllen 바이러스를 검정 배지에서 미리 결정된 역가로 희석하고, 100 μL의 부피로 배양액에 첨가한다. 이러한 바이러스의 역가는 감염 후 4일차에 80% 세포 사멸을 산출하여 결정된 양이다. 배양액을 4일 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 시험 플레이트를 전술한 바와 같이 테트라졸륨 염료 XTT로 염색한다.
아데노바이러스 및 리노바이러스에 대한 활성의 평가:
바이러스-유도된 세포 병변 효과(cytopathic effects, CPE)의 억제 및 HeLa 세포에서 아데노바이러스 복제 또는 MRC-5 세포에서 인간 리노바이러스 복제 후 세포 생존능은 XTT 테트라졸륨 염료에 의해 측정된다. 세포(웰 당 1 x 104개의 세포)를 96-웰 평평한-바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하고, 37℃/5% CO2에서 하룻밤 동안 부착시킨다. 인큐베이션 후에, 배지를 세포 단층으로부터 제거하고, 감염 후 6일 차에 85 내지 95%의 세포 사멸을 산출하도록 미리 결정된 역가로 희석된 바이러스 및 연속적으로 희석된 중합체(6가지 농도)를 플레이트에 첨가한다. 양성 검정 대조군 화합물로 리바비린(Ribavirin)을 동시에 평가한다. 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션 후에, 세포 생존능을 후술되는 바와 같이 XTT 염색에 의해 측정한다.
Ca Ski 및 ME180 세포에 대한 독성의 평가
화합물 노출 24시간 전에, 100 μL의 세포를 평평한-바닥 플레이트에서 웰 당 5x104개의 세포로 플레이팅한다. 5%CO2/37℃에서 24시간 인큐베이션한 후에, 연속적으로 희석된 화합물 및 배지를 3중 반복 실험으로 세포에 첨가한다. 5%CO2/37℃에서 추가로 24시간 동안 배양액을 인큐베이션하고, 이때 세정하여 잔류 화합물을 제거한다. 플레이트를 5% CO2/37℃에서 추가로 24시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 전술한 바와 같이 XTT를 사용하여 평가한다.
정상 질내 세균총
락토바실러스
종에 대한 독성의 평가
락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii) 및 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus)의 동결 글리세롤 스톡을 화합물 노출 48시간 전에 MRS 브로쓰에서 성장시킨다. 6가지 농도의 각각의 화합물을 MRS 브로쓰에 연속 희석하고, 각각을 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 3중 반복 실험으로 첨가한다. 락토바실러스 종 각각을 MRS 브로쓰에 OD625=0.06으로 희석하고, 플레이트의 적절한 웰에 첨가한다. 배양액을 24시간 동안 공기 없이 인큐베이션하고, 이때 박테리아의 성장을 분광광도계로 490 nM에서 평가한다. 페니실린/스트렙토마이신 용액을 검정 대조군으로서 사용한다.
질내 자궁경부 조직에 대한 독성의 평가
검사 당일, MatTek 검정 배지를 가온하고, 900 μL를 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가한다. 투여 1시간 전에, EpiVaginal 조직을 냉장고에서 꺼내 6-웰 플레이트에 놓은 다음, 플레이트를 37℃/5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 배지를 6 웰 플레이트로부터 제거하고, 900 μL의 새로운 배지를 첨가한다. 100 마이크로리터(100 μL)의 각각의 농도를 EpiVaginal 조직에 2중 반복 실험으로 첨가한다. 이어서, 플레이트를 37℃/5% CO2에서 추가로 24시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 종료 1시간 전에, DMEM에서 1 mg/mL(3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(이하, "MTT", 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen으로부터 입수 가능)를 준비한다. 인큐베이션 종료 15분 전에, 300 μL의 MTT를 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가한다. 인큐베이션 후에, 잔류 액체를 조직으로부터 제거하고, 이어서 PBS로 2회 조심스럽게 헹군다. 이어서, 각각의 EpiVaginal 조직 삽입물을 MTT 용액을 함유한 24-웰 플레이트의 개별 웰로 옮긴다. 이어서, 플레이트를 3시간 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션한다. 이어서, 각각의 삽입물을 미리 표지된 추출 플레이트로 옮기고, 2.0 mL의 추출 용액을 웰에 첨가하여 조직 삽입물을 완전히 침지시킨다. 추출은 2시간 동안 실온에서 진행되고, 이때 추출 용액을 완전히 혼합하여, 200 μL를 96-웰 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. 각각의 샘플의 광학 밀도는 650 nm의 백그라운드(background)를 사용하여 570 nm에서 결정된다. % 생존능은 100 x [OD(샘플)/OD(음성 대조군)]으로 결정된다. Triton™ X-100 및 N-9을 검정 대조군으로서 사용한다.
재료:
저분자량의 소수성으로 개질된 중합체인 칼륨 아크릴레이트 공중합체(미국 오하이오주 브렉스빌 소재, Lubrizol)를 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체로서 본 발명의 조성물에 사용하였다.
실시예 1
발명의 실시예 E1 내지 실시예 E3 및 비교예 C1 내지 비교예 C3: 시험할 조성물의 제조
E1 내지 E3, A1 및 C1 내지 C3의 조성물을 표 1에 열거된 양의 재료를 사용하여 하기에 기재된 설명에 따라 제조하였다. 조성물 E1 내지 조성물 E3은 본 발명의 조성물 및 방법에 따른다. 조성물 A1은 본 발명과 동시에 출원된, 공계류중인 특허 출원 등록번호 제JCO6079USNP호에 기재된 조성물 및 방법에 따른다. 조성물 C1 내지 조성물 C3은 비교 조성물이다.
[표 1]
표 1의 조성물 각각은 하기와 같이 독립적으로 제조되었다:
E1 - 1.7 g의 칼륨 아크릴레이트 공중합체(활성 30%)를 98.3 g의 탈이온수와 혼합하고, 20% 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 6.5로 조정하였다.
A1- 0.5 g의 PEG6000을 약간 가열하면서 물에 용해시키고, pH는 6.65로 측정되었다.
C1- 17.4 g의 코크아미도프로필 베타인, 23.4 g의 나트륨 라우레스 설페이트 및 8.3 gm의 PEG 80 소르비탄 라우레이트를 150.9 g의 탈이온수에 첨가하였고, pH는 6.8로 측정되었다.
C2 - 3.4 g의 칼륨 아크릴레이트 공중합체, 17.4 g의 코크아미도프로필 베타인, 23.4 gm의 나트륨 라우레스 설페이트 및 8.3 g의 PEG 80 소르비탄 라우레이트를 150.9 gm의 탈이온수에 첨가하였고, 칼륨 아크릴레이트 공중합체는 20% 수산화나트륨을 사용하여 중화시켰다. 최종 pH는 6.5로 측정되었다.
E2 - 10.0 gm의 칼륨 아크릴레이트 공중합체(활성 30%)를 88.56 gm의 탈이온수와 혼합하고, 1.44 gm의 20% 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 6.7로 조정하였다.
E3 - 3 gm의 노녹시놀-9를 86.24 gm의 탈이온수와 혼합하고, 노녹시놀-9가 완전히 용해될 때까지 혼합 플레이트에서 교반하였다. 10 gm의 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 혼합물에 첨가하고, 20% 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 6.4 내지 6.6으로 조정하였다.
C3 - 3 gm의 노녹시놀 9를 97 gm의 탈이온수와 혼합하고, 노녹시놀이 완전히 용해될 때까지 혼합 플레이트에서 교반하였고, pH는 5.2 내지 5.4로 측정되었다.
실시예 2
발명의 실시예 E4 내지 실시예 E11: 본 발명의 조성물의 예시적인 실시 형태의 제조
E4 내지 E11의 안정한 항바이러스 조성물을 표 2에 열거된 재료 및 양에 따라 그리고 하기에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
[표 2]
표 2의 실시 형태의 조성물 각각은 하기와 같이 독립적으로 제조되었다:
E4 및 E5 - E4의 경우: 메인 비커에서 물을 측정하였다. 혼합하면서 카보머를 물에 털어넣었다. 카보머를 균일하게 분산시켰다. 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 첨가하고, 가열을 시작하여 온도가 65℃가 되게 하였다. 칼륨 세틸 포스포페이트 (및) 수소화된 팜 글리세라이드, 광유를 혼합물에 첨가하였다. 10분 후, 가열을 멈추고 혼합물을 냉각시켰다. 실온에서, 페녹시에탄올;에틸헥실글리세린을 첨가하고, 조성물의 pH를 6.7 내지 7.00이 되도록 적당량으로 조정하고, 저장하였다. 로션의 pH는 6.8로 기록되었다.
E5의 경우에, 광유를 혼합물에 첨가한 후 폴리글리세릴-10 라우레이트 및 스테아릴 알코올이 첨가된 것을 제외하고, E5와 동일한 절차를 따랐다.
E6 - 아크릴레이트 가교중합체 및 물을 함께 비커로 첨가하였다. 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 첨가하고, 20% 수산화나트륨 용액을 사용하여 중화시켰다. 투명한 겔이 형성되었다. pH는 7.2로 기록되었다.
E7 - 물을 비커에 첨가하고, 하이드록시에틸셀룰로스를 교반하면서 물에 첨가한 다음, 45분 동안 혼합하였다. 혼합물을 50℃로 가열하였다. 칼륨 아크릴레이트 공중합체, 코코-글루코사이드 (및) 글리세릴올레이트, 라우릴 글루코사이드 (및) 폴리글리세릴-2 다이폴리하이드록시스테아레이트 (및) 글리세린을 비커에 첨가하였다. 조성물이 약 30℃에 도달하면, 가열을 멈추고, 글리세린, 페녹시에탄올; 에틸헥실글리세린 및 벤조산나트륨을 비커에 첨가하였다. pH를 7로 조정하고 아크릴레이트 가교중합체를 첨가하였다.
E8 - 물을 비커에 첨가하고 혼합하였다. 혼합하면서 카보머를 털어넣었다. 카보머를 균일하게 분산시켰다. 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 조성물에 첨가하고, 가열을 시작하여 온도가 65℃가 되게 하였다. 칼륨 세틸 포스포페이트 (및) 수소화된 팜 글리세라이드, 스테아릴 알코올 및 광유를 조성물에 첨가하였다. 10분 후, 가열을 멈추고 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 페녹시에탄올; 에틸헥실글리세린을 첨가하고, pH를 6.7 내지 7.00이 되도록 적당량으로 조정하고, 저장하였다.
E9 - 물 및 프로필렌 글리콜을 메인 비커에 첨가하였다. 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 교반하면서 비커에 첨가하였다. (용액이 투명하게 되고 pH가 6.5 내지 7이 될 때까지) 수산화나트륨을 첨가하여 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 중화시켰다. 벤조산나트륨을 첨가하고 조성물을 30분 동안 혼합시켰다. 혼합물을 55 내지 60℃로 가열하였다. 하이드록시에틸셀룰로스를 천천히 첨가하고, 매끄러운 겔을 수득할 때까지 조성물을 혼합하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 겔의 pH를 4.5로 기록하였다.
E10 - 혼합하면서 물, 카보머를 비커에 첨가한다. 하이드록시에틸셀룰로스를 교반하고, 50℃까지 가열하면서 45분 동안 혼합하였다. 조성물이 약 30℃에 도달하면 열을 제거하고 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 첨가하였다. (용액이 투명하게 되고 pH가 약 6.5 내지 약 7이 될 때까지) 수산화나트륨을 첨가하여 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 중화시킨다. 글리세린, 페녹시에탄올; 에틸헥실글리세린 및 벤조산나트륨을 적당량으로 첨가하고, pH를 6.5 내지 7.00이 되도록 조정하였다.
E11 - 카보머 및 물을 비커에 함께 첨가하였다. 이어서, 케톤 CG(Kathon CG)를 첨가하였다. 후속하여, 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 조성물에 첨가하고, 교반하면서 20% 수산화나트륨 용액을 사용하여 중화시켰다. 투명한 겔이 형성되었고, pH는 7.2로 기록하였다.
실시예 3
상피 투과성(TEP) 시험을 통한 순함 정도(Mildness) 시험
E2, E3 및 C3의 샘플을 상술한 상세한 방법에 따라 TEP에 대하여 시험하였다.
[표 3]
노녹시놀 N9 및 물을 함유한 C3는 둘 모두 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 함유하는 E2 및 E3에 비해 유의한 누출을 보여준다(E3도 노녹시놀 N9을 함유함). E2 및 E3은 모두 TEP 검정에서 우수한 순함 정도를 나타낸 반면 C3는 점막 조직을 통해 제제가 침투할 수 있는 막 손상의 가능성을 보여준다.
실시예 4
HSV-1에 대한 시험관내 시간-사멸 방법을 사용한 칼륨 아크릴레이트 공중합체(소수성으로 개질된 중합체)의 바이러스살멸성 효과.
전술한 프로토콜을 사용하여, 공격 바이러스 균주에 대하여 E1의 중화 연구를 수행하여 사용된 중화 용액(De Engle [D/E] 중화 브로쓰)이 생성물의 바이러스살멸성 활성을 중화시키는데 효과적임을 확인하였다. 중화 용액(D/E)은 시험 생성물의 바이러스살멸성 활성을 효과적으로 중화시켰으며 바이러스 및 세포 배양액에 독성이 아닌 것으로 나타났다.
[표 4]
바이러스 대조군 #1로부터 회수된 바이러스 개체군은 6.50 log10였고, 바이러스 대조군 #2로부터는 6.25 log10였고, 중화 대조군으로부터는 6.25 log10였다. 관찰된 차이는 1 log10을 초과하지 않았으므로 시험 바이러스 감염성은 영향을 받지 않았다.
놀랍게도, 칼륨 아크릴레이트 공중합체를 함유한 E1 조성물은 15분, 30분 및 1시간 노출 후 HSV-1 균주 HF(ATCC#VR-260)의 감염성을 4.00 log10(99.99%)까지 감소시켰다(표 4).
실시예 5
HIV-1, B형 간염, 인플루엔자, 아데노바이러스 및 리노바이러스에 대한 실시 형태의 활성
전술한 프로토콜에 따라, 실시 형태 E1, A1, C1 및 C2를 HIV-1 전세계적 다양성의 폭을 나타내는 광범위한 HIV-1 아형 및 굴성(tropism)에 대하여 시험하였다(표 5).
[표 5]
실시 형태 E1은 또한 92UG029, 92HT599, 98IN017, 92UG024, 92RW020, 92BR003, 97ZA003, 92UG035 및 93Th073를 포함한, 추가적인 지리적 및 유전적 다양성을 나타내는 몇몇 다른 HIV-1 균주에 대해서도 유사한 활성을 나타내었지만, 인플루엔자에 대해서는 그렇지 않다. 실시 형태 A1은 놀랍게도 인플루엔자 바이러스에 대하여 활성을 나타냈으나, 반면에 시험한 다른 피막 바이러스에 대해서는 활성을 나타내지 않았으며, 이는 공계류중인 특허 출원 등록번호 제JCO6079USNP호에 반영되어 있다. 본 출원인은 폴리알킬렌 글리콜, 더 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 가장 바람직하게는, 분자량이 약 6000과 같은 더 높은 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 조성물이 인플루엔자 바이러스를 억제하는 데 효과적일 것이라는 이론을 제시한다. 본 출원인은 추가로 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체 및 폴리알킬렌 글리콜 모두를 함유하는 조성물이 인플루엔자를 포함하는 피막 바이러스를 억제하는 데 더 광범위한 활성을 갖는다는 이론을 제시한다.
나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시 형태는 매우 낮은 농도에서 놀랍도록 다양한 HIV-1 아형 및 굴성에 대해 활성을 보여준다. 이러한 데이터는 HIV-1에 대한 실시 형태 E1의 광범위한 활성을 보여준다.
실시예 6: 항-HIV-1 활성의 기전
실시 형태 E1을 이의 항-HIV 작용 기전을 평가하고 정의하기 위해, 다중 시험관내 HIV-1 작용 기전 결정 검정으로 평가하였다.
결과:
표 6에 나타낸 바와 같이, E1은 HIV-1로 만성적으로 감염된 세포를 치료하는 데 효과가 없었다. 추가적으로, 실시 형태 E1은 HIV-1의 세포간 전파를 예방하거나 HIV-1 감염된 세포의 융합을 예방하는 데 불활성이었다. 실시 형태 E1은 TZM-bl-FcRI 세포에서 진입 억제 검정에 효능을 나타내었고, 이는 중합체가 약한 진입 억제제임을 시사한다. E1은 HIV-1 효소인 인테그라아제, 프로테아제 및 역전사 효소를 억제할 수 있지만; 이러한 활성은 비특이적일 수 있고, 세포 배양액에서 바이러스에 대한 효능에 기여할 것으로 예상되지 않는다. 표 6 및 표 7에 포함된 데이터에 기초하여, 실시 형태 E1은 역전사 이전의 HIV 복제의 초기 단계, 예컨대 바이러스 부착, 융합 또는 표적 세포로의 진입과 같은 단계를 차단할 가능성이 있다. 중합체는 바이러스 복제의 초기 단계를 차단하는 다른 활성 물질과 일관되게, 감염 후 처음 1 내지 2시간 이내에 존재해야 한다.
[표 6]
[표 7]
실시예 7 - 점막 세포 독성 시험
전술한 프로토콜을 사용하여 점막 세포 독성에 대하여 실시예 E1을 시험하였다. E1을 광범위한 활성의 항바이러스 계면활성제 N-9과 비교하였다. 모든 시험 사례에서, E1은 표 8에 기재된 바와 같이 노녹시놀-9보다 세포 및 조직에 대한 독성이 적었다. 추가적으로, E1의 독성 농도는 HIV-1에 대한 효능을 나타내는 E1 농도의 100 내지 1000배였다(표 7). 이들 데이터는 점막 조직에 대한 유사한 실시 형태 및 E1의 순함 정도를 나타낸다.
[표 8]
실시 형태 E1은 또한 전술한 시험에서 생물학적으로 적절한 농도(TC50 >1450 ㎍/ml)에서 락토바실러스 개체군에 대해 독성이 없는 것으로 입증되었다. 이는 추가로 점막 표면과의 상용성을 보인다.
Claims (25)
- 세포 내로의 피막 바이러스(enveloped virus)의 진입을 억제하는 방법으로서,
상기 피막 바이러스를 항바이러스 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 항바이러스 조성물은 적어도 하나의 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 세포 내로의 바이러스 진입을 억제하기 위한 유효량으로 포함하고, 상기 항바이러스 조성물에는 HLB가 12 초과인 계면활성제가 실질적으로 없는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 항바이러스 조성물의 TEP는 약 6 초과인, 방법.
- 제1항에 있어서, 대상체의 감염 가능한 표면에 상기 항바이러스 조성물을 도포하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 감염 가능한 표면은 대상체의 피부 및 점막 조직으로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 점막 조직은 구강 조직, 안구 조직, 비강 조직, 질 조직 및 직장 조직과 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체는 저분자량 아크릴, 셀룰로스, 다른 에틸렌계-불포화 중합체, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 폴리무수물, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리우레아, 폴리이미드, 폴리설폰, 폴리설파이드 및 이들의 둘 이상의 조합 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체는 (메트)아크릴산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 단량체 성분 및 하나 이상의 C1 내지 C9 알킬 (메트)아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 단량체 성분으로부터 유도된 중합체를 포함하며, 상기 저분자량 공중합체는 수평균 분자량이 약 100,000 이하인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체는, 상기 항바이러스 조성물의 중량을 기준으로, 약 0.00005% 내지 약 10%의 양으로 상기 항바이러스 조성물에 존재하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항바이러스 조성물은 적어도 50%의 양성자성 용매를 추가로 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 항바이러스 조성물은 적어도 97%의 물을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 폭스바이러스과(poxviridae), 헤르페스바이러스과(herpesviridae), 레트로바이러스과(retroviridae) 렌티바이러스 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 헤르페스바이러스과 패밀리로부터 선택되는 상기 바이러스는 단순포진 바이러스 1형, 단순포진 바이러스 2형 및 이들의 조합인, 방법.
- 제12항에 있어서, 레트로바이러스과 렌티바이러스 패밀리로부터 선택되는 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 1형인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 내로의 상기 바이러스 진입의 억제는 바이러스 감염에 대한 가능성의 감소를 야기하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항바이러스 조성물은 생물학적 표면을 실질적으로 파괴하지 않는, 방법.
- 피막 바이러스의 진입을 억제하는 방법으로서,
감염 가능한 표면과 항바이러스 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
상기 항바이러스 조성물은 적어도 하나의 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 세포 내로의 바이러스 진입을 억제하기 위한 유효량으로 포함하고, 상기 항바이러스 조성물에는 계면활성제가 실질적으로 없는, 방법. - 제17항에 있어서, 상기 바이러스를 상기 항바이러스 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 항바이러스 조성물로서,
적어도 하나의 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 세포 내로의 바이러스의 진입을 억제하기 위한 유효량으로 포함하고, 물을 적어도 55%로 포함하며, 계면활성제가 실질적으로 없는, 항바이러스 조성물. - 항바이러스 조성물로서,
적어도 하나의 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 세포 내로의 바이러스 진입을 억제하기 위한 유효량으로 포함하고, 물을 적어도 55%로 포함하며, HLB가 12 초과인 계면활성제가 실질적으로 없는, 바이러스 조성물. - 바이러스의 전파를 억제하는 방법으로서,
적어도 하나의 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 세포 내로의 바이러스의 진입을 억제하기 위한 유효량으로 포함하고, 계면활성제가 실질적으로 없는 조성물을 비생물학적 표면에 도포하는 단계를 포함하는, 방법. - 바이러스의 전파를 억제하는 방법으로서,
적어도 하나의 저분자량의 소수성으로 개질된 중합체를 세포 내로의 바이러스의 진입을 억제하기 위한 유효량으로 포함하고, 계면활성제가 실질적으로 없는 성물을 섭취 가능한(ingestable) 표면에 도포하는 단계를 포함하는, 방법. - 제18항에 있어서, 상기 조성물은 액체, 로션, 크림, 겔, 스틱, 스프레이, 면도용 크림, 연고, 세정용 액체 워시, 고체 바, 샴푸, 페이스트, 분말, 무스, 물티슈(wipe), 패치, 상처 드레싱, 접착 밴드, 하이드로겔 및 필름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여 형태를 포함하는, 조성물.
- 제19항에 있어서, 상기 소수성으로 개질된 저분자량 중합체는 (메트)아크릴산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 단량체 성분 및 하나 이상의 C1 내지 C9 알킬 (메트)아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 단량체 성분으로부터 유도된 저분자량의 비가교결합된 선형 아크릴 공중합체를 포함하고, 상기 저분자량 공중합체는 수평균 분자량이 약 100,000 이하인, 조성물.
- 제19항에 있어서, 상기 소수성으로 개질된 저분자량 중합체는 칼륨 아크릴레이트 공중합체인, 조성물.
- 제25항에 있어서, 상기 조성물은 노녹시놀-9를 추가로 포함하는, 조성물.
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