KR20230002829A - Psma 결합 리간드의 방사성 표지 방법 및 이의 키트 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 PSMA 결합 리간드를 방사성 동위원소, 바람직하게는 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 방사성표지하는 방법 및 이의 키트에 관한 것이다.
Description
본 개시는 PSMA 결합 리간드의 방사성 표지 방법 및 이의 키트에 관한 것이다.
전립선암은 미국 및 유럽에서 가장 광범위하게 발병하고 있는 암 중 하나이다. 특히, 전이성 전립선암(mCRPC)은 불량한 예후 및 삶의 질 저하와 관련이 있다.
최근에, 전립선암 치료를 위한 새로운 개발 흐름은 PSMA 리간드를 기반으로 하는 내방사선요법으로 대표되며, 이는 PSMA가 원발성 암 병변 및 연조직/뼈 전이성 질환에서 이의 과발현으로 인해 영상화 및 요법에 적합한 표적인 것으로 간주되기 때문이다. 또한, PSMA 발현은 미충족 의료 수요가 높은 환자 집단을 대표하는 질환의 가장 공격적인 거세 저항성 변이체에서 훨씬 더 높은 것으로 보인다. (Marchal et al., Histol Histopathol, 2004, Jul; 19(3):715-8; Mease et al., Curr Top Med Chem, 2013, 13(8):951-62).
PSMA를 표적화하는 많은 소분자 리간드 중, 가장 광범위하게 연구된 것은 우레아-기반 저분자량 제제이다. 이 제제는 전립선암 임상 평가 및 PRRT 요법에 적합한 것으로 밝혀졌다(Kiess et al., Q J Nucl Med Mol Imaging, 2015;59:241-68). 이러한 제제 중 일부는 표적화 스캐폴드로서 글루타메이트-우레아-라이신(GUL)을 포함한다. 킬레이트제와 GUL 모이어티 사이에 링커를 부착하는 전략에 따라 한 부류의 분자가 생성되었다. 이러한 접근법은 결합 부위 외부에 금속 킬레이트된 부분을 유지하면서 우레아가 결합 부위에 도달하도록 한다. 이러한 전략은 입증된 높은 흡수 및 유지와, 빠른 신장 청소율로 인해 이종이식편 PSMA 양성 종양에서 성공적이었다(Banerjee et al., J Med Chem, 2013; 56:6108-21). 또한 이 부류의 분자는 68Ga로 표지될 수 있고, PET 영상화를 통해 전립선암 병변의 검출에 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Eder et al. Pharmaceuticals 2014, 7, 779-796).
그러나 PSMA 결합 리간드를 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 표지하여 인간 환자의 전립선암 종양의 영상화를 목적으로, 표지된 PSMA 결합 리간드 용액을 수득하기 위한 최적화된 방법은 개발된 적이 없다. 특히, 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 정맥내 주사를 위한 높은 방사화학적 순도의 표지된 PSMA 결합 리간드, 예컨대 [68Ga] PSMA 결합 리간드를 제공할 신속하고 효율적이며 안전한 절차가 필요하다.
본 개시의 제1 양태는 PSMA 결합 리간드를 방사성 동위원소, 바람직하게는 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 표지하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i. 상기 PSMA 결합 리간드 및 임의로 증량제를 건조 형태로 포함하는 제1 바이알을 제공하는 단계,
ii. 상기 방사성 동위원소의 용액을 상기 제1 바이알에 첨가하여, 상기 방사성 동위원소가 있는 상기 PSMA 결합 리간드의 용액을 수득하는 단계,
iii. 단계 ii에서 수득된 용액을 하나 이상의 완충제와 혼합하고, 상기 방사성 동위원소로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계, 및
iv. 임의로, 용액의 pH를 조정하는 단계.
특정 구현예에서, 상기 방사성 동위원소는 68Ga이고 HPLC에서 측정된 방사화학적 순도는 92% 이상이며, 임의로 유리 68Ga3+의 백분율(HPLC에서)은 2% 이하이고/이거나, 비복합 68Ga3+ 종의 백분율(ITLC에서)은 3% 이하이다.
다른 특정 구현예에서, 상기 방사성 동위원소는 67Ga이고 HPLC에서 측정된 방사화학적 순도는 90% 이상이며, 임의로 유리 67Ga3+의 백분율(HPLC에서)은 2% 이하이고/이거나 비복합 67Ga3+ 종의 백분율(ITLC에서)은 5% 이하이다.
다른 특정 구현예에서, 상기 방사성 동위원소는 64Cu이고 HPLC에서 측정된 방사화학적 순도는 92% 이상이며, 임의로 유리 64Cu2+의 백분율(HPLC에서)은 2% 이하이고/이거나 비복합 64Cu2+ 종의 백분율(ITLC에서)은 3% 이하이다.
바람직하게는, PSMA 결합 리간드는 하기 화학식 I의 화합물이다:
[화학식 I]
[상기 화학식에서,
Z는 테트라졸 또는 COOQ이고, 바람직하게는 Z는 COOQ이고;
Q는 독립적으로 H 또는 보호기이고, 바람직하게는 Q는 H이고;
m은 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m은 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q는 1이고;
R은 C6-C10 아릴 및 5 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴은 X로 1회 이상 치환되고;
X는 -V-Y이고;
V는 결합 또는 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 V는 결합이고;
Y는 할로겐이고;
L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 (2m'+1) 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR'-C(NR"R'")=NR"", -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고, R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있고;
W는 -NR2-(C=O), -NR2-(C=S), -(C=O)-NR2-, 및 -(C=S)-NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 W는 -(C=O)-NR2-이고;
L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있고;
R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고, 바람직하게는 R2는 H이고;
n은 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고;
Ch는 킬레이트제, 일반적으로 DOTA임].
다른 양태에서, 본 개시는 해당 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는, 방사성 동위원소로 표지된 PSMA 결합 리간드를 포함하는 용액으로서, 종양, 일반적으로는 PSMA 발현 종양의 생체내 검출을 필요로 하는 대상체에서 영상화를 통해 이를 생체내 검출하기 위한 주사액으로서 사용하기 위한 용액에 관한 것이다.
본 개시의 다른 목적은 주사용 용액을 위한 분말로서, 다음의 성분:
i. 화학식 I의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 I]
[상기 화학식에서,
Z는 테트라졸 또는 COOQ이고, 바람직하게는 Z는 COOQ이고;
Q는 독립적으로 H 또는 보호기이고, 바람직하게는 Q는 H이고;
m은 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m은 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q는 1이고;
R은 C6-C10 아릴 및 5 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴은 X로 1회 이상 치환되고;
X는 -V-Y이고;
V는 결합 또는 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 V는 결합이고;
Y는 할로겐이고;
L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR'-C(NR"R'")=NR"", -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된다. R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있고;
W는 -NR2-(C=O), -NR2-(C=S), -(C=O)-NR2-, 및 -(C=S)-NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 W는 -(C=O)-NR2-이고;
L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있고;
R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고, 바람직하게는 R2는 H이고;
n은 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고;
Ch는 킬레이트제, 일반적으로 DOTA임]; 및
ii. 증량제, 예를 들어 만니톨을 건조 형태로 포함하는, 주사용 용액을 위한 분말에 관한 것이다.
일반적으로, 주사용 용액을 위한 상기 분말은 다음의 성분을 포함한다:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드;
[화학식 II]
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨.
본 개시는 또한 해당 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것으로, 해당 키트는 다음을 포함한다:
i. 다음의 성분을 건조 형태로 포함하는 제1 바이알:
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 II]
ii. 임의로 증량제, 예를 들어 만니톨, 및
ii. 하나 이상의 완충제를 바람직하게는 건조 형태로 포함하는 제2 바이알, 및
iii. 임의로, 방사성 동위원소 발생기 또는 사이클로트론에 의해 생성된 방사성 동위원소를 용출시키기 위한 보조 카트리지.
본원에 개시된 다른 키트는 다음을 포함한다:
i. 다음의 성분을 바람직하게는 건조 형태로 포함하는 단일 바이알:
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 II]
ii. 임의로 증량제, 예를 들어 만니톨,
iii. 하나 이상의 완충제, 및
ii. 임의로, 방사성 동위원소 발생기 또는 사이클로트론에 의해 생성된 방사성 동위원소를 용출시키기 위한 보조 카트리지.
예를 들어, 키트는 다음의 성분을 포함하는 제1 또는 단일 바이알을 포함할 수 있다:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드
[화학식 II]
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨.
일반적으로, 본 개시는 PSMA 결합 리간드를 방사성 동위원소, 바람직하게는 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 표지하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i. 상기 PSMA 결합 리간드 및 임의로 증량제를 건조 형태로 포함하는 제1 바이알을 제공하는 단계,
ii. 상기 방사성 동위원소의 용액을 상기 제1 바이알에 첨가하여, 상기 방사성 동위원소가 있는 상기 PSMA 결합 리간드의 용액을 수득하는 단계,
iii. 단계 ii에서 수득된 용액을 하나 이상의 완충제와 혼합하고, 상기 방사성 동위원소로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계, 및
iv. 임의로, 용액의 pH를 조정하는 단계.
개시된 방법에 의해 수득된 방사성표지된 PSMA 결합 리간드는 바람직하게는 PET/CT, SPECT, 또는 PET/MRI 영상화를 위한 조영제로서 사용하기 위한 방사성 PSMA 결합 리간드이다. 바람직한 구현예에서, 67Ga는 SPECT 영상화에 사용되며, 68Ga 및 64Cu는 PET/CT 또는 PET/MRI와 같은 PET 영상화에 사용된다.
개시된 방법에 의해 수득된 바람직한 방사성표지된 PSMA 결합 리간드는 PET/CT, SPECT, 또는 PET/MRI 영상화를 위한 조영제로서 사용하기에 적합한 방사성 동위원소, 바람직하게는 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 표지된 화학식 II의 PSMA 결합 리간드이다.
[화학식 II]
본 개시의 방법은 유리하게는, 우수한 방사화학적 순도의 방사성표지된 화합물, 예를 들어, 68Ga로 방사성표지된 화학식 II의 PSMA 결합 리간드를 제공할 수 있고, 일반적으로 HPLC에서 측정된 방사화학적 순도는 92% 이상이고, 임의로 유리 68Ga3+의 백분율(HPLC에서)은 2% 이하이고/이거나, 비복합 68Ga3+ 종의 백분율(ITLC에서)은 3% 이하이다.
HPLC 또는 ITLC에서의 방사화학적 순도 및 유리 68Ga3+를 측정하기 위한 분석법은 실시예에 상세히 추가로 기술되어 있다.
정의
용어 "PSMA 결합 리간드" 및 "PSMA 리간드"는 본 개시에서 상호교환적으로 사용된다. 이는 PSMA 효소와 상호작용, 예를 들어 결합할 수 있는 분자를 지칭한다.
문구 "~의 치료" 및 "치료하는"은 질환, 장애, 또는 이의 증상의 개선 또는 중지를 포함한다. 특히, 종양의 치료와 관련하여, 용어 "치료"는 종양의 성장을 억제하거나 종양의 크기를 감소시키는 것을 지칭할 수 있다.
국제 단위계와 일치하는 "MBq"는 방사능 단위 "megabecquerel"의 약어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "PET"는 양전자 방출 단층 촬영을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "SPECT"는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MRI"는 자기 공명 영상을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CT"는 컴퓨터 단층 촬영을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 화합물의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 일으키는, 예를 들어, 증상을 개선하거나, 상태를 완화하거나, 질환 진행을 늦추거나 지연시키거나, 질환을 예방하는 화합물의 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치환된" 또는 "임의로 치환된"은 0 내지 방향족 고리계 상의 총 개방 원자가 수 범위 내 수의, 할로겐, -OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'" -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕소, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 임의로 치환된 기를 지칭하고; R', R", R'", 및 R""는 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴로부터 선택될 수 있다. 본 개시의 화합물이 하나 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들어, 각각의 R 기는, 하나 초과의 R', R", R'", 및 R"" 기가 존재하는 경우의 각각의 R', R", R'", 및 R"" 기에서와 같이 독립적으로 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬"은 그 자체로 또는 다른 치환체의 일부로서 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 작용기를 지칭한다. 적합한 알킬기로는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, s-부틸, 및 t-부틸, 펜틸 및 이의 이성체(예를 들어, n-펜틸, 이소-펜틸), 및 헥실 및 이의 이성체(예를 들어, n-헥실, 이소-헥실)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로아릴"은 5 내지 10개의 원자를 함유하는 단일 고리 또는 다중 방향족 고리가 함께 융합되거나 공유 결합된 것을 갖는 다중불포화 방향족 고리계를 지칭하고, 하나 이상의 고리는 방향족이고 하나 이상의 고리 원자는 N, O, 및 S로부터 선택되는 헤테로원자이다. 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 임의로 4차화될 수 있다. 이러한 고리는 아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클릴 고리에 융합될 수 있다. 이러한 헤테로아릴의 비제한적인 예로는 푸라닐, 티오페닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 옥사트리아졸릴, 티아트리아졸릴, 피리디닐, 피리미딜, 피라지닐, 피리다지닐, 옥사지닐, 디옥시닐, 티아지닐, 트리아지닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조푸라닐, 이소벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 이소벤조티오페닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 퓨리닐, 벤조티아디아졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 퀴나졸리닐, 및 퀴녹살리닐을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아릴"은 6 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 단일 고리 또는 다중 방향족 고리가 함께 융합된 것을 갖는 다중불포화 방향족 하이드로카빌기를 지칭하고, 적어도 하나의 고리는 방향족이다. 방향족 고리는 이에 융합된 1 내지 2개의 추가 고리(본원에 정의된 바와 같은 시클로알킬, 헤테로시클릴, 또는 헤테로아릴)를 임의로 포함할 수 있다. 적합한 아릴기는 벤조피라닐, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥사닐 등과 같은 헤테로시클릴에 융합된 페닐, 나프틸, 및 페닐 고리를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "할로겐"은 플루오로(-F), 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 또는 요오도(-I) 기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "건조 형태"는 수분 함량이 약 10 wt% 미만, 일반적으로 약 5 wt% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만인 분말로 건조된 약학적 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "킬레이트제"는 비공유 결합을 통해 방사성 동위원소를 복합체화하기에 적합한 아민 또는 카복실 기와 같은 작용기를 갖는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항산화제"는 유기 분자의 산화를 억제하는 화합물을 지칭한다. 항산화제는 겐티신산 및 아스코르브산을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "방사화학적 순도"는 언급된 화학적 또는 생물학적 형태로 존재하는 언급된 방사성 핵종의 백분율을 지칭한다. HPLC 방법 또는 순간 박층 크로마토그래피(iTLC) 방법과 같은 방사성 크로마토그래피 방법은 핵약학에서 방사화학적 순도를 결정하는 데 가장 일반적으로 허용되는 방법이다.
건조 형태의 상기 PSMA 결합 리간드를 포함하는 제1 바이알을 제공하는 단계 (i)
PSMA 결합 리간드
유리하게는, PSMA 결합 리간드는 a) 2개의 아미노산 잔기의 우레아, 일반적으로 글루타메이트-우레아-리신(GUL) 모이어티, 및 b) 방사성 동위원소를 배위할 수 있는 킬레이트제를 포함하는 분자이다.
일 구현예에 따르면, PSMA 결합 리간드는 화학식 I의 화합물이다:
[화학식 I]
[상기 화학식에서,
Z는 테트라졸 또는 COOQ이고, 바람직하게는 Z는 COOQ이고;
Q는 독립적으로 H 또는 보호기이고, 바람직하게는 Q는 H이고;
m은 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m은 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q는 1이고;
R은 C6-C10 아릴 및 5 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴은 X로 1회 이상 치환되고;
X는 -V-Y이고;
V는 결합 또는 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 V는 결합이고;
Y는 할로겐이고;
L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR'-C(NR"R'")=NR"", -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고, R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있고;
W는 -NR2-(C=O), -NR2-(C=S), -(C=O)-NR2-, 및 -(C=S)-NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 W는 -(C=O)-NR2-이고;
L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있고;
R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고, 바람직하게는 R2는 H이고;
n은 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고;
Ch는 킬레이트제, 일반적으로 DOTA임].
화학식 I의 화합물은 화학식 Ia, Ib, Ic, 및 Id의 입체이성체를 포함한다:
[화학식 Ia]
[화학식 Ib]
[화학식 Ic]
[화학식 Id]
문구 "L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있음"은 변수 "n"이 2 또는 3인 경우, 하나의 "L" 기는 C1-C6 알킬렌일 수 있는 반면, 다른 "L" 기 또는 기들은 C3-C6 시클로알킬렌 또는 아릴렌일 수 있거나, 다른 구현예에서, 각각의 "L" 기는 예를 들어 C1-C6 알킬렌일 수 있음을 의미한다. 마찬가지로, 예를 들어, "n"이 2 또는 3인 경우, 하나의 "W" 기는 -(C=O)-NR2-일 수 있고 다른 "W" 기 또는 기들은 -(C=S)-NR2-일 수 있거나, 다른 구현예에서, 각각의 "W"는 예를 들어 -(C=O)-NR2-일 수 있다.
일 구현예에 따르면, L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', -NR'R", -할로겐, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR'로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된다. R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있다.
일 구현예에 따르면, L은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', -NR'R", -할로겐, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR'로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되는 C3-C6 알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이다. R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있다.
일 구현예에 따르면, R은 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C6-C10 아릴 및 하나 이상의 할로겐으로 치환된 피리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에 따르면, S는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(이 경우, p는 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 p는 1임)
특정 구현예에 따르면, R은
특정 구현예에 따르면, X는 Br 및 I로부터 선택된다.
유리하게는, R은 
이다.
Ch는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
특정 구현예에 따르면, Ch는
일 구현예에 따르면, W는 -(C=O)-NR2-이고, Ch는 
이다.
일 구현예에 따르면, m은 4이고, Z는 COOQ이고, Q는 H이다.
특정 구현예에서, 일 구현예에 따르면, R은 
이고, Ch는 
이다.
바람직한 구현예에 따르면, PSMA 결합 리간드는 화학식 II의 화합물이다:
[화학식 II]
화학식 II의 화합물은 PSMA-R2로 지칭될 수 있다.
다른 구현예에 따르면, PSMA 결합 리간드는 화학식 III의 화합물이다:
[화학식 III]
화학식 III의 화합물은 PSMA-Cpd2로 지칭될 수 있다.
상기 PSMA 결합 리간드를 포함하는 제1 바이알
특정 구현예에서, 방사성표지 방법은 단일 바이알 키트를 사용한다. 본 구현예에서, 상기 제1 바이알은 상기 PSMA 결합 리간드, 완충제, 및 임의로 증량제를 모두 건조 형태로 포함한다.
대안적으로, 방사성표지 방법은 2개의 바이알 키트를 사용한다. 본 구현예에서, 제1 바이알은 상기 PSMA 결합 리간드 및 임의로 증량제를 포함하고, 제2 바이알은 완충제를 포함한다.
예를 들어, 상기 PSMA 결합 리간드, 일반적으로 화학식 II의 PSMA 결합 리간드는 상기 제1 바이알에 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg의 양으로 포함된다.
바람직한 구현예에서, 만니톨은 증량제로서 바람직하게는 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg의 양으로 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 또는 단일은 항산화제를 함유하지 않는다. 예를 들어, 제1 또는 단일 바이알은 겐티신산을 함유하지 않는다.
상기 제1 바이알(2개 바이알 키트의 바이알 1)의 바람직한 예가 실시예에 제공된다.
제1 바이알은 바람직하게는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 동결 건조에 의해 수득된다. 따라서, 상기 제1 바이알은 동결건조 또는 분무 건조 형태로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 완충제는 인큐베이션 단계 (iii)에서 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8의 pH를 이루기에 적합한 완충제이다. "2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8의 pH를 위한 완충제"는 유리하게는 수산화나트륨을 포함하는 포름산 완충제일 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 또는 단일 바이알은 항산화제를 함유하지 않고, 예를 들어, 제1 또는 단일 바이알은 겐티신산을 함유하지 않고, 완충제는 인큐베이션 단계 (iii)에서 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8의 pH를 이루기에 적합한 완충제이다.
상기 완충제는 추가로, 단일 바이알 키트를 사용하는 구현예에서 제1 바이알, 또는 2개 바이알 키트를 사용하는 구현예에서 별개의 제2 바이알에 포함될 수 있다.
상기 방사성 동위원소의 용액을 상기 제1 바이알에 첨가하는 단계 (ii)
방사성표지 방법에 사용하기 위한 방사성 동위원소는 다음을 포함하는 PET 및 SPECT 영상화의 조영제로 적합한 동위원소를 포함한다:
111In, 133mIn, 99mTc, 94mTc, 67Ga, 66Ga, 68Ga, 52Fe, 72As, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 86Y, 51Cr, 52mMn, 157Gd, 169Yb, 172Tm, 177mSn, 89Zr, 43Sc, 44Sc, 55Co.
바람직한 구현예에 따르면, 방사성 동위원소는 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu이다. 바람직한 구현예에서, 67Ga는 SPECT 영상화에 사용되며, 68Ga 및 64Cu는 PET/CT 또는 PET/MRI와 같은 PET 영상화에 사용된다.
이러한 방사성 동위원소의 금속 이온은 킬레이트제의 작용기, 예를 들어 PSMA 결합 리간드의 카복실산과 비공유 결합을 형성할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 방사성 동위원소의 상기 용액은 다음의 단계로부터 수득되는 용출액이다:
i. 방사성 동위원소 발생기로 모 비방사성 원소로부터 방사성 동위원소를 생성하는 단계,
ii. 용출 용매로서의 HCl에서의 용출에 의해 상기 모 비방사성 원소로부터 상기 방사성 동위원소를 분리하는 단계, 및
iii. 용출액을 회수하는 단계
(이로써 HCl 중 상기 방사성 동위원소의 용액을 수득함).
특정 구현예에서, 상기 방사성 동위원소를 함유하는 용액은 금속 이온, 예를 들어 68Ga3+, 67Ga3+, 또는 64Cu2+ 형태의 방사성 동위원소를 포함하는 수용액이다. 상기 방사성 동위원소를 함유하는 용액은 HCl에 68GaCl3, 67GaCl3, 또는 64CuCl2를 포함하는 수용액일 수 있다.
방사성 동위원소 68Ga를 포함하는 상기 용액은 일반적으로 다음의 단계로부터 수득되는 용출액이다:
i. 발생기로 모 원소 68Ge로부터 68Ga 원소를 생성하는 단계, 및
ii. 임의로, 원소 68Ge/68Ga를 적합한 카트리지에 통과시키고 HCl 중 68Ga를 용출시킴으로써, 생성된 68Ga 원소를 68Ge 원소로부터 분리하는 단계
(이로써 HCl 중 상기 방사성 동위원소의 용액을 수득함).
68Ge/68Ga 발생기로부터의 68Ga의 이러한 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Martiniova L. et al. Gallium-68 in Medical Imaging. Curr Radiopharm. 2016;9(3):187-20; Dash A, Chakravarty Radionuclide generators: the prospect of availing PET radiotracers to meet current clinical needs and future research demands R Am J Nucl Med Mol Imaging. 2019 Feb 15;9(1):30-66]에 기술되어 있다.
방사성 동위원소 68Ga를 포함하는 상기 용액은 일반적으로 사이클로트론 생성으로부터 수득되는 용출액일 수 있다. 이러한 생성은 예를 들어 문헌[Am J Nucl Med Mol Imaging 2014;4(4):303-310] 또는 [B.J.B. Nelson et al. / Nuclear Medicine and Biology 80-81 (2020) 24-31]에 기술되어 있다.
일반적으로, 68Ga는 사이클로트론에 의해 생성될 수 있으며, 바람직하게는 8 내지 18 MeV, 보다 더 바람직하게는 11 내지 14 MeV의 에너지의 양성자 빔을 사용하여 생성될 수 있다. 68Ga는 고체 또는 액체 표적 시스템을 사용하여 68Zn(p,n) 68Ga 반응을 통해 생성될 수 있다. 표적은 농축된 68Zn 금속 또는 68Zn 액체 용액으로 이루어진다. 조사 후, 표적은 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 68Ga를 단리하는 추가의 화학적 프로세싱을 위해 이동된다. 68Ga는 HCl 용액에서 용출된다.
대안적으로, 상기 방사성 동위원소는 67Ga이다. 충격(bombarding) 입자로서 양성자, 중수소, 알파 입자, 또는 헬륨(III)을 이용하여 아연(농축 또는 천연) 또는 구리 또는 게르마늄 표적을 사용하여 67Ga를 생성하는 다양한 방법이 문헌[Helus, F., Maier-Borst, W., 1973. A comparative investigation of methods used to produce 67Ga with a cyclotron. In: Radiopharmaceuticals and Labelled Compounds, Vol. 1, IAEA, Vienna, pp. 317-324], 문헌[M.L Thakur Gallium-67 and indium-111 radiopharmaceuticals Int. J. Appl. Rad. Isot., 28 (1977), pp. 183-201], 및 문헌[Bjørnstad, T., Holtebekk, T., 1993. Production of 67Ga at Oslo cyclotron. University of Oslo Report OUP8-3-1, pp. 3-5]에 요약된 바와 같이 보고된 바 있다. 중간 에너지 양성자(최대 64 MeV)로 natGe 표적에 충격을 가하는 것도 67Ga를 생성하는 데 적합한 방법이며, 이는 문헌[T Horiguchi, H Kumahora, H Inoue, Y Yoshizawa Excitation functions of Ge(p,xnyp) reactions and production of 68Ge, Int. J. Appl. Radiat. Isot., 34 (1983), pp. 1531-1535]에 기술된 바와 같다.
바람직하게는, 67Ga는 사이클로트론에 의해 생성될 수 있다. 68Zn (p, 2n) 67Ga로부터 67Ga를 생성하는 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Alirezapour B et al. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2013), 12 (2): 355-366]에 기술되어 있다. 더 바람직하게는, 이 방법은 10 MeV 내지 40 MeV의 에너지의 양성자 빔을 사용한다. 67Ga는 고체 또는 액체 표적 시스템을 사용하여 67Zn (p, n) 67Ga 또는 68Zn (p, 2n) 67Ga 반응을 통해 생성될 수 있다. 표적은 농축된 67Zn 또는 68Zn 금속 또는 액체 용액으로 이루어졌다. 조사 후, 표적은 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 67Ga를 단리하는 추가의 화학적 프로세싱을 위해 이동된다. 수성 HCl로부터의 최종 증발에 의해 67GaCl3을 생성하고, 이 후 표지 방법을 위한 상기 단일 바이알에 첨가될 수 있다.
대안적으로, 상기 방사성 동위원소는 사이클로트론 생성으로부터 수득되는 바와 같은 64Cu이다. 이러한 제조 방법은 예를 들어 WO2013/029616에 기술되어 있다.
일반적으로, 64Cu는 사이클로트론에 의해 생성될 수 있고, 바람직하게는 11 내지 18 MeV의 에너지의 양성자 빔을 사용하여 생성될 수 있다. 64Cu는 고체 또는 액체 표적 시스템을 사용하여 64Ni (p,n) 64Cu 반응을 통해 생성될 수 있다. 표적은 64Ni 금속 또는 64Ni 액체 용액으로 이루어졌다. 조사 후, 표적은 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 64Cu를 단리하는 추가의 화학적 프로세싱을 위해 이동된다. 수성 HCl로부터의 최종 증발에 의해 64CuCl2를 생성하고, 이 후 표지 방법을 위한 상기 제1 바이알에 첨가될 수 있다.
단계 (ii)에서 수득된 용액을 하나 이상의 완충제와 혼합하고 상기 방사성 동위원소로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계 (iii). 단계 (iii)은 바람직하게는 충분히 승온된 온도, 예를 들어 50℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃에서 수행된다.
방사성표지는 PSMA 결합 리간드(예를 들어 화학식 II의 PSMA 결합 리간드)를 포함하는 제1 바이알을 상기 개시된 바와 같은 적합한 완충제 중 방사성 동위원소(일반적으로, 상기 개시된 바와 같은 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu)를 포함하는 용액과 혼합한 후에 시작된다.
특정 구현예에서, 인큐베이션 단계는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 수행된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션 단계는 2 내지 25분으로 이루어진 기간 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 인큐베이션 단계는 80℃ 내지 100℃, 바람직하게는 90℃ 내지 100℃, 일반적으로 약 95℃ 온도에서 수행된다.
다른 특정 구현예에서, 인큐베이션 단계는 50℃ 내지 90℃, 바람직하게는 60℃ 내지 80℃, 일반적으로 약 70℃ 온도에서 수행된다.
특정 구현예에서, 인큐베이션 단계는 2 내지 20분, 바람직하게는 5 내지 10분, 바람직하게는 6 내지 8분, 보다 더 바람직하게는 약 7분으로 이루어진 기간 동안 수행된다.
다른 특정 구현예에서, 인큐베이션 단계는 5 내지 25분, 바람직하게는 10 내지 20분, 바람직하게는 12 내지 18분, 보다 더 바람직하게는 약 15분으로 이루어진 기간 동안 수행된다.
표지 과정이 끝나면 방사성 동위원소(예컨대 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu)에 대해 특정 친화성을 갖는 격리제를 첨가하여 동위원소의 미반응 부분을 킬레이팅할 수 있다. 이 후, 격리제와 미반응 방사성 동위원소에 의해 형성된 해당 복합체는 방사성표지 후 방사화학적 순도를 높이기 위해 폐기될 수 있다.
화학식 II의 PSMA 결합 리간드를
68
Ga로 방사성표지하는 방법의 바람직한 구현예
본 개시는 보다 구체적으로 하기 화학식 II의 PSMA 결합 리간드를 68Ga로 표지하는 방법에 관한 것으로,
[화학식 II]
해당 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드 약 30 μg을 건조 형태로 함유하는 제1 바이알을 제공하는 단계,
ii. 상기 제1 바이알에 HCl 중 68Ga의 용액을 첨가하는 단계,
iii. 단계 ii에서 수득된 용액을, pH를 3.2 내지 3.8의 범위에서 조정하기 위한 완충제를 포함하는 반응 용액과 혼합하고, 68Ga로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 충분히 승온된 온도에서 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계, 및
iv. 임의로, 용액의 pH를 조정하는 단계.
상기 방법의 특정 구현예에서, HCl 중 상기 68Ga의 상기 용액은 다음의 단계로부터 수득되는 용출액이다:
i. 발생기로 모 원소 68Ge로부터 68Ga 원소를 생성하는 단계, 및
ii. 임의로, 원소 68Ga/68Ge를 적합한 카트리지에 통과시키고 HCl 중 68Ga를 용출시킴으로써, 생성된 68Ga 원소를 68Ge 원소로부터 분리하는 단계
(이로써 HCl 중 상기 방사성 동위원소의 용액을 수득함).
일반적으로, 상기 완충제는 60 mg의 포름산 및 56.5 mg의 수산화나트륨으로 이루어진다.
특정 구현예에서, 주사용 용액을 위한 분말은 항산화제를 함유하지 않는다. 예를 들어, 주사용 용액을 위한 분말은 겐티신산을 함유하지 않는다.
유리하게는, 특정 구현예에서, PSMA 결합 리간드의 간단한 표지는 용출액의 임의의 프로세싱 또는 임의의 추가 정제 단계 없이 상업적으로 입수가능한 68Ge/68Ga 발생기로부터 생성되는 HCl 중 68Ga의 용출액으로 수득될 수 있다.
주사용 용액을 위한 분말
본 개시는 추가로, 다음의 성분:
i. 화학식 I의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 I]
[상기 화학식에서,
Z는 테트라졸 또는 COOQ이고, 바람직하게는 Z는 COOQ이고;
Q는 독립적으로 H 또는 보호기이고, 바람직하게는 Q는 H이고;
m은 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m은 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q는 1이고;
R은 C6-C10 아릴 및 5 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴은 X로 1회 이상 치환되고;
X는 -V-Y이고;
V는 결합 또는 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 V는 결합이고;
Y는 할로겐이고;
L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR'-C(NR"R'")=NR"", -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된다. R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있고;
W는 -NR2-(C=O), -NR2-(C=S), -(C=O)-NR2-, 및 -(C=S)-NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 W는 -(C=O)-NR2-이고;
L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있고;
R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고, 바람직하게는 R2는 H이고;
n은 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고;
Ch는 킬레이트제, 일반적으로 DOTA임]; 및
ii. 증량제, 예를 들어 만니톨을 건조 형태로 포함하는, 주사용 용액을 위한 분말에 관한 것이다.
바람직한 구현예는 다음의 성분을 포함한다:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드;
[화학식 II]
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨.
특정 구현예에서, 주사용 용액을 위한 분말은 항산화제를 함유하지 않는다. 예를 들어, 주사용 용액을 위한 분말은 겐티신산을 함유하지 않는다.
본 개시의 방사성표지 키트
본 발명은 또한 상기 표지 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 다음을 포함한다:
i. 다음의 성분을 건조 형태로 포함하는 제1 바이알:
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 II]
ii. 임의로 증량제, 예를 들어 만니톨, 및
ii. 하나 이상의 완충제를 바람직하게는 건조 형태로 포함하는 제2 바이알, 및
iii. 임의로, 방사성 동위원소 발생기 또는 사이클로트론에 의해 생성된 방사성 동위원소를 용출시키기 위한 보조 카트리지.
바람직하게는, 상기 제1 또는 단일 바이알은 다음의 성분을 포함한다:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드;
[화학식 II]
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨.
상기 제2 바이알 및 단일 바이알은 pH를 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8로 유지하기 위한 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 바이알은 완충제로서 포름산 및 수산화나트륨을 포함한다. 완충제는 건조 형태 또는 용액 형태일 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 완충제는 포름산 및 수산화나트륨의 수용액으로 이루어지고, 포름산은 약 60 mg/mL의 농도로 존재하고 수산화나트륨은 약 56.5 mg/mL의 농도로 존재한다.
바람직하게는, 상기 제1, 제2, 또는 단일 바이알의 모든 성분은 건조 형태이다.
PSMA 결합 리간드를 표지하기 위한 방사성 동위원소는 즉시 사용가능한 제품(즉, 키트로 제공되는 완충제 및 제1 바이알과 혼합하고 이와 함께 인큐베이션하기 위한 것)으로서 키트에 제공될 수 있거나, 대안적으로, 특히 상기 방사성 동위원소가 68Ga, 67Ga, 및 64Cu와 같이 비교적 짧은 반감기를 갖는 경우에 상기 제1 바이알 및 완충제와 혼합 및 인큐베이션하기 이전 및 직전에 방사성 동위원소 발생기 또는 사이클로트론으로부터 용출될 수 있다. 68Ga, 67Ga, 및 64Cu와 같은 표지용 방사성 동위원소는 사이클로트론에 의해 생성될 수도 있다.
바람직하게는, 구성요소들은 본 개시에 따른 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하여 함께 패키징될 수 있는 밀봉 용기에 삽입된다.
키트는 또한 갈륨-68 발생기의 용출 및/또는 후속 혼합 및 가열을 자동으로 수행하는 자동 시스템 또는 원격 제어 메커니즘 시스템의 일부로 사용될 수 있다. 본 구현예에서, PSMA 결합 리간드를 포함하는 바이알(제1 바이알)은 용출 시스템 및/또는 가열 시스템에 직접 연결된다.
키트는 특히 다음 섹션에 개시된 바와 같은 방법에서의 사용을 위해 적용될 수 있다.
특정 구현예에서, 키트는 항산화제를 함유하지 않는다. 예를 들어, 키트는 겐티신산을 함유하지 않는다.
특정 구현예에서, 키트는 항산화제를 함유하지 않고, 예를 들어 키트는 겐티신산을 함유하지 않고, 상기 제2 또는 단일 바이알은 pH를 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8로 유지하기 위한 완충제를 포함한다.
특정 구현예에서, PSMA 결합 리간드는 상기 정의된 바와 같은 화학식 II의 PSMA 결합 리간드이다.
본 개시에 따른 키트의 용도
상기 정의된 키트는 특히 이전 섹션에 개시된 바와 같은 표지 방법의 사용을 위해 적용될 수 있다.
유리하게는, 방사성 동위원소(예를 들어, 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu)로 표지된 PSMA 결합 리간드(예를 들어, 화학식 II의 PSMA 결합 리간드)를 포함하는 용액은 이전 섹션에 개시된 바와 같은 표지 방법에 의해 수득가능하거나 수득된다.
이러한 용액은 예를 들어 종양의 생체내 검출을 필요로 하는 대상체에서 영상화를 통해 이를 생체내 검출하기 위한 주사액으로서 사용할 준비가 된 것일 수 있다.
특정 양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 설치류, 개, 고양이, 또는 영장류이지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 양태에서, 대상체는 인간이다.
주사가능 조성물을 위한 효과적인 약학적 담체에 대한 요건은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)], 및 문헌[SHP Handbook on Injectable Drugs, Trissel, 15th ed., pages 622-630 (2009)] 참조).
일반적으로, 주사액으로서 사용하기 위한 상기 용액은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 [68Ga]-화학식 II의 PSMA 결합 리간드를 100 내지 350 MBq, 바람직하게는 159 내지 250 MBq의 단회 용량으로 제공한다.
특정 구현예에서, 이를 필요로 하는 상기 대상체는 종양 또는 세포를 발현하는 PSMA를 갖는 암이 있는 대상체이다. PSMA 발현 종양 또는 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 전립선 종양 또는 세포, 전이된 전립선 종양 또는 세포, 폐 종양 또는 세포, 신장 종양 또는 세포, 교모세포종, 췌장 종양 또는 세포, 방광 종양 또는 세포, 육종, 흑색종, 유방 종양 또는 세포, 결장 종양 또는 세포, 생식 세포, 갈색세포종, 식도 종양 또는 세포, 위 종양 또는 세포, 및 이들의 조합. 일부 다른 구현예에서, PSMA 발현 종양 또는 세포는 전립선 종양 또는 세포이다.
일반적으로, PET/MRI, SPECT, 또는 PET/CT 영상화는 대상체에게 방사성표지된 PSMA 결합 리간드를 정맥내 투여한지 20 내지 120분, 바람직하게는 50 내지 100분 후, 더 바람직하게는 대상체에게 방사성표지된 PSMA 결합 리간드를 투여한지 2 내지 3시간 후에 입수할 수 있다.
화학식 I, II, 및 III의 화합물의 합성
화학식 I, II, 및 III의 화합물은 WO2017/165473에 개시된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
구체적으로, 화학식 II의 화합물은 반응식 1에 개시된 바와 같이 합성될 수 있다. Glu-Lys 우레아 2의 변형된 p-브로모벤질 기는 메탄올에서 시아노수소화붕소나트륨의 존재 하에 p-브로모벤즈알데히드를 이용한 Glu-Lys 우레아 1의 환원성 알킬화에 의해 제조될 수 있다. 이 절차는 문헌[Tykvart et al. (2015) Journal of medicinal chemistry 58, 4357-63]에 기술되어 있다. 이어서, 지방족 링커인 Boc-6-아미노헥산산은 예를 들어 염기(예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민) 및 커플링제(예컨대 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트 또는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄-3-옥시드 헥사플루오로-포스페이트)를 사용하여 2의 동일한 ε-Lys 아민에 커플링되어, 화합물 3을 생성할 수 있다. 이 후, 화합물 3은 예를 들어 트리플루오로아세트산과 같은 산을 사용하여 화합물 4를 생성하도록 탈보호될 수 있다. 최종적으로, 상업적으로 입수가능한 DOTA-NHS 에스테르와의 접합을 수행하여 화합물 II를 생성할 수 있다.
반응식 1: 화학식 II의 화합물의 합성
구현예
특정 구현예가 다음과 같이 개시된다:
1. PSMA 결합 리간드를 방사성 동위원소, 바람직하게는 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 표지하는 방법으로서,
i. 상기 PSMA 결합 리간드 및 임의로 증량제를 건조 형태로 포함하는 제1 바이알을 제공하는 단계,
ii. 상기 방사성 동위원소의 용액을 상기 제1 바이알에 첨가하여, 상기 방사성 동위원소가 있는 상기 PSMA 결합 리간드의 용액을 수득하는 단계,
iii. 단계 ii에서 수득된 용액을 하나 이상의 완충제와 혼합하고, 상기 방사성 동위원소로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계, 및
iv. 임의로, 용액의 pH를 조정하는 단계를 포함하는 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 단계 i의 제1 바이알은 상기 PSMA 결합 리간드, 완충제, 및 임의로 증량제를 바람직하게는 모두 건조 형태로 포함하는 바이알인, 방법.
3. 구현예 1에 있어서, 단계 iii은 단계 ii에서 수득된 용액을 적어도 완충제 함유 반응 용액과 혼합하고 상기 방사성 동위원소로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분히 승온된 온도에서 충분한 시간 동안 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 방사성 동위원소를 포함하는 상기 용액은 HCl을 추가로 포함하는, 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 68Ga이고 HPLC에서 측정된 방사화학적 순도는 92% 이상이고, 임의로 유리 68Ga3+의 백분율(HPLC에서)은 2% 이하이고/이거나 비복합 68Ga3+ 종의 백분율(ITLC에서)은 3% 이하인, 방법.
6. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 64Cu이고 HPLC에서 측정된 방사화학적 순도는 92% 이상이고, 임의로, 유리 64Cu2+의 백분율(HPLC에서)은 2% 이하이고/이거나 비복합 64Cu2+ 종의 백분율(ITLC에서)은 3% 이하인, 방법.
7. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 67Ga이고 HPLC에서 측정된 방사화학적 순도는 92% 이상이고, 임의로 유리 67Ga3+의 백분율(HPLC에서)은 2% 이하이고/이거나 비복합 67Ga3+ 종의 백분율(ITLC에서)은 3% 이하인, 방법.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 PSMA 결합 리간드는 화학식 I의 화합물인, 방법.
[화학식 I]
[상기 화학식에서,
Z는 테트라졸 또는 COOQ이고, 바람직하게는 Z는 COOQ이고;
Q는 독립적으로 H 또는 보호기이고, 바람직하게는 Q는 H이고;
m은 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m은 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q는 1이고;
R은 C6-C10 아릴 및 5 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴은 X로 1회 이상 치환되고;
X는 -V-Y이고;
V는 결합 또는 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 V는 결합이고;
Y는 할로겐이고;
L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR'-C(NR"R'")=NR"", -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된다. R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있고;
W는 -NR2-(C=O), -NR2-(C=S), -(C=O)-NR2-, 및 -(C=S)-NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 W는 -(C=O)-NR2-이고;
L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있고;
R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고, 바람직하게는 R2는 H이고;
n은 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고;
Ch는 킬레이트제, 일반적으로 DOTA임]
9. 구현예 8에 있어서, 상기 PSMA 결합 리간드는 화학식 II의 화합물인, 방법.
[화학식 II]
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 PSMA 결합 리간드는 상기 제1 바이알에 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg의 양으로 포함되는, 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 바이알은 증량제로서 만니톨을, 바람직하게는 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg의 양으로 포함하는, 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 완충제는 인큐베이션 단계 (iii)에서 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8의 pH를 이루기에 적합한 양으로 존재하는, 방법.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충제는 완충제로서 포름산 및 수산화나트륨을 포함하는, 방법.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 수행되는, 방법.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 2 내지 25분으로 이루어진 기간 동안 수행되는, 방법.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 80℃ 내지 100℃, 바람직하게는 90℃ 내지 100℃, 보다 더 바람직하게는 약 95℃의 온도에서 수행되는, 방법.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 2 내지 20분, 바람직하게는 5 내지 10분, 바람직하게는 6 내지 8분, 보다 더 바람직하게는 약 7분으로 이루어진 기간 동안 수행되는, 방법.
18. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 50℃ 내지 90℃, 바람직하게는 60℃ 내지 80℃, 일반적으로 약 70℃ 온도에서 수행되는, 방법.
19. 구현예 1 내지 15, 또는 18 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 5 내지 25분, 바람직하게는 10 내지 20분, 바람직하게는 12 내지 18분, 보다 더 바람직하게는 약 15분으로 이루어진 기간 동안 수행되는, 방법.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 방사성 동위원소의 상기 용액은
i. 방사성 동위원소 발생기로 모 비방사성 원소로부터 방사성 동위원소를 생성하는 단계,
ii. 용출에 의해 상기 모 비방사성 원소로부터 상기 방사성 동위원소를 분리하는 단계,
iii. 용출액을 회수하는 단계
(이로써 상기 방사성 동위원소의 용액을 수득함)로부터 수득되는 용출액인, 방법.
21. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 방사성 동위원소의 상기 용액은
i. 사이클로트론을 사용하여 비방사성 또는 방사성 원소로부터 방사성 동위원소를 생성하는 단계,
ii. 용출에 의해 상기 비방사성 또는 방사성 원소로부터 상기 방사성 동위원소를 분리하는 단계,
iii. 용출액을 회수하는 단계
(이로써 상기 방사성 동위원소의 용액을 수득함)로부터 수득되는 용출액인, 방법.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 단일 바이알은 항산화제를 함유하지 않고, 예를 들어, 제1 또는 단일 바이알은 겐티신산을 함유하지 않고, 완충제는 인큐베이션 단계 (iii)에서 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8의 pH를 이루기에 적합한 완충제인, 방법.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 또는 단일 바이알은 겐티신산을 함유하지 않는, 방법.
24. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드를 68Ga로 표지하는 방법으로서,
[화학식 II]
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드 약 30 μg을 건조 형태로 함유하는 제1 바이알을 제공하는 단계,
ii. 상기 제1 바이알에 HCl 중 68Ga의 용액을 첨가하는 단계,
iii. 단계 ii에서 수득된 용액과, pH를 3.2 내지 3.8의 범위에서 조정하기 위한 완충제를 포함하는 반응 용액을 혼합하고, 68Ga로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 충분히 승온된 온도에서 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계,
iv. 임의로, 용액의 pH를 조정하는 단계를 포함하는 방법.
25. 구현예 24에 있어서, HCl 중 상기 68Ga의 상기 용액은
i. 발생기로 모 원소 68Ge로부터 68Ga 원소를 생성하는 단계,
ii. 원소 68Ga/68Ge를 적합한 카트리지에 통과시키고 HCl 중 68Ga를 용출시킴으로써, 생성된 68Ga 원소를 68Ge 원소로부터 분리하는 단계
(이로써 HCl 중 상기 방사성 동위원소의 용액을 수득함)로부터 수득되는 용출액인, 방법.
26. 구현예 24에 있어서, HCl 중 상기 68Ga의 상기 용액은
i. 사이클로트론을 사용하여 원소, 예를 들어 68Zn으로부터 68Ga 원소를 생성하는 단계,
ii. 원소 68Ga/출발 원소를 적합한 카트리지에 통과시키고 HCl 중 68Ga를 용출시킴으로써, 생성된 68Ga 원소를 출발 원소로부터 분리하는 단계
(이로써 HCl 중 상기 방사성 동위원소의 용액을 수득함)로부터 수득되는 용출액인, 방법.
27. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드를 67Ga로 표지하는 방법으로서,
[화학식 II]
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드 약 30 μg을 건조 형태로 함유하는 제1 바이알을 제공하는 단계,
ii. 상기 제1 바이알에 HCl 중 67Ga의 용액을 첨가하는 단계,
iii. 단계 ii에서 수득된 용액과, pH를 3.2 내지 3.8의 범위에서 조정하기 위한 완충제를 포함하는 반응 용액을 혼합하고, 67Ga로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 충분히 승온된 온도에서 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계,
iv. 임의로, 용액의 pH를 조정하는 단계를 포함하는 방법.
28. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드를 64Cu로 표지하는 방법으로서,
[화학식 II]
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드 약 30 μg을 건조 형태로 함유하는 제1 바이알을 제공하는 단계,
ii. 상기 제1 바이알에 HCl 중 64Cu의 용액을 첨가하는 단계,
iii. 단계 ii에서 수득된 용액과, pH를 3.2 내지 3.8의 범위에서 조정하기 위한 완충제를 포함하는 반응 용액을 혼합하고, 64Cu로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 충분히 승온된 온도에서 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계,
iv. 임의로, 용액의 pH를 조정하는 단계를 포함하는 방법.
29. 구현예 24 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 제1 또는 단일 바이알은 항산화제를 함유하지 않고, 예를 들어, 제1 또는 단일 바이알은 겐티신산을 함유하지 않고, 완충제는 인큐베이션 단계 (iii)에서 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8의 pH를 이루기에 적합한 완충제인, 방법.
30. 구현예 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충제는 60 mg의 포름산 및 56.5 mg의 수산화나트륨으로 이루어진, 방법.
31. 구현예 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 완충제는 포름산 및 수산화나트륨의 수용액으로 이루어지고, 포름산은 약 60 mg/mL의 농도로 존재하고 수산화나트륨은 약 56.5 mg/mL의 농도로 존재하는, 방법.
32. 구현예 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 수행되는, 방법.
33. 구현예 24 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 2 내지 25분으로 이루어진 기간 동안 수행되는, 방법.
34. 구현예 24 내지 27 및 29 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 80℃ 내지 100℃, 바람직하게는 90℃ 내지 100℃, 일반적으로 약 95℃의 온도에서 수행되는, 방법.
35. 구현예 24 내지 27 또는 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 2 내지 20분, 바람직하게는 5 내지 10분, 바람직하게는 6 내지 8분, 보다 더 바람직하게는 약 7분으로 이루어진 기간 동안 수행되는, 방법.
36. 구현예 28 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 50℃ 내지 90℃, 바람직하게는 60℃ 내지 80℃, 일반적으로 약 70℃의 온도에서 수행되는, 방법.
37. 구현예 28 내지 33 또는 36 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 5분 내지 25분, 바람직하게는 10 내지 20분, 바람직하게는 12 내지 18분, 보다 더 바람직하게는 약 15분으로 이루어진 기간 동안 수행되는, 방법.
38. 구현예 24 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 또는 단일 바이알은 항산화제, 예를 들어 겐티신산을 함유하지 않는, 방법.
39. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는, 방사성 동위원소로 표지된 PSMA 결합 리간드를 포함하는 용액으로서, 종양, 일반적으로는 PSMA 발현 종양의 생체내 검출을 필요로 하는 대상체에서 영상화를 통해 이를 생체내 검출하기 위한 주사액으로서 사용하기 위한 용액.
40. 구현예 39에 있어서, 방사성 동위원소는 111In, 133mIn, 99mTc, 94mTc, 67Ga, 66Ga, 68Ga, 52Fe, 72As, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 86Y, 51Cr, 52mMn, 157Gd, 169Yb, 172Tm, 177mSn, 89Zr, 43Sc, 44Sc, 55Co로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용액.
41. 구현예 24 내지 38 중 어느 하나의 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는, 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 표지된 화학식 II의 PSMA 결합 리간드를 포함하는 용액으로서, 종양, 일반적으로는 PSMA 발현 종양의 생체내 검출을 필요로 하는 대상체에서 영상화를 통해 이를 생체내 검출하기 위한 주사액으로서 사용하기 위한 용액.
42. 주사용 용액을 위한 분말로서, 다음의 성분:
i. 화학식 I의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 I]
[상기 화학식에서,
Z는 테트라졸 또는 COOQ이고, 바람직하게는 Z는 COOQ이고;
Q는 독립적으로 H 또는 보호기이고, 바람직하게는 Q는 H이고;
m은 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m은 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q는 1이고;
R은 C6-C10 아릴 및 5 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴은 X로 1회 이상 치환되고;
X는 -V-Y이고;
V는 결합 또는 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 V는 결합이고;
Y는 할로겐이고;
L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR'-C(NR"R'")=NR"", -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된다. R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있고;
W는 -NR2-(C=O), -NR2-(C=S), -(C=O)-NR2-, 및 -(C=S)-NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 W는 -(C=O)-NR2-이고;
L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있고;
R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고, 바람직하게는 R2는 H이고;
n은 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고;
Ch는 킬레이트제, 일반적으로 DOTA임]; 및
ii. 증량제, 예를 들어 만니톨을 건조 형태로 포함하는, 주사용 용액을 위한 분말.
43. 구현예 42에 있어서, 상기 PSMA 결합 리간드는 화학식 II의 것인, 주사용 용액을 위한 분말.
[화학식 II]
44. 구현예 42 또는 43에 있어서, PSMA 결합 리간드는 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg의 양으로 포함되는, 주사용 용액을 위한 분말.
45. 구현예 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 증량제는 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨인, 주사용 용액을 위한 분말.
46. 구현예 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 다음의 성분:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드;
[화학식 II]
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨
을 포함하는, 주사용 용액을 위한 분말.
47. 구현예 42 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 분말은 항산화제를 함유하지 않고, 예를 들어 겐티신산을 함유하지 않는, 주사용 용액을 위한 분말.
48. 구현예 24 내지 28 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
i. 다음의 성분을 건조 형태로 포함하는 제1 바이알
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 II]
ii. 임의로 증량제, 예를 들어 만니톨, 및
ii. 하나 이상의 완충제를 바람직하게는 건조 형태로 포함하는 제2 바이알, 및
iii. 임의로, 방사성 동위원소 발생기 또는 사이클로트론에 의해 생성된 방사성 동위원소를 용출시키기 위한 보조 카트리지
를 포함하는 키트.
49. 구현예 24 내지 28 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
i. 다음의 성분을 바람직하게는 건조 형태로 포함하는 단일 바이알:
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 II]
ii. 임의로 증량제, 예를 들어 만니톨,
iii. 하나 이상의 완충제, 및
ii. 임의로, 방사성 동위원소 발생기 또는 사이클로트론에 의해 생성된 방사성 동위원소를 용출시키기 위한 보조 카트리지
를 포함하는 키트.
50. 구현예 48 또는 49에 있어서, PSMA 결합 리간드는 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg의 양으로 포함되는, 키트.
51. 구현예 48 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 증량제는 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨인, 키트.
52. 구현예 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 또는 단일 바이알은 다음의 성분:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드
[화학식 II]
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨
을 포함하는, 키트.
53. 구현예 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 제2 또는 단일 바이알은 pH를 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8로 유지하기 위한 완충제를 포함하는, 키트.
54. 구현예 48 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 키트는 항산화제를 함유하지 않고, 예를 들어 겐티신산을 함유하지 않고, 상기 제2 바이알 또는 단일 바이알은 pH를 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8로 유지하기 위한 완충제를 포함하는, 키트.
55. 구현예 48 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 또는 단일 바이알은 겐티신산을 함유하지 않는, 키트.
56. 구현예 48 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 또는 단일 바이알은 완충제로서 포름산 및 수산화나트륨을 포함하는, 키트.
57. 구현예 48 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1, 제2, 또는 단일 바이알의 모든 성분은 건조 형태인, 키트.
실시예
이하, 본 개시는 실시예를 참조하여 보다 상세하고 구체적으로 기술되지만, 이는 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다.
방사화학적 순도: ITLC에 의한 비복합 68Ga 종
이동상 용액의 제조:
5 M 아세트산암모늄: 10 mL의 눈금 플라스크에서 아세트산암모늄 3.85 g을 정확하게 칭량하고, 이를 10 mL의 MilliQ 물로 용해시킨다.
아세트산암모늄 / MeOH: 눈금 실린더를 사용하여 5 M 아세트산암모늄 용액 1 mL, MilliQ 물 4 mL, 및 메탄올 5 mL를 첨가한다. TLC 챔버에 용출액을 옮긴다.
ITLC-SG 준비: 115 mm의 각 바이알당 하나의 ITLC-SG를 절단하고, 바닥으로부터 10 mm에 선을 긋고(5 uL 샘플 드롭을 떨어뜨리는 곳), 바닥으로부터 105 mm에 선을 긋는다(크로마토그래피 전개를 포기해야 하는 곳).
68Ga-PSMA-R2: 기준 계수 0.7~1.0
68Ga 비복합 종: 기준 계수 =0.0÷0.1
(68Ga 비복합 종은 68Ga 콜로이드 종 및 유리 68Ga를 지칭함)
실시예 1: 2-바이알 키트를 사용하여
68
갈륨으로 PSMA-R2를 방사성표지하는 방법의 개발
1. 2-바이알 키트의 설명 및 조성
본 출원인은 다음으로 이루어진 살균 2-바이알 키트를 개발하였다:
이 키트를 68Ge/68Ga 발생기에서 용출된 묽은 HCl 중 68Ga 용액과 조합하여 사용하여 정맥 주사용 방사성표지 영상화 제품으로 68Ga-PSMA-R2를 수득한다.
투여할 방사성선량에 해당하는, 68Ga-PSMA-R2 주사용액의 부피는 발생기에서 제공하는 현재 활성과 방사성 핵종의 물리적 붕괴를 근거로 추정된 주사시간에 따라 계산한다(반감기 = 68분).
바이알 1은 30 μg PSMA-R2를 활성 성분으로서 함유하는 주사용 용액을 위한 분말이며, 10 mL Ultra Inert Type I Plus 유리 바이알에 패킹된다.
바이알 1의 조성은 표 1에 제공되어 있다.
바이알 2의 조성은 표 2에 제공되어 있다.
2. 분말 바이알(바이알 1)
상기에 기술된 바와 같이, 바이알 1(PSMA-R2, 30 μg, 주사용 용액을 위한 분말)은 방사성의약품 키트의 일부로서, 상기 키트는 반응 완충제(바이알 2) 및 보조 카트리지를 또한 포함한다.
해당 키트는 환자에게 직접 주사할 수 있는 방사성표지 영상화 제품인 주사용 68Ga-PSMA-R2 용액을 수득하기 위해 68Ge/68Ga 발생기에 의해 제공되는 HCl 중 68Ga 용액과 조합되어 사용되어야 한다.
2.1 완제 의약품의 성분
완제 의약품은 활성 성분으로 PSMA-R2 및 부형제로 만니톨을 포함한다.
2.1.1 원료 의약품
활성 물질은 C6(6-아미노헥산산) 링커를 통해 킬레이트제(DOTA)에 공유 결합된 7-메라미노산 서열인 PSMA-R2 펩티드이다. 이는 화학식 II의 화합물이다.
PSMA-R2의 서열은 다음과 같다: HO-Glu-CO-Lys(Ne-4브로모벤질-Ne'-Ahx-DOTA)-OH, 분자식: C41H63BrN8O15.
2.1.2 부형제
바이알 1의 조성물을 위해 선택된 부형제를 첨가하여 최종 제형에서의 활성 물질의 안정성을 유지하고, 완제 의약품의 안전성 및 효능을 보장하고, 또한 재구성 절차 동안 68GaPSMA-R2 용액의 필요한 방사화학적 순도를 수득한다. 선택된 부형제는 필요한 약리학적(pharmaco-technical) 특성을 가진 완제 의약품으로 이어진다.
각 부형제에 대한 간략한 설명을 다음과 같이 제공한다:
만니톨은 증량제로서 사용된다. 펩티드 약물은 매우 강력하기 때문에 완제 의약품에 매우 적은 양이 필요하다. 증량제의 부재시, 제품 프로세싱은 기술적 관점에서 적합하지 않게 된다. 증량제는 약학적 프로세싱 및 적절한 동결건조 제품의 생산을 가능하게 한다.
2.2 완제 의약품
2.2.1 제형 개발
제형 개발은 상업적으로 입수가능한 68Ge/68Ga 발생기에서 나오는 용출액의 임의의 프로세싱 또는 임의의 추가 정제 단계 없이 상기 용출액을 사용하여 직접 재구성한 것을 기반으로 DOTA-분자의 간단한 표지를 허용할 수 있는 반응 혼합물 조성을 확인하기 위해 수행되었다.
이 프로젝트의 목표는 전립선 종양의 검출을 위한 방사성 추적자로 사용할 PSMA-R2 소분자를 개발하는 것이었다.
바이알 1은 활성 성분으로서 펩티드를 함유하는 동결건조 분말로서, 이는 방사성표지 절차 동안 68Ga로 방사성표지된다.
PSMA-R2(바이알 1)에 적합한 제형을 개발하기 위한 초기 노력에는 액체 형태의 테스트가 포함되었다.
완제 의약품 제조사는 방사성의약품 조제물에 일반적으로 요구되는 규격을 충족하는 완제품을 수득하기 위해 PSMA-R2 특성과 관련하여 적절한 부형제 선택에 개발 작업을 집중하였다.
활성 성분의 양 및 적절한 부형제의 선택에서 시작하여 관련 수행 연구를 포함한 개발 작업이 설명된다.
2.2.1.1 PSMA-R2 양의 선택
방사화학적 순도 92% 이상 및 유리 68Ga 2% 미만(HPLC 분석을 통해 확인됨)을 달성하는 데 필요한 최소량을 식별하기 위해 Galliapharm, E&Z 68Ge/68Ga 발생기(1850 MBq)를 사용하여 PSMA-R2의 증가량을 테스트하였다.
표 3에 요약된 하기의 HPLC 분석은 5 μg의 PSMA-R2로 수행된 표지가 규격(유리 68Ga %: 2% 미만)을 충족하지 않음을 보여준다. 10 μg으로 수행된 표지는 유리 68Ga % 값이 규격한계에 매우 근접함을 보여준다. 결과는 15 μg를 초과하는 PSMA-R2 양으로 분명히 개선된다.
현재 특이적 활성을 갖는 68GaPSMA-R2 분자에 대해 수행된 생체분포 연구는 종양 모델에서 유리한 생체분포 프로파일을 나타낸다(종양 및 신장에서의 주요 흡수, 다른 기관에서의 상대적으로 낮은 흡수). 생체내 생체분포 데이터는 제형에서 냉각 펩티드를 증가시킬 특별한 필요성을 나타내지 않는다.
따라서 이러한 모든 고려 사항에 근거하여, 방사성표지, 안정성, 및 생체분포 요건을 충족하는 30 μg을 최종 양으로 설정하였다.
본 개발 연구는 또한 잠재적인 항산화제 및 증량제의 선택에 초점을 맞췄다. 방사성표지 절차도 철저히 평가하였다.
2.2.1.2 중요 부형제의 선택
항산화제 특성을 가진 라디칼 제거제의 존재시, PSMA-R2를 방사선분해로부터 보호할 수 있다.
겐티신산에 관심이 집중되었다. 표지를 간섭하지 않으면서 목적하는 보호 기능을 발휘할 수 있는 항산화제의 최저량을 확인하기 위해 테스트를 하였다.
항산화제의 양을 다양하게 하고 다른 파라미터를 일정하게 유지하면서 표지를 테스트하여, 68Ga가 DOTA 분자에 혼입되는 것을 방해하지 않는 농도를 우선적으로 확인하였다.
분자를 2030 mCi 범위의 활성을 갖는 E&Z 발생기를 사용하여 68Ga로 표지하였다. 표지를 갈륨 완충제(pH 3.2~3.8)로 95℃에서 7분 동안 수행하였다. 실험은 방사선분해 제거제로서의 겐티신산의 상이한 양과 펩티드 양(15 μg 및 30 μg)을 테스트하여 수행하였다. 모든 테스트에서 20 mg의 만니톨을 케이크 형성제로서 첨가하였다.
하기의 표는 표지 조건 및 수득한 결과를 요약한 것이다.
표 4에 나타난 결과에서 알 수 있듯이 68GaPSMA-R2의 방사화학적 순도는 이미 겐티신산이 없는 상태에서 최대 4시간의 안정성을 보이며 항상 92% 이상이다. 또한, 유리 68Ga는 겐티신산이 제형에 사용되지 않는 경우, 항상 2% 미만이다. 이러한 예비 결과는 분자가 방사선 분해에 대해 우수한 안정성을 나타냄을 보여준다.
겐티신산의 양을 증가시켜 수행한 하기의 테스트에서는 분자의 안정성이 향상되지 않는 것으로 보인다. 양호한 방사화학적 결과를 제공하는 겐티신산의 최대량은 2 mg인 반면 5 mg의 겐티신산을 사용하면 결과가 규격을 충족하지 못한다. 이는 아마도 금속 이온 복합체화에 적합한 킬레이트 작용기(카복실기)를 나타내는, DOTA 킬레이트제와 겐티신산 사이에서 발생하는 68Ga 복합체화에 대한 부분적인 경쟁 때문일 것이다. DOTA 분자보다 훨씬 약한 킬레이트제이기 때문에 겐티신산의 영향은 많은 양(5 mg)에서만 분명하다.
따라서, 이러한 실험 결과에 근거하여 완제 의약품 조성물에 항산화제가 필요하지 않다는 결론을 얻었다.
동결 건조 공정을 위한 증량제를 첨가하여 제형을 최종적으로 완성하였다.
펩티드의 동결건조를 위해 일반적으로 권고되는 증량제 중 만니톨은 동결건조 공정에서 형태, 안정성, 수분 면에서 우수한 특성을 가진 케이크를 형성하기 때문에 선택되었다.
하기의 표에 기재된 바와 같이 겐티신산을 사용하지 않고 만니톨의 양을 변경하여 두 가지 다른 제형에 대해 E&Z 발생기(활성 30 mCi - 1110 MBq)를 사용하여 방사성표지 테스트를 수행하였다. 두 제형 모두 방사성표지 결과에 부정적인 영향을 미치지 않지만, 20 mg의 만니톨을 포함하는 제형에서 수득한 결과가 더 나은 결과를 보였다. 선택된 만니톨의 양은 20 mg이었다. 또한, 만니톨은 OH 라디칼의 우수한 제거제로서 문헌에 기술되어 있다.
2.3 방사화학적 순도에 대한 pH의 영향
이 테스트의 목적은 다양한 제형의 방사화학적 순도에 대한 표지 pH의 영향을 평가하는 것이었다. pH는 배위 화학뿐만 아니라 액체 제형에서 펩티드 및 소분자의 안정성에도 중요한 역할을 한다. 68Ga의 화학적 성질과 관련하여 pH 변화는 표지 거동에 지대한 영향을 미친다:
이러한 68Ga 표지 제품에 대해 정의된 pH의 규격값은 3.2~3.8이다. 이 pH 범위는 본 발명자들의 표지 방식을 사용하여 DOTA 킬레이트제와 68GaCl3의 복합체화에 적합한 값을 포함한다.
이러한 고려 사항을 기반으로, 갈륨 완충제(바이알 2)의 부피를 변경하여 서로 다른 pH(3.0, 3.2, 3.8, 4.0)에서 E&Z 발생기로 세 가지 다른 제형을 표지하였다.
가장 적은 양의 항산화제를 사용하여 수득한 최상의 방사화학적 순도 결과를 기반으로 다음의 제형을 선택하였다(표 4 참조).
- 제형 1: 30 μg PSMA-R2, 20 mg 만니톨;
- 제형 2: 30 μg PSMA-R2, 6.0 μg 겐티신산, 20 mg 만니톨;
- 제형 3: 30 μg PSMA-R2, 100 μg 겐티신산, 20 mg 만니톨;
하기의 표에서 알 수 있는 바와 같이, 최종 pH가 2.90~3.35인 제형 1에 대해 수행된 모든 방사성표지는 규격 내에 있는 결과를 보여준다.
표 7은 pH가 3.80을 초과하는 제형 1에 대해 수행된 결과를 보여준다: 모든 결과는 규격을 충족한다.
하기의 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 최종 pH가 3.40 미만인 제형 2에 대해 수행된 모든 방사성표지는 규격 내에 있는 결과를 보여준다.
표 9는 pH가 3.80을 초과하는 제형 2에 대해 수행된 결과를 보여준다: 모든 결과는 규격을 충족한다.
표 10은 pH가 3.2미만인 제형 3에 대해 수행된 결과를 보여준다: 모든 결과는 규격을 충족하지 못한다(RCP%: 92% 미만).
표 11은 pH가 3.80을 초과하는 제형 3에 대해 수행된 결과를 보여준다: 모든 결과는 규격을 충족한다.
결론적으로, 수집된 결과는 표지의 최종 pH가 3.0~3.2 사이의 더 낮은 경우에만 제형 3(겐티신산 양 100 μg)에서 68GaPSMA-R2의 방사화학적 순도가 상당히 감소됨을 보여준다. 상한선 부근의 최종 pH(pH 약 3.8)에서 테스트한 동일한 제형은 항상 규격 내 결과를 보여준다.
제형 1(겐티신산 없음) 및 제형 2(겐티신산 양 6 μg)에 대해 수행된 테스트는 더 낮은 pH(3.0~3.2)와 더 높은 pH(3.8~4.0)에서 항상 규격 내 결과를 보여준다.
이러한 고려사항에 근거하면, 표지의 최종 pH가 약 3.2로 더 낮은 경우에만 겐티신산의 부정적인 영향이 있다고 추정할 수 있다. HPLC 결과는 이러한 특정 조건이 방사성표지 제품에서 방사성 불순물의 증가를 초래함을 보여준다.
이러한 이유로, 항상 최종 표지 pH를 하한값(pH 3.2) 부근으로 유지하면서 다른 양의 겐티신산으로 일부 제형을 테스트하였다. 겐티신산이 68GaPSMA-R2의 방사화학적 순도에 부정적인 영향을 미칠 수 있는지 더 명확하게 이해하는 것이 목표였다.
표 12에 수집된 방사성표지 결과는 최종 표지 pH가 약 3.2인 경우 제형에 포함된 200 μg 양의 겐티신산이 제품의 RCP%에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 100 μg으로 수득한 결과는 규격보다 약간 높으며, 12 μg 미만으로 양을 더 낮추면 결과가 확실히 향상된다. 이러한 모든 결과를 바탕으로, 겐티신산의 존재가 방사성표지된 용액의 방사화학적 순도에 부정적인 영향을 미치고 낮은 pH 용액에서 잠재적인 불순물(다른 방사성 종)의 출현을 촉진한다는 결론을 내릴 수 있다.
2.4 방사성표지 절차
2-바이알 키트 디자인을 기반으로 하여, 다음과 같이 3단계 표지 절차를 수립하였다:
1. 68Ge/68Ga E&Z 발생기가 제공하는 HCl 중 68Ga 용액을 사용하여 분말 바이알을 직접 재구성
2. 필요한 부피의 반응 완충제를 첨가
3. 95℃에서 7분 이상 가열(10분을 초과하여 가열하지 않음)
이 시점에서 68Ga-PSMA-R2 용액은 투여할 준비가 된 것이다.
표지 절차 수립시, 상이한 시간 및 온도 조건을 테스트하였다.
온도에 대한 표지 효율의 의존성을 연구하여, 68Ga의 짧은 반감기(68분)와 양립가능한 시간프레임에서 우수한 혼입을 제공하는 값을 확인하였다.
DOTA 킬레이팅 모이어티 내로의 68Ga의 혼입은 가열이 필요한 것으로 알려져 있다.
테스트는 95℃에서 가열한 후 실온에서 발생기의 용출 및 반응 완충제의 첨가로 시작하였다. 결과는 하기의 표에 요약되어 있다.
또한 70℃, 80℃, 90℃, 95℃에서의 표지는 다른 반응 시간(3, 5, 7분) 및 100℃로 테스트하였다. 70℃에서 7분 동안 수행된 68Ga-방사성표지는 부적절한 68Ga 혼입을 나타냈다. 온도를 80℃로 증가시키면 혼입이 94%를 초과하여 촉진된다. 95℃에서 혼입은 5분 후에 거의 완료된다. 이러한 관찰에 근거하면, 7분 동안 95℃가 가장 보존적인 표지 조건을 나타내어, ±5℃ 범위의 온도 변동의 경우에도 유의한 단편화 없이 95% 초과의 혼입을 보장할 수 있다.
68Ga 용출액의 첨가와 규격을 충족하는 방사성표지 영상화 제품을 여전히 제공하는 완충제 첨가 사이의 허용 가능한 지연을 평가하기 위해 테스트를 수행하였다.
재구성 절차는 동결건조된 제형의 재구성 후와 완충제의 첨가 전에 증가하는 시간(분)을 기다리면서 테스트하였다. 방사화학적 순도는 HPLC로 테스트하였다.
결과는 최대 15분의 완충제 첨가 지연이 표지의 성공에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
68Ge/68Ga 발생기의 용출 전에 바이알 1에 갈륨 완충제를 첨가할 가능성도 테스트하였다. 이 절차에 따라, 표 19에 HPLC 분석으로 수득한 표지 결과를 제공한다.
용출 단계 전에 갈륨 완충제를 첨가하여 수행한 방사성표지 테스트는 규격을 충족하지 않는 결과를 나타내어, 이 옵션은 폐기된다.
64
Cu를 사용한 방사성표지 절차
68Ga뿐만 아니라, 2-바이알 키트 디자인을 기반으로 하여, 64Cu 표지 절차를 다음과 같이 수립하였다:
1. 사이클로트론을 통해 생성된 64Cu에 의해 제공되는 HCl 중 64Cu 용액을 사용하여 분말 바이알을 직접 재구성.
2. 필요한 부피의 반응 완충제를 첨가
3. 70℃에서 15분 이상 가열.
표지 절차 수립시, 상이한 시간 및 온도 조건을 테스트하였다.
온도에 대한 표지 효율의 의존성을 연구하여, 제품의 열화를 일으키지 않고 최대 24시간 동안 우수한 혼입 및 우수한 안정성을 제공하는 값을 확인하였다.
테스트는 실온에서 혼입으로 시작하였다. 표 17은 실온에서 인큐베이션된 PSMA R2 펩티드 및 PSMA R2 키트를 사용하여 달성된 결과를 제공한다.
40℃, 70℃, 및 95℃의 표지 조건은 표 18에 나타낸 바와 같이 다양한 반응 시간 및 pH를 사용하여 테스트하였다.
실온에서 수행된 64Cu-방사성표지는 pH가 4 미만인 경우 부적절한 64Cu 혼입을 나타냈다. 온도를 70℃로 증가시키면 혼입이 94%를 초과하여 촉진된다. 95℃에서 혼입은 7분 후에 우수하다. 이러한 관찰을 기반으로 하여, 15분 동안 70℃가 가장 보존적인 표지 조건을 나타내어, 최대 24시간 동안 유의한 단편화 없이 94% 초과의 혼입을 보장할 수 있다.
또한, 가열 단계로 70℃를 15분 동안 사용하여 얻은 3개의 최종 결과는 3 내지 8 mL 범위의 최종 부피에서 100 MBq/mL 내지 200 MBq/mL의 다른 방사성 농도를 사용하여 좋은 결과를 달성할 수 있음을 보여주었다.
이러한 결과는, 고하전 68Ge/68Ga 발생기가 약 200 MBq/mL를 용출할 수 있다는 점을 고려할 때 68Ga 방사성표지 농도에 사용된 것과 동일한 범위를 모방하여 64CuPSMA-R2를 수득할 수 있음을 보여준다.
2.5 최종 제형 및 세부 구성
위에 제시된 제형에 대해 수행된 모든 개발을 기반으로 하여 최종 선택된 바이알 1의 제형은 다음과 같다:
방사성표지된 제형은 다음과 같다:
제품 개발 과정에서 입증된 바와 같이 68Ga-PSMA-R2의 방사화학적 순도는 겐티신산 없이도 최대 4시간 동안 항상 92%를 초과하여 매우 높다(표 4). 이러한 거동은 분자가 방사선 분해에 본질적인 안정성을 제공함을 나타낸다.
제형에 겐티신산을 첨가해도 68GaPSMA-R2 제품의 안정성에 대한 개선 효과를 나타내지 않는 것으로 보이며, 따라서 이 부형제는 최종 제형에 포함되지 않았다.
2.6 규격 평가
개발 중 수득한 결과를 확인하기 위해 최종 제형을 테스트하였다.
액체 제형은 매우 높은 방사화학적 순도 값을 목표로 수행되었다. 이 접근 방식은 R&D 액체 제형에서 여전히 적절한 품질을 보장하는 GMP 동결건조 제품으로의 진화에 대한 넓은 마진을 보장하기 위해 따른 것이다.
유리 68Ga 함량은 개발 중 HPLC로 모니터링했으며 선택한 제형은 목표 한계 내에서 일관된 결과를 나타냈다. 이를 기반으로, ITLC로 평가한 비복합 68Ga 종에는 콜로이드성 및 유리 68Ga가 모두 포함된다는 점을 고려하면, 후자의 파라미터에 대한 지속적인 모니터링은 필요한 것으로 간주되지 않는다.
개발 중 자체적으로 수득한 결과로부터 국부적으로 재구성되는 GMP 제품으로의 전환시, 비복합 68Ga 종에 대한 규격을 5% 미만의 ITLC로 설정하는 것도 적절한 것으로 간주되었다. 이 규격은 키트 기반 방사성의약품에 대한 일반적인 요건과 일치하는 95% 이상의 방사성 동위원소의 혼입을 보장한다.
68Ga-PSMA-R2 방사화학적 순도는 재구성 지침이 적절히 적용되는 경우, 재구성 후 68Ga 표지된 펩티드가 총 방사능의 90.0%를 초과하도록 키트를 출시하기 전에 HPLC로 확인한다.
결론적으로 제형 개발 결과 및 방사성의약품 조제물에 대한 일반적인 요건을 기반으로, 제조 현장에서 동결건조된 GMP 제품의 출시에 대해 다음과 같은 방사화학적 규격이 설정되었다.
3 반응 완충제 바이알(바이알-2)
3.1 제형 개발
3.1.1 일반 사항
반응 완충제의 제형 개발은 68Ge/68Ga 발생기가 제공하는 용출액으로 직접 재구성하여 높고 재현 가능한 복합체화 수율로 DOTA 분자의 표지가 가능한 제형을 정의하는 것을 목표로 하였다.
이러한 직접 절차를 통해, 매우 비싸고 한정된 수의 핵약학에서만 사용할 수 있는 자동 합성 모듈의 사용에 의존하지 않고 표지 프로세스에 액세스할 수 있다.
제시된 재구성 절차는 추가 정제 단계가 필요하지 않으며 기정의된 품질 기준을 충족하는 방사성표지 영상화 제품을 제공한다.
이 접근 방식은 핵의학 커뮤니티에서 인식하고 있는 미충족 수요에 대한 해답이다.
방사성의약품 제조를 위한 키트 개발의 주요 과제는 68Ga 동위원소의 경우 다음으로 제한되는 성공적인 표지 절차와 관련되어 있음이 일반적으로 알려져 있다:
1
적절한 pH 값을 일정하게 유지하는 것의 어려움,
2
복합체화 과정에서 금속 불순물의 경쟁,
3
제품의 안정성 및 주요 지표: 방사화학적 순도
이러한 세 가지 측면으로 인해 지금까지, 68Ge/68Ga 발생기에서 나오는 용출액을 표지 절차에서 직접 적용할 수 없었다.
결과적으로, 제형 개발의 첫 번째 초점은 발생기에 의해 제공되는 총 용출액의 회수 후 목적하는 pH 값을 양호한 신뢰성으로 유지할 수 있는 완충제에 대한 연구였다.
pH 값은 68Ga 표지에 중요한 역할을 한다. 그 이유는 pH 값의 변화가 표지 거동에 지대한 영향을 미치기 때문이다:
사용 가능한 다양한 완충제 중 첫 번째 테스트된 완충제는 HEPES(설폰산 유도체) 또는 아세테이트 완충제와 같이 이미 알려져 있으며, 68Ga로 표지하는 데 사용되었다.
3.1.2 완충제 선택
HEPES는 HCl 용액 부피의 작은 변화에도 견딜 수 없으며 이러한 이유로 일상적인 사용에서 부피가 정확히 일정할 수 없는 68Ge/68Ga 발생기에서 나오는 용출액으로 직접 재구성하도록 설계된 키트에 거의 적용할 수 없다.
또한, HEPES는 키트 접근 방식과 맞지 않는 표지 후 최종 정제를 부과할 정도의 고농도로 주사액 내부에 남아 있어서는 안 된다.
아세테이트 완충제는 68Ga 표지에 사용하는 것으로도 잘 알려져 있으며 예비 테스트에서 상당히 안정적인 pH 값을 제공하였다. 그럼에도 불구하고 일관성 없는 결과를 나타냈다.
HEPES 및 아세테이트에 대한 문헌에 기록된 모든 성공적인 표지는 용출액의 전처리 단계 및 방사성표지된 제품의 최종 정제를 기반으로 하는 표지 절차에서 발생한다는 점에 유의할 필요가 있다.
이 후, 주사 가능한 사용과 호환되는 대체 완충제에 대한 연구는 pKa가 3.2~4.2 범위에 있어 68Ga 표지를 위한 최적의 pH 값에서 효과적인 완충력을 보장하는 완충제에 초점이 맞추어져 있다. 표 23은 일반적인 유기산을 이의 pKa와 함께 나열한 것이다.
시트르산은 갈륨과 안정한 복합체를 형성하는 능력 때문에 제외되었다. 이는 잘 알려진 SPECT 제품 67Ga-시트레이트의 존재에 의해서도 확인된다.
젖산은 표지의 예비 테스트에서 97% 초과의 유리 68Ga를 제공하는 DOTA 킬레이트제에 의해 68Ga의 복합체화를 방해하는 것으로 입증되었다.
숙신산은 HCl 0.1 중 5 ml의 68Ga 용액으로 표지에서 테스트되었지만 약 3.4의 신뢰할 수 있는 pH 값을 설정하더라도 HPLC에서 유리 68Ga 함량이 항상 8%보다 높아 만족스러운 최종 68Ga 표지된 DOTA 펩티드를 제공하지 못했다.
마지막으로, 포름산은 이의 pKa로 인해 68Ga 복합체화에 적합한 pH 값에 잘 집중된 완충 용량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 완충제는 포름산이 약전에서 클래스 3(독성 가능성이 낮은 용매) 잔류 용매로 분류되고, 1일노출허용량(PDE) 미만으로 유지되는 경우 표지 종료시에 최종 주사액에서 제거되지 않았어야 하므로, 의도된 약학적 적용에 적합한 것으로 간주되었다.
완충 시스템의 거동을 설명하는 헨더슨-하셀바흐(Henderson-Hasselbalch) 식을 토대로, 발생기에서 나오는 HCl의 기여를 고려하여 약 3.5의 최종 pH를 갖는 데 필요한 포름산 및 알칼리 대응물의 양을 계산하였다.
수산화나트륨은, 강한 HCl 산을 보상하고 완충제 쌍을 설정하는 데 필요한 포름산의 공액 염기를 생성할 수 있는 강염기이기 때문에 알칼리 대응물로 선택되었다. 30 mg의 포름산과 28.25 mg의 수산화나트륨은 pH 값을 약 3.5로 유지하기에 충분했다. 또한 이러한 포름산 양은 클래스 3 용매의 PDE 50 mg보다 훨씬 적다.
위 농도의 포름산염 완충제는 표준 부피의 용출액(5 mL의 HCl 0.1 N 및 4 mL의 HCl 0.05 N, 따라서 가장 일반적인 상업적으로 입수가능한 68Ge/68Ga 발생기의 용출액 특성을 모방함)을 첨가한 후에 뿐만 아니라 상당히 확장된 범위의 HCl 부피에 대해 pH를 3.2~3.8 범위로 유지할 수 있음이 입증되었다. 이는 정확히 일정한 부피를 보장할 수 없는 발생기에서 현실적으로 발생할 수 있는 용출액 회수가 감소하는 경우에도 최적의 표지 조건을 보장한다.
키트형 접근 방식에서 발생기 용출액 부피의 사전 농축이 예상되지 않으므로, 반응 혼합물의 추가 희석을 방지하기 위해, 제형 내 포름산의 농도를 표지에 필요한 완충제의 부피를 낮게 유지하도록 최적화하였다. 이는 나노몰 펩티드 농도에서의 표지가 표지 수율을 최대화하기 위해 작은 반응 부피를 필요로 하기 때문에 이점이 있다.
표 24 및 표 25에는 적합한 부피의 포름산염 완충제를 가변 부피의 HCl 0.1 N 및 0.05 N과 혼합한 후 측정한 pH 값이 요약되어 있다.
포름산염 완충제의 적절성은 DOTA 모이어티에 의한 68Ga 킬레이트화에 대한 간섭 효과의 부재를 입증하는 표지의 성공으로 확인되었다. 위 농도의 포름산/포름산염 완충제는 전반적으로 다음과 같이 입증되었다:
- 용출액 부피를 줄이거나 농축할 필요 없이 발생기에서 나오는 총 용출액의 산도를 보상할 수 있어 키트형 직접 표지 절차가 가능함;
- HCl 용출액의 현저한 변화에도 안정적인 pH 값을 보장하여 정확히 일정한 용출량을 예상할 수 없는 일상적 적용에 특히 적합함.
- DOTA 킬레이트제에 의한 68Ga 복합체화를 부정적으로 방해하지 않음. 이러한 모든 관찰결과는 추가 개발에 있어 포름산에 초점을 맞추게 한다.
3.2 최종 조제 및 세부 조성
위에 제시된 제형에 대해 수행된 모든 개발을 기반으로 하여 최종 선택된 바이알 2의 제형은 다음과 같다:
Claims (20)
- PSMA 결합 리간드를 방사성 동위원소, 바람직하게는 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 표지하는 방법으로서,
i. 상기 PSMA 결합 리간드 및 임의로 증량제를 건조 형태로 포함하는 제1 바이알을 제공하는 단계,
ii. 상기 방사성 동위원소의 용액을 상기 제1 바이알에 첨가하여, 상기 방사성 동위원소가 있는 상기 PSMA 결합 리간드의 용액을 수득하는 단계,
iii. 단계 ii에서 수득된 용액을 하나 이상의 완충제와 혼합하고, 상기 방사성 동위원소로 표지된 상기 PSMA 결합 리간드를 수득하기에 충분한 시간 동안 해당 혼합물을 인큐베이션하는 단계, 및
iv. 임의로, 용액의 pH를 조정하는 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 PSMA 결합 리간드는 화학식 I의 화합물인, 방법.
[화학식 I]
[상기 화학식에서,
Z는 테트라졸 또는 COOQ이고, 바람직하게는 Z는 COOQ이고;
Q는 독립적으로 H 또는 보호기이고, 바람직하게는 Q는 H이고;
m은 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m은 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q는 1이고;
R은 C6-C10 아릴 및 5 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴은 X로 1회 이상 치환되고;
X는 -V-Y이고;
V는 결합 또는 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 V는 결합이고;
Y는 할로겐이고;
L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR'-C(NR"R'")=NR"", -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고, R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있고;
W는 -NR2-(C=O), -NR2-(C=S), -(C=O)-NR2-, 및 -(C=S)-NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 W는 -(C=O)-NR2-이고;
L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있고;
R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고, 바람직하게는 R2는 H이고;
n은 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고;
Ch는 킬레이트제, 일반적으로 DOTA임] - 제2항에 있어서, 상기 PSMA 결합 리간드는 화학식 II의 화합물인, 방법.
[화학식 II]
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 완충제로서 포름산 및 수산화나트륨을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는, 방사성 동위원소로 표지된 PSMA 결합 리간드를 포함하는 용액으로서, 종양, 일반적으로는 PSMA 발현 종양의 생체내 검출을 필요로 하는 대상체에서 영상화를 통해 이를 생체내 검출하기 위한 주사액으로서 사용하기 위한 용액.
- 제3항의 방법에 의해 수득가능하거나 수득되는, 68Ga, 67Ga, 또는 64Cu로 표지된 화학식 II의 PSMA 결합 리간드를 포함하는 용액으로서, 종양, 일반적으로는 PSMA 발현 종양의 생체내 검출을 필요로 하는 대상체에서 영상화를 통해 이를 생체내 검출하기 위한 주사액으로서 사용하기 위한 용액.
- 주사용 용액을 위한 분말로서, 다음의 성분:
i. 화학식 I의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 I]
[상기 화학식에서,
Z는 테트라졸 또는 COOQ이고, 바람직하게는 Z는 COOQ이고;
Q는 독립적으로 H 또는 보호기이고, 바람직하게는 Q는 H이고;
m은 1, 2, 3, 4, 및 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m은 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q는 1이고;
R은 C6-C10 아릴 및 5 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아릴 및 헤테로아릴은 X로 1회 이상 치환되고;
X는 -V-Y이고;
V는 결합 또는 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 V는 결합이고;
Y는 할로겐이고;
L은 C1-C6 알킬렌, C3-C6 시클로알킬렌, 및 C6-C10 아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커이고, 상기 알킬렌, 시클로알킬렌, 및 아릴렌은 0 내지 2m' 범위(m'은 이러한 기의 총 탄소 원자 수)의 수의, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)OR', -NR'-C(NR"R'")=NR"", -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환되고, R', R", R'", 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴을 지칭할 수 있고;
W는 -NR2-(C=O), -NR2-(C=S), -(C=O)-NR2-, 및 -(C=S)-NR2-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 W는 -(C=O)-NR2-이고;
L 및 W은 각각의 경우에 동일하거나 상이할 수 있고;
R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고, 바람직하게는 R2는 H이고;
n은 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수이고;
Ch는 킬레이트제, 일반적으로 DOTA임]; 및
ii. 증량제, 바람직하게는 만니톨
을 건조 형태로 포함하는, 주사용 용액을 위한 분말. - 제7항에 있어서, 상기 PSMA 결합 리간드는 화학식 II의 것인, 주사용 용액을 위한 분말.
[화학식 II]
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 다음의 성분:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드
[화학식 II]
, 및
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨
을 포함하는, 주사용 용액을 위한 분말. - 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분말은 항산화제를 함유하지 않고, 예를 들어 겐티신산을 함유하지 않는, 주사용 용액을 위한 분말.
- 제3항의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
i. 다음의 성분을 바람직하게는 건조 형태로 포함하는 제1 바이알:
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 II]
, 및
ii. 임의로 증량제, 바람직하게는 만니톨, 및
ii. 하나 이상의 완충제를 바람직하게는 건조 형태로 포함하는 제2 바이알, 및
iii. 임의로, 방사성 동위원소 발생기 또는 사이클로트론에 의해 생성된 방사성 동위원소를 용출시키기 위한 보조 카트리지
를 포함하는 키트. - 제11항에 있어서, 제1 바이알은 다음의 성분:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드
[화학식 II]
, 및
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨
을 포함하는, 키트. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 제2 바이알은 pH를 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8로 유지하기 위한 완충제를 포함하는, 키트.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 키트는 항산화제를 함유하지 않고, 바람직하게는 겐티신산을 함유하지 않고, 상기 제2 바이알은 pH를 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8로 유지하기 위한 완충제를 포함하는, 키트.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 바이알은 완충제로서 포름산 및 수산화나트륨을 포함하는, 키트.
- 제3항의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
i. 다음의 성분을 바람직하게는 건조 형태로 포함하는 단일 바이알:
i. 화학식 II의 PSMA 결합 리간드:
[화학식 II]
, 및
ii. 임의로 증량제, 바람직하게는 만니톨, 및
iii. 하나 이상의 완충제(바람직하게는 건조 형태); 및
ii. 임의로, 방사성 동위원소 발생기 또는 사이클로트론에 의해 생성된 방사성 동위원소를 용출시키기 위한 보조 카트리지
를 포함하는 키트. - 제16항에 있어서, 상기 단일 바이알은 다음의 성분:
i. 10 내지 100 μg, 바람직하게는 15 내지 60 μg, 보다 더 바람직하게는 약 30 μg 양의 화학식 II의 PSMA 결합 리간드
[화학식 II]
, 및
ii. 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 30 mg, 보다 더 바람직하게는 약 20 mg 양의 만니톨
을 포함하는, 키트. - 제16항 또는 제17항에 있어서, 단일 바이알은 pH를 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8로 유지하기 위한 완충제를 포함하는, 키트.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 키트는 항산화제를 함유하지 않고, 바람직하게는 겐티신산을 함유하지 않고, 상기 제2 바이알은 pH를 2.5 내지 4.0, 바람직하게는 2.8 내지 4.0, 더 바람직하게는 3.0 내지 4.0, 보다 더 바람직하게는 3.2 내지 3.8로 유지하기 위한 완충제를 포함하는, 키트.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 바이알은 완충제로서 포름산 및 수산화나트륨을 포함하는, 키트.
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