KR20220166837A - Nk억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포 및 그 용도 - Google Patents

Nk억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포 및 그 용도 Download PDF

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KR20220166837A
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샤오얀 지앙
지앙타오 렌
샤오홍 흐
얀빈 왕
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난징 바이오흐엥 바이오테크 씨오., 엘티디
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Abstract

하나 또는 다수의 NK억제 리간드, 트랜스멤브레인 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하고, 상기 NK억제 리간드는 NK억제 수용체(NK inhibitory receptor, NKIR)에 특이적으로 결합하여 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포에 대한 NK 세포의 살상을 억제하도록 하는 NK억제 분자를 제공한다. 조작된 면역 세포는, 본 발명의 NK억제 분자를 발현하고, 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵화된다. 암, 감염 또는 자가면역 질환의 치료에서의 상기 조작된 면역 세포의 용도를 제공하였다. 상기 조작된 면역 세포는 기존의 조작된 면역 세포보다 피험자 체내의 NK세포의 살상 작용을 현저하게 억제하여, HvGD 위험을 감소시킬 수 있다.

Description

NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포 및 그 용도
본 발명은 면역 치료 분야에 속한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 하나 또는 다수의 NK억제 리간드, 트랜스멤브레인 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하고, 상기 NK억제 리간드는 NK억제 수용체(NK inhibitory receptor, NKIR)에 특이적으로 결합하여 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포에 대한 NK세포의 살상을 억제하도록 하는 NK억제 분자에 관한 것이다.
근래, 암 면역 치료 기술이 빠르게 발전하고 있으며, 특히 키메라 항원 수용체T세포(CAR-T)와 관련된 면역 치료법은 혈액 종양의 치료에서 탁월한 임상 효과를 보이고 있다. CAR-T세포 면역 치료법은 체외에서 종양 항원을 인식할 수 있도록 T세포에 대해 유전자 조작하고, 일정 수까지 증폭시킨 후 환자의 체내에 주입하여 종양 치료 목적을 달성하는 것이다.
2017년, 2개 종류의 자가형 CAR-T요법이 FDA 승인을 받아 미국에서 출시되었고, 하나는 B세포 급성 백혈병에 대한 것이고, 다른 하나는 미만성 B세포 비호지킨 림프종에 대한 것이다. 이 두가지의 CAR-T세포는 임상에서 치료 효과가 우수하지만, 높은 가격과 긴 제조 주기로 인해, 대규모 보급이 어렵다. 따라서, 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 범용형 CAR-T제품의 개발이 필요한 상황이다. 이 외에, 건강한 공여체로부터 얻은 T세포의 활력과 기능도 환자 유래 T세포보다 우수하여, CAR감염률을 높일 수 있으므로, 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
그러나, 범용형 CAR-T세포의 개발은 여전히 아래와 같은 두가지 문제에 직면하고 있다: (1) 조작된 CAR-T세포가 환자 체내에 유입되고 일정 정도로 증식되면, 환자의 정상 세포 또는 조직을 공격하여, 이식편대숙주질환(GvHD)을 일으킬 수 있고; (2) 환자 체내에서의 정상적인 면역 체계는 이체 유래 CAR-T세포를 거부하여, 숙주편대이식질환(host-versus-graft disease, HvGD)를 일으킬 수 있다. 현재, HvGD의 경우, 주로 CD52 또는 HLA를 녹아웃(knock out)시키는 방식으로 감소시키거나 방지한다. 구체적으로, CD52를 녹아웃시키면 범용형 CAR-T세포가 알렘투주맙(Alemtuzumab)(CD52항체)에 내성을 갖게 함으로써, 알렘투주맙으로 환자 체내 T세포 제거시, 유입된 CAR-T세포에 대한 살상을 방지할 수 있다. 그러나, 알렘투주맙의 사용은 범용형 CAR-T제품의 생산 및 치료 원가를 증가시킨다. 다른 한편, HLA분자를 녹아웃시키면 항체를 사용하거나 기타 처리를 수행하는 조작이 없이도 CAR-T세포가 환자의 T세포에 의해 제거되는 것을 방지할 수 있으나, HLA분자가 녹아웃된 세포는 환자의 NK세포에 의해 인식되어 거부 반응이 발생된다.
따라서, 여전히 기존의 범용형 CAR세포 요법을 개선할 필요가 있고, 특히, CAR세포에 대한 NK세포 살상 작용을 감소시켜, HvGD 위험을 더 한층 감소시키거나 방지해야 한다.
제1양태에 있어서, 본 발명은 하나 또는 다수의 NK억제 리간드, 트랜스멤브레인 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하고, 상기 NK억제 리간드는 NK억제 수용체(NK inhibitory receptor, NKIR)에 특이적으로 결합하여 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포에 대한 NK세포의 살상을 억제하도록 하는 NK억제 분자를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKIR을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편, 또는 NKIR의 천연 리간드 또는 이들이 포함하는 NKIR 결합 단편이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 NKIR은 NKG2/CD94성분(예를 들어, NKG2A, NKG2B, CD94); 살상 세포Ig-유사 수용체(KIR) 패밀리 구성원(예를 들어, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2 및 KIR3DL3); 백혈구Ig-유사 수용체(LIR) 패밀리 구성원(예를 들어, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5 및 LIR8); NK 세포 수용체 단백질 1(NKR-Pl) 패밀리 구성원(예를 들어, NKR-P1B 및 NKR-P1D); 면역 체크포인트 수용체(예를 들어, PD-1, TIGIT 및 CD96, TIM3, LAG3); 암배아 항원 관련 세포 부착 분자1(CEACAM1); 시알산 결합 면역글로불린형 렉틴(SIGLEC) 패밀리 구성원(예를 들어, SIGLEC7 및 SIGLEC9); 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체1(LAIR1); Ly49 패밀리 구성원(예를 들어, Ly49A, Ly49C, Ly49F, Ly49Gl 및 Ly49G4) 및 킬러 세포 렉틴 유사-수용체 G1(KLRG1)로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 NKIR은 PD1, NKG2A, NKG2B, CD94, LIR1, LIR2, LIR3, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1, CEACAM1, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9 및 KLRG1로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 NKIR은 PD1, NKG2A, CD94, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1, LIR1, CEACAM1, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9 및 KLRG1로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKIR을 타겟팅하는 항체이고, 상기 항체는 완전한 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv단편, scFv항체 단편, 선형 항체, sdAb 또는 나노 항체이다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 PD1, NKG2A, LIR1, KIR, SIGLEC7, SIGLEC9 및/또는 KLRG1을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKIR의 천연 리간드 또는 이들이 포함하는 NKIR 결합 단편이다. 바람직하게, 상기 NK억제 리간드는 HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, 콜라겐, OCIL, 시알산, 면역 체크포인트 리간드(예를 들어, PD-L1/PD-L2, CD155, CD112, CD113, Gal-9, FGL1 등), 및 이들이 포함하는 NKIR 결합 영역으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 NK억제 리간드는 시알산, HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, PD-L1, PD-L2, 또는 이들이 포함하는 NKIR결합 영역이다. 보다 바람직하게, 상기 NK억제 리간드는 시알산, HLA-E세포 외 영역, HLA-G세포 외 영역, E-카드헤린 세포 외 영역, PD-L1세포 외 영역 및 PD-L2세포 외 영역으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 상기 NK억제 리간드는 E-카드헤린 세포 외 영역이고, EC1 및 EC2를 포함하며, 보다 바람직하게는 EC1, EC2, EC3, EC4 및 EC5를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 분자에 포함된 트랜스멤브레인 도메인은, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 및 HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, 콜라겐, OCIL의 트랜스멤브레인 도메인과 같은 NKIR천연 리간드의 트랜스멤브레인 도메인으로부터 선택되는 단백질의 트랜스멤브레인 도메인이다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 트랜스멤브레인 도메인은 CD8α, CD4, CD28 및 CD278의 트랜스멤브레인 도메인으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 트랜스멤브레인 도메인은 서열번호 9 또는 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 분자에 포함된 공동자극 도메인은, LTB, CD94, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54, CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM, ZAP70 및 이들의 조합으로부터 선택되는 단백질의 공동자극 신호 전달 도메인이다. 바람직하게, 본 발명의 공동자극 도메인은 4-1BB, CD28, CD27, OX40, CD278 또는 이들의 조합으로부터 유래된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 서열번호 13 또는 15로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 분자는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하지 않는다. 다른 일 실시형태에 있어서, NK억제 분자는 세포 내 신호 전달 도메인을 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 선택되는 단백질의 신호 전달 도메인이다. 바람직하게, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3ζ의 신호 전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 서열번호 17 또는 19로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
본 발명은 상기 NK억제 분자를 코딩하는 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 벡터를 더 제공한다.
제2양태에 있어서, 본 발명은, (1) 본 발명의 NK억제 분자를 발현하고, (2) 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체를 추가로 발현하고, 상기 키메라 항원 수용체는 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은, (1) 본 발명의 NK억제 분자 및 키메라 항원 수용체의 융합 단백질을 발현하되, 상기 융합 단백질은 NK억제 리간드, 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, (2) 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, MHC관련 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAPI, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 추가로 포함하고, 상기 TCR/CD3 유전자는 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 조작된 면역 세포의 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자와 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되도록 하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자는 TRAC, TRBC 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 적어도 하나의 MHC관련 유전자는 B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, 및 B2M의 발현이 억제되거나 침묵된다. 일 실시형태에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, 및 CIITA의 발현이 억제되거나 침묵된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, B2M 및 CIITA의 발현이 억제되거나 침묵된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, B2M 및 RFX5의 발현이 억제되거나 침묵된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조작된 면역 세포는, CD52, GR, dCK, 및 PD1, LAG3, TIM3, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3과 같은 면역 체크포인트 유전자로부터 선택되는 하나 또는 다수의 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 상기 조작된 면역 세포의 CD52, dCK, PD1, LAG3, TIM3, CTLA4, TIGIT 또는 이들의 조합이 억제되거나 침묵된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 리간드 결합 도메인은, TSHR, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD23, CD24, CD25, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD46, CD47, CD52, CD54, CD56, CD70, CD73, CD80, CD97, CD123, CD22, CD126, CD138, CD 179a, DR4, DR5, TAC, TEM1/CD248, VEGF, GUCY2C, EGP40, EGP-2, EGP-4, CD133, IFNAR1, DLL3, kappa경쇄, TIM3, tEGFR, IL-22Ra, IL-2, ErbB3, ErbB4, MUC16, MAGE-A3, MAGE-A6, NKG2DL, BAFF-R, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린(mesothelin), IL-1 1Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, AFP, Folate 수용체α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CS1, CD138, NCAM, 클라우딘(Claudin)18.2, Prostase, PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제(tyrosinase), EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산(polysialic acid), PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인(legumain), HPV E6, E7, MAGE-A4, MART-1, WT-1, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제(telomerase), PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린Bl(Cyclin Bl), MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제(intestinal tract carboxylesterase), mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, NKG2D, NKG2DL 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 타겟과 결합된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 B세포, T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 또는 NKT세포이다. 바람직하게, 상기 조작된 면역 세포는 T세포이고, 예를 들어, CD4+/CD8+T세포, CD4+헬퍼T 세포(예를 들어, Thl 및 Th2세포), CD8+T세포(예를 들어, 세포 독성 T세포), 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포(Naive T Cell), γδ-T세포, αβ-T세포이다.
다른 하나의 양태에서, 본 발명은 활성제인 본 발명에 따른 NK억제 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 조작된 면역 세포, 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 본 발명에 따른 NK억제 분자, 핵산 분자, 벡터, 조작된 면역 세포 또는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암, 감염 또는 자가면역 질환에 걸린 피험자를 치료하는 방법을 더 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 암, 감염 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약물 제조에서의 NK억제 분자, 핵산 분자, 벡터, 조작된 면역 세포의 용도를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 암은 고형 종양 또는 혈액 종양이다. 구체적으로, 상기 암은, 뇌 신경교종, 모세포종, 육종, 백혈병, 기저세포암, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암(choriocarcinoma), 결장 및 직장암, 결합조직암(connective tissue cancer), 소화기 계통의 암(cancer of digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암, 교모세포종(GBM), 간암, 간세포종양, 상피내종양, 신장암, 후두암, 간종양, 폐암, 림프종, 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기 계통의 암, 타액샘 암종(salivary gland cancer), 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기 계통의 악성 종양, 외음부암 및 기타 암 및 육종, 및 B세포 림프종, T세포 림프종, 외투세포 림프종, AIDS관련 림프종, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), B세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 종양, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 림프 증식 질환(malignant lymphoproliferative disorder), MALT 림프종, 털세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성(myelodysplasia), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 전백혈병, 형질세포양 수지상 세포 종양, 및 이식후 림프세포증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD)으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 감염은 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충에 의해 유발되는 감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제I형 당뇨병, 셀리악병, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 애디슨병, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염(hashimoto thyroiditis), 중증 근무력증, 혈관염, 악성빈혈 및 전신홍반루푸스 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 다음과 같은 장점이 있다. NK억제 리간드만을 발현하는 것과 비교하여, 본 발명의 NK억제 분자는 공동자극 도메인을 더 포함하고, 이는 피험자 체내의 조작된 면역 세포에 대한 NK세포의 살상을 추가로 감소/억제하며, 더 나아가, NK억제 분자가 세포 내 신호 전달 도메인을 포함할 경우, 피험자 체내의 NK세포에 대한 조작된 면역 세포 살상을 증강시켜, HvGD 위험을 더 잘 감소시키고, 진정한 동종 이식(allogeneic transfusion)을 구현할 수 있다.
도 1은 EO-UNKi-T 및 E28-UNKi-T세포에서의 HLA-E의 발현 수준을 나타낸다.
도 2는 GO-UNKi-T 및 G28-UNKi-T세포에서의 HLA-G의 발현 수준을 나타낸다.
도 3은 ECadO-UNKi-T 및 ECad28-UNKi-T세포에서의 E-카드헤린의 발현 수준을 나타낸다.
도 4는 A28-UNK1-T세포에서의 NKG2AscFv의 발현 수준을 나타낸다.
도 5는 NK92-KLRG1세포에서의 KLRG1의 발현 수준을 나타낸다.
도 6은 NK세포 살상 작용에 대한 본 발명의 UNKi-T세포의 억제 효과를 나타낸다. 투-웨이(Two-way) ANOVA로 분석하고, T test로 통계적 분석을 수행하였다. *는 P값이 0.05 미만임을 나타내고, **는 P값이 0.01 미만임을 나타내며, ***는 P값이 0.001 미만으로 유의한 수준에 도달했음을 의미한다.
도 7은 A28z-UNKi-T세포에서의 NKG2AScFv의 발현 수준을 나타낸다.
도 8은 E28z-UNKi-T세포에서의 HLA-E의 발현 수준을 나타낸다.
도 9는 NK세포에 대한 본 발명의 UNKi-T세포의 살상 효과를 나타낸다. Two-way ANOVA로 분석하고, T test로 통계적 분석을 수행하였다. *는 P값이 0.05 미만임을 나타내고, **는 P값이 0.01 미만임을 나타내며, ***는 P값이 0.001 미만으로 유의한 수준에 도달했음을 의미한다.
도 10은 본 발명의 UNKi-T세포와 NK세포를 공동배양한 후의 IFN-Y 방출 정도를 나타낸다. Two-way ANOVA로 분석하고, T test로 통계적 분석을 수행하였다. ***는 P값이 0.001 미만으로 유의한 수준에 도달했음을 의미한다.
도 11은 본 발명의 KIRG4-UNKi-T세포에서의 KIRscFv의 발현 수준을 나타낸다.
도 12는 LIRG4-UNKi-l-T 및 LIRG4-UNKi-2-T세포에서의 LIR1scFv의 발현 수준을 나타낸다.
도 13은 NK세포 살상 작용에 대한 본 발명의 UNKi-T세포의 억제 효과를 나타낸다.
도 14는 SC7G4-T세포, SC7/SC9G4-T세포 및 K1G4-T세포에서의 scFv의 발현 수준을 나타낸다.
도 15는 NK세포 살상 작용에 대한 SC7G4-T세포, SC7/SC9G4-T세포 및 K1G4-T세포의 억제 효과를 나타낸다.
도 16은 PDL1-T세포에서의 PDL1의 발현 수준을 나타낸다.
도 17은 NK세포 증식에 대한 PDL1-T세포의 억제 효과를 나타낸다.
도 18은 NKi-B세포 및 NKi-Huh7세포에서의 KIRscFv의 발현 수준을 나타낸다.
도 19는 NK세포 살상 작용에 대한 NKi-B세포 및 NKi-Huh7세포의 억제 효과를 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
NK억제 분자
하나 또는 다수의 HLA-클래스 I 분자 발현이 감소되거나 제거된 세포는 NK세포에 의해 비자기로 인식되어, 살상의 타겟이 될 수 있다. 따라서, 상기 세포에서의 하나 또는 다수의 NK억제 분자의 발현은 이들이 NK세포 살상으로부터 보호되도록 할 수 있다.
따라서, 제1양태에 있어서, 본 발명은 하나 또는 다수의 NK억제 리간드, 트랜스멤브레인 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하고, 상기 NK억제 리간드는 NK억제 수용체(NK inhibitory receptor, NKIR)에 특이적으로 결합하여 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포에 대한 NK세포의 살상을 억제하도록 하는 NK억제 분자를 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "NK억제 리간드"는 NKIR와 결합되어 NK세포 기능(예를 들어, 살상 기능)을 억제할 수 있는 분자를 의미한다. 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKIR을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편, 또는 NKIR의 천연 리간드 또는 이들이 포함하는 NKIR 결합 단편이다. NKIR의 비제한적인 예시로, 면역 수용체 타이로신 기반 억제 모티프(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)를 갖거나 이에 결합하는 NK세포 표면 수용체를 포함한다. 이러한 수용체는 NKG2/CD94성분(예를 들어, NKG2A, NKG2B, CD94); 살상 세포Ig-유사 수용체(KIR) 패밀리 구성원(예를 들어, KIR2DL1, KKIR2DL2/3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2 및 KIR3DL3); 백혈구Ig-유사 수용체(LIR) 패밀리 구성원(예를 들어, LIR1, LIR2, LIR3, LIR5 및 LIR8); NK 세포 수용체 단백질 1(NKR-Pl) 패밀리 구성원(예를 들어, NKR-P1B 및 NKR-P1D); 면역 체크포인트 수용체(예를 들어, PD-1, TIGIT 및 CD96, TIM3, LAG3); 암배아 항원 관련 세포 부착 분자1(CEACAM1); 시알산 결합 면역글로불린형 렉틴(SIGLEC) 패밀리 구성원(예를 들어, SIGLEC7 및 SIGLEC9); 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); Ly49 패밀리 구성원(예를 들어, Ly49A, Ly49C, Ly49F, Ly49Gl 및 Ly49G4) 및 킬러 세포 렉틴 유사-수용체 G1(KLRG1)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKIR을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이고, 예를 들어, 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체 및 이들의 기능적 단편이다. 항체 또는 이의 기능적 단편의 예시로, 완전한 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv단편, scFv항체 단편, 선형 항체(linear antibody), sdAb (VH 또는 VL), 나노 항체(Nanobody, Nb) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 바람직하게는 Fab, scFv, sdAb 및 나노 항체로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKG2A/CD94성분을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 NKG2A, NKG2B 또는 CD94를 타겟팅하는 항체이다. NKG2/CD94은 CD94가 이황화 결합을 통해 다른 하나의 NKG2서브유닛에 결합되어 구성된 헤테로다이머이다. CD94의 세포질 영역은 7개의 아미노산 잔기만을 가지고 있고, 신호를 전달하는 구조를 가지고 있지 않다. NKG2 패밀리는 NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2D, NKG2E, NKG2F 등 구성원을 포함하고, 여기서, NKG2A 및 NKG2B는 높은 상동성을 갖는 동일한 유전자의 다른 스플라이소좀(spliceosome)이다. NKG2A/2B의 세포질 영역의 테일부(cytoplasmic region tail)에는 2개의 ITIM을 포함하고, SHP1 또는 SHP-2를 동원하여 억제 신호를 전달한다. NKG2A/2B의 천연 리간드는 HLA-E이다. NKG2A/2B가 리간드에 결합하는 친화력이 활성화 수용체NKG2C보다 높으므로, NK세포의 억제 수용체와 활성화 수용체 모두가 HLA-E를 발현하는 타겟 세포에 결합할 수 있는 경우, 억제적인 NKG2A/CD94가 우세하게 되어 궁극적으로 NK세포 활성을 억제한다. 당업자에게 잘 알려진 NKG2A항체는 본 발명에 사용될 수 있으며, 예를 들어, Z270(프랑스 이뮤노텍(Immunotech, France)으로부터 구입될 수 있음), Z199(미국 벡크만쿨터(BeckmanCoulter, USA) 로부터 구입될 수 있음), 20D5(미국 BDBiosciences Pharmingen으로부터 구입될 수 있음), P25(이탈리아 Morettaetal, Univ.Genova로부터 구입될 수 있음)등 일 수 있다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKG2A를 타겟팅하는 항체이고, (1) 서열번호 72로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 73으로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 74로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 75로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 76으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 77로 표시되는 CDR-H3, 또는 (2) 서열번호 78로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 79로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 80으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 81로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 82로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 83으로 표시되는 CDR-H3을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKG2A를 타겟팅하는 항체이고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 3, 7 또는 68로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 5, 67로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 서열번호 1 및 3을 포함하는 항NKG2A항체, 서열번호 5 및 7을 포함하는 항NKG2A항체, 또는 서열번호 67 및 68을 포함하는 항NKG2A항체이다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 KIR을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. KIR분자는 I형 막 관통 단백질이고, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며, 그 구조는 막외 영역, 막관통 영역 및 세포질 영역을 포함한다. 막외 영역에 포함된 Ig유사 도메인의 수에 따라, KIR는 KIR2D 및 KIR3D 서브패밀리로 나눌 수 있다. 세포질 영역의 길이에 따라, KIR은 롱폼(long forms)(L) 및 숏폼(short forms)(S)으로도 나뉠 수 있고, 예를 들어, KIR2DL, KIR2DS, KIR3DL, KIR3DS일 수 있다. 여기서, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3의 세포질 영역은 2개의 면역 수용체 타이로신 기반 억제 모티프 (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)를 포함하고, KIR2DL5의 세포질 영역은 1개의 ITIM을 포함하며, 억제 KIR수용체에 속한다. 구체적으로, 억제 KIR수용체의 세포질 영역에 포함된 ITIM가 인산화될 때 포스파타제 SHP1 및 SHP2를 동원하여, 세포 기질(cellular substrate)의 탈인산화를 유도함으로써, 궁극적으로 세포 독성 작용 및 사이토카인의 분비와 같은 NK세포의 효능(effector functions)을 억제하거나 종료한다. KIR은 대부분의 NK 세포에서 발현되나, 상이한 개체에서 발현되는 수준은 개체마다 상이하다. 심지어 동일한 개체에서, 상이한 NK세포가 발현하는 KIR 유형이 상이할 뿐만 아니라, 동일한 NK세포도 여러가지 상이한 KIR 분자를 발현할 수 있다. KIR의 인식 리간드는 전형적인 HLA-클래스 I 분자이고, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 일부 다형성 에피토프(polymorphic epitopes)를 포함한다. 예를 들어, KIR3DL2는 HLA-A대립유전자-A3 및 -A11을 인식하고, KIR3DL1은 HLA-Bw-4를 인식하며, KIR2DL1은 HLA-Cw2, HLA-Cw4 및 HLA-Cw6아이소타입(isoforms)을 인식한다. KIR의 마우스 상동체는 gp49Bl이고, 길이는 335개 아미노산이며, 세포질 영역에 2개의 ITIM 구조를 포함한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, KIR을 타겟팅하는 항체는, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DL5 및 gp49B1로부터 선택되는 하나 또는 다수의 타겟을 타겟팅하는 항체이다. 당업자에게 잘 알려진 KIR항체는 본 발명에 사용될 수 있으며, 예를 들어, GL183(KIR2DL2/L3을 타겟팅하고, 프랑스 이뮤노텍 및 미국 벡크만쿨터로부터 구입될 수 있음), EB6(KIR2DL1을 타겟팅하고, 프랑스 이뮤노텍 및 미국 벡크만쿨터로부터 구입될 수 있음), AZ138(KIR3DL1을 타겟팅하고, 이탈리아 Morettaetal, Univ.Genova으로부터 구입될 수 있음), Q66(KIR3DL2을 타겟팅하고, 프랑스 이뮤노텍으로부터 구입될 수 있음), Z27(KIR3DL1을 타겟팅하고, 프랑스 이뮤노텍 및 미국 벡크만쿨터로부터 구입될 수 있음) 등일 수 있다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 KIR을 타겟팅하는 항체이고, 서열번호 84로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 85로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 86으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 87로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 88로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 89로 표시되는 CDR-H3을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 KIR을 타겟팅하는 항체이고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 58로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 서열번호 58 및 서열번호 59를 포함하는 항KIR항체이고, 그 아미노산 서열은 예를 들어 서열번호 57 또는 60으로 표시된다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 LIR을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. LIR은 면역글로불린 유사 전사체(Immunoglobulin-like transcripts, ILT) 또는 단핵구-대식세포 억제 수용체(Monocyte-macrophage inhibitory receptor, MIR)로도 지칭된다. LIR 패밀리에는 8개의 구성원을 포함하고, LIR1(ILT2라고도 함), LIR2(ILT4라고도 함), LIR3(ILT5라고도 함), LIR5(ILT3라고도 함) 및 LIR8의 세포질 영역에는 2-4개의 ITIM구조를 포함하며, 여기서 적어도 하나는 VXYXXL/V모티프이고, 억제 LIR수용체에 속한다. 이미 보고된 바에 따르면, LIR-1은 HLA-클래스 I 분자를 발현하는 타겟 세포에 대한 NK세포주NKL의 살상 및 CD16에 의해 매개되NKL의 활성화를 억제할 수 있다. 마우스에서 LIR의 상동체(Homologue)는 PIR(PairedIg-like receptor)이고, PIR-A 및 PIR-B를 포함하며, 여기서, PIR-A는 FcRγ 동종 이량체의 도움으로 활성화 신호를 전달하고, PIR-B는 이의 세포질 영역에 포함된 4개의 ITIM 구조를 통해 억제 신로를 전달한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 LIR1, LIR2, LIR3, LIR5, LIR8 또는 PIR-B를 타겟팅하는 항체이다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 LIR1을 타겟팅하는 항체이고, (1) 서열번호 90으로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 91로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 92로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 93으로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 94로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 95로 표시되는 CDR-H3, 또는 (2) 서열번호 96으로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 97로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 98로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 99로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 100으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 101로 표시되는 CDR-H3을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 LIR1을 타겟팅하는 항체이고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 61 또는 65로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 62 또는 64로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 항LIR1항체이고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 66으로 표시된다. 본 분야에 공지된 LIR 패밀리 구성원을 타겟팅하는 기타 항체도 본 발명에 사용될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 면역 체크포인트 수용체(예를 들어, PD-1, TIGIT, CD96, TIM3, LAG3)를 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK의 억제 리간드는 PD-1을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. PD-1은 활성화된 NK세포에서 주로 발현되고, CD28 패밀리 구성원에 속하며, 268개의 아미노산으로 구성된 I형 막관통 당단백질이다. 그 구조는 주로 세포외 면역글로불린 가변영역(IgV) 유사 구조, 소수성 막관통 영역 및 세포내 영역을 포함한다. 세포질 영역의 테일부에는 2개의 독립적인 아미노산 잔기가 있고, 질소 말단 티로신 잔기는 하나의 TIM 구성에 관여하고, 탄소 말단 티로신 잔기는 하나의 면역 수용체 티로신 전환 모티프(irnniunoreceptor tyrosine based switch motif, ITSM) 구성에 관여한다. PD-1이 이의 리간드(예를 들어, PD-L1 및 PD-L2)에 결합한 후, PD-1의 ITSM도메인의 티로신을 인산화시켜, 나아가 다운스트림 단백질키나제 Syk 및 PI3K의 탈인산화화를 유발하여, 다운스트림AKT, ERK 등 경로의 활성화를 억제함으로써, 궁국적으로 NK의 활성을 억제한다.
하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 TIGIT를 타겟팅하는 항체 또는 기능적 단편이다. TIGIT는 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원이고, 이는 세포 외 면역글로불린 가변 영역(IgV) 도메인, I형 트랜스멤브레인 도메인, 및 ITIM와 면역글로불린 티로신 테일(immunoglobulin tyrosine tail, ITT)모티프를 갖는 세포 내 도메인으로 구성된다. 리간드(예를 들어, CD155, CD112, CD113)에 결합된 후, 세포 내 억제 신호의 전달을 유발하여, NK세포의 활성을 억제할 수 있다.
하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 LAG3을 타겟팅하는 항체 또는 기능적 단편이다. LAG3은 단백질Ig 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이는 I형 막 관통 단백질이고, 활성화된 T세포, NK세포, B세포 및 형질세포양 수지상 세포에서 발현된다. LAG3의 4개의 IgG 도메인은 CD4 분자와 높은 구조적 상동성(structural homology)을 가지나, 아미노산의 상동성은 20% 미만이다. 연구에 따르면, LAG3은 T세포 및 NK세포의 증식 및 장기 기억에 대해 음성 조절 작용이 있는 것으로 나타났다. 이의 리간드(예를 들어, FGL1)에 의해 활성화 되면, 종양 세포 등 "나쁜 세포"가 면역계의 살상으로부터 도피할 수 있다.
하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 TIM3을 타겟팅하는 항체 또는 기능적 단편이다. TIM3은 TIM 패밀리의 하나의 수용체 단백질이고, T세포, Treg세포, 선천 면역 세포(수지상 세포, 자연 살해 세포, 단핵구)의 표면에서 발현된다. TIM 패밀리 구성원은 3개의 유전자에 의해 코딩되며, 구체적으로 HAVCR1이 TIM1을 코딩하고, HAVCR2이 TIM3을 코딩하며, TIMD4이 TIM4를 코딩한다. TIM3에는 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 갈렉틴9(galectin-9 또는 Gal-9), HMGB1 및 CEACAM-1 등과 같은 다양한 리간드가 있다. NK세포에서 발현될 때, TIM3은 기능 장애인 NK세포의 마커로 간주될 수 있고, TIM3의 차단은 NK세포의 기능 장애를 역전시키는 것으로 증명되었다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKR-P1을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. NKR-P1은 II형 막관통 당단백질에 속하고, 인간, 마우스 및 래트 NK세포에서 모두 발현되었다. 현재, 마우스의 6개의 NKR-P1 구성원을 발견하였고, 각각 NKR-P1A, NKR-P1B, NKR-P1C, NKR-P1D, NKR-P1E, NKR-P1F이며, 인체에서는 NKR-P1A(CD161라고도 함)만을 발견하였다. NKR-P1분자 세포 외 영역은 C형 렉틴 유사 슈퍼패밀리(C-type lectin-like superfamily)의 NK수용체 도메인(NKD)에 속하며, 구조 상에서 Ly49, Cd69, CD94/NKG2분자와 유사하다. NKR-P1은 동종 이량체 형태로 주로 존재하지만, 인간NKR-P1A는 단량체 형태로 존재할 수 있다. NKR-P1 패밀리 분자의 세포질 영역은 상이한 종에 따라 구조가 상이하고, 예를 들어, NKR-P1B 및 NKR-P1D의 세포질 영역은 ITIM모티프를 함유하며, 티로신이 인산화된 후 SHP-1을 동원하여 억제 신호를 전달하고, NKR-P1C는 막관통 영역의 양전하를 띈 아미노산을 통해 Fc수용체에 결합함으로써, Syk를 동원하여 활성화 신호를 전달한다. 따라서, 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 NKR-P1B 또는 NKR-P1D를 타겟팅하는 항체이다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 CEACAM1을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. CEACAM1은 CD66a, 담즙 당단백질(BGP) 또는 C-CAM1라고도 하고, 암배아항원(CEA) 유전자 패밀리의 구성원이며, 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리에 속한다. 활성화된 NK세포에서, CEACAM1 발현은 상향 조절되고, 이의 동종친화 상호작용(hemophilic interaction)은 림프구 세포 독성 효과를 억제한다. CEACAM1은 CD66a(CEACAM1), CD66c(CEACAM6) 및 CD66e(CEACAM5, CEA) 단백질을 포함하는 기타 알려진 CEACAM 단백질과 상호작용한다. 인간에서, 현재까지 11개의 서로 상이한 CEACAM1스플라이스 변이체(splice variants)가 검측되었다. CEACAM1 아이소타입의 명명은 세포 외 면역글로불린-유사 도메인의 수(예를 들어, 4개 cell 외 면역글로불린 유사 도메인을 갖는 CEACAM1을 CEACAM1-4라고 함), 세포질 테일(cytoplasmic tail) 길이(예를 들어, 긴 세포질 테일을 갖는 CEACAM1-4를 CEACAM1-4L라고 하고, 짧은 세포질 테일을 갖는 CEACAM1-4를 CEACAM1-4S라고함)와 관련이 있다. CEACAM1의 N-말단 도메인은 시그널 펩타이드 바로 뒤에서 시작되고, 그 구조는 IgV-형으로 간주된다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 SIGLEC를 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. 인간에서 16가지의 SIGLEC 단백질을 동정해냈고, 마우스에서 9가지의 SIGLEC단백질을 동정해냈으며, 상기 SIGLEC 단백질은 아미노산 말단 V-형 도메인을 포함하는 2-17개 cell 외 Ig도메인으로 구성되고, 상기 V-형 도메인은 시알산 결합 부위(sialic acid binding site)를 포함한다. 통상적으로 Siglec는, Siglecl, Siglec2, Siglec4 및 Siglecl5로 구성된 제1 서브세트, 및 Siglec3, Siglec5, Siglec6, Siglec7, Siglec8, Siglec9, Siglec10, Siglec11, Siglec12, Siglec14 및 Siglec16을 포함하는 CD33와 관련된 제2 서브세트 두 개의 그룹으로 나뉜다. Siglec7은 p75, CD328 또는 AIRM이라고도 불리우고, 세포 외 N-말단 Ig 유사 V-형 도메인, 2개의 Ig유사 C2-형 도메인 및 하나의 ITIM모티프와 하나의 ITIM유사 모티프를 함유하는 세포질 내 영역을 포함한다. Siglec7은 NK세포, 수지상 세포, 단핵구 및 호중성 과립구에서 구성적으로 발현된다. Siglec7은 NK세포에 의해 매개되는 종양 제거에 대해 억제 작용이 있는 것으로 관찰되었다. Siglec9의 구조는 Siglec7와 매우 유사하고, 이들의 N-말단 V-그룹 Ig도메인(N-terminal V-group Ig domains)은 약 77%의 총 아미노산 서열 상동성을 가지며, 상이한 시알산 결합 특이성을 나타낸다. NK세포의 기능 연구에 비추어 보면, Siglec9 결합 시알산 리간드를 발현하는 종양 세포가 NK세포 활성화 및 종양 세포 살상을 억제한다는 것이 입증되었다. 많은 인간 종양에서는 Siglec9에 결합되는 시알산 리간드가 안정적으로 상향 조절되는데, 이를 통해 종양이 면역을 도피하여 암으로 진행된다.
하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 Siglec7 또는 Siglec9를 타겟팅하는 항체이고, 예를 들어, 본 분야에 공지된 것들이다. 예를 들면, 항Siglec7항체는 인간 유래 Siglec7/CD328항체(AF1138, R&D Systems), 클론#194212(MAB1138, R&D Systems), 클론#194211(MAB11381, R&D Systems), 클론Z176(A22330, BeckmanCoulter), 6-434(339202, Biolegend), REA214(Miltenyl Biotec), S7.7(MCA5782GA, BioRad), 10B2201(MBS604764, MyBioSource), 8D8(MBS690562, MyBioSource), 10B2202(MBS608694, MyBioSource), 5-386(MBS214370, MyBioSource)일 수 있다. 항Siglec9항체는 인간 유래 MAB1139(클론#191240, R&D Systems), AF1139(R&D Systems), D18(SC-34936, Santa Cruz Biotechnology), Y-12SC34938(SC3-4938, Santa Cruz Biotechnology), AB197981(Abeam), AB96545(Abeam), AB89484(클론#MM0552-6K12, Abeam), AB130493(Abeam), AB117859(클론#3G8, Abeam), E10-286(Becton Dickinson)일 수 있다. Siglec7 및 Siglec9의 세포 외 구조에서의 유사성을 감안하면, 둘 모두를 동시에 타겟팅하는 항체를 본 발명의 NK억제 리간드로 사용할 수도 있다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 SIGLEC7, SIGLEC9 또는 두가지 모두를 타겟팅하는 항체이고, (1) 서열번호 102로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 103으로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 104로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 105로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 106으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 107로 표시되는 CDR-H3, (2) 서열번호 122로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 123으로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 124로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 125로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 126으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 1277로 표시되는 CDR-H3, (3) 서열번호 131로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 132로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 133으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 134로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 135로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 136으로 표시되는 CDR-H3, (4) 서열번호 140으로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 141로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 142로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 143으로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 144로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 155로 표시되는 CDR-H3, (5) 서열번호 176으로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 177로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 178로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 179로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 180으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 181로 표시되는 CDR-H3, 또는 (6) 서열번호 188로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 189로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 190으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 191로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 192로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 193으로 표시되는 CDR-H3을 포함한다. 상기 항체(1)-(4)는 SIGLEC7을 타겟팅하고, 항체(5)-(6)는 SIGLEC7 및 SIGLEC9 모두를 동시에 타겟팅 한다. 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 SIGLEC7, SIGLEC9 또는 두가지 모두를 타겟팅하는 항체이고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 108, 128, 137, 146, 182, 185 또는 194로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 109, 129, 138, 147, 183, 186 또는 195로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 항SIGLEC7, SIGLEC9 또는 둘 모두에 대한 항체이고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 110, 130, 139, 148, 184, 187 또는 196으로 표시된다. 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 LAIR1을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. LAIR1은 10개의 엑손을 함유하고, 287개의 아미노산으로 구성된 I형 막관통 당단백질을 코딩하며, 단일 세포 외 C2형 Ig유사 도메인을 포함하고, 이에 이어 단일 트랜스멤브레인 도메인에 연결되는 스템 영역(stem region) 및 억제신호를 전달하는 2개의 ITIM모티프이다. LAIR1은 구조상에서 LIR 및 KIR 패밀리 구성원과 어느 정도 상동성을 가지고, 이는 이러한 분자들이 동일한 조상 유전자로부터 유래될 수 있음을 나타낸다. LAIR1은 T세포, B세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포 및 수지상 세포 및 인간CD34+세포를 비롯한 조혈 전구 세포에서 발현된다. ITIM모티프의 존재로 인해, 지금까지 인간 및 마우스 체내의 연구에서 LAIR1이 면역 억제 작용을 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 추가 연구에 따르면, LAIR1은 정지 NK세포(static NK cells)를 억제할 뿐만 아니라, 활성화 NK세포의 타겟 세포에 대한 살상도 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 Ly49를 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. Ly49는 II형 막관통 당단백질이고, 이황화 결합을 통해 연결되어 동종 이량체를 형성함으로써, 인간KIR과 유사한 기능을 발휘할 수 있고, 즉, MHC-클래스 I 분자 리간드와의 상호작용을 통해 신호를 전달하여, NK세포의 활성을 조정한다. 지금까지 마우스Ly49 패밀리에는 11개의 구성원이 포함되는 것으로 밝혀졌고, 각각 Ly49A, Ly49B, Ly49C, Ly49D, Ly49E, Ly49F, Ly49G, Ly49H, Ly49I, Ly49P, Ly49Q이다. 여기서, Ly49A, Ly49C, Ly49F, Ly49G 및 Ly49Q는 모두 세포질 영역에 ITIM모티프를 함유하여, 티로신 키나아제SHP-1와 결합하여 이를 활성화시키고, 인산화 티로신의 생성을 간섭하여 NK세포의 활성화를 억제한다. 따라서, 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 Ly49A, Ly49C, Ly49F, Ly49G 또는 Ly49Q를 타겟팅하는 항체이다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 KLRG1을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이다. KLRG1은 T세포 및 NK세포의 활성을 조절하는 II형 막 관통 단백질 표면 공동 억제 수용체(type II transmembrane protein surface co-inhibitory receptor)이다. 이의 세포 외 부분은 C형 렉틴 도메인을 포함하고, 알려진 리간드는 카드헤린이며, 또한, 이의 세포 내 부부은 면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프(TTIM) 도메인을 포함한다. C형 간염 환자의 말초혈액 NK세포에서의 KLRG1수용체 발현은 NK세포 수 감소와 기능 손상을 촉진할 수 있다고 문헌에 보고된 바 있으며, 그 기전은 주로 NK세포의 증식을 억제하고, NK세포의 사멸을 촉진하며, NK세포 염즘 사이토카인의 방출을 감소시키는 것이다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 KLRG1을 타겟팅하는 항체이고, (1) 서열번호 111로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 112로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 113으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 114로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 115로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 116으로 표시되는 CDR-H3, (2) 서열번호 149로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 150으로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 151로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 152로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 153으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 154로 표시되는 CDR-H3, (3) 서열번호 158로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 159로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 160으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 161로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 162로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 163으로 표시되는 CDR-H3, 또는 (4) 서열번호 167로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 168로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 169로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 170으로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 171로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 172로 표시되는 CDR-H3을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 KLRG1을 타겟팅하는 항체이고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 117, 155, 164 또는 173으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 상기 중쇄 가변 영역서열번호 118, 156, 165 또는 174로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 항KLRG1항체이고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 119, 157, 166 또는 175로 표시된다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 NKIR천연 리간드 또는 이들이 포함하는 NKIR 결합 영역(예를 들어, 세포 외 영역)이고, 이러한 천연 리간드는 비전형적인 HLA-클래스 I 분자(예를 들어, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G), 카드헤린(Cadherin), 콜라겐, OCIL, 시알산, 면역 체크포인트 리간드(예를 들어, PD-L1/PD-L2, CD155, CD112, CD113, Gal-9, FGL1) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 비전형적인 HLA-클래스 I 분자 또는 이의 세포 외 영역이고, 보다 바람직하게는, 비전형적인 HLA-클래스 I 분자의 a1 및 a2 도메인이다. 비전형적인 LA-클래스 I 분자는 동일한 염색체 영역 6p21.3(6번 염색체 쇼트암(short arm))에 위치되고, 비공유 결합에 의해 결합된 중쇄(α사슬) 및 경쇄(β사슬, B2M유전자에 의해 코딩)로 구성된다. α사슬은 세포 외 영역(α1, α2, α3 3개의 도메인을 포함), 트랜스멤브레인 도메인 및 세포질 영역의 3개 부분을 포함하고, 여기서, α1 및 α2는 항원 결합 홈을 형성하여, 홈으로 들어가는 항원 펩타이드에 대한 결합을 담당하며, α3은 면역글로불린의 불변영역 도메인과 상동한 것으로, T세포 표면 분자CD8와 결합한다. 비전형적인 HLA-클래스 I 분자는 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G 3개의 구성원을 포함한다. HLA-E는 NK세포 표면의 CD94/NKG2수용체와 결합하여, NK세포 활성을 조절한다. HLA-E의 기능은 클래스 I HLA분자(HLA-A, HLA-B, HLA-C 및HLA-G)의 선도 서열로부터 유래된 펩타이드에 결합하고, 억제 수용체CD94/NKG2A와의 상호작용을 통해 이들을 NK세포로 전달하여, 클래스 I HLA분자를 정상 수준으로 발현하는 세포에 대한 NK세포의 용해를 억제하는 것이다. 생리학적 조건에서 HLA-E의 억제 수용체CD94/NKG2A에 대한 친화력은 이와 활성화성 수용체CD94/NKG2C사이의 친화력보다 현저하게 높기 때문에, HLA-E의 발현 수준의 상향 조절은 NK세포 살상 작용으로부터 타겟 세포를 보호할 수 있다. HLA-F는 NK억제 수용체ILT2 및 ILT4와 결합할 수 있으며, 이러한 결합은 ILT2 및 ILT4항체에 의해 효과적으로 억제될 수 있다. 현재 HLA-F의 기능은 아직 연구 중이나, 이와 LT2 및 ILT4의 결합은 면역억제 효과가 있는 것으로 추측된다. HLA-G는 CD94/NKG2A, LIR-1, LIR-2, KIR2DL1 등과 같은 다양한 NK억제 수용체를 인식할 수 있다. 연구에 따르면 태아 세포 표면의 HLA-G분자가 모체NK세포 표면의 KIR와 결합하여, NK세포 살상 활성을 억제함으로써, HLA세미-이종 태아(HLA semi-heterologous fetus)대한 모체의 면역 내성을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이 외에, 흑색종, 육종, 림프종 등과 같은 고형 종양의 세포 표면에서 고도로 발현되는 HLA-G분자는 또한 종양 세포가 NK세포의 살상, 용해로부터 도피할 수 있도록 한다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 HLA-E세포 외 영역이고, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 또는 이의 코딩 서열은 서열번호 32로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다. 다른 일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 HLA-E세포 외 영역의 변이체(Y84C 돌연변이 포함)이고, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 또는 이의 코딩 서열은 서열번호 34로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 HLA-G세포 외 영역이고, 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 또는 이의 코딩 서열은 서열번호 36으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, 조작된 면역 세포의 내인성 B2M을 녹아웃시키고 NK억제 리간드로서 비전형적인 HLA-클래스 I 분자를 발현시켜야 하는 경우, 동의 돌연변이(즉, 뉴클레오티드 서열만이 변화되고 아미노산 서열 변화되지 않음)된 B2M유전자를 도입하여, 비전형적인 HLA-I분자와 복합체을 형성하여 억제 기능을 발휘해야 하는 동시에, 동의 돌연변이된 B2M유전자는 내인성B2M을 타겟팅하는 유전자 편집 도구에 의해 녹아웃되지 말아야 한다. 상기 실시형태에서, NK억제 리간드는 B2M 및 비전형적인 HLA-클래스 I 분자의 세포 외 영역의 융합 분자(fusion molecule)를 포함한다. 예를 들어, NK억제 리간드는 B2M 및 HLA-E세포 외 영역 또는 HLA-G세포 외 영역의 융합 분자를 포함한다. 하나의 구체적인 실시형태에서, NK억제 리간드는 B2M 및 HLA-E세포 외 영역의 융합 분자를 포함하고, 바람직하게, 상기 HLA-E세포 외 영역은 Y84C돌연변이(서열번호 33)를 포함한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 제시펩타이드(presenting peptide), 및 B2M와 HLA-E세포 외 영역의 융합 분자를 포함하고, 상기 제시펩타이드는 서열번호 46-53으로부터 선택된다. B2M유전자를 동의 돌연변이시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서, B2M은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고; 예를 들어, 동의 돌연변이된 B2M유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 38로 표시된다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 파골 세포 억제 렉틴(OsteOCILast inhibitory lectin, OCIL) 또는 이의 NKIR결합 영역이다. 마우스OCIL는, OCIL(Clr-b라고도 함), OCILrP1(Clr-d라고도 함) 및 mOCILrP2(Clr-g라고도 함)의 3개의 구성원을 포함한다. OCIL은 다양한 조직에서 광범위하게 발현되며, 발현 패턴은 MHC-클래스 I 분자와 유사하다. OCIL은 NKR-P1B/D의 리간드이다. 연구에 따르면, 종양 세포에서의 OCIL의 발현은 종양 세포에 대한 NK세포의 살상 작용을 억제할 수 있고, OCIL 특이적 항체는 이러한 억제 작용을 역전시킬 수 있는 것으로 나타났다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 카드헤린 또는 이의 세포 외 영역이고, 예를 들어, E-카드헤린(E-cad), N-카드헤린(N-cad) 또는 R-카드헤린(R-cad)이며, 바람직하게는 E-카드헤린의 세포 외 영역이다. 카드헤린은 주로 세포간 동종 접착(homogeneous intercellular adhesion)을 매개하는 칼슘 의존성 막 관통 단백질(calcium-dependent transmembrane proteins)이고, 이는 NK억제 수용체KLRG1에 결합된다. 카드헤린 분자는 I형 막단백질이고, 약 723-748개의 아미노산으로 구성되었으며, 구조적으로 리간드와의 결합을 담당하는 세포 외 영역, 막관통 영역 및 고도로 보존된 세포질 영역을 포함한다. 여기서, 세포 외 영역에는 여러 개의 카드헤린 반복 도메인(cadherin repeat domains, EC) 이 있으며, 4~5개의 아미노산 잔기로 구성된 반복서열을 포함하고, 리간드와의 결합을 담당한다. 인간 E-카드헤린은 CDH1유전자에 의해 코딩되고, 현재 가장 많이 연구되고 있는 카드헤린 패밀리 구성원이다. 따라서, 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드은 E-카드헤린의 세포 외 영역이고, EC1 및 EC2를 포함한다. 보다 바람직하게, NK억제 리간드는 E-카드헤린의 세포 외 영역이고, EC1, EC2, EC3, EC4 및 EC5를 포함한다. 보다 바람직하게, NK억제 리간드는 E-Cad이고, 서열번호 39 또는 41로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 또는 이의 코딩 서열은 서열번호 40 또는 42로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 콜라겐 또는 이의 NKIR결합 영역이고, 이는 LAIR1과 결합한다. 콜라겐 분자는 3가닥의 α사슬로 구성된 삼량체이며, 각 가닥의 α사슬은 모두 (글리신-프롤린-히드록시프롤린) n반복 서열을 포함한다. LAIR1은 Gly-Pro-Hyp반복 서열을 인식하고 이와 상호작용한다. 상기 반복 서열은 광범위하게 존재하기 때문에, LAIR1은 다양한 콜라겐 분자와 광범위하게 결합될 수 있으며, 예를 들어, 콜라겐 XVII, XIII, XXIII과 같은 막관통 콜라겐; 및 콜라겐 I, II, III 등과 같은 비막관통 콜라겐을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 종양 세포 또는 종양 간질 세포는 종종 다양한 콜라겐 분자를 고도로 발현하고, 이는 면역 세포 표면의 억제 수용체 LAIR1과 결합하여 면역 세포에 억제 신호를 전달하여, 면역 회피의 목적에 달성할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 시알산 또는 이의 NKIR결합 영역이고, 이는 SIGLEC 패밀리 구성원(예를 들어, SIGLEC7 및/또는 SIGLEC9)과 결합한다. 시알산은 척추동물의 선천적 면역계의 중요한 구성 부분이고, NK세포 살상 활성은 종양 세포 표면의 시알산화와 관련이 있다. 종양 세포의 시알산화는 종양 세포와 NK 세포 사이의 물리적 상호작용을 저해할 수 있을 뿐만 아니라, 이와 결합할 수 있는 종양 세포 표면에서의 활성화 리간드(activating ligands)를 차폐할 수도 있다. 이 외에, 종양 세포 표면의 시알산화는 종양 세포와 NK세포 사이의 면역 시냅스 형성을 차단하여, 종양에 대한 NK 세포의 살상 독성을 약화시킨다. 연구에 따르면, 종양 세표 표면의 시알산화는 Siglec에 의해 매개된 면역 억제 신호를 촉발하여 NK세포의 살상 활성을 억제할 수 있다. Siglec7은 대부분의 NK세포 표면에 발현되고, 종양 세포 표면의 β-2,8글리코시드 결합에 의해 연결된 시알산과 NK세포 표면의 Siglec7이 결합되면, NK세포의 활성화를 억제함으로써, 종양 세포가 NK세포에 의해 매개된 살상 기능으로부터 도피(escape)하도록 한다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 PD-L1/PD-L2 또는 이의 세포 외 영역이고, 이는 PD1에 결합된다. PD-L1은 항원 제시 세포(APC), 및 혈관 내피 세포, 췌도 세포와 면역 특권 부위(예를 들어, 태반, 고환 및 눈)와 같은 비조혈 세포에서 구성적으로 낮게 발현된다. I형 및 II형 인터페론, TNF-a 및 VEGF 등과 같은 염증성 사이토카인은 PD-L1의 발현을 유도할 수 있다. PD-L2는 활성화된 대식 세포 및 수지상 세포에서만 발현된다. 종양 세포 자체가 PD-L1의 발현을 상향조절할 수 있는 동시에, 종양 미세환경의 염증 인자도 PD-L1 및 PDL2의 발현을 유도할 수 있다. 종양 세포 표면에서 PD-L1 및 PD-L2의 발현이 상향 조절되면 PD-1에 의해 매개된 면역 억제 신호의 전달을 촉발하여 NK세포의 살상 활성을 억제할 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서, NK억제 리간드는 PD-L1세포 외 영역 또는 PD-L2 세포 외 영역이고, 서열번호 70 또는 71로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 CD155, CD112 또는 CD113 또는 이의 NKIR결합 영역이고, 이들은 모두 TIGIT에 결합된다. CD155는 TIGIT와 높은 친화력을 가지는 리간드이다. 종양 표면에서 고도로 발현된 CD155가 NK 표면의 TIGIT와 결합되면, 종양 세포에 대한 NK 세포의 살상 작용이 억제된다. CD112 및 CD113은 친화력이 상대적으로 약하나, 이들도 TIGIT에 결합된다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 갈렉틴9(Gal-9라고도 함) 또는 이의 NKIR결합 영역이고, 이는 TIM3에 결합된다. Gal-9는 많은 조혈 세포에서 광범위하게 발현 및 분비되는 C형 렉틴이며, 세포 표면 단백질의 탄수화물 부분에 결합될 수 있다. TIM3에서, Gal-9는 IgV도메인의 탄수화물 모티프에 결합되어, TIM3 양성 NK세포의 칼슘 유입과 세포 사망을 유도할 수 있다. 대량의 증명에 따르면, TIM3/Gal-9상호작용은 면역 반응의 억제에서 작용을 발휘하는 것으로 나타났다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 리간드는 FGL1 또는 이의 NKIR결합 영역이고, 이는 LAG3에 결합된다. FGL1은 피브리노겐 패밀리에 속하는 새롭게 발견된 LAG3의 리간드이지만, 이는 혈소판 결합 부위, 트롬빈 민감 부위 등과 같은 특징적인 도메인을 가지고 있지 않다. FGL1단백질은 주로 종양 세포에 분포되고, 종양 간질에서 낮게 발현된다. FGL1/LAG3 상호작용은 B7-H1/PD-1경로와 무관한 또 다른 종양 면역 회피 경로이고, 이 경로의 차단은 PD-1 경로의 차단과 상승 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스멤브레인 도메인"은 면역 세포(예를 들어, 림프구 또는 NKT세포) 표면에서 키메라 항원 수용체의 발현을 가능하게 하고, 타겟 세포에 대한 면역 세포의 응답을 가이드하는 폴리펩타이드 구조이다. 트랜스멤브레인 도메인은 천연 또는 합성일 수 있으며, 임의의 막 결합 단백질 또는 막 관통 단백질에서 유래된 것일 수도 있다. 키메라 항원 수용체와 타겟 항원이 결합될 때, 트랜스멤브레인 도메인은 신호를 전달할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 특히 적합한 트랜스멤브레인 도메인은, 예를 들어, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 및 비전형적인 HLA-클래스 I 분자(예를 들어, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G), 카드헤린(Cadherin), 콜라겐, OCIL등과 같은 NKIR천연 리간드로부터 유래된 트랜스멤브레인 도메인일 수 있다. 바람직하게, 트랜스멤브레인 도메인은 CD8α, CD4, CD28 및 CD278로부터 선택되는 트랜스멤브레인 도메인이다. 또는, 트랜스멤브레인 도메인은 합성된 것일 수 있으며, 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 트랜스멤브레인 도메인은 CD8α 또는 CD28로부터 유래되고, 보다 바람직하게, 서열번호 9 또는 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 또는 상기 트랜스멤브레인 도메인의 코딩 서열은 서열번호 10 또는 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 NK억제 분자는 NK억제 리간드와 트랜스멤브레인 도메인 사이에 위치하는 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "힌지 영역"은 일반적으로 트랜스멤브레인 도메인 내지 리간드 결합 도메인을 연결하는 역할을 하는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 구체적으로, 힌지 영역은 리간드 결합 도메인에 더 큰 유연성(flexibility)과 접근성(accessibility)을 제공하기 위해 사용된다. 힌지 영역은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10개 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25개 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 전체 또는 일부분이 천연분자로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 전체 또는 일부분이 CD8, CD4 또는 CD28의 세포 외 영역으로부터 유래되거나, 또는 전체 또는 일부분이 항체 불변 영역으로부터 유래된다. 또는, 힌지 영역은 천연적으로 존재하는 힌지 서열에 대응되는 합성 서열일 수 있거나, 완전 합성된 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 CD8α, CD28, FcγRIIIα수용체, IgG4 또는 IgG1의 힌지 영역 부분을 포함하고, 보다 바람직하게는 CD8α, CD28 또는 IgG4 힌지이고, 이는 SEQ ID NO 25, 27 또는 29로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, CD28 힌지의 코딩 서열은 서열번호 26, 28 또는 30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
본 발명의 NK억제 분자는 공동자극 도메인을 포함한다. 따라서, NK억제 리간드가 NKIR에 결합하는 경우, 한편으로, NKIR의 신호 전달 영역을 통해 억제 신호를 NK세포로 전달하여, 타겟 세포(예를 들어, 본 발명의 조작된 면역 세포)에 대한 살상을 감소시킬 수 있고; 다른 한편, NK억제 분자에 포함된 공동자극 도메인을 통해 자극 신호를 타겟 세포(예를 들어, 본 발명의 조작된 면역 세포) 내부로 전달하여, 증식 및 생존을 자극함으로써, NK세포의 살상에 대해 더 잘 저항하도록 할 수 있다. 이전의 연구에 따르면, 항체를 사용하여 NK세포NKG2A, KIR, ILT2 등 억제 수용체를 타겟팅하는 경우, HLA-E, HLA-G 등 억제 분자의 결합 부위에 경쟁하여 결합하거나 억제 효과를 중화하여, NK세포의 작용을 활성화시킬 수 있다. 반면, 본 발명은 NK억제 수용체를 타겟팅하는 NK억제 분자의 발현은 NK세포를 억제할 수 있음을 처음으로 발견하였다. 본 발명은 또한 공동자극 도메인을 포함하는 NK억제 분자는 공동자극 도메인을 포함하지 않은 NK억제 분자보다 NK세포의 살상 작용에 대한 억제 효과가 더 우수함을 발견하였다.
공동자극 도메인은 공동자극 분자로부터 유래된 세포 내 기능성 신호 전달 도메인일 수 있고, 상기 공동자극 분자의 전체 세포 내 부분 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다. "공동자극 분자"는 T세포에서 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T세포의 공동 자극 반응(예를 들어, 증식)을 매개하는 동족 결합파트너(homologous binding partner)를 지칭한다. 공동자극 분자는 클래스(Class) I MHC분자, BTLA 및 Toll리간드 수용체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 공동자극 도메인의 비제한적인 예시로, LTB, CD94, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54, CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM, ZAP70 및 이들의 조합으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 공동자극 신호 전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 공동자극 도메인은 4-1BB, CD28, CD27, OX40, CD278 또는 이들의 조합으로부터 유래되고, 보다 바람직하게는 4-1BB, CD28 또는 이들의 조합으로부터 유래된다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 공동자극 도메인은 서열번호 13 또는 15로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지거나, 또는 상기 공동자극 도메인의 코딩 서열은 서열번호 14 또는 16으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, NK억제 분자는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하지 않는다. 다른 일 실시형태에 있어서, NK억제 분자는 세포 내 신호 전달 도메인을 더 포함한다. 즉, NK억제 분자는 NK억제 리간드, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 상기 실시형태에서, NK억제 리간드와 NKIR의 결합은 공동자극 도메인과 세포 내 신호 전달 도메인을 통해 활성화 신호를 타겟 세포(예를 들어, 본 발명의 조작된 면역 세포)로 전달하여, NK세포에 대한 타겟 세포의 살상을 촉진함으로써, NK세포 살상 작용에 대한 억제 효과를 더욱 증가시킨다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 내 신호 전달 도메인"은 이펙터 기능 신호(effector function signal)를 전달하여 세포가 지정된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 지칭한다. 세포 내 신호 전달 도메인은 리간드 결합 도메인에 항원이 결합된 후의 세포 내 1차 신호를 전달하여, 면역 세포와 면역 반응을 활성화시키는 것을 책임지고 있다. 다시 말해서, 세포 내 신호 전달 도메인은 NK억제 분자를 발현하는 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나를 활성화시키는 것을 책임지고 있다. 예를 들어, T세포의 이펙터 기능은 세포 용해 활성 또는 보조 활성일 수 있고, 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 세포 내 신호 전달 도메인은, 항원 수용체 결합 후 함께 작용하여 1차 신호 전달을 일으키는 T세포 수용체 및 보조 수용체(co-receptor)의 세포질 서열, 및 이러한 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일하거나 유사한 기능을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다. 세포 내 신호 전달 도메인은 많은 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs, ITAM)를 포함할 수 있다. 본 발명의 세포 내 신호 전달 도메인의 비제한적인 예시로, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d와 같은 것들로부터 유래되는 것들을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명CAR의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함할 수 있고, 상기 신호 전달 도메인은 서열번호 17 또는 19로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지거나, 또는 이의 코딩 서열은 서열번호 18 또는 20으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 NK억제 분자는 T세포와 같은 세포에서 발현될 때, 초기 단백질이 소포체로 가이드된 후 세포 표면으로 가이드되도록 하는 시그널 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 시그널 펩타이드의 코어는 단일α-나선을 형성하는 경향이 있는 긴 소수성 아미노산 세그먼트를 포함할 수 있다. 시그널 펩타이드의 말단에는 통상적으로 시그널 펩티다아제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 세그먼트가 있다. 시그널 펩티다아제는 전위(transposition)되는 동안 또는 완료 후 절단되어, 유리된 시그널 펩타이드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 이 후, 유리된 시그널 펩타이드는 특정 프로테아제에 의해 소화된다. 본 발명에 사용 가능한 시그널 펩타이드는 B2M, CD8α, IgG1, GM-CSFRα로부터 유래된 것과 같은 당업자에게 잘 알려진 시그널 펩타이드이다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 사용 가능한 시그널 펩타이드는 서열번호 21 또는 23으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지거나, 또는 상기 시그널 펩타이드의 코딩 서열은 서열번호 22 또는 24로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진다.
적어도 하나의 MHC관련 유전자의 억제 또는 침묵
일 실시형태에 있어서, 상기 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 MHC관련 유전자 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함하고, 예를 들어, 적어도 하나의 MHC유전자의 발현이 억제되거나 침묵되거나, 또는 적어도 하나의 MHC유전자와 상호작용하거나 그 발현을 조절하는 유전자의 발현이 억제되거나 침묵된다.
주조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex, MHC)는 최초에 이식 반응에서 주요 역할을 하는 단백질로 특성화되었고, 모든 고등 척추동물의 표면에서 발현되며, 마우스에서는 H-2라고 하고, 인간의 세포에서는 HLA라고 한다. MHC는 주로 클래스 I 및 II 클래스 두가지 유형으로 나뉜다. 클래스(Class) I MHC단백질은 두가지 단백질의 헤테로다이머이고, 하나는 MHCI유전자에 의해 코딩된 막 관통 단백질 α사슬이며, 다를 하나는 MHC유전자 클러스터 내에 위치하지 않는 유전자에 의해 코딩된 세포 외 단백질의 β2마이크로글로불린 사슬이다. α사슬은 3개의 도메인을 포함하고, 외래 펩타이드는 N말단에서 2개의 가장 가변적인 도메인이기도 한α1, α2에 결합된다. 클래스(Class) II MHC단백질도 헤테로다이머이고, 2개의 MHC복합체 내의 유전자에 의해 코딩된 막 관통 단백질을 포함한다. 클래스(Class) I MHC/항원 복합체는 세포 독성 T세포와 상호 작용하는 반면, 클래스(Class) II MHC는 헬퍼 T 세포에 항원을 제시한다. 이 외에, 클래스(Class) I MHC단백질은 거의 모든 유핵 세포와 혈소판(및 마우스의 적혈구)에서 발현되는 경향이 있는 반면, 클래스(Class) II MHC단백질은 보다 선택적으로 발현된다. 통상적으로, 클래스(Class) II MHC단백질은 B 세포, 일부 대식세포 및 단핵구, 랑게르한스 세포 (Langerhans cell) 및 수지상 세포에서 발현된다.
인간의 클래스 I HLA유전자 클러스터(gene cluster)는 3개의 주요 유전자좌B, C 및 A를 포함한다. HLA-A, HLA-B 및 HLA-C는 클래스 I HLA 중쇄 파라로그이다. 클래스 I 분자는 MHCa 중쇄 (HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C에 의해 코딩) 및 경쇄(β-2마이크로글로불린, B2M에 의해 코딩)로 구성된 헤테로다이머이다. 중쇄는 막에 앵커링(nchoring)되고, 약 45kDa이며, 8개의 엑손을 포함한다. 엑손1은 선도 펩타이드(leader peptide)를 코딩하고, 엑손2 및 3은 α1 및 α2도메인을 코딩하며, 양자는 모두 펩티드에 결합되고, 엑손4는α3도메인을 코딩하며, 엑손5는 막관통 영역을 코딩하고, 엑손6 및 7은 세포질 테일부(cytoplasmic tail)를 코딩한다. 엑손2 및 엑손3 내의 다형성(Polymorphism)은 각 분자의 펩타이드 결합 특이성 초래한다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, MHC관련 유전자 발현이 억제되거나 침묵된다는 것은, HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 B2M로부터 선택되는 하나 또는 다수의 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 의미한다.
인간의 클래스 II HLA집단도 3개의 주요 유전자좌DP, DQ 및 DR을 포함하고, 클래스 I 유전자 클러스터는 클래스 II 유전자 클러스터는 모두 다형성이다. HLA-DPA1, HLA-DQA1 및 HLA-DRA 모두 클래스 II HLAα사슬 파라로그에 속한다. 클래스 II 분자는 주로 항원 제시 세포(예를 들어, B림프구, 수지상 세포, 대식 세포)에서 발현되고, 외인성 펩타이드를 제시함으로써 면역계에서 주요 역할을 한다. 클래스 II 분자는 모두 막에 앵커링된 α사슬과 β사슬로 구성된 헤테로다이머이고, 여기서, α사슬은 약 33-35kDa이며, 5개의 엑손을 포함한다. 엑손1은 선도 펩타이드를 코딩하고, 엑손2 및 3은 2개의 외인성 세포 외 도메인을 코딩하며, 엑손4는 트랜스멤브레인 도메인을 코딩하고, 엑손5는 세포질 테일부를 코딩한다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, MHC관련 유전자 발현이 억제되거나 침묵된다는 것은 HLA-DPA, HLA-DQ 및 HLA-DRA로부터 선택되는 하나 또는 다수의 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 의미한다.
클래스 I 및 클래스(Class) II MHC의 발현은 다양한 헬퍼 단백질에 의해 결정된다. 예를 들어, Tap1 및 Tap2 서브유닛은 펩타이드 항원을 클래스 I HLA복합체에 로딩하는데 필요한 TAP수송체 복합체의 일부이다. LMP2 및 LMP7프로테오솜(proteosome) 서브유닛은 항원 단백질을 펩타이드로 가수분해하여 HLA에서 디스플레이하는 역할을 한다. 연구에 따르면, LMP7을 감소시키면 세포 표면에서 클래스(Class) I MHC의 발현량이 감소하는 것으로 나타났다. 클래스(Class) II MHC의 발현은 RFX복합체, CIITA 등과 같은 일부 양성 조절자에 의해 유도 및 발현된다. RFX복합체는 3개의 서브 유닛, 즉 RFXANK(RFXB라고도 함), RFX5 및 RFX헬퍼 단백질(RFXAP라고도 함)으로 구성된다. RFX복합체는 기타 전사 인자와 클래스(Class) II MHC분자의 프로모터의 결합을 촉진하고 프로모터 결합의 특이성을 증가시켜 클래스(Class) II MHC분자의 발현을 촉진시킨다. CIITA는 클래스(Class) II MHC 발현의 주요 조절자이다. CIITA는 산성 아미노산이 풍부한 N말단, Pro, Ser, Thr이 풍부한 PST 영역, 중간의 GTP결합 영역 및 Leu반복 서열(LRR)이 풍부한 C말단을 포함하고, 여기서, N말단 산성 영역과 PST영역은 전사 활성화 영역이다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, MHC관련 유전자 발현이 억제되거나 침묵된다는 것은 TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK 및 CIITA로부터 선택되는 하나 또는 다수의 유전자 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 의미한다.
따라서, 일 실시형태에 있어서, MHC관련 유전자 발현이 억제되거나 침묵된다는 것은, HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 유전자 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 의미한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함한다.
T세포 표면수용체(Tcellreceptor, TCR)는 모든 T세포 표면의 특징적인 마커로서, 비공유 결합에 의해 CD3과 결합하여 TCR/CD3복합체를 형성하고, 항원 제시 세포 표면의 특이성 MHC-항원 펩타이드 복합체와의 결합을 통해, 특이적 항원 자극 신호를 생산하고, T세포를 활성화시켜, 살상 작용을 발휘한다. TCR은 2가닥의 상이한 펩타이드 사슬로 구성된 헤테로다이머이고, 통상적으로, α/β형 및γ/δ형 두가지 유형으로 나뉘며, 여기서, 95% 이상의 말초 T림프구는 모두 TCR α/β를 발현한다. TCRα은 TRAC유전자에 의해 코딩되고, β사슬은 TRBC유전자에 의해 코딩된다. TCR의 각 가닥의 펩타이드 사슬은 가변 영역(V영역), 불변 영역(C영역), 막관통 영역 및 세포질 영역을 포함하며, 여기서, 세포질 영역은 매우 짧아 항원자극 신호를 전달하는 능력이 없다. TCR분자는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하고, 항원 특이성은 V영역에 존재하며; V영역은CDR1, CDR2, CDR3의 3개의 고도가변영역이 있으며, 여기서, CDR3이 가장 큰 변이를 보이고, TCR의 항원 결합 특이성을 직접 결정한다. TCR이 MHC-항원 펩타이드 복합체를 인식할 때, CDR1, CDR2는 MHC분자를 인식하여 결합하는 반면, CDR3은 항원 펩타이드에 직접 결합한다. CD3은 γ, δ, ε, ζ 4가지 서브 유닛을 포함하고, 통상적으로 이량체 εγ, εδ, ζζ의 형태로 존재한다. 이러한 4가지 서브 유닛은 모두 보존적 면역 수용체 티로신 활성 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하고, 그 중의 2개의 티로신 잔기가 티로신 키나아제에 의해 인산화된 후, T세포로 활성화 신호를 전달한다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자 발현이 억제되거나 침묵된다는 것은 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ로부터 선택되는 하나 또는 다수의 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 의미한다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자 및 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자는 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ 및 이들의 조합으로부터 선택되고; 상기 적어도 하나의 MHC관련 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 바람직하게는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자는 TRAC, TRBC 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 상기 적어도 하나의 MHC관련 유전자는 B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, 및 B2M의 발현이 억제되거나 침묵된다. 일 실시형태에 있어서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, 및 CIITA의 발현이 억제되거나 침묵된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, B2M 및 CIITA의 발현이 억제되거나 침묵된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 조작된 면역 세포의 TRAC 또는 TRBC, B2M 및 RFX5의 발현이 억제되거나 침묵된다.
일 실시형태에 있어서, MHC관련 유전자 및 임의의 TCR/CD3유전자 외에, 본 발명의 조작된 면역 세포는, CD52, GR, dCK, 및 PD1, LAG3, TIM3, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3과 같은 면역 체크포인트 유전자로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함한다.
유전자 발현을 억제하거나 유전자를 침묵시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있는 것이고, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TALE뉴클레아제 또는 CRISPR계에서의 Cas효소에 의해 DNA 절단을 매개하거나, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티, RNAi, shRNA 등 기술에 의해 유전자를 비활성화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
키메라 항원 수용체
다른 양태에 있어서, 본 발명의 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체를 발현할 수도 있다. 즉, 상기 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 NK억제 분자 및 키메라 항원 수용체를 발현하고, 바람직하게, 상기 조작된 면역 세포의 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵된 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"는 인공적으로 구축된 하이브리드 폴리펩타이드를 지칭하고, 상기 하이브리드 폴리펩타이드는 일반적으로 하나 또는 다수의 리간드 결합 도메인(예를 들어, 항체의 항원 결합 부분), 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, 각각의 도메인은 링커에 의해 연결된다. CAR은 비 MHC 제한적 방식(non-MHC-restricted manner)으로 단일클론 항체의 항원 결합 특성을 이용하여 T 세포 및 기타 면역 세포의 특이성과 반응성을 선택한 타겟으로 재지향할 수 있다. 비 MHC 제한적 항원 인식은 CAR세포가 항원 처리와 무관하게 항원을 인식할 수 있는 능력을 제공하여, 종양 회피의 주요 메커니즘을 우회하였다. 이 외에, T세포 내에서 발현될 때, CAR은 유리하게 내인성 T세포 수용체(TCR)의 α사슬과 β사슬과 이량체화되지 않는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "리간드 결합 도메인"은 리간드(예를 들어, 항원)에 결합할 수 있는 임의의 구조 또는 기능적 변이체를 지칭한다. 리간드 결합 도메인은 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 및 이들의 기능적 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 구조일 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합 도메인은 완전한 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv단편, scFv항체 단편, 선형 항체, sdAb(VH 또는 VL), 나노 항체(Nanobody, Nb), 재조합 피브로넥틴 도메인, 안티칼린(anticalin) 및 DARPIN 등을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 바람직하게는 Fab, scFv, sdAb 및 나노 항체로부터 선택된다. 본 발명에서, 리간드 결합 도메인은 1가(monovalent) 또는 2가(bivalent)일 수 있고, 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항체일 수 있다.
"Fab"는 면역글로불린 분자가 파파인에 의해 용해된 후 생성된 2개의 동일한 단편 중 임의의 하나로서, 이황화 결합에 의해 연결된 완전한 경쇄 및 중쇄 N말단 부분으로 이루어진 것을 의미하며, 여기서 중쇄 N말단 부분은 중쇄 가변 영역과 CH1을 포함한다. 완전한 IgG와 비교할 때, Fab는 Fc단편이 없고, 이동성과 조직 침투성이 높으며, 항체 효과의 매개가 필요없이 항원에 1가(monovalent) 결합된다.
"단일 사슬 항체" 또는 "scFv"는 항체중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)이 링커에 의해 연결된 항체이다. 링커의 최적 길이 및/또는 아미노산의 조성에 대해 선택할 수 있다. 링커의 길이는 scFv의 가변 영역 폴딩 및 상호작용 정황에 현저한 영향을 미친다. 사실상, 더 짧은 링커를 사용하는 경우(예를 들어, 5-10개의 아미노산 사이), 사슬 내 폴딩(intrachain folding)을 방지할 수 있다. 링커의 크기 및 조성의 선택에 대하여, 예를 들어, Hollinger et al., 1993Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-6448: 미국 특허 출원 공개 번호: 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794; 및 PCT 공개 번호W02006/020258 및 W02007/024715을 참조할 수 있고, 그 전체 내용은 참조로서 본 발명에 포함된다. scFv는 임의의 순서로 연결된 VH 및 VL을 포함할 수 있는데, 예를 들어, VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH등 일 수 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 하나의 중쇄 가변 영역(VHH)과 2개의 통상적인 CH2 및 CH3 영역만을 포함하는 경쇄가 천연적으로 결실된 항체를 지칭하며, "중쇄 항체"라고도 한다.
"나노 항체" 또는 "Nb"는 개별적으로 클로닝되고 발현되는 VHH 구조를 지칭하고, 원래의 중쇄 항체와 동등한 구조 안정성과 항원에 대한 결합 활성을 가지며, 현재 알려진 표적 항원에 결합 가능한 가장 작은 단위이다.
용어 "기능적 변이체" 또는 "기능적 단편"은 실질적으로 모체 아미노산 서열(amino acid sequence of a parent)을 포함하지만 모체 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형(즉, 치환, 결실 또는 삽입) 을 포함하는 변이체를 지칭하며, 상기 변이체는 모체 아미노산 서열의 생물학적 활성을 유지하는 것을 조건으로 한다. 예를 들어, 항체의 경우, 이들의 기능적 단편은 이의 항원 결합 부분이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 아미노산 변형은 바람직하게는 보존적 변형(conservative modification)이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 변형(conservative modification)"은 상기 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특성에 유의한 영향을 미치지 않거나 변화되지 않게 하는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보전적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 위치-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 본 분야에 공지된 표준 기술로 본 발명의 키메라 항원 수용체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 본 분야에 정의되어 있고, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 사티닌, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 보존적 변형(conservative modification)은 예를 들어, 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 관련된 잔기의 양친매성의 유사성에 기반하여 선택할 수 있다.
따라서, "기능적 변이체" 또는 "기능적 단편"은 모체 아미노산 서열과 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지고, 모체 아미노산의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 활성)을 유지한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 2개의(뉴클레오티드 또는 아미노산) 서열이 정렬(alignment)에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 정도를 나타내고, 일반적으로 백분율로 나타낸다. 바람직하게, 동일성은 비교되는 서열의 전체 길이에 의해 결정된다. 따라서, 완전히 동일한 서열을 갖는 2개의 코피(copy)는 100%의 동일성을 가진다. 당업자는 Blast(Altschul 등 (1997)Nucleic Acids Res.25: 3389-3402), Blast2(Altschul 등(1990)J.Mol.Biol.215: 403-410), Smith-Waterman(Smith 등(1981)J.Mol.Biol.147: 195-197) 및 ClustalW 등과 같은 일부 알고리즘을 표준 매개변수를 사용하여 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있음을 인식하였다.
리간드 결합 도메인의 선택은 구체적인 질병 상태와 관련된 인식될 타겟 세포 상의 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원과 같은 세포 표면 마커에 따라 결정된다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 리간드 결합 도메인은, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-1 1Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, Folate수용체α, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GMl, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE Al, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린Bl(Cyclin Bl), MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라제, mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGFβ, APRIL, 클라우딘(Claudin)18.2, NKG2D 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 타겟에 결합된다. 바람직하게, 상기 타겟은 CD19, CD20, CD22, BAFF-R, CD33, EGFRvIII, BCMA, GPRC5D, PSMA, ROR1, FAP, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, CAIX, WT1, NY-ESO-1, CD79a, CD79b, GPC3, 클라우딘(Claudin)18.2, NKG2D 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 타겟팅될 항원에 따라, 본 발명의 CAR은 항원에 대한 특이적인 리간드 결합 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CD19가 타겟팅될 항원인 경우, CD19항체는 본 발명의 리간드 결합 도메인으로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 CAR에 포함된 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인, 세포 내 신호 전달 도메인 및 임의의 힌지 영역, 시그널 펩타이드 등의 구조의 정의는 상술된 바와 같다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 CAR은 또한 CAR의 발현 시간을 조절하기 위한 스위치 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스위치 구조는 대응되는 리간드와의 결합을 통해 구조적 변화를 일으켜, 타켓팅된 항원에 결합하도록 세포 외 결합 도메인을 노출시킴으로써 신호 전달 경로를 활성화시키는 이량체화 도메인의 형태일 수 있다. 또는, 스위치 도메인을 사용하여 결합 도메인과 신호 전달 도메인에 각각 연결되되, 스위치 도메인이 서로 결합하는 경우(예를 들어, 유도 화합물의 존재 하)에만, 결합 도메인 및 신호 전달 도메인이 함께 이량체화되어, 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 스위치 구조는 또한 마스킹 펩타이드(masking peptide)의 형태일 수 있다. 마스킹 펩타이드는 세포 외 결합 도메인을 마스킹하여, 타겟 항원이 결합되는 것을 방지할 수 있으며, 예를 들어, 마스킹 펩타이드가 프로테아제에 의해 절단되어 세포 외 결합 도메인이 노출되면, 하나의 "통상"적인 CAR구조가 될 수 있다. 당업자에게 공지된 다양한 스위치 구조는 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 CAR은 또한 자살 유전자를 포함할 수 있으며, 즉, 외부 물질에 의해 유도될 수 있는 세포 사멸 신호를 발현하도록 하여, 필요할 때(예를 들어, 심각한 독성 부작용이 발생할 때), CAR 세포를 제거할 수 있다. 예를 들어, 자살 유전자는 CD20 에피토프, RQR8 등과 같은 삽입 에피토프(inserted epitope)의 형태일 수 있으며, 필요한 경우, 이러한 에피토프를 타겟팅하는 항체 또는 시약을 추가하여 CAR 세포를 제거할 수 있다. 자살 유전자는 단순 포진 바이러스 티미딘키나아제(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)일 수도 있고, 상기 유전자는 간시클로버(ganciclovir) 치료 유도에 의해 세포가 사멸되게 할 수 있다. 자살 유전자는 iCaspase-9일 수도 있고, AP1903, AP20187 등과 같은 화학적 유도 약물에 의해 iCaspase-9의 이량체화를 유도할 수 있어, 다운스트림의 Caspase3분자를 활성화하여 세포 사멸을 유도한다. 당업자에게 공지된 다양한 자살 유전자는 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
수요에 따라, NK억제 분자가 세포내 신호전달 도메인을 포함하고 세포가 CAR을 발현하는 경우, 본 발명의 NK억제 분자 및 CAR은 결합 영역 외의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인와 같은 다른 구조를 공유할 수 있다. 따라서, 상기 실시형태에서, 본 발명의 조작된 면역 세포는, (1) 본 발명의 NK억제 분자 및 키메라 항원 수용체의 융합 단백질을 발현하고, 상기 융합 단백질은 NK억제 리간드, 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, (2) 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵된다.
핵산 및 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 NK 억제 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 선택적으로, 상기 핵산 분자는 또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 서열을 포함(예를 들어, 변형되거나 변형되지 않은 RNA 또는 DNA)하고, 각각 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 형태인 선형 또는 환형, 또는 이들의 혼합물(하이브리드 분자 포함)이다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산은 DNA(예를 들어, dsDNA, ssDNA, cDNA), RNA(예를 들어, dsRNA, ssRNA, mRNA, ivtRNA), 이들의 조합 또는 유도체(예를 들어, PNA)를 포함한다. 바람직하게, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이고, 보다 바람직하게는 mRNA이다.
핵산은 상규적인 포스포디에스터 결합 또는 비상규적인 결합(예를 들어, 펩타이드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산은 또한 예를 들어 트리틸화 염기 및 흔하지 않은 염기(예: 이노신(inosine))과 같은 하나 이상의 변형된 염기를 함유할 수 있다. 본 발명의 다중쇄 CAR이 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 한, 화학적, 효소적 또는 대사적 변형을 비롯한 다른 변형이 또한 고려될 수 있다. 핵산은 분리된 형태로 제공될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산은 또한 전사 제어 요소(프로모터, 인핸서, 오페론, 리프레서 및 전사 종결 신호 포함), 리보솜 결합 부위, 인트론 등과 같은 조절 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 원하는 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 최적의 발현을 위해, 또는 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 표적 서열에 존재하는 주어진 종(given species)에서 고도로 발현되는 유전자 중의 일반적으로 드문 코돈을 이러한 종에서 고도로 발현된 유전자 중의 일반적으로 흔한 코돈으로 대체하되, 대체 전후의 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하는 것을 의미한다. 따라서, 최적 코돈의 선택은 숙주 게놈의 코돈 사용 선호도에 따라 결정된다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 선택적으로, NK 억제 분자를 코딩하는 핵산 서열 및 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 위치할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 (외인성)유전 물질을 숙주 세포로 전달하기 위한 매개체로 사용되는 핵산 분자이며, 상기 숙주 세포에서 상기 핵산 분자는 예를 들어 복제 및/또는 발현될 수 있다.
벡터는 일반적으로 타겟 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. "타겟 벡터"는 예를 들어 상동 재조합을 통해, 또는 특이적 타겟 부위의 서열의 하이브리드 리콤비나아제(hybrid recombinases)를 사용하여, 분리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 매질이다. "발현 벡터" 는 적합한 숙주 세포에서 이종 핵산 서열(예를 들어, 본 발명의 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 서열)의 전사 및 이들의 mRNA 번역에 사용되는 벡터이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 벡터는 본 분야에 공지되어 있으며, 대부분 상업적으로 구입할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 벡터는 플라스미드, 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 라우스육종바이러스(RSV), 폴리오마 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 등), 파지, 파스미드, 코스미드 및 인공 염색체(BAC 및 YAC를 포함)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 벡터 자체는 일반적으로 뉴클레오티드 서열이고, 일반적으로 삽입체(전이 유전자(transgene))의 DNA 서열 및 벡터의 “백본”인 더 큰 서열을 포함한다. 조작된 벡터는 또한 일반적으로 숙주 세포에서 자율 복제되는 기점(폴리뉴클레오티드의 안정적인 발현이 필요한 경우), 선별 마커(selectable marker) 및 제한 효소 절단 부위(예를 들어, 다중 클로닝 부위, MCS)를 포함한다. 벡터는 프로모터, 폴리아데닐산 테일(polyA), 3'UTR, 인핸서, 터미네이터, 인슐레이터, 오페론, 선별 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열(protein purification tag) 및/또는 단백질 정제 태그(protein purification tag)와 같은 요소를 포함할 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 상기 벡터는 생체외 전사 벡터이다.
조작된 면역 세포
본 발명은 또한 본 발명의 NK 억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 MHC 관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵된다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 하나 또는 다수의 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 추가로 포함한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함한다.
일 실시형태에 있어서, MHC관련 유전자 및 임의의 TCR/CD3유전자 외에, 본 발명의 조작된 면역 세포는, CD52, GR, dCK, 및 PD1, LAG3, TIM3, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3과 같은 면역 체크포인트 유전자로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함한다.
수요에 따라, NK억제 분자가 세포내 신호전달 도메인을 포함하고 세포가 CAR을 발현하는 경우, 본 발명의 NK억제 분자 및 CAR은 결합 영역 외의 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인과 같은 다른 구조를 공유할 수 있다. 따라서, 상기 실시형태에서, 본 발명의 조작된 면역 세포는, (1) 본 발명의 NK억제 분자 및 키메라 항원 수용체의 융합 단백질을 발현하고, 상기 융합 단백질은 NK억제 리간드, 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며, (2) 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 더 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 하나 또는 다수의 이펙터 기능(예를 들어, 세포 독성 세포 살상 활성(cytotoxic cell killing activity), 사이토카인의 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역 세포는 B세포, T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 또는 NKT세포, 또는 제대혈과 같은 줄기 세포 공급원으로부터 수득된 면역 세포일 수 있다. 바람직하게, 면역 세포는 T세포이다. T세포는 체외 배양된 T세포와 같은 임의의 T세포일 수 있고, 예를 들어, 1차 T세포, 또는 Jurkat, SupTl 등과 같은 체외 배양된 T세포주에서 유래된 T세포, 또는 피험자로부터 수득된 T세포일 수 있다. 피험자의 예시로 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 형질전환 종(transgenic species)을 포함한다. T세포는 말초 혈액 단핵구, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T세포는 농축되거나 정제될 수도 있다. T세포는 모든 발달 단계에 있을 수 있고, CD4+/CD8+T세포, CD4+헬퍼 T 세포(예를 들어, Thl 및 Th2세포), CD8+T세포(예를 들어, 세포 독성 T세포), 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포, γδ-T세포, αβ-T세포 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 면역 세포는 인간 T세포이다. T 세포는 피콜(Ficoll) 분리와 같은 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 피험자의 혈액으로부터 수득될 수 있다.
NK 억제 분자 및 임의의 키메라 항원 수용체는 당업계에 공지된 통상적인 방법(예를 들어, 형질도입, 형질감염, 형질전환 등에 의해)을 사용하여 면역 세포 내로 도입될 수 있다. "형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)를 타겟 세포에 도입하는 과정이다. 일 예로, RNA형질감염은 RNA(예를 들어, 생체외 전사된 RNA, ivtRNA)를 숙주 세포에 도입하는 과정이다. 상기 용어는 주로 진핵 세포에서의 비바이러스성 방법에 사용된다. 용어 "형질도입"은 일반적으로 바이러스에 의해 매개되는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 전이의 설명에 사용된다. 동물 세포의 형질감염은 일반적으로 세포막에 일시적인 기공(pores) 또는 "구멍(holes)"을 열어 물질의 흡수를 허용하는 것에 관한 것이다. 인산칼슘을 사용거나, 전기천공법을 통하거나, 세포 스퀴징을 통하거나, 또는 양이온성 지질을 재료물질과 혼합하여 세포막과 융합되고 내부에 캐리어 물질을 침착시키는 리포솜을 생성함으로써, 형질감염시킬 수 있다. 진핵 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 예시적인 기술은 지질 소포 매개 흡수(lipid vesicle-mediated uptake), 열 충격 매개 흡수, 인산칼슘 매개 형질감염(인산칼슘/DNA공침전), 미세주입 및 전기천공법을 포함한다. 용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드(벡터 포함)의 박테리아으로의, 또는 비동물성 진핵 세포(식물 세포 포함)로의 비바이러스성 전달의 설명에 사용된다. 따라서, 형질전환은 박테리아(bacteria) 또는 비동물 진핵 세포의 유전학적 변형으로서, 세포막을 통해 주위로부터 직접 흡수 한 후 외인성 유전 물질(핵산 분자)을 도입시킴으로써 발생된다. 형질전환은 인공적 수단으로 구현될 수 있다. 형질전환이 일어나려면 세포나 박테리아가 컴피턴스의 상태(competent state)여야 한다. 원핵 형질전환의 경우, 기술로서 열 충격 매개 흡수, 완전한 세포와의 박테리아 원형질체의 융합, 미세주입 및 전기천공법을 포함할 수 있다.
키트 및 약물 조성물
본 발명은 본 발명의 NK 억제 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 조작된 면역 세포를 포함하는 키트를 제공한다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 키트는 설명서를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 활성제인 본 발명의 NK 억제 분자, 조작된 면역 세포, 핵산 분자 또는 벡터, 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 약물 조성물 또는 약물의 제조에서의 상기 NK억제 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 조작된 면역 세포의 용도를 더 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 약리학적 및/또는 생리학적으로 피험자 및 활성 성분과 상용(즉, 원하지 않는 국소 또는 전신 작용을 일으키지 않으면서 원하는 치료 효과를 일으킴)되는 벡터 및/또는 부형제를 지칭하고, 당업계에 공지된 것이다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR, 19th ed.Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조). 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예시로, 충진제, 결합제, 붕해제, 피복제, 흡착제, 부착방지제, 활택제, 항산화제, 향미제, 착색제, 감미제, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이트제, 계면활성제, 희석제, 습윤제, 방부제, 유화제, 코팅제, 등장제, 흡수 지연제, 안정제 및 장력 조절제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 원하는 약물 조성물을 제조하기 위해 적합한 부형제를 선택하는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 약물 조성물에 사용하기 위한 예시적인 부형제는 식염수, 완충 식염수, 글루코스 및 물을 포함한다. 통상적으로, 적합한 부형제의 선택은 특히 사용된 활성제, 치료할 질병 및 약물 조성물의 원하는 투여 형태에 따라 결정된다.
본 발명의 약물 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 통상적으로, 비경구적으로 투여된다. 비경구 투여는 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 골수내(intramedullary), 척수강내(intrathecal), 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 설하 또는 비강내 투여를 포함한다.
본 발명의 약물 조성물은, 고체, 액체, 기체 또는 동결건조 형태와 같은 다양한 형태로 제조될 수도 있고, 특히 연고, 크림, 경피 패치, 겔, 분말, 정제, 용액, 에어로졸, 과립, 환제, 현탁액, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 엘릭시르, 엑스제(extract), 팅크제 또는 유동 엑스제(liquid extract) 추출물의 형태일 수 있고, 또는 특히 원하는 투여 방법에 적합한 형태일 수 있다. 발명에 공지된 약물을 생산하기 위한 과정은 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 제립, 당의정 제조, 밀링, 유화, 봉입(encapsulating), 포매 또는 동결건조 과정을 포함할 수 있다. 본 발명에 기재된 것과 같은 면역 세포를 포함하는 약물 조성물은 통상적으로 용액 형태로 제공되고, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 완충제를 포함한다.
본 발명에 따른 약물 조성물은 치료될 질환의 치료 및/또는 예방에 적합한 하나 또는 다수의 기타 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합에 적합한 약제의 바람직한 예시로, 시스플라틴(cisplatin), 메이탄신(maytansine) 유도체, 라켈마이신(rachelmycin), 칼리키아미신(calicheamicin), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 젬시타빈(gemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), 멜파란(melphalan), 미토산트론(mitoxantrone), 소르피머 소듐포토프린II(sorfimer sodiumphotofrin II) , 테모졸로미드(temozolomide), 토포테칸(topotecan), 트리메트레이트 글루쿠로네이트(trimetreate glucuronate), 아우리스타틴E(auristatinE), 빈크리스틴(vincristine) 및 아드리아마이신(adriamycin)과 같은 항암 약물; 리신(ricin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 슈도모나스 균체외 독소A(pseudomonas exotoxin A), DNA효소 및 RNA효소와 같은 펩타이드 세포독소(peptide cytotoxins); 요드131, 레늄186, 인듐111, 이리듐90, 비스무트210 및 213, 악티늄225 및 아스타틴213과 같은 방사성핵종(radionuclide); 항체 지향적 효소 프로드러그와 같은 프로드러그; 혈소판 인자4, 흑색종 성장 자극 단백질(melanoma growth stimulating protein) 등과 같은 면역 자극제; 항CD3항체 또는 이의 단편과 같은 항체 또는 이의 단편, 보체 활성화제, 이종 단백질 도메인, 동종 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인 및 바이러스/박테리아 펩타이드를 포함한다. 이 외에, 본 발명의 약물 조성물은 화학요법, 방사선 요법과 같은 하나 또는 다수의 치료 방법과 함께 조합하여 사용될 수도 있다.
치료 응용
본 발명은 또한 유효량의 본 발명에 따른 NK억제 분자, 핵산 분자, 벡터, 조작된 면역 세포 또는 약물 조성물을 피험자에 투여하는 단계를 포함하는 암, 감염 또는 자가면역 질환을 앓고 있는 피험자를 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 암, 감염 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 약물 제조에서의 상기 NK억제 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 조작된 면역 세포의 용도를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 유효량의 본 발명의 면역 세포 및/또는 약물 조성물을 피험자에게 직접 투여한다.
다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 치료 방법은 생체 외 치료(ex-vivo treatment)이다. 구체적으로, 상기 방법은, (a) 면역 세포를 포함하는 시료를 제공하는 단계; (b) 체외에서 상기 면역 세포의 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자와 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되도록 하고, 본 발명의 NK억제 분자 및 임의의 키메라 항원 수용체를 상기 면역 세포에 도입하여, 변형된 면역 세포를 얻는 단계; (c) 상기 변형된 면역 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 단계 (a)에서 제공된 면역 세포는 B세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, T세포, NK세포 또는 NKT세포로부터 선택되고; 상기 면역 세포는 본 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 피험자의 시료(특히, 혈액 시료)로부터 수득될 수 있다. 그러나, 본 발명의 키메라 항원 수용체 및 NK 억제 분자를 발현할 수 있고 본 발명에 기재된 바와 같은 원하는 생물학적 이펙터 기능을 발휘할 수 있는 기타 면역 세포를 사용할 수도 있다. 이 외에, 통상적으로 선택된 면역 세포는 피험자의 면역계와 상용될 수 있고, 즉, 바람직하게 상기 면역 세포는 면역원성 반응을 유도하지 않는다. 예를 들어, "만능 수용 세포(universal recipient cell)"를 사용할 수 있고, 즉, 원하는 생물학적 이펙터 기능을 발휘하고 보편적으로 상용되며 체외에서 성장 및 증폭될 수 있는 림프구를 사용할 수 있다. 이러한 세포를 사용하는 경우, 피험자 자체의 림프구를 획득 및/또는 제공할 필요가 없다. 단계 (b) 의 생체외 도입은 전기천공을 통해 본 발명에 기술된 핵산 또는 벡터를 면역 세포에 도입하거나 바이러스 벡터로 면역 세포를 감염시킴으로써 수행될 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 전술된 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 기타 이용 가능한 방법으로는 형질감염 시약(예를 들어, 리포솜)을 사용하는 형질감염 또는 일시적 RNA 형질감염이 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 면역 세포는 자가 또는 동종이계(allogeneic)의 세포이고, 바람직하게는 B세포, T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구 또는, NK세포, NKT세포이며, 보다 바람직하게는 T세포, NK세포 또는 NKT세포이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "자가"는 개체로부터 유래된 임의의 물질이 잠시 뒤 동일한 개체에 다시 도입되는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이계(allogeneic)"는 임의의 물질이 유래되는 개체와 당해 물질이 도입되는 개체가 동일한 종의 다른 동물 또는 다른 환자인 것을 의미한다. 하나 또는 다수의 유전자좌에서의 유전자가 상이한 경우, 당해 둘 또는 그 이상의 개체가 서로 동종이계(allogeneic)인 것으로 간주된다. 일부 경우, 같은 종의 개체에서 유래한 동종이계 물질은 유전적으로 달라 충분히 항원 상호작용이 일어날 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비 인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예시에 한정되지 않는다. 인간 이외의 포유동물은 암의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 피험자는 인간이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 암은 리간드 결합 도메인에 결합되는 타겟 발현과 관련된 암이다. 예를 들어, 상기 암은, 뇌 신경교종, 모세포종, 육종, 백혈병, 기저세포암, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모막암(choriocarcinoma), 결장 및 직장암, 결합조직암(connective tissue cancer), 소화기 계통의 암(cancer of digestive system), 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암(위장암 포함), 교모세포종(GBM), 간암, 간세포종양, 상피내종양, 신장암, 후두암, 간종양, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암 및 편평상피 폐암), 림프종(호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종 포함), 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 입 및 인두), 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기 계통의 암, 타액샘 암종(salivary gland cancer), 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암 또는 자궁내막암, 비뇨기 계통의 악성 종양, 외음부암 및 기타 암 및 육종, 및 B세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL), 소림프구성(SL)NHL, 중등급/여포성NHL, 중등급 미만성NHL, 고등급 면역아세포성NHL(high-grade immunoblastic NHL), 고등급 림프아세포성NHL(high-grade lymphoblastic NHL), 고등급 소형 비-절단된 세포NHL(high-grade small non-cracked cell NHL), 벌키병 NHL(bulky disease NHL)), 외투세포 림프종, AIDS관련 림프종, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), T세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL), B세포 전림프구성 백혈병, 모구 형질세포양 수지상 세포 종양, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 악성 림프 증식 질환(malignant lymphoproliferative disorder), MALT 림프종, 털세포 백혈병, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성(myelodysplasia), 형질모세포 림프종(plasmablastic lymphoma), 전백혈병, 형질세포양 수지상 세포 종양, 및 이식후 림프세포증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD); 및 기타 타겟 발현과 관련된 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 조작된 면역 세포 또는 약물 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 질환은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 뇌 신경교종, 췌장암, 위암 등으로부터 선택된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 감염에는 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충에 의한 감염이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, 상기 자가면역 질환은 I형 당뇨병, 셀리악병, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 애디슨병, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 혈관염, 악성빈혈 및 전신홍반루푸스 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 또한 하나 또는 다수의 별도의 화학요법제, 생물학적 제제, 약물 또는 치료제를 피험자에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시형태에서, 화학요법제, 생물학적 제제, 약물 또는 치료제는 방사선 요법, 수술, 항체 시약 및/또는 소분자 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
본 발명은 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 이하에서 상세히 설명될 것이다. 당업자는 첨부된 도면 및 본 발명의 실시예가 단지 예를 들기 위한 목적이며 본 발명에 대해 어떠한 제한도 구성하지 않는다는 것을 이해해야 한다는 점에 유의해야 한다. 본 출원의 실시예와 실시예의 특징은 모순되지 않는 범위에서 서로 조합될 수 있다.
본 발명의 모든 실시예에 사용된 T 세포는 Ficoll-PaqueTM PREMIUM(GE Healthcare, Lot No. 17-5442-02)에 의해 백혈구 성분 채집술(Leukapheresis)을 사용하여 건강한 공여체로부터 분리된 1차 인간 CD4+CD8+T세포이다.
실시예 1: NK억제 분자를 발현하고 TCR/HLA-I/HLA-II를 녹아웃시킨 UNKi-T면역 세포의 구축
B2m시그널 펩타이드(서열번호 21), NK억제 리간드, CD28힌지 영역(서열번호 27), CD28막관통 영역(서열번호 11)의 코딩 서열을 합성하고, 이를 pGEM-TEasy벡터(Promega, Lot No. A1360)에 순차적으로 클로닝하되, 여기서, NK억제 리간드는 E-카드헤린의 세포 외 영역(서열번호 41, ECad0 플라스미드에 해당됨), B2M 및 HLA-E세포 외 영역의 융합분자(제시펩타이드 서열번호 46, B2M서열번호 37 및 HLA-E세포 외 영역 변이체 서열번호 33을 포함하고, 여기서, B2M의 핵산 서열은 동의 돌연변이된 서열번호 38이며, E0플라스미드에 해당됨), 또는 B2M 및 HLA-G세포 외 영역의 융합분자(B2M 서열번호 37 및 HLA-G세포 외 영역 서열번호 35를 포함하고, 여기서, B2M의 핵산 서열은 동의 돌연변이된 서열번호 38이며, G0플라스미드에 해당됨)이다. ECad0, E0 및 G0 플라스미드에 CD28공동자극 도메인(서열번호 13)을 추가로 포함시켜, 각각 ECad28, E28 및 G28플라스미드를 얻었다. 시퀀싱을 통해 표적 서열의 플라스미드에서의 정확한 삽입을 확인하였다.
B2m시그널 펩타이드(서열번호 21), 항NKG2A-scFv(서열번호 5 및 7 포함), IgG4힌지 영역(서열번호 29), CD28막관통 영역(서열번호 11), CD28공동자극 도메인(서열번호 13)의 코딩 서열을 합성하고, 이를 pGEM-TEasy벡터(Promega, Lot No. A1360)에 순차적으로 클로닝하여, A28플라스미드를 얻었으며, 시퀀싱을 통해 표적 서열의 플라스미드에서의 정확한 삽입을 확인하였다.
무균 튜브에 3ml의 Opti-MEM(Gibco, Lot No. 31985-070)을 넣어 상기 플라스미드를 희석한 후, 플라스미드: 바이러스 패키징 벡터: 바이러스 외피 벡터=4: 2: 1의 비율로 패키징 벡터psPAX2(Addgene, Lot No. 12260) 및 외피 벡터pMD2.G(Addgene, Lot No. 12259)를 넣었다. 다음, 120ul의 X-treme GENE HP DNA 형질감염 시약(Roche, Lot No. 06366236001)을 넣어, 즉시 균일하게 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 플라스미드/벡터/형질감염 시약 혼합물을 293T세포의 배양 플라스크에 적가하였다. 24시간 및 48시간에 바이러스를 수집하고, 합병 후 초원심분리(25000g, 4°C, 2.5시간) 하여 농축된 렌티바이러스를 얻었다.
DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco, Lot No. 40203D)로 T세포를 활성화 하고, 37°C 및 5%의 CO2 조건 하에서 1일동안 배양하였다. 다음, 농축된 렌티바이러스를 첨가하고, 계속하여 3일 배양한 후, NK억제 분자를 발현하는 T세포를 얻었다.
다음, CRISPR 시스템을 사용하여 상기 NK억제 분자를 발현하는 T세포의 TCR/CD3성분(구체적으로, TRAC유전자) 및 MHC관련 유전자(구체적으로, B2M 및 RFX5)를 녹아웃시켰다. 구체적으로, BTX Agile Pulse Max전기천공기(Harvard Apparatus BTX)를 사용하여, 400V, 0.7ms으로 l0ug의 Cas9 단백질과 l0ug의 sgRNA(3.3ug의 TRAC sgRNA(서열번호 43) + 3.3ug의 B2m sgRNA(서열번호 44) + 3.3ug의 RFX5 sgRNA(서열번호 45))를 활성화된 NKi-T세포에 전기적 형질감염시켰다. 이후, 전기적 형질감염시킨 후, NKi-T세포를 1ml의 예열된 배지에 넣고, IL-2(300IU/ml)의 존재 하에서, 37°C 및 5%의 CO2의 조건에서 배양하여, TCR/B2M/RFX5가 트리블 녹아웃된 UNKi-T세포를 얻었다. CRISPR시스템을 사용하여 TCR/B2M/RFX5를 녹아웃시킨 야생형 T세포(즉, MockT세포) 및 유전자를 녹아웃시키지 않은 야생형T10세포(즉, NT세포)를 대조군으로 하였다.
본 실시예에서 제조된 UNKi-T세포에 포함된 NK억제 분자의 구조는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1. NK억제 분자를 포함하는 UNKi-T세포
Figure pct00001
11일 후, FITC 마우스 항 인간 CD3(FITC Mouse Anti-Human CD3) (BD Pharmingen, Lot No. 555916)항체, PE 마우스 항 인간 HLA-I(PE mouse anti-human HLA-I)(R&DLot No. FAB7098P) 및APC 항 인간 DR, DP, DQ(biolegend, Lot No. 361714)항체를 사용하여, 유세포 분석기로 UNKi-T세포, Mock T세포 및 NT세포에서의 TCR/HLA-I/HLA-II의 발현 효율을 검측하였으며, 그 결과는 하기 표 2와 같다.
표 2.UNKi-T세포에서의 유전자 발현 효율
Figure pct00002
표 2로부터, 본 발명에 의해 제조된 UNKi-T세포 및 Mock T세포에서의 TCR/B2M/RFX5의 발현이 효과적으로 억제되거나 침묵되었음을 알 수 있다.
이 외에, 유세포 분석기를 사용하여, PE 마우스 항 인간 HLA-E(PE mouse anti-human HLA-E)(biolegend Lot No. 342604)로 UNKi-T세포 및 MockT세포에서의 HLA-E 발현을 검측하고(도 1), PE 마우스 항 인간 HLA-G(PE mouse anti-human HLA-G)(biolegendLot No. 335906)로 UNKi-T세포 및 MockT세포에서의 HLA-G 발현을 검측하며(도 2), E-카드헤린 단일클론 항체(E-cadherin monOCILonal antibody)(invitrogenLot No. 13-5700) 및 염소 항-마우스 IgG(Goat anti-Mouse IgG)(H+L) 교차 흡착 이차 항체(Cross-Adsorbed Secondary Antibody), Alexa Fluor 488(invitrogen, Lot No. A-l1001)로 UNKi-T세포 및 MockT세포에서의 E-카드헤린 발현을 검측하고(도 3), 비오틴-SP(롱 스페이서) 아피니퓨어 염소 항 인간 IgG (Biotin-SP(long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG), F(ab') 단편 특이적 항체(F(ab') fragment specific antibody)(Jackson Immuno Research, Lot No. 109-065-097) 및APC 스트렙타비딘(APC Streptavidin)(BD, Lot No. 554067)으로 UNKi-T세포 및 MockT세포에서의 항-NKG2A scFv 발현을 검측하였다(도 4).
도 1-4로부터 알 수 있다시피, 본 발명에 의해 제조된 UNKi-T세포에서는 NK억제 분자가 모두 효과적으로 발현되었다.
실시예 2. NK세포 살상 작용에 대한 UNKi-T세포의 억제 효과
본 실시예에 사용된 효과 세포는 NK92세포이다. NK92세포주는 E-카드헤린의 수용체KLRG1을 발현하지 않으므로, KLRG1을 과발현하는 NK92세포를 먼저 제조하였다.
KLRG1(서열번호 54)을 코딩하는 핵산 서열을 합성하고, pGEM-TEasy벡터(Promega, Lot No. A1360)에 순차적으로 클로닝하며, 시퀀싱을 통해 표적 서열의 정확한 삽입을 확인하였다. Spel 효소로 상기 벡터를 절단하고, 정제 및 회수하여 선형화된 벡터를 얻었다. 다음, 제조업체의 건의에 따라, 선형화된 벡터를 주형으로 하고, mMESSAGE mMACHINE®T7Ultra Kit키트(Invitrogen, Lot No. AM1345)를 사용하여 mRNA를 제조하며, Fastpure 세포/조직 전체 RNA 분리 키트(Fastpure cell/Tissue total RNA isolation kit)(Vazyme, Lot No. RC101-01)로 정제하여, 정제된 mRNA를 얻었다. BTX Agile Pulse Max전기천공기(Harvard Apparatus BTX)를 사용하여, 200V, 2ms로 상기 제조된 정제 mRNA 20ug를 NK92세포 내에 전기적 형질감염시켰다. 16h시간 후, KLRG1의 발현을 검측하고, 결과는 도 5에 도시된 바와 같다. KLRG1로 형질감염시키지 않은 NK92세포를 대조군으로 하였다.
도 5로부터 알 수 있다시피, NK92-KLRG1세포는 KLRG1을 효과적으로 발현할 수 있다.
다음, 하기 방법에 따라, 본 발명에 의해 제조된 UNKi-T세포의 NK세포 살상 작용에 대한 억제 효과를 검측하한다. Far-Red(invitrogen, Lot No. C34564)로 본 발명에 의해 제조된 UNKi-T세포 및 Mock-T세포를 표기하였다. 다음, 1Х104개 cell/웰의 농도로 표기된 UNKi-T세포 및 MockT세포를 96웰 플레이트에 분주하고, 2: 1의 이펙터-타겟 비율로 NK92세포(HLA-E, HLA-G 또는 NKG2A scFv를 발현하기 위한 UNKi-T세포 및 MockT세포) 또는 NK92-KLRG1세포(E-카드헤린을 발현하기 위한 UNKi-T세포)를 넣어 공동으로 배양하였다. 16-18시간 후, 유세포 분석기로 배양물 중의 T세포의 비율을 검측하여, T세포에 대한 NK세포의 살상율을 계산하고, 결과는 도 6에 도시된 바와 같다.
도 6으로부터 알 수 있다시피, NK억제 분자를 발현하지 않는 MockT세포와 비교할 때, NKG2AscFv, HLA-G, HLA-E, E-카드헤린과 같은 억제 리간드를 포함하는 NK억제 분자를 발현하는 UNKi-T세포는 전부 T세포에 대한 NK세포의 살상 작용을 현저히 감소시킬 수 있다. 또한, 억제 리간드 및 트랜스멤브레인 도메인만을 발현하는 T세포와 비교할 때, 공동자극 도메인의 추가는 NK세포 살상에 대한 T세포의 억제를 더욱 현저하게 향상시킬 수 있다(G0 vs G28; E0 vs E28: ECad0 vs ECad28 참조). 따라서, 본 발명에 의해 제조된 억제 리간드, 트랜스멤브레인 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 NK억제 분자는 UNKi-T세포에 대한 NK세포의 살상 작용을 현저하게 감소시킬 수 있어, HvGD 위험을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
실시예 3. NK세포에 대한 UNKi-T세포 살상 효과
실시예 1에 따른 방법으로 E28z-UNKi-T 및 A28z-UNKi-T세포를 제조하되, E28-UNKi-T 및 A28-UNKi-T세포와의 구별점은 단지 CD3ζ세포 내 신호 전달 도메인(서열번호 17)을 추가로 포함하는 것이다.
(1) NK억제 분자의 발현 검측
비오틴-SP(롱스페이서) 아피니퓨어 염소 항 인간 IgG (Biotin-SP(long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG), F(ab') 단편 특이적 항체(F(ab') fragment specific antibody)(Jackson Immuno Research, Lot No. 109-065-097) 및APC 스트렙타비딘(APC Streptavidin)(BD, Lot No. 554067)으로 A28z-UNKi-T세포 및 MockT세포에서의 항-NKG2A scFv 발현을 검측하였다(도 7). 유세포 분석기를 사용하여, PE 마우스 항 인간 HLA-E(PE mouse anti-human HLA-E)(biolegend Lot No. 342604)로 E28z-UNKi-T세포 및 Mock T세포에서의 HLA-E 발현을 검측하였다(도 8).
이로부터 알 수 있다시피, 본 발명에 의해 제조된 E28z-UNKi-T세포 및 A28z-UNKi-T세포에서 NK억제 분자가 효과적으로 발현될 수 있다.
(2) CD107 a의 발현 검측
세포 독성 T림프구(CTL세포) 세포질 내에는 소포 형태로 존재하는 세포 독성 과립(cytotoxic particles)이 고농도로 함유되고, 리소좀 관련 막 단백질 I(CD107a)는 소포 막 단백질의 주성분이다. CTL세포가 타겟 세포를 살상할 때, 독성 과립은 세포막에 도달하여 세포막과 융합되어(이때, CD107a분자가 세포막 표면으로 수송됨), 입자 내용물이 방출되고, 최종적으로 타겟 세포의 죽음을 초래한다. 따라서, CD107a분자는 CTL세포 탈과립의 민감한 마커로, 세포 사멸 활성을 반영할 수 있다.
1Х105개 cell/웰의 농도로 타겟 세포(NK92세포)를 96웰 플레이트에 분주한 후, 각 웰당 1: 1의 비율로 Mock T세포, E28z-UNKi-T세포 및 A28z-UNKi-T세포를 넣고, 동시에 10μl의 PE-항 인간CD107a(BD Pharmingen, Lot No. 555801)를 넣어, 37 ℃, 5%의 CO2 배양 조건에서 공동으로 배양하였다. 1시간 후, Goigstop(BD Pharmingen, Lot No. 51-2092KZ)를 넣고 계속하여 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 각 웰에 5μl의 APC-항 인간CD8(BD Pharmingen, Lot No. 555369) 및 5μl의 FITC-항 인간CD4(BD Pharmingen, Lot No. 561005)를 넣고, 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 유세포 분석기로 CD107a의 발현 상황을 검측하고, 결과는 도 9의 A부분 (CD4+T세포독성) 및 도 9의 B부분(CD8+T세포독성)에 도시된 바와 같다.
NK억제 분자를 발현하지 않는 Mock T세포는 타겟 세포에 대해 거의 살상 작용이 없음을 확인할 수 있다. 반면, 본 발명에 의해 제조된 E28z-UNKi-T세포 및 A28z-UNKi-T세포를 타겟 세포와 공동으로 배양한 후, CD107a의 발현률이 현저하게 향상되며, 본 발명의 UNKi-T세포가 NK세포를 현저하게 살상함을 나타냈다.
(3) IFN-γ의 분비 검측
1Х105개 cell/웰의 농도로 타겟 세포(NK92세포)를 96웰 플레이트에 분주하고, 각 웰당 1: 1의 비율로 Mock T세포, E28z-UNKi-T세포 및 A28z-UNKi-T세포를 넣은 후, 37 ℃, 5%의 CO2 배양 조건에서 공동으로 배양하고, 18-24시간 후 세포 공동 배양 상등액을 수집하였다.
96웰 플레이트를 포획 항체 정제된 항 인간 IFN-γ항체(Purified anti-human IFN-γ Antibody)(Biolegend, Lot No. 506502)로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양한 다음 항체 용액을 제거하였다. 2%의BSA(sigma, Lot No. V900933-lkg)를 함유하는 PBST(0.1%의 트윈이 함유된 1XPBS) 용액 250μL를 첨가하고, 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 플레이트를 250μL의 PBST(0.1%의 트윈이 함유된 1XPBS)로 3회 세척하였다. 각 웰에 50μL의 세포 공동 배양 상등액 또는 표준품을 넣고, 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 250μL의 PBST(0.1%의 트윈이 함유된 1XPBS)로 3회 세척하였다. 다음, 각 웰에 50μL의 검측 항체 항-인터페론 감마 항체[MD-1](Biotin)(abeam, Lot No. ab25017)를 넣고, 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 250μL의 PBST(0.1%의 트윈이 함유된 1XPBS)로 3회 세척하였다. HRP스트렙트아비딘(HRP Streptavidin)(Biolegend, Lot No. 405210)을 더 넣고, 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 상등액을 제거하고, 250μL의 PBST(0.1%의 트윈이 함유된 1XPBS)로 5회 세척하였다. 각 웰에 50μL의 TMB기질 용액을 넣었다. 암실에서 실온조건으로 30분 동안 반응이 일어나도록 한 후, 각 웰에 lmol/L의 H2SO4를 50μL 넣어 반응을 정지시켰다. 반응을 정지시킨 후 30분 이내에 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서의 흡광도를 검측하고, 표준 그래프(표준품의 리딩값 및 농도에 따라 제작)에 따라 사이토카인 함량을 계산하며, 결과는 도 10에 되시된 바와 같다.
본 발명의 E28z-UNKi-T세포 및 A28z-UNKi-T세포의 사이토카인IFN-γ방출 정도가 Mock T세포보다 훨씬 높음을 알 수 있으며, 이는 또한 NK92타겟 세포에 대한 살상이 현저하게 증가되었음을 나타낸다.
실시예 4. KIR 또는 LIR1을 타겟팅하는 UNKi-T세포 및 NK세포 살상 작용에 대한 이의 억제 효과
B2m시그널 펩타이드(서열번호 21), 항KIR-scFv(서열번호 55 및 56포함) 또는 항LIR1 scFv(서열번호 57 및 58포함하거나, 서열번호 59 및 60포함), IgG4힌지 영역(서열번호 29), CD8α막관통 영역(서열번호 9), CD28공동자극 도메인(서열번호 13)의 코딩 서열을 합성하여 pLVX벡터(Public Protein/Plasmid Library(PPL), Lot No. PPL00157-4a)에 순차적으로 클로닝하여, KIRG4, LIRG4-1 및 LIRG4-2플라스미드를 얻고, 시퀀싱을 통해 표적 서열의 플라스미드에서의 정확한 삽입을 확인하였다.
실시예 1에 따른 녹아웃 및 감염 방식으로 UNKi-T세포를 제조하고, FITC 마우스 항 인간CD3(FITC Mouse Anti-HumanCD3)(BDPharmingen, Lot No. 555916)항체, PE 마우스 항 인간 HLA-I(PE mouse anti-human HLA-I)(R&DLot No. FAB7098P) 및 APC 항 인간 DR, DP, DQ(biolegend, Lot No. 361714)항체를 사용하여, 유세포 분석기로 UNKi-T세포, Mock T세포 및 NT세포에서의 CD3/HLA-I/HLA-II의 발현 효율을 검측하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
표3. UNKi-T세포에서 유전자 발현 효율
Figure pct00003
표 3으로부터 알 수 있다시피, 본 발명에 의해 제조된 UNKi-T세포 및 Mock T세포에서의 CD3/HLA-I/HLA-II의 발현이 효과적으로 억제되거나 침묵되었음을 알 수 있다.
비오틴-SP(롱스페이서) 아피니퓨어 염소 항 인간 IgG (Biotin-SP(long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG), F(ab') 단편 특이적 항체(F(ab') fragment specific antibody)(Jackson Immuno Research, Lot No. 109-065-097) 및APC 스트렙타비딘(APC Streptavidin)(BD, Lot No. 554067)으로 KIRG4-UNKi-T세포에서의 scFv발현을 검측하고, 결과는 도 11에 도시된 바와 같다. 재조합 인간 LILRB1 단백질(recombinant humanLILRB1 protein)(sinobiological, Lot No. 16014-H02H)을 1차 항체로 하고, APC 항 인간 IgG Fc(APC anti-human IgGFc)(biolegend, Lot No. 409306)를 2차 항체로 하여 LIRG4-UNKi-l T세포 및 LIRG4-UNKi-2 T세포에서의 scFv의 발현을 검측하고, 결과는 도 12에 도시된 바와 같다. 도 11 및 도 12로부터 알 수 있다시피, 본 발명에 의해 제조된 UNKi-T세포에서 scFv가 모두 효과적으로 발현되었다.
실시예 2의 방법에 따라 UNKi-T세포 및 NK92세포를 공동으로 배양하여, NK세포 살상 작용에 대한 UNKi-T세포의 억제 효과를 검측하고, 결과는 도 13에 도시된 바와 같다. Mock T와 비교할 때, 본 실시예에서 제조된 KIR(도 13A) 또는 LIR1(도 13B)을 타겟팅하는 UNKi-T세포는 전부 T세포에 대한 NK세포의 살상 작용을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. SIGLC7, SIGLEC9 또는 KLRG1을 타겟팅하는 T세포 및 NK세포 살상 작용에 대한 이의 억제 효과
B2m시그널 펩타이드(서열번호 21), 항SIGLEC7-scFv(서열번호 130), 항SIGLEC7/SIGLEC9-scFv(서열번호 184) 또는 항KLRG1-scFv(서열번호 119), IgG4힌지 영역(서열번호 29), CD8α막관통 영역(서열번호 9), CD28공동자극 도메인(서열번호 13)의 코딩 서열을 합성하여 pLVX벡터(Public Protein/Plasmid Library(PPL), Lot No. PPL00157-4a)에 순차적으로 클로닝하여, SC7G4, SC7/SC9G4 및 K1G4플라스미드를 얻고, 시퀀싱을 통해 표적 서열의 플라스미드에서의 정확한 삽입을 확인하였다.
상기 플라스미드를 실시예 1에서의 방법에 따라 T세포에 전입하고, B2M유전자를 녹아웃시켜, NK억제 분자를 발현하고 B2M이 녹아웃된 NKi-T세포(즉, SC7G4-T세포, SC7/SC9G4-T세포 및 K1G4-T세포)를 얻었다. B2M을 녹아웃시킨 T세포를 음성대조 (NT)로 사용하였다.
비오틴-SP(롱스페이서) 아피니퓨어 염소 항 인간 IgG(Biotin-SP(long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG), F(ab') 단편 특이적 항체(F(ab') fragment specific antibody)(Jackson Immuno Research, Lot No. 115-066-072) 및 APC 스트렙타비딘(APC Streptavidin)(BD, Lot No. 554067)으로 SC7G4, SC7/SC9G4 및 K1G4T세포에서의 scFv의 발현을 검측하고, 결과는 도 14에 도시된 바와 같다. 본 발명에 의해 제조된 NKi-T세포에서 scFv가 모두 효과적으로 발현되었다.
실시예 2의 방법에 따라, 상기 NKi-T세포와 NK92-KLRG1세포를 공동으로 배양하여, NK세포 살상 작용에 대한 억제 효과를 검측하였고, 결과는 도 15에 도시된 바와 같다. NT와 비교할 때, 본 실시예에 의해 제조된 SIGLEC7, SIGLEC9 또는 KLRG1을 타겟팅하는 T세포는 전부 T세포에 대한 NK세포의 살상 작용을 현저하게 감소시키는 것을 알 수 있다.
실시예 6. PD-1을 타겟팅하는 T세포 및 NK세포 증식에 대한 이의 억제 효과
PDL1시그널 펩타이드(서열번호 121), PDL1세포 외 영역(서열번호 70), PDL1막관통 영역(서열번호 120), CD28공동자극 도메인(서열번호 13)의 코딩 서열을 합성하여 pLVX벡터(Public Protein/Plasmid Library(PPL), Lot No. PPL00157-4a)에 순차적으로 클로닝하여, PDL1플라스미드를 얻고, 시퀀싱을 통해 표적 서열의 플라스미드에서의 정확한 삽입을 확인하였다.
상기 플라스미드를 실시예 1에서의 방법에 따라 T세포에 전입하고, NK억제 분자를 발현하는 NKi-T세포, 즉, PDL1-T세포를 얻었다. 항PD-Ll항체(Anti-PD-Ll Antibody)((제조사: 솔라바이오(solarbio), Lot No. 10084-R312-A)로 이의 발현을 검측하고, 결과는 도 16에 도시된 바와 같다. PDL1이 효과적으로 발현되었음을 알 수 있다. 미처리된 T세포를 음성 대조군(NT)으로 사용하였다.
상기 NKi-T세포를 배양하여 사이토미토마이신C로 처리하는 동시에, 2개의 이종 유래 PBMC(공여체1(donor1) 및 공여체2(donor2))를 Far-Red로 표기한 후, T세포: PBMC=1: 2의 비율에 따라 공동으로 배양하였다. 2-3일마다 반액체 교환처리(Half-medium-replacement treatment)를 진행하였다. 8일 후 세포 계수를 진행하고, PE 항 인간 CD3(PE anti-human CD3)(제조사: biolegend, Lot No. 317308) 및FITC 항 인간 CD56(FITC anti-human CD56)(제조사: biolegend, Lot No. 362546)으로 염색한 후, 유세포 분석에 의해 NK 세포 집단의 비율을 검측하였다. 세포 총량 * NK세포 집단 비율로 NK세포 수를 계산하였고, 결과는 도 17에 도시된 바와 같다. PD-1을 타겟팅하는 NKi-T세포는 NK세포의 증식을 현저하게 억제할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7. KIR을 타겟팅하는 B세포 및 Huh7세포의 NK세포 살상 작용에 대한 억제 효과
실시예 4에서 제조된 KIRG4플라스미드를 실시예 1에 따른 방법으로 B세포 및 Huh7세포(간암세포)에 전입하고, B2M유전자를 녹아웃시켜, NK억제 분자를 발현하고 B2M이 녹아웃된 NKi-B세포 및 NKi-Huh7세포를 얻었다. B2M유전자만이 녹아웃된 B세포 및 Huh7세포(NC세포)를 음성 대조군으로 사용하였다.
비오틴-SP(롱스페이서) 아피니퓨어 염소 항 인간 IgG(Biotin-SP(long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG), F(ab') 단편 특이적 항체(F(ab') fragment specific antibody)(Jackson Immuno Research, Lot No. 109-065-097) 및 APC 스트렙타비딘(APC Streptavidin)(BD, Lot No. 554067)으로 NKi-B세포 및 NKi-Huh7세포에서의 scFv의 발현을 검측하고, 결과는 도 18에 도시된 바와 같다. B세포 및 Huh7세포에서 모두 NK 억제분자(NK inhibitory molecules)가 효과적으로 발현된 것을 알 수 있다.
실시예 2의 방법에 따라, 상기 제조된 세포 및 NK세포를 공동으로 배양하여, NK세포 살상 작용에 대한 상기 세포의 억제 효과를 검측하고, 결과는 19에 도시된 바와 같다. NC세포와 비교와 비교할 때, 본 실시예에서 제조된 NKi-B세포 및 NKi-Huh7세포는 전부 이에 대한 NK세포의 살상 작용을 현저하게 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
상기 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니며, 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 본 발명은 다양한 보정 및 변경을 가할 수 있다. 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 균등한 대체, 개선 등은 본 발명의 보호 범위 내에 포함되어야 한다는 것은 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해된다.
<110> NANJING BIOHENG BIOTECH CO., LTD <120> Engineered Immune Cell Expressing NK Inhibitory Molecule and Use Thereof <130> BHCN20V2 <160> 196 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mNKG2A scFv-VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 5 9 14 19 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 24 29 34 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 39 44 49 Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 54 59 64 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 69 74 79 84 Leu Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 89 94 99 Thr Arg His Gly Asp Tyr Pro Arg Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 104 109 114 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 119 <210> 2 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> mNKG2A scFv-VH <400> 2 gaagttcaac tggtagagtc agggggcgga ttggtaaagc cggggggctc tctgaagctg 60 tcatgcgccg catctgggtt taccttcagt tcttacgcta tgagttgggt tcgccagtct 120 cccgaaaaga gattggagtg ggtagcggaa attagttcag gcggaagcta cacgtattac 180 cccgatacag tcacgggacg gtttaccatt tcccgcgata atgccaagaa cacgctgtac 240 ctcgagatca gctctttgcg gagcgaggat actgcgatgt attactgcac ccgacacgga 300 gattatccga gattttttga tgtatgggga gcgggaacga cagttaccgt ctccagc 357 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> mNKG2A scFv-VL <400> 3 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 5 9 14 19 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 24 29 34 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 39 44 49 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 54 59 64 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 69 74 79 84 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr 89 94 99 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 104 109 <210> 4 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> mNKG2A scFv-VL <400> 4 cagatagtgc 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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 119 124 129 Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser 134 139 144 Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn 149 154 159 164 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu 169 174 179 Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 184 189 194 Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val 199 204 209 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr 214 219 224 Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 229 234 239 <210> 185 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SIGLEC7/9 scFv-1-2 VL <400> 185 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 5 9 14 19 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 24 29 34 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 39 44 49 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 54 59 64 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 69 74 79 84 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 89 94 99 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 104 109 <210> 186 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SIGLEC7/9 scFv-1-2 VH <400> 186 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 5 9 14 19 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly 24 29 34 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Thr Leu Glu Trp 39 44 49 Met Gly Tyr Ile Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 54 59 64 Asn Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe 69 74 79 84 Leu Gln Phe Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 89 94 99 Ala Arg Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 104 109 114 Thr Val Ser Ala 119 <210> 187 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SIGLEC7/9 scFv-1-2 <400> 187 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 5 9 14 19 Ser Leu Ser Leu 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Ala Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg 184 189 194 Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn 199 204 209 Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Thr 214 219 224 Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 229 234 239

Claims (35)

  1. NK억제 분자에 있어서,
    상기 NK억제 분자는 하나 또는 다수의 NK억제 리간드, 트랜스멤브레인 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하고,
    상기 NK억제 리간드는 NK억제 수용체(NK inhibitory receptor, NKIR)에 특이적으로 결합하여 상기 NK억제 분자를 발현하는 조작된 면역 세포에 대한 NK세포의 살상을 억제하도록 하는 NK억제 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 NK억제 리간드는 NKIR을 타겟팅하는 항체, 또는 NKIR의 천연 리간드 또는 이들이 포함하는 NKIR 결합 영역인 NK억제 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 NKIR은, NKG2/CD94성분; 살상 세포Ig-유사 수용체(KIR) 패밀리 구성원; 백혈구Ig-유사 수용체(LIR) 패밀리 구성원; NK 세포 수용체 단백질1(NKR-P1) 패밀리 구성원; 면역 체크포인트 수용체; 암배아 항원 관련 세포 부착 분자1(CEACAM1); 시알산 결합 면역글로불린형 렉틴(SIGLEC) 패밀리 구성원; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체1(LAIR1); Ly49 패밀리 구성원 및 킬러 세포 렉틴 유사-수용체 G1(KLRG1)로부터 선택되는 NK억제 분자.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 NKG2/CD94성분은 NKG2A, NKG2B 및 CD94으로부터 선택되고; 상기 KIR 패밀리 구성원은 KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2 및 KIR3DL3으로부터 선택되며; 상기 LIR 패밀리 구성원은 LIR1, LIR2, LIR3, LIR5 및 LIR8로부터 선택되고; 상기 NKR-P1 패밀리 구성원은 NKR-P1B 및 NKR-P1D로부터 선택되며; 상기 면역 체크포인트 수용체는 PD-1, TIGIT, CD96, TIM3 및 LAG3으로부터 선택되고; 상기 SIGLEC 패밀리 구성원은 SIGLEC7 및 SIGLEC9로부터 선택되며; 상기 Ly49 패밀리 구성원은 Ly49A, Ly49C, Ly49F, Ly49Gl 및 Ly49G4로부터 선택되는 NK억제 분자.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 NKIR은 NKG2A, NKG2B, CD94, LIR1, LIR2, LIR3, KIR2DL1.KIR2DL2/3, KIR3DL1, CEACAM1, PD1, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9 및 KLRG1로부터 선택되는 NK억제 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK억제 리간드는 NKIR을 타겟팅하는 항체 또는 이의 기능적 단편이고, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 완전한 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv단편, scFv항체 단편, 선형 항체, sdAb 또는 나노 항체인 NK억제 분자.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK억제 리간드는 PD1, NKG2A, LIR1, KIR, SIGLEC7, SIGLEC9 및/또는 KLRG1을 타겟팅하는 항체인 NK억제 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    (i) 상기 NKG2A를 타겟팅하는 항체는, (1) 서열번호 72로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 73으로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 74로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 75로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 76으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 77로 표시되는 CDR-H3, 또는 (2) 서열번호 78로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 79로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 80으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 81로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 82로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 83으로 표시되는 CDR-H3을 포함하고;
    (ii) 상기 LIR1을 타겟팅하는 항체는, (1) 서열번호 90으로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 91로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 92로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 93으로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 94로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 95로 표시되는 CDR-H3, 또는 (2) 서열번호 96으로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 97로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 98로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 99로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 100으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 101로 표시되는 CDR-H3을 포함하며;
    (iii) 상기 KIR을 타겟팅하는 항체는, 서열번호 84로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 85로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 86으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 87로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 88로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 89로 표시되는 CDR-H3을 포함하고;
    (iv) 상기 SIGLEC7, SIGLEC9 또는 두가지 모두를 타겟팅하는 항체는, (1) 서열번호 102로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 103으로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 104로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 105로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 106으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 107로 표시되는 CDR-H3, (2) 서열번호 122로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 123으로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 124로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 125로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 126으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 127로 표시되는 CDR-H3, (3) 서열번호 131로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 132로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 133으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 134로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 135로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 136으로 표시되는 CDR-H3, (4) 서열번호 140으로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 141로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 142로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 143으로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 144로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 155로 표시되는 CDR-H3, (5) 서열번호 176으로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 177로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 178로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 179로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 180으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 181로 표시되는 CDR-H3, 또는 (6)서열번호 188로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 189로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 190으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 191로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 192로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 193으로 표시되는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는
    (v) 상기 KLRG1을 타겟팅하는 항체는, (1) 서열번호 111로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 112로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 113으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 114로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 115로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 116으로 표시되는 CDR-H3, (2) 서열번호 149로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 150으로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 151로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 152로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 153으로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 154로 표시되는 CDR-H3, (3) 서열번호 158로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 159로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 160으로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 161로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 162로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 163으로 표시되는 CDR-H3, 또는 (4) 서열번호 167로 표시되는 CDR-L1, 서열번호 168로 표시되는 CDR-L2, 서열번호 169로 표시되는 CDR-L3, 서열번호 170으로 표시되는 CDR-H1, 서열번호 171로 표시되는 CDR-H2 및 서열번호 172로 표시되는 CDR-H3을 포함하는 것인 NK억제 분자.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK억제 리간드는 HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, 콜라겐, OCIL, 시알산, PD-L1/PD-L2, CD155, CD112, CD113, Gal-9, FGL1, 및 이들이 포함하는 NKIR 결합 영역으로부터 선택되는 NK억제 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 NK억제 리간드는 시알산(sialic acid), HLA-E세포 외 영역(HLA-E extracellular region), HLA-F세포 외 영역(HLA-F extracellular region), HLA-G세포 외 영역(HLA-G extracellular region), E-카드헤린 세포 외 영역(E-cadherin extracellular region), PD-L1세포 외 영역(PD-L1 extracellular region) 및 PD-L2세포 외 영역(PD-L2 extracellular region)으로부터 선택되는 NK억제 분자.
  11. 제10항에 있어서,
    (i) 상기 HLA-E의 세포 외 영역은 서열번호 31 또는 33으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고;
    (ii)상기 HLA-G의 세포 외 영역은 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고;
    (iii) E-카드헤린 세포 외 영역은 서열번호 39 또는 41로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지며;
    (iv) PD-L1세포 외 영역은 서열번호 70으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지고;
    (v) PD-L2세포 외 영역은 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 NK억제 분자.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 트랜스멤브레인 도메인은, TCRα사슬, TCRβ사슬, TCRγ사슬, TCRδ사슬, CD3ζ서브 유닛, CD3ε서브 유닛, CD3γ서브 유닛, CD3δ서브 유닛, CD45, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, HLA-E, HLA-F, HLA-G, 카드헤린, 콜라겐, OCI로부터 선택되는 단백질의 트랜스멤브레인 도메인인 NK억제 분자.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 공동자극 도메인은, LTB, CD94, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD8, CD18, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54, CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD276(B7-H3), CD278(ICOS), CD357(GITR), DAP10, DAP12, LAT, NKG2C, SLP76, PD-1, LIGHT, TRIM, ZAP70 및 이들의 조합으로부터 선택되는 단백질의 공동자극 신호 전달 도메인인 NK억제 분자.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 NK억제 분자는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하지 않는 것인 NK억제 분자.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 NK억제 분자는 세포 내 신호 전달 도메인을 더 포함하는 것인 NK억제 분자.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 세포 내 신호 전달 도메인은, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 선택되는 단백질의 신호 전달 도메인인 NK억제 분자.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 것인 NK억제 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 NK 억제 분자를 코딩하는 핵산 분자.
  19. 제18항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  20. (1) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 NK 억제 분자를 발현하고,
    (2) 적어도 하나의 MHC 관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포는, 키메라 항원 수용체를 추가로 발현하고,
    상기 키메라 항원 수용체는 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 조작된 면역 세포.
  22. (1) 본 발명의 NK억제 분자 및 키메라 항원 수용체의 융합 단백질을 발현하되, 상기 융합 단백질은 NK억제 리간드, 리간드 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하며,
    (2) 적어도 하나의 MHC관련 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 MHC관련 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 MHC관련 유전자는 B2M, RFX5, RFXAP, RFXANK, CIITA 및 이들의 조합으로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 MHC관련 유전자는 B2M을 포함하고,
    상기 NK억제 리간드는 B2M 및 비전형적인 HLA-클래스 I 분자의 세포외 영역의 융합 분자인 조작된 면역 세포.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 비전형적인 HLA-클래스 I 분자는 HLA-E 또는 HLA-G인 조작된 면역 세포.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 NK 억제 분자는 서열번호 46-53으로부터 선택되는 제시펩타이드를 더 포함하는 조작된 면역 세포.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포의 적어도 하나의 TCR/CD3 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되되, 상기 TCR/CD3 유전저는 TRAC, TRBC, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ 및 이들의 조합으로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD52, GR, dCK, PD1, LAG3, TIM3, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 및 GUCY1B3으로부터 선택되는 하나 또는 다수의 유전자의 발현이 억제되거나 침묵되는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드 결합 도메인은, TSHR, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD23, CD24, CD25, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD46, CD47, CD52, CD54, CD56, CD70, CD73, CD80, CD97, CD123, CD22, CD126, CD138, CD 179a, DR4, DR5, TAC, TEM1/CD248, VEGF, GUCY2C, EGP40, EGP-2, EGP-4, CD133, IFNAR1, DLL3, kappa경쇄, TIM3, BAFF-R, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, tEGFR, GD2, GD3, BCMA, GPRC5D, Tn항원, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-22Ra, IL-2, 메소텔린, IL-llRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, CD20, AFP, Folate수용체α, ERBB2(Her2/neu), ErbB3, ErbB4, MUC1, MUC16, EGFR, CS1, CD138, NCAM, 클라우딘(Claudin)18.2, Prostase, PAP, ELF2M, 에프린(Ephrin) B2, IGF-I수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나아제, EphA2, Fucosyl GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, Folate수용체β, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD 179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 레구메인, HPV E6, E7, MAGE-A4, MART-1, WT-1, ETV6-AML, 정자 단백질17(sperm protein 17), XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos관련 항원1, p53, p53변이체, 전립선 특이 단백질(prostate specific protein), 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제(telomerase), PCTA-l/Galectin 8, MelanA/MARTl, Ras변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점(sarcoma translocation breakpoint), ML-IAP, ERG(TMPRSS2ETS융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린Bl(Cyclin Bl), MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B 1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES 1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2, 장 카르복실에스테라아제(intestinal tract carboxylesterase), mut hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, PD1, PDL1, PDL2, TGF β, APRIL, NKG2D, NKG2DL및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 타겟과 결합되는 조작된 면역 세포.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 타겟은, CD7, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD123, CD138, CD171, MUC1, AFP, Folate수용체α, CEA, PSCA, PSMA, Her2, EGFR, IL13Ra2, GD2, NKG2D, EGFRvIII, CS1, BCMA, 메소텔린, Cluadin18.2, ROR1, NY-ESO-1, MAGE-A4 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조작된 면역 세포.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포는 B세포, T세포, 대식 세포, 수지상 세포, 단핵구, NK세포 또는 NKT세포인 조작된 면역 세포.
  33. 제22항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포는 CD4+/CD8+T세포, CD4+헬퍼T 세포, CD8+T세포, 종양 침윤 세포, 기억 T세포, 미접촉 T세포, γδ-T세포 또는 αβ-T세포인 조작된 면역 세포.
  34. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 NK 억제 분자, 제18항에 따른 핵산 분자, 제19항에 따른 벡터 또는 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포, 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약물 조성물.
  35. 암, 감염 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약물 제조에서의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 NK 억제 분자, 제18항에 따른 핵산 분자, 제19항에 따른 벡터 또는 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포의 용도.
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