KR20220160259A - 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220160259A KR20220160259A KR1020210068226A KR20210068226A KR20220160259A KR 20220160259 A KR20220160259 A KR 20220160259A KR 1020210068226 A KR1020210068226 A KR 1020210068226A KR 20210068226 A KR20210068226 A KR 20210068226A KR 20220160259 A KR20220160259 A KR 20220160259A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- taz
- yap1
- slc22a3
- prostate cancer
- mdvr
- Prior art date
Links
- 229960004671 enzalutamide Drugs 0.000 title claims abstract description 119
- WXCXUHSOUPDCQV-UHFFFAOYSA-N enzalutamide Chemical compound C1=C(F)C(C(=O)NC)=CC=C1N1C(C)(C)C(=O)N(C=2C=C(C(C#N)=CC=2)C(F)(F)F)C1=S WXCXUHSOUPDCQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 119
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 89
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 87
- 239000000101 novel biomarker Substances 0.000 title abstract description 6
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102100031873 Transcriptional coactivator YAP1 Human genes 0.000 claims description 155
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 121
- 102100036929 Solute carrier family 22 member 3 Human genes 0.000 claims description 113
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 claims description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 claims description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 3
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 claims description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 2
- 101000775102 Homo sapiens Transcriptional coactivator YAP1 Proteins 0.000 claims 3
- 108091006734 SLC22A3 Proteins 0.000 claims 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 102100027548 WW domain-containing transcription regulator protein 1 Human genes 0.000 description 164
- 101710175789 Tafazzin Proteins 0.000 description 163
- 101710193680 Transcriptional coactivator YAP1 Proteins 0.000 description 152
- 101710102693 Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 110
- 108010009540 DNA (Cytosine-5-)-Methyltransferase 1 Proteins 0.000 description 81
- 102100036279 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Human genes 0.000 description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 102100032187 Androgen receptor Human genes 0.000 description 62
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 62
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 26
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 21
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 20
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 17
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 16
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 14
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 102100032813 Hepatocyte growth factor-like protein Human genes 0.000 description 11
- 101001066435 Homo sapiens Hepatocyte growth factor-like protein Proteins 0.000 description 11
- 101000880431 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase 4 Proteins 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 11
- 108700014788 member 3 solute carrier family 22 (organic cation transporter) Proteins 0.000 description 11
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 238000010199 gene set enrichment analysis Methods 0.000 description 7
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 6
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 6
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 4
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 4
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 102100031171 CCN family member 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010019961 Cysteine-Rich Protein 61 Proteins 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- 102100030943 Glutathione S-transferase P Human genes 0.000 description 3
- 101001010139 Homo sapiens Glutathione S-transferase P Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102100023267 YY1-associated protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- ZQFGRJWRSLZCSQ-ZSFNYQMMSA-N verteporfin Chemical compound C=1C([C@@]2([C@H](C(=O)OC)C(=CC=C22)C(=O)OC)C)=NC2=CC(C(=C2C=C)C)=NC2=CC(C(=C2CCC(O)=O)C)=NC2=CC2=NC=1C(C)=C2CCC(=O)OC ZQFGRJWRSLZCSQ-ZSFNYQMMSA-N 0.000 description 3
- 229960003895 verteporfin Drugs 0.000 description 3
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101150042405 CCN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 description 2
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000871508 Homo sapiens PTB domain-containing engulfment adapter protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 229960003603 decitabine Drugs 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033051 40S ribosomal protein S19 Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000004602 Aldo-Keto Reductase Family 1 Member C3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039181 Ankyrin repeat domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100098985 Caenorhabditis elegans cct-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150091877 Ccn2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- 108010060267 Cyclin A1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 description 1
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 description 1
- 102100025176 Cyclin-A1 Human genes 0.000 description 1
- 102100025191 Cyclin-A2 Human genes 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000848255 Homo sapiens Acyl-CoA 6-desaturase Proteins 0.000 description 1
- 101000889396 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000650162 Homo sapiens WW domain-containing transcription regulator protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 108091007767 MALAT1 Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100033719 PTB domain-containing engulfment adapter protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010065942 Prostaglandin-F synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009167 androgen deprivation therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000023549 cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- 230000002922 epistatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000012742 immunoprecipitation (IP) buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 230000027405 negative regulation of phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000000683 nonmetastatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 229940126701 oral medication Drugs 0.000 description 1
- 150000002892 organic cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011472 radical prostatectomy Methods 0.000 description 1
- 238000011470 radical surgery Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000025053 regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033772 system development Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 전립선암 환자로부터 거세저항성 전립선암 치료제인 엔잘루타미드에 대한 저항성 여부를 예측하기 위한 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측할 수 있는 신규 바이오마커를 제시함으로써 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측용 조성물 및 키트를 제공하여 조기에 엔잘루타미드 저항성을 가지는 개체를 신속하고 정확하게 판별하고 적절한 치료법을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 전립선암 환자로부터 거세저항성 전립선암 치료제인 엔잘루타미드에 대한 저항성 여부를 예측하기 위한 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 조성물 및 키트, 및 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.
전립선암(Prostate cancer, PC)은 국내 남성 암 중 발생률이 가장 빠르게 증가하는 질환이다. 암이 전립선에 국한된 국소 전립선암은 주로 근치적 수술이나 방사선치료를 적용할 수 있어 상대적으로 생존율이 높은 편이며, 특히 근치적 전립선 절제술 후 10년간 재발 없이 생존하는 비율이 70 ~ 85% 정도이다. 하지만 전이성 전립선암은 4기의 말기암으로, 수술이 가능한 1 ~ 2기 전립선암에 비해 암이 빠르게 진행되기 때문에 평균 생존기간이 2년 반으로 급격하게 저하된다.
전립선암은 특징적으로 남성호르몬 수용체(androgen receptor, AR)를 가지는데, 거세 치료와 같이 혈중 남성호르몬 수준을 낮추면 수용체를 통한 세포 신호 전달 체계가 차단됨으로써 암세포가 사멸되게 된다. 그러나 혈중 남성호르몬을 차단했음에도 암이 진행되는 경우를 거세저항성 전립선암(castration resistant prostate cancer, CRPC)이라 하며, 림프절, 뼈, 폐 등 다른 부위로까지 암세포가 전이되는 전이성 거세저항성 전립선암(metastatic CRPC)을 치료하기 위해 도세탁셀(Docetaxel)이라는 항암제와 함께 엔잘루타미드와 같은 차세대 남성호르몬 수용체 억제제를 이용하고 있다.
엔잘루타미드(Enzalutamid)는 2013년에 이전에 도세탁셀로 치료받은 경험이 있는 전이성 거세저항성 전립선암 환자의 치료에 대한 적응증을 허가 받았고, 2015년과 2019년에 각각 무증상 또는 경미한 증상의 전이성 거세저항성 전립선암과 고위험 비전이성 거세저항성 전립선암에 대해 승인을 받아 최초로 전이 여부와 관계없이 거세저항성 전립선암에 사용 가능한 표적치료제가 되었다. 하지만 10 ~ 25%의 거세저항성 전립선암 환자에서는 엔잘루타미드에 저항성을 나타내어 엔잘루타미드에 의한 치료 효과를 보지 못하고 시기적절한 전립선암 치료가 지연되어 예후가 좋지 않다. 따라서 거세저항성 전립선암을 치료하기 전에 환자의 엔잘루타미드에 대한 저항성 여부를 예측 또는 판별할 수 있다면, 적절한 치료법 또는 치료약물을 선택하여 보다 긍정적인 치료 효과를 기대할 수 있다. 그러나 현재 전립선암의 발병을 진단하거나 전립선암의 치료 예후를 예측하는 바이오마커에 관한 연구가 일부 진행되고 있으나, 아직 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측하는 바이오마커에 관한 연구가 미비한 실정이다.
본 발명은 엔잘루타미드 저항성을 예측 가능한 신규 바이오마커를 검출할 수 있는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 엔잘루타미드 저항성을 예측하는 신규 바이오마커의 단백질 발현 수준을 측정하여 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 엔잘루타미드 저항성을 가지는 거세저항성 전립선암 세포주가 약물 저항성이 없는 거세저항성 전립선암 세포주에 비해 SLC22A3 유전자를 현저히 낮은 수준으로 발현하는 것을 확인하여, 두 거세저항성 전립선암 세포주들에서 SLC22A3 유전자 발현에 관여하는 단백질들의 발현 수준을 비교 분석하였다. 그 결과, SLC22A3 유전자의 상위(upstream) 영역에 YAP1/TAZ가 작용하여 SLC22A3 유전자의 발현을 감소시키며, 이러한 YAP1/TAZ 작용에 AR-V7 단백질 또한 관여한다는 것을 최초로 발견함으로써 SLC22A3, YAP1/TAZ 및/또는 AR-V7 단백질의 조합을 전립선암의 엔잘루타미드 저항성을 예측 또는 판별하는 바이오마커로 제시하며, 이러한 바이오마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 양상은 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 조성물을 제공한다.
상기 엔잘루타미드는 남성호르몬 수용체 또는 안드로겐 수용체의 억제제(inhibitor)로, 안드로겐 수용체에 결합하여 남성호르몬이 안드로겐 수용체와 결합하는 것을 방해하거나, 남성호르몬이 결합한 안드로겐 수용체가 세포의 핵 내로 전달되는 것을 차단하거나, 또는 세포 내로 들어간 안드로겐 수용체가 표적유전자의 DNA에 결합하는 것을 차단함으로써 남성호르몬에 의한 신호 전달을 차단하여 암세포의 성장을 억제한다. 이러한 엔잘루타미드는 전이 여부와 관계없이 거세저항성 전립선암의 치료에 사용되는 경구 약물이다.
상기 거세저항성 전립선암은 남성호르몬 박탈요법에 의해 혈중 테스토스테론(testosterone)의 양이 매우 낮은 수준으로 감소된 경우 (50 ng/dL)에도 계속 성장하는 전립선암이다. 초기 단계의 전립선암은 성장을 위해 남성호르몬을 필요로 하지만, 남성호르몬 차단 치료에 저항성을 가지는 거세저항성 전립선암은 남성호르몬 없이도 계속 성장하여 암이 진행되므로 예후가 매우 나쁘다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 전립선암은 거세저항성 전립선암인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "엔잘루타미드 저항성 예측"은 전립선암 환자가 엔잘루타미드를 복용하더라도 암세포가 사멸하지 않아 엔잘루타미드에 의한 치료 효과가 나타나지 않는 경우를 엔잘루타미드에 대해 저항성 또는 내성(resistance)이 있다라고 하며, 전립선암 환자에게 치료약물을 처방하기 전에 환자의 엔잘루타미드 저항성 여부를 판단하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 바이오마커의 발현 수준은 전립선암 환자의 전립선 암세포 또는 이를 포함하는 조직에서 측정되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "바이오마커(biomarker)"는 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 물질로서 생체 변화를 알아낼 수 있는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 본 발명에서는 바이오마커로서 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 핵산 또는 단백질을 이용할 수 있다.
상기 SLC22A3(solute carrier family 22 member 3)는 유기 양이온 수송단백질(organic cation transporter 3, OCT3)로 알려져 있으며, 다양한 조직에서 SLC22A3 유전자에 의해 발현되어 내인성 유기 양이온, 약물, 독소 등을 제거하는 역할을 한다.
상기 YAP1(yes-associated protein 1)은 세포 증식과 세포 사멸 억제에 관여하는 유전자의 전사를 활성화하는 전사 조절자(transcriptional regulator)로, 히포(Hippo) 신호 전달의 마지막 단계에서 작용하는 단백질 분자이다. 이러한 YAP1은 다양한 기능적 파트너와 함께 작용하는데, 그 중 TAZ (WWTR1)와 결합한 YAP1/TAZ 복합체(complex)는 히포 신호 전달이 활성화될 경우 YAP1 및 TAZ 모두 인산화되어 세포질에 존재하는 반면, 히포 신호 전달이 활성화되지 않을 경우 YAP1/TAZ가 핵내로 들어가 유전자 발현을 조절한다.
최근 연구에서는 엔잘루타미드에 대해 저항성을 가지는 전립선암에서 약물 저항성이 없는 전립선암에 비해 유전자 XLOC_l2_002352, FADS2, SLC22A3 및 MALAT1의 발현 감소가 확인되었으나 (John Greene, et al., Scientific Reports volume 9, Article number: 10739, 2019), SLC22A3 유전자의 발현 기전이나 SLC22A3 유전자와 YAP1/TAZ의 상관관계에 관해 밝혀진 바가 없었다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 엔잘루타미드 저항성을 가지는 거세저항성 전립선암 세포주 (MDVR)는 저항성이 없는 거세저항성 전립선암 세포주 (C4-2B)에 비해 다양한 신호 전달에 관여하는 유전자들 중 SLC22A3 유전자의 발현량이 현저히 감소하는데, YAP1/TAZ 단백질이 높은 수준으로 발현할 경우 SLC22A3 유전자의 발현이 현저히 감소하며, 특히 세포핵에서 국소적으로 YAP1/TAZ 단백질이 위치하는 것을 확인하였다. 따라서, SLC22A3 유전자의 전사 수준을 조절하는 YAP1/TAZ 단백질은 전립선암의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위한 바이오마커이며, 전립선암의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위해서는 SLC22A3 및 YAP1/TAZ 단백질의 발현 수준을 전립선 암세포의 핵 또는 암세포 용해물의 핵산 분획물에서 관찰하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 바이오마커의 유전자 또는 단백질에 각각 특이적으로 결합하여 각 유전자 또는 단백질의 존재 여부 및 발현 수준을 측정할 수 있는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제제는 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 유전자 또는 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, 올리고펩티드 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "프라이머(primer)"는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만, 전형적으로 15-30 뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명에서 사용된 "프로브(probe)"는 자연의 또는 변형된 모노머(monomer) 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고, 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머(aptamer), 올리고펩티드 및 PNA(peptide nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서는 표적 단백질의 특이적인 검출을 위해 항원-항체 반응(antigen-antibody reaction)을 이용할 수 있도록 항체인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서는 표적 단백질 SLC22A3 또는 YAP1/TAZ에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론 항체, 다클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.
상기 항체는 당업계에 공지된 기술을 통해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method) (Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 다클론 항체는 표적 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 동물로부터 제조 가능하다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 조성물은 AR-V7의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
상기 AR-V7(androgen receptor splice variant 7)은 안드로겐 수용체(AR) mRNA의 다양한 변이체 중 하나로서 전체 길이의 AR (androgen receptor full length, AR(FL))에 비해 안드로겐과 결합하는 도메인의 C 말단이 일부 절단된 형태이다. 최근 거세저항성 전립선암 환자에서 AR-V7 RNA가 검출되면 엔잘루타미드의 치료에 저항성을 나타낸다는 연구결과가 발표되었다 (C Thoma, N Engl J Med 2014; 371:1028-1038). 그러나, 해당 연구에서는 AR-V7과 YAP1/TAZ의 상호작용, AR-V7에 의한 SLC22A3 유전자의 발현 조절 가능성에 대해 연구한 바가 없었다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 엔잘루타미드 저항성을 가지는 거세저항성 전립선암 세포주 (MDVR)에 YAP1/TAZ와 AR-V7 단백질을 녹다운한 경우 YAP1/TAZ 또는 AR-V7 단백질을 단독으로 녹다운한 경우에 비해 SLC22A3 유전자의 단백질 발현량이 현저한 수준으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 엔잘루타미드 저항성을 가지는 거세저항성 전립선암 세포주의 핵에 YAP1/TAZ와 AR-V7 단백질이 위치하는 것을 확인하였다. 따라서, AR-V7 단백질은 YAP1/TAZ와 함께 SLC22A3 유전자의 전사 수준을 조절하므로 전립선암의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있으며, SLC22A3, YAP1/TAZ 및 AR-V7 단백질의 발현 수준을 모두 측정하여 보다 정확하게 전립선암의 엔잘루타미드 저항성을 예측하는데 이용될 수 있을 것이다.
상기 AR-V7의 발현 수준을 측정하는 제제는 전술한 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 제제에 대한 설명과 동일하므로 여기서 생략한다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 조성물을 포함하는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 키트"는 검사 대상자 또는 전립선암 환자로부터 채취한 생물학적 시료를 통해 엔잘루타미드 저항성 여부를 예측할 수 있는 물질을 의미하며, 이를 통해 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 여부를 신속하고 간편하게 진단할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 면역분석법을 이용하는 것일 수 있다.
상기 면역분석법(immunoassay)은 항원-항체 반응을 이용하여 표적 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 분석 방법으로, 그 일례로는 면역블롯팅(immunoblotting), 방사능면역분석(radioimmunoassay), 방사능면역침전(radio-immunoprecipitation), 면역침전(immunoprecipitation), 면역확산(immuno diffusion), 면역조직화학(immunohistochemistry), 면역형광(immunofluorescence), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 유세포 분석(flow cytometry), 면역친화성(immunoaffinity) 정제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 종래에 개발된 단백질 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 ELISA 키트, 웨스턴 블롯(Western blot) 키트, 방사선면역분석 키트, 면역확산 키트, 면역침전 키트, 면역조직화학 키트, 면역형광염색 키트 및 단백질 마이크로어레이 키트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 SLC22A3 및 YAP1/TAZ 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 AR-V7 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 항체는 전술한 설명과 동일하므로 여기서 생략한다.
본 발명의 다른 일 양상은 a) 전립선암 환자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; b) 상기 생물학적 시료에서 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 측정된 바이오마커의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
상기 a) 내지 c) 단계에 대해 다음에서 자세히 살펴보며, 전술한 내용과 공통된 내용은 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 a) 단계는 엔잘루타미드 저항성 여부에 대한 검사가 필요한 전립선암 환자로부터 생물학적 시료를 채취하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 전립선암 환자는 거세저항성 전립선암 환자인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 생물학적 시료는 전립선 암세포 또는 이를 포함하는 조직인 것일 수 있다.
상기 b) 단계는 생물학적 시료에서 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 존재 여부와 함께 발현 수준을 측정하는 과정으로, 바이오마커를 단백질 수준으로 측정하기 위해 항원-항체 반응을 이용할 수 있다. 본 발명에서는 전술한 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 조성물 또는 키트를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 바이오마커는 핵산 또는 단백질 발현 수준으로 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 핵산 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 단백질 발현 수준은 ELISA, 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, 면역확산, 면역침전, 면역조직화학, 면역형광 및 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.
상기 c) 단계는 생물학적 시료에서 측정된 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 발현량을 엔잘루타미드에 저항성을 나타내지 않는 대조군과 비교하여 엔잘루타미드 저항성 여부를 판단하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 대조군은 정상인 또는 엔잘루타미드 저항성이 없는 전립선암 환자인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계는 측정된 바이오마커 SLC22A3의 발현 수준이 대조군에 비해 낮고, YAP1/TAZ의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우, 엔잘루타미드 저항성을 가지는 것으로 판별하는 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법은 b) 단계에서, 생물학적 시료에서 AR-V7의 발현 수준을 더 측정하는 것일 수 있다. 상기 AR-V7의 발현 수준은 전술한 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 발현 수준과 동일한 방법으로 측정되므로 여기서 생략한다. 이후, 측정된 바이오마커 SLC22A3의 발현 수준이 대조군에 비해 낮고, YAP1/TAZ 및 AR-V7의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우, 엔잘루타미드 저항성을 가지는 것으로 판별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 엔잘루타미드 저항성 여부가 확인되지 않은 거세저항성 전립선암 환자의 암세포를 채취하여 면역조직화학 분석으로 SLC22A3, TAZ 및 AR-V7 단백질을 염색한 결과, 정상인의 전립선 세포에 비해 세포핵 내 SLC22A3 단백질이 낮은 수준으로, TAZ와 AR-V7 단백질이 높은 수준으로 발현함으로써 검사 대상자가 엔잘루타미드에 대해 저항성을 나타내는 거세저항성 전립선암인 것으로 판별할 수 있었다.
본 발명에서는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측할 수 있는 신규 바이오마커를 제시함으로써 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측용 조성물 및 키트를 제공하여 조기에 엔잘루타미드 저항성을 가지는 개체를 신속하고 정확하게 판별하고 적절한 치료법을 제공할 수 있다.
도 1은 엔잘루타미드 저항성(EnzR) 세포주의 전사체 변화의 특징을 나타낸 것으로, (A)는 C4-2B 세포와 비교한 EnzR 세포의 GSEA 분석 결과이고, (B)는 DAVID 웹사이트를 이용하여 현저하게 상향 또는 하향 조절된 유전자의 GO 분석 결과이고, (C)는 GSE110802, GSE130534, GSE137833 및 GSE136129를 포함하는 데이터 세트를 이용하여 공통적으로 상향 또는 하향 조절된 유전자를 보여주는 벤다이어그램이고, (D)는 공통적으로 상향 또는 하향 조절된 주요 유전자의 히트맵(heatmap)이고, (E)는 SLC22A3와 GULP1 유전자의 발현을 C4-2B 세포주와 MDVR 세포주를 통하여 확인한 결과이다.
도 2는 풍부한 AR(FL)에 의한 MST1로부터 YAP1/TAZ의 인산화 방지를 나타낸 것으로, (A)는 YAP1과 TAZ의 단백질 수준을 비교한 결과이고, (B)는 MDVR 세포에서 YAP1/TAZ 표적 유전자 CTGF 및 CYR61의 전사 수준을 확인한 결과이고, (C)는 YAP1과 TAZ의 mRNA 발현을 확인한 결과이고, (D)는 MDVR에서 YAP1과 TAZ의 단백질 수준을 확인한 결과이고, (E)는 Flag-MST1의 형질주입 여부에 따른 YAP1과 TAZ의 단백질 수준을 확인한 결과이고, (F) AR(FL)-결실 MDVR에서 YAP1과 TAZ의 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 AR-V7에 의한 핵 내 YAP1/TAZ의 잔류를 나타낸 것으로, (A) 및 (B)는 AR-V7를 표적하는 siRNA (siv7)의 형질주입 여부에 따른 YAP1과 TAZ의 단백질 및 mRNA 수준을 확인한 결과이고, (C)는 YAP1/TAZ 표적 유전자 CTGF, Cyr61 및 AnkrD1의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (D)는 MDVR에서 AR-V7를 표적하는 siRNA에 의한 YAP1/TAZ 전사 활성을 확인한 결과이고, (E)는 YAP1과 TAZ의 핵 위치화를 확인한 결과이고, (F) 및 (G)는 세포의 핵 내 Flag-YAP1과 AR-V7의 공동화를 확인한 면역형광염색 이미지이고 (축적바 = 20 μM), (H)는 AR-V7 결실에 의한 YAP1/TAZ의 핵 위치화 감소를 확인한 결과이다.
도 4는 TAZ에 의한 DNMT1 전사 유도 및 SLC22A3 발현 억제를 나타낸 것으로, (A) 내지 (C)는 MDVR에서 YAP1과 TAZ의 결핍 여부에 따른 DNMT1과 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (D) 및 (E)는 MDVR에서 TAZ와 DNMT1에 의한 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (F) 내지 (G)는 DAC의 농도 또는 처리 여부에 따른 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (H)는 엔잘루타미드와 DAC에 의한 SLC22A3의 발현 변화를 나타낸 것이고, (I)는 DAC에 의한 SLC22A3 단백질 발현 증가가 TAZ 과발현에 의해 감소됨을 나타낸 것이고, (J)는 SLC22A3의 발현이 DNMT1이 제거되었을 때 증가한 양상을 이미지로 보여준 것이다.
도 5는 MDVR 세포의 AR(FL)/AR-V7-YAP1/TAZ-DNMT1에 의한 SLC22A3 유전자의 발현조절을 보여준 것으로, (A) 및 (B)는 DTH에 의한 AR(FL)와 TAZ 또는 YAP1의 상호작용을 확인한 결과이고, (C)는 TAZ를 통한 AR(FL)과 DNMT1의 상호작용을 확인한 결과이고, (D)는 AR-V7가 매개하는 YAP1/TAZ-DNMT1의 상호작용을 확인한 결과이며, (E) 및 (F)는 MDVR 세포에서 YAP1/TAZ, DNMT1 및/또는 AR-V7을 표적하는 siRNA 처리 여부에 따른 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (G)는 정상(normal) 조직과 CRPC 조직의 TAZ, AR-V7 및 SLC22A3 발현 여부를 확인한 이미지이다.
도 6은 MDVR 세포의 YAP1/TAZ-DNMT1 축(Axis)에 의한 SLC22A3 유전자의 프로모터 조절을 나타낸 것으로, (A)는 SLC22A3 프로모터를 도식화한 것으로서 "A" 및 "B"는 각각 YAP1/TEAD-결합 모티프를 포함하거나 포함하지 않는 유전자 단편을 의미하고, (B)는 "B" 유전자 단편의 풍부한 Flag-YAP1를 확인한 결과이고, (C)는 "B" 유전자 단편의 풍부한 YAP1 또는 TAZ를 확인한 결과이고, (D)는 "B" 유전자 단편의 AR-V7 매개를 통한 풍부한 YAP1를 확인한 결과이고, (E)는 "B" 유전자 단편의 풍부한 DNMT1를 확인한 결과이다.
도 7은 TAZ-DNMT1에 의해 조절된 SLC22A3의 엔잘루타미트 저항성 요구를 나타낸 것으로, (A)는 ENZ와 DAC의 공동처리에 의한 세포 증식을 확인한 결과이고, (B)는 ENZ와 DAC의 공동처리에 의한 세포 증식 마커 유전자 Cyclin A, Cyclin D1 및 GSTP1의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, (C) 및 (D)는 siScr 또는 SLC22A3를 표적하는 siRNA로 형질주입된 MDVR 세포의 ENZ와 DAC의 공동처리에 의한 콜로니 형성율을 확인한 결과이고, (E) 및 (F)는 MDVR 세포에서 shYAP1 또는 shTAZ 레트로바이러스 벡터와 SLC22A3를 표적하는 siRNA의 도입에 의한 YAP1, TAZ 및 SLC22A3의 단백질 발현 수준 및 콜로니 형성율을 확인한 결과이다.
도 8은 YAP1/TAZ 억제제에 의한 SLC22A3 유전자의 발현조절을 보여준 것으로, (A) 및 (B)는 MDVR에서 YAP1/TAZ 억제제인 VER 처리 여부에 따른 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준으로 확인한 결과이고, (C)는 MDVR에서 YAP1/TAZ 억제제인 VER 처리 여부에 따른 콜로니 형성율을 확인한 결과이고, (D)는 MDVR에서 MET와 ENZ의 조합에 의한 시너지 효과 및 세포증식이 억제될 때 SLC22A3의 이소성 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 풍부한 AR(FL)에 의한 MST1로부터 YAP1/TAZ의 인산화 방지를 나타낸 것으로, (A)는 YAP1과 TAZ의 단백질 수준을 비교한 결과이고, (B)는 MDVR 세포에서 YAP1/TAZ 표적 유전자 CTGF 및 CYR61의 전사 수준을 확인한 결과이고, (C)는 YAP1과 TAZ의 mRNA 발현을 확인한 결과이고, (D)는 MDVR에서 YAP1과 TAZ의 단백질 수준을 확인한 결과이고, (E)는 Flag-MST1의 형질주입 여부에 따른 YAP1과 TAZ의 단백질 수준을 확인한 결과이고, (F) AR(FL)-결실 MDVR에서 YAP1과 TAZ의 단백질 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 AR-V7에 의한 핵 내 YAP1/TAZ의 잔류를 나타낸 것으로, (A) 및 (B)는 AR-V7를 표적하는 siRNA (siv7)의 형질주입 여부에 따른 YAP1과 TAZ의 단백질 및 mRNA 수준을 확인한 결과이고, (C)는 YAP1/TAZ 표적 유전자 CTGF, Cyr61 및 AnkrD1의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (D)는 MDVR에서 AR-V7를 표적하는 siRNA에 의한 YAP1/TAZ 전사 활성을 확인한 결과이고, (E)는 YAP1과 TAZ의 핵 위치화를 확인한 결과이고, (F) 및 (G)는 세포의 핵 내 Flag-YAP1과 AR-V7의 공동화를 확인한 면역형광염색 이미지이고 (축적바 = 20 μM), (H)는 AR-V7 결실에 의한 YAP1/TAZ의 핵 위치화 감소를 확인한 결과이다.
도 4는 TAZ에 의한 DNMT1 전사 유도 및 SLC22A3 발현 억제를 나타낸 것으로, (A) 내지 (C)는 MDVR에서 YAP1과 TAZ의 결핍 여부에 따른 DNMT1과 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (D) 및 (E)는 MDVR에서 TAZ와 DNMT1에 의한 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (F) 내지 (G)는 DAC의 농도 또는 처리 여부에 따른 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (H)는 엔잘루타미드와 DAC에 의한 SLC22A3의 발현 변화를 나타낸 것이고, (I)는 DAC에 의한 SLC22A3 단백질 발현 증가가 TAZ 과발현에 의해 감소됨을 나타낸 것이고, (J)는 SLC22A3의 발현이 DNMT1이 제거되었을 때 증가한 양상을 이미지로 보여준 것이다.
도 5는 MDVR 세포의 AR(FL)/AR-V7-YAP1/TAZ-DNMT1에 의한 SLC22A3 유전자의 발현조절을 보여준 것으로, (A) 및 (B)는 DTH에 의한 AR(FL)와 TAZ 또는 YAP1의 상호작용을 확인한 결과이고, (C)는 TAZ를 통한 AR(FL)과 DNMT1의 상호작용을 확인한 결과이고, (D)는 AR-V7가 매개하는 YAP1/TAZ-DNMT1의 상호작용을 확인한 결과이며, (E) 및 (F)는 MDVR 세포에서 YAP1/TAZ, DNMT1 및/또는 AR-V7을 표적하는 siRNA 처리 여부에 따른 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 확인한 결과이고, (G)는 정상(normal) 조직과 CRPC 조직의 TAZ, AR-V7 및 SLC22A3 발현 여부를 확인한 이미지이다.
도 6은 MDVR 세포의 YAP1/TAZ-DNMT1 축(Axis)에 의한 SLC22A3 유전자의 프로모터 조절을 나타낸 것으로, (A)는 SLC22A3 프로모터를 도식화한 것으로서 "A" 및 "B"는 각각 YAP1/TEAD-결합 모티프를 포함하거나 포함하지 않는 유전자 단편을 의미하고, (B)는 "B" 유전자 단편의 풍부한 Flag-YAP1를 확인한 결과이고, (C)는 "B" 유전자 단편의 풍부한 YAP1 또는 TAZ를 확인한 결과이고, (D)는 "B" 유전자 단편의 AR-V7 매개를 통한 풍부한 YAP1를 확인한 결과이고, (E)는 "B" 유전자 단편의 풍부한 DNMT1를 확인한 결과이다.
도 7은 TAZ-DNMT1에 의해 조절된 SLC22A3의 엔잘루타미트 저항성 요구를 나타낸 것으로, (A)는 ENZ와 DAC의 공동처리에 의한 세포 증식을 확인한 결과이고, (B)는 ENZ와 DAC의 공동처리에 의한 세포 증식 마커 유전자 Cyclin A, Cyclin D1 및 GSTP1의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, (C) 및 (D)는 siScr 또는 SLC22A3를 표적하는 siRNA로 형질주입된 MDVR 세포의 ENZ와 DAC의 공동처리에 의한 콜로니 형성율을 확인한 결과이고, (E) 및 (F)는 MDVR 세포에서 shYAP1 또는 shTAZ 레트로바이러스 벡터와 SLC22A3를 표적하는 siRNA의 도입에 의한 YAP1, TAZ 및 SLC22A3의 단백질 발현 수준 및 콜로니 형성율을 확인한 결과이다.
도 8은 YAP1/TAZ 억제제에 의한 SLC22A3 유전자의 발현조절을 보여준 것으로, (A) 및 (B)는 MDVR에서 YAP1/TAZ 억제제인 VER 처리 여부에 따른 SLC22A3의 단백질 및 mRNA 발현 수준으로 확인한 결과이고, (C)는 MDVR에서 YAP1/TAZ 억제제인 VER 처리 여부에 따른 콜로니 형성율을 확인한 결과이고, (D)는 MDVR에서 MET와 ENZ의 조합에 의한 시너지 효과 및 세포증식이 억제될 때 SLC22A3의 이소성 발현을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. RNA 서열분석(sequencing)
총 RNA는 RNA 추출 키트로 추출하였고 RNA 무결성(integrity)은 Bioanalyzer (Agilent)로 확인하였다. 서열분석을 위한 라이브러리(library)는 제조사의 지침에 따라 QuantSeq 3' Library Prep Kit (Lexogen, Inc.)로 생성하여 HiSeq 2000 system (Illumina)으로 서열을 판독하였다. 판독된 리드(read)들은 TopHat (version 2.1.1)을 이용하여 기본변수(default parameter) 값을 적용하여 hg19 인간 참조 유전체(human reference genome)에 매핑하였다. 각 유전자에 대한 매핑된 리드의 발현(abundance) 값은 Cufflinks (version 2.2.1)를 사용하여 계산하였다. 데이터 처리 및 분석은 R/Bioconductor libraries (version 1.4.1106)를 사용하여 수행되었다.
1-2. GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) & ssGSEA
GSEA 분석에서는 Molecular Signatures Database (MSIGDB 7.0)의 홀마크(Hallmark) 유전자 세트를 사용하였다. YAP 활성화의 GSEA를 수행하기 위해, MSigDB의 CORDENOSI_YAP_CONSERED 유전자 세트를 적용하여 이전에 발표된 데이터 세트 (JJ Alumkal et al., PNAS. September 29, 2009 106 (39) 16663-16668)를 사용하였다. ssGSEA(single sample GSEA)는 GSVA 패키지(package)를 사용하여 계산되었다.
1-3. 검증 세트(Validation set)
검증 분석을 위해, GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스에서 엔잘루타미드 저항성(enzalutamide resistant, EnzR) 전립선암 세포주의 전사체(transcriptome) 데이터를 다운로드하여 사용하였다. 본 실험의 결과를 검증하기 위한 데이터 세트는 GEO 웹사이트 (Accession number: GSE110802, GSE130534, GSE136129, 및 GSE137833)에서 얻었다.
1-4. 세포 배양 및 시약
C4-2B 세포는 인간 거세저항성 전립선암 세포주로서 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였으며, MDVR 세포는 엔잘루타미드 저항성을 가지는 인간 거세저항성 전립선암 세포주로서 미국 캘리포니아대학교 의학대학 (연구책임자: Christopher P. Evans)으로부터 공급받았다. C4-2B 세포 및 MDVR 세포는 모두 10% FBS(fetal bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 함유한 RPMI 배지에서 배양하였다. MDVR 세포를 유지하기 위해, RPMI 배지에 엔잘루타미드(enzalutamide, ENZ) 20 μM를 첨가하였다. 데시타빈(decitabine, DAC) (Sigma, A3656) 1 μM을 수용액에 용해하여 -20℃에서 저장하였다. DAC 함유 배지는 매일 신선한 DAC 함유 배지로 교체하였다. DHT(Dihydoxytestosterone)는 10 nM씩 세포에 첨가되었다. 베르테포르핀(verteporfin, VER)은 5 μM의 농도로 사용하였다.
1-5. 유전자 녹다운(knockdown), 발현 구조체 및 형질주입(transfection)
세포들은 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)를 사용하여 대조구로서 스크램블(scrambled) siRNA (siScr) (Santa Cruz) 또는 시험구로서 YAP1 표적 siRNA (Sata Cruz, sc-108080), TAZ 표적 siRNA (Santa Cruz, sc-38568), DNMT1 표적 siRNA (Thermo Fisher, 110914), AR-V7 표적 siRNA (Ambion, Life Technologies, GUAGUUGUGAGUAUCAUGA) 및 SLC22A3 표적 siRNA (Sigma-Aldrich, EHU002291)가 형질주입되었다. HA-TAZ, Flag-MST1, Flag-YAP1, 및 YAP1 또는 TAZ를 표적하는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector) shRNA는 카이스트(KAIST)에서 제공받았다. 이소성 발현(ectopic expression)을 위해, Lipofectamine 2000을 사용하여 형질주입이 수행되었다. 레트로바이러스는 당업계에 공지된 기술을 통해 생산하였다.
1-6. 웨스턴 블롯 및 면역침강
세포의 단백질 용해물(lysate)은 0.5% Triton X-100을 포함하는 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하여 수득하였다. 세포 분획화(Subcellular fractionation)는 단백질 용해물로부터 당업계에 공지된 방법과 같이 균질기(homogenizer)를 사용하여 수행하였다. 간략하게 설명하면, 차가운 저장성 완충액(hypotonic buffer) 200 ul에서 막자(pestle)를 사용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 1000 rpm에서 원심분리하여 침전물을 핵산 분획(nuclear fraction)으로, 상층액을 세포질 분획(cytoplasmic fraction)으로 사용하였다. 웨스턴 블롯과 면역침강(immunoprecipitation)은 최소 두 번의 독립적인 실험을 수행하였다. 상층액은 정상 토끼(normal rabbit) IgG 및 A/G 아가로스 비드(agarose bead)를 함유하는 IP 완충액으로 전처리하여 면역침강에 사용하였다. 여기서 사용된 항체는 AR-V7 (ab8394)이었다.
1-7. qRT-PCR.
RNA는 세포에서 추출하여 제조사의 프로토콜에 따라 M-MLV 역전사효소(reverse transcriptase) (Promega)로 역전사하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 SYBR green 및 하기 표 1의 각 표적 유전자에 대한 프라이머(primer)와 혼합하였다.
| 프라이머 명칭 | 프라이머 서열 | 서열번호 |
| CTGF | F: 5'-CCA ATG ACA ACG CCT CCT G-3' | 1 |
| R: 5'-TGG TGC AGC CAG AAA GCT C-3' | 2 | |
| CYR61 | F: 5'-GGT CAA AGT TAC CGG GCA GT-3' | 3 |
| R: 5'-GGA GGC ATC GAA TCC CAG C-3' | 4 | |
| ANKRD1 | F: 5'-CAC TTC TAG CCC ACC CTG TGA-3' | 5 |
| R: 5'-CCA CAG GTT CCG TAA TGA TTT-3' | 6 | |
| YAP1 | F: 5'-TAG CCC TGC GTA GCC AGT TA-3' | 7 |
| R: 5'-TCA TGC TTA GTC CAC TGT CTG T-3' | 8 | |
| TAZ | F: 5'-GAT CCT GCC GGA GTC TTT CTT-3' | 9 |
| R: 5'-CAC GTC GTA GGA CTG CTG G-3' | 10 | |
| SLC22A3 | F: 5'-ATC GTC AGC GAG TTT GAC CTT-3' | 11 |
| R: 5'-ACC TGT CTG CTG CAT AGC CTA-3' | 12 | |
| DNMT1 | F: 5'-AGG CGG CTC AAA GAT TTG GAA-3' | 13 |
| R: 5'-GCA GAA ATT CGT GCA AGA GAT TC-3' | 14 | |
| Cyclin A1 | F: 5'-GAG GTC CCG ATG CTT GTC AG-3' | 15 |
| R: 5'-GTT AGC AGC CCT AGC ACT GTC-3' | 16 | |
| Cyclin D1 | F: 5'-GCT GCG AAG TGG AAA CCA TC-3' | 17 |
| R: 5'-CCT CCT TCT GCA CAC ATT TGA A-3' | 18 | |
| GSTP1 | F: 5'-CCC TAC ACC GTG GTC TAT TTC C-3' | 19 |
| R: 5'-CAG GAG GCT TTG AGT GAG C-3' | 20 |
1-8. 염색질 면역침강(Chromatin immunoprecipitation, Chip) 분석
면역침강을 위한 MDVR 세포의 염색질 내 Flag-YAP1, HA-TAZ 또는 DNMT1의 결합 영역은 당분야에 공지된 방법으로 준비되었다. 간략하게 설명하면, MDVR 세포는 1% 포름알데히드로 교차결합된 Flag-YAP1, HA-TAZ, siScr 또는 siAR-V7이 형질주입되었고, 이를 1M 글리신으로 냉각하였다. 세포를 용해 완충액 (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-Hcl (pH 8.0) 및 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor) 함유)으로 용해한 후 초음파 처리하였다. 이후 실험 절차는 당분야에 공지된 방법에 따라 수행하였다. SLC22A3의 상위(upstream)에 결합하는 프라이머를 사용하여 A 단편(fragment) (음성 대조군)을 증폭하고, SLC22A3에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 B 단편 (TEAD-결합 모티프인 TGGAATG를 포함)을 증폭하였다 (도 5 참고). 여기서 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같다.
| 프라이머 명칭 | 프라이머 서열 | 서열번호 |
| A 단편 | F: 5'-CTA GCA CTT ATG TTT CAA GGC-3' | 21 |
| R: 5'-GTG CTC CTA ACA TAT CTA AGA-3' | 22 | |
| B 단편 | F: 5'-TGG AGA GCC CTG TCG AAA TAG-3' | 23 |
| R: 5'-TGT GTC ATC TTC TGC CCT CCT-3' | 24 |
1-9. 루시페라아제 분석(Luciferase assay)
8xGTIIc-루시페라아제 리포터 구조체(luciferase reporter construct)와 pTk-레닐라(Renilla) (형질주입 대조군)는 MDVR 세포에 공동형질주입(co-transfect) 되었다. 루시페라아제의 활성은 루시페라아제 분석 시약 (Promega luciferase assay reagent)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다.
1-10. 면역형광 분석(Immunofluorescence analysis)
C4-2B 또는 MDVR 세포는 PBS로 세척하여 4℃에서 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 0.1% 트리톤 X-100 함유 PBS로 투과시켜 2% BSA-PBS로 차단한 다음 1차 항체인 토끼(rabbit) 항-AR-V7 항체 (ab198394), 염소(goat) 항-Flag 항체 (ab1257), 토끼 항-DNMT1 항체 (ab188453) 또는 생쥐(mouse) 항-SLC22A3 항체 (ab75402)로 1시간 배양하였다. 세포를 1X PBS로 세척하고 2차 항체인 Alexa Fluor 488 donkey 항-염소 (molecular probes in LifeTechnologies A-11055), Cy3-conjugated AffiniPure F (ab')2' Fragment Donkey, 항-토끼 IgG (711-166-152) 또는 Alexa Fluor 488 donkey 항-생쥐 IgG (molecular probes in life technologies, A 21202)로 1시간 배양하였다. 이후, 세포를 1X PBS로 4회 세척하였다. 핵은 DAPI로 염색하고 세포는 DAKO 봉입제(mounting medium)로 봉입하였다.
1-11. 콜로니 형성 분석
C4-2B 또는 MDVR 세포는 6웰 플레이트(6-well plate)에서 웰당 세포 500 ~ 1,000개로 2주간 배양한 후 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정시키고 0.5% (w/v) 크리스털 바이올렛(crystal violet) (Sigma-Aldrich)으로 15분간 염색하였다.
1-12. 조직 및 면역형광 분석
조직(tissue)은 파라핀으로 포매하여 슬라이드로 준비하였고, 조직학적 분석을 위해 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하였다. 조직 슬라이드에서 각 표적 단백질의 발현을 모니터링하기 위해, 프로브(probe)로 TAZ 항체 (Abcam), AR-V7 항체 (ab198394), SLC22A3 항체 (ab75402) 또는 DBA 항체 (Vector, FL-1031)를 사용하였다.
2. 결과
2-1. 전사체 분석을 통한 EnzR 세포주의 변화 특징
EnzR 세포의 전사체 변화를 특징화하기 위해, C4-2B 세포 (Ctrl, 대조군)와 MDVR 세포 (EnzR) 모두에서 RNA 서열분석한 후 홀마크 유전자 세트를 이용하여 GSEA를 수행하였다. 그 결과, EnzR에서는 G2M 체크포인트(checkpoint) 및 E2F 표적(target) 유전자 세트를 포함한 세포 주기 관련 경로가 상당히 활성화된 반면, 안드로겐 반응(Androgen response) 관련 유전자 세트는 상당히 비활성화되었다 (도 1의 A). 또한, 엔잘루타미드에 저항성을 나타내는 동안 전사체 변화를 평가하기 위해, 대조군과 EnzR 간에 t-검정(test)을 수행하고 923개의 차등 발현 유전자(differentially expressed gene, DEG)를 식별하였다 (p < 0.05, 배수 차이(fold difference) > 1). EnzR에서 이러한 유전자의 생물학적 역할을 확인하기 위해, DAVID 웹사이트를 사용하여 GO(Gene Ontology)를 분석하였다. 그 결과, EnzR에서 상향 조절된 유전자는 세포 증식(cell proliferation), 시스템 발달(system development) 및 세포 분화(cell differentiation)의 조절과 관련된 것이며, EnzR에서 하향 조절된 유전자는 세포-세포 신호전달(cell-cell signaling), 세포 부착(cell adhesion), 이온 전달(ion transport)과 관련된 것이었다 (도 1의 B). 종합하면, 이러한 전사체 변화는 엔잘루타미드 저항성의 발생과 연관될 수 있다. 엔잘루타미드 저항성과 관련된 드라이버 유전자(driver gene)를 식별하기 위해, GSE110802, GSE137833, GSE130534 및 GSE136129를 포함한 4개의 독립 데이터 세트의 DEG 목록을 본 발명의 데이터 세트와 비교 분석하였다. 그 결과, 유전자 AKR1C3를 제외한 SLC22A3, GULP1 및 TFPI는 ENZ 처리에 의해 하향 조절되는 것으로 확인되었다 (도 1의 C 및 D). 특히 SLC22A3는 대조군과 EnzR 모두에서 뚜렷한 발현 차이가 확인되어, SLC22A3의 발현 저하가 엔잘루타미드 저항성과의 연관성이 높은 것을 알 수 있다 (도 1의 E).
2-2. 풍부한 AR(FL)에 의한 MST1로부터 YAP1/TAZ의 인산화 방지
종래 CRPC 세포의 핵에서 YAP1과 AR(FL) 사이에 관련성이 있음이 보고되었으나, 엔잘루타미드에 저항성이 있는 CRPC에서 YAP1과 TAZ의 발현은 보고된 바가 없었다. 따라서, CRPC 세포 (C4-2B)와 엔잘루타미드 저항성 CRPC 세포 (MDVR)에서 YAP1/TAZ와 AR(FL)의 구별되는 발현 패턴을 조사하였다. C4-2B과 MDVR 세포는 10 nM DHT를 6시간 처리하기 전에 대조구(control) 또는 20 μM ENZ를 처리하여 36시간 처리하였다. 그 결과, C4-2B에서 DHT 노출로 인해 증가된 AR(FL)은 ENZ 처리로 인해 감소한 반면, MDVR에서는 ENZ 처리와 관계없이 AR(FL)의 지배적인 발현을 보여주었다. AR-V7 및 YAP1/TAZ의 단백질 발현 또한 AR(FL)와 유사한 패턴으로 나타났다 (도 2의 A). 이러한 결과는 YAP1/TAZ 발현이 C4-2B과 MDVR에서 총 AR(FL)의 양과 상관관계가 있음을 나타낸다. 또한, C4-2B 또는 MDVR에서 YAP1/TAZ 활성을 반영하는 표적 유전자 (CTGF 및 CYR61)의 발현이 DHT (10 nM)가 있는 상태에서 엔잘루타미드의 영향을 받았는지 조사하였다. 그 결과, ENZ 처리는 C4-2B에서 두 유전자의 발현 수준을 감소시켰으나, MDVR에서는 ENZ 처리 여부와 관계없이 두 유전자가 높게 발현되어, 이는 MDVR에서 지속적으로 YAP1/TAZ가 활성화됨을 나타낸다 (도 2의 B). 또한, YAP1/TAZ의 발현을 mRNA 수준에서 평가한 결과, MDVR에서 YAP1/TAZ의 전사는 C4-2B에 비해 약간 증가하였으나, C4-2B 또는 MDVR에서 YAP1/TAZ mRNA의 발현 차이는 DHT, ENZ 처리 여부에 의한 유의미한 차이가 없었다 (도 2의 C). 이러한 결과는 YAP1/TAZ의 증가된 mRNA 수준이 MDVR에서 YAP1/TAZ 단백질을 풍부하게 하는데 충분하지 않음을 나타낸다. 또한, 단백질 수준에서 YAP1/TAZ가 증가하는지를 시험하기 위해, DHT 또는 ENZ+DHT 조건에서 Flag-YAP1 또는 HA-TAZ로 형질주입된 C4-2B 내 외인성 YAP1/TAZ의 단백질 수준을 조사하였다. 그 결과, DHT 처리는 C4-2B에서 Flag-YAP1 또는 HA-TAZ 단백질의 양을 증가시켰으며, ENZ가 있는 경우에는 감소하였다 (도 2의 D). 또한, 단백질 합성을 억제하는 사이클로헥시미드(cycloheximide, CHX)가 존재하는 상태에서 배양된 AR(FL)-침묵(silenced) MDVR에서 YAP1/TAZ의 안정성을 측정하였다. C4-2B와 MDVR 세포에 대조구 벡터 또는 Flag-MST1을 형질주입한 후 10 nM DHT가 있는 상태에서 대조구 또는 20 μM ENZ를 36시간 처리하였다. 그 결과, siRNA AR(FL)을 전달한 MDVR에서는 YAP1 또는 TAZ의 반감기는 대조군에 비해 발현이 상당히 감소하였다 (도 2의 E). 이러한 결과는 AR(FL)-녹다운 MDVR에서 YAP1/TAZ가 안정화되지 않았기 때문에 YAP1/TAZ 안정성에는 AR(FL)의 존재가 필요함을 시사한다.
MST1은 직접 인산화에 의한 YAP1의 분해를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 안드로겐 수용체(AR)는 안드로겐에 의해 YAP1을 조절하는 역할을 한다. 따라서 향상된 AR(FL) 발현이 MST1로부터 YAP1의 인산화를 보호한다고 가정하여, MST1의 이소성 발현(ectopic expression)이 ENZ를 처리하거나 처리하지 않은 C4-2B 및 MDVR에서 YAP1 단백질의 인산화 수준을 증가시키는지 조사하였다. 그 결과, ENZ 처리는 총 YAP1 단백질을 감소시키면서 YAP1의 인산화를 약간 증가시켜 AR 단백질을 C4-2B과 유사한 수준으로 발현시켰다 (도 2의 F, Line 1 및 2). 이와 비교하여, MST1의 강력한 발현은 AR(FL) 단백질의 양에 관계없이 총 YAP1 단백질을 감소시키면서 YAP1의 인산화를 현저하게 증가시켰다 (도 2의 F, Line 3 및 4). 또한, AR(FL)가 포화상태인 MDVR은 총 YAP1 단백질이 증가하면서 YAP1의 인산화 수준이 감소함을 보였으며, 이는 ENZ 처리나 MST1의 과발현에 있어서 변화가 없었다 (도 2의 F, Line 5 내지 8). 이러한 결과는 MST1 매개를 통한 YAP1/TAZ의 분해가 AR(FL)의 높은 발현에 의해 억제될 가능성이 있음을 나타낸다. 이를 확인하기 위해, AR(FL), MST1 또는 이들 모두에 대해 siRNA에 의해 침묵된 MDVR에서 YAP1의 인산화 수준을 분석하였다. 그 결과, AR(FL)의 결핍(depletion)은 YAP1/TAZ 단백질 수준을 감소시켰고, MST1의 녹다운에 의해 siScr-발현 MDVR과 비슷한 수준으로 회복되었다 (도 2의 G). 종합하면, 이러한 결과는 ENZ-저항성 MDVR의 풍부한 AR(FL) 단백질이 MST1에 의한 YAP1의 인산화 억제를 통해 YAP1/TAZ 단백질 수준을 증가시키는데 기여한다는 것을 시사한다.
2-3. AR-V7에 의한 핵 내 YAP1/TAZ의 잔류
전술한 실험을 통해 YAP1/TAZ가 MDVR에서 SLC22A3의 전사 활성화제(transcriptional activator) 역할을 하며 후생유전학적 조절(epigenetic regulation)을 하는 것을 확인하였다. 본 실험에서는 MDVR에서 YAP1/TAZ와 AR-V7 사이의 긍정적인 상관관계가 DNA 메틸화를 위해 DNMT1을 통한 SLC22A3 유전자의 발현을 상쇄한다는 가설을 세워, AR-V7 결핍이 YAP1/TAZ, DNMT1 또는 SLC22A3 단백질 수준에 미치는 영향을 조사하였다. C4-2B 및 MDVR 세포는 siScr 또는 AR-V7에 대한 siRNA로 형질주입한 후 32시간째 DHT를 처리하고, 형질전환한지 36시간째 세포를 회수하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, AR-V7의 녹다운이 MDVR의 YAP1/TAZ 단백질 수준을 변화시키지는 않았지만, DNMT1은 C4-2B와 유사한 수준으로 현저히 감소하였고, SLC22A3가 MDVR에서 발현되었다 (도 3의 A). 그리고 AR-V7가 없더라도 C4-2B에 비해 MDVR에서 높은 수준으로 발현되는 YAP1/TAZ 전사체가 변하지 않았다 (도 3의 B). 그러나 AR-V7의 결핍은 MDVR에서 Ctgf, Cyr61, AnkrD1과 같은 YAP1/TAZ 표적 유전자의 mRNA 발현과 YAP1/TAZ의 전사 활성을 감소시켰으며, 이는 AR-V7이 AP1/TAZ 단백질 수준의 변화 없이 YAP1/TAZ의 전사 활성을 긍정적으로 조절함을 의미한다 (도 3의 C 및 D). AR-V7의 핵 위치화(nuclear localization)를 고려하여, C4-2B 또는 MDVR의 핵에서 DHT 노출에 의한 YAP1/TAZ, DNMT1 및 AR-V7이 나타나는지 확인하였다. C4-2B 및 MDVR 세포는 DHT 10 nM를 24시간 처리한 후 핵산 분획물을 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 결과, DHT로 처리된 C4-2B에서는 핵에서 YAP1과 TAZ 단백질이 약간 증가한 반면, YAP1/TAZ와 DNMT1은 DHT 처리와 관계없이 MDVR의 핵에서 높게 나타났다 (도 3의 E). 또한, DHT를 처리한 C4-2B 또는 MDVR에서 Flag-YAP1이 AR-V7 또는 DNMT1와 공동화(colocalize)하는지 조사하였다. 그 결과, C4-2B에서는 AR-V7의 발현 없이 세포질과 핵에 분포하는 Flag-YAP1을 이소성으로 발현하는 반면, MDVR의 Flag-YAP1은 대부분 핵에 위치하여 AR-V7 발현과 겹쳤다 (도 3의 F). 또한, Flag-YAP1을 발현하는 MDVR에서 DNMT1가 높은 수준으로 발현되었고, C4-2B에 비해 MDVR에서 DNMT1와 Flag-YAP1가 핵에 동일하게 위치하였다 (도 3의 G). 이러한 결과는 AR-V7과 YAP1/TAZ 사이의 긍정적인 상관관계가 YAP1/TAZ의 핵 위치화와 관련 있으며, 이들의 활성을 조절함을 나타낸다. 또한, MDVR에서 AR-V7의 결핍에 의한 YAP1/TAZ의 핵 위치화, DNMT1 및 SLC22A3 단백질 수준 변화를 조사하였다. 그 결과, AR-V7의 침묵은 핵(N)에서 DNMT1 단백질 수준을 감소시킨 반면 세포질(C)에서 SLC22A3 단백질 수준을 증가시켜 MDVR에서 YAP1/TAZ의 핵 위치화 손실을 동반하였다 (도 3의 H). 종합하면, 엔잘루타미드 저항과 관련된 AR-V7은 DNMT1과 공동화된 핵 내에 보존됨으로써 YAP1/TAZ를 활성화시키며, 그 결과 SLC22A3 단백질의 발현 수준이 특히 세포질에서 감소된 것을 알 수 있다.
2-4. TAZ에 의해 유도된 DNMT1의 MDVR 내 SLC22A3 발현 억제
MDVR에서 YAP1/TAZ로 유도된 DNMT1이 SLC22A3의 프로모터 내 CpG 섬(island)의 메틸화를 통해 SLC22A3 유전자의 발현을 상쇄한다는 가설을 세워, MDVR에서 YAP1/TAZ의 결핍이 DNMT1 또는 SLC22A3 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, YAP1/TAZ의 녹다운에서는 DNMT1 단백질 양이 감소한 반면, SLC22A3 단백질 수준이 현저하게 증가하였다 (도 4의 A). 또한, YAP1, TAZ 또는 이들 모두의 결핍이 SLC22A3의 mRNA 발현을 증가시켰는지 확인한 결과, YAP1 및 TAZ 침묵은 각각 YAP1 또는 TAZ의 단독 결핍에 비해 SLC22A3의 mRNA 발현 수준을 증가시켰다 (도 4의 B). 또한, YAP1 또는 TAZ가 없을 때 DNMT1의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과, DNMT1의 mRNA 발현은 TAZ 녹다운에서 현저히 감소되었지만 YAP1 녹다운에서 감소되지 않았다 (도 4의 C). 이러한 결과는 TAZ의 이소성 발현이 DNMT1의 mRNA 발현을 상향 조절함을 나타낸다. 또한, SLC22A3 발현의 조절에서 TAZ와 DNMT1 사이의 상위(epistatic) 관계를 결정하기 위해, TAZ 또는 DNMT1의 단독 결핍 또는 공동 결핍이 SLC22A3의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. DNMT1 침묵은 TAZ의 결핍보다 SLC22A3 수준의 증가를 유도하여 DNMT1 단백질을 약간 감소시켰다. TAZ 및 DNMT1의 공동 결핍은 MDVR에서 TAZ 또는 DNMT1의 단독 결핍에 비해 SLC22A3 단백질의 수준을 증가시켰으며, 이는 TAZ와 DNMT1이 SLC22A3의 상위(upstream) 조절자로 기능한다는 것을 의미한다 (도 4의 D). 또한, DNMT1 침묵은 SLC22A3 전사체의 양을 증가시키고 TAZ의 과다 발현은 TAZ를 발현하는 C4-2B에서 DNMT1의 녹다운에 의해 회복된 SLC22A3 전사체의 발현을 감소시켰다 (도 4의 E). 이러한 결과는 DNMT1이 MDVR에서 SLC22A3 발현을 억제하는 TAZ의 하위 매개자(downstream mediator)가 될 수 있음을 나타낸다. 또한, MDVR에서 SLC22A3의 발현 억제에 대한 DNMT1의 역할을 추가로 조사하기 위해, DNMT1 억제제인 데시타빈(DAC)에 대한 SLC22A3 단백질의 발현 변화를 관찰하였다. C4-2B 및 MDVR 세포는 1 nM DAC를 36시간 처리하였다. 그 결과, C4-2B에서 SLC22A3의 높은 수준은 DAC의 처리에 의해 현저히 변화하지 않은 반면, DAC처리된 MDVR에서 DNMT1 단백질은 감소되었고 SLC22A3는 C4-2B와 유사한 수준으로 회복되고 되었다 (도 4의 F). 또한, DAC로 처리된 MDVR에서는 미처리 MDVR에 비해 SLC22A3의 mRNA가 증가하였다 (도 4의 G). 이러한 결과는 DNMT1의 적절한 발현이 MDVR에서 SLC22A3의 mRNA 발현을 억제함을 나타낸다. 또한, DNMT1은 MDVR에서 SLC22A3의 단백질 수준을 낮게 조절하지만, DAC 처리한 경우에는 DNMT1의 단백질 수준을 감소시켜 SLC22A3 단백질의 발현을 증가시켰다 (도 4의 H). 또한, ENZ에 노출된 MDVR은 DAC 처리에 의해 DNMT1가 낮은 수준으로 발현되면서 SLC22A3의 발현이 현저히 증가하였다 (도 4의 I). 이 결과도 DNMT1이 MDVR에서 SLC22A3의 발현을 억제한다는 사실을 뒷받침한다. 또한, 면역형광 분석을 이용하여 DNMT1의 결핍에 의한 SLC22A3 발현을 관찰한 결과, SLC22A3은 DNMT1-결핍 MDVR의 세포질막과 세포질에서 발현되는 반면, siScr-형질주입 MDVR에서는 발현되지 않았다 (도 4의 J).
2-5. AR(FL)/AR-V7-YAP1/TAZ-DNMT1에 의한 SLC22A3 유전자 발현 조절
앞서 설명한 것과 같이 과량의 AR(FL)와 AR-V7가 핵내에 위치하는 두가지 이유로 YAP1/TAZ를 활성화시키며, DNMT1의 발현을 유도하고 이는 SLC22A3의 발현을 억제한다는 것을 보였다. 본 실험에서는 YAP1/TAZ와 AR(FL)/AR-V7의 상호작용이 SLC22A3의 상위 영역의 프로모터에 DNMT1을 불러들여 SLC22A3의 발현을 조절할 것으로 예상하였다. 먼저, AR(FL)/AR-V7이 DHT 처리 여부에 따라 YAP1/TAZ 복합체를 이루는지 조사하였다. MDVR 세포는 1nM DHT로 36시간 처리한 후 각 항체를 이용하여 면역침강을 수행하였다. 그 결과, AR(FL) 면역침강에서 DHT를 처리하지 않은 경우에는 YAP1 또는 TAZ와 AR(FL)이 약한 상호작용을 나타낸 반면, DHT를 처리한 경우에는 AR(FL)이 TAZ 또는 YAP1과 잘 침강되었으며, AR(FL)과 AR-V7의 상호작용은 변하지 않았다 (도 5의 A). 이러한 결과는 DHT 처리로 활성화된 AR(FL)이 YAP1 또는 TAZ와 상호작용하기 쉽다는 것을 나타낸다. 그리고 TAZ 면역침강에서는 DHT 없이 DNMT1 또는 AR(FL)과의 상호작용을 보인 반면, DHT 처리로 인해 TAZ와 DNMT1 또는 AR(FL)이 강한 연관성을 보였다 (도 5의 B). 이러한 결과는 DHT에 대한 MDVR의 반응에서 DNMT1과 TAZ의 강한 상호작용이 AR(FL)이 TAZ와 작용하여 DNMT1과의 상호작용을 더 넓은 범위로 확장할 수 있음을 설명한다. DNMT1과의 AR(FL) 복합체를 형성하는 것이 TAZ가 필요한지를 확인하기 위해, DHT가 존재하는 상태에서 TAZ의 mRNA를 표적하는 shRNA 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 MDVR의 세포용해물을 이용하여 AR(FL)를 AR(FL) 항체로 침강하였다. 그 결과, AR(FL) 면역침강에서는 대조군에서 DNMT1이 AR(FL)과 함께 침강된 반면, TAZ의 발현이 적은 MDVR에서 DNMT1과 AR(FL)이 더 적게 침강되었다 (도 5의 C). 이러한 결과는 AR(FL)이 DNMT1과 상호작용하며, TAZ가 이러한 복합체를 형성하기 위해 필요함을 나타낸다. AR-V7에 의한 YAP1 또는 TAZ의 핵 위치화가 YAP1/TAZ와 DNMT1의 상호작용에 기여하는지 판단하기 위해, 스크램블 또는 AR-V7에 대한 siRNA가 형질주입된 DHT-처리 MDVR의 핵산 분획물을 사용하여 DNMT1의 면역침강을 수행하였다. 그 결과, 예상대로 MDVR의 AR-V7 녹다운은 YAP1 또는 TAZ가 DNMT1과 결합하는 양이 감소됨을 보여준다 (도 5의 D). 이러한 결과는 AR-V7-결핍 MDVR의 DNMT1 면역침강이 YAP1, TAZ 또는 AR-V7과 약한 상호작용을 하며, DNMT1이 AR-V7을 포함하는 복합체를 형성하고 YAP1 또는 TAZ가 AR-V7에 의해 핵에서 보존된다는 것을 나타낸다.
2-6. 엔잘루타미드 저항성을 예측하는 바이오마커
YAP1/TAZ-침묵 MDVR에서 AR-V7 또는 DNMT1의 녹다운이 SLC22A3의 mRNA 또는 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, YAP1/TAZ 결실은 DNMT1 또는 AR-V7의 침묵에 비해 SLC22A3의 단백질 또는 전사 수준을 더 증가시켰고, AR-V7와 YAP1/TAZ의 공동 침묵은 SLC22A3의 mRNA 또는 단백질 수준을 크게 증가시켰지만, YAP1/TAZ와 DNMT1의 공동 침묵은 SLC22A3의 MRNA 또는 단백질 수준에 미치는 영향이 크지 않았다 (도 5의 E 및 F). 이러한 결과는 AR-V7와 YAP1 또는 TAZ가 엔잘루타미드 저항성을 가지는 환자의 특이적 마커(marker)가 될 수 있음을 제안한다. 이를 확인하기 위해, 정상인과 CRPC 환자의 조직에서 TAZ, SLC22A3 및 AR-V7의 면역조직화학 분석을 수행하였다. 그 결과, 정상 조직(normal)에서는 TAZ와 AR-V7을 발현하지 않으면서 SLC22A3를 높게 발현하는 반면, CRPC 조직은 SLC22A3을 낮은 수준으로 발현하면서 TAZ 또는 AR-V7을 강하게 발현하였다 (도 5의 G). 따라서 본 실험의 CRPC 조직은 엔잘루타미드 저항성을 가지는 것임을 추측할 수 있다. 이러한 결과는 TAZ 및 AR-V7의 강력한 발현과 함께 SLC22A3의 미발현이 엔잘루타미드 저항성을 가지는 CRPC에 대한 유의미한 예측 마커가 될 수 있음을 시사한다.
2-7. YAP1/TAZ-DNMT1 축(Axis)에 의한 SLC22A3 유전자의 프로모터 조절
전술한 실험에서는 TAZ-유도 DNMT1이 MDVR에서 SLC22A3의 mRNA 수준을 억제하며, DNMT1과 함께 AR(FL)/AR-V7 및 YAP1/TAZ가 MDVR에 관련 있음을 확인하였다. DNMT1를 포함하는 단백질 복합체가 유전체 DNA에 결합하여 SLC22A3의 발현을 직접적으로 억제한다는 가설을 세우고, SLC22A3 유전자의 유전체 서열을 분석한 후 TEAD-결합 서열 (TGGAATG)로 추정되는 전사 시작 부위(transcription start site, TSS)의 하위 -1.5 kb의 존재를 확인하였다 (도 6의 A). Flag-YAP를 발현하는 MDVR에서 항-Flag 항체를 사용하여 Chip 분석을 수행한 결과, "B"로 표시되는 -1.5 kb 영역에는 YAP이 풍부한 반면, "A"로 표시되는 음성 대조군 영역에는 Flag-YAP이 풍부하지 않았다 (도 6의 B). 또한, HA-TAZ를 발현하는 MDVR에서는 HA-TAZ가 B 영역에 풍부하였다 (도 6의 C). AR-V7의 존재가 SLC22A3의 상위 영역에서 YAP1 풍부에 영향을 미치는지 시험하기 위해, MDVR 세포에 siScr 또는 scAR-V7를 형질주입하고 1 nM DHT로 36시간 배양하였다. 그 결과, 예상대로, AR-V7이 결핍된 경우에는 SLC22A3 프로모터의 B 영역에서 Flag-YAP1이 감소하였다 (도 6의 D). TAZ-유도 DNMT1이 TAZ를 포함하는 복합체를 형성하는지 확인하기 위해, HA-TAZ를 발현하는 MDVR에서 항-DNMT1 항체를 사용하여 Chip 분석을 수행하였다. 그 결과, DNMT1는 벡터 발현과 비교하여 HA-TAZ의 이소성 발현에 의해 "B" 영역에서 현저히 증가하였으며, 이는 AR(FL) 및 AR-V7의 복합체를 구성하는 YAP1/TAZ 또는 DNMT1가 SLC22A3의 프로모터를 직접 조절함을 나타낸다 (도 6의 E).
2-8. TAZ-DNMT1에 의해 조절된 SLC22A3을 요구하는 엔잘루타미드 저항
YAP1/TAZ-DNMT1 축이 엔잘루타미드 저항성 MDVR의 콜로니 형성(colony forming)에 미치는 영향을 조사하기 위해, C4-2B 및 MDVR 세포에 50 mM ENZ 및/또는 1 nM DAC를 14일간 처리한 후 콜로니 형성 여부를 관찰하였다. 그 결과, 예상대로 ENZ 단독 또는 ENZ와 DAC를 처리한 C4-2B에서는 집락형성(clonogenicity)이 50% 감소한 반면, DAC 처리군은 콜로니 형성에 변화가 없었으며, 이는 C-2B에서 DNMT1의 낮은 수준이 콜로니 형성에 영향을 미치지 않음을 시사한다 (도 7의 A). 그러나 DAC 단독 또는 ENZ와 DAC를 처리한 MDVR에서는 ENZ에 의한 콜로니 형성능이 억제되는 것으로 나타났다 (도 7의 A). MDVR에서 ENZ와 DAC의 공동 처리에 의한 억제 효과를 확인하기 위해, 세포 증식과 관련된 유전자의 mRNA 발현을 측정하였다. 그 결과, ENZ와 DAC 처리는 Cyclin A 및 Cyclin D의 발현을 감소시켰고, CRPC에서 낮은 수준으로 발현되는 GSTP1은 C4-2B 및 MDVR에서 모두 증가하였다 (도 7의 B). 이러한 결과는 DAC에 의한 DNMT1 억제가 MDVR의 콜로니 형성능 감소를 유발함을 나타낸다.
DNMT1이 SLC22A3 발현을 직접 억제하였고 DNMT1 억제가 콜로니 형성을 약화시켰다는 점을 감안하여, DNMT1에 의한 SLC22A3의 억제가 엔잘루타미드에 저항성이 있는 MDVR에 콜로니를 형성하는 능력을 부여한다고 가정한 후 SLC22A3에 대한 siRNA를 사용하여 SLC22A3-녹다운 MDVR을 생성하고 siScr로 형질주입된 대조군 세포를 사용하여 SLC22A3 유도를 통한 DNMT1의 억제가 ENZ가 있는 조건에서 콜로니 형성능 저하에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 웨스턴 블롯 분석에서는 DAC 및 ENZ의 처리에 의한 SLC22A3 단백질 수준의 증가가 SLC22A3-결핍 MDVR에서 효율적으로 감소하였다 (도 7의 C). 또한, SLC22A3 녹다운이 엔잘루타미드에 대한 DNMT1-억제 MDVR 반응의 콜로니 형성능 손실에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, siScr-형질주입 MDVR은 미처리 대조군과 비교하여 ENZ 및 DAC가 존재하는 상태에서 군집 형성능이 약 51% 감소한 반면, SLC22A3-침묵 MDVR은 군집 형성능이 약 75%까지 상승하였다 (도 7의 D). 이러한 결과는 MDVR이 SLC22A3에 대한 DNMT1의 억제 기능을 통해 콜로니 형성능을 얻을 수 있음을 시사한다. 이로부터 YAP1/TAZ가 DNMT1의 상위에 작용하여 SLC22A3을 억제하고, 이로 인해 엔잘루타미드에 대한 MDVR 증식 반응에 대한 YAP1/TAZ의 영향이 SLC22A3에 의존적으로 나타날 것으로 예상하여 shRNA-매개 YAP1 또는 TAZ 녹다운 MDVR에 SLC22A3에 대한 siRNA를 형질주입하였다. 그 결과, YAP1-/TAZ-녹다운 MDVR의 YAP1 또는 TAZ 발현 수준이 대조군 MDVR에 비해 현저하게 낮은 수준으로 조절되었다 (도 7의 E). 이러한 결과는 YAP1-/TAZ-결실(deleted) MDVR이 SLC22A3 발현과 관계없이 ENZ가 없는 조건에서 콜로니 형성능 상실을 나타내어 YAP1/TAZ가 MDVR의 증식에 관련 있음을 시사한다. 또한, YAP1/TAZ-결핍 MDVR의 콜로니 형성 감소는 ENZ가 있는 상태에서 SLC22A3의 결핍에 의해 70%까지 회복되었다 (도 7의 F). 이러한 결과는 SLC22A3의 YAP1/TAZ를 매개로 한 억제가 MDVR의 엔잘루타미드 저항성에 기여함을 시사하며, 엔잘루타미드 저항성의 원인은 SLC22A3의 발현 억제로 설명될 수 있다.
2-9. YAP1/TAZ 억제제에 의한 MDVR 증식 억제
MDVR에서 콜로니 형성 및 SLC22A3 발현에 YAP1/TAZ 억제제가 미치는 영향을 조사하기 위해, YAP1/TAZ 억제제인 베르테포르핀(VER)을 사용하였다. MDVR 세포는 5 μM VER 또는 20 μM ENZ만 36시간 처리하거나VER (5 μM)과 ENZ (20 μM)를 함께 처리하여 대조구(control)와 함께 세포를 분쇄하거나 콜로니 생성 실험에 사용하였다. 그 결과, 베르테포르핀은 엔잘루타미드 처리 여부와 관계없이 YAP1/TAZ의 단백질 발현을 감소시키며 SLC22A3의 발현 수준을 증가시켰다 (도 8의 A 및 B). 또한, 베르테포르핀은 MDVR의 콜로니 형성능을 감소시켰다 (도 8의 C).
또한, 대조군 벡터 또는 SLC22A3 벡터로 형질주입된 MDVR에 엔잘루타미드, 항암 효능이 알려진 메트포르민(metformin, MET) 또는 이들 모두를 처리한 결과, MET 단독 또는 MET와 ENZ의 조합은 MDVR의 콜로니 형성능을 약간 약화시켰고, SLC22A3를 발현하는 MDVR에서는 ENZ 또는 MET 단독 처리에 의한 콜로니 형성이 벡터를 처리한 대조군에 비해 각각 22%, 40% 감소하였다. 그리고 ENZ 및 MET의 조합은 MDVR에서 SLC22A3의 이소성 발현에 의해 콜로니 형성을 현저히 감소시킨다 (도 8의 D). 이러한 결과는 SLC22A3의 과발현에 의해 메트포르민 흡수가 촉진되고 ENZ가 있는 상태에서 MDVR의 증식을 협동적으로(synergistic) 억제함을 시사한다. 종합하면, CRPC의 엔잘루타미드 저항성을 극복하기 위한 새로운 치료 전략으로 메트포르민을 처리하여 SLC22A3의 발현을 회복시킬 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION
<120> Novel biomarker for predicting of resistance against enzalutamide
of prostate cancer and uses thereof
<130> PN200329
<160> 24
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTGF-F
<400> 1
ccaatgacaa cgcctcctg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTGF-R
<400> 2
tggtgcagcc agaaagctc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYR61-F
<400> 3
ggtcaaagtt accgggcagt 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYR61-R
<400> 4
ggaggcatcg aatcccagc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANKRD1-F
<400> 5
cacttctagc ccaccctgtg a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ANKRD1-R
<400> 6
ccacaggttc cgtaatgatt t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YAP1-F
<400> 7
tagccctgcg tagccagtta 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YAP1-R
<400> 8
tcatgcttag tccactgtct gt 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TAZ-F
<400> 9
gatcctgccg gagtctttct t 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TAZ-R
<400> 10
cacgtcgtag gactgctgg 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLC22A3-F
<400> 11
atcgtcagcg agtttgacct t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLC22A3-R
<400> 12
acctgtctgc tgcatagcct a 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNMT1-F
<400> 13
aggcggctca aagatttgga a 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNMT1-R
<400> 14
gcagaaattc gtgcaagaga ttc 23
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cyclin A1-F
<400> 15
gaggtcccga tgcttgtcag 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cyclin A1-R
<400> 16
gttagcagcc ctagcactgt c 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cyclin D1-F
<400> 17
gctgcgaagt ggaaaccatc 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cyclin D1-R
<400> 18
cctccttctg cacacatttg aa 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSTP1-F
<400> 19
ccctacaccg tggtctattt cc 22
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSTP1-R
<400> 20
caggaggctt tgagtgagc 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A-F
<400> 21
ctagcactta tgtttcaagg c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A-R
<400> 22
gtgctcctaa catatctaag a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-F
<400> 23
tggagagccc tgtcgaaata g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-R
<400> 24
tgtgtcatct tctgccctcc t 21
Claims (10)
- 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 전립선암은 거세저항성 전립선암인 것인 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 바이오마커의 발현 수준은 전립선암 환자의 전립선 암세포 또는 이를 포함하는 조직에서 측정되는 것인 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 제제는 바이오마커의 유전자 또는 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, 올리고펩티드 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 조성물. - 청구항 1 내지 4 중 어느 한 한의 조성물을 포함하는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성 예측용 키트.
- 청구항 5에 있어서,
상기 키트는 면역분석법을 이용하는 것인 키트. - a) 전립선암 환자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
b) 상기 생물학적 시료에서 바이오마커 SLC22A3 및 YAP1/TAZ의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 측정된 바이오마커의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계
를 포함하는 전립선암 환자의 엔잘루타미드 저항성을 예측하기 위한 정보의 제공 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 a) 단계의 생물학적 시료는 전립선 암세포 또는 이를 포함하는 조직인 것인 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 b) 단계의 바이오마커는 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 핵산 발현 수준이 측정되고, ELISA, 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, 면역확산, 면역침전, 면역조직화학, 면역형광 및 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 단백질 발현 수준이 측정되는 것인 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 c) 단계는 측정된 바이오마커 SLC22A3의 발현 수준이 대조군에 비해 낮고, YAP1/TAZ의 발현 수준이 대조군에 비해 높은 경우, 엔잘루타미드 저항성을 가지는 것으로 판별하는 것인 방법.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210068226A KR102543618B1 (ko) | 2021-05-27 | 2021-05-27 | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 |
| PCT/KR2022/007465 WO2022250465A1 (ko) | 2021-05-27 | 2022-05-26 | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 |
| KR1020230074153A KR102615262B1 (ko) | 2021-05-27 | 2023-06-09 | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210068226A KR102543618B1 (ko) | 2021-05-27 | 2021-05-27 | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230074153A Division KR102615262B1 (ko) | 2021-05-27 | 2023-06-09 | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220160259A true KR20220160259A (ko) | 2022-12-06 |
| KR102543618B1 KR102543618B1 (ko) | 2023-06-13 |
Family
ID=84228932
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210068226A KR102543618B1 (ko) | 2021-05-27 | 2021-05-27 | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 |
| KR1020230074153A KR102615262B1 (ko) | 2021-05-27 | 2023-06-09 | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230074153A KR102615262B1 (ko) | 2021-05-27 | 2023-06-09 | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (2) | KR102543618B1 (ko) |
| WO (1) | WO2022250465A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024111764A1 (ko) | 2022-11-25 | 2024-05-30 | 주식회사 엘지에너지솔루션 | 배터리 모듈 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007124314A2 (en) * | 2006-04-20 | 2007-11-01 | The Regents Of The University Of California | Use of organic cation transporters for cancer diagnosis and therapy |
| KR20160058774A (ko) * | 2013-08-12 | 2016-05-25 | 토카이 파마슈티컬, 아이엔씨. | 안드로겐-표적 치료제를 이용하는 종양 질환 치료를 위한 바이오마커 |
| KR101820771B1 (ko) * | 2017-10-11 | 2018-01-22 | 가천대학교 산학협력단 | 전립선암의 암전이를 예측할 수 있는 진단 바이오마커 및 호르몬 불응성 전립선암에서 암전이를 억제하는 치료용 조성물 |
| KR20180065684A (ko) * | 2016-12-08 | 2018-06-18 | 가천대학교 산학협력단 | 전립선암의 호르몬 불응성 출현을 예측하는 진단 바이오마커 |
| US20210003577A1 (en) * | 2019-05-24 | 2021-01-07 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for identifying and treating cancer |
| KR102208140B1 (ko) | 2013-04-02 | 2021-01-27 | 이뮤노비아 에이비 | 전립선암의 바이오마커 검출에서 사용하기 위한 방법 및 어레이 |
| KR102229255B1 (ko) | 2018-12-28 | 2021-03-19 | 경북대학교 산학협력단 | 전립선 암 예후 예측용 바이오마커, 조성물, 키트, 및 이를 이용한 전립선 암 예후 예측 방법 및 전립선 암의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법 |
-
2021
- 2021-05-27 KR KR1020210068226A patent/KR102543618B1/ko active IP Right Grant
-
2022
- 2022-05-26 WO PCT/KR2022/007465 patent/WO2022250465A1/ko active Application Filing
-
2023
- 2023-06-09 KR KR1020230074153A patent/KR102615262B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007124314A2 (en) * | 2006-04-20 | 2007-11-01 | The Regents Of The University Of California | Use of organic cation transporters for cancer diagnosis and therapy |
| KR102208140B1 (ko) | 2013-04-02 | 2021-01-27 | 이뮤노비아 에이비 | 전립선암의 바이오마커 검출에서 사용하기 위한 방법 및 어레이 |
| KR20160058774A (ko) * | 2013-08-12 | 2016-05-25 | 토카이 파마슈티컬, 아이엔씨. | 안드로겐-표적 치료제를 이용하는 종양 질환 치료를 위한 바이오마커 |
| KR20180065684A (ko) * | 2016-12-08 | 2018-06-18 | 가천대학교 산학협력단 | 전립선암의 호르몬 불응성 출현을 예측하는 진단 바이오마커 |
| KR101820771B1 (ko) * | 2017-10-11 | 2018-01-22 | 가천대학교 산학협력단 | 전립선암의 암전이를 예측할 수 있는 진단 바이오마커 및 호르몬 불응성 전립선암에서 암전이를 억제하는 치료용 조성물 |
| KR102229255B1 (ko) | 2018-12-28 | 2021-03-19 | 경북대학교 산학협력단 | 전립선 암 예후 예측용 바이오마커, 조성물, 키트, 및 이를 이용한 전립선 암 예후 예측 방법 및 전립선 암의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법 |
| US20210003577A1 (en) * | 2019-05-24 | 2021-01-07 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Methods and materials for identifying and treating cancer |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Grisanzio C et al, Proceedings of the National Academy of Sciences (2012), vol 109, no 28, pp 11252-11257. * |
| Lee H C et al, Oncogene (2021.03.04.), vol 40, no 13, pp 2407-2421. * |
| Lee Hyun Jung et al, Cell Cycle (2018), vol 17, no 2, pp 147-153. * |
| Sangryong et al, Cancers (2021.03.05.), vol 13, no 5, pp 1-20. * |
| Tomlins Scott A et al, Nature Genetics (2007), vol 39, no 1, pp 41-51. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024111764A1 (ko) | 2022-11-25 | 2024-05-30 | 주식회사 엘지에너지솔루션 | 배터리 모듈 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102615262B1 (ko) | 2023-12-19 |
| WO2022250465A1 (ko) | 2022-12-01 |
| KR102543618B1 (ko) | 2023-06-13 |
| KR20230092844A (ko) | 2023-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yu et al. | ZNF326 promotes malignant phenotype of glioma by up-regulating HDAC7 expression and activating Wnt pathway | |
| IL200908A (en) | Methods for classification of endometrial cancer and preparations for its treatment | |
| US20210395834A1 (en) | Abca1 downregulation in prostate cancer | |
| KR102615262B1 (ko) | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 예측용 신규 바이오마커 및 이의 용도 | |
| AU2011292809B2 (en) | BARD1 isoforms in lung and colorectal cancer and use thereof | |
| US20230287505A1 (en) | Biomarker for cancer immunotherapy and use thereof | |
| US20100035257A1 (en) | Methods to determine the responsiveness to cisplatin treatment | |
| KR101204620B1 (ko) | 혈관 형성 관련 질환 진단용 마커 및 이의 용도 | |
| WO2022250466A1 (ko) | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 억제용 약학 조성물 및 엔잘루타미드 저항성을 가지는 전립선암 치료용 약학 조성물 | |
| US20190142832A1 (en) | Marker for Cancer Prognosis and Methods Related Thereto | |
| KR101358810B1 (ko) | 방사선 피폭 진단용 마커 ｉｇｆｂｐ-5, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법 | |
| KR102025005B1 (ko) | 전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커 및 이의용도 | |
| US11921116B2 (en) | Enigma and CDH18 as companion diagnostics for CDK4 inhibitors | |
| KR20220160452A (ko) | 전립선암의 엔잘루타미드 저항성 억제용 약학 조성물 및 엔잘루타미드 저항성을 가지는 전립선암 치료용 약학 조성물 | |
| KR101150410B1 (ko) | 간암 진단용 마커로서의 ｓ100ｐ의 용도 | |
| EP3321683A1 (en) | Method for evaluating lymph node metastatic potential of endometrial cancer | |
| KR101927577B1 (ko) | 간암 바이오 마커로서 ｈ２ａ．ｚ．１의 용도 | |
| EP4134671A1 (en) | Methylene quinuclidinone companion diagnostics | |
| KR20230014990A (ko) | 대장암 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 | |
| KR102042332B1 (ko) | 간암의 재발 및 예후 예측용 tcirg1 마커 및 이의 용도 | |
| KR20240151659A (ko) | 폐암 치료의 반응 및 효능 평가와 예후 예측용 바이오 마커 | |
| KR20230136786A (ko) | 췌장암의 진단용 조성물 | |
| KR20240026431A (ko) | 암의 진단, 전이 가능성 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 이의 용도 | |
| KR101764970B1 (ko) | Nupr1을 포함하는 미토콘드리아 기능 저하된 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법 | |
| KR20220141216A (ko) | 유방암 진단을 위한 신규 바이오마커 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |