KR20220160009A - 스핑고신 1 포스페이트 수용체 조절제 - Google Patents

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KR20220160009A
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oxadiazol
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KR1020227035104A
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로저 바칼르
제프 쉬커얀츠
모리스 마시니
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리셉토스 엘엘씨
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Abstract

화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물이 제공된다:
[화학식 (I)]
Figure pct00032

상기 식에서, R은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 이러한 화합물은 스핑고신-1-포스페이트 수용체의 조절제로서 작용하며, 이 수용체의 활성화가 의학적으로 유도된 질병의 치료에 유용하다.

Description

스핑고신 1 포스페이트 수용체 조절제
스핑고신-1-포스페이트 수용체의 조절제는 이의 활성화가 의학적으로 유도된 질병의 치료를 위해 제공된다.
S1P1/EDG1 수용체는 G-단백질 연결 수용체 (GPCR)이고, 내피 세포 분화 유전자(EDG) 수용체 패밀리의 구성원이다. EDG 수용체에 대한 내인성 리간드는 스핑고신-1-포스페이트(S1P)와 같은 리소인지질을 포함한다. 모든 GPCR과 마찬가지로 수용체의 결찰은 G-단백질(알파, 베타 및 감마)의 활성화를 통해 2차 메신저 신호를 전파한다. 소분자 S1P1 작용제 및 길항제의 개발은 S1P1/S1P-수용체 신호전달 시스템의 일부 생리학적 역할에 대한 정보를 제공했다. 이를 위해 S1P 수용체는 5개의 하위유형(즉, S1P1, S1P2, S1P3, S1P4 및 S1P5)으로 나뉘며, 이 하위유형은 다양한 조직에서 발현되고 다른 세포 특이성을 나타낸다. S1P1 수용체의 효능 작용은 림프구 수송을 교란시켜 림프절 및 기타 2차 림프 조직에서 격리한다. 이는 신속하고 가역적인 림프구감소증을 유발하며, 이는 아마도 림프 내피 세포 및 림프구 자체 모두에 대한 수용체 결찰 때문일 것이다(문헌[Rosen et al, Immunol. Rev., 195:160-177, 2003]).
간단히 말해서, 스핑고신-1-포스페이트 수용체의 조절제는 이의 활성화가 의학적으로 유도된 질병의 치료를 위해 제공된다.
일 실시양태에서, 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물이 제공된다:
[화학식 (I)]
Figure pct00001
상기 식에서, R은 하기에 정의된 바와 같다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 또한, "를 포함하는", "를 포괄하는" 및 "를 갖는"이라는 단어는 본 명세서에서 사용된 바와 같은 개방형 용어이며, 추가적인 요소 또는 구성요소의 존재를 배제하지 않는다.
본 발명은 S1P 수용체를 조절하는 화합물, 뿐만 아니라 이의 제조 및 사용을 위한 관련 산물 및 방법에 관한 것이다. S1P 수용체는 5가지 하위유형(즉, S1P1, S1P2, S1P3, S1P4 및 S1P5)으로 나뉘고, 이 하위유형은 다양한 조직에서 발현되고 다른 세포 특이성을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 화합물은 이러한 하위유형 중 하나 이상을 조절한다. 일 실시양태에서, 본 화합물은 스핑고신-1-포스페이트 수용체의 하위유형 1을 조절하기 때문에 "S1P1" 조절제이다. 또 다른 실시양태에서, 본 화합물은 하위유형 1 및 하위유형 5와 같은 또 다른 하위유형을 조절한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "S1P1 조절제"는 단독으로 S1P1 하위유형을 조절하거나 S1P1 하위유형 뿐만 아니라 하나 이상의 다른 하위유형을 조절하는 화합물을 포함하는 것으로 이해된다. 일 실시양태에서, S1P1 조절제는 S1P1 하위유형과 S1P5 하위유형 모두를 조절한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, S1P1 수용체의 "조절제"는 대상체에게 투여될 때 수용체 자체에 직접 작용하는 화합물을 통해 또는 수용체에 작용하는 화합물의 대사 산물에 의해 표적 수용체와의 적절한 혼입을 제공한다. 대상체에 투여시, 본 발명의 화합물은 신호 전달을 위한 수용체를 활성화함으로써 S1P1 수용체를 조절한다. 이러한 화합물은 또한 본 명세서에서 "작용제" 또는 "S1P1 작용제"로 지칭된다. 이러한 S1P1 작용제는 S1P1에 대한 작용에 대해 선택적일 수 있다. 예를 들어, S1P1에 대한 선택적 작용을 하는 화합물은 S1P 수용체 패밀리의 다른 하위 유형보다 S1P1에 더 낮은 농도로 작용한다.
수용체 작용제는 오르토스테릭(orthosteric) 또는 알로스테릭(alosteric)으로 분류될 수 있고, 본 발명의 S1P1 작용제는 본 화합물에 의해 또는 수용체에 작용하는 본 화합물의 대사산물에 의해 두 분류를 모두 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 오르토스테릭 작용제이다. 오르토스테릭 작용제는 천연 리간드의 결합과 상당히 겹치는 수용체의 부위에 결합하고 천연 리간드와 수용체의 주요 상호작용을 복제한다. 오르토스테릭 작용제는 천연 리간드와 유사한 분자 기전에 의해 수용체를 활성화하고 천연 리간드에 대해 경쟁적이며 천연 리간드에 대한 경쟁적 길항제인 약리학적 제제에 의해 경쟁적으로 길항된다.
특정 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 알로스테릭 작용제이다. 알로스테릭 작용제는 천연 리간드와 부분적으로 또는 전체적으로 겹치지 않는 일부 중요한 상호작용을 생성하는 수용체의 한 부위에 결합한다. 알로스테릭 작용제는 알로스테릭 강화제가 아니라 진정한 작용제이다. 결과적으로, 이는 천연 리간드의 최대 농도 이하에 대한 요구 없이 수용체 신호 전달만을 활성화한다. 알로스테릭 작용제는 오르토스테릭 리간드에 대해 경쟁적인 것으로 알려진 길항제가 비경쟁적 길항작용을 보일 때 확인될 수 있다. 알로스테릭 작용제 부위는 또한 수용체 돌연변이유발에 의해 맵핑(mapping)될 수 있다.
일 실시양태에서, 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물이 제공된다:
화학식 (I)
Figure pct00002
상기 식에서,
R은
알킬;
알칸디일-NR1R2;
알칸디일-C(=O)OR1; 또는
헤테로사이클릴알킬이고;
R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-4알킬이다.
화학식 (I)에서 사용된 바와 같이, 하기 용어는 하기에 기재된 의미를 갖는다.
"알칸디일"은 2개의 수소 원자를 제거하여 알킬기로부터 유도된 2가 라디칼, 예컨대 메틸렌(-CH2-)을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 임의의 알킬기는 2가 라디칼을 제공하기 위해 2개의 수소 원자를 제거함으로써 알칸디일을 구성한다.
"알킬"은 1 내지 약 20개의 탄소 원자 (C1-20 알킬), 및 사이클로알킬의 경우 3 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 포화되거나 불포화된 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬기 (사이클로알킬)를 의미한다. 알킬은 통상적으로 1 내지 12 탄소 (C1-12 알킬) 또는, 일부 실시양태에서, 1 내지 8개의 탄소 원자 (C1-8 알킬) 또는, 일부 실시양태에서, 1 내지 4개의 탄소 원자 (C1-4 알킬) 또는, 일부 실시양태에서, 1 내지 3개의 탄소 원자 (C1-3 알킬)이다. 직쇄 알킬기의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, 및 n-옥틸 기를 포함한다. 분지쇄 알킬기의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 이소프로필, 이소-부틸, sec-부틸, t-부틸, 네오펜틸, 이소펜틸, 및 2,2-디메틸프로필 기를 포함한다. 불포화 알킬의 예는 알케닐 및 알키닐 기를 포함한다. 사이클로알킬의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이클로알킬기는 3 내지 8개의 고리원을 가지며, 다른 실시양태에서 고리 탄소 원자의 수는 3 내지 5, 3 내지 6, 또는 3 내지 7개 범위이다. 사이클로알킬기는 추가로 폴리사이클릭 사이클로알킬기 예컨대, 다음에 제한되는 것은 아니나, 노르보르닐, 아다만틸, 보르닐, 캄페닐, 이소캄페닐, 및 카레닐 기, 및 융합된 고리 예컨대, 다음에 제한되는 것은 아니나, 데칼리닐 등을 포함한다.
"알케닐"은 2개의 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 이중 결합이 존재하는, 상기 정의된 바와 같은 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬 기를 의미한다. 따라서, 알케닐 기는 2 내지 약 20개의 탄소 원자, 통상적으로 2 내지 12개의 탄소, 또는 일부 실시양태에서는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다. 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, CH=CH(CH3), CH=C(CH3)2, C(CH3)=CH2, C(CH3)=CH(CH3), C(CH2CH3)=CH2, vinyl, 사이클로헥세닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥사디에닐, 부타디에닐, 펜타디에닐 및 헥사디에닐 등을 포함한다.
"알키닐"은 2개의 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 삼중 결합이 존재하는, 상기 정의된 바와 같은 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬 기를 의미한다. 따라서, 알키닐 기는 2 내지 약 20개의 탄소 원자, 통상적으로 2 내지 12개의 탄소, 또는 일부 실시양태에서는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다. 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, -C≡CH, -C≡C(CH3), -C≡C(CH2CH3), CH2C≡CH, CH2C≡C(CH3), 및 CH2C≡C(CH2CH3) 등을 포함한다.
"헤테로사이클릴"은 3개 이상의 고리원을 포함하고, 그 중 하나 이상이 헤테로원자인 방향족(헤테로아릴) 및 비방향족 고리 화합물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 헤테로사이클릴은 3 내지 20개의 고리원을 포함하고, 다른 이러한 기는 3 내지 15개의 고리원을 갖는다. 적어도 하나의 고리는 헤테로원자를 포함하지만, 폴리사이클릭계의 모든 고리가 헤테로원자를 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 디옥솔라닐 고리 및 벤즈디옥솔라닐 고리계(메틸렌디옥시페닐 고리계)는 모두 본 명세서의 의미 내에서 헤테로사이클릴 기이다. C2-헤테로사이클릴로 지정된 헤테로사이클릴 기는 2개의 탄소 원자 및 3개의 헤테로원자를 갖는 5-원 고리, 2개의 탄소 원자 및 4개의 헤테로원자를 갖는 6-원 고리 등일 수 있다. 마찬가지로 C4-헤테로사이클릴은 1개의 헤테로원자를 갖는 5-원 고리, 2개의 헤테로원자를 갖는 6-원 고리 등일 수 있다. 탄소 원자 수에 헤테로 원자 수를 더하면 총 고리 원자 수와 같다. 포화 헤테로사이클릭 고리란, 불포화 탄소 원자를 포함하지 않는 헤테로사이클릭 고리를 지칭한다. 헤테로사이클릭 고리는 융합된 방향족 및 비방향족 기를 갖는 것을 포함하는 융합된 고리 종을 포함한다. 이는 또한 다음에 제한되는 것은 아니나 퀴누클리딜과 같은 헤테로원자를 포함하는 폴리사이클릭 고리계를 포함한다.
대표적인 헤테로사이클릴은 다음에 제한되는 것은 아니나, 피롤리디닐, 푸라닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 피리디닐, 티오페닐, 벤조티오페닐, 벤조푸라닐, 디하이드로벤조푸라닐, 인돌릴, 디아하이드로인돌릴, 아자인돌릴, 인다졸릴, 벤조이미다졸릴, 아자벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 이미다조피리디닐, 이속사졸로피리디닐, 티아나프탈레닐, 퓨리닐, 크산티닐, 아데니닐, 구아니닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 퀴녹살리닐 및 퀴나졸리닐기를 포함한다.
"헤테로사이클릴알킬"은 알킬 기의 수소 또는 탄소 결합이 상기 정의된 바와 같은 헤테로사이클릴 기에 대한 결합으로 대체된, 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 의미한다.
"헤테로아릴"은 5개 이상의 고리원을 포함하고, 그 중 1개 이상이 헤테로원자인 방향족 헤테로사이클릴을 의미한다. C2-헤테로아릴로 지정된 헤테로아릴 기는 2개의 탄소 원자 및 3개의 헤테로원자를 갖는 5원 고리, 2개의 탄소 원자 및 4개의 헤테로원자를 갖는 6원 고리 등일 수 있다. 마찬가지로 C4-헤테로아릴은 1개의 헤테로원자를 갖는 5-원 고리, 2개의 헤테로원자를 갖는 6-원 고리 등일 수 있다. 탄소 원자 수에 헤테로 원자 수를 더하면 총 고리 원자 수와 같다.
대표적인 헤테로아릴은 다음에 제한되는 것은 아니나, 피롤릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 피리디닐, 티오페닐, 벤조티오일페닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 아자인돌릴, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 아자벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 이미다조피리디닐, 이속사졸로피리디닐, 티아나프탈레닐, 퓨리닐, 크산티닐, 아데니닐, 구아니닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 퀴녹살리닐, 및 퀴나졸리닐기를 포함한다. 헤테로아릴은 또한 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 인돌릴 및 2,3-디하이드로 인돌릴을 포함하는 적어도 하나의 고리(반드시 모든 고리는 아님)가 방향족인 경우와 같이 융합된 고리 화합물을 포함한다.
"헤테로아릴알킬"은 알킬 기의 수소 또는 탄소 결합이 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 기에 대한 결합으로 대체된 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 의미한다.
일 실시양태에서, 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물이 제공되며, 상기 식에서, R은 알킬이고, 더욱 구체적인 실시양태에서 알킬은 메틸, 에틸, 프로프릴, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 또는 tert-부틸이다.
일 실시양태에서, 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물이 제공되며, 상기 식에서, R은 알칸디일-NR1R2이고, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-4알킬이다.
일 실시양태에서, 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물이 제공되며, 상기 식에서, R은 알칸디일-C(=O)OR1이고, R1은 H 또는 C1-4알킬이다.
일 실시양태에서, 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물이 제공되며, 상기 식에서, R은 헤테로사이클릴알킬이고, 헤테로사이클릴알킬은 -(CH2)1-3-헤테로사이클이고, 헤테로사이클은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
화학식 (I)의 대표적인 화합물은 표 1에 열거되어 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
상기 언급된 바와 같이, 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물은 또한 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 및 용매화물을 포함한다.
당업계에 공지된 "염"은 반대이온과 조합된 이온 형태의 카복실산, 술폰산 또는 아민과 같은 유기 화합물을 포함한다. 예를 들어, 음이온 형태의 산은 금속 양이온, 예를 들어 나트륨, 칼륨 등과 같은 양이온; NH4 +와 같은 암모늄 염 또는 테트라메틸암모늄과 같은 테트라알킬 암모늄 염 및 트로메타민 염과 같은 알킬 암모늄 염을 포함하는 다양한 아민의 양이온, 또는 트리메틸술포늄 등과 같은 기타 양이온과 염을 형성할 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한" 또는 "약리학적으로 허용 가능한" 염은 염화물 염 또는 나트륨 염과 같이 인간 소비에 대해 승인되고 일반적으로 무독성인 이온으로부터 형성된 염이다. "양쪽성이온"은 서로 균형을 이루는 역할을 하는 하나는 음이온을 형성하고 다른 하나는 양이온을 형성하는 적어도 2개의 이온화 가능한 기를 갖는 분자에서 형성될 수 있는 것과 같은 내부 염이다. 예를 들어, 글리신과 같은 아미노산은 양쪽성이온 형태로 존재할 수 있다. "양쪽성 이온"은 본 명세서에서 의미하는 염이다. 본 개시내용의 화합물은 염의 형태를 취할 수 있다. 용어 "염"은 본 개시내용의 화합물인 유리 산 또는 유리 염기의 부가염을 포함한다. 염은 "약제학적으로 허용 가능한 염"일 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 약제학적 적용에서 유용성을 제공하는 범위 내에서 독성 특성을 갖는 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되지 않는 염은 그럼에도 불구하고 높은 결정도와 같은 특성을 가질 수 있으며, 이는 예를 들어 본 개시내용의 화합물의 합성, 정제 또는 제형화 공정에서의 유용성과 같은 본 개시내용의 실시에서 유용성을 갖는다.
적합한 약제학적으로 허용 가능한 산 부가염은 무기산 또는 유기산으로부터 제조될 수 있다. 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 탄산, 황산 및 인산을 포함한다. 적절한 유기산은 유기산의 지방족, 지환족, 방향족, 방향지방족, 헤테로사이클릭, 카복실산 및 술폰산 부류로부터 선택될 수 있으며, 그 예로 포름산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 굴루쿠론산, 말레산, 푸마르산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 안트라닐산, 4 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산(파모산), 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, 칸토텐산, 트리플루오로메탄술폰산, 2 하이드록시에탄술폰산, p 톨루엔술폰산, 술파닐산, 사이클로헥실아미노술폰산, 스테아르산, 알긴산, β 하이드록시부티르산, 살리실산, 갈락타르산 및 갈락투론산이 포함된다. 약제학적으로 허용되지 않는 산 부가염의 예에는 예를 들어 과염소산염 및 테트라플루오로보레이트가 포함된다.
본 개시내용의 화합물의 적합한 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가 염은 예를 들어 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 전이 금속 염, 예를 들어 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연 염을 포함하는 금속 염을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가 염은 또한 염기성 아민, 예를 들어 N,N' 디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민(N-메틸글루카민) 및 프로카인으로부터 제조된 유기 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되지 않는 염기 부가염의 예는 리튬 염 및 시아네이트 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되지 않는 염은 일반적으로 약제로서 유용하지 않지만, 이러한 염은 예를 들어 화합물 합성, 예를 들어 재결정화에 의한 정제에서 중간체로서 유용할 수 있다. 이들 염 모두는 예를 들어 적절한 산 또는 염기를 화합물과 반응시킴으로써 상응하는 화합물로부터 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 무독성 무기 또는 유기 산 및/또는 염기 부가 염을 지칭하고, 예를 들어 문헌[Gould et al., Salt Selection for Basic Drugs (1986), Int J. Pharm., 33, 201-217]을 참조하고, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 잠재적 염의 비제한적 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 하이드로클로라이드, 시트레이트, 글리콜레이트, 푸마레이트, 말레이트, 타르트레이트, 메실레이트, 에실레이트, 신나메이트, 이세티오네이트, 술페이트, 포스페이트, 디포스페이트, 니트레이트, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 숙시네이트, 포르메이트, 아세테이트, 디클로로아세테이트, 락테이트, p-톨루엔술포네이트, 파미테이트, 피돌레이트, 파모에이트, 살리실레이트, 4-아미노살리실레이트, 벤조에이트, 4-아세트아미도 벤조에이트, 글루타메이트, 아스파르테이트, 글리콜레이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 베실레이트, 캄포레이트, 캄포술포네이트, 캄실레이트, 카프레이트, 카프로에이트, 사이클라메이트, 라우릴술페이트, 에디실레이트, 젠티세이트, 갈락타레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 옥소글루타레이트, 히푸레이트, 락토비오네이트, 말로네이트, 말레에이트, 만달레이트, 나프실레이트, 나파디실레이트, 옥살레이트 올레에이트, 세바케이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 티오시아네이트, 운데사이클네이트 및 크시나포에이트를 포함한다.
본 개시내용의 화합물의 "동족체"는 화합물의 하나 이상의 원자가 이러한 원자의 동위원소로 대체된 화합물이다. 예를 들어, 동족체는 화학식 I-R 및 I-S의 이소프로폭시 모이어티의 메틸 기가 완전히 또는 부분적으로 중수소화된(예를 들어, (D3C)2CHO-) 본 개시내용의 화합물과 같이, 화합물의 하나 이상의 수소 원자 대신에 중수소를 갖는 화합물을 포함한다. 본 개시내용의 동족체의 형성에서 이루어질 수 있는 동위원소 치환은 중수소 및 탄소 13과 같은 비방사성(안정한) 원자 뿐만 아니라 삼중수소, 탄소 14, 요오드 123, 요오드 125와 같은 방사성(불안정한) 원자 등을 포함한다.
"수화물"은 물 분자와 함께 조성물에 존재하는 화합물이다. 조성물은 일수화물 또는 이수화물과 같은 화학량론적 양의 물을 포함할 수 있거나, 무작위 양의 물을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수화물"은 수화될 수 있으나, 고체 형태, 즉 수용액 중의 화합물을 지칭하지만, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어로 수화물은 아니다.
"용매화물"은 물 이외의 용매가 물을 대체하는 것을 제외하고는 유사한 조성물이다. 예를 들어, 메탄올 또는 에탄올은 다시 화학량론적 또는 비화학량론적일 수 있는 "알콜레이트"를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "용매화물"은 고체 형태, 즉 용매화될 수 있지만 본 명세서에서 사용되는 용어로 용매화물이 아닌 용매 용액 중의 화합물을 지칭한다.
본 명세서에 개시된 화합물은 당업자에게 공지된 기술 뿐만 아니라 하기 실시예에 개시된 절차에 의해 제조될 수 있다.
실시예
일반적인 합성 방법
1H NMR (400 MHz) 및 13C NMR (100 MHz)을 중수소클로로포름(CDCl3), 중수소메탄올(CD3OD) 또는 디메틸 술폭사이드-D6(DMSO) 용액 중에 얻었다. NMR 스펙트럼을 Mestrec 5.3.0 및 6.0.1을 사용하여 처리하였다. 괄호 안의 13C NMR 피크는 동일한 탄소의 두 회전체이다. 질량 스펙트럼(LCMS)을 이동상 A로 0.1% 포름산이 포함된 물과 이동상 B로서 0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴을 사용하여 Thompson ODS-A, 100A, 5 μ (50 X 4.6 mm) 컬럼이 장착된 Agilent 1100/6110 HPLC 시스템을 사용하여 획득하였다. 구배는 이동상 B를 사용하여 2.5분에 걸쳐 20 내지 100%이고 2.5분 동안 100%로 유지하였다. 유속은 1 mL/min이었다. 더 많은 소수성 화합물의 경우 방법 1로 표시된 다음 구배가 사용되었다: 1 mL/min의 유속으로 0.5분에 걸쳐 40 내지 95%, 8.5분 동안 95%에서 유지, 2분에 걸쳐 40%로 복귀. 방법 2를 사용하여 최종 화합물의 순도를 확인했다: 1mL/min의 유속으로 1분 동안 5%, 9분 동안 5 내지 95%, 그 다음 5분 동안 95%에서 유지. 거울상 이성질체 과잉을 Chiralpak AD-H, 250 x 4.6 mm 컬럼, 5 μm 입자 크기에서 분리된 피크의 혼입에 의해 결정하였다. 1mL/min의 유속 및 등용매 이동상. 달리 명시되지 않는 한 제공된 키랄 데이터는 이 방법을 사용한다. 대안적으로, 키랄 방법 1: Chiralpak AY-H, 250 x 4.6 mm 컬럼, 5 μm 입자 크기로 표시된 다음 조건에서 키랄 분리를 수행했다. 1 mL/min의 유속 및 등용매 이동상. 키랄 방법 2: Chiralcel OZ-3, 250 x 4.6, 3μm 입자 크기, 0.75ml/min의 유속. 절차에 사용된 피리딘, 디클로로메탄(DCM), 테트라하이드로푸란(THF) 및 톨루엔은 질소(N2) 하에 보관된 Aldrich Sure-Seal 병에서 가져온 것이다. 모든 반응을 자석으로 교반하였으며 온도는 외부 반응 온도이다. Redisep(Teledyne Isco) 실리카겔(SiO2) 컬럼이 장착된 Combiflash Rf 플래시 정제 시스템(Teledyne Isco)을 사용하여 크로마토그래피를 수행했다. Varian ProStar/PrepStar 시스템에서 이동상 A로 0.05% 트리플루오로아세트산을 포함하는 물을 사용하고 이동상 B로 0.05% 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴을 사용하여 분취용 HPLC 정제를 수행했다. 구배는 22mL/min의 유속으로 이동상 B에서 12분에 걸쳐 10 내지 80%였으며, 2분 동안 80%에서 유지한 다음 2분에 걸쳐 10%로 복귀된다. 이와 유사한 다른 방법이 사용되었을 수 있다. Varian Prostar 분획 수집기를 사용하여 분획을 수집하고 Savant SpeedVac Plus 진공 펌프를 사용하여 증발시켰다. 마이크로파 가열을 Biotage 마이크로파 용기가 장착된 Biotage Initiator 마이크로파 반응기를 사용하여 수행하였다. 다음 약어가 사용된다: 에탄올(EtOH), 카보닐디이미다졸(CDI), 이소프로판올(IPA) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP).
실시예 1
화합물 1의 합성
Figure pct00007
단계 1 - 3-에톡시-1H-인덴-7-카보니트릴 (Int 2)의 합성:
무수(abs) EtOH (20 mL) 중 1-옥소-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-카보니트릴 (Int 1) (20.0g, 98 중량%, 18.6 분석 g, 124.8 mmol), 톨루엔(80mL) 중 트리에틸오르토포르메이트(80mL, 481mmol) 및 메탄술폰산(0.88mL, 12.5mmol)의 교반된 혼합물을 43 내지 47℃에서 가열하였다. 1시간 후, GC 분석은 오르토포르메이트가 소모되었고 Int 1의 12.8 면적%가 남은 것으로 나타났다. 트리에틸오르토포르메이트(20mL, 120.2mmol)를 추가로 충전하고 45분 후 GC 분석은 1.5면적% Int 1을 나타냈다. 배치를 주위 온도로 냉각시킨 다음 15℃의 급랭 온도를 유지하면서 격렬하게 교반하면서 1M aq. K2HPO4 (200 mL)를 부었다. 2상 혼합물을 10분 동안 격렬하게 교반하였다. 상을 분리하고 수성상(pH 11)을 톨루엔(100mL)으로 역추출하였다. 유기상을 합하고 대기압에서 증류하여 340mL의 증류물을 제거하였다. 톨루엔(500mL)을 첨가하고 대기압에서 증류하여 500mL 증류물을 제거하였다. 총 증류 시간 3시간, 온도 범위 80 내지 120℃. 이 시점에서 배치를 5℃ 미만에서 밤새 보관하였다. 과량의 오르토포르메이트를 증류가 멈출 때까지 감압 하에 에틸 아세테이트(100mL)로 추적하여 제거했다. 또 다른 부피의 에틸 아세테이트(100mL)를 첨가한 다음, 증류가 멈출 때까지 감압 하에 농축하였다. 세 번째 부피의 에틸 아세테이트(100mL)를 첨가한 다음, 증류가 멈출 때까지 감압 하에 농축한 후, GC 분석에서 오르토포르메이트가 남아 있지 않음을 확인했다. 그 다음, 미정제 물질을 110℃에서 1시간 동안 교반하여 중간체 케탈을 3-에톡시-1H-인덴-7-카보니트릴(Int 2)로 전환시켰다. 냉각 시, 내부 표준으로서 메시틸렌을 사용하는 1H NMR에 의해 미정제 물질(이동성 오일, 21.34g)을 Int 2에 대해 분석하였다. 78.1 중량% 산물에서 분석된 오일 = 16.73 분석 g, 90.0 mmol = 72.1% 분석 수율. 그 다음, 미정제 오일을 15% EtOAc/헥산으로 용출하는 실리카 겔 플러그를 통한 여과에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 합하여 다음 단계에 사용했다. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 7.78 (d, J = 8.4, 1H), 7.63 (m, 1H), 7.49 (m, 1H), 5.60 (m, 1H), 1.38 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 1.19 (t, J = 6.8 Hz, 1H); LRMS: 계산치 C12H12NO+ [M + H]: 186.2; 실측치: 186.2.
단계 2 - Int 3의 합성:
3-에톡시-1H-인덴-7-카보니트릴의 EtOAc/헥산 용액 (650 mL) (Int 2)을 감압 하에 약 17 mL로 농축시키고, 이소프로필 알콜 (IPA, 40 mL)을 첨가하였다. 용액을 약 17 mL로 농축시키고, 두 번째 부피의 IPA (34 mL)을 첨가하였다. 교반 용액에 수성 하이드록실아민 (50%, 30 mL, 455 mmol)을 첨가하였다. 배치를 그 후 5시간 동안 35 내지 40℃에서 가온시키고, 그 후 주위 온도에서 밤새 교반시켰다. 배치를 0℃로 냉각시키고, 시딩하고 (50 mg), 시딩 층을 전개시키기 위해 30분 동안 교반하였다. 물 (250 mL)을 그 후 약 1.5시간 동안 적가하였다. 배치를 1시간 동안 0 내지 20℃에서 교반하였다. 산물을 여과에 의해 단리하고, 덩어리를 물 (100 mL)로 세척하고, 진공 및 질소 대기 하에 필터 상에서 건조시켜, 3-에톡시-N-하이드록시-1H-인덴-7-카복시미드아미드 (Int 3) (20.8 g, 90% 수율)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 9.61 (s, 1H), 7.43 (m, 1H), 7.32 (m, 2H), 5.77 (s, 1H), 5.41 (s, 1H), 4.08 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.45 (s, 2H), 1.39 (t, J = 6.8 Hz, 3H); LRMS: 계산치 C12H15N2O2 + [M + H]: 219.2; 실측치: 219.1.
단계 3 - N-((3-시아노-4-이소프로폭시벤조일)옥시)-3-에톡시-1H-인덴-7-카복시미드아미드 (Int 4)의 합성:
DMF (83 mL) 중 CDI (16.64 g, 102.6 mmol) 및 3-시아노-4-이소프로폭실 벤조산 (21.06 g 102.6 mmol)의 혼합물을 1시간 동안 20℃에서 교반하였다. DMF (40 mL) 중 3-에톡시-N-하이드록시-1H-인덴-7-카복시미드아미드 (Int 3) (20.8 g, 93.3 mmol)의 용액을 약 5분 동안 첨가 깔때기를 통해 첨가하였다. 약 30분 후 배치는 점성이 되었고, 추가 부피의 DMF (40 mL)를 교반을 돕기 위해 첨가하였다. 이 시점에서 HPLC 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 생성된 슬러리를 물 (1.5 L)로 희석하고, 0℃로 냉각시키고, 여과에 의해 단리하였다. 필터 덩어리를 물 (1.5 L)로 세척하고, 산물을 질소 흐름 하에 필터 상에서 건조시켜 N-((3-시아노-4-이소프로폭시벤조일)옥시)-3-에톡시-1H-인덴-7-카복시미드아미드 (Int 4)를 회백색 고체로서 (34.8 g, 90% 수율) 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 8.70 (s, 1H), 8.33 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.45 (m, 4H), 7.10 (m, 2H), 5.49 (s, 1H), 4.94 (m, 1H), 4.10 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.55 (s, 2H), 1.38 (m, 9H); LRMS: 계산치 C23H24N3O4 + [M + H]: 406.4; 실측치: 406.2.
단계 4 - 5-(3-(3-에톡시-1H-인덴-7-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (Int 5)의 합성
N-((3-시아노-4-이소프로폭시벤조일)옥시)-3-에톡시-1H-인덴-7-카복시미드아미드 (Int 4) (34.8 g, 83.97 mmol)를 톨루엔 (590 mL) 중에 현탁시키고, 18시간 동안 Dean-Stark 장치에 의해 가열 환류시켰다. 약 2 mL를 수집하였다 (이론치 1.5 mL). 배치를 주위 온도로 냉각시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 미정제 고체 5-(3-(3-에톡시-1H-인덴-7-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (Int 5) (30 g, 90% 수율) 을 다음 단계에 그대로 적용하였다. LRMS: 계산치 C23H22N3O3 + [M + H]: 388.4; 실측치: 388.3.
단계 5 - 합성 2-이소프로폭시-5-(3-(1-옥소-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴 (Cpd. No. 1):
Int 5 (30 g, 75.57 mmol)를 4:1 IPA/H2O (300 mL) 중에 현탁시켰다. 촉매 H2SO4 (0.1 mL, 0.19 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 12시간 동안 가열 환류하였다. 슬러리를 주위 온도로 냉각시키고, 1시간 동안 교반한다. 산물을 여과에 의해 단리하고, 4:1 IPA/H2O (100 mL)로 세척하였다. 진공 하에 1시간 동안 필터 상에거 건조 후, 습성 덩어리를 반응기에 재충전하고, EtOAc (300 mL) 중에 현탁하였다. 혼합물을 3시간 동안 가열 환류시키고, 그 후 주위 온도로 냉각시키고, 1시간 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하여, EtOAc (100 mL)로 세척하고, 질소 하에 필터 상에서 건조시키고 2-이소프로폭시-5-(3-(1-옥소-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴 (Cpd. No. 1) (22 g, 80% 수율)를 회백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 8.55 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.44 (m, 2H), 7.88 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.99 (h, J = 12.4 Hz, 1H), 3.46 (dd, J 1 = 5.6, J 2 = 11.2 Hz, 2H), 2.76 (dd, J 1 = 5.6, J 2 = 11.2 Hz, 2H), 1.45 (d, J = 12.4 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, d6-DMSO) δ 205.9, 173.4, 167.4, 162.6, 154.2, 138.1, 134.7, 134.2, 133.9, 128.2, 125.9, 124.5, 115.8, 115.3, 114.9, 102.5, 72.6, 35.9, 27.3, 21.5; LRMS: 계산치 C21H18N3O3 + [M + H]: 360.1; 실측치: 360.2; C,H,N 분석: 실측치: %C: 70.25, %H: 4.69; %N: 11.71; 이론치: %C: 70.18; %H: 4.77; %N: 11.69.
실시예 2
화학식 (I)의 화합물의 일반 합성
Figure pct00008
화학식 (I)의 화합물을 화합물 1 (실시예 1)로부터 출발하여 합성할 수 있다. DMAP와 같은 촉매의 존재 하에 사이클릭 무수물로 처리하면 화학식 (I)의 화합물이 생성된다. 또한, 화학식 (I)의 화합물의 생성은 화합물 1을 강염기로 처리한 후 산 염화물로 포획함으로써 달성될 수 있다.
Figure pct00009
화학식 (I)의 화합물을 또한 화합물 1(실시예 1)로부터 출발하여 강염기로 처리한 후 2-할로아세트산 무수물로 포획하고 상응하는 알파 할로에스테르를 3차 아민으로 아민화시킴으로써 합성할 수 있다(상기 도식에서, Rf1, Rf2 및 Rf3은 알킬, 예컨대 C1-4알킬을 나타냄).
실시예 3
화합물 10의 합성
((Z)-5-(3-(1-(하이드록시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴)
Figure pct00010
DCM (8 ml, 완전히 용해됨) 중 2-이소프로폭시-5-(3-(1-옥소-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴 (100 mg, 0.28 mmol)에 95% EtOH ( 4 ml), NH2OH (43 mg, 0.61 mmol) 및 NaOAc (52 mg, 0.61 mmol)를 실온에서 첨가하였다. HPLC에 의해 반응의 진행을 모니터링하였다. 반응이 완료된 후(밤새), 침전물을 수집하고, DCM (5ml x 2)로 세척하고 순수한 산물: (Z)-5-(3-(1-(하이드록시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (60 mg, 0.16 mmol, 57%)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ ppm 1.40 (d, J=8Hz, 6 H), 2.90 (m, 2 H), 3.39 (m, 2 H), 4.99 (m, 1 H), 7.56 (m, 2 H), 7.80 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.14 (d, J=8Hz, 1 H), 8.42 (d, J=8Hz, 1H), 8.54 (s, 1 H), 11.1 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C21H18N4O3: m/z 375.3 (M+1).
실시예 4
화합물 11의 합성
((Z)-4-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)부탄산)
Figure pct00011
DCM (8 ml, 완전히 용해됨) 중 2-이소프로폭시-5-(3-(1-옥소-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴 (100 mg, 0.28 mmol)에 70% EtOH ( 4 ml), 4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드 (95 mg, 0.61 mmol) 및 NaOAc (68 mg, 0.61 mmol)를 실온에서 첨가하였다. HPLC에 의해 반응의 진행을 모니터링하였다. 반응을 실온에서 48시간 동안 교반하여 30%를 전환시켰다. 용매를 제거하고, 정제를 위해 ISCO 상에 직접 부가하였다. 그러나, 이는 분리되지 않았으며; 따라서 RP ISCO [5-95% MeOH -(0.05% AcOH 포함)/물에 의해 재정제하여 적절한 산물: (Z)-4-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)부탄산 (19 mg, 0.041 mmol, 15%)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ ppm 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 2.09 (m, 2H), 2.54 (m, 2H), 2.95 (m, 2 H), 3.41 (m, 2 H), 4.26 (m, 2 H), 4.80 (m, 1 H), 7.10 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.40 (m, 1 H), 7.83 (d, J=8Hz, 1 H), 8.12 (d, J=8Hz, 1H), 8.34 (d, J=8Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C25H24N4O5: m/z 461.3 (M+1).
실시예 5
화합물 12의 합성
((Z)-4-(5-(3-((l2-아자네일이덴)-l3-메틸)-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온 O-(3-(디메틸아미노)프로필) 옥심)
Figure pct00012
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 3-(아미노옥시)-N,N-디메틸프로판-1-아민으로 대체한 것을 제외하고, (Z)-4-(5-(3-((l2-아자네일이덴)-l3-메틸)-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온 O-(3-(디메틸아미노)프로필) 옥심을 실시예 4에 기재된 절차에 따라 25% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름(CHLOROFORM)-d) δ ppm 1.48 (d, J=8Hz, 6 H), 2.25 (m, 2H), 2.7 (s, 6H), 2.97 (m, 4H), 3.45 (m, 2H), 4.29 (m, 2H), 4.81 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C26H29N5O3: m/z 460.5 (M+1).
실시예 6
화합물 13의 합성
((Z)-4-(5-(3-((l2-아자네일이덴)-l3-메틸)-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온 O-프로피오닐 옥심)
Figure pct00013
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 O-프로피오닐하이드록실아민 하이드로클로라이드로 대체한 것을 제외하고, (Z)-4-(5-(3-((l2-아자네일이덴)-l3-메틸)-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온 O-프로피오닐 옥심을 실시예 4에 기재된 절차에 따라 3% 수율로 제조하였다. ESIMS 실측치 C24H22N4O4: m/z 431.5 (M+1).
실시예 7
화합물 14의 합성
((Z)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-((2-메톡시에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴)
Figure pct00014
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 O-(2-메톡시에틸)하이드록실아민으로 대체한 것을 제외하고, (Z)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-((2-메톡시에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴을 실시예 4에 기재된 절차에 따라, 7% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.48 (d, J=8Hz, 6 H), 3.0 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 3.72 (m, 2H), 4.37 (m, 2H), 4.81 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8Hz, 1H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.86 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.46 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C24H24N4O4: m/z 433.2 (M+1).
실시예 8
화합물 6의 합성
((Z)-2-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)아세트산)
Figure pct00015
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 2-(아미노옥시)아세트산 하이드로클로라이드로 대체한 것을 제외하고, (Z)-2-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)아세트산을 실시예 4에 기재된 절차에 따라, 42% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ ppm 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 2.92 (m, 2 H), 3.29 (m, 2 H), 4.62 (s, 2 H), 4.80 (m, 1 H), 7.48 (m, 2 H), 7.71 (d, J=8Hz, 1 H), 8.11 (d, J=8Hz, 1 H), 8.31 (d, J=8Hz, 1 H), 8.40 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C23H20N4O5: m/z 433.1 (M+1).
실시예 9
화합물 15의 합성
((Z)-5-(3-(1-((2-(디에틸아미노)에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴)
Figure pct00016
DMF (1.5 ml) 중 2-클로로-N,N-디에틸에탄-1-아민 하이드로클로라이드 (138 mg, 0.8 mmol)에 Et3N (0.112 ml, 0.8 mmol)를 첨가하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 한편, DMF (1.5 ml) 중(Z)-5-(3-(1-(하이드록시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (100 mg, 0.27 mmol)에 NaH (32 mg, 0.8 mmol, 오일 중 60%)를 실온에서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 그 후, 제1 용액을 제2 용액에 실온에서 첨가하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 빙냉수에 붓고, DCM (20 ml)으로 추출하고, DCM 층을 염수로 세척하고, 건조하고, 농축시키고, ISCO (0 내지 10% MeOH/DCM으로 용출, 0.35M NH3)에 의해 정제하여 적절한 산물: (Z)-5-(3-(1-((2-(디에틸아미노)에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (23 mg, 0.048 mmol, 18%)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.07 (m, 6H), 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 2.66 (m, 4 H), 2.99 (m, 4 H), 3.42 (m, 2H), 4.31 (m, 2 H), 4.81 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C27H31N5O3: m/z 474.3 (M+H).
실시예 10
화합물 9의 합성
((Z)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-((2-(피페리딘-1-일)에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴)
Figure pct00017
(Z)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-((2-(피페리딘-1-일)에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴을 2-클로로-N,N-디에틸에탄-1-아민 하이드로클로라이드를 1-(2-클로로에틸)피페리딘 하이드로클로라이드으로 대체한 것을 제외하고 실시예 9에 기재된 절차에 따라 37% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.25 (m, 2 H), 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 1.77 (m, 4H), 2.76 (m, 4 H), 2.99 (m, 4 H), 3.42 (m, 2 H), 4.31 (m, 2 H), 4.81 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C28H31N5O3: m/z 486.5 (M+1).
실시예 11
화합물 7의 합성
((E)-3-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)프로판 산)
Figure pct00018
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 3-(아미노옥시)프로판 산 하이드로클로라이드로 대체한 것을 제외하고, (E)-3-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)프로판 산을 실시예 4에 기재된 절차에 따라, 3% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 2.86 (m, 2H), 2.97 (m, 2 H), 3.46 (m, 2H), 4.48 (m, 2H), 4.81 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C24H22N4O5: m/z 447.4 (M+1).
실시예 12
화합물 2의 합성
((Z)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-(메톡시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴)
Figure pct00019
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 O-메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드로 대체한 것을 제외하고, (Z)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-(메톡시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴 (N39-031)을 실시예 4에 기재된 절차에 따라, 34% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 2.97 (m, 2H), 3.44 (m, 2H), 4.01 (s, 3H), 4.81 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C22H20N4O3: m/z 389.1 (M+1).
실시예 13
화합물 2의 합성
((Z)-5-(3-(1-(에톡시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴)
Figure pct00020
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 O-에틸하이드록실아민 하이드로클로라이드로 대체한 것을 제외하고, (Z)-5-(3-(1-(에톡시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (N39-030)을 실시예 4에 기재된 절차에 따라, 65% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.34 (m, 3 H), 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 2.97 (m, 2 H), 3.00 (m, 2 H), 4.23 (m, 2 H), 4.81 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C23H22N4O3: m/z 402.4 (M+).
실시예 14
화합물 4의 합성
((Z)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-(이소프로폭시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴)
Figure pct00021
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 O-이소프로필하이드록실아민 하이드로클로라이드로 대체한 것을 제외하고, (Z)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-(이소프로폭시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴을 실시예 4에 기재된 절차에 따라, 48% 수율로 제조하였다. ESIMS 실측치 C24H24N4O3: m/z 417.2 (M+1).
실시예 15
화합물 5의 합성
((Z)-5-(3-(1-(tert-부톡시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴)
Figure pct00022
4-(아미노옥시)부탄산 하이드로클로라이드를 O-(tert-부틸)하이드록실아민 하이드로클로라이드로 대체한 것을 제외하고, (Z)-5-(3-(1-(tert-부톡시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴을 실시예 4에 기재된 절차에 따라, 51% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.36 (s, 9 H), 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 2.97 (m, 2 H), 3.44 (m, 2 H), 4.81 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C25H26N4O3: m/z 431.2 (M+1).
실시예 16
화합물 16의 합성
((Z)-5-(3-(1-((2-하이드록시에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴)
Figure pct00023
단계 1:
(E)-5-(3-(1-(하이드록시이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (0.6 g, 1.6 mmol)의 DMF (9 ml) 용액에 NaH (192 mg, 4.8 mmol)를 첨가하고 20분 동안 교반하였다. DMF 슬러리에 1,2-디브로모에탄 (3 g, 16 mmol)의 DCM (6 ml) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하였다. LCMS는 일부 전환을 나타내었고, 반응 혼합물을 DCM (100 mL)으로 희석하고 물 (100 mL x 2)로 세척하였다. 유기물을 Na2SO4 상에서 건조하고, 농축시키고, ISCO (25 g 컬럼, 0 내지 100% EtOAc/Hex)에 의해 정제하고, 적절한 산물: (E)-5-(3-(1-((2-브로모에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (0.08 g, 0.166 mmol, 10%)을 제공하였다. ESIMS 실측치 C23H21BrN4O3: m/z 481.3 (M+1).
단계 2:
50 mL 플라스크에 2-메톡시-N-메틸에탄-1-아민 (11 mg, 0.125 mmol), DMF (1 ml), NaH (5 mg, 0.125 mmol)를 첨가하고 그 후 5분 동안 교반하였다. 교반 혼합물에 (E)-5-(3-(1-((2-브로모에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴 (40 mg, 0.08 mmol)의 DCM (4 ml) 용액을 첨가하고, 그 후 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 ISCO (4 g 컬럼, 0 내지 10% MeOH/DCM, 0.35 N NH3)에 의해 정제하고, 적절한 산물: (E)-2-이소프로폭시-5-(3-(1-((2-((2-메톡시에틸)(메틸)아미노)에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)벤조니트릴(10 mg, 0.02 mmol, 24 %)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 2.49 (s, 3 H), 2.50 (m, 2 H), 2.80 (m, 2 H), 2.99 (m, 2 H), 3.40 (s, 3 H), 3.46 (m, 2 H), 3.50 (m, 2 H), 4.36 (m, 2 H), 4.80 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C27H31N5O4: m/z 490.5(M+1).
실시예 17
화합물 17의 합성
((E)-5-(3-(1-((2-(아제티딘-1-일)에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴)
Figure pct00024
(E)-5-(3-(1-((2-(아제티딘-1-일)에톡시)이미노)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)-1,2,4-옥사디아졸-5-일)-2-이소프로폭시벤조니트릴을 2-메톡시-N-메틸에탄-1-아민을 아제티딘으로 대체한 것을 제외하고 실시예 16 단계 2에 기재된 절차에 따라 12.9% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 1.82 (m, 2 H), 2.46 (m, 2 H), 2.90 (m, 2 H), 3.01 (m, 2 H), 3.46 (m, 2 H), 3.60 (m, 2 H), 4.36 (m, 2 H), 4.80 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C26H27N5O3: m/z 458.6(M+1).
실시예 18
화합물 18의 합성
((Z)-2-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)아세트아미드)
Figure pct00025
(Z)-2-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)아세트아미드를 2-클로로-N,N-디에틸에탄-1-아민 하이드로클로라이드를 2-클로로아세트아미드로 대체한 것을 제외하고 실시예 9에 기재된 절차에 따라 19.4% 수율로 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 3.00 (m, 2 H), 3.5 (m, 2 H), 4.69 (s, 2 H), 4.78 (m, 1 H), 5.50 (s, 1 H), 6.40 (s, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C23H21N5O4: m/z 432.4 (M+1).
실시예 19
화합물 19의 합성
((E)-2-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)프로판 산)
Figure pct00026
단계 1:
메틸 (E)-2-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)프로파노에이트를 2-클로로-N,N-디에틸에탄-1-아민 하이드로클로라이드를 메틸 2-브로모프로파노에이트로 대체한 것을 제외하고 실시예 9에 기재된 절차에 따라 80% 수율로 제조하였다. ESIMS 실측치 C25H24N4O5: m/z 461.4 (M+1).
단계 2:
THF (5 mL) 및 MeOH (2 mL) 중 메틸 (E)-2-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)아미노)옥시)프로파노에이트 (33 mg, 0.072 mmol)의 교반 용액을 LiOH (10.3 mg, 0.215 mmol) 수용액 (1 mL)으로 처리하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 후 혼합물을 6M HCl로 pH1로 산성화하였다. 혼합물을 DCM (20 mL)으로 희석하고 물 (20 mL)로 추출하였다. 수성 층을 DCM (20 mL x 3)으로 추출하였다. 유기물을 합하고, Na2SO4 상에서 건조하고 그 후 농축시키고 적절한 산물: (E)-2-(((4-(5-(3-시아노-4-이소프로폭시페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-일이덴)-아미노)옥시)프로판 산 (26 mg, 0.058 mmol, 81%)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.47 (d, J=8Hz, 6 H), 1.43 (s, 1 H), 1.63 (d, J=8Hz, 3 H), 3.07 (m, 2 H), 3.50 (m, 2 H), 4.80 (m, 1 H), 4.82 (m, 1 H), 7.12 (d, J=8 Hz, 1 H), 7.45 (t, J=4 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=8Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.35 (d, J=8 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H); ESIMS 실측치 C24H22N4O5: m/z 447.4 (M+1).
실시예 20
시험관내 생물학적 분석
세포막 제제
재조합 S1P 수용체를 발현하는 CHO 세포를 500 cm2 배양 트레이에서 배양하고, 컨플루언스(confluence)되면, 세척하고 세포 리프팅 완충액(10mM HEPES, 154mM NaCl, 6.85mM EDTA, pH 7.4)으로 분리하였다. 그런 다음 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 재현탁하고, Polytron PT 1200E 균질화기(Kinematica, Luzern, Switzerland)를 사용하여 막 제조 완충액(10mM HEPES 및 10mM EDTA, pH 7.4)에서 균질화했다. 세포 단백질을 4℃에서 30분 동안 48,000 x g에서 원심분리하여 펠렛화했다. 생성된 상청액을 따라내고, 펠렛을 다시 막 제조 완충액에 재현탁시키고, 2차 균질화한 후, 상기 기재된 바와 같이 다시 원심분리하였다. 최종 세포 단백질 펠렛을 냉각 재현탁 완충액(10mM HEPES 및 0.1mM EDTA, pH 7.4)에 현탁시키고, 분취액으로 나누고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
GTPγS 결합 분석
[35S]-GTPγS에 대한 결합 분석을 200μL의 최종 부피로 96-웰 비결합 표면 플레이트에서 수행하였다. 시험 화합물을 DMSO 중에 연속 희석하고 0.4μL의 총 부피로 Tecan D300E 디지털 프린터를 사용하여 분석 플레이트에 첨가했다. 대조군 스핑고신-1-포스페이트(S1P)를 2% β-사이클로덱스트린을 포함하는 10mM Na2CO3에서 S1P의 100nmol 펠렛으로부터 400μM 스톡 용액을 제조하여 별도로 제조했다. S1P의 연속 희석을 완전한 분석 완충액(20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% 무지방산 소혈청 알부민[BSA], 및 30μg/mL 사포닌, pH7.4)을 사용하여 수행하고, 이미 0.4 μL DMSO가 들어 있는 웰로 옮겼다. 그런 다음 모든 웰을 비특이적 결합(NSB) 웰을 제외하고 40μL의 전체 분석 완충액의 총 부피로 로딩했다. NSB 웰의 경우 40μL/웰의 50μM GTPγS(Sigma Aldrich, cat# G8634, St. Louis, MO)를 0.4μL의 DMSO를 포함하는 웰에 첨가했다. 분석을 완전한 완충액에 40μg/mL의 막 단백질, 16.67μM 구아노신 디포스페이트(GDP; Sigma Aldrich, cat# G7127, St. Louis, MO) 및 2.5mg/mL의 WGA PVT SPA 비드를 포함하는 120μL/웰의 CHO-S1P 수용체 막 용액을 첨가하여 개시하였다. 그런 다음 분석 플레이트를 밀봉하고 실온에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 인큐베이션했다. 다음으로, 기본 분석 완충액(20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 및 1 mM EDTA, pH7.4)에서 1nM의 [35S]-GTPγS(PerkinElmer, cat# NEG030X250UC, Waltham, MA) 40μL/웰을 분석 플레이트에 첨가하여, 200pM의 최종 농도를 제조하고, 플레이트를 실온에서 부드럽게 교반하면서 40분 동안 추가로 인큐베이션하였다. Eppendorf 5810R 원심분리기(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 1000rp메서 3분 동안 플레이트를 원심분리하여 분석을 종료하고 Microbeta2 마이크로플레이트 섬광 계수기(PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 G 단백질 결합 방사능을 정량화했다.
상기 기술에 의해 분석된 대표적인 화합물에 대한 데이터는 표 2에 제시되어 있다.
S1P1 S1P5
화합물 번호 EC50 (uM) 효능 % EC50 (uM) 효능 %
5 0.020 98 0.078 79
6 0.019 90 >2.0 ---
7 0.336 89 0.030 29
8 0.008 90 0.015 64
10 0.004 97 0.006 58
11 0.006 85 0.080 85
실시예 21
생체내 생물학적 분석
랫트에서 절대 경구 생체이용률의 결정.
약동학 연구를 금식하지 않은 수컷 Sprague-Dawely 랫트(Simonsen Laboratories 또는 Harlan Laboratories)에서 수행한다. 랫트를 ALAAC 인증 시설에 수용하였고, 연구는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다. 동물을 실험을 시작하기 전에 적어도 48시간 동안 실험실에 적응시킨다.
화합물을 5% DMSO/5% Tween20 및 90% 정제수(정맥내 주입) 또는 5% DMSO/5% Tween20 및 90% 0.1N HCl(경구 위관법)에서 제형화한다. 투여 용액의 농도를 HPLC-UV로 확인한다. 정맥내 투여를 위해, 본 화합물을 수동으로 억제된 동물(n=4 랫트/화합물)에 1분에 걸쳐 경정맥으로 주입 펌프에 의해 투여하였다. 경구 투여는 표준 스테인리스 스틸 위관 바늘(n=2 내지 4 랫트/화합물)을 사용한 위관법에 의해 이루어진다. 두 투여 경로 모두에 대해, 투여 후 24시간 후에 최종 샘플을 채취하여 투여 후 8개의 시점에서 혈액을 수집한다. 혈액 샘플의 분취량을 폴리프로필렌 96웰 플레이트로 옮기고 분석할 때까지 -20℃에서 동결한다.
실온에서 혈액 샘플을 해동한 후, 5μL의 DMSO를 각 웰에 첨가한다. 200nM 내부 표준(4-하이드록시-3-(알파-이미노벤질)-1-메틸-6-페닐피린딘-2-(1H)-온) 및 0.1% 포름산을 포함하는 150μL 아세토니트릴을 첨가하여 단백질을 침전시킨다. 플레이트를 플레이트 진탕기에서 1분 동안 혼합하여 단백질 침전을 촉진한 다음 3,000rp메서 10분 동안 원심분리하여 단백질을 펠렛화한다. 상청액을 깨끗한 플레이트로 옮기고 3,000rp메서 10분 동안 원심분리하여 LC/MS/MS 분석 전에 남아 있는 임의의 고체 물질을 펠렛화한다. 보정 곡선 표준을 DMSO 중 5μL 화합물 스톡을 새로 수집한 EDTA 랫트 혈액에 스파이킹하여 생성한다. 5 nM 내지 10,000 nM 범위에 걸친 8점 표준 곡선이 각 생체 분석 실행에 포함되어 있다. 표준을 랫트 약동학 샘플과 동일하게 처리한다.
랫트 약동학 샘플의 농도를 8점 표준 곡선에 대해 표준화된 HPLC-LC/MS/MS 방법을 사용하여 결정한다. 이 시스템은 Applied Biosystems 3200 QTrap과 결합된 바이너리 펌프가 있는 Agilent 1200 HPLC, Leap CTC Pal 주입기로 구성된다. 화합물을 Security Guard가 장착된 Phenomenex Synergy Fusion RP 20x2mm 2um 수은 카트리지에서 크로마토그래피한다. 0.7 내지 0.8mL/min의 다양한 유속에서 물 중 0.1% 포름산으로 구성된 이동상 A와 아세토니트릴 중 0.1% 포름산으로 구성된 이동상 B의 구배 방법을 사용한다. 전기분무 이온화(ESI) 계면을 사용하여 양이온화 모드에서 이온을 생성한다. 다중 반응 모니터링(MRM) 방법을 각 화합물에 대해 진행하였다. 가열된 분무기를 4.8μA의 분무기 전류로 325℃로 설정한다. 충돌 에너지를 사용하여 29 내지 39V 범위의 딸 이온을 생성한다. 피크 면적 비율을 정량화에 사용되는 각 화합물에 특정한 질량 전이의 MRM으로부터 획득한다. 방법의 정량화 한계는 일반적으로 5nM이다. 분석 소프트웨어 버전 1.4.2를 사용하여 데이터를 수집하고 분석한다.
혈액 농도 대 시간 데이터를 비구획 방법(WinNonlin 버전 5.2; 경구 투여용 모델 200 및 정맥내 주입용 모델 202)을 사용하여 분석한다. 절대 경구 생체이용률(%)을 다음 식을 사용하여 계산한다: (경구 AUC x IV 투여량)/(IV AUC x 경구 투여량) x 100.
림프구감소증
마우스: 암컷 C57BL6 마우스(Simonsen Laboratories, Gilroy CA)를 ALAAC 인증 시설에 수용하였고 연구는 시설 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다. 동물을 실험을 시작하기 적어도 5일 전에 실험실에 적응시킨다. 마우스(n=3/화합물/시점)에 5% DMSO/5% Tween 20 및 90% 0.1N HCl로 구성된 비히클에서 제형화된 1 내지 30 mg/kg 화합물을 경구 위관법으로 투여한다. 대조군 마우스에 비히클을 PO 투여한다. 말단 전혈 샘플을 EDTA로의 심장 천자에 의해 이소플루란 마취된 마우스로부터 수집한다. 전혈을 랫트 항-마우스 CD16/CD32(마우스 BD Fc 블록, #553141), PE-랫트 항-마우스 CD45R/B220(BD #553089), APC-Cy7-랫트 항-마우스 CD8a(BD #557654) 및 Alexa Fluor647-랫트 항-마우스 CD4(BD #557681)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다. 적혈구를 BD Pharm Lyse Lysing 완충액(#555899)을 사용하여 용해시키고 백혈구를 FACS로 분석하였다. 림프구감소증을 CD4 또는 CD8 양성 T 세포인 백혈구의 %로 표시한다. 선형 사다리꼴 규칙을 사용하여 효과 곡선하 면적(AUEC)을 계산하여 24시간 동안의 전체 림프구감소증 반응을 추정한다.
랫트: 수컷 랫트(Simonsen Laboratories, Gilroy CA)를 ALAAC 인증 시설에 수용하였고 연구는 시설 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인했다. 동물을 실험을 시작하기 적어도 5일 전에 실험실에 적응시킨다. 랫트(n=3/화합물/시점)에게 5% DMSO/5% Tween 20 및 90% 0.1N HCl로 구성된 비히클에서 제형화된 1 내지 30 mg/kg 화합물을 경구 위관법으로 투여한다. 대조군 랫트에게 비히클을 PO 투여하였다. 전혈을 후안와동을 통해 이소플루란 마취된 랫트로부터 수집하고 말단 샘플을 EDTA로의 심장 천자에 의해 수집하였다. 전혈을 마우스 항-랫트 CD32(BD #550271), PE-마우스 항-랫트 CD45R/B220(BD #554881), PECy5-마우스 항-랫트 CD4(BD #554839) 및 APC-마우스 항-랫트 CD8a(eBioscience #17-0084)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다. 적혈구를 BD Pharm Lyse Lysing 완충액(#555899)을 사용하여 용해시키고 백혈구를 BD FACS 어레이로 분석한다. 림프구감소증을 CD4 또는 CD8 양성 T 세포인 백혈구의 %로 표시한다. 선형 사다리꼴 규칙을 사용하여 효과 곡선하 면적(AUEC)을 계산하여 24시간 동안의 전체 림프구감소증 반응을 추정한다.
림프구감소증
마우스: 암컷 C57BL6 마우스(Simonsen Laboratories, Gilroy CA)를 ALAAC 인증 시설에 수용하였고 연구는 시설 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다. 동물을 실험을 시작하기 적어도 5일 전에 실험실에 적응시킨다. 마우스(n=3/화합물/시점)에 5% DMSO/5% Tween 20 및 90% 0.1N HCl로 구성된 비히클에서 제형화된 1 mg/kg 화합물을 경구 위관법으로 투여한다. 대조군 마우스에 비히클을 PO 투여한다. 말단 전혈 샘플을 EDTA로의 심장 천자에 의해 이소플루란 마취된 마우스로부터 수집한다. 전혈을 랫트 항-마우스 CD16/CD32(마우스 BD Fc 블록, #553141), PE-랫트 항-마우스 CD45R/B220(BD #553089), APC-Cy7-랫트 항-마우스 CD8a(BD #557654) 및 Alexa Fluor647-랫트 항-마우스 CD4(BD #557681)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다. 적혈구를 BD Pharm Lyse Lysing 완충액(#555899)을 사용하여 용해시키고 백혈구를 FACS로 분석하였다. 림프구감소증을 CD4 또는 CD8 양성 T 세포인 백혈구의 %로 표시한다. 선형 사다리꼴 규칙을 사용하여 효과 곡선하 면적(AUEC)을 계산하여 24시간 동안의 전체 림프구감소증 반응을 추정한다.
랫트: 수컷 랫트(Simonsen Laboratories, Gilroy CA)를 ALAAC 인증 시설에 수용하였고 연구는 시설 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인했다. 동물을 실험을 시작하기 적어도 5일 전에 실험실에 적응시킨다. 랫트(n=3/화합물/시점)에게 5% DMSO/5% Tween 20 및 90% 0.1N HCl로 구성된 비히클에서 제형화된 1 mg/kg 화합물을 경구 위관법으로 투여한다. 대조군 랫트에게 비히클을 PO 투여하였다. 전혈을 후안와동을 통해 이소플루란 마취된 랫트로부터 수집하고 말단 샘플을 EDTA로의 심장 천자에 의해 수집하였다. 전혈을 마우스 항-랫트 CD32(BD #550271), PE-마우스 항-랫트 CD45R/B220(BD #554881), PECy5-마우스 항-랫트 CD4(BD #554839) 및 APC-마우스 항-랫트 CD8a(eBioscience #17-0084)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다. 적혈구를 BD Pharm Lyse Lysing 완충액(#555899)을 사용하여 용해시키고 백혈구를 BD FACS 어레이로 분석한다. 림프구감소증을 CD4 또는 CD8 양성 T 세포인 백혈구의 %로 표시한다. 선형 사다리꼴 규칙을 사용하여 효과 곡선하 면적(AUEC)을 계산하여 24시간 동안의 전체 림프구감소증 반응을 추정한다.
위에서 기재된 다양한 실시양태는 추가 실시양태를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 명세서에서 언급되고/거나 출원 데이터 시트에 나열된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 간행물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 실시양태의 양상은 추가 실시양태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 사용하기 위해 필요한 경우 수정될 수 있다. 이들 및 다른 변경은 상기 상세한 설명에 비추어 실시양태에 대해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기의 청구범위에서, 사용되는 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 실시양태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 이와 같은 청구범위에 인정되는 균등물의 전체 범위와 함께 가능한 모든 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 2020년 3월 27일에 출원된 미국 가출원 제 63/001,073호 및 2020년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 제 63/018,327호는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.

Claims (10)

  1. 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물:
    [화학식 (I)]
    Figure pct00027

    상기 식에서,
    R은
    알킬;
    알칸디일-NR1R2;
    알칸디일-C(=O)OR1; 또는
    헤테로사이클릴알킬이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-4알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, R은 알킬인, 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 tert-부틸인, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R은 알칸디일-NR1R2인, 화합물.
  5. 제4항에 있어서, R1 및 R2는 독립적으로 수소 또는 메틸인, 화합물.
  6. 제1항에 있어서, R은 알칸디일-C(=O)OR1인, 화합물.
  7. 제6항에 있어서, R1은 수소 또는 메틸인, 화합물.
  8. 제1항에 있어서, R은 헤테로사이클릴알킬인, 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 헤테로사이클알킬은 -(CH2)-헤테로사이클인, 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 화합물은 다음 구조 중 하나를 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 동족체, 수화물 또는 용매화물:
    Figure pct00028

    Figure pct00029

    Figure pct00030

    Figure pct00031
    .
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