KR20220151611A - 암 세포, 면역 세포 및 종양 미세환경으로의 시알리다제의 전달 - Google Patents

암 세포, 면역 세포 및 종양 미세환경으로의 시알리다제의 전달 Download PDF

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KR20220151611A
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Abstract

본 출원은 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스를 사용하여 암 (예컨대, 고형 종양)을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 하나 이상의 다른 이종 단백질을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 조작된 면역 세포를 통해 전달된다. 일부 실시양태에서, 본 출원은 시알리다제 또는 다른 이종 단백질을 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스 및 시알리다제 또는 다른 이종 단백질에 결합할 수 있는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포 (예컨대, CAR-T, CAR-NK 또는 CAR-NKT 세포)를 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

암 세포, 면역 세포 및 종양 미세환경으로의 시알리다제의 전달
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020 년 1 월 21 일에 출원된 미국 가출원 제62/964,082호 및 2020 년 12 월 30 일에 출원된 미국 가출원 제63/132,420호의 우선권 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
ASCII 텍스트 파일에 대한 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일에 대한 다음의 제출 내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF) (파일명: 208712000640SEQLIST.TXT, 기록 날짜: 2021 년 1 월 19 일, 크기: 253 KB).
분야
본 출원은 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)로 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
암은 미국에서 제2 주요 사망 원인이다. 최근 몇 년 동안, 면역 체크포인트 억제제, 키메라 항원 수용체를 갖는 T 세포, 및 종양용해성 바이러스를 포함하는, 암 면역요법에서 큰 진전이 있었다.
종양용해성 바이러스는 암 세포를 감염시키고, 복제하고, 궁극적으로 살해시키는 동시에 건강한 세포는 손상시키지 않는, 자연 발생 또는 유전적으로 변형된 바이러스이다. 절제불가능한(unresectable) IIIB 기, IIIC 기 또는 IV 기 흑색종 환자 436 명에서 종양용해성 단순 헤르페스 바이러스 T-VEC의 최근 완료된 III 상 임상 시험은, GM-CSF를 받은 환자에서의 2.1%에 비해 T-VEC을 받은 환자에서 16.3%의 지속적인 반응률로 일차 엔드 포인트를 충족하는 것으로 보고되었다. 이 시험으로부터의 결과에 기반하여, FDA는 2015 년에 T-VEC을 승인하였다.
아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스-1, 뉴캐슬 질환 바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스, 콕사키바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus) 및 백시니아 바이러스를 포함하여, 8 개 이상의 상이한 종으로부터의 종양용해성 바이러스 작제물을 임상 시험의 다양한 단계에서 테스트하였다. 종양용해성 바이러스가 암 환자에서 잘 용인된다는 것이 분명해졌다. 그러나, 독립형(stand-alone) 치료로서 종양용해성 바이러스의 임상적 이익은 제한적이다. 종양용해성 바이러스의 안전성에 대한 우려로 인해, 고도로 약독화된 종양용해성 바이러스 (자연적으로 비병원성(avirulent)이거나 유전적 조작을 통해 약독화됨)만이 전임상 및 임상 연구 둘 모두에 사용되었다. 종양용해성 바이러스의 안전성이 이제 잘 확립되었으므로, 최대 항-종양 효능을 갖는 종양용해성 바이러스를 설계하고 테스트할 때이다. 강력한 종양용해 효과를 갖는 종양용해성 바이러스는 풍부한 종양 항원을 방출하여, T 및 NK 세포를 포함한 면역 세포를 프라이밍하거나 활성화하여, 강한 면역요법 효과를 초래할 것이다.
간단한 요약
본 출원은 암세포에 이종 단백질 또는 핵산을 발현하는 종양용해성 바이러스를 전달하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 출원의 일 양태는 하나 이상의 인간 또는 박테리아 시알리다제 또는 이의 시알리다제 촉매 도메인을 함유하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스를 제공한다. 종양용해성 바이러스는 폭스바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 임의의 다른 적합한 종양용해성 바이러스로부터 유래될 수 있다. 적합한 재조합 종양용해성 바이러스는 종양용해성 바이러스에 시알리다제 또는 시알리다제 활성을 갖는 이의 일부를 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 삽입함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
많은 암세포가 과시알릴화되어 있다. 본원에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스는 시알리다제를 종양 세포 및 종양 미세환경에 전달할 수 있다. 전달된 시알리다제는 종양 세포 상에 존재하는 시알산을 감소시킬 수 있고, 면역 세포, 면역 세포-기반 요법 및 암세포의 과시알릴화에 의해 유효성이 줄어드는 기타 치료제에 의한 살해에 종양 세포를 더 취약하게 만들 수 있다. 예를 들어, 면역 세포 상의 Siglect (렉틴과 같은 시알산-결합 면역글로불린)라는 수용체의 그룹은 종양 세포 상의 시알릴화된 당컨쥬게이트인 억제 수용체 리간드에 결합할 것이다. 일부 실시양태에서, 시알산의 제거는 면역 세포 상의 Siglect에 대한 이러한 리간드의 결합을 방지하고, 따라서 종양 세포에 대한 면역의 억압을 폐지한다.
또한, 종양 미세환경에 시알리다제를 전달하는 방법을 제공한다. 종양 미세 환경 내에서 시알리다제는 암세포 상의 말단 시알산 잔기를 제거하여, 면역 세포 또는 면역요법 시약의 진입의 장벽을 감소시키고 암세포에 대한 세포성 면역을 촉진할 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스이다: 백시니아 바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 모르빌리바이러스 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 폭스바이러스, 홍역 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 이들의 유도체. 일부 실시양태에서, 바이러스는 탈리모진 라헤르파렙벡(Talimogene Laherparepvec)이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 레오바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 ElACR2 결실을 갖는 아데노바이러스이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 폭스바이러스이다. 일부 실시양태에서, 폭스바이러스는 백시니아 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 드라이백스, 리스터, M63, LIVP, 티안 탄, 변형된 백시니아 앙카라, 뉴욕시 보건위원회 (NYCBOH), 다이렌, 이케다, LC16M8, 타슈켄트, IHD-J, 브라이튼, 다이렌 I, 콘노트, 엘스트리, 와이어스, 코펜하겐, 웨스턴 리저브, 엘스트리, CL, 레덜레-코리오알란토익, AS 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 균주의 백시니아 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 상응하는 야생형 균주와 비교하여 바이러스의 면역원성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스이고, 하나 이상의 돌연변이는 A14, A17, A13, L1, H3, D8, A33, B5, A56, F13, A28 및 A27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 A27L, H3L, D8L 및 L1R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스이고, 바이러스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함한다: (a) 서열번호 66-69 중 어느 하나에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) H3L 단백질; (b) 서열번호 70-72 또는 85 중 어느 하나에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) D8L 단백질; (c) 서열번호 73에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) A27L 단백질; 및 (d) 서열번호 74에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) L1R 단백질.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 Neu5Ac 알파(2,6)-Gal 시알리다제, Neu5Ac 알파(2,3)-Gal 시알리다제 또는 Neu5Ac 알파(2,8)-Gal 시알리다제이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 박테리아, 인간, 진균, 바이러스 시알리다제 및 이들의 유도체를 포함하는 엑소-시알리다제 활성을 갖는 임의의 단백질 (효소 위원회 EC 3.2.1.18)이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 시알리다제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 클로스트리디움 퍼프린젠스 시알리다제, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 및 아르트로박터 우레아파시엔스 시알리다제, 살모넬라 티피무리움 시알리다제 및 비브리오 콜레라 시알리다제.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 인간 시알리다제 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 NEU1, NEU2, NEU3 또는 NEU4이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 자연 발생 시알리다제이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 앵커링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 앵커링 도메인에 융합된 시알리다제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 생리학적 pH에서 양전하를 띤다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 글리코사미노글리칸 (GAG)-결합 도메인이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 효소 위원회 EC 3.2.1.18에 의해 정의된 바와 같은 엑소-시알리다제 활성을 갖는 단백질이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 효소 위원회 EC 4.2.2.15에 의해 정의된 바와 같은 무수시알리다제이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 1-33 또는 53-54로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제에 작동가능하게 연결된 분비 서열을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 분비 서열은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함한다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 N-말단에서 C-말단까지 시알리다제 촉매 도메인, 힌지 영역 및 막관통 도메인을 포함한다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 시알리다제는 시알리다제의 카복시 말단에 위치한 앵커링 도메인 또는 막관통 도메인을 포함한다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 프로모터는 초기 프로모터, 중간 프로모터 또는 후기 프로모터
또는 초기/후기 하이브리드 프로모터일 수 있는 바이러스 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 폭스바이러스이고, 프로모터는 폭스바이러스 초기 프로모터, 후기 프로모터 또는 하이브리드 초기/후기 프로모터이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 프로모터는 바이러스 후기 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 F17R 후기 프로모터 (서열번호 61)이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 프로모터는 하이브리드 초기-후기 프로모터이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 프로모터는 인간 프로모터의 부분적 또는 완전한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 프로모터는 조직 또는 종양-특이적 프로모터이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 이종 단백질을 코딩한다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 면역 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, TIGIT, LAG3, TIM-3, VISTA, B7-H4 또는 HLA-G의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항체이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 면역 억압 수용체의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 억압 수용체는 LILRB, TYRO3, AXL 또는 MERTK이다. 일부 실시양태에서, 면역 억압 수용체의 억제제는 항-LILRB 항체이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 다중-특이적 면역 세포 인게이저이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 이중특이적 T 세포 인게이저 (BiTE)이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 사이토카인, 공동자극 분자, 종양 항원 제시 단백질, 항-혈관신생 인자, 종양-연관된 항원, 외래 항원 및 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 CD55 또는 CD59의 억제제이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 IL-15, IL-12, IL2, 감소된 독성 또는 우수한 기능을 갖는 변형된 IL-2, IL18, IL-18 결합 단백질에 대한 결합이 적거나 전혀 없는 변형된 IL-18, Flt3L, CCL5, CXCL10 또는 CCL4 및 항-종양 면역을 여전히 갖고 있는 이러한 사이토카인의 임의의 변형된 형태, 또는 이들 사이토카인 기능 및 활성을 차단하고 중화할 수 있는 임의의 결합 단백질의 억제제이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 박테리아 폴리펩티드이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR (예컨대, EGFRvIII), GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, 피불린-3, CDH17 및 임상적 유의성을 갖는 기타 종양 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양-연관된 항원이다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 바이러스는 2 개 이상의 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오티드 서열은 이종 단백질을 코딩한다.
본 출원의 일 양태는 선행하는 청구범위 중 어느 하나의 재조합 종양용해성 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 출원의 일 양태는 위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나를 포함하는 담체 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 담체 세포는 조작된 면역 세포 또는 줄기 세포 (예컨대, 중간엽 줄기 세포)이다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)-T, CAR-NK 또는 CAR-NKT 세포이다.
본 출원의 일 양태는 위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스, 약학 조성물 또는 담체 세포 중 어느 하나의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 담체 세포 (예컨대, 면역 세포 또는 줄기 세포, 예컨대, 중간엽 줄기 세포)를 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 네이키드 바이러스로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 직접적인 종양내 주사를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역요법제의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역요법제는 단일 또는 다중-특이적 항체, 세포 요법, 암 백신 (예컨대, 수지상 세포-기반 암 백신), 사이토카인, PI3K감마 억제제, TLR9 리간드, HDAC 억제제, LILRB2 억제제, MARCO 억제제 및 면역 체크포인트 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
위에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 면역요법제는 세포 요법이다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 출원의 일 양태는 위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나를 포함하고 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 출원의 일 양태는 (a) 외래 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량; 및 (b) 상기 외래 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 종양의 치료를 필요로 하는 개체에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
본 출원의 일 양태는 위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스, 약학 조성물 또는 조작된 면역 세포 중 어느 하나의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법에 대해 종양을 감작시키는 방법을 제공한다.
본 출원의 일 양태는 위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스, 약학 조성물 또는 조작된 면역 세포 중 어느 하나의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 세포의 시알화를 감소시키는 방법을 제공한다.
위에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 실시양태에서, CAR을 발현하는 조작된 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포 또는 NKT 세포이다.
위에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 키메라 수용체를 발현하며, 여기서 키메라 수용체는 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR (예컨대, EGFRvIII), GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, 피불린-3, CDH17 및 임상적 유의성을 갖는 기타 종양 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 항원을 특이적으로 인식한다.
위에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 키메라 수용체를 발현하며, 여기서 키메라 수용체는 시알리다제를 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181 또는 이의 유도체이고, 키메라 수용체는 인간 천연 뉴라미니다제와 교차-반응하지 않는 항-DAS181 항체를 포함한다.
위에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포 및 재조합 종양용해성 바이러스는 동시에 투여된다.
위에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 조작된 면역 세포의 투여 전에 투여된다.
또한, 위에 기재된 방법 중 어느 하나에 사용하기 위한 조성물, 키트 및 제조 물품을 제공한다.
도 1: 형광 현미경에 의한 A549 및 MCF 세포 상의 2,6 시알산의 (FITC-SNA에 의한) 검출. A549 및 MCF 세포를 고정하고, 37℃에서 1 시간 동안 FITC-SNA와 함께 항온처리한 후, 형광 현미경으로 이미징하여, FITC-SNA 표지된 세포 (좌측) 및 명시야 세포와의 오버레이 (우측)를 도시하였다.
도 2: DAS181 처리에 의한 A549 세포 상의 2,6 시알산, 2,3 시알산의 효과적인 제거 및 갈락토오스의 노출. A549를 37℃에서 2 시간 동안 DAS181로 처리하고, 1 시간 염색 시약과 함께 항온처리한 후, 형광 현미경으로 이미징하여, 종양 세포 상의 시알산의 효과적인 제거를 도시하였다.
도 3: DAS185 처리가 아닌 DAS181에 의한 A549 세포 상의 2,6 시알산의 효과적인 제거. A549를 37℃에서 30 분 또는 2 시간 동안 DAS181로 처리하고, FITC-SNA와 1 시간 동안 항온처리한 후, 유세포 분석법을 사용하여 조사하여, 종양 세포 상의 2,6 시알산의 효과적인 제거를 도시하였다.
도 4: DAS185 처리가 아닌 DAS181에 의한 A549 세포 상의 2,3 시알산의 효과적인 제거. A549를 37℃에서 30 분 또는 2 시간 동안 DAS181로 처리하고, FITC-MALII와 1 시간 동안 항온처리한 후, 유세포 분석법을 사용하여 조사하여, 종양 세포 상의 2,3 시알산의 효과적인 제거를 도시하였다.
도 5: DAS185 처리가 아닌 DAS181에 의한 A549 세포 상의 갈락토오스의 효과적인 노출. A549를 37℃에서 30 분 또는 2 시간 동안 DAS181로 처리하고, FITC-PNA와 1 시간 동안 항온처리한 후, 유세포 분석법을 사용하여 조사하여, 종양 세포 상의 갈락토오스의 효과적인 노출을 도시하였다.
도 6: DAS181 처리 및 PBMC 자극 양생법은 A549-적색 세포 증식에 영향을 미치지 않는다. A549-적색 세포를 밤새 2k 개/웰로 씨딩한 후, 좌측에 나열된 시약을 함유하는 배지를 교체하였다. IncuCyte에 의한 스캔을 시약이 첨가된 직후 (0 시간) 개시하였고, 3 시간마다 예정하였다. A549-적색 세포 증식을 핵 (적색) 카운트를 분석함으로써 모니터링하였다. 동역학 판독은 PBMC의 존재 없이 비히클, DAS181 또는 다양한 자극 시약에 의한 A549 세포 증식에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
도 7: DAS181 처리 여부에 관계없이 공여자 1로부터의 PBMC와 공동-배양한 후 A549-적색 세포에서의 세포독성의 검출. 이러한 결과는 DAS181 처리가 공여자 1로부터의 PBMC에 의한 항-종양 세포독성을 유의하게 상승시킨다는 것을 보여주었다. A549-적색 세포를 밤새 2k 개/웰로 씨딩한 후, 배지 (활성화 없음), CD3+CD28+IL-2 (T 세포 활성화), 또는 CD3+CD29+IL-2+IL-15+IL-21 (T 및 NK 세포 활성화)의 존재 하에 100K 개/웰의 공여자-1 PBMC (E:T=50:1)와 공동-배양하였다. 대표적인 이미지를 PBMC를 첨가한 후 0 시간 및 72 시간에 IncuCyte에 의해 촬영하였다.
도 8: DAS181 처리 유무에 관계없이 공여자 2로부터의 PBMC와 공동-배양한 후 A549-적색 세포에서의 세포독성의 검출. 이러한 결과는 DAS181 처리가 공여자 2로부터의 PBMC에 의한 항-종양 세포독성을 유의하게 상승시킨다는 것을 보여주었다. A549-적색 세포를 밤새 2k 개/웰로 씨딩한 후, 배지 (활성화 없음), CD3+CD28+IL-2 (T 세포 활성화), 또는 CD3+CD29+IL-2+IL-15+IL-21 (T 및 NK 세포 활성화)의 존재 하에 100k 개/웰의 공여자-1 PBMC (E:T=50:1)와 공동-배양하였다. 대표적인 이미지를 PBMC를 첨가한 후 0 시간 및 72 시간에 IncuCyte에 의해 촬영하였다.
도 9a-9c: DAS181 처리 유무에 관계없이 공여자 1로부터의 PBMC와 공동-배양한 후 A549-적색 세포에서의 세포독성의 검출. 이러한 결과는 DAS181 처리가 공여자 1로부터의 PBMC에 의한 항-종양 세포독성을 유의하게 상승시킨다는 것을 보여주었다. A549-적색 종양 세포를 96-웰 플레이트에 2k 개의 세포/웰로 씨딩하였다. 밤새 항온처리한 후, (a) 배지 (b) CD3/CD28/IL-2 또는 (c) CD3/CD28/IL-2/IL-15/IL-21과 혼합된 공여자 1로부터의 PBMC를 표시된 E:T 비율로 각각의 웰에 첨가하였다. 그러는 동안, DAS 181 (100 nM)을 첨가하였다. 총 72 시간 동안 3 시간마다 IncuCyte로 플레이트를 스캔하였다. RFP 세포 카운트를 분석함으로써 증식을 모니터링하였다.
도 10a-10c: DAS181 처리 유무에 관계없이 공여자 2로부터의 PBMC와 공동-배양한 후 A549-적색 세포에서의 세포독성의 검출. 이러한 결과는 DAS181 처리가 공여자 2로부터의 PBMC에 의한 항-종양 세포독성을 유의하게 상승시킨다는 것을 보여주었다. A549-적색 종양 세포를 96-웰 플레이트에 2k 개의 세포/웰로 씨딩하였다. 밤새 항온처리한 후, (a) 배지, (b) CD3/CD28/IL-2 또는 (c) CD3/CD28/IL-2/IL-15/IL-21과 혼합된 공여자 2로부터의 PBMC를 표시된 E:T 비율로 각각의 웰에 첨가하였다. 그러는 동안, DAS 181 (100 nM)을 첨가하였다. 총 72 시간 동안 3 시간마다 IncuCyte로 플레이트를 스캔하였다. RFP 세포 카운트를 분석함으로써 증식을 모니터링하였다.
도 11: DAS181은 MTS 검정에 의해 측정된 백시니아 바이러스에 의한 NK-매개된 종양 용해를 향상시킨다.
Figure pct00001
=T-테스트 P 값 <0.05, 이는 DAS181 단독이 효소-사멸 DAS185와 비교하여 생체외에서 NK 세포-매개된 U87 종양 살해를 상승시킨다는 것을 시사한다. * = T-테스트 P 값 <0.05.
도 12: DAS181은 MTS 검정에 의해 측정된 바와 같은 백시니아 바이러스에 의한 NK-매개된 종양 살해를 증가시킨다. * = T-테스트 P 값 <0.05, 이는 DAS181이 생체외 VV에 의한 U87 세포의 NK 세포-매개된 살해를 증가시킨다는 것을 시사한다.
도 13: DAS181은 단독으로 배양되거나 VV-감염된 종양 세포에 노출된 인간 DC 세포에서 성숙 마커 (CD80, CD86, HLA-Dr, HLA-ABC)의 발현을 유의하게 향상시켰다. * =: T-테스트 P 값 <0.05.
도 14: DAS181은 THP-1 유래된 대식세포에 의한 TNF-알파 생산을 유의하게 향상시켰다. * = T-테스트 P 값 <0.05
도 15: DAS181 처리는 종양용해성 아데노바이러스-매개된 종양 세포 살해 및 성장 억제를 촉진한다. A549-적색 종양 세포를 96-웰 플레이트에 2K 개의 세포/웰로 씨딩하였다. 밤새 항온처리한 후, DAS181 비히클, 종양용해성 아데노바이러스 및 DAS181을 표시된 바와 같이 첨가하였다. CD3/CD28/IL-2를 또한 앞서 설명한 양으로 각각의 웰에 첨가하였다. 그래프는 DAS181 + 종양용해성 아데노바이러스가 종양 세포 증식을 효과적으로 감소시켰음을 보여주었다.
도 16a-16b: DAS181 처리는 종양용해성 바이러스에 의한 PBMC-매개된 종양 세포 살해를 향상시킨다. A549-적색 종양 세포를 96-웰 플레이트에 2K 개의 세포/웰로 씨딩하였다. 밤새 항온처리한 후, 신선한 PBMC를 10K 개/웰 (a) 또는 40K 개/웰 (b)의 밀도로 첨가하였다. IncuCyte에 의한 시간별 스캔에 이어, 그래프에 표시된 바와 같이 CD3, CD28, IL-2, DAS181 및 종양용해성 아데노바이러스를 첨가하였다. 그래프는 DAS181 + 종양용해성 아데노바이러스가 인간 PBMC-매개된 종양 세포 박멸을 극적으로 향상시켰음을 보여주었다.
도 17: 시알리다제를 코딩하는 백시니아 바이러스 작제물의 일부의 개략도.
도 18a-18b: 시알리다제-VV에 의해 발현된 DAS181은 시알산-함유 기질에 대해 생체외 활성을 갖는다. (a) 0.5 nM, 1 nM 및 2 nM에서 DAS181 활성의 표준 곡선. (b) 시알리다제-VV로 감염된 1x106 개의 세포는 생체외에서 1 ml의 배지 중 0.78 nM - 1.21 nM의 DAS181과 등가인 DAS181을 발현한다.
도 19: 시알리다제-VV는 수지상 세포 성숙을 향상시킨다. GM-CSF/IL4 유래된 인간 DC를 시알-VV 또는 VV 감염된 U87 종양 세포 용해물과 함께 24 시간 동안 배양하였다. LPS를 대조군으로서 사용하였다. DC를 수집하고, CD80, CD86, HLA-DR 및 HLA-ABC에 대한 항체로 염색하였다. DC 성숙 마커의 발현을 유동 분석에 의해 결정하였다. 결과는 시알-VV가 DC 성숙을 향상시켰음을 시사하였다. * = T-테스트 P 값 <0.05
도 20: T 세포에 의한 시알리다제-VV 유도된 IFN-감마 및 IL2 발현. CD3 항체-활성화된 인간 T 세포를 시알-VV- 또는 VV-감염된 종양 세포 용해물의 존재 하에 A594 종양 세포와 24 시간 동안 공동-배양하고, 사이토카인 IFNr 또는 IL-2 발현을 ELISA로 측정하였다. 결과는 시알-VV-감염된 종양 세포 용해물이 인간 T 세포에 의한 IFNr 및 IL2 발현을 유도하였음을 시사하였다. * = T-테스트 P 값 <0.05
도 21: 시알리다제-VV는 T 세포-매개된 종양 세포 용해 활성을 향상시킨다. CD3 Ab 활성화된 인간 T 세포를 시알-VV- 또는 VV-감염된 A594 종양 세포와 24 시간 동안 공동-배양하고, 종양 세포 생존율을 MTS 검정에 의해 결정하였다. 결과는 종양 세포의 시알-VV 감염이 향상된 종양 살해를 초래하였음을 시사하였다. * = T-테스트 P 값 <0.05.
도 22a-22c: 세포 표면 α2,3 시알산 (도 22a); α2,6 시알산 (도 22b) 및 갈락토오스 (도 22c)에 대한 DAS181 및 분비된 시알리다제 작제물 1, 2 및 3의 영향. 도 22a: A549-적색 세포를 작제물-1, 2 또는 3에 의해 형질주입시켰다. 밤새 항온처리한 후, 형질주입된 세포를 들어올려, 24-웰 플레이트에 재-씨딩하였다. 추가적인 24 시간, 48 시간 및 72 시간 후, 세포를 고정하고, 유동을 수행하기 전에 1 시간 동안 MALII-FITC로 염색하였다. 비-형질주입된 세포를 100 nM의 DAS181로 2 시간 동안 처리한 후, 고정하였다. DAS181용으로 제조된 비히클을 사용하여, 대조군으로서 비-형질주입된 세포의 다른 세트를 처리하였다. 도 22b: A549-적색 세포를 작제물-1, 2 및 3에 의해 형질주입시켰다. 밤새 항온처리한 후, 형질주입된 세포를 들어올려, 24-웰 플레이트에 재-씨딩하였다. 추가적인 24 시간, 48 시간 및 72 시간 후, 세포를 고정하고, 유동을 수행하기 전에 1 시간 동안 SNA-FITC로 염색하였다. 비-형질주입된 세포를 100 nM의 DAS181로 2 시간 동안 처리한 후, 고정하였다. DAS181용으로 제조된 비히클을 사용하여, 대조군으로서 비-형질주입된 세포의 다른 세트를 처리하였다. 도 22c: A549-적색 세포를 작제물-1, 2 및 3에 의해 형질주입시켰다. 밤새 항온처리한 후, 형질주입된 세포를 들어올려, 24-웰 플레이트에 재-씨딩하였다. 추가적인 24 시간, 48 시간 및 72 시간 후, 세포를 고정하고, 유동을 수행하기 전에 1 시간 동안 PNA-FITC로 염색하였다. 비-형질주입된 세포를 100 nM의 DAS181로 2 시간 동안 처리한 후, 고정하였다. DAS181용으로 제조된 비히클을 사용하여, 대조군으로서 비-형질주입된 세포의 다른 세트를 처리하였다.
도 23a-23c: 세포 표면 α2,3 시알산 (도 23a); α2,6 시알산 (도 23b); 및 갈락토오스 (도 23c)에 대한 DAS181 및 막관통 시알리다제 작제물 1, 4, 5 및 6의 영향. 도 23a: A549-적색 세포를 작제물-1, 4, 5 및 6에 의해 형질주입시켰다. 밤새 항온처리한 후, 형질주입된 세포를 들어올려, 24-웰 플레이트에 재-씨딩하였다. 추가적인 24 시간, 48 시간 및 72 시간 후, 세포를 고정하고, 1 시간 동안 MALII-비오틴화된 후 추가적인 1 시간 동안 FITC-스트렙타비딘으로 염색하였다. 2,3-시알산 수준을 유세포 분석법에 의해 검출하였다. 도 23b: A549-적색 세포를 작제물-1, 4, 5 및 6에 의해 형질주입시켰다. 밤새 항온처리한 후, 형질주입된 세포를 들어올려, 24-웰 플레이트에 재-씨딩하였다. 추가적인 24 시간, 48 시간 및 72 시간에, 세포를 고정하고, 1 시간 동안 SNA-FITC로 염색하였다. 2,6-시알산 수준을 유세포 분석법에 의해 검출하였다. 도 23c: A549-적색 세포를 작제물-1, 4, 5 및 6에 의해 형질주입시켰다. 밤새 항온처리한 후, 형질주입된 세포를 들어올려, 24-웰 플레이트에 재-씨딩하였다. 추가적인 24 시간, 48 시간 및 72 시간 후, 세포를 고정하고, 1 시간 동안 PNA-FITC로 염색하였다. 갈락토오스 수준을 유세포 분석법에 의해 검출하였다.
도 24: 작제물 1의 안정적인 발현은 종양용해성 바이러스 및 PBMC-매개된 A549 세포 살해를 증가시킨다. 새로 단리된 PBMC를 2 개의 분리된 플레이트 (플레이트 2 및 4) 상에서 오직 A549-적색 모 세포와만 함께 또는 작제물-1을 안정하게 발현하는 세포 또는 1 MOI 또는 5 MOI로 작제물-1을 안정하게 발현하는 세포와 함께 항온처리하였다.
도 25: 작제물 4의 안정적인 발현은 종양용해성 바이러스 및 PBMC-매개된 A549 세포 살해를 증가시킨다. 신선한 단리된 PBMC를 활성화하고, 2 개의 분리된 플레이트 (플레이트 2 및 4)에서 오직 A549-적색 세포와만 함께 또는 작제물-4를 안정하게 발현하는 세포 또는 1 MOI 또는 5 MOI OL을 포함하는 작제물-4를 안정하게 발현하는 세포와 함께 항온처리하였다.
도 26: 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스를 생성하기 위한 웨스턴 리저브 VV의 TK 유전자로의 재조합을 위한 예시적인 시알리다제 발현 작제물의 설계. 예시적인 작제물은 세포내 시알리다제, 앵커링 도메인을 갖는 분비된 시알리다제, 및 막관통 도메인을 갖는 세포 표면 발현된 시알리다제에 대해 도시된다.
도 27: 시알리다제 발현의 PCR 검출: CV-1 세포를 MOI 0.2에서 시알리다제-VV로 감염시켰다. 48 시간 후, CV-1 세포를 수집하고, Wizard® SV 게놈 DNA 정제 시스템을 사용하여 DNA를 추출하고, 시알리다제 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. PCR을 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 예상된 PCR 산물 크기는 1251 bp이다.
도 28: U87 또는 CV-1 세포를 MOI 1에서 대조군 VV, SP-, 엔도- 또는 TM-시알-VV로 감염시켰다. 세포를 24, 48, 72 또는 96 시간에 수집하였다. 바이러스 역가를 플라크 검정에 의해 결정하였다.
도 29: U87 종양 세포를 MOI 0.1, 1 또는 5에서 대조군 VV, SP-, 엔도- 또는 TM-시알-VV로 감염시켰다. 종양 살해를 MTS 검정에 의해 측정하였다.
도 30: DC 성숙 마커 HLA-ABC의 발현은 분비된 또는 막관통 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스와의 배양에 의해 향상된다.
도 31: DC 성숙 마커 HLA-DR의 발현은 분비된 또는 막관통 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스와의 배양에 의해 향상된다.
도 32: DC 성숙 마커 CD80의 발현은 분비된 또는 막관통 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스와의 배양에 의해 향상된다.
도 33: DC 성숙 마커 CD86의 발현은 분비된 또는 막관통 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스와의 배양에 의해 향상된다.
도 34: 시알-VV는 생체외에서 NK-매개된 종양 용해를 향상시킨다. 음성 선택된 인간 NK 세포 (Astarte, WA) 및 VV-U87 세포 (ATCC, VA)를 공동-배양하고, LDH 검정 (Abeam, MA)에 의해 종양 살해 효험을 측정하였다. 결과는 시알-VV가 생체외에서 NK 세포-매개된 U87 종양 살해를 향상시켰음을 시사하였다. (* P 값, U87 및 NK 배양물에서의 시알-VV 대 모의 VV).
도 35: 결과는 TM-시알-VV가 생체내에서 대조군 VV와 비교하여 종양 (마우스의 우측 옆구리에 접종된 종양 세포) 성장을 유의하게 억제하였음을 나타낸다.
도 36 결과는 TM-시알-VV가 생체내에서 대조군 VV와 비교하여 종양 (마우스의 좌측 옆구리에 접종된 종양 세포) 성장을 유의하게 억제하였음을 나타낸다.
도 37: 마우스 체중은 시알-VV 또는 VV 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 결과는 마우스 체중에 대한 상이함을 나타내지 않았다.
도 38a-38b: 시알리다제 무장된 종양용해성 백시니아 바이러스는 종양 내에서 CD8+ 및 CD4+ T 세포 침윤을 유의하게 향상시켰다. * p 값: 치료군 대 대조군 VV 군. 도 38a는 결과의 정량화를 도시한다. 도 38b는 FACS 플롯을 도시한다.
도 39: TM-시알-VV는 대조군 VV와 비교하여 종양 내의 Treg/CD4+ T 세포의 비율을 저하시켰다. * p 값: 치료군 대 대조군 VV 군.
도 40: 시알리다제 무장된 종양용해성 백시니아 바이러스는 종양 내에서 NK 및 NKT 세포 침윤을 유의하게 향상시켰다. * p 값: 치료군 대 대조군 VV 군.
도 41: TM-시알-VV는 종양 세포 내에서 PD-L1 발현을 유의하게 증가시켰다 (p <0.05).
본 출원은 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)로 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스는 시알리다제를 종양 세포 및/또는 종양 세포 환경에 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달된 시알리다제는 종양 세포 또는 면역 세포 상에 존재하는 시알산을 감소시키고, 종양 세포를 면역 세포, 면역 세포-기반 요법 및/또는 암세포의 과시알릴화에 의해 유효성이 줄어드는 기타 치료제에 의한 살해에 보다 취약하게 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달된 시알리다제는 억제 수용체 리간드 (시알릴화된 당컨쥬게이트)와 면역 세포에 대한 Siglect의 결합을 감소 또는 방지한다. 따라서, 일부 실시양태에서 전달된 시알리다제는 종양 세포에 대한 면역의 억압을 감소 또는 폐지한다. 일부 실시양태에서, 전달된 시알리다제 (예컨대, 박테리아 시알리다제)는 외래 항원으로서 작용하고, 종양 세포 상에서의 이의 발현은 종양 세포에 대한 면역 반응을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 바이러스를 발현하는 담체 세포 (예컨대, 조작된 면역 세포 또는 줄기 세포)를 통해 전달된다. 일부 실시양태에서, 방법은 (예컨대, 종양용해성 바이러스에 의해 전달되는 외래 항원, 예컨대, 시알리다제를 표적화하는 키메라 수용체를 발현함으로써) 재조합 종양용해성 바이러스의 항-종양 효과를 향상시키는 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
I. 정의
용어는 다음과 같이 달리 정의되지 않는 한, 당업계에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하여 유익한 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 출원의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 질환으로 인한 하나 이상의 증상의 저하, 질환의 정도의 줄어듬, 질환의 안정화 (예컨대, 질환의 악화의 예방 또는 지연), 질환의 확산의 예방 또는 지연, 질환의 발생 또는 재발의 예방 또는 지연, 질환의 진행의 지연 또는 저속, 질환 상태의 호전, 질환의 (부분적이든 전체적이든) 관해의 제공, 질환 치료에 필요한 하나 이상의 다른 의약의 용량의 저하, 질환의 진행의 지연, 삶의 질의 증가 및/또는 생존의 연장. 또한 "치료"에는 질환의 병리학적 결과의 감소가 포함된다. 본 출원의 방법은 이들 치료 양태 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
용어 "개체", "대상체" 및 "환자"는 인간을 포함하는 포유류를 설명하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 개체는 암을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 치료가 필요하다.
당업계에 이해되는 바와 같이, "유효량"은 원하는 치료적 결과 (예컨대, 암의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 기간의 감소, 이의 중증도의 안정화, 또는 이의 제거)를 생산하기에 충분한 조성물의 양을 지칭한다. 치료적 용도의 경우, 유익한 또는 원하는 결과는 예컨대, 질환의 발달 동안 나타나는 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하여 질환으로 인한 하나 이상의 증상의 저하 (생화학적, 조직학적 및/또는 행동적), 질환을 앓고 있는 사람들의 삶의 질의 증가, 질환 치료에 필요한 다른 의약의 용량의 저하, 다른 의약의 효과의 향상, 질환의 진행의 지연 및/또는 환자의 생존의 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제의 유효량은 생존 (전체 생존 및 무진행 생존 포함)을 연장할 수 있고/있거나; 객관적인 반응 (완전한 반응 또는 부분적 반응 포함)을 초래할 수 있고/있거나; 질환 또는 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상을 어느 정도로 완화시킬 수 있고/있거나; 대상체의 삶의 질을 개선시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "야생형"은 당업자에 의해 이해되는 당업계의 용어이며, 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되는 자연에서 발생하는 유기체, 균주, 유전자 또는 특질의 전형적인 형태를 의미한다.
용어 "비-자연 발생" 또는 "조작된"은 상호교환적으로 사용되며, 사람의 손이 관여함을 나타낸다. 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 언급할 때 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 자연에서 자연적으로 회합되고 자연에서 발견되는 하나 이상의 다른 구성요소가 적어도 실질적으로 없음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "시알리다제"는 당단백질 또는 당지질 상의 탄수화물로부터 말단 시알산의 절단을 촉매할 수 있는 자연 발생 또는 조작된 시알리다제를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "시알리다제"는 당단백질 또는 당지질 상의 탄수화물로부터 말단 시알산의 절단을 촉매할 수 있는 자연 발생 또는 비-자연 발생 시알리다제의 도메인을 지칭할 수 있다. 용어 "시알리다제"는 또한 자연 발생 또는 비-자연 발생 시알리다제 단백질 또는 이의 효소 활성 단편 또는 도메인 및 다른 폴리펩티드, 이의 단편 또는 도메인, 예컨대, 앵커링 도메인 또는 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "시알리다제"는 시알리다제 촉매 도메인 단백질을 포함한다. "시알리다제 촉매 도메인 단백질"은 시알리다제의 촉매 도메인, 또는 시알리다제의 촉매 도메인과 실질적으로 상동성이지만 시알리다제의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 촉매 도메인이 유래되고, 여기서 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 촉매 도메인이 유래된 온전한 시알리다제로서 실질적으로 기능적 활성을 유지한다. 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 시알리다제로부터 유래되지 않은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 하나 이상의 다른 알려진 단백질의 아미노산 서열로부터 유래되거나 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 다른 알려진 단백질의 아미노산 서열로부터 유래되거나 실질적으로 상동성인 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사물 및 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 생성물"로서 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중-특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체 등), 인간화 항체, 키메라 항체, 전장 항체 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 이들의 항원-결합 단편, 단일 쇄 Fv, 나노바디, Fc 융합 단백질을 포함하는 다양한 항체 구조체를 포함한다. 항체 및/또는 항체 단편은 뮤린 항체, 토끼 항체, 닭 항체, 인간 항체, 완전 인간화 항체, 낙타류 항체 가변 도메인 및 인간화 버전, 상어 항체 가변 도메인 및 인간화 버전, 및 낙타화 항체 가변 도메인으로부터 유래될 수 있다.
예컨대, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합체"는 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래된다는 것을 나타낸다.
용어 "바이러스" 또는 "바이러스 입자"는 바이러스학 내에서 이의 일반적인 의미에 따라 사용되며, 바이러스 게놈 (예컨대, DNA, RNA, 단일 가닥, 이중 가닥), 바이러스 캡시드 및 연관된 단백질, 및 외피 바이러스 (예컨대, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스)의 경우, 지질 및 임의로 숙주 세포막의 구성요소를 포함하는 외피, 및/또는 바이러스 단백질을 포함하는 비리온을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "종양용해성 바이러스"는 종양을 갖는 대상체에서 종양 세포에서 선택적으로 복제하고 종양 세포를 선택적으로 살해시키는 바이러스를 지칭한다. 이들은 종양 세포에서 자연적으로 우선적으로 복제 및 축적되는 바이러스, 예컨대, 폭스바이러스, 및 그렇게 하도록 조작된 바이러스를 포함한다. 일부 종양용해성 바이러스는 종양 세포의 감염 후 종양 세포를 살해시킬 수 있다. 예를 들어, 종양용해성 바이러스는 종양 세포를 용해하거나 종양 세포의 세포 사멸을 유도함으로써 종양 세포의 사멸을 유발할 수 있다. 예시적인 종양용해성 바이러스는 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 랍도바이러스, 유두종바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스, 피코마바이러스, 신드비스 바이러스, 유두종바이러스, 파보바이러스, 레오바이러스 및 콕사키바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "폭스바이러스"는 바이러스학 내에서 이의 일반적인 의미에 따라 사용되며, 숙주의 세포질에서 복제하는, 척추동물 및 무척추동물을 감염시킬 수 있는 폭스비리다에 과의 구성원을 지칭한다. 실시양태에서, 폭스바이러스 비리온은 약 200 nm의 직경 및 약 300 nm의 길이의 크기를 갖고, DNA의 단일 선형 이중-가닥 세그먼트, 전형적으로 130-375 킬로베이스의 게놈을 보유한다. 용어 폭스바이러스는 제한없이, 폭스비리다에의 모든 속 (예컨대, 베타엔토모폭스바이러스, 야타폭스바이러스, 세르비드폭스바이러스, 감마엔토모폭스바이러스, 레포리폭스바이러스, 수이폭스바이러스, 몰루스키폭스바이러스, 크로코딜리드폭스바이러스, 알파엔토모폭스바이러스, 카프리폭스바이러스, 오르토폭스바이러스, 아비폭스바이러스 및 파라폭스바이러스)을 포함한다. 실시양태에서, 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스 (예컨대, 천연두 바이러스, 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 원숭이두 바이러스), 파라폭스바이러스 (예컨대, orf 바이러스, 가성우두 바이러스, 소 대중성 구내염 바이러스), 야타폭스바이러스 (예컨대, 타나폭스 바이러스, 야바 원숭이 종양 바이러스) 또는 몰루스키폭스바이러스 (예컨대, 몰루스쿰 콘타기오숨 바이러스)이다. 실시양태에서, 폭스바이러스는 오르토폭스바이러스 (예컨대, 우두 바이러스 균주 브라이튼, 라쿤두 바이러스 균주 헤르만, 토끼두 바이러스 균주 위트레흐트, 백시니아 바이러스 균주 WR, 백시니아 바이러스 균주 IHD, 백시니아 바이러스 균주 엘스트리, 백시니아 바이러스 균주 CL, 백시니아 바이러스 균주 레덜레-코리오알란토익 또는 백시니아 바이러스 균주 AS)이다. 실시양태에서, 폭스바이러스는 파라폭스바이러스 (예컨대, orf 바이러스 균주 NZ2 또는 유사우두 바이러스 균주 TJS)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "변형된 바이러스" 또는 "재조합 바이러스"는 바이러스의 모 균주와 비교하여 게놈이 변경된 바이러스를 지칭한다. 전형적으로 변형된 바이러스는 바이러스의 모 균주의 게놈에서 뉴클레오티드의 하나 이상의 절두(truncation), 치환 (교체), 돌연변이, 삽입 (첨가) 또는 결실 (절두)을 갖는다. 변형된 바이러스는 변형된 하나 이상의 내인성 바이러스 유전자 및/또는 변형된 하나 이상의 유전자간 영역을 가질 수 있다. 예시적인 변형된 바이러스는 바이러스의 게놈에 삽입된 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 변형된 바이러스는 이종 유전자의 발현을 위한 유전자 발현 카세트의 형태로 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 변형은 본원에 제공된 것들, 예컨대, 유전적 조작 및 재조합 DNA 방법을 포함하여 당업자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.
본원에서 식별된 폴리펩티드 및 항체 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하여 서열을 정렬한 후 비교되는 폴리펩티드의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) 또는 MUSCLE 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 MUSCLE을 사용하여 생성된다 (Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5): 1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1): 113, 2004, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 원용됨).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 항체 또는 디아바디가 결합하는 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특이적 그룹을 지칭한다. 2 개의 항체 또는 항체 모이어티는 항원에 대해 경쟁적 결합을 나타내는 경우 항원 내에서 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 제한없이 당단백질뿐만 아니라 기타 모든 변형된 단백질의 유형 (예컨대, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 팔미토일화, 글리코실화, 산화, 포르밀화, 아미드화, 폴리글루타밀화, ADP-리보실화, 페길화, 비오틴화 등으로 인한 단백질)을 포함하는 모든 길이의 단백질 단편, 융합 단백질 및 변형된 단백질을 포함하는 모든 종류의 자연 발생 및 합성 단백질을 포함하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식하는" 및 "에 특이적이다"는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대, 표적 및 항체 (예컨대, 디아바디) 사이의 결합을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 특이적 결합은 생물학적 분자 (예컨대, 세포 표면 수용체)를 포함하는 분자의 이종 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정한다. 예를 들어, 표적 (이는 에피토프일 수 있음)을 특이적으로 인식하는 항체는 다른 분자에 대한 결합보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속기간으로 이 표적에 결합하는 항체 (예컨대, 디아바디)이다. 일부 실시양태에서, 관련되지 않은 분자에 대한 항체의 결합 정도는, 예컨대, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 실시양태에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤10-5 M, ≤10-6 M, ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M, ≤10-10 M, ≤10-11 M 또는 ≤10-12 M의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 중에서 보존되는 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있으나, 이를 필요로 하지 않는다. 항체 또는 항원-결합 도메인의 결합 특이성은 당업계에 알려진 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA, RIA, ECL, IRMA, EIA, BIACORETM 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동시 투여"는 병용 요법에서 제1 요법 및 제2 요법이 약 15 분 이하, 예컨대, 약 10 분, 5 분 또는 1 분 중 임의의 것 이하의 시간 분리로 투여됨을 의미한다. 제1 및 제2 요법이 동시에 투여되는 경우, 제1 및 제2 요법은 동일한 조성물 (예컨대, 제1 및 제2 요법 둘 모두를 포함하는 조성물) 또는 별도의 조성물 (예컨대, 제1 요법은 하나의 조성물에 함유되고 제2 요법은 다른 조성물에 함유됨)에 함유될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "순차적 투여"는 병용 요법에서 제1 요법 및 제2 요법이 약 15 분 초과, 예컨대, 약 임의의 20, 30, 40, 50, 60 분 이상 초과의 시간 분리로 투여됨을 의미한다. 제1 요법 또는 제2 요법이 먼저 투여될 수 있다. 제1 및 제2 요법은 동일하거나 상이한 패키지 또는 키트에 함유될 수 있는 별도의 조성물에 함유된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "병행 투여"는 병용 요법에서 제1 요법의 투여 및 제2 요법의 투여가 서로 중첩되는 것을 의미한다.
용어 "약학 조성물"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태이며 제형이 투여될 대상체에 허용가능하지 않은 독성인 추가적인 구성요소를 함유하지 않은 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분이 아닌, 대상체에게 무독성인, 약학 제형의 하나 이상의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 동결보호제, 강장제, 보존제 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성학적 및 제조 테스트의 필수 표준을 충족하고/하거나 미국 식품의약국 또는 기타 주/연방 정부에서 준비한 비활성 성분 가이드에 포함되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인식되는 포유류 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한 약전에 나열되어 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 이러한 치료적 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 치료적 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 지칭하는 데 사용된다.
"제조 물품"은 하나 이상의 시약, 예컨대, 질환 또는 병태 (예컨대, 암)의 치료를 위한 의약, 또는 본원에 기재된 바이오마커를 특이적으로 검출하는 탐침을 포함하는 임의의 제조품 (예컨대, 패키지 또는 용기) 또는 키트이다. 특정 실시양태에서, 제조품 또는 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 판촉, 유통 또는 판매된다.
본원에 기재된 발명의 실시양태는 실시양태로 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 값 또는 매개변수 "약"에 대한 언급은 해당 값 또는 매개변수 그 자체에 대한 변동을 포함 (및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 값 또는 매개변수가 "아닌"에 대한 언급은 일반적으로 값 또는 매개변수 "외에"를 의미하고 설명한다. 예를 들어, 방법이 유형 X의 질환을 치료하는 데 사용되지 않는다는 것은 방법이 X 유형 이외의 질환을 치료하는 데 사용됨을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나(a)", "일(an)" 또는 "그(the)"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "및/또는" 어구, 예컨대, "A 및/또는 B"는 A 및 B 둘 모두; A 또는 B; A (단독); 및 B (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는" 어구, 예컨대, "A, B 및/또는 C"는 다음의 실시양태 각각을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
II. 조성물
본 출원은 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하기 위한 재조합 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 출원은 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 시알리다제를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스를 제공하며, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 2 개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 각각의 뉴클레오티드 서열은 이종 단백질 또는 핵산을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 면역 체크포인트 억제제, 면역 억압 수용체의 억제제, 다중-특이적 면역 세포 인게이저 (예컨대, BiTE), 사이토카인, 공동자극 분자, 종양 항원 제시 단백질, 항-혈관신생 인자, 종양-연관된 항원, 외래 항원 및 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), 대식세포 또는 단핵구 기능의 조절 분자 (LILRB에 대한 항체), 폴레이트 수용체 베타에 대한 항체, 종양 세포 특이적 항원 (CD19, CDH17 등) 또는 종양 스캐폴드 (FAP, 피불린-3 등)에 대한 항체으로 이루어진 군으로부터 선택된 이종 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스이다: 백시니아 바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 모르빌리바이러스 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 폭스바이러스, 홍역 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 (Ad) 및 이들의 유도체. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 바이러스의 면역원성을 감소시키도록 변형된다. 적합한 종양용해성 바이러스 및 이들의 유도체는 아래의 "종양용해성 바이러스" 하위섹션에 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 제공하며, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 이종 단백질, 예컨대, 면역 체크포인트 억제제, 면역 억압 수용체의 억제제, 사이토카인, 공동자극 분자, 종양 항원 제시 단백질, 항-혈관신생 인자, 종양-연관된 항원, 외래 항원 또는 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), 대식세포 또는 단핵구 기능의 조절 분자 (LILRB에 대한 항체), 폴레이트 수용체 베타에 대한 항체, 종양 세포 특이적 항원 (CD19, CDH17 등) 또는 종양 스캐폴드 (FAP, 피불린-3 등)에 대한 항체를 코딩하는 제2 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 제2 뉴클레오티드 서열은 동일한 또는 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스이고, 하나 이상의 돌연변이는 A14, A17, A13, L1, H3, D8, A33, B5, A56, F13, A28 및 A27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 A27L, H3L, D8L 및 L1R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 있다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 제공하며, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 이종 단백질을 코딩하는 제2 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 이종 단백질은 막-결합된 보체 활성화 조정인자, 예컨대, CD55, CD59, CD46, CD35, 인자 H, C4-결합 단백질 또는 기타 식별된 보체 활성화 조정인자이며, 여기서 제2 뉴클레오티드 서열은 동일한 또는 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스이고, 하나 이상의 돌연변이는 A14, A17, A13, L1, H3, D8, A33, B5, A56, F13, A28 및 A27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 A27L, H3L, D8L 및 L1R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 있다.
본 출원은 아래에 기재된 바와 같은 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 시알리다제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 인간 또는 박테리아 시알리다제이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 분비된 시알리다제이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 막 앵커링 모이어티 또는 막관통 도메인을 포함한다. 적합한 시알리다제 및 이의 유도체 또는 변이체는 아래의 "시알리다제" 하위섹션에 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 아래의 "기타 이종 단백질 또는 핵산" 하위섹션에 기재된 바와 같이 면역 반응을 촉진하거나 면역 억압 단백질을 억제하는 하나 이상의 이종 단백질 또는 핵산을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 또는 이의 유도체를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)를 제공하며, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 이종 단백질 (예컨대, 면역 체크포인트 억제제, 면역 억압 수용체의 억제제, 사이토카인, 공동자극 분자, 종양 항원 제시 단백질, 항-혈관신생 인자, 종양-연관된 항원, 외래 항원 또는 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP))을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기서 제2 뉴클레오티드 서열은 동일한 또는 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 외피 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)이고, 이종 단백질은 막-결합된 보체 활성화 조정인자, 예컨대, CD55, CD59, CD46, CD35, 인자 H, C4-결합 단백질 또는 기타 식별된 보체 활성화 조정인자이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 1 또는 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 앵커링 도메인을 포함하는 시알리다제 (예컨대, DAS181)를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 글리코사미노글리칸 (GAG)-결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 생리학적 pH에서 양전하를 띤다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 시알리다제의 카복시 말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제에 작동가능하게 연결된 분비 서열을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 분비 서열은 시알리다제의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인을 포함하는 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열번호 45-52로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제에 작동가능하게 연결된 분비 서열을 추가로 코딩한다.
이종 단백질 또는 핵산 (예컨대, 시알리다제 단백질)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 바이러스 프로모터, 예컨대, 초기, 후기 또는 초기/후기 바이러스 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 하이브리드 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 인간 프로모터 (예컨대, 조직- 또는 종양-특이적 프로모터)의 프로모터 서열을 포함한다. 적합한 프로모터는 아래의 "이종 단백질 또는 핵산의 발현을 위한 프로모터" 하위섹션에 설명되어 있다.
본 출원은 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암의 치료를 위한 조작된 면역 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 종양 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 본원에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 의해 코딩된 외래 항원 (예컨대, 박테리아 시알리다제)을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 포함한다. 적합한 조작된 면역 세포는 아래의 "조작된 면역 세포" 하위섹션에 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 백시니아 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브 균주이다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 바이러스 (예컨대, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 백시니아 바이러스, 여기서 돌연변이는 하나 이상의 단백질, 예컨대, A14, A17, A13, L1, H3, D8, A33, B5, A56, F13 또는 A28에 있음)이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제에 작동가능하게 연결된 분비 서열을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체이다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 억압 T 세포, NK 세포 및 NK-T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 환자의 자가유래 세포 또는 동종이계 세포이다.
일부 실시양태에서, (a) 외래 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스; 및 (b) 상기 외래 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 박테리아 항원이다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 시알리다제이다.
본 출원은 본원에 제공된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나를 포함하는 면역 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 면역 세포는 면역 세포를 재조합 종양용해성 바이러스와 함께 항온처리함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 면역 세포는 (예컨대, 작제물로 세포를 형질도입 또는 형질주입시킴으로써) 세포에 재조합 종양용해성 바이러스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써 제조된다. 재조합 종양용해성 바이러스를 발현하는 적합한 면역 세포 및 이의 제조 방법은 아래의 "종양용해성 바이러스 및 조작된 면역 세포" 하위섹션에 설명되어 있다.
A. 종양용해성 바이러스
본 출원은 이종 단백질을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 재조합 종양용해성 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 시알리다제이다.
백시니아 바이러스, 콕사키 바이러스, 아데노바이러스, 홍역, 뉴캐슬 질환 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 콕사키 A21, 수포성 구내염 바이러스, 파보바이러스 H1, 레오바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스 및 폴리오바이러스, 및 파보바이러스를 비롯한 수많은 종양용해성 바이러스. 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브, GLV-1h68, ACAM2000 및 Onco VEX GFP가 이용가능하다. 이들 종양용해성 바이러스의 게놈은 시알리다제의 촉매 부분 또는 전부를 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 시알리다제의 전부 또는 촉매 활성 부분을 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제가 감염된 세포에 의해 발현되도록 바이러스 발현 카세트의 제어 하에 배치된다.
종양용해성 바이러스 (OV)는 정상 세포에 비해 종양 세포에 우선적으로 축적되고 종양 세포에서 복제하고 이를 살해시키는 능력을 갖는다. 이 능력은 바이러스의 고유한 특징 (예컨대, 폭스 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스 및 볼거리 바이러스)일 수 있거나, 이 특성에 대해 바이러스를 변형시키거나 선택할 수 있다. 바이러스 (예컨대, 수포성 구내염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스)는 유전적으로 약독화되거나 변형되어, 대상체에서 항바이러스 면역 및 기타 방어를 우회하여, 종양 세포 또는 종양 미세환경에서 우선적으로 축적할 수 있고/있거나, 종양 세포에 대한 선호도는 예를 들어, 종양-특이적 세포 표면 분자, 전사 인자 및 조직-특이적 마이크로RNA를 사용하여 바이러스에 대해 선택되거나 바이러스로 조작될 수 있다 (예컨대, Cattaneo el al, Nat. Rev. Microbiol., 6(7):529-540 (2008); Dorer et al, Adv. Drug Deliv. Rev., 61(7- 8):554-571 (2009); Kelly et al. , Mol. Ther., 17(3):409-416 (2009); 및 Naik et al. , Expert Opin. Biol. Ther., 9(9): 1163-1176 (2009) 참고).
종양용해성 바이러스의 전달은 직접 종양내 주사를 통해 달성될 수 있다. 직접 종양내 전달은 바이러스에 대한 정상 세포의 노출을 최소화할 수 있지만, 예컨대, 종양 부위 (예컨대, 뇌 종양)의 접근불가능성 또는 넓은 구역에 걸쳐 퍼진 여러 개의 작은 결절 형태인 종양 또는 전이성 질환으로 인해 종종 제한이 있다. 바이러스는 전신 또는 국소 전달, 예컨대, 정맥내 투여 또는 복강내 투여 및 기타 이러한 경로를 통해 전달될 수 있다. 전신 전달은 원발성 종양 부위뿐만 아니라 파종성 전이에도 바이러스를 전달할 수 있다.
백시니아 바이러스, 콕사키 바이러스, 아데노바이러스, 홍역, 뉴캐슬 질환 바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 콕사키 A21, 수포성 구내염 바이러스, 파보바이러스 H1, 레오바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스 및 폴리오바이러스, 및 파보바이러스를 비롯한 수많은 종양용해성 바이러스. 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브, GLV-1h68, ACAM2000 및 OncoVEX GFP가 이용가능하다. 이들 종양용해성 바이러스의 게놈은 시알리다제의 전부 또는 촉매 부분을 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 시알리다제의 전부 또는 촉매 활성 부분을 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제가 감염된 세포에 의해 발현되도록 바이러스 발현 카세트의 제어 하에 배치된다.
다른 비변형된 종양용해성 바이러스는 GLV-1h68, JX-594, JX-954, ColoAdl, MV-CEA, MV-NIS, ONYX-015, B18R, H101, OncoVEX GM-CSF, 레오리신, NTX-010, CCTG-102, 카바탁, 온코린 및 TNFerade로 지정된 바이러스 중에서 선택된 것들을 포함하여 당업자에게 알려진 임의의 것을 포함한다.
적합한 종양용해성 바이러스는 예를 들어, WO2020097269호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다. 본원에 기재된 종양용해성 바이러스는 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 예컨대, 미국 특허 제7,731,974호, 제7,153,510호, 제6,653,103호 및 미국 특허 공개공보 제2010/0178684호, 제2010/0172877호, 제2010/0113567호, 제2007/0098743호, 제20050260601호, 제20050220818호 및 EP 특허 제1385466호, 제1606411호 및 제1520175호; 단순 헤르페스 바이러스, 예컨대, 미국 특허 제7,897,146호, 제7731,952호, 제7,550,296호, 제7,537,924호, 제6,723,316호, 제6,428,968호 및 미국 특허 공개공보 제2011/0177032호, 제2011/0158948호, 제2010/0092515호, 제2009/0274728호, 제2009/0285860호, 제2009/0215147호, 제2009/0010889호, 제2007/0110720호, 제2006/0039894호 및 제20040009604호 참고; 레트로바이러스, 예컨대, 미국 특허 제6,689,871호, 제6,635,472호, 제6,639,139호, 제5,851,529호, 제5,716,826호, 제5,716,613 및 미국 특허 공개공보 제20110212530호 참고; 및 아데노-연관된 바이러스, 예컨대, 미국 특허 제8,007,780호, 제7,968,340호, 제7,943,374호, 제7,906,111호, 제7,927,585호, 제7,811,814호, 제7,662,627호, 제7,241,447호, 제7,238,526호, 제7,172,893호, 제7,033,826호, 제7,001,765호, 제6,897,045호 및 제6,632,670호 참고를 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)이다. VSV는 다중 종양용해성 바이러스 적용에 사용되었다. 게다가, VSV는 백신화를 통해 HPV 양성 자궁경부암을 치료하는 방법 (REF 18337377, 29998190)으로서 인간 유두종 바이러스 (HPV)의 항원성 단백질을 발현하고 종양에 대한 면역 반응을 증가시키는 전-염증 인자를 발현하도록 조작되었다 (REF 12885903). 추가적인 유전자를 코딩하기 위해 VSV를 조작하는 다양한 방법이 설명되어 있다 (REF 7753828). 간단히 말해서, VSV RNA 게놈은 업스트림 T7 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 상보적인 이중 가닥-DNA로 역전사되고, (예컨대, 비코딩 5' 또는 3' 영역 플랭킹 VSV 당단백질 (G) 내의) 유전자 삽입을 위한 VSV 게놈 내의 적절한 위치가 식별된다 (REF 12885903). 제한 효소 소화는 예컨대, Mlu I 및 Nhe I를 사용하여 수행되어, 선형화된 DNA 분자를 산출할 수 있다. 적절한 제한 부위가 플랭킹된 관심 유전자를 코딩하는 DNA 분자로 이루어진 삽입물은 선형화된 VSV 게놈 DNA에 결찰될 수 있다. 생성된 DNA는 T7 중합효소로 전사되어, 삽입된 관심 유전자를 함유하는 완전한 VSV 게놈 RNA를 산출할 수 있다. 예컨대, 형질주입 및 항온처리를 통한 이 RNA 분자의 포유동물 세포로의 도입은 관심 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 바이러스 자손을 생성한다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스이다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스는 아데노바이러스 혈청형 5 바이러스 (Ad5)이다. Ad5는 인간 E2F-1 프로모터를 함유하며, 이는 필수 Ela 바이러스 유전자의 발현을 구동하여 Rb 경로-결함 종양 세포에 대한 바이러스 복제 및 세포독성을 제한하는 망막모세포종 (Rb) 경로-결함 종양 특이적 전사 조절 요소이다 (REF 16397056). 종양 세포의 특징은 Rb 경로 결함이다. Ad5에 관심 유전자를 조작하는 것은 Ad5 게놈으로의 결찰을 통해 달성된다. 관심 유전자를 함유하는 플라스미드는 예컨대, AsiSI 및 PacI를 통해 생성되고 소화된다. Ad5 DNA 플라스미드, 예컨대, PSF-AD5 (REF 시그마 OGS268)는 AsiSI 및 PacI로 소화되고, 재조합 박테리아 리가제로 결찰되거나, 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 발현 Ad5의 생성에 대해 보고된 바와 같이 RE 소화된 관심 유전자와 함께 허용성 대장균으로 공동-형질전환된다 (REF 16397056). DNA의 회수 및 허용성 숙주, 예컨대, 인간 배아 신장 세포 (HEK293) 또는 HeLa로의 형질주입은 관심 유전자를 코딩하는 바이러스를 산출한다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 변형된 종양용해성 바이러스 (예컨대, 본원에 기재된 바이러스 중 어느 하나의 유도체)이다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 상응하는 야생형 균주와 비교하여 바이러스의 면역원성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
백시니아 바이러스 (VV)
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 백시니아 바이러스 (VV)이다. 다양한 VV 균주가 OV 치료제의 주형으로서 사용되었으며; 통합된 특징은 바이러스성 티미딘 키나제 (TK) 유전자의 결실로, 생산적인 복제를 위해 바이러스가 능동적으로 복제하는 세포, 즉, 신생물 세포에 의존하도록 하므로, 이들 VV는 VV의 웨스턴 리저브 (WR) 균주로 예시되는 암세포의 우선적 감염성을 갖는다 (REF 25876464). 게놈에 삽입된 관심 유전자를 포함하는 VV의 생산은 lox 부위를 활용하는 상동 재조합으로 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 변형된 백시니아 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형된 백시니아 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 단백질, 예컨대, A14, A17, A13, L1, H3, D8, A33, B5, A56, F13, A28 및 A27에 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 A27L, H3L, D8L 및 L1R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 있다. 예시적인 돌연변이는 예를 들어, 국제 특허 공개공보 WO2020086423호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
암 치료 전달 벡터로서 VV의 사용에 있어 제한 인자는 바이러스의 지속 및 확산 능력을 제한하고 벡터 재-투약을 방지하는, VV를 혈류로 주사함으로써 유도되는 강한 중화 항체 (Nab) 반응이다. NAb는 VV 외피에 임베딩된 바이러스 당단백질을 인식하고 결합하여, 숙주 세포 수용체와의 바이러스 상호작용을 방지한다. 숙주 세포 수용체 인식에 관여하는 다수의 VV 당단백질이 식별되었다. 이들 중에서, 단백질 H3L, L1R, A27L, D8L, A33R 및 B5R은 NAb에 의해 표적화되는 것으로 나타났으며, A27L, H3L, D8L 및 L1R은 성숙한 바이러스 입자의 표면 상에 제시된 주요 NAb 항원이다. A27L, H3L 및 D8L은 숙주 글리코사미노글리칸 (GAG) 헤파란 설페이트 (HS)(A27L 및 H3L) 및 콘드로이틴 설페이트 (CS)(D8L)에 결합하고 숙주 세포로 바이러스의 엔도사이토시스를 매개하는 접착 분자이다. L1R 단백질은 바이러스 성숙에 관여한다. 이들 단백질 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 변형된 백시니아 바이러스는 국제 특허 공개공보 WO2020086423호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
일부 실시양태에서, 변형된 백시니아 바이러스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함한다: (a) 서열번호 66-69 중 어느 하나에 대해 90% 이상 (예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%)의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) H3L 단백질; (b) 서열번호 70-72 또는 85 중 어느 하나에 대해 90% 이상 (예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%)의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) D8L; (c) 서열번호 73에 대해 90% 이상 (예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%)의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) A27L 단백질; 및 (d) 서열번호 74에 대해 90% 이상 (예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%)의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) L1R 단백질.
일부 실시양태에서, 변이체 VV H3L 단백질은 다음의 아미노산 잔기 중 하나 이상에서 아미노산 치환 또는 결실을 포함하고: 14, 15, 16, 33, 34, 35, 38, 40, 44, 45, 52, 131, 134, 135, 136, 137, 154, 155, 156, 161, 166, 167, 168, 198, 227, 250, 253, 254, 255 및 256, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 66을 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 변이체 VV H3L은 I14A, D15A, R16A, K38A, P44A, E45A, V52A, E131A, T134A, L136A, R137A, R154A, E155A, I156A, M168A, I198A, E250A, K253A, P254A, N255A 및 F256A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하며, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 66을 기반으로 한다.
일부 실시양태에서, 변이체 VV D8L 단백질은 다음의 아미노산 잔기 중 하나 이상에서 아미노산 치환 또는 결실을 포함하고: 44, 48, 98, 108, 117 및 220, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 70을 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 변이체 VV D8L 작제물은 R44A, K48A, K98A, K108A, K117A 및 R220A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 70을 기반으로 한다.
일부 실시양태에서, 변이체 VV A27L 단백질은 다음의 아미노산 잔기 중 하나 이상에서 아미노산 치환 또는 결실을 포함하고: 27, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 107, 108 및 109, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 73을 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 변이체 A27L 작제물은 K27A, A30D, R32A, E33A, A34D, I35A, V36A, K37A, D39A, E40A, R107A, P108A 및 Y109A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 73을 기반으로 한다.
일부 실시양태에서, 변이체 VV L1R 단백질은 다음의 아미노산 잔기 중 하나 이상에서 아미노산 치환 또는 결실을 포함하고: 25, 27, 31, 32, 33, 35, 58, 60, 62, 125 및 127, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 74를 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 변이체 L1R 작제물은 E25A, N27A, Q31A, T32A, K33A, D35A, S58A, D60A, D62A, K125A 및 K127A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 74를 기반으로 한다.
일부 실시양태에서, 변이체 VV H3L 단백질은 다음의 아미노산 잔기 중 하나 이상에서 아미노산 치환 또는 결실을 포함하고: 14, 15, 16, 33, 34, 35, 38, 40, 44, 45, 52, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 154, 155, 156, 161, 166, 167, 168, 195, 198, 199, 227, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 258, 262, 264, 266, 268, 272, 273, 275 및 277, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 68을 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 변이체 H3L 작제물은 I14A, D15A, R16A, K33A, F34A, D35A, K38A, N40A, P44A, E45A, V52A, E131A, D132A, T134A, F135A, L136A, R137A, R154A, E155A, I156A, K161A, L166A, VI 67 A, M168A, E195A, I198A, V199A, R227A, E250A, N251A, M252A, K253A, P254A, N255A, F256A, S258A, T262P, A264T, K266I, Y268C, M272K, Y273N, F275N 및 T277A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 68을 기반으로 한다.
일부 실시양태에서, 변이체 VV D8L 단백질은 다음의 아미노산 잔기 중 하나 이상에서 아미노산 치환 또는 결실을 포함하고: 43, 44, 48, 53, 54, 55, 98, 108, 109, 144, 168, 177, 196, 199, 203, 207, 212, 218, 220, 222 및 227, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 72를 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 변이체 VV D8L 작제물은 V43A, R44A, K48A, S53A, G54A, G55A, K98A, K108A, K109A, A144G, T168A, S177A, L196A, F199A, L203A, N207A, P212A, N218A, R220A, P222A 및 D227A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 넘버링은 서열번호 72를 기반으로 한다.
B. 이종 단백질 또는 핵산
1. 시알리다제
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 예컨대, 인간 세포 상의 글리칸으로부터 시알산 (N-아세틸뉴라민산 (Neu5Ac))을 제거할 수 있는 시알리다제의 전부 또는 촉매 부분을 포함하는 이종 단백질을 코딩한다. 일반적으로, Neu5Ac는 알파 2,3, 알파 2,6 또는 알파 2,8 연결을 통해 다양한 시알릴 트랜스퍼라제 중 임의의 것에 의해 단백질 상의 글리칸에 있는 끝에서 두 번째의 당에 연결된다. 통상적인 인간 시알릴트랜스퍼라제는 표 1에 요약되어 있다.
표 1. Neu5Ac 시알릴트랜스퍼라제의 명명법
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자연 발생 시알리다제 또는 이의 촉매 부분에 더하여 이종 단백질은 임의로 단백질의 치료적 활성에 기여하는 펩티드 또는 단백질 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 단백질 및 세포 표면 사이의 상호작용을 촉진하는 앵커링 도메인을 포함할 수 있다. 앵커링 도메인 및 시알리다제 도메인은 치료적 시알리다제가 시알산 잔기를 제거하는 세포외 활성을 나타낼 수 있도록 단백질이 표적 세포막에서 또는 그 근처에 결합하도록 하는 임의의 적절한 방식으로 배열될 수 있다. 단백질은 하나 초과의 앵커링 도메인을 가질 수 있다. 폴리펩티드가 하나 초과의 앵커링 도메인을 갖는 경우, 앵커링 도메인은 동일하거나 상이할 수 있다. 단백질은 하나 이상의 막관통 도메인 (예컨대, 하나 이상의 막관통 알파 나선)을 포함할 수 있다. 단백질은 하나 초과의 시알리다제 도메인을 가질 수 있다. 화합물이 하나 초과의 시알리다제 도메인을 갖는 경우, 시알리다제 도메인은 동일하거나 상이할 수 있다. 단백질이 다중 앵커링 도메인을 포함하는 경우, 앵커링 도메인은 탠덤으로 (링커와 함께 또는 링커 없이) 또는 다른 도메인, 예컨대, 시알리다제 도메인의 교대 측면 상에 배열될 수 있다. 화합물이 다중 시알리다제 도메인을 포함하는 경우, 시알리다제 도메인은 탠덤으로 (링커와 함께 또는 링커 없이) 또는 다른 도메인의 교대 측면 상에 배열될 수 있다.
시알리다제 촉매 활성
일부 실시양태에서, 시알리다제는 효소 위원회 EC 3.2.1.18에 의해 정의된 바와 같은 엑소-시알리다제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 효소 위원회 EC 4.2.2.15에 의해 정의된 바와 같은 무수시알리다제이다.
일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스에 의해 발현된 시알리다제는 알파 2,3 연결을 통해 연결된 Neu5Ac에 대해 특이적일 수 있거나, 알파 2,6을 통해 연결된 Neu5Ac에 대해 특이적일 수 있거나, 알파 2,8 연결을 통해 연결된 Neu5Ac에 대해 특이적일 수 있거나, 알파 2,3 연결 또는 알파 2,6 연결을 통해 연결된 Neu5Ac를 절단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 알파 2,3 연결, 알파 2,6 연결, 또는 알파 2,8 연결을 통해 연결된 Neu5Ac를 절단할 수 있다. 다양한 시알리다제가 표 2 내지 5에 설명되어 있다.
시알산 잔기 및 기질 분자의 나머지 부분 사이의 하나 초과의 유형의 연결을 절단할 수 있는 시알리다제, 특히, 알파(2,6)-Gal 및 알파(2,3)-Gal 연결 둘 모두 또는 알파(2,6)-Gal 및 알파(2,3)-Gal 연결 둘 모두 및 알파(2,8)-Gal 연결을 절단할 수 있는 시알리다제가 개시내용의 화합물에 사용될 수 있다. 포함된 시알리다제는 수용체 시알산 Neu5Ac 알파(2,6)-Gal 및 Neu5Ac 알파(2,3)-Gal을 분해할 수 있는 큰 박테리아 시알리다제이다. 예를 들어, 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Genbank 수탁 번호 X87369), 악티노마이세스 비스코수스 (GenBankX62276), 아르트로박터 우레아파시엔스 GenBank (AY934539) 또는 마이크로모노스포라 비리디파시엔스 (Genbank 수탁 번호 D01045)로부터의 박테리아 시알리다제 효소가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 큰 박테리아 시알리다제의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하거나, 큰 박테리아 시알리다제의 아미노산 서열의 전부 또는 일부에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 도메인은 서열번호 2 또는 27, 또는 서열번호 12에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 시알리다제 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 도메인은 서열번호 26의 아미노산 274-666으로부터 연장되는 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제의 촉매 도메인을 포함하며, 서열번호 26의 아미노산 274-666에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
추가적인 시알리다제는 인간 시알리다제, 예컨대, 유전자 NEU2 (서열번호 4; Genbank 수탁 번호 Y16535; Monti, E, Preti, Rossi, E., Ballabio, A 및 Borsani G. (1999) Genomics 57:137-143) 및 NEU4 (서열번호 6; Genbank 수탁 번호 NM080741; Monti et al. (2002) Neurochem Res 27:646-663)에 의해 코딩된 것들을 포함한다. 본 개시내용의 화합물의 시알리다제 도메인은 시알리다제의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있거나, 시알리다제의 아미노산 서열의 전부 또는 일부에 대해 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 도메인이 자연 발생 시알리다제의 아미노산 서열의 일부, 또는 자연 발생 시알리다제의 아미노산 서열의 일부에 대해 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경우, 일부는 온전한 시알리다제와 본질적으로 동일한 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스에 의해 발현되는 시알리다제는 시알리다제 촉매 도메인 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같이 "시알리다제 촉매 도메인 단백질"은 시알리다제의 촉매 도메인을 포함하나, 촉매 도메인이 유래된 시알리다제의 전체 아미노산 서열은 포함하지 않는다. "시알리다제 촉매 도메인 단백질"은 시알리다제 활성을 가지며, 본원에서 사용된 바와 같은 용어는 "시알리다제"와 상호교환가능하다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 촉매 도메인 서열이 유래되는 시알리다제의 활성의 10% 이상, 20% 이상, 50% 이상, 70% 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 촉매 도메인 서열이 유래되는 시알리다제의 활성의 90% 이상을 포함한다.
시알리다제 촉매 도메인 단백질은 다른 아미노산 서열, 예컨대, 비제한적으로 추가적인 시알리다제 서열, 다른 단백질로부터 유래된 서열, 또는 자연 발생 단백질의 서열로부터 유래되지 않은 서열을 포함할 수 있다. 추가적인 아미노산 서열은 촉매 도메인 단백질에 대한 다른 활성의 기여, 시알리다제 촉매 도메인 단백질의 발현, 가공, 접힘 또는 안정성의 향상, 또는 심지어 단백질의 원하는 크기 또는 간격의 제공을 포함하여 다수의 기능 중 임의의 것을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 A. 비스코수스 시알리다제의 촉매 도메인을 포함하는 단백질이다. 일부 실시양태에서, A. 비스코수스 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 A. 비스코수스 시알리다제 서열 (서열번호 26; GenBank WP_003789074)의 아미노산 270-666을 포함한다. 일부 실시양태에서, A. 비스코수스 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 A. 비스코수스 시알리다제 서열 (서열번호 26)의 아미노산 270 내지 아미노산 290의 아미노산 중 임의의 것에서 시작하여 상기 A. 비스코수스 시알리다제 서열 (서열번호 26)의 아미노산 665 내지 아미노산 901의 아미노산 중 임의의 것에서 종료되고, 아미노산 1로부터 아미노산 269까지 연장되는 임의의 A. 비스코수스 시알리다제 단백질 서열이 결여되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, A. 비스코수스 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 A. 비스코수스 시알리다제 서열 (서열번호 26)의 아미노산 274-681을 포함하고, 다른 A. 비스코수스 시알리다제 서열은 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, A. 비스코수스 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 A. 비스코수스 시알리다제 서열 (서열번호 26)의 아미노산 274-666을 포함하고, 임의의 다른 A. 비스코수스 시알리다제 서열이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, A. 비스코수스 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 A. 비스코수스 시알리다제 서열 (서열번호 26)의 아미노산 290-666을 포함하고, 임의의 다른 A. 비스코수스 시알리다제 서열이 결여되어 있다. 또 다른 실시양태에서, A. 비스코수스 시알리다제 촉매 도메인 단백질은 A. 비스코수스 시알리다제 서열 (서열번호 26)의 아미노산 290-681을 포함하고, 임의의 다른 A. 비스코수스 시알리다제 서열이 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스에 의한 발현을 위한 유용한 시알리다제 폴리펩티드는 서열번호 27과 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하거나, 서열번호 27의 375, 376, 377, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 또는 392 개의 연속 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181, 이의 기능적 유도체 (예컨대, 이의 단편), 또는 이의 바이오시밀러이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 2와 약 80% 이상 (예컨대, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나 이상) 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 2의 414, 413, 412, 411 또는 410 개의 연속 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 앵커링 도메인 (AR 도메인)이 없는 DAS181의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 27과 약 80% 이상 (예컨대, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나 이상) 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
DAS181은 헤파린-결합 앵커링 도메인을 갖는 재조합 시알리다제 융합 단백질이다. DAS181 및 DAS181의 제조 및 제형화 방법은 US 7,645,448호; US 9,700,602호 및 US 10,351,828호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 임의의 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181, 이의 기능적 유도체, 또는 이의 바이오시밀러의 분비된 형태이다. 일부 실시양태에서, 분비된 형태의 DAS181을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 DAS181에 작동가능하게 연결된 분비 서열을 코딩하며, 여기서 분비 서열은 진핵 세포로부터 단백질의 분비를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 28과 약 80% 이상 (예컨대, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나 이상) 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 28과 약 80% 이상 (예컨대, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나 이상) 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 28의 414, 413, 412, 411 또는 410 개의 연속 아미노산을 포함한다. 예시적인 분비된 형태의 DAS181이 실시예 11에 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181의 막관통 형태, 이의 기능적 유도체 또는 이의 바이오시밀러이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 31과 약 80% 이상 (예컨대, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나 이상) 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 31과 약 80% 이상 (예컨대, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나 이상) 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 31의 414, 413, 412, 411 또는 410 개의 연속 아미노산을 포함한다. DAS181의 예시적인 막관통 형태는 실시예 11에 설명되어 있다.
표 2: 조작된 시알리다제
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Figure pct00004
표 3: 인간 시알리다제
Figure pct00005
표 4: 인간과 크게 공생하는 유기체의 시알리다제
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표 5: 추가적인 시알리다제
Figure pct00007
앵커링 도메인
일부 실시양태에서, 시알리다제는 앵커링 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포외 앵커링 도메인" 또는 "앵커링 도메인"은 표적 세포의 외부 표면에 있거나 상에 있거나 표적 세포의 외부 표면에 매우 근접한 엔티티와 상호작용하는 임의의 모이어티이다. 앵커링 도메인은 표적 세포의 외부 표면에서 또는 그 근처에서 본 개시내용의 시알리다제를 유지하는 역할을 할 수 있다. 세포외 앵커링 도메인은 1) 암세포의 표면 상에 발현된 분자, 또는 암세포의 표면 상에 발현된 분자의 모이어티, 도메인 또는 에피토프, 2) 암세포의 표면 상에 발현된 분자에 부착된 화학적 엔티티, 또는 3) 암세포를 둘러싸고 있는 세포외 기질의 분자에 결합할 수 있다.
예시적인 앵커링 도메인은 세포막 상에 편재적으로 존재하는 GAG 유형인 헤파린/설페이트에 결합한다. 많은 단백질이 헤파린/헤파란 설페이트에 특이적으로 결합하고, 이들 단백질 중 GAG-결합 서열이 식별되었다 (Meyer, F A, King, M and Gelman, R A. (1975) Biochimica et Biophysica Acta 392: 223-232; Schauer, S. ed., pp 233. Sialic Acids Chemistry, Metabolism and Function. Springer-Verlag, 1982). 예를 들어, 인간 혈소판 인자 4 (PF4)(서열번호 77), 인간 인터루킨 8 (IL8)(서열번호 78), 인간 안티트롬빈 III (AT III)(서열번호 80), 인간 아포단백질 E (ApoE)(서열번호 80), 인간 혈관-연관된 이동성 세포 단백질 (AAMP)(서열번호 81) 또는 인간 암피레귤린 (서열번호 82)의 GAG-결합 서열은 헤파린에 대해 매우 높은 친화도를 갖는 것으로 나타났다.
일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 비-단백질 앵커링 모이어티, 예컨대, 포스파티딜이노시톨 (GPI) 링커이다.
링커
시알리다제 또는 이의 촉매 도메인을 포함하는 단백질은 시알리다제의 다양한 도메인을 접합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드 링커를 임의로 포함할 수 있다. 링커는 단백질 도메인의 최적의 간격 또는 접힘을 제공하는 데 사용될 수 있다. 링커에 의해 접합된 단백질의 도메인은 시알리다제 도메인, 앵커링 도메인, 막관통 도메인, 또는 추가적인 기능, 예컨대, 단백질 안정성의 향상, 정제를 용이하게 함 등을 제공하는 화합물의 임의의 다른 도메인 또는 모이어티일 수 있다. 일부 바람직한 링커는 아미노산 글리신을 포함한다. 예를 들어, (GGGGS (서열번호 55))n의 서열을 갖는 링커, 여기서 n은 1-20이다. 일부 실시양태에서, 링커는 면역글로불린의 힌지 영역이다. 촉매 도메인을 입체 장애가 없도록 유지할 수 있는 임의의 힌지 또는 링커 서열을 사용하여, 시알리다제의 도메인을 다른 도메인 (예컨대, 막관통 도메인 또는 앵커링 도메인)에 연결할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열번호 62의 서열을 포함하는 힌지 도메인이다.
분비 서열
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제에 작동가능하게 연결된 분비 서열 (예컨대, 신호 서열 또는 신호 펩티드)을 추가로 코딩한다. 용어 "분비 서열", "신호 서열" 및 "신호 펩티드"는 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 분비 서열은 단백질의 N-말단에 작동가능하게 연결된 신호 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 분비 서열의 길이는 10 내지 30 개의 아미노산 (예컨대, 15 내지 25 개의 아미노산, 15 내지 22 개의 아미노산, 또는 20 내지 25 개의 아미노산)의 범위이다. 일부 실시양태에서, 분비 서열은 진핵 세포로부터 단백질의 분비를 가능하게 한다. 소포체 막을 가로지르는 전위 동안에, 분비 서열은 일반적으로 절단 제거되고 단백질은 분비 경로로 진입한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 N-말단으로부터 C-말단까지, 분비 서열, 시알리다제, 및 막관통 도메인을 코딩하며, 여기서 시알리다제는 분비 서열 및 막관통 도메인에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, N-말단 분비 서열이 절단되어, N-말단 세포외 도메인을 갖는 단백질이 생성된다. 예시적인 분비 서열은 서열번호 40에 제공된다.
막관통 도메인
일부 실시양태에서, 시알리다제는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 도메인은 포유동물 (바람직하게는 인간) 막관통 (TM) 도메인에 접합될 수 있다. 이러한 배열은 시알리다제가 세포 표면 상에 발현되도록 한다. 적합한 막관통 도메인은 인간 CD28 TM 도메인 (NM_006139; FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (서열번호 46), 인간 CD4 TM 도메인 (M35160; MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF (서열번호 47); 인간 CD8 TM1 도메인 (NM_001768; IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (서열번호 48); 인간 CD8 TM2 도메인 (NM_001768; IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY (서열번호 49); 인간 CD8 TM3 도메인 (NM_001768; IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (서열번호 50); 인간 41BB TM 도메인 (NM_001561; IISFFLALTSTALLFLLFF LTLRFSVV (서열번호 51); 인간 PDGFR TM1 도메인 (VVISAILA LVVLTIISLIILI; 서열번호 52); 및 인간 PDGFR TM2 도메인 NAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR; 서열번호 45)을 포함하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지 분비 서열 (예컨대, 서열번호 40), 시알리다제 (예컨대, 서열번호 1-27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 시알리다제) 및 막관통 도메인 (예컨대, 서열번호 45-52로부터 선택된 막관통 도메인)을 포함하는 단백질을 코딩한다. 그러나, 임의의 적합한 분비 서열, 시알리다제 도메인 서열, 또는 막관통 도메인이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지, 분비 서열 (예컨대, 서열번호 40), 서열번호 27의 시알리다제, 및 막관통 도메인 (예컨대, 서열번호 45-52로부터 선택된 막관통 도메인)을 포함하는 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 31로부터 선택된 서열에 대해 50% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 80% (예컨대, 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 중 어느 하나 이상) 또는 90% 이상 (예컨대, 약 91%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99% 중 어느 하나 이상)의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 31로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
2. 기타 이종 단백질 또는 뉴클레오티드 서열
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 이종 단백질을 코딩한다.
위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나에 따른 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 면역 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, TIGIT, LAG3, TIM-3, VISTA, B7-H4 또는 HLA-G의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 조정인자는 면역 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD47, CXCR4, CSF1R, LAG-3, TIM-3, HHLA2, BTLA, CD160, CD73, CTLA-4, B7-H4, TIGIT, VISTA 또는 2B4의 억제제 또는 길항제 항체 또는 데코이 리간드이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 조정인자는 PD-1의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 분자, 예컨대, 항-PD-1 항체에 대한 항체이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 분자에 결합하는 리간드, 예컨대, 가용성 또는 유리 PD-L1/PD-L2이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역 세포 상의 면역 체크포인트 PD-1에 결합하는 종양 세포 표면 상의 PDL-1을 차단할 수 있는 면역글로불린의 Fc 단편 (예컨대, IgG4 Fc)에 융합된 PD-1의 세포외 도메인이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 HHLA2에 결합하는 리간드이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역글로불린의 Fc 단편, 예컨대, IgG4 Fc에 융합된 TMIGD2의 세포외 도메인이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 2 개 이상의 상이한 억제 면역 체크포인트 분자에 결합하는 (예컨대, 이중특이적) 리간드, 예컨대, CD47 및 CXCR4 둘 모두에 결합하는 리간드이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 SIRPα의 세포외 도메인 및 면역글로불린의 Fc 단편, 예컨대, IgG4 Fc에 융합된 CXCL12 단편을 포함한다. 이들 분자는 암세포 상의 CD47에 결합하여, 대식세포 및 수지상 세포에 대한 "나를 먹지 마세요" 신호를 차단하기 위해 SIRP알파와의 상호작용을 중지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종 단백질은 면역 억압 수용체의 억제제이다. 면역 억압 수용체는 종양 세포에 대한 면역 반응을 억제하거나 감소시키는 면역 이펙터 세포에 의해 발현되는 임의의 수용체일 수 있다. 예시적인 이펙터 세포는 제한없이 T 림프구, B 림프구, 자연 살해 (NK) 세포, 수지상 세포 (DC), 대식세포, 단핵구, 호중구 또는 NKT-세포 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 억압 수용체는 LILRB, TYRO3, AXL, 폴레이트 수용체 베타 또는 MERTK이다. 일부 실시양태에서, 면역 억압 수용체의 억제제는 항-LILRB 항체이다.
일부 실시양태에서, 이종 단백질은 다중-특이적 면역 세포 인게이저이다. 일부 실시양태에서, 다중-특이적 면역 세포 인게이저는 이중특이적 면역 세포 인게이저이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 이중특이적 T 세포 인게이저 (BiTE)이다. 예시적인 이중특이적 면역 세포 인게이저는 예를 들어, 국제 특허 공개공보 WO2018049261호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 면역 세포 인게이저는 종양 항원 (예컨대, EpCAM, FAP, 또는 EGFR 등)을 특이적으로 인식하는 제1 항원-결합 도메인 (예컨대, scFv) 및 이펙터 세포 상의 세포 표면 분자 (예컨대, T 림프구 상의 CD3 또는 4-1BB)를 특이적으로 인식하는 제2 항원-결합 도메인 (예컨대, scFv)을 포함한다. 종양 항원은 종양-연관된 항원 (TAA) 또는 종양-특이적 항원 (TSA)일 수 있다. 일부 실시양태에서, TAA 또는 TSA는 고형 종양의 세포 상에서 발현된다. 종양 항원은 EpCAM, FAP, EphA2, HER2, GD2, EGFR, VEGFR2 및 글리피칸-3 (GPC3), CDH17, 피불린-3, HHLA2, 폴레이트 수용체 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 EpCAM이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 FAP이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 EGFR이다.
위에 기재된 바와 같이, 이펙터 세포는 T 림프구, B 림프구, 자연 살해 (NK) 세포, 수지상 세포 (DC), 대식세포, 단핵구, 호중구 또는 NKT-세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 림프구이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 세포독성 T 림프구이다. 이펙터 세포 상의 세포 표면 분자는 CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD28, CD40, CD64, CD89, CD134, CD137, NKp46 또는 NKG2D 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 분자는 CD3이다.
본 출원의 이펙터 세포 상의 세포 표면 분자는 특이적 세포 유형 또는 제한된 수의 세포 유형의 외부 세포벽 또는 원형질막에서 발견되는 분자이다. 세포 표면 분자의 예는 막 단백질, 예컨대, 수용체, 수송체, 이온 채널, 양성자 펌프 및 G 단백질-커플링된 수용체; 세포외 기질 분자, 예컨대, 접착 분자 (예컨대, 인테그린, 카드헤린, 셀렉틴 또는 NCAMS)를 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 예컨대, 미국 특허 제7,556,928호를 참고하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다. 이펙터 세포 상의 세포 표면 분자는 CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD27, CD28, CD38, CD64, CD89, CD134, CD137, CD154, CD226, CD278. NKp46, NKp44, NKp30, NKG2D 및 불변성 TCR을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
인게이저 분자의 세포 표면 분자-결합 도메인은 면역 이펙터 세포에 활성화를 제공할 수 있다. 당업자는 면역 세포가 상이한 세포 표면 분자를 갖는다는 것을 인식한다. 예를 들어 CD3은 T-세포 상의 세포 표면 분자인 반면, CD16, NKG2D 또는 NKp30은 NK 세포 상의 세포 표면 분자이고, CD3 또는 불변성 TCR은 NKT-세포 상의 세포 표면 분자이다. 따라서, T-세포를 활성화하는 인게이저 분자는 NK 세포를 활성화하는 인게이저 분자와 상이한 세포 표면 분자-결합 도메인을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 면역 세포가 T-세포이고, 활성화 분자는 CD3, 예컨대, CD3γ, CD3δ 또는 CD3ε; 또는 CD27, CD28, CD40, CD134, CD137 및 CD278 중 어느 하나이다. 다른 일부 실시양태에서, 예컨대, 면역 세포가 NK 세포이고, 세포 표면 분자는 CD16, NKG2D 또는 NKp30이거나, 면역 세포가 NKT-세포인 경우, 세포 표면 분자는 CD3 또는 불변성 TCR이다.
CD3는 3 개의 상이한 폴리펩티드 쇄 (ε, δ 및 γ 쇄)를 포함하며, T 세포에 의해 발현되는 항원이다. 3 개의 CD3 폴리펩티드 쇄는 T-세포 수용체 (TCR) 및 ζ-쇄와 회합하여, T 세포에서 시그널링 캐스케이드를 활성화하는 기능을 갖는 TCR 복합체를 형성한다. 현재, 많은 치료적 전략은 항-인간 CD3 단클론 항체를 사용하여 질환을 치료하기 위해 TCR 신호 전달을 표적화한다. CD3 특이적 항체 OKT3는 인간 치료적 용도로 승인된 제1 단클론 항체이며, 동종이계 이식 거부반응의 치료를 위한 면역조정인자로서 임상적으로 사용된다.
일부 실시양태에서, 이종 단백질은 개체의 면역계에 의한 재조합 종양용해성 바이러스의 중화를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 외피 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)이고, 이종 단백질은 보체 활성화 조정인자 (예컨대, CD55 또는 CD59)이다. 보체는 순환계로부터의 중화 및 청소율을 위해 바이러스를 표적화하는 선천성 면역계의 핵심 구성요소이다. 보체 활성화는 C3의 절단 및 활성화 및 표면 상의 옵소닉 C3 단편의 침착을 초래한다. C5의 후속 절단은 지질 이중층을 붕괴하는 막 공격 복합체 (C5b, 6, 7, 8, 9)의 조립으로 이어진다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 외피 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스)이고, 이종 단백질은 보체 활성화 조정인자, 예컨대, CD55, CD59, CD46, CD35, 인자 H, C4-결합 단백질 또는 기타 식별된 보체 활성화 조정인자이다. 이론에 얽매이지 않고, 바이러스 외피 표면 (예컨대, 백시니아 바이러스 외피) 상의 보체 활성화 조정인자의 발현은 야생형 바이러스와 비교하여 보체 활성화를 조정하고 보체-매개된 바이러스 중화를 감소시키는 능력을 갖는 바이러스를 초래한다. 일부 실시양태에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 인간 CD55, CD59, CD46, CD35, 인자 H, C4-결합 단백질 또는 기타 식별된 보체 활성화 조정인자의 도메인을 코딩한다. 다른 실시양태에서, 이종 핵산은 서열번호 58의 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CD55 단백질을 코딩한다. 본원에 제시된 개시내용의 관점에서, 당업자는 본원에 제시된 외피 재조합 종양용해성 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스) 중 어느 하나의 기타 보체 활성화 조정인자 (예컨대, CD59, CD46, CD35, 인자 H, C4-결합 단백질 등)를 용이하게 사용할 것이다.
일부 실시양태에서, 이종 단백질은 사이토카인이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 IL-15, IL-12, IL-2, IL-18, CXCL10 또는 CCL4, 또는 전술한 단백질 중 임의의 것으로부터 유래된 변형된 단백질 (예컨대, 융합 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 감소된 부작용을 갖도록 변형된 IL-2의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 IL18-BP에 대한 결합이 결여된 변형된 IL-18이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 염증성 사이토카인 및 안정화 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 안정화 도메인은 억제성 폴리펩티드를 안정화시키는 임의의 적합한 도메인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화 도메인은 생체내에서 억제성 폴리펩티드의 반감기를 연장시킨다. 일부 실시양태에서, 안정화 도메인은 Fc 도메인이다. 일부 실시양태에서, 안정화 도메인은 알부민 도메인이다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 및 이들의 조합 및 하이브리드의 Fc 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgG의 조합 또는 하이브리드의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태 (예컨대, IL-12 또는 IL-2로부터 유래된 융합 단백질)에서, Fc 도메인은 상응하는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 감소된 이펙터 기능 (예컨대, 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)의 수준으로 측정된 바와 같은 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 감소된 이펙터 기능)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 염증성 사이토카인 및 안정화 도메인은 링커, 예컨대, 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 펩티드 링커는 자연 발생 서열, 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열을 링커로서 사용할 수 있다. 펩티드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 단단한 3-차원 구조를 채택하지 않고 오히려 폴리펩티드에 가요성을 제공하는 경향이 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 가요성 링커이다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체, 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종 단백질은 박테리아 또는 바이러스 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서 이종 단백질은 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR (예컨대, EGFRvIII), GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, CDH17 및 임상적 유의성을 갖는 기타 종양 항원으로부터 선택된 종양-연관된 항원이다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 2 개 이상의 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 이종 단백질 또는 핵산 중 어느 하나를 코딩한다.
길항제 또는 억제제
본원에 사용된 바와 같이, 길항제는 억제제와 상호교환가능하다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 표적 단백질의 억제제 (즉, 길항제)이며, 여기서 표적 단백질은 면역 억압 단백질 (예컨대, 면역 세포 활성화의 체크포인트 억제제 또는 기타 억제제)이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 면역 체크포인트 단백질이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 PD-1, PD-L1, PD-L2, CD47, CXCR4, CSF1R, LAG-3, TIM-3, HHLA2, BTLA, CD160, CD73, CTLA-4, B7-H4, TIGIT, VISTA 또는 2B4이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, B7-H4 또는 HLA-G이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 LILRB, TYRO3, AXL 또는 MERTK로부터 선택된 면역 억압 수용체이다.
길항제는 표적 단백질 (예컨대, 면역 억압 수용체 또는 면역 체크포인트 단백질)의 발현 및/또는 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 길항제는 표적 단백질의 발현 (예컨대, mRNA 또는 단백질 수준)을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 중 어느 하나 이상으로 억제한다. 표적 단백질의 발현 수준은, 예를 들어, 정량적 중합효소 쇄 반응 (qPCR), 마이크로어레이 및 RNA 수준을 결정하기 위한 RNA 시퀀싱; 및 단백질 수준을 결정하기 위한 웨스턴 블롯 및 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)을 포함하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 길항제는 표적 단백질의 활성 (예컨대, 표적 단백질의 리간드 또는 수용체에 대한 결합, 또는 효소 활성)을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 중 어느 하나 이상으로 억제한다. 결합은 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정 및 겔 시프트 검정을 포함하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 판정될 수 있다.
길항제는 제한없이 소분자 억제제, 올리고펩티드, 펩티드모방체, RNAi 분자 (예컨대, 작은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA)), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 단백질 (예컨대, 항체, 억제성 폴리펩티드, 융합 단백질 등), 및 유전자 편집 시스템을 포함하여 임의의 적합한 분자 양식의 길항제일 수 있다.
i. 항체
일부 실시양태에서, 길항제는 표적 단백질 (예컨대, 면역 체크포인트 단백질 또는 면역 억압 단백질)의 리간드 또는 수용체로의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 길항제는 표적 단백질 (예컨대, CTLA-4, PD-1, PD-L1, B7-H4, HLA-G, LILRB, TYRO3, AXL 또는 MERTK, 폴레이트 수용체 베타 등)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 다클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 단클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 전장 항체 또는 면역글로불린 유도체이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 항원-결합 단편이다. 예시적인 항원-결합 단편은 단일-쇄 Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디설파이드 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 단일-도메인 항체 (예컨대, VHH), Fv-Fc 융합, scFv-Fc 융합, scFv-Fv 융합, 디아바디, 트리바디 및 테트라바디를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 길항제는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화 또는 반-합성 항체이다. 항체 및/또는 항체 단편은 뮤린 항체, 토끼 항체, 인간 항체, 완전 인간화 항체, 낙타류 항체 가변 도메인 및 인간화 버전, 상어 항체 가변 도메인 및 인간화 버전, 및 낙타화 항체 가변 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 길항제는 이중-특이적 분자 (예컨대, 이중-특이적 항체 또는 이중-특이적 Fab, 이중-특이적 scFv, 항체-Fc 융합 단백질 Fv 등) 또는 삼중-특이적 분자 (예컨대, Fab, scFv, VH 또는 Fc 융합 단백질 등으로 구성된 삼중-특이적 항체)이다.
일부 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 항체 불변 영역, 예컨대, 인간 항체 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgA, IgG, IgD, IgE 및 IgM으로부터 선택된 아이소타입이다. 일부 실시양태에서, 인간 경쇄 불변 영역은 κ 및 λ로부터 선택된 아이소타입이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 불변 영역, 예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 기능이 바람직한 경우, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 인간 IgG3 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체가 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 기능이 바람직하지 않은 경우, 인간 IgG4 또는 IgG2 중쇄 불변 영역, 또는 FcγR 결합에 부정적인 영향을 미치는 돌연변이, 예컨대, N297A/Q를 갖는 IgG1 중쇄를 포함하는 항체가 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG4 불변 영역에 S241P 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 Fc 도메인을 포함한다. 용어 "Fc 영역", "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 비-항원 결합 영역을 지칭한다. 용어는 천연 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 Fc 영역의 구조 또는 안정성에 영향을 미치지 않고 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, IgG 또는 Fc 영역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된 바와 같이 EU 인덱스라고 또한 불리는 항체에 대한 EU 넘버링 시스템을 따른다. 일부 실시양태에서, 항체는 야생형 IgG 또는 야생형 항체의 Fc 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 저하시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예컨대, 비-인간 포유류를 면역화하고 이로부터 하이브리도마를 수득함으로써, 또는 당업계에 알려진 분자 생물학 기술을 사용하여 항체의 라이브러리를 클로닝하고 하위서열을 선택함으로써 또는 파지 디스플레이를 사용함으로써 수득될 수 있다.
ii. 핵산 제제
일부 실시양태에서, 이종 핵산은 표적 단백질을 하향조절하는 핵산 제제이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 표적 단백질의 발현 (예컨대, mRNA 또는 단백질 발현)을 억제한다. 일부 실시양태에서, 길항제는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 유전자 편집 시스템이다.
일부 실시양태에서, 길항제는 RNAi 분자이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 siRNA이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 shRNA이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 miRNA이다.
당업자는 표적 단백질을 하향조절하기 위해 RNAi 분자 또는 RNAi 분자를 코딩하는 핵산을 용이하게 설계할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "RNAi" 또는 "RNA 간섭"은 RNA 분자가 표적 mRNA 분자에 대한 특이적 결합에 의해 유전자 발현 또는 번역을 억제하는 생물학적 과정을 지칭한다. 예를 들어, Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33: Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; 및 Kreutzer et al., 국제 PCT 공개공보 WO 00/44895호; Zernicka-Goetz et al., 국제 PCT 공개공보 WO 01/36646호; Fire, 국제 PCT 공개공보 WO 99/32619호; Plaetinck et al., 국제 PCT 공개공보 WO00/01846호; Mello and Fire, 국제 PCT 공개공보 WO 01/29058호; Deschamps-Depaillette, 국제 PCT 공개공보 WO 99/07409호; 및 Li et al., 국제 PCT 공개공보 WO 00/44914호; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; 및 Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626; 및 Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831)를 참고한다. 예시적인 RNAi 분자는 siRNA, miRNA 및 shRNA를 포함한다.
siRNA는 자가-상보성 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자일 수 있으며, 여기서 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 이의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 영역은 표적 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, siRNA는 하나 이상의 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 이차 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA는 자연 발생 miRNA의 스캐폴드에서 작제될 수 있다. siRNA 분자는 RNA만을 함유하는 분자에 제한될 필요는 없으며, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
RNAi는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, siRNA는 기능성에 기반하여 RNAi 서열, 예를 들어, 1000 개의 서열을 분류함으로써 설계될 수 있으며, 기능 기는 85% 초과의 녹다운 활성을 갖는 것으로서 분류되고 비-기능 기는 85% 미만의 녹다운 활성을 갖는 것으로 분류된다. 기능 기 및 비-기능 기 둘 모두에 대한 전체 RNAi 표적 서열에 대해 염기 조성의 분포를 계산하였다. 이어서, 기능 기 및 비-기능 기의 염기 분포의 비율을 사용하여, RNAi 서열의 각각의 위치에 대한 스코어 매트릭스를 구축할 수 있다. 주어진 표적 서열에 대해, 각각의 위치에 대한 염기를 스코어링한 다음, 모든 위치의 곱의 로그 비율을 최종 스코어로서 간주하였다. 이 스코어 시스템을 사용하여, 기능적 녹다운 활성 및 로그 비율 스코어의 매우 강한 상관관계를 찾을 수 있다. 표적 서열이 선택되면, Unigene 데이터베이스에 대한 빠른 NCBI blast 및 느린 Smith Waterman 알고리즘 검색 둘 모두를 통해 필터링하여, 유전자-특이적 RNAi 또는 siRNA를 식별할 수 있다. 마지막 12 개의 염기에서 하나 이상의 미스매치를 포함하는 서열이 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 안티센스 RNA, DNA 또는 PNA이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 리보자임이다. "안티센스" 핵산은 표적 단백질 또는 단편을 코딩하는 "센스" 핵산에 상보적인 (예컨대, 이중-가닥 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적인 또는 mRNA 서열에 상보적인) 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 안티센스 핵산은 전체 코딩 가닥, 또는 이의 일부 또는 이의 실질적으로 동일한 서열에 상보적일 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예컨대, 관심 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 -10 및 +10 영역 사이의, mRNA의 번역 시작 부위를 둘러싸는 영역에 상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열의 코딩 가닥의 "비코딩 영역"에 대한 안티센스이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 약 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 개 이상의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 안티센스 핵산은 표준 절차를 사용하여 화학적 합성 또는 효소 결찰 반응을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 (예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 자연 발생 뉴클레오티드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스 및 센스 핵산 사이에 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (예컨대, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있음). 안티센스 핵산은 또한 핵산이 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다.
안티센스 핵산은 일부 실시양태에서 리보자임이다. 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 특이성을 갖는 리보자임은 이러한 뉴클레오티드 서열에 상보적인 하나 이상의 서열, 및 mRNA 절단을 담당하는 알려진 촉매 영역을 갖는 서열을 포함할 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제5,093,246호 또는 Haselhoff and Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988)). 예를 들어, Tetrahymena L-19 IVS RNA의 유도체는 활성 부위의 뉴클레오티드 서열이 mRNA에서 절단될 뉴클레오티드 서열에 상보적인 경우 때때로 활용된다 (예컨대, Cech et al. 미국 특허 제4,987,071호; 및 Cech et al. 미국 특허 제5,116,742호). 표적 mRNA 서열은 RNA 분자의 풀로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA를 선택하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대, Bartel & Szostak, Science 261: 1411-1418 (1993)).
일부 실시양태에서, 길항제는 유전자-편집 시스템, 예컨대, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 또는 TALEN 유전자 편집 시스템, 아연-핑거 유전자 편집 시스템 등이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 예컨대, 조직-특이적 방식으로 표적 단백질을 녹-다운시키는 유전자-편집 시스템이다. 일부 실시양태에서, 길항제는 표적 단백질의 발현을 침묵시키는 유전자-편집 시스템이다.
일부 실시양태에서, 유전자-편집 시스템은 가이드된 뉴클레아제, 예컨대, 표적 단백질을 코딩하는 표적 서열 (예컨대, DNA 서열 또는 RNA 서열)의 유전자 편집을 유도하기 위해 조작된 (예컨대, 프로그램가능한 또는 표적화가능한) 뉴클레아제를 포함한다. CRISPR-연관된 단백질 (Cas) 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 기타 엔도- 또는 엑소-뉴클레아제, 이의 변이체, 이의 단편 및 이의 조합을 비제한적으로 포함하는 임의의 적합한 가이드된 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자-편집 시스템은 전사 억압인자에 융합된 가이드된 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자-편집 시스템은 표적 단백질을 코딩하는 표적 서열에 혼성화하는 조작된 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자-편집 시스템은 Cas 뉴클레아제 (예컨대, Cas9) 및 가이드 RNA (즉, gRNA)를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템이다.
3. 이종 단백질 또는 핵산의 발현을 위한 프로모터
본원에 기재된 이종 단백질 (예컨대, 시알리다제) 또는 핵산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 시알리다제를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 추가적인 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 모든 핵산은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질 또는 핵산을 코딩하는 모든 핵산은 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 바이러스 프로모터는 VV 프로모터, 폭스바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 우두 ATI 프로모터, 또는 T7 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 프로모터는 백시니아 바이러스 프로모터, 합성 프로모터, 감염의 적어도 초기 단계 동안 전사를 지시하는 프로모터, 감염의 적어도 중간 단계 동안 전사를 지시하는 프로모터, 감염의 초기/후기 단계 동안 전사를 지시하는 프로모터, 또는 감염의 적어도 후기 단계 동안 전사를 지시하는 프로모터일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프로모터는 유도성 프로모터이다.
포유동물 세포에서 구성적 발현에 적합한 프로모터는 거대세포바이러스 (CMV) 즉시 초기 프로모터 (US 5,168,062호), RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터 (Adra et al., 1987, Gene 60: 65-74), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)-1의 티미딘 키나제 (TK) 프로모터 및 T7 중합효소 프로모터 (WO98/10088호)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 백시니아 바이러스 프로모터는 종양용해성 폭스바이러스에서의 발현에 특히 적합하다. 대표적인 예는 제한없이 백시니아 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28), TK, p28, pll, pB2R, pA35R 및 K1L 프로모터뿐만 아니라 합성 프로모터, 예컨대, Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; 및 Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8)에 기재된 것들뿐만 아니라 초기/후기 키메라 프로모터를 포함한다. 종양용해성 홍역 바이러스에 적합한 프로모터는 홍역 전사 유닛의 발현을 지시하는 임의의 프로모터를 제한없이 포함한다 (Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31: 271).
유도성 프로모터는 조절된 프로모터의 범주에 속한다. 유도성 프로모터는 하나 이상의 조건, 예컨대, 물리적 조건, 숙주 세포의 미세환경, 또는 숙주 세포의 생리학적 상태, 인듀서 (즉, 유도제), 또는 이들의 조합에 의해 유도될 수 있다.
발현을 위한 적절한 프로모터는 생체외에서 (예컨대, 적합한 배양된 세포주에서) 또는 생체내에서 (예컨대, 적합한 동물 모델에서 또는 대상체에서) 테스트될 수 있다. 코딩된 면역 체크포인트 조정인자(들)가 항체 및 특히 mAb를 포함하는 경우, 상기 면역 체크포인트 조정인자의 중질의 구성요소를 발현시키기 위한 적합한 프로모터의 예는 CMV, SV 및 백시니아 바이러스 pH5R, F17R 및 pllK7.5 프로모터를 포함하고; 상기 면역 체크포인트 조정인자의 경질의 구성요소를 발현시키기 위한 적합한 프로모터의 예는 PGK, 베타-액틴 및 백시니아 바이러스 p7.5K, F17R 및 pA35R 프로모터를 포함한다.
프로모터는 더 강한 또는 더 약한 프로모터로 교체될 수 있으며, 여기서 교체는 바이러스의 약독화의 변화를 초래한다. 본원에 사용된 바와 같이, 프로모터를 더 강한 프로모터로 교체하는 것은 게놈으로부터 프로모터를 제거하고 교체된 프로모터에 비해 전사 개시의 수준을 증가시키는 데 영향을 미치는 프로모터로 교체하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 더 강한 프로모터는 교체되는 프로모터에 비해 중합효소 복합체에 결합하는 개선된 능력을 갖는다. 그 결과, 더 강한 프로모터에 작동가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임은 더 높은 수준의 유전자 발현을 갖는다. 유사하게, 프로모터를 더 약한 프로모터로 교체하는 것은 게놈으로부터 프로모터를 제거하고 교체된 프로모터에 비해 전사 개시의 수준을 저하시키는 프로모터로 교체하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 더 약한 프로모터는 교체되는 프로모터에 비해 중합효소 복합체에 결합하는 약화된 능력을 갖는다. 그 결과, 더 약한 프로모터에 작동가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임은 더 낮은 유전자 발현 수준을 갖는다. 바이러스는 더 강한 프로모터 대 더 약한 프로모터를 사용한 결과로서, 특질, 예컨대, 약독화의 상이함을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 백시니아 바이러스에서, 합성 초기/후기 및 후기 프로모터는 비교적 강한 프로모터인 반면, 백시니아 합성 초기, P7.5k 초기/후기, P7.5k 초기 및 P28 후기 프로모터는 비교적 더 약한 프로모터이다 (예컨대, Chakrabarti et al. (1997) BioTechniques 23 (6) 1094-1097 참고). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프로모터는 약한 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프로모터는 강한 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 종양용해성 바이러스의 바이러스 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 초기 바이러스 프로모터, 후기 바이러스 프로모터, 중간 바이러스 프로모터, 또는 초기/후기 바이러스 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 합성 바이러스 프로모터, 예컨대, 합성 초기, 초기/후기 또는 후기 바이러스 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 백시니아 바이러스 프로모터이다. 본 발명에 사용하기 위한 예시적인 백시니아 바이러스 프로모터는 P7.5k, P11k, PSE, PSEL, PSL, H5R, TK, P28, C11R, G8R, F17R, I3L, I8R, A1L, A2L, A3L, H1L, H3L, H5L, H6R, H8R, D1R, D4R, D5R, D9R, D11L, D12L, D13L, M1L, N2L, P4b 또는 K1 프로모터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 백시니아 초기, 중간 및 후기 단계 프로모터는 예를 들어, 백시니아 P7.5k 초기/후기 프로모터, 백시니아 PEL 초기/후기 프로모터, 백시니아 P13 초기 프로모터, 백시니아 P11k 후기 프로모터 및 본원의 다른 곳에 열거된 백시니아 프로모터를 포함한다. 예시적인 합성 프로모터는 예를 들어, PSE 합성 초기 프로모터, PSEL 합성 초기/후기 프로모터, PSL 합성 후기 프로모터, 본원의 다른 곳에 열거된 백시니아 합성 프로모터를 포함한다 (Patel et al.. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 9431-9435 (1988); Davison and Moss, J Mol Biol 210: 749-769 (1989); Davison et al., Nucleic Acids Res. 18: 4285-4286 (1990); Chakrabarti et al., BioTechniques 23: 1094-1097 (1997)). 상이한 프로모터의 조합을 사용하여, 동일한 바이러스 또는 2 개의 상이한 바이러스에서 상이한 유전자 생성물을 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로모터 (예컨대, 서열번호 61에 도시된 F17R 프로모터)는 감염의 적어도 후기 단계 동안 전사를 지시한다. 일부 실시양태에서, 후기 프로모터는 F17R, I2L 후기 프로모터, L4R 후기 프로모터, P7.5k 초기/후기 프로모터, PEL 초기/후기 프로모터, P11k 후기 프로모터, PSEL 합성 초기/후기 프로모터, 및 PSL 합성 후기 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 후기 백시니아 바이러스 프로모터 F17R은 종양 세포에서 VV 감염 후에만 활성화되며, 따라서 VV로부터의 이종 단백질 또는 핵산의 종양 선택적 발현은 F17R 프로모터의 사용에 의해 추가로 향상될 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이종 단백질 또는 핵산의 후기 발현은 T-세포 활성화 및 매개된 종양 용해 전에 충분한 바이러스 복제를 허용한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 하이브리드 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 하이브리드 프로모터는 합성 초기/후기 바이러스 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 인간 프로모터의 부분적 또는 완전한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 프로모터는 조직 또는 종양-특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 종양-특이적 프로모터는 종양 세포에서 향상된 발현을 구동하거나 종양 세포에서 특이적으로 발현을 구동하는 프로모터 (예컨대, 종양 종양-연관된 항원 (TAA) 또는 종양-특이적 항원 (TSA)의 발현을 구동하는 프로모터)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하이브리드 프로모터는 조직 또는 종양-특이적 프로모터의 부분적 또는 완전한 뉴클레오티드 서열 및 조직- 또는 종양-특이적 프로모터에 비해 하이브리드 프로모터의 강도를 증가시키는 뉴클레오티드 서열 (예컨대, CMV 프로모터 서열)을 포함한다. 조직- 또는 종양-특이적 프로모터를 포함하는 하이브리드 프로모터의 비-제한적인 예는 hTERT 및 CMV 하이브리드 프로모터 또는 AFP 및 CMV 하이브리드 프로모터를 포함한다.
C. 조작된 면역 세포
본 출원의 일부 양태에서, 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 억압 T 세포, NK 세포 및 NK-T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 NKT 세포이다.
본원에 기재된 조작된 면역 세포의 일부 실시양태는 표적 항원을 발현하는 종양 세포에 대해 직접 또는 간접적으로 면역 세포 (예컨대, T 세포 또는 NK 세포)를 활성화할 수 있는 하나 이상의 조작된 키메라 수용체를 포함한다. 예시적인 조작된 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR), 조작된 T 세포 수용체 및 TCR 융합 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 자가유래 세포 (치료될 대상체로부터 수득된 세포)이다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 다양한 용이하게 단리가능한 및/또는 상업적으로 이용가능한 세포/세포주를 포함할 수 있는 동종이계 세포이다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본원에 사용된 바와 같이 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 세포, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포 상에 하나 이상의 표적-결합 특이성을 이식하는데 사용될 수 있는 조작된 수용체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 수용체 및/또는 다른 수용체의 세포외 표적 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 시그널링 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 조작된 면역 세포의 일부 실시양태는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CAR을 직접적으로 또는 간접적으로 발현하는 면역 세포를 활성화시키는 일차 면역 세포 시그널링 분자 또는 일차 면역 세포 시그널링 도메인을 포함하는 항원-결합 모이어티 및 이펙터 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 항원-결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 시그널링 도메인을 포함한다. 또한 CAR을 포함하는 조작된 면역 세포 (예컨대, T 세포 또는 NK 세포)를 제공한다. 항원-결합 모이어티 및 이펙터 단백질 또는 이의 단편은 하나 이상의 폴리펩티드 쇄에 존재할 수 있다. 예시적인 CAR 작제물은 예를 들어, 본원에 참조로 원용되는 US9765342B2호, WO2002/077029호 및 WO2015/142675호에 기재되어 있다. 알려진 CAR 작제물 중 임의의 하나가 본 출원에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 일차 면역 세포 시그널링 분자 또는 일차 면역 세포 시그널링 도메인은 CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은 일차 면역 세포 시그널링 도메인으로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진된다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 공동자극 분자 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동자극 분자 또는 이의 단편은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD28 세포내 시그널링 서열을 포함하는 공동-자극 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD28 세포내 시그널링 서열 및 CD3ζ의 세포내 시그널링 서열을 포함한다.
막관통 도메인은 자연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 자연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 막관통 영역은 CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154로부터 유래될 수 있다 (즉, 이의 막관통 영역(들)을 적어도 포함한다). 일부 실시양태에서, CAR은 클론 FMC63으로부터의 CD19 scFv (Nicholson IC, et al. Mol Immunol. 1997), CH2-CH3 스페이서, CD28-TM, 41BB 및 CD3ζ를 포함하는 CD-19 CAR이다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 이는 주로 소수성 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항은 합성 막관통 도메인의 각각의 단부에서 발견될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 약 2 내지 약 10 개 (예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 중 임의의 것)의 아미노산 길이의 길이를 갖는 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 막관통 도메인 및 세포내 시그널링 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 이중항이다.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인의 서열 중 하나와 자연적으로 회합된 막관통 도메인이 사용된다 (예컨대, 세포내 도메인이 CD28 공동-자극 서열을 포함하는 경우, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인으로부터 유래됨). 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
CAR의 세포내 시그널링 도메인은 CAR이 배치된 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 하나 이상의 활성화를 담당한다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 시그널링 도메인"은 이펙터 기능 신호를 변환하고 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 시그널링 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 시그널링 도메인의 절두된 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절두된 부분은 이펙터 기능 신호를 변환하는 한 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 시그널링 서열"은 이펙터 기능 신호를 변환하기에 충분한 세포내 시그널링 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본 출원의 CAR에 사용하기 위한 세포내 시그널링 도메인의 예는 항원 수용체 인게이지먼트 후 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 TCR 및 공동-수용체의 세포질 서열뿐만 아니라 이들의 서열 및 동일한 기능적 역량을 갖는 임의의 합성 서열의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함한다.
TCR을 통해 생성된 신호만으로는 T 세포의 완전한 활성화에 충분하지 않을 수 있으며 이차 또는 공동-자극 신호가 또한 필요할 수 있음이 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포내 시그널링 서열의 다음의 2 개의 구별되는 부류에 의해 매개된다고 말할 수 있다: TCR을 통해 항원-의존적 일차 활성화를 개시하는 것들 (일차 시그널링 서열) 및 항원-독립적 방식으로 작용하여 이차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 것들 (공동-자극 시그널링 서열).
일차 시그널링 서열은 TCR 복합체의 일차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 시그널링 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 시그널링 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서 CAR 작제물은 하나 이상의 ITAM을 포함한다. 발명에서 특히 사용되는 일차 시그널링 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD3ζ로부터 유래된 일차 시그널링 서열을 포함한다. 예를 들어, CAR의 세포내 시그널링 도메인은 그 자체로 CD3ζ 세포내 시그널링 서열을 포함하거나 본원에 기재된 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포내 시그널링 서열(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 시그널링 서열 및 공동자극 시그널링 서열을 포함할 수 있다. 공동자극 시그널링 서열은 예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함하는 공동자극 분자의 세포내 도메인의 일부일 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR의 세포내 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포내 시그널링 서열 및 CD28의 세포내 시그널링 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포내 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포내 시그널링 서열 및 4-1BB의 세포내 시그널링 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포내 시그널링 도메인은 CD3ζ의 세포내 시그널링 서열 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 시그널링 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 scFv 또는 Fab를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 종양-연관된 또는 종양-특이적 항원, 예컨대, 제한없이 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR (예컨대, EGFRvIII), GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, CDH17 및 임상적 유의성을 갖는 기타 종양 항원을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 (예컨대, 재조합 종양용해성 바이러스에 의해) 종양 세포에 전달되는 외래 항원에 대해 지시된다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 DAS181 또는 이의 유도체 (예컨대, 실시예 11 및 15에 기재된 바와 같이 앵커링 도메인이 없는 DAS181의 시알리다제 도메인의 막관통 형태)이다.
일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스를 사용하여 종양 세포에 전달된 시알리다제 도메인 (예컨대, 비-인간 시알리다제 또는 이의 유도체, 예컨대, DAS181의 시알리다제 도메인)은 종양 세포의 표면으로부터 시알산을 제거하고 종양 세포의 면역 세포-매개된 살해를 향상시키는 외래 항원으로서 기능한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제-무장된 종양용해성 바이러스는 시알리다제 도메인 (예컨대, DAS181)을 특이적으로 표적화하는 조작된 면역 세포와 조합되어, 종양용해성 바이러스에 의해 감염된 종양 세포의 살해를 향상시킨다.
또한 본원은 본원에 기재된 CAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포 (예컨대, 림프구, 예컨대, T 세포, NK 세포)를 제공한다. 또한, 본원에 기재된 CAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 방법은 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 면역 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터를 면역 세포에 도입하는 단계는 면역 세포를 벡터로 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터를 면역 세포에 도입하는 단계는 면역 세포를 벡터로 형질주입하는 단계를 포함한다. 면역 세포로의 벡터의 형질도입 또는 형질주입은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
조작된 T 세포 수용체
일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 T 세포 수용체이다. 조작된 면역 세포가 T 세포인 일부 실시양태에서, T 세포 수용체는 내인성 T 세포 수용체이다. 일부 실시양태에서, TCR을 갖는 조작된 면역 세포는 미리-선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체는 재조합 TCR이다. 일부 실시양태에서, TCR은 종양 항원에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR (예컨대, EGFRvIII), GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, 피불린-3, CDH17 및 임상적 유의성을 갖는 기타 종양 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, NY-ESO-1 암-고환 항원, p53 종양 억압인자 항원, 흑색종 (예컨대, MARTI, gp 100), 백혈병 (예컨대, WT1, 소수 조직적합성 항원) 및 유방암 (예를 들어, HER2, NY-BR1)의 종양 항원에 대한 TCR을 포함하여 (종양-연관된 항원을 포함하여) 종양 항원에 대해 특이적인 많은 TCR이 기재되어 있다. 당업계에 알려진 TCR 중 임의의 것이 본 출원에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은 종양 항원에 대해 향상된 친화도를 갖는다. 면역 세포에 TCR을 도입하기 위한 예시적인 TCR 및 방법은 예를 들어, US5830755호 및 Kessels et al. Immunotherapy through TCR gene transfer. Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 TCR-T 세포이다.
TCR 융합 단백질 (TFP)
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 TCR 융합 단백질 (TFP)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "TCR 융합 단백질" 또는 "TFP"는 TCRα 쇄, TCRβ 쇄, TCRγ 쇄, TCRδ 쇄, CD3ε, CD3δ, 또는 CD3γ를 포함하는 TCR-CD3 복합체의 서브유닛 또는 이의 일부에 융합된 세포외 표적-결합 도메인을 포함하는 조작된 수용체를 지칭한다. TCR-CD3 복합체의 서브유닛 또는 이의 일부는 막관통 도메인 및 자연 발생 TCR-CD3 서브유닛의 세포내 도메인의 적어도 일부를 포함한다. TFP는 TCR-CD3 서브유닛의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다.
표적-결합 모이어티로서 항체 단편을 포함하는 예시적인 TFP 작제물은 예를 들어, 본원에 참조로 원용되는 WO2016187349호 및 WO2018098365호에 기재되어 있다.
종양-연관된 항원에 대해 조작된 면역 세포의 표적화.
조작된 면역 세포는 다음을 제한없이 포함할 수 있는 다양한 종양-연관된 항원 (TAA) 또는 면역 세포 수용체 중 임의의 것을 표적화할 수 있다: EGFRvIII, PD-L1, EpCAM, 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD-19 등. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포를 사용하여, 이들 또는 임의의 수의 알려진 암 항원을 발현하는 암 세포에 본원에 제공된 재조합 종양용해성 바이러스를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 재조합 종양용해성 바이러스를 사용하여 종양 세포에 전달되는 외래 항원 (예컨대, 박테리아 펩티드 또는 박테리아 시알리다제)을 표적화할 수 있다. 조작된 면역 세포는 또한 다양한 면역 세포 항원, 예컨대, 제한없이 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR (예컨대, EGFRvIII), GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, 피불린-3, CDH17 및 임상적 유의성을 갖는 기타 종양 항원을 발현하는 다양한 면역 세포를 표적화할 수 있다.
조작된 면역 세포는 조작된 면역 세포 (예컨대, CART-T, CAR-NK 또는 CAR-NKT 세포)를 전달하기 위해 당업계에 알려진 임의의 방식으로 환자에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 발현 조작된 면역 세포의 표면 상에 발현된 시알리다제 또는 시알리다제 발현 조작된 면역 세포에 의해 분비된 시알리다제는 면역 세포 및/또는 종양 세포 상에 발현된 시알로글리칸으로부터 시알산을 제거할 수 있다. 종양 세포 상의 시알산의 제거는 Siglecs/시알산 축 및 기타 셀렉틴 상호작용을 통해 더 이상 종양 세포의 억제성 신호와 인게이징하지 않는 수지상 세포, 대식세포, T 및 NK 세포를 추가로 활성화할 수 있다. 이러한 상호작용은 암에 대한 면역 활성화를 추가로 향상시키고, 종양 미세환경 (TME)을 변화시킬 수 있다. 종양세포에 관해서, 이들이 탈시알릴화되면 활성화된 NK 세포 및 T 세포 및 기타 면역 세포의 공격에 노출되어, 종양 크기의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제시된 조작된 면역 세포는 시알리다제가 막 결합되도록 면역 세포 표면 막 상에서 시알리다제, 예컨대, 제한없이 막관통 도메인에 융합된 DAS181의 시알리다제 도메인을 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 예컨대, 막관통 도메인에 융합될 수 있다.
임의의 이론 또는 가설에 얽매이지 않고, 막 결합된 시알리다제는 자유롭게 순환하지 않고 CAR-T의 표적 세포, 즉, CAR-T 수용체가 표적화하는 항원을 발현하는 종양 세포와만 접촉하게 될 것이다. 예를 들어, CAR-T가 CD-19 수용체 또는 CD19 발현 CAR-T에 대한 mAb인 경우, 막 결합된 시알리다제는 주로 CD-19를 발현하는 종양 세포와만 접촉하게 될 것이다. 이러한 방식으로, 시알리다제는 비-표적된 세포, 예컨대, 적혈구를 탈시알릴화하지 않을 것이고, 대신 주로 종양 세포로부터의 시알산 만을 제거할 것이다. 본원에 제시된 CAR-T는 또한 분비된 시알리다제, 예컨대, 제한없이 DAS181의 분비된 형태를 발현하도록 조작될 수 있다.
D. 종양용해성 바이러스 및 담체 세포
일부 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나를 포함하는 담체 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 담체 세포는 면역 세포 또는 줄기 세포 (예컨대, 중간엽 줄기 세포)이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 조작된 면역 세포, 예컨대, 위의 하위섹션 C에 기재된 조작된 면역 세포 중 임의의 것이다.
담체 세포 (예컨대, 면역 세포 또는 줄기 세포)의 집단은 종양용해성 바이러스에 감염될 수 있다. 시알리다제 함유 바이러스는 임의의 적절한 생리학적으로 허용가능한 세포 담체로 투여될 수 있다. 감염 다중도는 일반적으로 약 0.001 내지 1000의 범위, 예컨대, 0.001 내지 100의 범위일 것이다. 바이러스-함유 세포는 1 회 이상 투여될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 DNA는 리포솜, 당업계에 잘 알려진 일반적인 형질주입 방법 (예컨대, 칼슘 포스페이트 침전 및 전기천공) 등을 사용하여 이펙터 세포를 형질주입시키는 데 사용될 수 있다. 바이러스의 높은 형질주입 효율로 인해, 높은 수준의 변형된 세포를 획득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 조작된 면역 세포는 면역 세포를 일정 기간 동안 바이러스와 함께 항온처리함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 바이러스로 세포를 감염시키고 하나 이상의 바이러스로 코딩된 이종 단백질(들) (예컨대, 본원에 기재된 시알리다제 및/또는 면역조정 단백질 중 임의의 것)을 발현하기에 충분한 시간 동안 바이러스와 함께 항온처리될 수 있다.
재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 담체 세포 (예컨대, 면역 세포 또는 줄기 세포)의 집단은 수용자에 주사될 수 있다. 본 발명의 세포 투여 적합성의 결정은 특히, 판정가능한 임상적 매개변수, 예컨대, 혈청학적 적응증 및 조직 생검의 조직학적 검사에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 약학 조성물이 투여된다. 투여 경로는 전신 주사, 예컨대, 혈관내, 피하 또는 복강내 주사, 종양내 주사 등을 포함한다.
III. 치료 방법
본 출원은 본원에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스, 약학 조성물 또는 조작된 면역 세포 중 어느 하나의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암 (예컨대, 고형 종양)을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 백시니아 바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 모르빌리바이러스 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 폭스바이러스, 홍역 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 콕사키바이러스 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 탈리모진 라헤르파렙벡이다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 레오바이러스이다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 아데노바이러스 (예컨대, E1ACR2 결실을 갖는 아데노바이러스)이다.
일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 폭스바이러스이다. 일부 실시양태에서, 폭스바이러스는 백시니아 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 백시니아 바이러스는 종, 예컨대, 드라이백스, 리스터, M63, LIVP, 티안 탄, 변형된 백시니아 앙카라, 뉴욕시 보건위원회 (NYCBOH), 다이렌, 이케다, LC16M8, 타슈켄트, IHD-J, 브라이튼, 다이렌 I, 콘노트, 엘스트리, 와이어스, 코펜하겐, 웨스턴 리저브, 엘스트리, CL, 레덜레-코리오알란토익 또는 AS의 백시니아 바이러스 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브이다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 담체 세포 (예컨대, 면역 세포 또는 줄기 세포, 예컨대, 중간엽 줄기 세포)를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 네이키드 바이러스로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 종양내 주사를 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 재조합 종양용해성 바이러스는 상응하는 야생형 균주와 비교하여 바이러스의 면역원성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 백시니아 바이러스 (예컨대, 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브)이고, 하나 이상의 돌연변이는 A27L, H3L, D8L 및 L1R 또는 다른 면역원성 단백질 (예컨대, A14, A17, A13, L1, H3, D8, A33, B5, A56, F13, A28 및 A27)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 A27L, H3L, D8L 및 L1R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함한다: (a) 서열번호 66-69 중 어느 하나에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) H3L 단백질; (b) 서열번호 70-72 또는 85 중 어느 하나에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) D8L 단백질; (c) 서열번호 73에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) A27L 단백질; 및 (d) 서열번호 74에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 백시니아 바이러스 (VV) L1R 단백질.
일부 실시양태에서, 방법은 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 시알리다제는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 Neu5Ac 알파(2,6)-Gal 시알리다제 또는 Neu5Ac 알파(2,3)-Gal 시알리다제이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 박테리아 시알리다제 (예컨대, 클로스트리디움 퍼프린젠스 시알리다제, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 및 아르트로박터 우레아파시엔스 시알리다제, 살모넬라 티피무리움 시알리다제 또는 비브리오 콜레라 시알리다제) 또는 이의 유도체이다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 큰 박테리아 시알리다제의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하거나, 큰 박테리아 시알리다제의 아미노산 서열의 전부 또는 일부에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 도메인은 서열번호 2 또는 27, 또는 서열번호 12에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 시알리다제 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 도메인은 서열번호 26의 아미노산 274-666에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성를 갖는, 서열번호 26의 아미노산 274-666으로부터 연장되는 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제의 촉매 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 인간 시알리다제 (예컨대, NEU1, NEU2, NEU3 또는 NEU4), 또는 이의 유도체이다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 자연 발생 시알리다제이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 시알리다제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 앵커링 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 앵커링 도메인에 융합된 시알리다제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 생리학적 pH에서 양전하를 띤다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 글리코사미노글리칸 (GAG)-결합 도메인이다.
일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 1-33 또는 53-54로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 약 80% 이상 (예컨대, 약 85%, 90% 또는 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 약 80% 이상 (예컨대, 약 85%, 90% 또는 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181이다.
일부 실시양태에서, 분비 펩티드 (예컨대, 시알리다제에 작동가능하게 연결된 신호 서열 또는 신호 펩티드)를 포함하는 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열. 일부 실시양태에서, 분비 서열은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인 또는 막관통 도메인은 시알리다제의 카복시 말단에 위치한다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 담체 세포 (예컨대, 면역 세포 또는 줄기 세포, 예컨대, 중간엽 줄기 세포)의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 재조합 종양용해성 바이러스는 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 박테리아 시알리다제 (예컨대, 클로스트리디움 퍼프린젠스 시알리다제, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 및 아르트로박터 우레아파시엔스 시알리다제, 살모넬라 티피무리움 시알리다제 또는 비브리오 콜레라 시알리다제) 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제에 작동가능하게 연결된 분비 서열 (예컨대, 분비 서열 또는 분비 펩티드)을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 분자는 막관통 도메인에 연결된 시알리다제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 담체 세포는 조작된 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 키메라 수용체, 예컨대, CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 종양 연관된 항원 및 항종양 면역 반응 및 종양 살해 기능을 자극할 수 있는 코딩된 다른 분자를 특이적으로 인식한다.
일부 실시양태에서, (a) 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량, 또는 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 담체 세포의 유효량; 및 (b) 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 박테리아 시알리다제 (예컨대, 클로스트리디움 퍼프린젠스 시알리다제, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 및 아르트로박터 우레아파시엔스 시알리다제, 살모넬라 티피무리움 시알리다제 또는 비브리오 콜레라 시알리다제)이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 앵커링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 GAG-결합 단백질 도메인, 예컨대, 인간 암피레귤린의 상피 앵커링 도메인이다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 생리학적 pH에서 양전하를 띤다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 GPI 링커이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 종양-연관된 항원 또는 종양-특이적 항원을 인식한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 CAR이다.
일부 실시양태에서, (a) 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량, 또는 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 담체 세포의 유효량; 및 (b) 시알리다제를 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 박테리아 시알리다제 (예컨대, 클로스트리디움 퍼프린젠스 시알리다제, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 및 아르트로박터 우레아파시엔스 시알리다제, 살모넬라 티피무리움 시알리다제 또는 비브리오 콜레라 시알리다제)이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 앵커링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 GAG-결합 단백질 도메인, 예컨대, 인간 암피레귤린의 상피 앵커링 도메인이다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 생리학적 pH에서 양전하를 띤다. 일부 실시양태에서, 앵커링 도메인은 GPI 링커이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 시알리다제 (예컨대, DAS181)를 특이적으로 인식하고, 인간 천연 암피레귤린 또는 임의의 다른 인간 항원과 교차-반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 CAR이다.
일부 실시양태에서, 외래 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 암세포에 외래 항원을 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 박테리아 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 시알리다제이다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 박테리아 시알리다제 (예컨대, 클로스트리디움 퍼프린젠스 시알리다제, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 및 아르트로박터 우레아파시엔스 시알리다제, 살모넬라 티피무리움 시알리다제 또는 비브리오 콜레라 시알리다제)이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181의 시알리다제 촉매 도메인이다. 일부 실시양태에서, 방법은 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 외래 항원 또는 임의의 관련 종양 연관된 항원 또는 치료될 종양의 종양 특이적 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현한다.
일부 실시양태에서, (a) 외래 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량; 및 (b) 상기 외래 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, (a) 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량; 및 (b) 면역요법의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 위에 기재된 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 종양을 면역요법에 감작시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 박테리아 시알리다제 (예컨대, 클로스트리디움 퍼프린젠스 시알리다제, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 및 아르트로박터 우레아파시엔스 시알리다제, 살모넬라 티피무리움 시알리다제 또는 비브리오 콜레라 시알리다제) 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181이다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 시알리다제에 작동가능하게 연결된 분비 서열 (예컨대, 분비 신호 펩티드)을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에 면역요법의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 다중-특이적 면역 세포 인게이저 (예컨대, 이중특이적 분자), 세포 요법, 암 백신 (예컨대, 수지상 세포 (DC) 암 백신), 사이토카인 (예컨대, IL-15, IL-12, 알파 수용체에 대한 결합이 없거나 감소된 결합을 갖는 변형된 IL-2, IL-18 BP에 대한 결합이 없거나 감소된 결합을 갖는 변형된 IL-18 BP, CXCL10 또는 CCL4), 면역 체크포인트 억제제 (예컨대, CTLA-4, PD-1, PD-L1, B7-H4 또는 HLA), 마스터 스위치 항-LILRB, 및 이중특이적 항-LILRB-4-1BB, 항-FAP-CD3, PI3K감마 억제제, TLR9 리간드, HDAC 억제제, LILRB2 억제제, MARCO 억제제 등이다.
일부 실시양태에서, 면역요법은 세포 요법이다. 세포 요법은 개체에 살아있는 세포 (예컨대, 면역 세포)의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 비-제한적인 예에서, 면역 세포는 T-세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 수지상 세포 (DC), 사이토카인-유도된 살해 (CIK) 세포, 사이토카인-유도된 자연 살해 (CINK) 세포, 림포카인-활성화된 살해 (LAK) 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 대식세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 본원에 기재된 면역 세포 유형 중 어느 하나의 발달 중간체 (예컨대, 전구체)를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 요법제는 엑스 비보 배양에서 증식된 및 획득된 살해 활성을 갖는 무분별한 이종 세포 집단, 예컨대, 확장된 PBMC를 포함할 수 있다. 적합한 세포 요법은 예를 들어, Hayes, C. ''Cellular immunotherapies for cancer." Ir J Med Sci (2020)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 다양한 사이토카인 및 항체 조합으로 자극되어, 이펙터 T 세포 (CD3, CD38 및 IL-2), 또는 일부 경우에서, T 세포 및 NK 세포 (CD3, CD28, IL-15 및 IL-21)를 활성화시키는 PBMC 세포를 포함한다. 실시예 3, 5 및 6은 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스 및 세포 요법의 조합을 사용하여 향상된 종양 세포 살해를 입증하는 결과를 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포 요법은 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 면역 세포는 예컨대, 생체내 또는 엑스 비보 항원에 대한 노출에 의해 종양 항원에 반응하도록 프라이밍된다.
일부 실시양태에서, 세포 요법은 키메라 수용체, 예컨대, 위의 "조작된 면역 세포" 섹션에 기재된 키메라 수용체 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 CAR-T, CAR-NK 또는 CAR-NKT 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 종양 세포에 의해 발현된 항원, 예컨대, 내인성 종양-연관된 또는 종양-특이적 항원을 인식한다. 비-제한적인 예에서, 키메라 수용체는 종양 항원, 예컨대, 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR (예컨대, EGFRvIII), GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, 피불린-3, CDH17 및 임상적 유의성을 갖는 기타 종양 항원을 인식할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 본원에 제공된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나를 통해 종양 세포에 전달된 이종 단백질과 같은 종양 세포에 의해 발현된 외래 항원을 인식한다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스에 의해 전달된 외래 항원은 박테리아 펩티드 또는 박테리아 시알리다제, 예컨대, DAS181 (서열번호 2)이다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 막관통 도메인을 포함하는 시알리다제이다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 AR 태그가 없고 C-말단 막관통 도메인에 융합된 DAS181 (예컨대, 서열번호 31)이다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량 및 면역요법의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법을 필요로 하는 개체에서 면역요법의 효험을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 다중-특이적 면역 세포 인게이저 (예컨대, BiTE), 세포 요법, 암 백신 (예컨대, 수지상 세포 (DC) 암 백신), 사이토카인 (예컨대, IL-15, IL-12, 변형된 IL-2, 변형된 IL-18, CXCL10 또는 CCL4) 및 면역 체크포인트 억제제 (예컨대, CTLA-4, PD-1, PD-L1, B7-H4, TIGIT, LAG3, TIM3 또는 HLA-G의 억제제)이다. 일부 실시양태에서, 면역요법은 세포 요법, 예컨대, T-세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 수지상 세포 (DC), 사이토카인-유도된 살해 (CIK) 세포, 사이토카인-유도된 자연 살해 (CINK) 세포, 림포카인-활성화된 살해 (LAK) 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 대식세포 또는 이들의 조합을 포함하는 세포 요법이다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 면역요법 전, 후에 또는 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스를 투여하는 것은 면역요법 단독과 비교하여 종양 세포 살해를 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 또는 100% 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 면역 세포는 이종 단백질을 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스를 발현한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 암과 연관된 표적 분자를 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 바이러스에 의해 코딩되는 시알리다제를 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현한다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 면역 세포는 이종 단백질을 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스를 발현하고, 여기서 이종 단백질은 시알리다제이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 암과 연관된 표적 분자를 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 바이러스에 의해 코딩되는 시알리다제를 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현한다.
본 출원의 일 양태는 위에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스, 약학 조성물 또는 조작된 면역 세포 중 어느 하나의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 세포의 시알화를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 종양 세포 상의 표면 시알산을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 종양 세포 상의 표면 시알산을 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 종양 세포의 세포 표면으로부터 α2,3 및 α2,6 시알산 둘 모두를 절단한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 α2,3 및 α2,6 시알산 둘 모두의 절단을 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 촉진하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체의 종양 미세환경에서 국소 면역 반응을 촉진한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제 (예컨대, DAS181)를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 수지상 세포 (DC) 성숙을 촉진하는 방법을 제공한다. DC 성숙은 수지상 세포 마커, 예컨대, CD80 및 DC MHC I 및 MHC-II 단백질의 발현을 기반으로 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 DC 성숙을 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 이상 증가시킨다. 실시예 9는 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 투여 후 증가된 DC 성숙을 입증하는 결과를 제공한다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양 세포의 면역 세포 살해를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 NK 세포에 의한 살해를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스는 NK 세포에 의한 살해를 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스는 시알리다제가 결여된 재조합 종양용해성 바이러스와 비교하여 NK 세포에 의한 살해를 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가시킨다. 실시예 3은 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 투여를 이용한 종양 세포의 향상된 NK 세포-매개된 살해를 입증한다. 일부 실시양태에서, 방법은 T 세포에 의한 살해를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스는 T 세포에 의한 살해를 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스는 시알리다제가 결여된 재조합 종양용해성 바이러스와 비교하여 T 세포에 의한 살해를 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가시킨다. 실시예 10은 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 투여를 이용한 종양 세포의 향상된 NK 세포-매개된 살해를 입증한다. 일부 실시양태에서, 방법은 PBMC에 의한 살해를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스는 PBMC에 의한 살해를 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스는 시알리다제가 결여된 재조합 종양용해성 바이러스와 비교하여 PBMC에 의한 살해를 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가시킨다. 실시예 6은 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 투여를 이용한 종양 세포의 향상된 PBMC-매개된 살해를 입증한다.
일부 실시양태에서, 시알리다제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양용해성 바이러스의 종양용해성 살해를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 종양용해성 바이러스에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스에 의한 종양용해성 살해는 시알리다제가 결여된 재조합 종양용해성 바이러스와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가된다. 실시예 5는 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스에 의한 향상된 종양용해성 살해를 입증하는 결과를 제공한다.
일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 사이토카인 생산 및 종양용해 활성을 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 T-림프구에 의한 사이토카인 생산을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체의 종양 미세환경에서 국소적으로 T-림프구 매개된 사이토카인 생산을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 IL2 및 IFN-감마를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스를 투여하는 것은 시알리다제가 결여된 종양용해성 바이러스를 투여하는 것과 비교하여 사이토카인 생산을 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스를 투여하는 것은 시알리다제가 결여된 종양용해성 바이러스를 투여하는 것과 비교하여 IL2 생산을 2.5-배 이상, 3-배 이상, 또는 4-배 이상 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스를 투여하는 것은 시알리다제가 결여된 종양용해성 바이러스를 투여하는 것과 비교하여 IFN-감마 생산을 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가시킨다. 실시예 10은 시알리다제를 코딩하는 재조합 종양용해성 바이러스의 투여 후 T-림프구에 의한 향상된 사이토카인 생산 및 살해를 입증한다.
본원에 사용된 바와 같이, 암은 전이성 암, 고형 종양, 림프 종양 및 혈액암을 포함하는 임의의 유형의 악성 종양 또는 혈액학적 악성종양에 의해 유발되거나 이를 특징으로 하는 질환에 대한 용어이다.
암은 백혈병, 림프종 (호지킨 및 비-호지킨), 육종, 흑색종, 선종, 유방암 및 췌장암을 포함하는 고형 조직의 암종, 저산소 종양, 입, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 비뇨생식기암, 예컨대, 자궁경부암 및 방광암, 조혈암, 두경부암, 및 신경계암, 예컨대, 신경교종, 성상세포종, 수막종 등, 및 양성 병변, 예컨대, 유두종 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시알리다제의 전달은 종양 세포 상에 존재하는 시알산을 감소시키고 종양 세포를 면역 세포, 면역 세포-기반 요법 및 암 세포의 과시알릴화에 의해 유효성이 줄어드는 기타 치료제에 의한 살해에 보다 취약하게 만들 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 면역요법제의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 비-제한적인 예에서, 면역요법제는 다중-특이적 면역 세포 인게이저, 세포 요법, 암 백신, 사이토카인, PI3K감마 억제제, TLR9 리간드, HDAC 억제제, LILRB2 억제제, MARCO 억제제, 또는 면역 체크포인트 억제제일 수 있다. 적합한 면역 세포 인게이저 및 면역 체크포인트 억제제는 위의 "기타 이종 단백질 또는 핵산" 하위섹션에 설명되어 있다.
일부 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 암은 선암종, 전이성 암 및/또는 불응성 암이다. 전술한 방법 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 암은 유방, 결장 또는 결장직장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 자궁경부, 자궁내막, 두경부, 간, 신장, 피부, 위, 고환, 갑상선 또는 요로상피 암이다. 전술한 방법 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 암은 상피암, 예컨대, 자궁내막암, 난소암, 자궁경부암, 외음부암, 자궁암, 나팔관암, 유방암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 비뇨기암, 방광암, 두경부암, 구강암 또는 간암이다. 일부 실시양태에서, 암은 인간 폐포 기저 상피 선암종, 인간 유선 상피 선암종 및 교모세포종으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 재조합 종양용해성 바이러스, 약학 조성물 또는 위에 기재된 조작된 면역 세포 중 어느 하나의 유효량, 및 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 재조합 종양용해성 바이러스에 의해 발현되는 이종 단백질을 표적화한다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 시알리다제 (예컨대, DAS181 또는 이의 유도체, 예컨대, DAS181의 막-결합된 형태)이고, 키메라 수용체는 시알리다제를 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에서, 시알리다제는 DAS181 또는 이의 유도체이며, 여기서 키메라 수용체는 인간 천연 암피레귤린 또는 임의의 다른 인간 항원과 교차-반응하지 않는 항-DAS181 항체를 포함한다.
일 양태에서, 본 출원은 (a) 외래 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량; 및 (b) 상기 외래 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 종양의 치료를 필요로 하는 개체에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 외래 항원은 비-인간 단백질 (예컨대, 박테리아 단백질)이다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포 및 재조합 종양용해성 바이러스는 개별적으로 (예컨대, 단일요법으로서) 또는 조합 요법으로서 동시에 (예컨대, 동일한 또는 별도의 제형으로) 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 조작된 면역 세포의 투여 전에 투여된다. 비-제한적인 예에서, 재조합 종양용해성 바이러스는 키메라 수용체를 포함하는 조작된 면역 세포보다 1 시간 이상, 2 시간 이상, 4 시간 이상, 6 시간 이상, 8 시간 이상, 10 시간 이상, 12 시간 이상, 24 시간 이상, 또는 48 시간 이상 전에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스를 발현하는 조작된 면역 세포의 집단은 재조합 종양용해성 바이러스에 의해 발현되는 이종 단백질을 표적화하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 집단보다 먼저 투여된다. 비-제한적인 예에서, 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 조작된 면역 세포는 재조합 종양용해성 바이러스에 의해 발현되는 이종 단백질을 표적화하는 키메라 수용체를 포함하는 조작된 면역 세포보다 1 시간 이상, 2 시간 이상, 4 시간 이상, 6 시간 이상, 8 시간 이상, 10 시간 이상, 12 시간 이상, 24 시간 이상 또는 48 시간 이상 전에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, (예컨대, 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 약학 조성물 또는 담체 세포 중의) 재조합 종양용해성 바이러스의 투여 및 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 투여 사이의 기간은 바이러스가 종양 세포의 이종 단백질 또는 핵산을 발현하도록 허용하기에 충분하다.
재조합 종양용해성 바이러스, 및 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포 및/또는 추가적인 면역요법제(들)는 임의의 적합한 투여 경로 및 적합한 투여량을 사용하여 투여될 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법에 대한 유효 용량의 결정을 위한 신뢰할 수 있는 가이던스를 제공한다. 유효 용량의 종간 스케일링은 Mordenti, J. and Chappell, W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46가 제시한 원칙에 따라 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스, 조작된 면역 세포 및/또는 추가적인 면역요법제(들)는 순차적으로 투여된다 (예컨대, 재조합 종양용해성 바이러스는 조작된 면역 세포 이전에 및/또는 위에 기재된 바와 같은 기타 치료제, 예컨대, FAP/CD3의 이중-특이적 항체, LILRB-4-1BB의 이중-특이적 또는 삼중특이적 항체, PD-1 항체 등 이전에 투여될 수 있음). 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스, 조작된 면역 세포 및/또는 추가적인 면역요법제(들)는 동시에 또는 병행하여 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스, 조작된 면역 세포 및/또는 추가적인 면역요법제(들)는 단일 제형으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스, 조작된 면역 세포 및/또는 추가적인 면역요법제(들)는 별도의 제형으로서 투여된다.
본 발명의 방법은 암 치료의 통상적인 화학요법, 방사선 및/또는 외과적 방법과 조합될 수 있다.
IV. 약학 조성물, 키트 및 제조 물품
본 출원은 재조합 종양용해성 바이러스, 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 담체 세포, 및/또는 본원에 기재된 조작된 면역 세포(들) 중 어느 하나, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 시알리다제를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열 및/또는 본원에 기재된 다른 이종 단백질 또는 핵산 중 어느 하나를 포함하는 종양용해성 바이러스 (예컨대, VV)를 포함하는 약학 조성물, 및 키메라 수용체 또는 면역 세포 기능, 예컨대, 항 LILRB, 항-폴레이트 수용체 베타, 이중-특이적 항체, 예컨대, 항-LILRB/4-1BB 등을 조정 및 향상시킬 수 있는 본원에 기재된 이종 단백질 또는 핵산 중 임의의 것을 발현하는 조작된 면역 세포 (예컨대, CAR-T, CAR-NK 또는 CAR-NKT 세포)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 시알리다제를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열 및/또는 본원에 기재된 다른 이종 단백질 또는 핵산 중 어느 하나를 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스 (예컨대, VV), 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제1 약학 조성물; 및 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포 (예컨대, CAR-T, CAR-NK 또는 CAR-NKT 세포), 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제2 약학 조성물을 제공한다.
약학 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 본원에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 및/또는 조작된 면역 세포를 임의로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조된 제형 또는 수용액 형태와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충액, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 소듐 메타바이설파이트를 포함한 항산화제; 보존제, 등장화제(isotonicifier) (예컨대, 소듐 클로라이드), 안정화제, 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물); 킬레이팅제, 예컨대, EDTA 및/또는 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
제형은 담체를 포함할 수 있다. 담체는 순환계에서 가용성이고 생리학적 수용이 당업자가 치료적 양생법의 일부로서 환자에게 상기 담체의 주사를 수용할 것임을 의미하는 경우에 생리학적으로 허용가능한 거대분자이다. 담체는 바람직하게는 청소율에 대해 허용가능한 혈장 반감기로 순환계에서 비교적 안정하다. 이러한 거대분자는 대두 레시틴, 올레산 및 소르비탄 트리올레에이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
제형은 또한 pH 유지, 용액 안정화 또는 삼투압 조절에 유용한 다른 제제를 포함할 수 있다. 제제의 예는 염, 예컨대, 소듐 클로라이드 또는 포타슘 클로라이드, 및 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 갈락토오스 또는 만노스 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 일회용 바이알, 예컨대, 일회용 밀봉된 바이알에 함유된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 다용도 바이알에 함유된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 용기에 벌크로 함유된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 동결보존된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 시스템은 동결보존 조건, 예컨대, 예를 들어, -80℃ 하에서 안정적으로 무기한으로 저장될 수 있고, 투여 전에 필요에 따라 또는 원하는 대로 해동될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 시스템은 투여를 위해 해동하기 전에 보존 온도, 예컨대, -20℃ 또는 -80℃에서 적어도 또는 약 몇 년 사이, 예컨대, 제한없이 1, 2, 3 년 이상을 포함하여 적어도 또는 약 몇 시간 사이, 1, 2, 3, 4 또는 5 시간 동안, 예를 들어, 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4 또는 5 시간 내지 적어도 또는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 또는 72 시간 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30 일 또는 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5 또는 12 개월 또는 1, 2, 3, 4 또는 5 년 이상 동안 저장될 수 있다. 본원에 제공된 시스템은 또한 냉장 조건 하에서, 예컨대, 4℃에서 안정적으로 저장될 수 있고/있거나 얼음 위에서 치료를 위해 투여 부위로 수송될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 시스템은 치료를 위해 투여하기 전에 4℃에서 또는 얼음 위에서 적어도 또는 약 몇 시간 사이, 예컨대, 제한없이 1, 2, 3, 4 또는 5 시간, 내지 적어도 또는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 또는 48 시간 이상 동안 보관될 수 있다.
본 출원은 본원에 기재된 치료 방법의 임의의 실시양태에 사용하기 위한 키트 및 제조 물품을 추가로 제공한다. 키트 및 제조 물품은 본원에 기재된 제형 및 약학 조성물 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나를 발현시키기 위한 하나 이상의 핵산 작제물, 및 재조합 종양용해성 바이러스를 생산하기 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 암을 치료하기 위한 지침서를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 종양용해성 바이러스 중 어느 하나, 및 암을 치료하기 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 면역요법제 (예컨대, 세포 요법 또는 본원에 기재된 면역요법 중 어느 하나)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 암을 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 길항제, 재조합 종양용해성 바이러스 및/또는 하나 이상의 면역요법제는 단일 조성물 (예컨대, 세포 요법 및 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하는 조성물) 중에 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해성 바이러스 및 임의로 암을 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 면역요법제 및/또는 추가적인 치료제는 별도의 조성물 중에 있다.
본 발명의 키트는 적합한 패키징 중에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 항아리 및 가요성 패키징 (예컨대, 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 키트는 추가적인 구성요소, 예컨대, 완충액 및 해석 정보를 임의로 제공할 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 바이알 (예컨대, 밀봉된 바이알), 병, 항아리 및 가요성 패키징 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안 특징으로 교체될 수 있다. 따라서, 달리 분명하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.
실시예
아래의 실시예는 순수하게 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 따라서 본 발명을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 다음의 실시예 및 상세한 설명은 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.
실시예 1: DAS181 처리는 종양 세포 상의 표면 시알산을 감소시킨다
이 연구에서 특정 종양 세포의 시알산 부하에 대한 DAS181의 영향을 조사하였다. 간단히 말해서, A549 (인간 폐포 기저 상피 선암종) 및 MCF (인간 유선 상피 선암종) 종양 세포에 대한 α-2,3 및 α-2,6 시알산 변형의 FAC 및 이미지-기반 정량화를 수행하였다. A549 및 MCF7 세포에서 시알산 제거 후 갈락토오스 노출을 유세포 분석법 분석 및 이미징 접근법을 사용하여 PNA-FITC에 의해 검출하였다. 위에 논의된 바와 같이, 2 개의 시알산이 α-2,3 연결 또는 α-2,6 연결에 의해 끝에서 두 번째 당에 가장 자주 부착되며, 이는 각자 마아키아 아무렌시스(Maackia Amurensis) 렉틴 II (MAL II) 및 삼부쿠스 니그라(Sambucus Nigra) 렉틴 (SNA)에 의해 검출될 수 있다. 게다가, 땅콩 응집소 (PNA)를 사용하여 표면 갈락토오스 (예컨대, 시알산 제거 후 노출된 갈락토오스)를 검출할 수 있다.
도 1은 형광 이미징에 의한 A549 및 MCF 세포 상의 FITC-SNA에 의한 α-2,6 시알산의 검출을 묘사한다.
A549 세포를 다양한 농도의 DAS181로 처리하고, 2,6 연결된 시알산 (FITC-SNA), α-2,3 연결된 시알산 (FITC-MALII) 또는 갈락토오스 (FITC-PNA)를 이미징하기 위해 염색하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, DAS181은 2,3 및 2,6 연결된 시알산 및 노출된 갈락토오스 둘 모두를 효과적으로 제거하였다.
대조적으로, Y348F 돌연변이로 인해 시알리다제 활성이 결여된 DAS181의 변이체인 DAS185는 α-2,6 연결된 시알산 또는 α-2,3 연결된 시알산을 제거할 수 없었다. 도 3에 도시된 바와 같이, A549 세포와 DAS185의 항온처리는 본질적으로 표면 α-2,3 연결된 시알산에 영향을 미치지 않은 반면, DAS181은 농도 의존적 방식으로 표면 α-2,3 연결된 시알산을 감소시켰다 (FITC-MALII로 염색된 세포; 도 3에 도시된 결과). 유사하게, A549 세포와 DAS185의 항온처리는 본질적으로 표면 α2,6 연결된 시알산에 영향을 미치지 않은 반면, DAS181은 농도 의존적 방식으로 표면 α-2,6 연결된 시알산을 감소시켰다 (FITC-SNA로 염색된 세포; 도 4에 도시된 결과). 이러한 결과와 일치하게, A549 세포와 DAS185의 항온처리는 본질적으로 표면 갈락토오스에 영향을 미치지 않은 반면, DAS181은 농도 의존적 방식으로 표면 갈락토오스를 증가시켰다 (FITC-PNA로 염색된 세포; 도 5에 도시된 결과).
실시예 2: DAS181 처리는 PBMC-매개된 종양 세포 살해를 증가시킨다
실시예 1은 DAS181이 광범위한 특이성 (예컨대, α-2,3 대 α-2,6 연결 둘 모두의 절단)으로 종양 세포의 시알산 부하를 효과적으로 감소시킨다는 것을 입증하였다. 실시예 2는 DAS181을 이용한 종양 세포의 처리가 미처리된 종양 세포와 비교하여 처리된 종양 세포의 PBMC-매개된 살해를 유의하게 향상시킨다는 것을 입증한다.
간단히 말해서, α-2,3 및 α-2,6 시알산의 FAC 및 이미지-기반 정량화
A549 세포를 적색 형광 단백질 (A549-적색)로 유전적으로 표지하였다. 신선한 인간 PBMC를 수확하고, 다양한 사이토카인 및 항체 조합으로 자극하여, 이펙터 T 세포 (CD3, CD38 및 IL-2) 또는 일부 경우에, T 세포 및 NK 세포 (CD3, CD28, IL-15 및 IL-21)를 활성화하였다. 그런 다음, 활성화된 PBMC를 DAS181 (100 nM)에 노출된 A549-적색 세포와 공동-배양하였다. PBMC에 의한 종양 세포 살해를 IncuCyte를 이용한 살아있는 세포 이미징 및 정량화에 의해 모니터링하였다. 세포 배양 배지를 수집하고, ELISA로 분석하여, PBMC에 의한 사이토카인 생산을 판정하였다.
도 6은 PBMC를 자극하기 위해 사용된 처리 및 PBMC를 자극하기 위해 사용된 처리와 조합된 DAS181 둘 모두가 A549-적색 세포 증식에 영향을 미치지 않는다는 것을 도시한다.
도 7은 DAS181이 비히클 단독 대조군과 비교하여 T 세포 매개 및 NK 세포 매개 둘 모두인 PBMC (공여자 1)에 의해 매개된 종양 세포 독성을 유의하게 증가시킨다는 것을 도시한다. 상이한 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 유사한 결과를 관찰하였다 (공여자 2; 도 8). 도 9a-c는 도 7에 제시된 데이터의 정량화를 나타낸다. 도 9a는 표시된 이펙터 세포:종양 세포 비율에서 DAS181이 있거나 없이 PBMC로 처리한 후 A549-적색 세포의 정량화를 도시한다. 도 9b는 표시된 이펙터 세포:종양 세포 비율에서 DAS181이 있거나 없이 이펙터 T 세포를 활성화하기 위해 CD3, CD38 및 IL-2로 자극된 PBMC로 처리한 후 A549-적색 세포의 정량화를 도시한다. 도 9c는 표시된 이펙터 세포:종양 세포 비율에서 DAS181이 있거나 없이 이펙터 T 및 NK 세포를 활성화하기 위해 CD3, CD28, IL-15 및 IL-21로 자극된 PBMC로 처리한 후 A549-적색 세포의 정량화를 도시한다. 도 10a-10c는 상이한 공여자 (공여자 2)로부터의 PBMC를 사용하여 각자 동일한 정량화를 도시한다.
실시예 3: 종양용해성 백시니아 바이러스 및 DAS181에 의한 종양 세포의 NK 세포 매개된 살해
이 연구에서 NK 세포-매개된 살해에 대한 종양용해성 백시니아 바이러스 (웨스턴 리저브, VV) 및 DAS181의 영향을 조사하였다. 시알리다아제 활성이 결여된 변이체 단백질인 DAS185를 대조군으로서 사용하였다. 이 실시예는 DAS181에 대한 노출이 종양용해성 바이러스에 의한 종양 세포 살해를 증가시킨다는 것을 입증한다.
간단히 말해서, 종양 세포 (U87-GFP)를 DMEM 중 웰당 5x104 개의 세포 (100 ul)로 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 2 일차에, 세포를 소 태아 무-혈청 배지에서 MOI 0.5, 1 또는 2에서 2 시간 동안 VV로 감염시킨 다음, 1 nM의 DAS181 또는 1 mM의 DAS185에 노출시켰다. 그런 다음, 종양 세포를 이펙터:종양 (E:T) = 1:1, 5:1, 10:1에서 정제된 NK 세포와 혼합하였다. 뉴라미니다제/시알리다제 배경을 저하시키기 위해 세포를 2% FBS가 보충된 배지에서 배양하였다. 24 시간 후, 종양 살해를 MTS 검정으로 측정하고 (96 웰 플레이트), 세포 배양 배지를 수집하였다. IFN 감마의 발현은 ELISA로 측정하였다. 이 연구의 결과는 비활성 DAS185가 아닌 DAS181이 종양용해성 백시니아 바이러스에 의한 종양 세포 살해를 증가시킴을 볼 수 있는 도 11 및 도 12에 도시되어 있다.
실시예 4: 종양 세포의 존재 하에 DC 성숙 및 대식세포 활성에 대한 DAS181의 영향
이 연구에서, 단핵구-유래된 수지상 세포 또는 대식세포에 대한 DAS181의 영향을 조사하였다. 시알리다제 활성이 결여된 변이체 단백질인 DAS185를 대조군으로서 사용하였다.
간단히 말해서, 단핵구-유래된 수지상 세포 (DC)를 100 ng/ml의 GM-CSF 및 50 ng/ml의 IL-4가 보충된 3 ml의 배지에 5x106 개의 부착성 PBMC를 재현탁함으로써 제조하였다. 48 시간 후, 100 ng/ml의 GM-CSF 및 50 ng/ml의 IL-4가 보충된 2 ml의 신선한 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 추가 72 시간 후, 종양 세포 (U87-GFP)를 DMEM의 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 종양 세포를 2 시간 동안 FBS 유리 배지에서 다양한 MOI에서 VV로 감염시켰다. 1 nM의 DAS181 또는 DAS185의 존재 하에 배양된 DC를 1:1의 종양 세포:DC 비율로 종양 세포와 혼합하였다. 수지상 세포 성숙 (CD86, CD80, MHC-II, MHC-I의 발현).
게다가, THP-1 세포를 10% 열-비활성화된 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지 (Invitrogen)에서 배양하였다. 6-웰 플레이트 중 THP-1 세포 (3x10e6 개의 세포/웰)를 1 nM의 시알리다제 DAS181 또는 DAS185의 부재 및 존재 하에 PMA (20 ng/ml)로 자극하였다. 세포 배양 배지 부피는 2 ml였다. 5 일차에, 종양 세포 (U87-GFP, DMEM 세포 배양 배지)를 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 종양을 2 시간 동안 FBS 유리 배지에서 다양한 MOI (즉, 0.5, 1, 2)에서 VV로 감염시켰다. THP-1 세포 배양의 경우, 1.5 ml의 세포 배양 배지를 피펫으로 제거하였다. 분화된 THP-1 세포를 또한 1 nM의 시알리다제 DAS181 또는 DAS185 및 1:1의 종양:대식세포 비율의 종양 세포-VV의 부재 및 존재 하에 이오노마이신 (1 ug/ml) 및 PMA (20 ng/ml)에 의해 12 시간 동안 추가로 자극하였다. THP-1 세포를 뉴라미니다제 배경을 저하시키기 위해 2% FBS가 보충된 배지에서 배양하였다. 6 일차에, 배양 배지 중 사이토카인의 농도를 ELISA 어레이로 측정하였다.
도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, DAS181은 세포가 단독으로 또는 백시니아 바이러스에 감염된 종양 세포와 함께 배양되었는지 여부에 상관없이 수지상 세포 성숙 마커의 발현을 유의하게 향상시켰다.
추가적으로, 이 연구의 결과는 DAS181에 대한 노출이 THP-1 유래된 대식세포에 의한 TNF-알파 분비를 증가 및 증가시켰다는 것을 입증한다 (도 14).
실시예 5: DAS181은 면역 세포의 부재 하에 종양용해성 아데노바이러스 종양 세포 살해를 증가시킨다
이 실시예는 DAS181을 이용한 처리가 면역 세포의 부재 하에서도 종양용해성 바이러스 종양 세포 살해를 증가시킨다는 것을 입증하는 예상치 못한 결과를 제공한다.
A549 세포를 적색 형광 단백질 (A549-적색)로 유전적으로 표지하였다. DAS181의 존재 또는 부재 하에 종양용해성 아데노바이러스 (Ad5)에 의한 종양 세포 증식 및 살해를 IncuCyte를 이용한 살아있는 세포 이미징 및 정량화에 의해 모니터링하였다. PBMC에 의한 사이토카인 생산의 ELISA 측정을 위해 세포 배양 배지를 수집하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, DAS181은 종양용해성 아데노바이러스-매개된 종양 세포 살해 및 성장 억제를 증가시켰다.
실시예 6: DAS181은 PBMC의 존재 하에 종양용해성 아데노바이러스 종양 세포 살해를 증가시킨다
실시예 5에 도시된 바와 같이, DAS181을 이용한 처리는 면역 세포의 부재 하에 종양용해성 바이러스에 의한 종양 세포의 살해를 증가시킨다. 실시예 6은 DAS181을 이용한 처리가 PBMC의 존재 하에 종양용해성 바이러스와 함께 존재할 때 종양 세포 살해를 또한 증가시킨다는 것을 입증하는 결과를 제공한다
A549 세포를 적색 형광 단백질 (A549-적색)로 유전적으로 표지하였다. 신선한 인간 PBMC를 수확하고, 적절한 사이토카인 및 항체 조합으로 자극하여, 이펙터 T 세포를 활성화시켰다. 그런 다음, 활성화된 PBMC를 종양용해성 아데노바이러스 (Ad5)가 있거나 없이 DAS181로 처리된 A549-적색 세포와 공동-배양하였다. PBMC에 의한 종양 세포 살해를 IncuCyte를 이용한 살아있는 세포 이미징 및 정량화에 의해 모니터링하였다. PBMC에 의한 사이토카인 생산의 ELISA 측정을 위해 세포 배양 배지를 수집하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, DAS181은 PBMC의 존재 하에 종양용해성 아데노바이러스와 함께 존재할 때 종양 세포 살해를 유의하게 증가시켰다.
실시예 7: DAS181을 발현하는 종양용해성 바이러스의 작제 및 특성화
DAS181의 발현을 위해 설계된 작제물은 도 17에 개략적으로 묘사되어 있다.
DAS181을 발현하는 재조합 VV를 생성하기 위해, pSEM-1 벡터를 DAS181을 코딩하는 서열뿐만 아니라 GFP 단백질을 코딩하는 서열 (GFP 코딩 서열은 서열번호 63에 도시됨)에 플랭킹된 동일한 배향을 갖는 2 개의 loxP 부위 (loxP 부위 서열은 서열번호 62에 도시됨)를 포함하도록 변형시켰다. (pSEM-1-TK-DAS181-GFP). DAS181 발현은 종양 조직 내에서 발현을 제한하기 위해 FT7R 후기 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 예시적인 작제물의 일부의 서열은 서열번호 65에 도시되어 있다.
웨스턴 리저브 VV를 모 바이러스로서 사용하였다. DAS181을 발현하는 VV를 생성된 VV-DAS181에 대한 웨스턴 리저브 VV의 TK 유전자로의 pSEM-1-TK-DAS181-GFP를 이용한 재조합에 의해 생성하였다.
재조합 바이러스를 다음과 같이 생성할 수 있다.
형질주입:
5x105 개의 세포/2 ml의 DMEM-10% FBS/웰로 6-웰 플레이트에 CV-1 세포를 씨딩하고, 밤새 성장시켰다. MOI 0.05에서 DMEM/2% FBS의 바이러스 스톡을 희석함으로써 모 VV 바이러스 (1 ml/웰)를 제조하였다. CV-1 웰로부터 배지를 제거하고, 즉시 VV를 첨가하고, 1-2 시간 동안 배양하였다. CV-1 세포는 이 시점에서 60-80% 콘플루언트(confluent)여야 한다. 1.5 ml의 튜브 중 형질주입 혼합물.
각각의 형질주입에 대해, 9 μl의 Genejuice를 91 ul의 무-혈청 DMEM에 희석하고, 실온에서 5 분 동안 항온처리하였다. 3 ug의 pSEM-l-TK-DAS181-GFP DNA를 2 또는 3 회 위아래로 피펫팅함으로써 부드럽게 첨가하였다. 15 분 동안 실온에서 두었다. CV-1 웰로부터 VV 바이러스를 흡인하고, 2 ml의 무-혈청 DMEM으로 세포를 1 회 세척하였다. 2 ml의 DMEM-2% FBS를 첨가하고, DNA-Genejuice 용액을 한 방울씩 첨가하였다. 48-72 시간 동안 또는 모든 세포가 모일(round up) 때까지 37℃에서 항온처리하였다. 반복적으로 피펫팅함으로써 세포를 수확하였다. 먼저 드라이-아이스/에탄올 배쓰에 넣은 다음, 37℃ 물 배쓰에서 해동하고, 볼텍싱함으로써, 수확한 세포를 반복적으로 동결-해동하여 세포로부터 바이러스를 방출하였다. 동결-해동 사이클링을 3 회 반복하였다. 세포 용해물을 -80℃에서 저장할 수 있다.
플라크 단리:
5x105 개의 세포/2 ml의 DMEM-10% FBS/웰로 6-웰 플레이트에 CV-1 세포를 씨딩하고, 밤새 성장시켰다. CV-1 세포는 세포 용해물을 받을 때 60-80% 콘플루언트여야 한다. 현탁액 중 물질이 분산될 때까지, 30 초의 4 주기 동안 초음파 전환기 프로브가 있는 음파 파쇄기(sonic dismembrator)를 사용하여 얼음 위에서 세포 용해물을 초음파처리하였다. DMEM-2% FBS 중 세포 용해물의 10-배 연속 희석을 한다. 10-2, 10-3, 10-4 희석액으로 웰당 세포 용해물-배지 1 ml를 첨가하고, 37℃에서 항온처리하였다. 피펫 팁을 사용하여 잘-분리된 GFP+ 플라크를 선택하였다. 피펫 팁을 약간 흔들어 플라크의 세포를 긁어내고 떼어내었다. 0.5 ml의 DMEM 배지를 함유하는 미세원심분리기 튜브로 부드럽게 옮긴다. 3 회 동결-해동하고, 초음파처리하였다. 플라크 단리의 동일한 과정을 3-5 회 반복하였다.
바이러스 증폭:
5x105 개의 세포/2 ml의 DMEM-10% FBS/웰로 CV-1 세포를 씨딩하고, 6-웰 플레이트에서 밤새 성장시켰다. CV-1은 실험을 시작할 때 콘플루언트여야 한다. 250 ul의 플라크 용해물/1 ml의 DMEM-2% FBS로 1 웰을 감염시키고, 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 플라크 용해물을 제거하고, 2 ml의 신선한 DMEM-2% FBS를 첨가하고, 세포가 모일 때까지 48-72 시간 동안 항온처리하였다. 반복적으로 피펫팅함으로써 세포를 수집하고, 3 회 동결-해동하고, 초음파처리하였다. 4 ml의 DMEM-2%FBS 중 세포 용해물의 절반을 첨가하고, 75-CM2 플라스크에서 CV-1 세포를 감염시키고, 2 시간 후 바이러스를 제거하고, 12 ml의 DMEM-2%FBS를 첨가하고, (세포가 모일 때까지) 48-72 시간 배양하였다. 세포를 수확하고, 1800 G에서 5 분 회전시키고, 상층액을 버리고, 1 ml의 DMEM-2.5% FBS에 재현탁하였다.
바이러스 적정:
5x105 개의 세포/2 ml의 DMEM-10% FBS/웰로 CV-1 세포를 씨딩하고, 6-웰 플레이트에서 밤새 성장시켰다. DMEM-2% FBS, 50 ul의 바이러스/4950 ul의 DMEM-2% FBS (A, 10-2), 500 ul의 A/4500 ul의 배지 (B, 10-3) 및 500 ul의 B/4500 ul의 배지 (C, 10-4), 바이러스 스톡의 경우 10-7 내지 10-10에서 바이러스를 희석한다. 배지를 제거하고, PBS로 1x 세척하고, 세포를 1 ml의 바이러스 희석액으로 이중으로 감염시켰다. 1 시간 동안 세포를 항온처리하고, 10 분마다 플레이트를 흔든다. 1 시간 후, 바이러스를 제거하고, 2 ml의 DMEM-10% FBS를 첨가하고, 48 시간 항온처리한다. 배지를 제거하고, 실온에서 15 분 동안 20% 에탄올 중 0.1% 크리스탈 바이올렛 1 ml를 첨가한다. 배지를 제거하고, 실온에서 24 시간 동안 건조시킨다. 플라크를 카운팅하고, ml당 플라크 형성 유닛 (pfu)으로 표현한다.
VV-DAS181에 의한 DAS181 발현의 검출:
CV-1 세포를 MOI 0.2에서 VV-DAS181로 감염시켰다. 48 시간 후, CV-1 세포를 수집하였다. Wizard SV 게놈 DAN 정제 시스템을 사용하여 DNA를 추출하고, DAS181 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. PCR을 표준 PCR 프로토콜 및 프라이머 서열 (시알F:
Figure pct00008
(서열번호 56) 및 시알R:
Figure pct00009
(서열번호 57))을 사용하여 수행하였다. 예상된 PCR 산물 (1251 bp)이 발견되었다.
실시예 8: 백시니아 바이러스에 의해 발현된 DAS181은 생체외에서 활성이다
실시예 8은 종양용해성 바이러스를 사용한 세포로의 DAS181의 전달이 1 ml의 배지에서 대략 0.78 nM-1.21 nM의 정제된 DAS181을 이용한 처리와 등가인 시알리다제 활성을 초래한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다.
CV-1 세포를 6 개의 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 MOI 0.1 또는 MOI 1에서 시알리다제-VV 또는 대조군 VV로 형질도입하였다. 24 시간 후, 형질주입된 세포를 수집하고, 단일 세포 현탁액을 PBS에서 3x106 개/500 μl로 만들었다. 세포 용해물을 Sigma사의 단백질 추출용 포유동물 세포 용해 키트 (Sigma, MCL1-1KT)를 사용하여 제조하고, 상층액을 수집하였다. 시알리다제 (DAS181) 활성을 제조사의 지침서에 따라 뉴라미니다제 검정 키트 (Abcam, ab138888)를 사용하여 측정하였다. 1 nM, 2 nM 및 10 nM의 DAS181을 대조군으로서의 VV-세포 용해물에 첨가하고, 표준 곡선을 생성하였다. 시알리다제-VV로 감염된 1x106 개의 세포는 1 ml의 배지 중 0.78 nM-1.21 nM의 DAS181에 등가인 DAS181을 발현한다. 도 18에 도시된 바와 같이, DAS181은 생체외에서 시알리다제 활성을 갖는다.
실시예 9: 백시니아 바이러스-시알리다제는 수지상 세포 성숙을 촉진한다
실시예 9는 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스가 시알리다제가 없는 종양용해성 바이러스와 비교하여 수지상 세포 성숙을 촉진한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다.
시알리다제-VV가 DC 활성화 및 성숙을 촉진할 수 있는지 결정하기 위해, 부착성 인간 PBMC를 100 ng/ml의 GM-CSF 및 50 ng/ml의 IL-4가 보충된 3 ml의 배지에서 5x106 개의 세포로 재-현탁시킨 다음, 동일한 농도의 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 웰당 2 ml의 신선한 배지로 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 세포 배양 6 일 후, 세포를 시알리다제-VV 감염된 종양 세포 용해물, VV-감염된 종양 세포 용해물, VV-감염된 종양 세포 용해물 + 합성 DAS181 단백질, 또는 LPS (양성 대조군)의 존재 하에 배양하였다. 추가 24 시간 후, CD86, CD80, MHC-II, MHC-I의 발현을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 시알리다제-VV는 VV 단독 처리와 비교하여 수지상 세포 활성화 및 성숙을 나타내는 마커의 발현을 촉진한다.
실시예 10: 시알리다제-VV는 T 림프구-매개된 사이토카인 생산 및 종양용해 활성을 향상시킨다
DAS181이 IFN-감마 (IFNr) 및 IL-2 발현을 유도함으로써 인간 T 세포를 활성화시킬 수 있는지 판정하기 위해, 인간 PBMC를 10 μg/ml의 CD3 항체를 첨가함으로써 활성화시키고, 48 시간마다 IL-2를 첨가함으로써 증식을 추가로 자극하였다. 15 일차에, 종양 세포 (A549)를 2 시간 동안 2.5% FBS 배지에서 MOI 0.5, 1 또는 2에서 VV로 감염시켰다. 활성화된 T 세포를 1 ug/ml의 CD3 항체의 존재 하에 5:1 또는 10:1의 이펙터:표적 비율로 배양물에 첨가하였다. 추가 24 시간 후, 종양 세포독성을 측정하고, 사이토카인 어레이를 위해 세포 배양 배지를 수집하였다. 도 20에서 알 수 있는 바와 같이, 시알리다제-VV는 VV보다 CD3 활성화된 T 세포에 의해 유의하게 더 큰 IL-2 및 IFN-감마 발현을 유도한다. 게다가, 도 21에서 알 수 있는 바와 같이, 시알리다제-VV는 5:1의 E:T에서 VV보다 더 강한 항-종양 반응을 이끌어낸다.
실시예 11: 분비된 및 막관통 DAS181에 대한 발현 작제물의 생성
시알리다제 활성에 대한 영향을 조사하기 위해 DAS181의 분비된 및 막관통 형태를 생성하였다. 음성 대조군으로서, 시알리다제 활성을 매우 실질적으로 감소시키는 점 돌연변이체의 분비된 및 막관통 형태를 또한 생성하였다. 마지막으로, 대안적 시알리다제인 Neu2의 분비된 및 막관통 형태를 또한 작제하였다.
세포로부터 DAS181의 분비를 용이하게 하기 위해, 마우스 면역글로불린 카파 쇄의 신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 유전자 합성에 의해 DAS181 서열의 N-말단에 첨가한 다음, 함께 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.4에 클로닝하였다. 세포 표면에서 DAS181 시알리다제 활성을 제한하기 위해, DAS181 촉매 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 합성하고, 포유동물 발현 벡터 pDisplay에서 인간 PDGFR 베타 막관통 도메인과 함께 프레임-내 클로닝하였다. 대조군의 경우, 시알리다제 활성이 결여된 돌연변이체 단백질인 DAS185의 분비된 및 막관통 버전을 코딩하는 DNA 서열을 유사하게 합성하고, 각자 pcDNA3.4 및 pDisplay 벡터에 클로닝하였다. 게다가, 인간 Neu2 시알리다제의 분비된 및 막관통 버전을 발현하는 작제물을 동일한 방식으로 생성하였다. 다음의 작제물에 대한 서열을 도시하였다: 작제물 1 (분비된 DAS181; 서열번호 34). 작제물 4 (막관통 DAS181; 서열번호 37), 작제물 2 (분비된 DAS185; 서열번호 35), 작제물 5 (막관통 DAS185; 서열번호 38), 작제물 3 (분비된 인간 Neu2; 서열번호 36) 및 작제물 6 (막관통 인간 Neu2; 서열번호 39).
실시예 12: 분비된 및 막관통 시알리다제의 효소 활성
이소성 발현을 위해, 포유동물 발현 벡터 (실시예 11에 상세히 기재됨)를 제조사의 프로토콜에 따라 jetPRIME 형질주입 시약 (Polyplus 형질주입 #114-15)을 사용하여 HEK293 세포에 형질주입시켰다. 간단히 말해서, 인간 배아 신장 세포 (HEK293)를 6-웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 ~ 2 x 105 개의 살아있는 세포로 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2 및 95% 상대 습도에서 (전형적으로 밤새) 항온처리하여 콘플루언시(confluency)가 되도록 성장시켰다. 2 마이크로그램의 DNA와 등가인 2 마이크로리터를 200 마이크로리터의 jetPRIME 완충액에 희석한 다음, 4 마이크로리터의 jetPRIME 시약으로 희석하였다. 튜브를 볼텍싱하고, 1,000 x g (~10 초)에서 간단히 원심분리하고, 실온에서 10 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 동안, 모든 웰의 배지에 신선한 배양 배지 (MEM + 10% FBS)를 보충하였다. 형질주입을 개별 웰에 첨가하고, 플레이트를 24 시간 동안 항온처리기로 되돌렸다. 항온처리 후, 상층액을 보존하였다. 비-효소적 세포 해리 시약 Versene (Gibco #15040-066)을 사용하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 단층을 DPBS로 1 회 세척하고, 500 마이크로리터의 Versene을 플레이트에 첨가하고, 세포가 용기 표면으로부터 해리될 때까지 항온처리하고; 500 마이크로리터의 완전 배지를 첨가하고, 세포를 300xg에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 흡인하고, 세포를 효소 검정을 위해 300 마이크로리터의 경쟁 배지에 현탁시켰다.
생성된 각각의 형질주입 배양물에 대해, 상층액 및 재현탁된 세포를 시알리다제가 형광성 기질인 2'-(4-메틸움벨리페릴)-α-D-N-아세틸뉴라민산 소듐 염 수화물 (MuNaNa)을 효소적으로 절단하여 형광 분자 4-메틸움벨리페론 (4-Mu)을 방출하는 능력을 활용하는 활성에 대해 평가하였다. 생성된 유리 4-Mu는 365 nM에서 여기되고, 방출은 형광 플레이트 판독기를 사용하여 445 nM에서 판독된다. 간단히 말해서, 각각의 샘플 100 μl를 비-처리된 흑색의 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃의 물 배쓰에서 대략 30 분 동안 항온처리하고, 미리-항온처리된 (37℃, 30 분) 100 μM의 MuNaNa와 후속적으로 혼합하였다. 분자 장치 SpectraMax M5e 다중-모드 플레이트 판독기를 사용하여 60 분 동안 30 초 간격으로 형광을 동역학적으로 측정하였다. 절단에 의해 생성된 4-Mu의 양은 100-5 μM 범위의 순수한 4-Mu의 표준 곡선과 비교하여 정량화하였다. 생산된 4-Mu의 양 (≤ 20 μM)을 그렇게 하는 데 필요한 시간 (초)으로 나누어 각각의 샘플에 대한 반응 속도를 결정하였다. 관찰된 반응 속도를 비교하여, 각각의 샘플 용액의 대략적인 상대 활성을 결정하였다 (표 6). 분비된 DAS181 형질주입으로부터의 상층액 및 막관통 DAS181 형질주입으로부터의 재현탁된 세포가 가장 활성이고 대략적으로 동등함을 나타내었다. 모든 DAS185 및 Neu2 샘플 용액은 DAS181 샘플 용액과 비교하여 무시할만한 활성을 보였다. Neu2 샘플 용액은 배경과 등가였다. 더욱이, 관찰된 반응 속도를 1000-60 pM 범위의 알려진 농도의 DAS181의 표준 곡선과 비교하였다. 분비된 DAS181 형질주입으로부터의 상층액 및 막관통 DAS181 형질주입으로부터의 재현탁된 세포를 대략 4000 pM의 DAS181과 등가이도록 외삽하였다. 다른 모든 샘플은 90 pM의 DAS181과 대략적으로 등가이거나 그 미만인 것으로 관찰되었다.
표 6
Figure pct00010
실시예 13: 분비된 DAS181 및 막관통 DAS181은 종양 세포 상의 표면 시알산을 감소시킨다
세포 표면 시알산 제거 및 갈락토오스 노출에 대한 분비된 및 막관통 시알리다제의 효과를, 제조사에 의해 제공된 지침서에 따라 Fugene HD (Promega)를 사용하여 다양한 발현 작제물을 A549-적색 세포에 일시적으로 형질주입시킨 후 이미징 및 유세포 분석법에 의해 조사하였다. 간단히 말해서, A549-적색 세포를 6-웰 플레이트에서 2 ml의 A549-적색 완전 성장 배지에서 웰당 2 x 105 개의 세포로 플레이팅하였다. 형질주입될 세포의 각각의 웰에 대해, 3 μg의 플라스미드 DNA 및 9 μl의 Fugene HD를 150 μl의 Opti-MEM® I 환원 혈청 배지에 희석하고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 5 분 동안 항온처리하여, DNA-Fugene HD 복합체를 형성하였다. 위의 DNA-Fugene HD를 세포를 함유하는 각각의 웰에 직접 복합체화하고, 세포를 추가 실험 전에 밤새 CO2 항온처리기에서 37℃에서 항온처리하였다.
이미징 실험을 위해, 형질주입된 세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 8,000 개의 세포로 재-씨딩하였다. 그런 다음, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 동안 세포 배양 후 세포를 고정하고, α2,3-시알산; α2,6-시알산; 및 갈락토오스에 대해 염색하였다. 세포를 40 μg/ml의 SNA-FITC, 20 μg/ml의 PNA-FITC와 함께 실온에서 1 시간 동안 항온처리하여, α2,6-시알산 및 갈락토오스를 개별적으로 염색하였다. α2,3-시알산의 경우, 세포를 40 μg/ml에서 비오틴화된 MA II와 함께 1 시간 동안 항온처리한 다음, FITC-스트렙타비딘과 함께 추가적인 1 시간 동안 항온처리하였다. HA-태그 발현을 검출하기 위해, 세포를 실온에서 1 시간 동안 HA-태그 토끼 mAb (1:200)와 함께 항온처리한 다음, 추가적인 1 시간 동안 당나귀 항-토끼-Alexa Fluor647과 함께 항온처리하였다. 이미지를 Keyence 형광 현미경으로 촬영하였다.
형질주입 24 시간 후 촬영한 이미지는 재조합 DAS181 처리와 유사하게, 분비된 DAS181 (작제물 1) 및 막관통 DAS181 (작제물 4) 형질주입이 세포 표면으로부터 α2,3 및 α2,6 시알산 둘 모두를 제거하였으며, 그에 따라 증가된 갈락토오스 염색을 수반하는 것으로 나타났다. 효소-비활성 DAS185 (작제물 2, 5) 또는 인간 Neu2 (작제물 3, 6)로 형질주입된 세포는 효소 활성 결과와 일치하는 비히클 대조군 세포와 유사한 염색 패턴을 보여주었다.
형질주입 72 시간 후 촬영한 이미지는 분비된 및 막관통 DAS181 형질주입만이 종양 세포 표면 시알산을 효율적으로 제거할 수 있음을 더욱 명백하게 입증하였다. 그러나, 인간 Neu2는 막관통 작제물에 존재하는 HA 태그의 염색이 DAS181 및 DAS185 작제물로 형질주입된 세포에서만 양성이기 때문에 세포에 의해 잘 발현되지 않았을 가능성이 있다.
유세포 분석법 분석을 위해, 형질주입된 세포를 24-웰 플레이트에서 웰당 1x105 개의 세포로 재-씨딩하였다. 그런 다음, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 동안 세포 배양 후 세포를 고정하고, α2,3-시알산, α2,6-시알산 및 갈락토오스에 대해 염색하였다. 결과를 Acea 유세포 분석기 시스템을 사용하여 분석하였다. 대조군으로서 재조합 DAS181 처리를 이용한 분비된 작제물 형질주입의 결과는 α2,3 (도 22a) 및 α2,6 (도 22b) 시알산, 및 갈락토오스 (도 22c)에 대해 도 22a-22c에 도시되어 있다. 대조군으로서 분비된 DAS181 형질주입을 이용한 막관통 작제물 형질주입의 결과는 α2,3 (도 23a) 및 α2,6 (도 23b) 시알산, 및 갈락토오스 (도 23c)에 대해 도 23a-23c에 도시되어 있다. 이미징 연구 결과와 일치하게, 분비된 DAS181 및 막관통 DAS181 형질주입은 세포 표면 α2,3 및 α2,6 시알산의 제거 및 갈락토오스의 노출을 야기한 반면, 분비된 및 막관통 DAS185 또는 인간 Neu2를 이용한 형질주입은 거의 효과가 없었다.
실시예 14: 분비된 DAS181 및 막관통 DAS181은 PBMC 및 종양용해성 바이러스에 의해 매개되는 종양 세포 살해를 증가시킨다
분비된 DAS181 및 막관통 DAS181이 세포 표면 시알산을 효율적으로 제거하는 것으로 나타났기 때문에, PBMC 및 종양용해성 바이러스-매개된 종양 세포 살해에 대한 이들의 효과를 분비된 및 막관통 DAS181로 형질주입된 세포로 평가하였다. 일시적인 형질주입은 세포 성장에 해로운 영향을 미칠 수 있기 때문에, 대조군 비-형질주입된 세포가 완전히 살해 제거될 때까지 3 주 동안 1 mg/ml의 G418의 존재 하에 형질주입된 A549-적색 세포를 배양함으로써 분비된 및 막관통 DAS181에 대한 안정한 풀 세포를 생성하였다. DAS181로 안정한 풀 형질주입된 A549-적색 세포를 웰당 2000 개의 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. A549-적색 모 세포를 대조군으로서 씨딩하였다. 다음 날, 완전 성장 배지를 제거하고, 종양용해성 바이러스가 있거나 없이 배지 50 ul로 교체하였다. 새로 단리된 PBMC를 카운팅하고, 항-CD3/항-CD28/IL2를 포함하는 A549 완전 배지에서 200,000 개/ml로 재현탁한 다음, 새로 50 μl의 PBMC를 세포에 첨가하였다. 세포 성장을 카운팅된 적색 개체에 기반하여 최대 5 일까지 Essen Incucyte로 모니터링하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 분비된 DAS181 발현은 MOI 1 및 5 둘 모두에서 활성화된 PBMC-매개된 종양 세포 살해 및 증가된 종양용해성 바이러스 연관된 PBMC-매개된 세포 살해를 감작시켰다. 도 25에 도시된 바와 같이, 막관통 DAS181 발현은 활성화된 PBMC 살해에 대해 A549-적색 세포를 유의하게 감작시켰다. 훨씬 더 큰 효과는 MOI 1보다 MOI 5에서 바이러스가 관찰되었다는 것이다. 단일 제제로서의 시알리다제 활성 및 종양용해성 바이러스의 효능은 특정 실험 조건 하에서 함께 조합될 때 부가 효과를 마스킹할 수 있는 가능성이 있다.
실시예 15: 시알리다제-무장된 종양용해성 백시니아 바이러스의 생성
이 실시예는 시알리다제를 코딩하는 예시적인 종양용해성 바이러스 작제물의 생성을 입증한다. 엔도-시알-VV, SP-시알-VV 및 TM-시알-VV에 대한 작제물을 성공적으로 생성하였다.
1.1. pSEM-1-시달리다제-GFP/RFP의 설계.
시알리다제를 발현하는 재조합 VV를 생성하기 위해, 유전자 합성을 사용하여 pSEM-1 벡터를 생성하였다. 작제물은 시알리다제를 코딩하는 유전자, GFP 또는 RFP를 코딩하는 유전자, GFP/RFP에 플랭킹된 동일한 배향을 가진 2 개의 loxP 부위 (pSEM-1-시알리다제-GFP/RFP)로 구성된다. 삽입된 시알리다제는 종양 조직 내에서 시알리다제 발현을 제한하기 위해 F17R 후기 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 플라스미드의 단순화된 설계는 도 26에 도시된 바와 같다.
1.2. SP-시알-VV 및 TM-시알-VV의 생성.
백시니아 바이러스 (VV) 균주 WR을 시알리다제와의 재조합을 위한 모 바이러스로서 사용하여, 시알리다제를 3 개의 상이한 아이소폼으로 발현하는 VV를 생성하였다: i) 세포내 구획 (엔도-시알-VV)에 구속됨; ii) 세포외 환경으로 분비됨 (SP-시알-VV); 또는 iii) 세포 표면에 국소화됨 (TM-시알-VV).
시알리다제-VV는 상동 재조합을 통해 VV의 TK 유전자에 pSEM-1-TK-시알리다제-GFP, pSEM-1-TK-SP-시알리다제-RFP 또는 pSEM-1-TK-TM-시알리다제-GFP를 삽입하여 생성하였다. 모든 바이러스를 생산하고, CV-1 세포에 대한 적정에 의해 정량화하였다.
1.2.1. 적정에 의한 VV, 엔도-시알-VV, SP-시알-VV 및 TM-시알-VV 정량화
재조합 바이러스를 수득하고 이들의 스톡을 증폭시킨 후, 감염성 입자를 플라크 검정에 의해 적정하였다. 간단히 말해서, 12-웰 플레이트에 씨딩된 CV-1 세포를 VV, 엔도-시알-VV, SP-시알-VV 또는 TM-시알-VV의 연속 희석액으로 감염시켰다. 감염 48 시간 후, 세포를 고정하고, 20% 에탄올/0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 바이러스 플라크를 카운팅하였다. 본 발명자들은 배송을 위해 10 mM Tris-HCl pH 9.0의 100 μl 중 각각의 바이러스 스톡 106 개의 분취량을 제조하였다. 따라서, 모든 바이러스는 107 pfu/ml이다.
1.2.2 PCR에 의한 바이러스 재조합의 검출
시알리다제 아이소폼이 VV 게놈에 성공적으로 삽입되었는지 확인하기 위해, 표준 프로토콜에 따라 PCR을 수행하여, 각각의 바이러스 스톡을 주형 DNA로서 사용하여 작제물을 증폭하였다. 이를 위해, PCR 프라이머를 도 2에 도시된 영역에 특이적으로 결합하도록 설계하였다. 이들 프라이머는 다음을 확인할 수 있을 것이다: i) 작제물이 VV 게놈에 성공적으로 삽입됨. ii) 작제물이 재조합 동안 각자의 변형을 유지함 (즉, 분비 및 막관통 도메인). 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다:
시알-fwd:
Figure pct00011
(서열번호 56)
시알-rev:
Figure pct00012
(서열번호 57)
SP-시알-rev:
Figure pct00013
(서열번호 83)
TM-시알-fwd:
Figure pct00014
(서열번호 84)
시알리다제의 예측된 크기의 밴드를 3 개의 아이소폼 모두에서 검출하였고, 이는 시알리다제 VV 작제물의 성공적인 생성을 입증하였다 (도 27). 시알FWD + SP시알REV 프라이머 쌍을 사용하였을 때, SP-시알-VV 및 TM-시알-VV만이 SP-시알에 대해 예상한 크기의 밴드를 보였으며, 이는 이들 바이러스가 분비 신호를 가짐을 확인하였다. 마지막으로, TM-시알-fwd + SP-시알-rev 프라이머를 사용하였을 때, TM-시알-VV만이 TM-시알리다제의 예측된 크기의 강한 밴드를 보였다. 이 데이터는 VV 재조합이 성공적으로 생성되었고 3 개의 아이소폼에 대한 작제물이 바이러스 게놈 내에서 온전함을 확인하였다.
실시예 16: 시알리다제-VV'는 생체외에서 종양 세포를 감염, 복제 및 용해할 수 있다.
이 실시예는 엔도-시알-VV, SP-시알-VV 및 TM-시알-VV가 모 백시니아 바이러스에 대해 CV-1 및 U87 세포에서 비슷한 감염성 및 복제 활성을 갖고 U87 및 A549 세포에서 비슷한 용해 활성을 갖는다는 것을 입증하는 결과를 제공하며, 이는 트랜스진이 VV의 감염성, 복제 및 용해 능력을 손상시키지 않았음을 나타낸다. 종양 세포를 증가하는 MOI에서 시알리다제-VV 또는 모 VV로 감염시켰다. 감염 후 다양한 시점 (24, 48, 72 또는 96 시간)에서, 세포를 수확하고, 플라크 검정 및 MTS 검정에 적용하여, 바이러스 복제를 결정하였다.
도 28에 도시된 바와 같이, 바이러스의 복제 능력은 시알리다제를 이용한 변형에 의해 영향을 받지 않았다. CV-1 또는 U87 세포를 12-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 2.5% FBS 배지에서 MOI 0.1에서 시알리다제-VV 또는 VV로 2 시간 동안 감염시킨 후, 완전 배지에서 배양하였다. 감염 후 다양한 시점 (24, 48, 72 또는 96 시간)에서, 세포를 수확하고, CV-1 세포를 사용한 플라크 검정에 의해 바이러스 복제를 결정하였다.
더욱이, 도 29에 도시된 바와 같이, 변형된 백시니아 바이러스의 용해 활성은 도 29 및 아래의 표 7-9에 도시된 바와 같이 U87 및 A549 세포에서 모 백시니아 바이러스의 용해 활성과 비슷하였다.
표 7. U87 세포 생존 퍼센트 (%)
Figure pct00015
표 8. A549 세포 생존 퍼센트 (%)
Figure pct00016
실시예 17: 시알리다제-VV는 생체외에서 수지상 세포 성숙을 향상시킨다
이 실시예는 성숙 마커의 발현을 향상시킴으로써 SP-, & TM-시알-VV 활성화된 인간 DC를 입증하는 결과를 제공한다. SP-시알-VV 및 TM-시알-VV 둘 모두는 생체외에서 DC의 활성화를 효과적으로 유도하였다.
DC의 성숙에 대한 시알리다제를 코딩하는 종양용해성 바이러스의 효과를 평가하였다. GM-CSF/IL4 유래된 인간 DC (Astarte, WA)를 VV-U87 종양 세포 (ATCC, VA)와 함께 24 시간 동안 배양하였다. DC를 수집하고, DC 상의 DC 성숙 마커 CD86, CD80, HLA-ABC, HLA-Dr에 대한 항체로 염색하여, 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 세포를 수집하고, HLA-Dr-FITC (ab193620, Abcam, MA) 및 HLA-ABC-PE (ab155381, Abcam, MA) 또는 CD80-FITC (ab18279, Abcam, MA) 및 CD86-PE (ab234226, Abcam, MA) 항체로 염색하고, 유동 분석 (Sony SA3800)에 적용하였다.
도 30-33은 각자 DC 성숙 마커 HLA-ABC, HLA-DR, CD80 및 CD86의 발현을 도시한다. DC를 SP-시알-VV 또는 TM-시알-VV로 감염된 U87 종양 세포와 함께 배양하면 DC 성숙 마커의 발현이 VV로 감염된 U87 또는 U87 단독을 이용한 DC 세포 배양물의 DC 성숙 마커의 발현과 비교하여 향상되었다.
실시예 18: 시알리다제-VV는 생체외에서 NK-매개된 종양 세포 살해를 향상시킨다
이 실시예는 시알-VV가 NK-매개된 세포독성을 향상시킨다는 것을 입증하는 결과를 제공한다. VV-감염된 종양 세포를 NK와 공동-배양하고, 종양 세포의 특이적 용해를 결정하였다.
프로토콜: 음성 선택된 인간 NK 세포 (Astarte, WA) 및 VV-U87 세포 (ATCC, VA)를 공동-배양하고, 종양 살해 효험을 LDH 검정 (Abcam, MA)에 의해 측정하였다. 도 34에 도시된 바와 같이, 결과는 시알-VV가 생체외에서 NK 세포-매개된 U87 종양 살해를 향상시킴을 시사하였다. (* P 값, U87 및 NK 배양물에서 시알-VV 대 모의 VV)
특이적 용해를 다음과 같이 계산하였다:
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예 19: 시알리다제-VV는 생체내에서 종양 성장을 억제한다
위의 실시예는 생체외에서 면역 세포 활성화 및 세포독성을 촉진함에 있어 시알리다제-VV의 놀라운 유익한 효과를 입증한다. 실시예 19는 시알리다제-VV가 대조군 VV와 비교하여 생체외에서 종양 성장을 유의하게 억제한다는 것을 입증하는 결과를 제공한다.
생체내 종양 성장에 대한 시알리다제-VV의 효과를 테스트하기 위해, 2x105 개 및 2x104 개의 B16-F10 종양 세포를 C57 마우스의 우측 또는 좌측 옆구리에 접종하였다. 우측 또는 좌측 옆구리의 종양 크기가 100 mm에 도달하였을 때 (14 일), 4x107 pfu의 VV를 우측 또는 좌측 부위의 종양에 3 회 용량 동안 격일로 종양내 주사하였다. 종양 크기를 측정하였다. 도 35는 우측 옆구리의 종양 크기를 도시한다. 결과는 TM-시알-VV가 대조군 VV와 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제함을 나타내었다. SP-시알 VV는 비록 더 적은 정도이지만 종양 성장을 억제하였다. 도 36은 좌측 옆구리의 종양 크기를 도시한다. 결과는 TM-시알-VV가 대조군 VV와 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제함을 나타내었다.
도 37은 다양한 VV 또는 PBS 대조군으로 치료된 마우스의 경우 마우스 체중에 유의한 상이함이 없음을 도시한다. 2x105 개 및 2x104 개의 B16-F10 종양 세포를 C57 마우스의 우측 또는 좌측 옆구리에 접종하였다. 올바른 종양 크기가 100 mm에 도달하였을 때 (14 일), 4x107 pfu의 VV를 3 회 용량 동안 격일로 종양내 주사하였다. 시알리다제 무장된 종양용해성 백시니아 바이러스는 종양 내의 CD8+ 및 CD4+ T 세포 침윤을 유의하게 향상시킨다
종양 세포를 C57 마우스의 우측 옆구리에 접종하고, 생성된 종양에 위에 기재된 바와 같이 (3 회 용량 동안 격일로) VV를 종양내 주사하였다. 제1 VV 치료 7일 후, 종양 조직 (n=6)을 수집하고, 유동 분석을 수행하여, 종양 내 CD8+ 및 CD4+ T 세포 침윤을 분석하였다. * p 값: 치료군 대 대조군 VV 군. 도 38a는 시알리다제 무장된 종양용해성 백시니아 바이러스에 의한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 침윤의 유의한 향상을 나타내는 결과 및 p 값의 정량화를 도시한다. 도 38b는 FACS 플롯을 도시한다. 결과는 시알리다제 무장된 종양용해성 백시니아 바이러스가 대조군 백시니아 바이러스와 비교하여 종양 내의 CD8+ 및 CD4+ T 세포 침윤을 유의하게 향상시켰음을 입증하였다.
시알리다제 무장된 종양 용해성 백시니아 바이러스는 종양 내의 Treg/CD4+ T 세포의 비율을 유의하게 저하시켰다
종양 세포를 C57 마우스의 우측 옆구리에 접종하고, 생성된 종양에 위에 기재된 바와 같이 (3 회의 용량 동안 격일로) VV를 종양내 주사하였다. 제1 VV 치료 7 일 후, 종양 조직 (n=6)을 수집하고, 유동 분석을 수행하여, 종양 내의 Treg/CD4+ T 세포의 비율을 결정하였다. 도 39에 도시된 바와 같이, TM-시알-VV는 대조군 VV와 비교하여 종양 내의 Treg/CD4+ T 세포의 비율을 저하시켰다. * p 값: 치료군 대 대조군 VV 군.
시알리다제 무장된 종양용해성 백시니아 바이러스는 종양 내의 NK 및 NKT 세포 침윤을 유의하게 향상시켰다
종양 세포를 C57 마우스의 우측 옆구리에 접종하고, 생성된 종양에 위에 기재된 바와 같이 (3 회의 용량 동안 격일로) VV를 종양내 주사하였다. 제1 VV 치료 7 일 후, 종양 조직 (n=6)을 수집하고, 유동 분석을 수행하여, NK1.1+ NK 세포의 수를 결정하였다. 도 40에 도시된 바와 같이, 시알리다제 무장된 종양용해성 백시니아 바이러스는 종양 내의 NK 및 NKT 세포 침윤을 유의하게 향상시켰다. * p 값: 치료군 대 대조군 VV 군.
시알리다제 무장된 종양용해성 백시니아 바이러스는 종양 내의 NK 및 NKT 세포 침윤을 유의하게 향상시켰다
종양 세포를 C57 마우스의 우측 옆구리에 접종하고, 생성된 종양에 위에 기재된 바와 같이 (3 회의 용량 동안 격일로) VV를 종양내 주사하였다. 제1 VV 치료 7 일 후, 종양 조직 (n=6)을 수집하고, 유동 분석을 수행하여, PD-L1의 발현을 결정하였다. 도 41에 도시된 바와 같이, 막관통 결합된 시알리다제 무장된 종양용해성 바이러스는 종양 세포 내에서 PD-L1 발현을 유의하게 증가시켰다 (p<0.05, TM-시알-VV 대 대조군 VV).
서열 목록: 예시적인 서열
서열번호 3 인간 Neu1 시알리다제
Figure pct00019
서열번호 4 인간 Neu2 시알리다제
Figure pct00020
서열번호 5 인간 Neu3 시알리다제
Figure pct00021
서열번호 6 인간 Neu4 시알리다제
Figure pct00022
서열번호 7 인간 Neu4 아이소폼 2 시알리다제
Figure pct00023
Figure pct00024
서열번호 8 인간 Neu4 아이소폼 3 시알리다제
Figure pct00025
서열번호 9 A. 비스코수스 nanH 시알리다제
Figure pct00026
서열번호 10 A. 비스코수스 nanA 시알리다제
Figure pct00027
서열번호 11 S. 오랄리스 nanA 시알리다제
Figure pct00028
서열번호 12 S. 오랄리스 nanH 시알리다제
Figure pct00029
서열번호 13 S. 미티스 nanA 시알리다제
Figure pct00030
서열번호 14 S. 미티스 nanA_1 시알리다제
Figure pct00031
서열번호 15 S. 미티스 nanA_2 시알리다제
Figure pct00032
서열번호 16 S. 미티스 nanA_3 시알리다제
Figure pct00033
서열번호 17 S. 미티스 nanA_4 시알리다제
Figure pct00034
서열번호 18 S. 미티스 nanA_5 시알리다제
Figure pct00035
서열번호 19 S. 미티스 nanH 시알리다제
Figure pct00036
서열번호 20 P. 진기발리스 시알리다제
Figure pct00037
서열번호 21 T. 포르시티아 siaHI 시알리다제
Figure pct00038
서열번호 22 T. 포르시티아 nanH 시알리다제
Figure pct00039
서열번호 23 A. 무니시필라 시알리다제
Figure pct00040
Figure pct00041
서열번호 24 A. 무니시필라 시알리다제
Figure pct00042
서열번호 25 B. 테타이오타오미크론 시알리다제
Figure pct00043
서열번호 26 A. 비스코수스 시알리다제
Figure pct00044
서열번호 27 초기 Met 및 앵커링 도메인이 없는 DAS181
Figure pct00045
Figure pct00046
서열번호 28 작제물 1: mIg-K_DAS181 단백질 서열
Figure pct00047
서열번호 29 작제물 2: mIg-K_DAS185 단백질 서열
Figure pct00048
서열번호 30 작제물 3: mIg-K_Neu2-AR 단백질 서열
Figure pct00049
서열번호 31 작제물 4: DAS181(-AR)_TM 단백질 서열
Figure pct00050
서열번호 32 작제물 5: DAS185(-AR)_TM 단백질 서열
Figure pct00051
Figure pct00052
서열번호 33 작제물 6: Neu2_TM 단백질 서열
Figure pct00053
서열번호 34 작제물 1: mIg-K_DAS181 뉴클레오티드 서열
Figure pct00054
Figure pct00055
서열번호 35 작제물 2: mIg-K_DAS185 뉴클레오티드 서열
Figure pct00056
서열번호 36 작제물 3: mIg-K_Neu2-AR 뉴클레오티드 서열
Figure pct00057
Figure pct00058
서열번호 37 작제물 4: DAS181(-AR)_TM 뉴클레오티드 서열
Figure pct00059
서열번호 38 작제물 5: DAS185(-AR)_TM 뉴클레오티드 서열
Figure pct00060
Figure pct00061
서열번호 39 작제물 6: Neu2_TM 뉴클레오티드 서열
Figure pct00062
서열번호 40 예시적인 아미노산 분비 서열
Figure pct00063
서열번호 41 HA 태그 아미노산 서열
Figure pct00064
서열번호 42 N-말단 클로닝 부위 아미노산 서열
Figure pct00065
서열번호 43 C-말단 클로닝 부위 아미노산 서열
Figure pct00066
서열번호 44 Myc 태그 아미노산 서열
Figure pct00067
서열번호 53 살모넬라 티피무리움 시알리다제
Figure pct00068
서열번호 54 비브리오 콜레라 시알리다제
Figure pct00069
서열번호 55 Lv-CD19-CAR 플라스미드 DNA 서열
Figure pct00070
Figure pct00071
서열번호 56 Lv-CD19-CAR 번역된 아미노산 서열
Figure pct00072
서열번호 57 CD19-scFv 아미노산 서열
Figure pct00073
서열번호 58 CD55-A27 아미노산 서열
Figure pct00074
TK-좌측 (서열번호 59)
Figure pct00075
시알리다제 (역보체): (서열번호 60)
Figure pct00076
Figure pct00077
F17R: (서열번호 61)
Figure pct00078
LoxP: (서열번호 62)
Figure pct00079
GFP: (서열번호 63)
Figure pct00080
TK-우측: (서열번호 64)
Figure pct00081
서열번호 65 시알리다제 (DAS181)를 발현하기 위한 백시니아 바이러스 작제물의 일부의 서열.
Figure pct00082
Figure pct00083
서열번호 66 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) H3L 단백질
Figure pct00084
서열번호 67 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) H3L 단백질
Figure pct00085
서열번호 68 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) H3L 단백질
Figure pct00086
서열번호 69 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) H3L 단백질
Figure pct00087
Figure pct00088
서열번호 70 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) D8L 단백질
Figure pct00089
서열번호 71 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) D8L 단백질
Figure pct00090
서열번호 72 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) D8L 단백질
Figure pct00091
서열번호 73 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) A27L 단백질
Figure pct00092
서열번호 74 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) L1R 단백질
Figure pct00093
서열번호 75 시알F 프라이머
Figure pct00094
서열번호 76 시알R 프라이머
Figure pct00095
서열번호 77 인간 혈소판 인자 4 (PF4)
Figure pct00096
서열번호 78 인간 인터루킨 8 (IL8)
Figure pct00097
서열번호 79 인간 안티트롬빈 III (AT-III)
Figure pct00098
서열번호 80 인간 아포단백질 E (ApoE)
Figure pct00099
서열번호 81 인간 혈관-연관된 이동성 세포 단백질 (AAMP)
Figure pct00100
서열번호 82 인간 암피레귤린 (AR)
Figure pct00101
서열번호 83 SP-시알-rev
Figure pct00102
서열번호 84 TM-시알-fwd
Figure pct00103
서열번호 85 돌연변이체 백시니아 바이러스 (VV) D8L 단백질
Figure pct00104
특정 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변동, 변화 및 치환이 이제 본 개시내용을 벗어나지 않고 당업자에게 발생할 것이다. 본원에 기재된 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 개시내용을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위는 개시내용의 범주를 정의하고 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 이들의 등가물이 이에 의해 다루어지는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Ansun Biopharma, Inc. <120> DELIVERY OF SIALIDASE TO CANCER CELLS, IMMUNE CELLS AND THE TUMOR MICROENVIRONMENT <130> 20871-20006.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/132,420 <151> 2020-12-30 <150> US 62/964,082 <151> 2020-01-21 <160> 85 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser 1 5 10 15 Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn 20 25 30 Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn 35 40 45 Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn 50 55 60 Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser 65 70 75 80 Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly 85 90 95 Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val 100 105 110 Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp 115 120 125 Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly 130 135 140 Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp 145 150 155 160 Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr 165 170 175 Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro 180 185 190 His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly 195 200 205 Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp 210 215 220 Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val 225 230 235 240 Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly 245 250 255 Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp 260 265 270 Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala 275 280 285 Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala 290 295 300 Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg 305 310 315 320 Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr 325 330 335 Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala 340 345 350 Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn 355 360 365 Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp 370 375 380 Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu 385 390 395 <210> 2 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser 1 5 10 15 Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn 20 25 30 Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn 35 40 45 Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn 50 55 60 Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser 65 70 75 80 Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly 85 90 95 Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val 100 105 110 Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp 115 120 125 Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly 130 135 140 Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp 145 150 155 160 Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr 165 170 175 Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro 180 185 190 His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly 195 200 205 Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp 210 215 220 Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val 225 230 235 240 Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly 245 250 255 Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp 260 265 270 Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala 275 280 285 Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala 290 295 300 Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg 305 310 315 320 Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr 325 330 335 Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala 340 345 350 Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn 355 360 365 Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp 370 375 380 Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Lys Arg Lys Lys Lys Gly 385 390 395 400 Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro 405 410 415 <210> 3 <211> 415 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Thr Gly Glu Arg Pro Ser Thr Ala Leu Pro Asp Arg Arg Trp Gly 1 5 10 15 Pro Arg Ile Leu Gly Phe Trp Gly Gly Cys Arg Val Trp Val Phe Ala 20 25 30 Ala Ile Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ala Ala Ser Trp Ser Lys Ala Glu 35 40 45 Asn Asp Phe Gly Leu Val Gln Pro Leu Val Thr Met Glu Gln Leu Leu 50 55 60 Trp Val Ser Gly Arg Gln Ile Gly Ser Val Asp Thr Phe Arg Ile Pro 65 70 75 80 Leu Ile Thr Ala Thr Pro Arg Gly Thr Leu Leu Ala Phe Ala Glu Ala 85 90 95 Arg Lys Met Ser Ser Ser Asp Glu Gly Ala Lys Phe Ile Ala Leu Arg 100 105 110 Arg Ser Met Asp Gln Gly Ser Thr Trp Ser Pro Thr Ala Phe Ile Val 115 120 125 Asn Asp Gly Asp Val Pro Asp Gly Leu Asn Leu Gly Ala Val Val Ser 130 135 140 Asp Val Glu Thr Gly Val Val Phe Leu Phe Tyr Ser Leu Cys Ala His 145 150 155 160 Lys Ala Gly Cys Gln Val Ala Ser Thr Met Leu Val Trp Ser Lys Asp 165 170 175 Asp Gly Val Ser Trp Ser Thr Pro Arg Asn Leu Ser Leu Asp Ile Gly 180 185 190 Thr Glu Val Phe Ala Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ile Gln Lys Gln Arg 195 200 205 Glu Pro Arg Lys Gly Arg Leu Ile Val Cys Gly His Gly Thr Leu Glu 210 215 220 Arg Asp Gly Val Phe Cys Leu Leu Ser Asp Asp His Gly Ala Ser Trp 225 230 235 240 Arg Tyr Gly Ser Gly Val Ser Gly Ile Pro Tyr Gly Gln Pro Lys Gln 245 250 255 Glu Asn Asp Phe Asn Pro Asp Glu Cys Gln Pro Tyr Glu Leu Pro Asp 260 265 270 Gly Ser Val Val Ile Asn Ala Arg Asn Gln Asn Asn Tyr His Cys His 275 280 285 Cys Arg Ile Val Leu Arg Ser Tyr Asp Ala Cys Asp Thr Leu Arg Pro 290 295 300 Arg Asp Val Thr Phe Asp Pro Glu Leu Val Asp Pro Val Val Ala Ala 305 310 315 320 Gly Ala Val Val Thr Ser Ser Gly Ile Val Phe Phe Ser Asn Pro 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ccttggggcg 1080 ctcgtcatag ctgatcagca gatcgccatt tggggctgtg gtgatggcgg ggattctgta 1140 gttgtctgtt gcggtatttg ctgccaggtg ctgtgcctgg gacatgcttg ctggcagctc 1200 ggtggaggca tctggggcag gtgctggtgt tgcctgtggg tggtcgccca t 1251 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 gaatttcatt ttgttttttt ctatgctata a 31 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34 <210> 63 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 63 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 64 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 64 aattctgtga gcgtatggca aacgaaggaa aaatagttat agtagccgca ctcgatggga 60 catttcaacg taaaccgttt aataatattt tgaatcttat tccattatct gaaatggtgg 120 taaaactaac tgctgtgtgt atgaaatgct ttaaggaggc ttccttttct aaacgattgg 180 gtgaggaaac cgagatagaa ataa 204 <210> 65 <211> 3110 <212> DNA <213> Vaccinia virus <400> 65 atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60 ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120 tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg 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ccaccttgcg 1020 gaagccggag ccgtcgctgg ccctagagtt cagcatcagg gagccatcgc tcagctccac 1080 caccttattc tcgtccatgc ctgtgccgat tggggtgcct gcctgccagg tcttgccgtg 1140 atcgtcagaa tacacggaca cggcctgcac tgctcctcct gctgttctga tggtgtactg 1200 ctgcaccagc cggcctgcgt gaggtccgtg ctggatctgg atgccctgtc cgcttgctgc 1260 gaatcttgcg gtccagggct tatcctttgt gatgtcggct gtgatggtcc ggtgtgtcca 1320 ggtccagccg ttgtctgtgc tggtagacac ctcggcctgg atgatgccgc gattctcagg 1380 atcggtgccg cccctagagc ctccccatcc ctggtcatag gacttcacgt gaaagttgaa 1440 gattgtgccg gtctggtgat ccaccacata gcttgggtca gagtagccga ccttcttgcc 1500 tgtctcggtg ccctggtgga tgtaggtagg ggcgctccat gtcttgccgc catcggtaga 1560 tctccgctgc acgatgtgat tagggtttgg tgcgtcggag cctccatttc cgttatcctt 1620 ggggcgctcg tcatagctga tcagcagatc gccatttggg gctgtggtga tggcggggat 1680 tctgtagttg tctgttgcgg tatttgctgc caggtgctgt gcctgggaca tgcttgctgg 1740 cagctcggtg gaggcatctg gggcaggtgc tggtgttgcc tgtgggtggt cgcccattta 1800 tagcatagaa aaaaacaaaa tgaaattcaa gctttcacta attccaaacc 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Asn Ile His 180 185 190 Ser Asp Gln Leu Ser Lys Phe Arg Thr Leu Leu Ser Ser Ser Asn His 195 200 205 Asp Gly Lys Pro His Tyr Ile Thr Glu Asn Tyr Ala Asn Pro Tyr Lys 210 215 220 Leu Asn Asp Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala 225 230 235 240 Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser 245 250 255 Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu 260 265 270 Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr 275 280 285 Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn 290 295 300 <210> 71 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 71 Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile 1 5 10 15 Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys 20 25 30 Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Phe Trp Ile Asn Phe Lys 35 40 45 Gly Gly Tyr Ile Ser Gly Trp Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser 50 55 60 Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly 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Thr 275 280 285 Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn 290 295 300 <210> 72 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile 1 5 10 15 Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys 20 25 30 Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Ala Ala Ile Asn Phe Ala 35 40 45 Gly Gly Tyr Ile Ala Ala Ala Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser 50 55 60 Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His 65 70 75 80 Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp 85 90 95 Asn Ala Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Ala Ala His Asp Asp 100 105 110 Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn 115 120 125 Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Gly 130 135 140 Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu 145 150 155 160 Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Ala Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His 165 170 175 Ala Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His 180 185 190 Ser Asp Gln Ala Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ala Ser Ser Ser Ala His 195 200 205 Asp Gly Lys Ala His Tyr Ile Thr Glu Ala Tyr Ala Asn Ala Tyr Lys 210 215 220 Leu Asn Ala Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala 225 230 235 240 Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser 245 250 255 Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu 260 265 270 Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr 275 280 285 Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn 290 295 300 <210> 73 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 Met Asp Gly Thr Leu Phe Pro Gly Asp Asp Asp Leu Ala Ile Pro Ala 1 5 10 15 Thr Glu Phe Phe Ser Thr Lys Ala Ala Lys Ala Pro Glu Asp Lys Ala 20 25 30 Ala Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Asn Glu Glu Thr Leu Lys 35 40 45 Gln Arg Leu Thr Asn Leu Glu Lys Lys Ile Thr Asn Val Thr Thr Lys 50 55 60 Phe Glu Gln Ile Glu Lys Cys Cys Lys Arg Asn Asp Glu Val Leu Phe 65 70 75 80 Arg Leu Glu Asn His Ala Glu Thr Leu Arg Ala Ala Met Ile Ser Leu 85 90 95 Ala Lys Lys Ile Asp Val Gln Thr Gly Arg Ala Ala Ala Glu 100 105 110 <210> 74 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 Met Gly Ala Ala Ala Ser Ile Gln Thr Thr Val Asn Thr Leu Ser Glu 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Cys Ala Ile Glu Ile Gly Asn Phe Tyr Ile Arg Gln Asn His Gly 35 40 45 Cys Asn Leu Thr Val Lys Asn Met Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln 50 55 60 Leu Asp Ala Val Leu Ser Ala Ala Thr Glu Thr Tyr Ser Gly Leu Thr 65 70 75 80 Pro Glu Gln Lys Ala Tyr Val Pro Ala Met Phe Thr Ala Ala Leu Asn 85 90 95 Ile Gln Thr Ser Val Asn Thr Val Val Arg Asp Phe Glu Asn Tyr Val 100 105 110 Lys Gln Thr Cys Asn Ser Ser Ala Val Val Asp Asn Ala Leu Ala Ile 115 120 125 Gln Asn Val Ile Ile Asp Glu Cys Tyr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Thr 130 135 140 Asn Leu Glu Phe Ile Asn Thr Gly Ser Ser Lys Gly Asn Cys Ala Ile 145 150 155 160 Lys Ala Leu Met Gln Leu Thr Thr Lys Ala Thr Thr Gln Ile Ala Pro 165 170 175 Lys Gln Val Ala Gly Thr Gly Val Gln Phe Tyr Met Ile Val Ile Gly 180 185 190 Val Ile Ile Leu Ala Ala Leu Phe Met Tyr Tyr Ala Lys Arg Met Leu 195 200 205 Phe Thr Ser Thr Asn Asp Lys Ile Lys Leu Ile Leu Ala Asn Lys Glu 210 215 220 Asn Val His Trp Thr Thr Tyr Met Asp Thr Phe Phe Arg Thr Ser Pro 225 230 235 240 Met Val Ile Ala Thr Thr Asp Met Gln Asn 245 250 <210> 75 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 75 ggcgaccacc cacaggcaac accagcacct gcccca 36 <210> 76 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 76 ccggttgcgc ctattcttgc cgttcttgcc gcc 33 <210> 77 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Asn Gly Arg Arg Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys 1 5 10 15 Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser 20 <210> 78 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val 1 5 10 15 Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser 20 25 <210> 79 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys 1 5 10 15 Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn Arg Leu Phe Gly Asp 20 25 30 Lys Ser <210> 80 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg 1 5 10 15 Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln 20 25 30 Ala Gly <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Arg Arg Leu Arg Arg Met Glu Ser Glu Ser Glu Ser 1 5 10 <210> 82 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Thr Thr Asn Thr 1 5 10 15 Lys Lys Lys Asn Pro 20 <210> 83 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 tcctgtcttg cattgcacta agtcttg 27 <210> 84 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 tcatcactaa cgtggcttct tctgccaaag catg 34 <210> 85 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile 1 5 10 15 Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys 20 25 30 Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ile Asn Phe Lys 35 40 45 Gly Gly Tyr Ile Ser Gly Trp Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser 50 55 60 Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His 65 70 75 80 Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp 85 90 95 Asn Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Lys His Asp Asp 100 105 110 Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn 115 120 125 Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Thr 130 135 140 Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu 145 150 155 160 Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His 165 170 175 Tyr Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His 180 185 190 Ser Asp Gln Leu Ser Lys Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Ser Ser Asn His 195 200 205 Asp Gly Lys Thr His Tyr Ile Thr Glu Cys Tyr Arg Asn Leu Tyr Lys 210 215 220 Leu Asn Gly Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala 225 230 235 240 Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser 245 250 255 Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu 260 265 270 Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr 275 280 285 Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn 290 295 300

Claims (71)

  1. 시알리다제(sialidase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스로서, 상기 시알리다제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 재조합 종양용해성 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스가 백시니아 바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스 (SVV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬 질환 바이러스 (NDV), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV), 모르빌리바이러스 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 폭스바이러스, 홍역 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 렌티바이러스, 아데노바이러스, 콕사키바이러스 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스인, 종양용해성 바이러스.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스가 폭스바이러스인, 종양용해성 바이러스.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 폭스바이러스가 백시니아 바이러스인, 종양용해성 바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 드라이백스, 리스터, M63, LIVP, 티안 탄, 변형된 백시니아 앙카라, 뉴욕시 보건위원회 (NYCBOH), 다이렌, 이케다, LC16M8, 타슈켄트, IHD-J, 브라이튼, 다이렌 I, 콘노트, 와이어스, 코펜하겐, 웨스턴 리저브, 엘스트리, CL, 레덜레-코리오알란토익, AS 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 균주의 것인, 종양용해성 바이러스.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 바이러스가 백시니아 바이러스 웨스턴 리저브인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 종양용해성 바이러스가 상응하는 야생형 균주와 비교하여 바이러스의 면역원성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스가 탈리모진 라헤르파렙벡인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 바이러스가 레오바이러스인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 바이러스가 E1ACR2 결실을 갖는 아데노바이러스인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시알리다제가 Neu5Ac 알파(2,6)-Gal 시알리다제, Neu5Ac 알파(2,3)-Gal 시알리다제 또는 Neu5Ac 알파(2,8)-Gal 시알리다제인, 종양용해성 바이러스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시알리다제가 엑소-시알리다제 활성을 갖는 단백질인, 종양용해성 바이러스.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시알리다제가 박테리아 시알리다제 또는 이의 유도체인, 종양용해성 바이러스.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 박테리아 시알리다제가 클로스트리디움 퍼프린젠스 시알리다제, 악티노마이세스 비스코수스 시알리다제 및 아르트로박터 우레아파시엔스 시알리다제, 살모넬라 티피무리움 시알리다제 및 비브리오 콜레라 시알리다제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 종양용해성 바이러스.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시알리다제가 인간 시알리다제 또는 이의 유도체인, 종양용해성 바이러스.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 시알리다제가 NEU1, NEU2, NEU3 또는 NEU4인, 종양용해성 바이러스.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시알리다제가 자연 발생 시알리다제인, 종양용해성 바이러스.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시알리다제가 앵커링(anchoring) 도메인을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 앵커링 도메인이 생리학적 pH에서 양전하를 띠는, 종양용해성 바이러스.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 앵커링 도메인이 글리코사미노글리칸 (GAG)-결합 도메인인, 종양용해성 바이러스.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시알리다제가 서열번호 1-28, 31, 53 및 54로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시알리다제가 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 시알리다제가 DAS181인, 종양용해성 바이러스.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열이 시알리다제에 작동가능하게 연결된 분비 서열을 추가로 코딩하는, 종양용해성 바이러스.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 분비 서열이 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 시알리다제가 막관통 도메인을 포함하는, 종양용해성 바이러스.
  27. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 앵커링 도메인 또는 막관통 도메인이 시알리다제의 카복시 말단에 위치하는, 종양용해성 바이러스.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터가 바이러스 초기 프로모터인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 종양용해성 바이러스가 폭스바이러스이고 프로모터가 폭스바이러스 초기 프로모터인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  30. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터가 바이러스 후기 프로모터인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 프로모터가 F17R 후기 프로모터인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  32. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터가 하이브리드 프로모터인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 프로모터가 바이러스 초기 및 바이러스 후기 단백질의 하이브리드인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 단백질을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 재조합 종양용해성 바이러스.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 제2 뉴클레오티드 서열이 이종 단백질을 코딩하는, 재조합 종양용해성 바이러스.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 이종 단백질이 면역 체크포인트 억제제인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PD-1, PD-L1, B7-H4, TIGIT, LAG3, TIM-3, VISTA 또는 HLA-G의 억제제인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 억제제가 항체인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  39. 제35항에 있어서,
    상기 이종 단백질이 면역 억압 수용체의 억제제인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 면역 억압 수용체가 LILRB, TYRO3, AXL 또는 MERTK인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 면역 억압 수용체의 억제제가 항-LILRB 항체인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  42. 제35항에 있어서,
    상기 이종 단백질이 다중-특이적 면역 세포 인게이저인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  43. 제41항에 있어서,
    상기 이종 단백질이 이중특이적 분자인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  44. 제35항에 있어서,
    상기 이종 단백질이 사이토카인, 공동자극 분자, 종양 항원 제시 단백질, 항-혈관신생 인자, 종양-연관된 항원, 외래 항원 및 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 종양용해성 바이러스.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 이종 단백질이 IL-15, IL-12, CXCL10, CCL4, IL-18, IL-2 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 종양용해성 바이러스.
  46. 제44항에 있어서,
    상기 이종 단백질이 박테리아 폴리펩티드인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  47. 제44항에 있어서,
    상기 이종 단백질이 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR (예컨대, EGFRvIII), GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, 피불린-3, CDH17 및 임상적 유의성을 갖는 기타 종양 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양-연관된 항원인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  48. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스가 2 개 이상의 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 뉴클레오티드 서열이 이종 단백질을 코딩하는 것인, 재조합 종양용해성 바이러스.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 종양용해성 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 종양용해성 바이러스를 포함하는 담체 세포.
  51. 제52항에 있어서,
    상기 담체 세포가 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 종양용해성 바이러스를 포함하는 면역 세포인 것인, 담체 세포.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 면역 세포가 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR)-T, CAR-NK 또는 CAR-NKT 세포인 것인, 면역 세포.
  53. 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 종양용해성 바이러스, 제49항의 약학 조성물 또는 제50항의 담체 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    유효량의 면역요법제를 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 면역요법제가 다중-특이적 면역 세포 인게이저, 세포 요법, 암 백신, 사이토카인, PI3K감마 억제제, TLR9 리간드, HDAC 억제제, LILRB2 억제제, MARCO 억제제 및 면역 체크포인트 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 면역요법제가 세포 요법인 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 세포 요법이 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  58. 제53항에 있어서,
    상기 재조합 종양용해성 바이러스를 포함하고 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서,
    상기 키메라 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 CAR을 발현하는 면역 세포가 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포 또는 NKT 세포인 것인, 방법.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체가 암배아 항원, 알파태아단백질, MUC16, 서바이빈, 글리피칸-3, B7 패밀리 구성원, LILRB, CD19, BCMA, NY-ESO-1, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR, GD2, HER2, IGF1R, 메조텔린, PSMA, ROR1, WT1, NY-ESO-1, 피불린-3 및 CDH17로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 항원을 특이적으로 인식하는 것인, 방법.
  62. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체가 시알리다제를 특이적으로 인식하는 것인, 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 시알리다제가 DAS181 또는 이의 유도체이고, 키메라 수용체가 인간 천연 암피레귤린 또는 뉴라미니다제와 교차-반응하지 않는 항-DAS181 항체를 포함하는 것인, 방법.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포 및 재조합 종양용해성 바이러스가 동시에 투여되는 것인, 방법.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 종양용해성 바이러스가 조작된 면역 세포의 투여 전에 투여되는 것인, 방법.
  66. 종양의 치료를 필요로 하는 개체에서 종양을 치료하는 방법으로서,
    (a) 외래 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 종양용해성 바이러스의 유효량; 및 (b) 상기 외래 항원을 특이적으로 인식하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    상기 외래 항원이 박테리아 단백질인 것인, 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서,
    상기 외래 항원이 시알리다제를 포함하는 것인, 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인, 방법.
  70. 면역요법에 대해 종양을 감작시키는 방법으로서,
    유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 종양용해성 바이러스, 제49항의 약학 조성물 또는 제50항의 담체 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  71. 개체에서 암 세포의 시알화를 감소시키는 방법으로서,
    유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 재조합 종양용해성 바이러스, 제49항의 약학 조성물 또는 제50항의 담체 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
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