JP2023511129A - がん細胞、免疫細胞及び腫瘍微小環境へのシアリダーゼの送達 - Google Patents

がん細胞、免疫細胞及び腫瘍微小環境へのシアリダーゼの送達 Download PDF

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Abstract

本出願は、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスを使用して、がん（固形腫瘍など）を治療するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上の他の異種タンパク質を更にコードする。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、操作された免疫細胞を介して送達される。いくつかの実施形態において、本出願は、シアリダーゼまたは別の異種タンパク質をコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルス、及びシアリダーゼまたは他の異種タンパク質に結合することが可能なキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、またはＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）を使用して、がんを治療するための方法及び組成物を提供する。【選択図】図２６

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／９６４，０８２号及び２０２０年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／１３２，４２０号の優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：２０８７１２０００６４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年１月１９日、サイズ：２５３ＫＢ）。
［技術分野］
本出願は、シアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）を用いて、がんを治療するための方法及び組成物に関する。
米国において、がんは、第２位の死因である。近年、免疫チェックポイント阻害薬、キメラ抗原受容体を持つＴ細胞、及び腫瘍溶解性ウイルスを含むがん免疫療法が大きな進歩を遂げている。
腫瘍溶解性ウイルスは、天然に存在するウイルスまたは遺伝子改変されたウイルスであり、がん細胞に感染し、複製し、最終的には、健康な細胞を傷つけることなく、がん細胞を殺傷する。先般終了した切除不能なステージＩＩＩＢ、ＩＩＩＣまたはＩＶの黒色腫の患者４３６名における腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＴ－ＶＥＣの第ＩＩＩ相臨床試験では、持続的奏効率がＧＭ－ＣＳＦ投与患者における２．１％と比較して、Ｔ－ＶＥＣ投与患者では１６．３％であり、その主要評価項目を満たすことが報告された。この治験結果に基づき、ＦＤＡは２０１５年にＴ－ＶＥＣを承認した。
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス－１、ニューキャッスル病ウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、セネカバレーウイルス、及びワクシニアウイルスを含む、少なくとも８つの異なる種に由来する腫瘍溶解性ウイルスコンストラクトが臨床試験の様々な段階で試験されている。腫瘍溶解性ウイルスは、がん患者において忍容性が良好であることが明らかになっている。しかしながら、単独治療としての腫瘍溶解性ウイルスの臨床上の利益は、まだ限られている。前臨床試験と臨床試験のいずれにおいても、腫瘍溶解性ウイルスの安全性に対する懸念から、高度に弱毒化された腫瘍溶解性ウイルス（天然に弱毒であるか、または遺伝子操作により弱毒化されているもの）が使用されている。現在では腫瘍溶解性ウイルスの安全性が十分に確立されたことから、最大の抗腫瘍能力を有する腫瘍溶解性ウイルスを設計及び試験する時期に来ている。強力な腫瘍溶解効果を持つ腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原を大量に放出し、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む免疫細胞を刺激または活性化することで、強い免疫治療効果がもたらされる。
本出願は、異種タンパク質または核酸を発現する腫瘍溶解性ウイルスをがん細胞に送達するための方法及び組成物を提供する。
本出願の一態様は、１つ以上のヒトもしくは細菌シアリダーゼまたはそのシアリダーゼ触媒ドメインを含有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたは任意の他の好適な腫瘍溶解性ウイルスから得ることができる。好適な組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、シアリダーゼまたはシアリダーゼ活性を持つその一部分をコードする配列を含む発現カセットを、腫瘍溶解性ウイルスに挿入することによって作製することができる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。
多くのがん細胞は、高シアル化されている。本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、シアリダーゼを腫瘍細胞及び腫瘍微小環境に送達することが可能である。送達されたシアリダーゼは、腫瘍細胞上に存在するシアル酸を減少させ、免疫細胞、免疫細胞ベースの治療法及びがん細胞の高シアル化によって有効性が低下する他の治療薬による殺傷に対して、腫瘍細胞を脆弱化させる。例えば、免疫細胞上のＳｉｇｌｅｃｔ（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン）と呼ばれる一群の受容体は、腫瘍細胞上のシアル化複合糖鎖であるその抑制性受容体リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、シアル酸を除去することは、そのようなリガンドが免疫細胞上のＳｉｇｌｅｃｔに結合することを防ぎ、それにより、腫瘍細胞に対する免疫抑制をなくすことができる。
また、シアリダーゼを腫瘍微小環境に送達するための方法が提供される。腫瘍微小環境内において、シアリダーゼは、がん細胞上の末端シアル酸残基を除去することができ、それにより、免疫細胞または免疫療法試薬の侵入障壁を減らし、がん細胞に対する細胞免疫を促進することができる。
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、モルビリウイルス属ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、ポックスウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、及びその派生体からなる群から選択されるウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レオウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ＥｌＡＣＲ２欠失を有するアデノウイルスである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルスである。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスは、ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、Ｄｒｙｖａｘ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｍ６３、ＬＩＶＰ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＹＣＢＯＨ）、Ｄａｉｒｅｎ、Ｉｋｅｄａ、ＬＣ１６Ｍ８、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、ＩＨＤ－Ｊ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、Ｄａｉｒｅｎ Ｉ、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＣＬ、Ｌｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ、ＡＳ、及びその派生体からなる群から選択される株のものである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、対応する野生型株と比較してウイルスの免疫原性を減少させる１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルスであり、１つ以上の変異は、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１３、Ｌ１、Ｈ３、Ｄ８、Ａ３３、Ｂ５、Ａ５６、Ｆ１３、Ａ２８、及びＡ２７からなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ及びＬ１Ｒからなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルスであり、ウイルスは、（ａ）配列番号６６～６９のいずれか１つに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質、（ｂ）配列番号７０～７２または８５のいずれか１つに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質、（ｃ）配列番号７３に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ａ２７Ｌタンパク質、及び（ｄ）配列番号７４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）－Ｇａｌシアリダーゼ、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）－Ｇａｌシアリダーゼ、またはＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，８）－Ｇａｌシアリダーゼである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、細菌、ヒト、真菌、ウイルスシアリダーゼ及びその誘導体を含むエキソ型シアリダーゼ活性（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ＥＣ３．２．１．１８）を有する任意のタンパク質である。いくつかの実施形態において、細菌シアリダーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼからなる群から選択される。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ヒトシアリダーゼまたはその誘導体である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、またはＮＥＵ４である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、天然に存在するシアリダーゼである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、アンカリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、アンカリングドメインに融合されたシアリダーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、生理学的ｐＨで正に帯電する。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ＥＣ３．２．１．１８で定義されるエキソ型シアリダーゼ活性を有するタンパク質である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ＥＣ４．２．２．１５で定義されるアンヒドロシアリダーゼである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号１～３３または５３～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼはＤＡＳ１８１である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼに作動可能に連結される分泌配列を更にコードする。いくつかの実施形態において、分泌配列は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シアリダーゼ触媒ドメイン、ヒンジ領域、及び膜貫通ドメインを含む。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、シアリダーゼは、シアリダーゼのカルボキシ末端に位置するアンカリングドメインまたは膜貫通ドメインを含む。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、プロモーターは、初期プロモーター、中間プロモーター、または後期プロモーターまたは初期／後期ハイブリッドプロモーターであり得るウイルスプロモーターである。
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルスであり、プロモーターは、ポックスウイルス初期プロモーター、後期プロモーターまたはハイブリッド初期／後期プロモーターである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、プロモーターは、ウイルス後期プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｆ１７Ｒ後期プロモーター（配列番号６１）である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッド初期後期プロモーターである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトプロモーターの部分的または完全なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒトプロモーターは、組織または腫瘍特異的プロモーターである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、異種タンパク質または核酸をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態において、第２のヌクレオチド配列は、異種タンパク質をコードする。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、免疫チェックポイント阻害薬である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、またはＨＬＡ－Ｇの阻害薬である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、抗体である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、免疫抑制性受容体の阻害薬である。いくつかの実施形態において、免疫抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、またはＭＥＲＴＫである。いくつかの実施形態において、免疫抑制性受容体の阻害薬は、抗ＬＩＬＲＢ抗体である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、多重特異性免疫細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、サイトカイン、共刺激分子、腫瘍抗原提示タンパク質、抗血管新生因子、腫瘍関連抗原、外来抗原、及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）からなる群から選択される。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ＣＤ５５またはＣＤ５９の阻害薬である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ２、毒性を低下させたもしくは機能を向上させた改変ＩＬ－２、ＩＬ１８、ＩＬ－１８結合タンパク質への結合が少ないもしくは全くない改変ＩＬ－１８、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、もしくはＣＣＬ４、及び抗腫瘍免疫を依然として有するそのようなサイトカインの任意の改変形態、またはこれらのサイトカインの機能及び活性を遮断及び中和することができる任意の結合タンパク質の阻害薬である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、細菌ポリペプチドである。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、フィブリン－３、ＣＤＨ１７、及び臨床上意義のある他の腫瘍抗原からなる群から選択される腫瘍関連抗原である。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、ウイルスは、２つ以上の追加のヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、異種タンパク質をコードする。
本出願の一態様は、先行請求項のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本出願の一態様は、上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つを含むキャリア細胞を提供する。いくつかの実施形態において、キャリア細胞は、操作された免疫細胞または幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、またはＣＡＲ－ＮＫＴ細胞である。
本出願の一態様は、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルス、医薬組成物、またはキャリア細胞のいずれか１つの有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、方法は、上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つの有効量を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、キャリア細胞（例えば、免疫細胞または間葉系幹細胞などの幹細胞）を介して投与される。
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ネイキッドウイルスとして投与される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内への直接注射を介して投与される。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の免疫療法剤を個体に投与することを更に含む。いくつかの実施形態において、免疫療法剤は、単一特異性または多重特異性抗体、細胞療法、がんワクチン（例えば、樹状細胞ベースのがんワクチン）、サイトカイン、ＰＩ３Ｋガンマ阻害薬、ＴＬＲ９リガンド、ＨＤＡＣ阻害薬、ＬＩＬＲＢ２阻害薬、ＭＡＲＣＯ阻害薬、及び免疫チェックポイント阻害薬からなる群から選択される。
上記の方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態において、免疫療法剤は、細胞療法である。いくつかの実施形態において、細胞療法は、キメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む。
本出願の一態様は、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つを含み、キメラ受容体を発現する、操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。
本出願の一態様は、腫瘍を治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、（ａ）外来抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量、及び（ｂ）当該外来抗原を特異的に認識するキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。
本出願の一態様は、腫瘍を免疫療法に感作させる方法であって、上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルス、医薬組成物、または操作された免疫細胞のいずれか１つの有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。
本出願の一態様は、個体のがん細胞のシアル化を減少させる方法であって、上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルス、医薬組成物、または操作された免疫細胞のいずれか１つの有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。
上記の方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態において、キメラ受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ細胞である。
上記の方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、キメラ受容体を発現し、キメラ受容体は、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、フィブリン－３、ＣＤＨ１７、及び臨床上意義のある他の腫瘍抗原からなる群から選択される１つ以上の腫瘍抗原を特異的に認識する。
上記の方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、キメラ受容体を発現し、キメラ受容体は、シアリダーゼを特異的に認識する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１またはその誘導体であり、キメラ受容体は、ヒト天然型ノイラミニダーゼと交差反応しない抗ＤＡＳ１８１抗体を含む。
上記の方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態において、操作された免疫細胞及び組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、同時に投与される。
上記の方法のいずれか１つによるいくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、操作された免疫細胞の投与前に投与される。
また、任意の１つの上記方法において使用される組成物、キット及び製造品も提供される。
蛍光顕微鏡法によるＡ５４９細胞及びＭＣＦ細胞上の２，６シアル酸（ＦＩＴＣ－ＳＮＡによる）の検出を示す。ＦＩＴＣ－ＳＮＡ標識細胞（左）及び明視野細胞とのオーバーレイ（右）を示すために、Ａ５４９細胞及びＭＣＦ細胞を固定し、ＦＩＴＣ－ＳＮＡとともに３７℃で１時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡で画像化した。 ＤＡＳ１８１処理によるＡ５４９細胞上の２，６シアル酸、２，３シアル酸の効果的な除去、及びガラクトースの露出。腫瘍細胞上のシアル酸の効果的な除去を示すために、Ａ５４９をＤＡＳ１８１により３７℃で２時間処理し、染色試薬とともに１時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡で画像化した。 ＤＡＳ１８５処理ではなくＤＡＳ１８１処理によるＡ５４９細胞上の２，６シアル酸の効果的な除去。腫瘍細胞上の２，６シアル酸の効果的な除去を示すために、Ａ５４９をＤＡＳ１８１により３７℃で３０分間または２時間処理し、ＦＩＴＣ－ＳＮＡとともに１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用して調べた。 ＤＡＳ１８５処理ではなくＤＡＳ１８１処理によるＡ５４９細胞上の２，３シアル酸の効果的な除去。腫瘍細胞上の２，３シアル酸の効果的な除去を示すために、Ａ５４９をＤＡＳ１８１により３７℃で３０分間または２時間処理し、ＦＩＴＣ－ＭＡＬＩＩ とともに１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用して調べた。 ＤＡＳ１８５処理ではなくＤＡＳ１８１処理によるＡ５４９細胞上のガラクトースの効果的な露出。腫瘍細胞上のガラクトースの効果的な露出を示すために、Ａ５４９をＤＡＳ１８１により３７℃で３０分間または２時間処理し、ＦＩＴＣ－ＰＮＡとともに１時間インキュベートした後、フローサイトメトリーを使用して調べた。 ＤＡＳ１８１処理及びＰＢＭＣ刺激レジメンは、Ａ５４９－ｒｅｄ細胞増殖に影響しない。Ａ５４９－Ｒｅｄ細胞を２ｋ／ウェルで一晩播種し、続いて、左に列挙される試薬を含有する培地に交換した。ＩｎｃｕＣｙｔｅによるスキャンは、試薬を添加した直後（０時間）に開始し、３時間ごとにスケジュールした。Ａ５４９－ｒｅｄ細胞の増殖は、核（赤色）の数を解析することによってモニタリングされる。反応速度論的読み取り値により、ＰＢＭＣが存在しない場合、ビヒクル、ＤＡＳ１８１、または様々な刺激試薬がＡ５４９細胞の増殖に影響しないことが明白である。 ＤＡＳ１８１処理ありまたはなしでのドナー１由来のＰＢＭＣと共培養した後のＡ５４９－ｒｅｄ細胞の細胞毒性の検出。これらの結果から、ＤＡＳ１８１処理はドナー１由来のＰＢＭＣによる抗腫瘍細胞毒性を有意に高めることが示された。Ａ５４９－Ｒｅｄ細胞を２ｋ／ウェルで一晩播種し、続いて、培地（活性化なし）、ＣＤ３＋ＣＤ２８＋ＩＬ－２（Ｔ細胞活性化）、またはＣＤ３＋ＣＤ２９＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５＋ＩＬ－２１（Ｔ及びＮＫ細胞活性化）の存在下で、１００Ｋ／ウェルのドナー１のＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝５０：１）と共培養した。ＰＢＭＣ添加後０時間及び７２時間後にＩｎｃｕＣｙｔｅで代表的な画像を撮影した。 ＤＡＳ１８１処理ありまたはなしでのドナー２由来のＰＢＭＣと共培養した後のＡ５４９－ｒｅｄ細胞の細胞毒性の検出。これらの結果から、ＤＡＳ１８１処理はドナー２由来のＰＢＭＣによる抗腫瘍細胞毒性を有意に高めることが示された。Ａ５４９－Ｒｅｄ細胞を２ｋ／ウェルで一晩播種し、続いて、培地（活性化なし）、ＣＤ３＋ＣＤ２８＋ＩＬ－２（Ｔ細胞活性化）、またはＣＤ３＋ＣＤ２９＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５＋ＩＬ－２１（Ｔ及びＮＫ細胞活性化）の存在下で、１００ｋ／ウェルのドナー１のＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝５０：１）と共培養した。ＰＢＭＣ添加後０時間及び７２時間後にＩｎｃｕＣｙｔｅで代表的な画像を撮影した。 ＤＡＳ１８１処理ありまたはなしでのドナー１由来のＰＢＭＣと共培養した後のＡ５４９－ｒｅｄ細胞の細胞毒性の検出。これらの結果から、ＤＡＳ１８１処理はドナー１由来のＰＢＭＣによる抗腫瘍細胞毒性を有意に高めることが示された。Ａ５４９－ｒｅｄ腫瘍細胞を９６ウェルプレートに２ｋ細胞／ウェルで播種した。一晩インキュベーションした後、（Ａ）培地、（Ｂ）ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ－２、または（Ｃ）ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１と混合したドナー１由来のＰＢＭＣを指定のＥ：Ｔ比で各ウェルに加えた。この時点でＤＡＳ１８１（１００ｎＭ）を加えた。プレートを、３時間ごとに合計７２時間、ＩｎｃｕＣｙｔｅによってスキャンした。増殖は、ＲＦＰ細胞数を解析することによってモニタリングされる。 ＤＡＳ１８１処理ありまたはなしでのドナー２由来のＰＢＭＣと共培養した後のＡ５４９－ｒｅｄ細胞の細胞毒性の検出。これらの結果から、ＤＡＳ１８１処理はドナー２由来のＰＢＭＣによる抗腫瘍細胞毒性を有意に高めることが示された。Ａ５４９－ｒｅｄ腫瘍細胞を９６ウェルプレートに２ｋ細胞／ウェルで播種した。一晩インキュベーションした後、（Ａ）培地、（Ｂ）ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ－２、または（Ｃ）ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－２１と混合したドナー２由来のＰＢＭＣを指定のＥ：Ｔ比で各ウェルに加えた。この時点でＤＡＳ１８１（１００ｎＭ）を加えた。プレートを、３時間ごとに合計７２時間、ＩｎｃｕＣｙｔｅによってスキャンした。増殖は、ＲＦＰ細胞数を解析することによってモニタリングされる。 ＤＡＳ１８１は、ＭＴＳアッセイによる測定において、ワクシニアウイルスによるＮＫ媒介性腫瘍溶解を増大させる。★＝Ｔ検定のＰ値＜０．０５は、ＤＡＳ１８１単独が、酵素死ＤＡＳ１８５と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＫ細胞媒介性Ｕ８７腫瘍殺傷を高めることを示唆している。＊＝Ｔ検定のＰ値＜０．０５。 ＤＡＳ１８１は、ＭＴＳアッセイによる測定において、ワクシニアウイルスによるＮＫ媒介性腫瘍殺傷を増加させる。＊＝Ｔ検定のＰ値＜０．０５は、ＤＡＳ１８１が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＶによるＮＫ細胞媒介性Ｕ８７腫瘍殺傷を増加させることを示唆している。 ＤＡＳ１８１は、単独培養したまたはＶＶ感染腫瘍細胞に曝露したヒトＤＣ細胞において、成熟マーカー（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－Ｄｒ、ＨＬＡ－ＡＢＣ）の発現を有意に増大させた。＊＝：Ｔ検定のＰ値＜０．０５。 ＤＡＳ１８１は、ＴＨＰ－１由来マクロファージによるＴＮＦ－アルファ産生を有意に増大させた。＊＝Ｔ検定のＰ値＜０．０５ ＤＡＳ１８１処理は、腫瘍溶解性アデノウイルスを媒介とした腫瘍細胞殺傷及び成長阻害を増加させた。Ａ５４９－ｒｅｄ腫瘍細胞を９６ウェルプレートに２Ｋ細胞／ウェルで播種した。一晩インキュベーションした後、ＤＡＳ１８１ビヒクル、腫瘍溶解性アデノウイルス、及びＤＡＳ１８１を指定のとおり加えた。ＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ－２も先に記載の量で各ウェルに加えた。グラフから、ＤＡＳ１８１＋腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞増殖を効果的に減少させることが示された。 ＤＡＳ１８１処理は、腫瘍溶解性ウイルスによるＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞殺傷を増大させる。Ａ５４９－ｒｅｄ腫瘍細胞を９６ウェルプレートに２Ｋ細胞／ウェルで播種した。一晩インキュベーションした後、新鮮なＰＢＭＣを１０Ｋ／ウェルの濃度で加えた。ＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＤＡＳ１８１、及び腫瘍溶解性アデノウイルスをグラフに示されるとおりに加え、ＩｎｃｕＣｙｔｅによる時間指定スキャンをした。グラフから、ＤＡＳ１８１＋腫瘍溶解性アデノウイルスがヒトＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞排除を劇的に増大させることが示された。 ＤＡＳ１８１処理は、腫瘍溶解性ウイルスによるＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞殺傷を増大させる。Ａ５４９－ｒｅｄ腫瘍細胞を９６ウェルプレートに２Ｋ細胞／ウェルで播種した。一晩インキュベーションした後、新鮮なＰＢＭＣを４０Ｋ／ウェルの濃度で加えた。ＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－２、ＤＡＳ１８１、及び腫瘍溶解性アデノウイルスをグラフに示されるとおりに加え、ＩｎｃｕＣｙｔｅによる時間指定スキャンをした。グラフから、ＤＡＳ１８１＋腫瘍溶解性アデノウイルスがヒトＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞排除を劇的に増大させることが示された。 シアリダーゼをコードするワクシニアウイルスコンストラクトの一部の模式図。 シアリダーゼ－ＶＶによって発現されたＤＡＳ１８１は、シアル酸含有基質に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有する。０．５ｎＭ、１ｎＭ、及び２ｎＭでのＤＡＳ１８１活性の標準曲線。 シアリダーゼ－ＶＶによって発現されたＤＡＳ１８１は、シアル酸含有基質に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有する。シアリダーゼ－ＶＶを感染させた１×１０６細胞は、１ｍｌ培地中ＤＡＳ１８１ ０．７８ｎＭ～１．２１ｎＭに相当するＤＡＳ１８１をｉｎ ｖｉｔｒｏで発現する。 シアリダーゼ－ＶＶは、樹状細胞成熟を増大させる。ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ４由来ヒトＤＣをＳｉａｌ－ＶＶまたはＶＶ感染Ｕ８７腫瘍細胞溶解物とともに２４時間培養した。ＬＰＳを対照として使用した。ＤＣを回収し、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＨＬＡ－ＡＢＣに対する抗体で染色した。ＤＣ成熟マーカーの発現をフロー解析によって決定した。結果から、Ｓｉａｌ－ＶＶがＤＣ成熟を増大させることが示唆された。＊＝Ｔ検定のＰ値＜０．０５ シアリダーゼ－ＶＶは、Ｔ細胞によるＩＦＮ－ガンマ及びＩＬ２発現を誘導した。ＣＤ３抗体活性化ヒトＴ細胞をＡ５９４腫瘍細胞とＳｉａｌ－ＶＶまたはＶＶ感染腫瘍細胞溶解物の存在下で２４時間共培養し、サイトカインＩＦＮｒまたはＩＬ－２の発現をＥＬＩＳＡによって測定した。結果から、Ｓｉａｌ－ＶＶ感染腫瘍細胞溶解物がヒトＴ細胞によるＩＦＮｒ及びＩＬ２発現を誘導することが示唆された。＊＝Ｔ検定のＰ値＜０．０５ シアリダーゼ－ＶＶは、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞溶解活性を増大させる。ＣＤ３ Ａｂで活性化したヒトＴ細胞をＳｉａｌ－ＶＶまたはＶＶ感染Ａ５９４腫瘍細胞と２４時間共培養し、腫瘍細胞生存率をＭＴＳアッセイによって決定した。結果から、腫瘍細胞のＳｉａｌ－ＶＶ感染が腫瘍殺傷を増大させることが示唆された。＊＝Ｔ検定のＰ値＜０．０５。 ＤＡＳ１８１ならびに分泌シアリダーゼコンストラクト１、２、及び３の細胞表面α２，３シアル酸（Ａ）；α２，６シアル酸（Ｂ）；及びガラクトース（Ｃ）に対する影響。Ａ：Ａ５４９－ｒｅｄ細胞にコンストラクト１、２または３をトランスフェクトした。一晩インキュベーションした後、トランスフェクトした細胞を取り、２４ウェルプレートに再播種した。更に２４時間、４８時間及び７２時間後、細胞を固定し、ＭＡＬＩＩ－ＦＩＴＣで１時間染色した後、フローを実施した。トランスフェクトしていない細胞を１００ｎＭのＤＡＳ１８１で２時間処理した後、固定する。ＤＡＳ１８１のために調製したビヒクルを使用して、対照の別のトランスフェクトしていない細胞セットを処理した。Ｂ：Ａ５４９－ｒｅｄ細胞にコンストラクト１、２及び３をトランスフェクトした。一晩インキュベーションした後、トランスフェクトした細胞を取り、２４ウェルプレートに再播種した。更に２４時間、４８時間及び７２時間後、細胞を固定し、ＳＮＡ－ＦＩＴＣで１時間染色した後、フローを実施した。トランスフェクトしていない細胞を１００ｎＭのＤＡＳ１８１で２時間処理した後、固定する。ＤＡＳ１８１のために調製したビヒクルを使用して、対照の別のトランスフェクトしていない細胞セットを処理した。Ｃ：Ａ５４９－ｒｅｄ細胞にコンストラクト１、２及び３をトランスフェクトした。一晩インキュベーションした後、トランスフェクトした細胞を取り、２４ウェルプレートに再播種した。更に２４時間、４８時間及び７２時間後、細胞を固定し、ＰＮＡ－ＦＩＴＣで１時間染色した後、フローを実施した。トランスフェクトしていない細胞を１００ｎＭのＤＡＳ１８１で２時間処理した後、固定する。ＤＡＳ１８１のために調製したビヒクルを使用して、対照の別のトランスフェクトしていない細胞セットを処理した。 ＤＡＳ１８１ならびに膜貫通シアリダーゼコンストラクト１、４、５及び６の細胞表面α２，３シアル酸（Ａ）；α２，６シアル酸（Ｂ）；及びガラクトース（Ｃ）に対する影響。Ａ：Ａ５４９－ｒｅｄ細胞にコンストラクト１、４、５、及び６をトランスフェクトした。一晩インキュベーションした後、トランスフェクトした細胞を取り、２４ウェルプレートに再播種した。更に２４時間、４８時間及び７２時間後、細胞を固定し、ＭＡＬＩＩ－ビオチン化で１時間染色し、続いて、ＦＩＴＣ－ストレプトアビジンで更に１時間染色した。２、３－シアル酸レベルをフローサイトメトリーによって検出した。Ｂ：Ａ５４９－ｒｅｄ細胞にコンストラクト１、４、５、及び６をトランスフェクトした。一晩インキュベーションした後、トランスフェクトした細胞を取り、２４ウェルプレートに再播種した。更に２４時間、４８時間及び７２時間、細胞を固定し、ＳＮＡ－ＦＩＴＣで１時間染色した。２，６－シアル酸レベルをフローサイトメトリーによって検出した。Ｃ：Ａ５４９－ｒｅｄ細胞にコンストラクト１、４、５、及び６をトランスフェクトした。一晩インキュベーションした後、トランスフェクトした細胞を取り、２４ウェルプレートに再播種した。更に２４時間、４８時間及び７２時間後、細胞を固定し、ＰＮＡ－ＦＩＴＣで１時間染色した。ガラクトースレベルをフローサイトメトリーによって検出した。 コンストラクト１の安定発現は、腫瘍溶解性ウイルス及びＰＢＭＣを媒介としたＡ５４９細胞の殺傷を増加させる。新鮮な単離ＰＢＭＣを、Ａ５４９－ｒｅｄ親細胞のみ、またはコンストラクト１を安定発現する細胞、またはコンストラクト１を安定発現する１ＭＯＩもしくは５ＭＯＩの細胞とともに２つの別個のプレート（プレート２及び４）でインキュベートした。 コンストラクト４の安定発現は、腫瘍溶解性ウイルス及びＰＢＭＣを媒介としたＡ５４９細胞の殺傷を増加させる。新鮮な単離ＰＢＭＣを活性化し、Ａ５４９－ｒｅｄ細胞のみ、またはコンストラクト４を安定発現する細胞、またはコンストラクト４を安定発現する１ＭＯＩもしくは５ＭＯＩ ＯＬの細胞とともに２つの別個のプレート（プレート２及び４）でインキュベートした。 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＶＶのＴＫ遺伝子を組み換えてシアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルスを作製するための例示的なシアリダーゼ発現コンストラクトの設計。細胞内シアリダーゼ、アンカリングドメインを含む分泌シアリダーゼ、及び膜貫通ドメインを含む細胞表面発現シアリダーゼについて、例示的をコンストラクトを示す。 シアリダーゼ発現のＰＣＲ検出：ＣＶ－１細胞にシアリダーゼ－ＶＶを０．２のＭＯＩで感染させた。４８時間後、ＣＶ－１細胞を回収し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＤＮＡを抽出し、シアリダーゼＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ＰＣＲは、標準的なＰＣＲプロトコルを使用して実施した。予想されるＰＣＲ産物のサイズは、１２５１ｂｐである。 Ｕ８７またはＣＶ－１細胞を対照ＶＶ、ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉａｌ－ＶＶまたはＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶにＭＯＩ１で感染させた。細胞を２４、４８、７２、または９６時間に回収した。ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。 Ｕ８７腫瘍細胞を対照ＶＶ、ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉａｌ－ＶＶまたはＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶにＭＯＩ０．１、１、または５で感染させた。腫瘍殺傷をＭＴＳアッセイによって測定した。 ＤＣ成熟マーカーＨＬＡ－ＡＢＣの発現は、分泌または膜貫通シアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルスとの培養によって増大する。 ＤＣ成熟マーカーＨＬＡ－ＤＲの発現は、分泌または膜貫通シアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルスとの培養によって増大する。 ＤＣ成熟マーカーＣＤ８０の発現は、分泌または膜貫通シアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルスとの培養によって増大する。 ＤＣ成熟マーカーＣＤ８６の発現は、分泌または膜貫通シアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルスとの培養によって増大する。 Ｓｉａｌ－ＶＶは、ＮＫ媒介性腫瘍溶解をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させる。陰性選択したヒトＮＫ細胞（Ａｓｔａｒｔｅ、ＷＡ）及びＶＶ－Ｕ８７細胞（ＡＴＣＣ、ＶＡ）を共培養し、腫瘍殺傷有効性をＬＤＨアッセイ（Ａｂｃａｍ、ＭＡ）によって測定した。この結果により、Ｓｉａｌ－ＶＶがＮＫ細胞媒介性Ｕ８７腫瘍殺傷をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させることが示唆された。（＊Ｐ値は、Ｕ８７及びＮＫ培養におけるＳｉａｌ－ＶＶ対モックＶＶ）。 結果は、ＴＭ－ｓｉａｌ－ＶＶが対照ＶＶと比較して腫瘍成長をｉｎ ｖｉｖｏで有意に阻害したことを示す（マウスの右脇腹に接種した腫瘍細胞）。 結果は、ＴＭ－ｓｉａｌ－ＶＶが対照ＶＶと比較して腫瘍成長をｉｎ ｖｉｖｏで有意に阻害したことを示す（マウスの左脇腹に接種した腫瘍細胞）。 マウス体重は、Ｓｉａｌ－ＶＶまたはＶＶの処理による影響を受けなかった。マウスの体重に結果の差はみられなかった。 シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を有意に増大させた。＊ｐ値：処理群対対照ＶＶ群。結果の定量を示す。 シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を有意に増大させた。＊ｐ値：処理群対対照ＶＶ群。ＦＡＣＳプロットを示す。 ＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶは、対照ＶＶと比較して腫瘍内のＴｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を減少させた。＊ｐ値：処理群対対照ＶＶ群。 シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内ＮＫ及びＮＫＴ細胞浸潤を有意に増大させた。＊ｐ値：処理群対対照ＶＶ群。 ＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶは、腫瘍細胞内でＰＤ－Ｌ１発現を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。
本出願は、シアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）を用いて、がんを治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、シアリダーゼを腫瘍細胞及び／または腫瘍細胞環境に送達することが可能である。いくつかの実施形態において、送達されたシアリダーゼは、腫瘍細胞または免疫細胞上に存在するシアル酸を減少させ、免疫細胞、免疫細胞ベースの治療法及び／またはがん細胞の高シアル化によって有効性が低下する他の治療薬による殺傷に対して、腫瘍細胞を脆弱化させる。いくつかの実施形態において、送達されたシアリダーゼは、免疫細胞上のＳｉｇｌｅｃｔとその抑制性受容体リガンド（シアル化複合糖鎖）との結合を減少または阻害する。したがって、いくつかの実施形態において、送達されたシアリダーゼは、腫瘍細胞に対する免疫抑制を減少または消失させる。いくつかの実施形態において、送達されたシアリダーゼ（例えば、細菌シアリダーゼ）は、外来抗原として機能し、腫瘍細胞上でのその発現は、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強させる。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスを発現するキャリア細胞（例えば、操作された免疫細胞または幹細胞）を介して送達される。いくつかの実施形態において、方法は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍作用を増強する（例えば、腫瘍溶解性ウイルスによって送達されるシアリダーゼなどの外来抗原を標的とするキメラ受容体を発現することによる）、操作された免疫細胞を投与することを更に含む。
Ｉ．定義
本明細書において、以下のように別途定義されない限り、当該技術分野において一般的に使用される用語が使用される。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む、有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本出願上、有用なまたは望ましい臨床結果には、次のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：疾患に起因する１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の防止または遅延）、疾患の拡大の防止もしくは遅延、疾患の発生もしくは再発の防止もしくは遅延、疾患の進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善、疾患の寛解（部分または全体）の提供、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の向上、及び／または生存の延長。疾患の病理学的結果の低減も「治療」に包含される。本出願の方法は、治療のこれらの態様のうちのいずれか１つ以上を企図する。
「個体」、「対象」及び「患者」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を記載するために本明細書中で区別なく使用される。いくつかの実施形態において、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、個体は、がんを罹患している。いくつかの実施形態において、個体は、治療を必要としている。
当該技術分野において理解されるように、「有効量」は、所望の治療結果（例えば、がんの１つ以上の症状の重症度もしくは持続期間の低減、重症度の安定化、または排除）をもたらすのに十分な組成物の量を指す。治療的使用の場合、有益なまたは望ましい結果は、例えば、疾患に起因する１つ以上の症状（生化学的、組織学的及び／または行動学的）ならびに疾患の発症中に現れる合併症及び中間の病理学的表現型の軽減、疾患を罹患する者の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の減少、別の薬剤の作用増強、疾患の進行の遅延、及び／または患者の生存延長を含む。いくつかの実施形態において、治療薬の有効量は、生存の延長（全生存期間及び無増悪生存期間を含む）、客観的な応答（完全奏効または部分奏効を含む）、疾患もしくは病態の１つ以上の徴候もしくは症状のある程度の緩和、及び／または対象の生活の質の改善をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者によって理解される技術用語であり、変異型またはバリアント型とは区別される、自然に発生する生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
「非天然」または「操作された」という用語は、区別なく使用され、人の手が加わっていることを示す。核酸分子またはポリペプチドについて言及する場合、この用語は、その核酸分子またはポリペプチドが、自然界において元来関連し、自然界においてみられる少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「シアリダーゼ」は、糖タンパク質または糖脂質上の炭水化物から末端シアル酸を切断することを触媒することが可能な天然に存在するまたは操作されたシアリダーゼを指す。本明細書で使用される場合、「シアリダーゼ」は、糖タンパク質または糖脂質上の炭水化物から末端シアル酸を切断することを触媒することが可能な天然に存在するまたは非天然のシアリダーゼのドメインを指し得る。「シアリダーゼ」という用語はまた、天然に存在するもしくは非天然のシアリダーゼタンパク質またはその酵素的に活性な断片もしくはドメイン、及びその別のポリペプチド、断片またはドメイン、例えば、アンカリングドメインまたは膜貫通ドメインを含む融合タンパク質を包含する。
本明細書で使用される「シアリダーゼ」という用語は、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質を包含する。「シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質」は、シアリダーゼの触媒ドメイン、またはシアリダーゼの触媒ドメインと実質的に相同であるが、シアリダーゼの全アミノ酸配列を含まないアミノ酸配列を含む、タンパク質である。触媒ドメインは、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質が、触媒ドメインの由来となるインタクトなシアリダーゼとしての機能活性を実質的に保持する場合、由来する。シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、シアリダーゼに由来しないアミノ酸配列を含み得る。シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、１つ以上の他の既知のタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、またはそれと実質的に相同であるアミノ酸配列を含み得、あるいは、他の既知のタンパク質のアミノ酸配列に由来しないか、または実質的に相同でない１つ以上のアミノ酸を含み得る。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から転写されるプロセス（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などへ）及び／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体など）、ヒト化抗体、キメラ抗体、完全長抗体及びその抗原結合断片、一本鎖Ｆｖ、ナノボディ、Ｆｃ融合タンパク質（所望の抗原結合活性を呈する場合に限る）を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。抗体及び／または抗体断片は、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ化抗体可変ドメイン及びヒト化型、サメ抗体可変ドメイン及びヒト化型、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来し得る。
「組み換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターを参照して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入または天然型の核酸もしくはタンパク質の改変によって改変されていること、あるいは、細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。
「ウイルス」または「ウイルス粒子」という用語は、ウイルス学におけるその通常の単純な意味に従って使用され、ウイルスゲノム（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖）、ウイルスカプシド及び関連タンパク質、ならびにエンベロープウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）の場合には脂質及び任意選択により宿主細胞膜の成分、及び／またはウイルスタンパク質を含むエンベロープを含む、ビリオンを指す。
本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍を有する対象において、腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を選択的に殺傷するウイルスを指す。これらには、腫瘍細胞において天然に優先的に複製及び蓄積するポックスウイルスなどのウイルス、及びそのように操作されたウイルスなどが含まれる。一部の腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染した後、腫瘍細胞を殺傷することができる。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を溶解するか、または腫瘍細胞の細胞死を誘導することによって、腫瘍細胞の死を引き起こすことができる。例示的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、パピローマウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ピコマウイルス、シンドビスウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、及びコクサッキーウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
「ポックスウイルス」という用語は、ウイルス学におけるその通常の単純な意味に従って使用され、脊椎動物及び無脊椎動物に感染することが可能で、宿主の細胞質内で複製するＰｏｘｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーを指す。実施形態において、ポックスウイルスビリオンは、直径約２００ｎｍ及び長さ約３００ｎｍのサイズを有し、典型的に１３０～３７５キロベースのゲノムを単一の線状二本鎖ＤＮＡセグメントで保有する。ポックスウイルスという用語は、限定するものではないが、ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科の全ての属（例えば、ベータエントモポックスウイルス、ヤタポックスウイルス、セルビドポックスウイルス、ガンマエントモポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、クロコダイリドポックスウイルス、アルファエントモポックスウイルス、カプリポックスウイルス、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、及びパラポックスウイルス）を含む。実施形態において、ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サルポックスウイルス）、パラポックスウイルス（例えば、オルフウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス）、ヤタポックスウイルス（例えば、タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス）またはモルシポックスウイルス（例えば、伝染性軟属腫ウイルス）である。実施形態において、ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス（例えば、牛痘ウイルス株Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、ラクーンポックスウイルス株Ｈｅｒｍａｎ、ウサギポックスウイルス株Ｕｔｒｅｃｈｔ、ワクシニアウイルス株ＷＲ、ワクシニアウイルス株ＩＨＤ、ワクシニアウイルス株Ｅｌｓｔｒｅｅ、ワクシニアウイルス株ＣＬ、ワクシニアウイルス株Ｌｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ、またはワクシニアウイルス株ＡＳ）である。実施形態において、ポックスウイルスは、パラポックスウイルス（例えば、オルフウイルス株ＮＺ２または偽牛痘ウイルス株ＴＪＳ）である。
本明細書で使用される場合、「改変されたウイルス」または「組み換えウイルス」は、ウイルスの親株と比較してそのゲノムに変更があるウイルスを指す。典型的に、改変されたウイルスは、ウイルスの親株のゲノムに１つ以上のヌクレオチドの切断、置換（交換）、変異、挿入（付加）または欠失（切断）を有する。改変されたウイルスは、１つ以上の内因性ウイルス遺伝子が改変され、及び／または１つ以上の遺伝子間領域が改変され得る。例示的な改変されたウイルスは、ウイルスのゲノムに挿入された１つ以上の異種ヌクレオチド配列を有し得る。改変されたウイルスは、異種遺伝子を発現させるための遺伝子発現カセットの形態で、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を含有し得る。改変は、遺伝子工学及び組み換えＤＮＡ方法などの本明細書で提供される方法を含む、当業者に知られている任意の方法を使用して行うことができる。
本明細書で同定されるポリペプチド及び抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮して配列を整列させた後、比較されるポリペプチド内のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、またはＭＵＳＣＬＥソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを評価するのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本発明の目的上、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＭＵＳＣＬＥを使用して生成される（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（５）：１７９２－１７９７，２００４；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５（１）：１１３，２００４，そのそれぞれは、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される）。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体またはダイアボディが結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特定の一群を指す。２つの抗体または抗体部分が抗原に対して競合的な結合を示す場合、それらは抗原内の同じエピトープに結合し得る。
「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、本明細書において、あらゆる長さのタンパク質断片、融合タンパク質及び改変されたタンパク質、例えば、限定するものではないが、糖タンパク質、ならびに他の全ての種類の改変されたタンパク質（例えば、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、ポリグルタミル化、ＡＤＰリボース化、ペグ化、ビオチン化などから生じるタンパク質）を含む、全ての種類の天然に存在するタンパク質及び合成タンパク質を包含するように使用される。
明細書で使用される場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、及び「特異的である」という用語は、標的と抗体（ダイアボディなど）との間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。ある特定の実施形態において、特異的結合は、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体）を含む不均質な分子集団の存在下において標的の存在を決定付けるものである。例えば、標的（エピトープであり得る）を特異的に認識する抗体は、他の分子に結合する場合よりも大きな親和性、アビディティで、より容易に、及び／またはより長い時間、この標的に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体が無関係の分子に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体の標的への結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態において、標的に特異的に結合する抗体は、≦１０－５Ｍ、≦１０－６Ｍ、≦１０－７Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦１０－９Ｍ、≦１０－１０Ｍ、≦１０－１１Ｍ、または≦１０－１２Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、異なる種に由来するタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、これを必要とするものではない。抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該技術分野において知られている方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。
「同時投与」という用語は、本明細書で使用される場合、併用療法における第１の治療法及び第２の治療法が、約１５分を超えない、例えば、約１０、５、または１分のいずれかを超えない時間間隔で実施されることを意味する。第１及び第２の治療法が同時に実施される場合、第１及び第２の治療法は、同じ組成物中に含有されてもよいし（例えば、組成物は第１及び第２の両方の治療法を含む）、別個の組成物中に含有されてもよい（例えば、第１の治療法が１つの組成物に、第２の治療法がもう１つの組成物に含有される）。
本明細書で使用される場合、「順次投与」という用語は、併用療法における第１の治療法及び第２の治療法が、約１５分を超える、例えば、２０、３０、４０、５０、６０分以上のいずれかを超える時間間隔で実施されることを意味する。第１の治療法または第２の治療法のいずれかが最初に実施され得る。第１及び第２の治療法は、別個の組成物中に含有され、同じまたは異なる包装またはキットに収容され得る。
本明細書で使用される場合、「並行投与」という用語は、併用療法における第１の治療法の実施と第２の治療法の実施が互いに重複することを意味する。
「医薬組成物」という用語は、その中に含有される有効成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ当該製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性がある追加の成分を何ら含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、有効成分以外の医薬製剤中の１つ以上の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、抗凍結剤、等張化剤、保存剤、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、毒性試験及び製造試験の必要基準を満たしており、及び／または米国食品医薬品局もしくは他の州／連邦政府によって作成されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに収載されているか、哺乳動物、より具体的にはヒトでの使用について、米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されているものである。
「添付文書」という用語は、治療用製品の商業包装に通常含まれる説明書を指すために使用され、かかる治療用製品の適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／または使用に関する警告についての情報が含まれる。
「製造物品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患もしくは病態（例えば、がん）の治療のための医薬品、または本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む、任意の製造品（例えば、包装または容器）またはキットである。ある特定の実施形態において、製造品またはキットは、本明細書に記載される方法を実施するためのユニットとして、宣伝、配布、または販売される。
本明細書に記載される本発明の実施形態は、実施形態「からなる」こと及び／または実施形態「から基本的になる」ことを含むことが理解される。
本明細書において、ある値またはパラメータに関する「約」の言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変形形態を含む（及び記載する）ものである。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」についての記載を含む。
本明細書で使用される場合、ある値またはパラメータに関する「ない」という言及は、一般に、その値またはパラメータ「以外」を意味し、それを記載するものである。例えば、方法がタイプＸの疾患を治療するために使用されないということは、その方法がＸ以外のタイプの疾患を治療するために使用されることを意味する。
本明細書で使用される「約Ｘ～Ｙ」という用語は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上、別途明記されない限り、複数の指示物を含む。
本明細書において、「Ａ及び／またはＢ」などのフレーズで使用される「及び／または」という用語は、ＡとＢの両方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；及びＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、本明細書において、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などのフレーズで使用される「及び／または」という用語は、次の実施形態のいずれをも包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
ＩＩ．組成物
本出願は、がんを治療することを、それを必要とする個体において行うための組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態において、本出願は、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、異種タンパク質または核酸をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む。
いくつかの実施形態において、本出願は、シアリダーゼをコードする第１のヌクレオチド配列及び異種タンパク質または核酸をコードする第２のヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供し、第１のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結され、第２のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は、同じプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、２つ以上のヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、異種タンパク質または核酸をコードする。いくつかの実施形態において、第２のヌクレオチド配列は、免疫チェックポイント阻害薬、免疫抑制性受容体の阻害薬、多重特異性免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＢｉＴＥ）、サイトカイン、共刺激分子、腫瘍抗原提示タンパク質、抗血管新生因子、腫瘍関連抗原、外来抗原、及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、マクロファージまたは単球機能の制御分子（ＬＩＬＲＢに対する抗体）、葉酸受容体ベータに対する抗体、腫瘍細胞特異的抗原（ＣＤ１９、ＣＤＨ１７など）または腫瘍スカフォールド（ＦＡＰ、フィブリン－３など）に対する抗体からなる群から選択される異種タンパク質をコードする。
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、モルビリウイルス属ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、ポックスウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス（Ａｄ）、及びその派生体からなる群から選択されるウイルスである。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスの免疫原性が減少するように改変される。好適な腫瘍溶解性ウイルス及びその派生体は、以下の「腫瘍溶解性ウイルス」のサブセクションに記載される。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする第１のヌクレオチド配列を含む組み換えワクシニアウイルスが提供され、第１のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、異種タンパク質、例えば、免疫チェックポイント阻害薬、免疫抑制性受容体の阻害薬、サイトカイン、共刺激分子、腫瘍抗原提示タンパク質、抗血管新生因子、腫瘍関連抗原、外来抗原、もしくはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、マクロファージもしくは単球機能の制御分子（ＬＩＬＲＢに対する抗体）、葉酸受容体ベータに対する抗体、腫瘍細胞特異的抗原（ＣＤ１９、ＣＤＨ１７など）または腫瘍スカフォールド（ＦＡＰ、フィブリン－３など）に対する抗体をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含み、第２のヌクレオチド配列は、同じまたは異なるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルスであり、１つ以上の変異は、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１３、Ｌ１、Ｈ３、Ｄ８、Ａ３３、Ｂ５、Ａ５６、Ｆ１３、Ａ２８、及びＡ２７からなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ及びＬ１Ｒからなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする第１のヌクレオチド配列を含む組み換えワクシニアウイルスが提供され、第１のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、異種タンパク質をコードする第２のヌクレオチドを更に含み、異種タンパク質は、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、Ｈ因子、Ｃ４結合タンパク質、または他の同定されている補体活性化調節因子などの膜結合補体活性化調節因子であり、第２のヌクレオチド配列は、同じまたは異なるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルスであり、１つ以上の変異は、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１３、Ｌ１、Ｈ３、Ｄ８、Ａ３３、Ｂ５、Ａ５６、Ｆ１３、Ａ２８、及びＡ２７からなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ及びＬ１Ｒからなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある。
本出願は、以下に記載される異種タンパク質または核酸をコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）を提供する。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、シアリダーゼをコードする。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ヒトまたは細菌シアリダーゼである。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、分泌シアリダーゼである。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜アンカリング部分または膜貫通ドメインを含む。好適なシアリダーゼ及びその誘導体またはバリアントは、以下の「シアリダーゼ」のサブセクションに記載される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、以下の「他の異種タンパク質または核酸」のサブセクションに記載されるように、免疫応答を促進するか、または免疫抑制性タンパク質を阻害する１つ以上の異種タンパク質または核酸をコードする。
いくつかの実施形態において、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼまたはその誘導体をコードする第１のヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）が提供され、第１のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、異種タンパク質（例えば、免疫チェックポイント阻害薬、免疫抑制性受容体の阻害薬、サイトカイン、共刺激分子、腫瘍抗原提示タンパク質、抗血管新生因子、腫瘍関連抗原、外来抗原、またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ））をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含み、第２のヌクレオチド配列は、同じまたは異なるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、エンベロープウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）であり、異種タンパク質は、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、Ｈ因子、Ｃ４結合タンパク質、または他の同定されている補体活性化調節因子などの膜結合補体活性化調節因子である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号１または２６のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、アンカリングドメインを含むシアリダーゼ（例えば、ＤＡＳ１８１）をコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）が提供される。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、異種タンパク質または核酸をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインである。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、生理学的ｐＨで正に帯電する。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、シアリダーゼのカルボキシ末端に位置する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼに由来する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼに作動可能に連結される分泌配列を更にコードする。いくつかの実施形態において、分泌配列は、シアリダーゼのアミノ末端に作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインを含むシアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）が提供される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号４５～５２から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、異種タンパク質または核酸をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼに由来する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼに作動可能に連結される分泌配列を更にコードする。
異種タンパク質または核酸（例えば、シアリダーゼタンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、初期、後期、または初期／後期ウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトプロモーター（例えば、組織または腫瘍特異的プロモーター）のプロモーター配列を含む。好適なプロモーターは、以下の「異種タンパク質または核酸の発現のためのプロモーター」のサブセクションに記載される。
本出願は、がんの治療を必要とする個体におけるがんの治療のための操作された免疫細胞を更に提供する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、腫瘍抗原を特異的に認識するキメラ受容体を含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによってコードされる外来抗原（例えば、細菌シアリダーゼ）を特異的に認識するキメラ受容体を含む。好適な操作された免疫細胞は、「操作された免疫細胞」のサブセクションに記載される。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む操作された免疫細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、ＷｅｓｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ株である。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、改変されたワクシニアウイルスである（例えば、１つ以上の変異を含むワクシニアウイルスであり、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１３、Ｌ１、Ｈ３、Ｄ８、Ａ３３、Ｂ５、Ａ５６、Ｆ１３、またはＡ２８などの１つ以上のタンパク質に変異がある）。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼに由来する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼに作動可能に連結される分泌配列を更にコードする。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜貫通ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、キメラ受容体をコードする。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、キメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、患者の自己細胞または同種細胞である。
いくつかの実施形態において、（ａ）外来抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルス、及び（ｂ）当該外来抗原を特異的に認識するキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、外来抗原は、細菌抗原である。いくつかの実施形態において、外来抗原は、シアリダーゼである。
本出願は、本明細書で提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つを含む免疫細胞を更に提供する。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む免疫細胞は、免疫細胞を組み換え腫瘍溶解性ウイルスとともにインキュベートすることによって調製される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む免疫細胞は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスをコードするヌクレオチド配列を用いて細胞を操作することによって（例えば、細胞にコンストラクトを形質導入またはトランスフェクトすることによって）調製される。組み換え腫瘍溶解性ウイルスを発現する好適な免疫細胞及びその調製方法は、「腫瘍溶解性ウイルス及び操作された免疫細胞」のサブセクションに記載される。
Ａ．腫瘍溶解性ウイルス
本出願は、異種タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、がんの治療に使用するための組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、シアリダーゼである。
ワクシニアウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス、麻疹、ニューキャッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーＡ２１、水疱性口内炎ウイルス、パルボウイルスＨ１、レオウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、及びポリオウイルス、及びパルボウイルス、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＡＣＡＭ２０００、及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰを含む多数の腫瘍溶解性ウイルスが利用可能である。これらの腫瘍溶解性ウイルスのゲノムは、遺伝子改変をして、シアリダーゼの全部または触媒部分を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入することができる。シアリダーゼの全部または触媒活性部分を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼが感染細胞によって発現されるように、ウイルス発現カセットの制御下に置かれる。
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、正常細胞と比べて、腫瘍細胞に優先的に蓄積し、複製し、腫瘍細胞を殺傷する能力を有する。この能力は、ウイルス（例えば、ポックスウイルス、レオウイルス、ニューキャッスル病ウイルス及びムンプスウイルス）の本来の特徴である場合もあれば、ウイルスは、この特性について改変または選択することができる。ウイルスは、対象における抗ウイルス免疫及び他の防御を回避することができるように、腫瘍細胞もしくは腫瘍微小環境において優先的に蓄積するように、遺伝子的に弱毒化もしくは改変することができ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス）、及び／または腫瘍細胞に対する選好性は、例えば、腫瘍特異的細胞表面分子、転写因子及び組織特異的マイクロＲＮＡを使用して、ウイルスについて選択もしくは操作することができる（例えば、Ｃａｔｔａｎｅｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６（７）：５２９－５４０（２００８）；Ｄｏｒｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，６１（７－８）：５５４－５７１（２００９）；Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７（３）：４０９－４１６（２００９）；及びＮａｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９（９）：１１６３－１１７６（２００９）参照）。
腫瘍溶解性ウイルスの送達は、腫瘍内への直接注射を介して達成することができる。腫瘍内への直接送達は、正常細胞のウイルスへの曝露を最小限に抑えることができるが、例えば、腫瘍部位にアクセスできない場合（例えば、脳腫瘍）または広い範囲に広がるいくつかの小さな結節の形態の腫瘍の場合または転移性疾患の場合には、しばしば制限がある。ウイルスは、静脈内投与または腹腔内投与などの全身的または局所的な送達及び他のそのような経路を介して送達することができる。全身送達は、原発腫瘍部位だけでなく、播種した転移にもウイルスを送達することができる。
ワクシニアウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス、麻疹、ニューキャッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、コクサッキーＡ２１、水疱性口内炎ウイルス、パルボウイルスＨ１、レオウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、及びポリオウイルス、及びパルボウイルス、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＡＣＡＭ２０００、及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰを含む多数の腫瘍溶解性ウイルスが利用可能である。これらの腫瘍溶解性ウイルスのゲノムは、遺伝子改変をして、シアリダーゼの全部または触媒部分を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入することができる。シアリダーゼの全部または触媒活性部分を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼが感染細胞によって発現されるように、ウイルス発現カセットの制御下に置かれる。
他の非改変の腫瘍溶解性ウイルスには、当業者に知られた任意のものが含まれ、指定されるウイルスのなかでも、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＪＸ－５９４、ＪＸ－９５４、ＣｏｌｏＡｄｌ、ＭＶ－ＣＥＡ、ＭＶ－ＮＩＳ、ＯＮＹＸ－０１５、Ｂ１８Ｒ、Ｈ１０１、ＯｎｃｏＶＥＸＧＭ－ＣＳＦ、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ、ＮＴＸ－０１０、ＣＣＴＧ－１０２、Ｃａｖａｔａｋ、Ｏｎｃｏｒｉｎｅ、及びＴＮＦｅｒａｄｅから選択されるものが含まれる。
好適な腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、ＷＯ２０２００９７２６９に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書に記載される腫瘍溶解性ウイルスには、例えば、水疱性口内炎ウイルス（例えば、米国特許第７，７３１，９７４号、同第７，１５３，５１０号、同第６，６５３，１０３号ならびに米国特許公開第２０１０／０１７８６８４号、同第２０１０／０１７２８７７号、同第２０１０／０１１３５６７号、同第２００７／００９８７４３号、同第２００５０２６０６０１号、同第２００５０２２０８１８号及び欧州特許第１３８５４６６号、同第１６０６４１１号及び同第１５２０１７５号参照）；単純ヘルペスウイルス（例えば、米国特許第７，８９７，１４６号、同第７７３１，９５２号、同第７，５５０，２９６号、同第７，５３７，９２４号、同第６，７２３，３１６号、同第６，４２８，９６８号ならびに米国特許公開第２０１１／０１７７０３２号、同第２０１１／０１５８９４８号、同第２０１０／００９２５１５号、同第２００９／０２７４７２８号、同第２００９／０２８５８６０号、同第２００９／０２１５１４７号、同第２００９／００１０８８９号、同第２００７／０１１０７２０号、同第２００６／００３９８９４号及び同第２００４０００９６０４号参照）；レトロウイルス（例えば、米国特許第６，６８９，８７１号、同第６，６３５，４７２号、同第６，６３９，１３９号、同第５，８５１，５２９号、同第５，７１６，８２６号、同第５，７１６，６１３号及び米国特許公開第２０１１０２１２５３０号参照）；及びアデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第８，００７，７８０号、同第７，９６８，３４０号、同第７，９４３，３７４号、同第７，９０６，１１１号、同第７，９２７，５８５号、同第７，８１１，８１４号、同第７，６６２，６２７号、同第７，２４１，４４７号、同第７，２３８，５２６号、同第７，１７２，８９３号、同第７，０３３，８２６号、同第７，００１，７６５号、同第６，８９７，０４５号、及び同第６，６３２，６７０号参照）が含まれる。
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。ＶＳＶは、複数の腫瘍溶解性ウイルス用途に使用されている。加えて、ＶＳＶは、ワクチンを介してＨＰＶ陽性子宮頸癌を治療する方法としてヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の抗原タンパク質を発現するように操作され（ＲＥＦ１８３３７３７７、２９９９８１９０）、また腫瘍に対する免疫反応を増加させる炎症促進性因子を発現するように操作されている（ＲＥＦ１２８８５９０３）。追加の遺伝子をコードするようにＶＳＶを操作する様々な方法が記載されている（ＲＥＦ７７５３８２８）。簡潔に述べると、ＶＳＶ ＲＮＡゲノムを、上流にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む相補的な二本鎖ＤＮＡに逆転写し、遺伝子挿入に適切なＶＳＶゲノム内の位置を特定する（例えば、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）に隣接する非コーディング５’または３’領域内（ＲＥＦ１２８８５９０３）。制限酵素による消化を、例えば、Ｍｌｕ Ｉ及びＮｈｅ Ｉにより実施することで、線状ＤＮＡ分子を得ることができる。この線状ＶＳＶゲノムＤＮＡに、適切な制限部位に隣接する目的遺伝子をコードするＤＮＡ分子からなるインサートをライゲーションすることができる。得られたＤＮＡをＴ７ポリメラーゼで転写すると、挿入した目的遺伝子を含有する完全なＶＳＶゲノムＲＮＡを得ることができる。このＲＮＡ分子を哺乳動物細胞に、例えば、トランスフェクションを介して導入し、インキュベーションすると、目的遺伝子によってコードされるタンパク質を発現するウイルス子孫が得られる。
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルスである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスは、アデノウイルス血清型５型ウイルス（Ａｄ５）である。Ａｄ５は、ヒトＥ２Ｆ－１プロモーターを含有し、これは、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）経路欠損腫瘍に特異的な転写調節エレメントであり、必須のＥ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動するものであり、ウイルス複製及び細胞毒性がＲｂ経路欠損腫瘍細胞に制限される（ＲＥＦ１６３９７０５６）。腫瘍細胞の特質は、経路欠損である。Ａｄ５への目的遺伝子の操作は、Ａｄ５ゲノムへのライゲーションにより達成される。目的遺伝子を含有するプラスミドを、例えば、ＡｓｉＳＩ及びＰａｃＩを介して、生成及び消化する。Ａｄ５ ＤＮＡプラスミド、例えば、ＰＳＦ－ＡＤ５（ＲＥＦ Ｓｉｇｍａ ＯＧＳ２６８）をＡｓｉＳＩ及びＰａｃＩで消化し、組み換え細菌リガーゼでライゲーションするか、またはＡｄ５を発現するヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の生成について報告されているように制限酵素消化した目的遺伝子と一緒に許容性Ｅ．ｃｏｌｉに同時形質転換する（ＲＥＦ１６３９７０５６）。ＤＮＡを回収し、許容性宿主、例えば、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）またはＨｅＬａにトランスフェクションすることで、目的遺伝子をコードするウイルスが得られる。
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、改変された腫瘍溶解性ウイルス（例えば、本明細書に記載されるウイルスのいずれか１つの派生体）である。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、対応する野生型株と比較して、ウイルスの免疫原性を減少させる１つ以上の変異を含む。
ワクシニアウイルス（ＶＶ）
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）である。様々な株のＶＶがＯＶ療法のテンプレートとして使用されており、その共通の特徴は、ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の欠失であり、これにより、ウイルスは、活発に複製する細胞、すなわち、新生細胞性細胞に依存して生産的な複製を行うことになることから、これらのＶＶは、ＶＶのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株に例示されるように、がん細胞に対して優先的な感染力を有する（ＲＥＦ２５８７６４６４）。目的遺伝子がゲノムに挿入されたＶＶの産生は、ｌｏｘ部位を活用した相同組み換えにより達成され得る。
いくつかの実施形態において、ウイルスは、改変されたワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、１つ以上の変異を含む、改変されたワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１３、Ｌ１、Ｈ３、Ｄ８、Ａ３３、Ｂ５、Ａ５６、Ｆ１３、Ａ２８、及びＡ２７などの１つ以上のタンパク質にある。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ及びＬ１Ｒからなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある。例示的な変異は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０２００８６４２３号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
がん治療用送達ベクターとしてのＶＶの使用を制限する因子は、血流へのＶＶ注射によって誘導される強い中和抗体（Ｎａｂ）応答であり、これが、ウイルスの持続及び拡散する能力を制限し、ベクターの再投与を妨げている。ＮＡｂは、ＶＶエンベロープに埋め込まれたウイルス糖タンパク質を認識して結合し、それゆえ、ウイルスと宿主細胞受容体との相互作用を阻害する。宿主細胞の受容体認識に関与する多くのＶＶ糖タンパク質が特定されている。とりわけ、タンパク質Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ、Ａ２７Ｌ、Ｄ８Ｌ、Ａ３３Ｒ、及びＢ５Ｒは、ＮＡｂによって標的にされることが示されており、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ及びＬ１Ｒは、成熟ウイルス粒子の表面上に存在する主なＮＡｂ抗原である。Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、及びＤ８Ｌは、宿主のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）（Ａ２７Ｌ及びＨ３Ｌ）及びコンドロイチン硫酸（ＣＳ）（Ｄ８Ｌ）に結合し、宿主細胞へのウイルスのエンドサイトーシスを媒介する接着分子である。Ｌ１Ｒタンパク質は、ウイルス成熟に関与する。これらのタンパク質のうちの１つ以上に変異を含む改変されたワクシニアウイルスは、国際特許公開第ＷＯ２０２００８６４２３号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、改変されたワクシニアウイルスは、（ａ）配列番号６６～６９のいずれか１つに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質、（ｂ）配列番号７０～７２または８５のいずれか１つに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質、（ｃ）配列番号７３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ａ２７Ｌタンパク質、及び（ｄ）配列番号７４に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ｈ３Ｌタンパク質は、次のアミノ酸残基：１４、１５、１６、３３、３４、３５、３８、４０、４４、４５、５２、１３１、１３４、１３５、１３６、１３７、１５４、１５５、１５６、１６１、１６６、１６７、１６８、１９８、２２７、２５０、２５３、２５４、２５５、及び２５６のうちの１つ以上にアミノ酸置換または欠失を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号６６に基づく。いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ｈ３Ｌは、Ｉ１４Ａ、Ｄ１５Ａ、Ｒ１６Ａ、Ｋ３８Ａ、Ｐ４４Ａ、Ｅ４５Ａ、Ｖ５２Ａ、Ｅ１３１Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｌ１３６Ａ、Ｒ１３７Ａ、Ｒ１５４Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｉ１５６Ａ、Ｍ１６８Ａ、Ｉ１９８Ａ、Ｅ２５０Ａ、Ｋ２５３Ａ、Ｐ２５４Ａ、Ｎ２５５Ａ、及びＦ２５６Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号６６に基づく。
いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ｄ８Ｌタンパク質は、次のアミノ酸残基：４４、４８、９８、１０８、１１７、及び２２０のうちの１つ以上にアミノ酸置換または欠失を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号７０に基づく。いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ｄ８Ｌコンストラクトは、Ｒ４４Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｋ９８Ａ、Ｋ１０８Ａ、Ｋ１１７Ａ、及びＲ２２０Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号７０に基づく。
いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ａ２７Ｌタンパク質は、次のアミノ酸残基：２７、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３９、４０、１０７、１０８、及び１０９のうちの１つ以上にアミノ酸置換または欠失を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号７３に基づく。いくつかの実施形態において、バリアントＡ２７Ｌコンストラクトは、Ｋ２７Ａ、Ａ３０Ｄ、Ｒ３２Ａ、Ｅ３３Ａ、Ａ３４Ｄ、Ｉ３５Ａ、Ｖ３６Ａ、Ｋ３７Ａ、Ｄ３９Ａ、Ｅ４０Ａ、Ｒ１０７Ａ、Ｐ１０８Ａ、及びＹ１０９Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号７３に基づく。
いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ｌ１Ｒタンパク質は、次のアミノ酸残基：２５、２７、３１、３２、３３、３５、５８、６０、６２、１２５、及び１２７のうちの１つ以上にアミノ酸置換または欠失を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号７４に基づく。いくつかの実施形態において、バリアントＬ１Ｒコンストラクトは、Ｅ２５Ａ、Ｎ２７Ａ、Ｑ３１Ａ、Ｔ３２Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｓ５８Ａ、Ｄ６０Ａ、Ｄ６２Ａ、Ｋ１２５Ａ、及びＫ１２７Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号７４に基づく。
いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ｈ３Ｌタンパク質は、次のアミノ酸残基：１４、１５、１６、３３、３４、３５、３８、４０、４４、４５、５２、１３１、１３２、１３４、１３５、１３６、１３７、１５４、１５５、１５６、１６１、１６６、１６７、１６８、１９５、１９８、１９９、２２７、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６４、２６６、２６８、２７２、２７３、２７５、及び２７７のうちの１つ以上にアミノ酸置換または欠失を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号６８に基づく。いくつかの実施形態において、バリアントＨ３Ｌコンストラクトは、Ｉ１４Ａ、Ｄ１５Ａ、Ｒ１６Ａ、Ｋ３３Ａ、Ｆ３４Ａ、Ｄ３５Ａ、Ｋ３８Ａ、Ｎ４０Ａ、Ｐ４４Ａ、Ｅ４５Ａ、Ｖ５２Ａ、Ｅ１３１Ａ、Ｄ１３２Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｆ１３５Ａ、Ｌ１３６Ａ、Ｒ１３７Ａ、Ｒ１５４Ａ、Ｅ１５５Ａ、Ｉ１５６Ａ、Ｋ１６１Ａ、Ｌ１６６Ａ、ＶＩ６７Ａ、Ｍ１６８Ａ、Ｅ１９５Ａ、Ｉ１９８Ａ、Ｖ１９９Ａ、Ｒ２２７Ａ、Ｅ２５０Ａ、Ｎ２５１Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｋ２５３Ａ、Ｐ２５４Ａ、Ｎ２５５Ａ、Ｆ２５６Ａ、Ｓ２５８Ａ、Ｔ２６２Ｐ、Ａ２６４Ｔ、Ｋ２６６Ｉ、Ｙ２６８Ｃ、Ｍ２７２Ｋ、Ｙ２７３Ｎ、Ｆ２７５Ｎ、及びＴ２７７Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号６８に基づく。
いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ｄ８Ｌタンパク質は、次のアミノ酸残基：４３、４４、４８、５３、５４、５５、９８、１０８、１０９、１４４、１６８、１７７、１９６、１９９、２０３、２０７、２１２、２１８、２２０、２２２、及び２２７のうちの１つ以上にアミノ酸置換または欠失を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号７２に基づく。いくつかの実施形態において、バリアントＶＶ Ｄ８Ｌコンストラクトは、Ｖ４３Ａ、Ｒ４４Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｓ５３Ａ、Ｇ５４Ａ、Ｇ５５Ａ、Ｋ９８Ａ、Ｋ１０８Ａ、Ｋ１０９Ａ、Ａ１４４Ｇ、Ｔ１６８Ａ、Ｓ１７７Ａ、Ｌ１９６Ａ、Ｆ１９９Ａ、Ｌ２０３Ａ、Ｎ２０７Ａ、Ｐ２１２Ａ、Ｎ２１８Ａ、Ｒ２２０Ａ、Ｐ２２２Ａ、及びＤ２２７Ａからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含み、アミノ酸ナンバリングは、配列番号７２に基づく。
Ｂ．異種タンパク質または核酸
１．シアリダーゼ
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、シアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ））を、例えば、ヒト細胞上のグリカンから除去することが可能なシアリダーゼの全部または触媒部分を含む異種タンパク質をコードする。一般に、Ｎｅｕ５Ａｃは、様々なシアリルトランスフェラーゼのいずれかによって、タンパク質上のグリカンの最後から２番目の糖にアルファ２，３、アルファ２，６またはアルファ２，８連結を介して連結される。一般的なヒトシアリルトランスフェラーゼは、表１にまとめられている。
Figure 2023511129000002
異種タンパク質は、天然に存在するシアリダーゼまたはその触媒部分に加え、任意選択により、タンパク質の治療活性に寄与するペプチドまたはタンパク質配列を含み得る。例えば、タンパク質は、タンパク質と細胞表面との間の相互作用を促進するアンカリングドメインを含み得る。アンカリングドメイン及びシアリダーゼドメインは、治療用シアリダーゼがシアル酸残基を除去する細胞外活性を示すことができるように、当該タンパク質が標的細胞膜にまたはその近くに結合することができる任意の適切な方法で配置することができる。タンパク質は、１つを超えるアンカリングドメインを有し得る。ポリペプチドが１つを超えるアンカリングドメインを有する場合、アンカリングドメインは、同じであっても異なってもよい。タンパク質は、１つ以上の膜貫通ドメイン（例えば、１つ以上の膜貫通アルファヘリックス）を含み得る。タンパク質は、１つを超えるシアリダーゼドメインを有し得る。化合物が１つを超えるシアリダーゼドメインを有する場合、シアリダーゼドメインは、同じであっても異なってもよい。タンパク質が複数のアンカリングドメインを含む場合、アンカリングドメインは、タンデムに（リンカーありまたはなしで）、またはシアリダーゼドメインなどの他のドメインと交互に配置することができる。化合物が複数のシアリダーゼドメインを含む場合、シアリダーゼドメインは、タンデムに（リンカーありまたはなしで）、または他のドメインと交互に配置することができる。
シアリダーゼ触媒活性
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ＥＣ３．２．１．１８で定義されるエキソ型シアリダーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ＥＣ４．２．２．１５で定義されるアンヒドロシアリダーゼである。
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスによって発現されるシアリダーゼは、アルファ２，３連結を介して連結されたＮｅｕ５Ａｃに特異的であるか、アルファ２，６を介して連結されたＮｅｕ５Ａｃに特異的であるか、アルファ２，８連結を介して連結されたＮｅｕ５Ａｃに特異的であるか、あるいはアルファ２，３連結またはアルファ２，６連結を介して連結されたＮｅｕ５Ａｃを切断することができる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、アルファ２，３連結、アルファ２，６連結、またはアルファ２，８連結を介して連結されたＮｅｕ５Ａｃを切断することができる。様々なシアリダーゼが表２～５に記載される。
シアル酸残基と基質分子の残り部分との間の１種を超える連結を切断することができるシアリダーゼ、特に、アルファ（２，６）－Ｇａｌ及びアルファ（２，３）－Ｇａｌ連結の両方またはアルファ（２，６）－Ｇａｌ及びアルファ（２，３）－Ｇａｌ連結及びアルファ（２，８）－Ｇａｌ連結の両方を切断することができるシアリダーゼは、本開示の化合物に使用することができる。含まれるシアリダーゼは、シアル酸受容体Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）－Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）－Ｇａｌを分解することができる大型細菌シアリダーゼである。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ８７３６９）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ （ＧｅｎＢａｎｋＸ６２２７６）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＹ９３４５３９）、またはＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ０１０４５）の細菌シアリダーゼ酵素が使用され得る。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、大型細菌シアリダーゼのアミノ酸配列の全部または一部を含むか、あるいは、大型細菌シアリダーゼのアミノ酸配列の全部または一部に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、シアリダーゼドメインは、配列番号２もしくは２７を含か、または配列番号１２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するシアリダーゼ配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼドメインは、配列番号２６のアミノ酸２７４～６６６にわたるＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼの触媒ドメインを含み、配列番号２６のアミノ酸２７４～６６６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
追加のシアリダーゼには、遺伝子ＮＥＵ２（配列番号４；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ１６５３５；Ｍｏｎｔｉ，Ｅ，Ｐｒｅｔｉ，Ｒｏｓｓｉ，Ｅ．，Ｂａｌｌａｂｉｏ，Ａ ａｎｄ Ｂｏｒｓａｎｉ Ｇ．（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５７：１３７－１４３）及びＮＥＵ４（配列番号６；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ０８０７４１；Ｍｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２７：６４６－６６３）によってコードされるものなどのヒトシアリダーゼが含まれる。本開示の化合物のシアリダーゼドメインは、シアリダーゼのアミノ酸配列の全部または一部を含み得、あるいは、シアリダーゼのアミノ酸配列の全部または一部に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、シアリダーゼドメインが、天然に存在するシアリダーゼのアミノ酸配列の一部分、または天然に存在するシアリダーゼのアミノ酸配列の一部分に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む場合、その部分は、インタクトなシアリダーゼと本質的に同じ活性を含む。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスによって発現されるシアリダーゼは、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質である。本明細書で使用される場合、「シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質」は、シアリダーゼの触媒ドメインを含むが、触媒ドメインが由来するシアリダーゼの全アミノ酸配列を含まないものである。「シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質」は、シアリダーゼ活性を有するものであり、本明細書で使用されるこの用語は、「シアリダーゼ」と置き換え可能である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、触媒ドメイン配列が由来するシアリダーゼの活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、触媒ドメイン配列が由来するシアリダーゼの活性の少なくとも９０％を含む。
シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、限定するものではないが、追加のシアリダーゼ配列、他のタンパク質に由来する配列、または天然に存在するタンパク質の配列に由来しない配列などの他のアミノ酸配列を含み得る。追加のアミノ酸配列は、触媒ドメインタンパク質に他の活性を付与すること、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質の発現、プロセシング、折り畳み、もしくは安定性を増大させること、または更にはタンパク質の望ましい大きさもしくは間隔を与えることなどを含む、多数の機能のいずれかを実現し得る。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼの触媒ドメインを含むタンパク質である。いくつかの実施形態において、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列（配列番号２６；ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿００３７８９０７４）のアミノ酸２７０～６６６を含む。いくつかの実施形態において、Ａ．Ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列（配列番号２６）のアミノ酸２７０～アミノ酸２９０のいずれかのアミノ酸から始まり、当該Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列（配列番号２６）のアミノ酸６６５～アミノ酸９０１のいずれかのアミノ酸で終わり、アミノ酸１～アミノ酸２６９にわたるあらゆるＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼタンパク質配列を欠くアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列（配列番号２６）のアミノ酸２７４～６８１を含み、他のＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列を欠く。いくつかの実施形態において、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列（配列番号２６）のアミノ酸２７４～６６６を含み、任意の他のＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列を欠く。いくつかの実施形態において、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列（配列番号２６）のアミノ酸２９０～６６６を含み、任意の他のＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列を欠く。更に他の実施形態において、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列（配列番号２６）のアミノ酸２９０～６８１を含み、任意の他のＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ配列を欠く。
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスによる発現に有用なシアリダーゼポリペプチドは、配列番号２７に対して、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一である配列を含むポリペプチドを含むか、または配列番号２７の３７５、３７６、３７７、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、もしくは３９２の連続アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１、その機能性誘導体（例えば、その断片）、またはそのバイオシミラーである。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号２に対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号２の４１４、４１３、４１２、４１１、または４１０の連続アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼはアンカリングドメイン（ＡＲドメイン）を含まないＤＡＳ１８１の断片を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号２７に対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＤＡＳ１８１は、ヘパリン結合アンカリングドメインを含む組み換えシアリダーゼ融合タンパク質である。ＤＡＳ１８１ならびにＤＡＳ１８１を調製及び製剤化するための方法は、ＵＳ７，６４５，４４８；ＵＳ９，７００，６０２及びＵＳ１０，３５１，８２８に記載されており、そのそれぞれは、任意及び全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、分泌型のＤＡＳ１８１、その機能性誘導体、またはそのバイオシミラーである。いくつかの実施形態において、分泌型のＤＡＳ１８１をコードするヌクレオチド配列は、ＤＡＳ１８１に作動可能に連結される分泌配列をコードし、分泌配列は、真核細胞からのタンパク質の分泌を可能にする。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号２８に対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号２８に対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号２８の４１４、４１３、４１２、４１１、または４１０の連続アミノ酸を含む。例示的な分泌型のＤＡＳ１８１は、実施例１１に記載される。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜貫通型のＤＡＳ１８１、その機能性誘導体、またはそのバイオシミラーである。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号３１に対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号３１に対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか１つ）または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号３１の４１４、４１３、４１２、４１１、または４１０の連続アミノ酸を含む。例示的な膜貫通型のＤＡＳ１８１は、実施例１１に記載される。
Figure 2023511129000003
Figure 2023511129000004
Figure 2023511129000005
Figure 2023511129000006
Figure 2023511129000007
アンカリングドメイン
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、アンカリングドメインを含む。本明細書で使用される場合、「細胞外アンカリングドメイン」または「アンカリングドメイン」は、標的細胞の外表面にあるもしくは外表面上にあるまたは標的細胞の外表面に極めて接近している実体と相互作用する任意の部分である。アンカリングドメインは、標的細胞の外側表面にまたはその近傍に、本開示のシアリダーゼを保持するように機能することができる。細胞外アンカリングドメインは、１）がん細胞の表面上に発現される分子、もしくはがん細胞の表面上に発現される分子の部分、ドメイン、もしくはエピトープ、２）がん細胞の表面上に発現される分子に付着する化学実体、または３）がん細胞の周りの細胞外マトリックスの分子、に結合し得る。
例示的なアンカリングドメインは、細胞膜上に偏在するＧＡＧの一種であるヘパリン／硫酸に結合する。多くのタンパク質は、ヘパリン／ヘパラン硫酸に特異的に結合し、これらのタンパク質中のＧＡＧ結合配列は、同定されている（Ｍｅｙｅｒ，Ｆ Ａ，Ｋｉｎｇ，Ｍ ａｎｄ Ｇｅｌｍａｎ，Ｒ Ａ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ３９２：２２３－２３２；Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｓ．ｅｄ．，ｐｐ ２３３．Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９８２）。例えば、ヒト血小板因子４（ＰＦ４）（配列番号７７）、ヒトインターロイキン８（ＩＬ８）（配列番号７８）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）（配列番号８０）、ヒトアポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）（配列番号８０）、ヒト血管関連遊走細胞タンパク質（ＡＡＭＰ）（配列番号８１）、またはヒトアンフィレグリン（配列番号８２）のＧＡＧ結合配列は、ヘパリンに対して、極めて高い親和性を有することが示されている。
いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンカーなどの非タンパク質アンカリング部分である。
リンカー
シアリダーゼまたはその触媒ドメインを含むタンパク質は、任意選択により、シアリダーゼの様々なドメインを接続することができる１つ以上のポリペプチドリンカーを含む。リンカーは、タンパク質のドメインの最適な間隔または折り畳みをもたらすために使用することができる。リンカーによって接続されるタンパク質のドメインは、シアリダーゼドメイン、アンカリングドメイン、膜貫通ドメイン、またはタンパク質の安定性の増大、精製の容易化などの追加の機能をもたらす化合物の任意の他のドメインもしくは部分であり得る。いくつかの好ましいリンカーは、アミノ酸グリシンを含む。例えば、配列：（ＧＧＧＧＳ（配列番号５５））ｎを有するリンカーであり、式中、ｎは、１～２０である。いくつかの実施形態において、リンカーは、免疫グロブリンのヒンジ領域である。触媒ドメインを立体障害のない状態に保つことが可能な任意のヒンジまたはリンカー配列を使用して、シアリダーゼのドメインを別のドメイン（例えば、膜貫通ドメインまたはアンカリングドメイン）に連結することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号６２の配列を含むヒンジドメインである。
分泌配列
いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼに作動可能に連結される分泌配列（例えば、シグナル配列またはシグナルペプチド）を更に含む。「分泌配列」、「シグナル配列」、及び「シグナルペプチド」という用語は、区別なく使用される。いくつかの実施形態において、分泌配列は、タンパク質のＮ末端に作動可能に連結されるシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、分泌配列の長さは、１０～３０アミノ酸（例えば、１５～２５アミノ酸、１５～２２アミノ酸、または２０～２５アミノ酸）の範囲である。いくつかの実施形態において、分泌配列は、真核細胞からのタンパク質の分泌を可能にする。小胞体膜を移動する間に、分泌配列は、通常、切除され、タンパク質は、分泌経路に入る。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、分泌配列、シアリダーゼ、及び膜貫通ドメインをコードし、シアリダーゼは、分泌配列及び膜貫通ドメインに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、Ｎ末端の分泌配列は、切断されて、Ｎ末端細胞外ドメインを含むタンパク質が生じる。例示的な分泌配列は、配列番号４０に提供される。
膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼドメインは、哺乳動物（好ましくは、ヒト）膜貫通（ＴＭ）ドメインに接続され得る。この配置により、シアリダーゼが細胞表面上に発現される。好適な膜貫通ドメインには、ヒトＣＤ２８ ＴＭドメイン（ＮＭ＿００６１３９；ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４６）、ヒトＣＤ４ ＴＭドメイン（Ｍ３５１６０；ＭＡＬＩＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦＩＧＬＧＩＦＦ（配列番号４７）；ヒトＣＤ８ ＴＭ１ドメイン（ＮＭ＿００１７６８；ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号４８）；ヒトＣＤ８ ＴＭ２ドメイン（ＮＭ＿００１７６８；ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ（配列番号４９）；ヒトＣＤ８ ＴＭ３ドメイン（ＮＭ＿００１７６８；ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号５０）；ヒト４１ＢＢ ＴＭドメイン（ＮＭ＿００１５６１；ＩＩＳＦＦＬＡＬＴＳＴＡＬＬＦＬＬＦＦＬＴＬＲＦＳＶＶ（配列番号５１）；ヒトＰＤＧＦＲ ＴＭ１ドメイン（ＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩ；配列番号５２）；及びヒトＰＤＧＦＲ ＴＭ２ドメインＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ；配列番号４５）を含む配列が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、分泌配列（例えば、配列番号４０）、シアリダーゼ（例えば、配列番号１～２７から選択されるアミノ酸配列を含むシアリダーゼ）、及び膜貫通ドメイン（例えば、配列番号４５～５２から選択される膜貫通ドメイン）を含むタンパク質をコードする。しかしながら、任意の好適な分泌配列、シアリダーゼドメイン配列、または膜貫通ドメインが使用され得る。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、分泌配列（例えば、配列番号４０）、配列番号２７のシアリダーゼ、及び膜貫通ドメイン（例えば、配列番号４５～５２から選択される膜貫通ドメイン）を含むタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号３１から選択される配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、８０％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％のいずれか１つ）または少なくとも９０％（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のいずれか１つ）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号３１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
２．他の異種タンパク質またはヌクレオチド配列
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、異種タンパク質または核酸をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む。いくつかの実施形態において、第２のヌクレオチド配列は、異種タンパク質をコードする。
上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、免疫チェックポイント阻害薬である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４、またはＨＬＡ－Ｇの阻害薬である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、抗体である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント調節因子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、または２Ｂ４の阻害薬またはアンタゴニスト抗体またはデコイリガンドなどの免疫チェックポイント阻害薬である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント調節因子は、ＰＤ－１の阻害薬である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、抗ＰＤ－１抗体などの免疫チェックポイント分子に対する抗体である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、可溶性または遊離ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２などの免疫チェックポイント分子に結合するリガンドである。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、免疫細胞上の免疫チェックポイントＰＤ－１に結合する腫瘍細胞表面上のＰＤＬ－１を遮断することができる、免疫グロブリンのＦｃ断片（ＩｇＧ４ Ｆｃなど））に融合されたＰＤ－１の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、ＨＨＬＡ２に結合するリガンドである。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、ＩｇＧ４ Ｆｃなどの免疫グロブリンのＦｃ断片に融合されたＴＭＩＧＤ２の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、ＣＤ４７及びＣＸＣＲ４の両方に結合するリガンドなどの少なくとも２つの異なる抑制性免疫チェックポイント分子に結合するリガンド（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は、ＩｇＧ４ Ｆｃなどの免疫グロブリンのＦｃ断片に融合されたＳＩＲＰαの細胞外ドメイン及びＣＸＣＬ１２断片を含む。これらの分子は、がん細胞上のＣＤ４７に結合することができるので、ＳＩＲＰアルファとの相互作用を止め、マクロファージ及び樹状細胞への「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ（私を食べないで）」というシグナルを遮断することができる。
いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、免疫抑制性受容体の阻害薬である。免疫抑制性受容体は、腫瘍細胞に対する免疫応答を阻害または減少させる免疫エフェクター細胞によって発現される任意の受容体であってよい。例示的なエフェクター細胞としては、限定するものではないが、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、単球、好中球、ＮＫＴ細胞などが挙げられる。いくつかの実施形態において、免疫抑制性受容体は、ＬＩＬＲＢ、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、葉酸受容体ベータまたはＭＥＲＴＫである。いくつかの実施形態において、免疫抑制性受容体の阻害薬は、抗ＬＩＬＲＢ抗体である。
いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、多重特異性免疫細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態において、多重特異性免疫細胞エンゲージャーは、二重特異性免疫細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。例示的な二重特異性免疫細胞エンゲージャーは、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１８０４９２６１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、二重特異性免疫細胞エンゲージャーは、腫瘍抗原（ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、またはＥＧＦＲなど）を特異的に認識する第１の抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）及びエフェクター細胞上の細胞表面分子（Ｔリンパ球上のＣＤ３または４－１ＢＢなど）を特異的に認識する第２の抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）を含む。腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＡＡまたはＴＳＡは、固形腫瘍の細胞上に発現される。腫瘍抗原には、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、及びグリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＣＤＨ１７、フィブリン－３、ＨＨＬＡ２、葉酸受容体などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＥｐＣＡＭである。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＦＡＰである。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＥＧＦＲである。
上記のとおり、エフェクター細胞には、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、単球、好中球、ＮＫＴ細胞などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球である。エフェクター細胞上の細胞表面分子には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞表面分子は、ＣＤ３である。
本出願のエフェクター細胞上の細胞表面分子は、特定の細胞種または限定数の細胞種の外部細胞壁または原形質膜上にみられる分子である。細胞表面分子の例としては、受容体、トランスポーター、イオンチャネル、プロトンポンプ、及びＧタンパク質結合受容体などの膜タンパク質；接着分子（例えば、インテグリン、カドヘリン、セレクチン、またはＮＣＡＭＳ）などの細胞外マトリックス分子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第７，５５６，９２８号を参照されたく、その全体が参照により本明細書に援用される。エフェクター細胞上の細胞表面分子には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２２６、ＣＤ２７８、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、及び不変ＴＣＲが含まれるが、これらに限定されない。
エンゲージャー分子の細胞表面分子結合ドメインは、免疫エフェクター細胞に活性化をもたらすことができる。当業者であれば、免疫細胞が異なる細胞表面分子を有することを認識している。例えば、ＣＤ３は、Ｔ細胞上の細胞表面分子であるが、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫｐ３０は、ＮＫ細胞上の細胞表面分子であり、ＣＤ３または不変ＴＣＲは、ＮＫＴ細胞上の細胞表面分子である。したがって、Ｔ細胞を活性化するエンゲージャー分子は、ＮＫ細胞を活性化するエンゲージャー分子とは異なる細胞表面分子結合ドメインを有し得る。いくつかの実施形態において、例えば、免疫細胞がＴ細胞である場合、活性化分子は、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δもしくはＣＤ３ε、またはＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８のうちの１つ以上である。他のいくつかの実施形態において、例えば、免疫細胞がＮＫ細胞である場合、細胞表面分子はＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫｐ３０であり、あるいは、免疫細胞がＮＫＴ細胞である場合、細胞表面分子はＣＤ３または不変ＴＣＲである。
ＣＤ３は、３つの異なるポリペプチド鎖（ε、δ及びγ鎖）を含み、Ｔ細胞によって発現される抗原である。３つのＣＤ３ポリペプチド鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖と会合してＴＣＲ複合体を形成し、この複合体は、Ｔ細胞においてシグナル伝達カスケードを活性化させる機能を有する。現在、多くの治療戦略が、疾患を治療するために、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を使用してＴＣＲシグナル伝達を標的としている。ＣＤ３特異的抗体ＯＫＴ３は、ヒト治療使用に承認された最初のモノクローナル抗体であり、同種移植拒絶反応の治療のための免疫調節剤として臨床使用されている。
いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、個体の免疫系による組み換え腫瘍溶解性ウイルスの中和を減少させる。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、エンベロープウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）であり、異種タンパク質は、補体活性化調節因子（例えば、ＣＤ５５またはＣＤ５９）である。補体は、自然免疫系の重要な構成成分であり、ウイルスを中和し、循環系から排除することを目的とする。補体活性化により、Ｃ３が切断されて活性化し、オプソニンＣ３断片が表面上に固着する。その後、Ｃ５の切断により、膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ、６、７、８、９）が組み立てられ、これが脂質二重層を破壊する。
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、エンベロープウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）であり、異種タンパク質は、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、Ｈ因子、Ｃ４結合タンパク質、または他の同定されている補体活性化調節因子などの補体活性化調節因子である。理論に束縛されることを望むものではないが、ウイルスエンベロープ表面（例えば、ワクシニアウイルスエンベロープ）上に補体活性化調節因子を発現させることにより、野生型ウイルスと比較して、補体活性化を調節し、補体媒介性ウイルス中和を減少させる能力を有するウイルスが得られる。いくつかの実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、Ｈ因子、Ｃ４結合タンパク質、または他の同定されている補体活性化調節因子のドメインをコードする。別の実施形態において、異種核酸は、配列番号５８の配列を有するアミノ酸配列を含むＣＤ５５タンパク質をコードする。当業者であれば、本明細書で提示される開示を考慮して、本明細書で提示されるエンベロープ組み換え腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）のいずれか１つに、他の補体活性化調節因子（例えば、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＣＤ３５、Ｈ因子、Ｃ４結合タンパク質など）を容易に採用することができるであろう。
いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、サイトカインである。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＣＸＣＬ１０、もしくはＣＣＬ４、または前述のタンパク質のいずれかに由来する改変されたタンパク質（例えば、融合タンパク質）である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、副作用が低減するように改変されたＩＬ－２の誘導体である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ＩＬ１８－ＢＰへの結合を欠く、改変されたＩＬ－１８である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、炎症性サイトカイン及び安定化ドメインを含む融合タンパク質である。安定化ドメインは、抑制性ポリペプチドを安定化させる任意の好適なドメインであり得る。いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、抑制性ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長させる。いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態において、安定化ドメインは、アルブミンドメインである。
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ならびにこれらの組み合わせ及びハイブリッドのＦｃ断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または組み合わせもしくはハイブリッドＩｇＧのＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－２に由来する融合タンパク質）において、Ｆｃドメインは、対応する野生型Ｆｃドメインと比較して低下したエフェクター機能を有する（例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のレベルで測定した場合、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％低下したエフェクター機能）。
いくつかの実施形態において、炎症性サイトカイン及び安定化ドメインは、ペプチドリンカーなどのリンカーを介して互いに融合される。ペプチドリンカーは、天然に存在する配列、または非天然の配列を有し得る。例えば、重鎖のみの抗体のヒンジ領域に由来する配列がリンカーとして使用され得る。ペプチドリンカーは、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、強固な三次元構造体を採用せず、むしろ、ポリペプチドに柔軟性を与える傾向がある。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。例示的なフレキシブルリンカーとしては、グリシンポリマー、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野において知られている他のフレキシブルリンカーが挙げられる。
いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、細菌またはウイルスポリペプチドである。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＨ１７、及び臨床上意義のある他の腫瘍抗原から選択される腫瘍関連抗原である。
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、２つ以上追加のヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、本明細書に記載される異種タンパク質または核酸のいずれか１つをコードする。
アンタゴニストまたは阻害薬
アンタゴニストは、本明細書で使用される場合、阻害薬と置き換え可能である。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、標的タンパク質の阻害薬（すなわち、アンタゴニスト）であり、標的タンパク質は、免疫抑制性タンパク質である（例えば、チェックポイント阻害薬または免疫細胞活性化の他の阻害薬）。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、免疫チェックポイントタンパク質である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４７、ＣＸＣＲ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＨＨＬＡ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、または２Ｂ４である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、またはＨＬＡ－Ｇである。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、ＬＩＬＲＢ、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、またはＭＥＲＴＫから選択される免疫抑制性受容体である。
アンタゴニストは、標的タンパク質（例えば、免疫抑制性受容体または免疫チェックポイントタンパク質）の発現及び／または活性を阻害する。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、標的タンパク質の発現（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベル）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のいずれか１つの程度まで阻害する。標的タンパク質の発現レベルは、当該技術分野において知られている方法を使用して決定することができ、例えば、ＲＮＡレベルを調べるための定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ、及びＲＮＡシーケンシング；ならびにタンパク質レベルを調べるためのウェスタンブロット及び酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）がある。
いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、標的タンパク質の活性（例えば、標的タンパク質のリガンドもしくは受容体への結合、または酵素活性）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のいずれか１つの程度まで阻害する。結合は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、及びゲルシフトアッセイを含む、当該技術分野において知られている方法を使用して評価することができる。
アンタゴニストは、任意の好適な分子モダリティであってよく、限定するものではないが、低分子阻害薬、オリゴペプチド、ペプチド模倣物、ＲＮＡｉ分子（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、タンパク質（例えば、抗体、抑制性ポリペプチド、融合タンパク質など）、及び遺伝子編集システムが挙げられる。
ｉ．抗体
いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、標的タンパク質（例えば、免疫チェックポイントタンパク質または免疫抑制性タンパク質）のリガンドまたは受容体への結合を阻害する。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、ＨＬＡ－Ｇ、ＬＩＬＲＢ、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、またはＭＥＲＴＫ、葉酸受容体ベータなど）、またはその抗原結合断片に特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、全長抗体、または免疫グロブリン誘導体である。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、抗原結合断片である。例示的な抗原結合断片としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、Ｆｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合体、ダイアボディ、トリボディ、及びテトラボディが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ＦａｂまたはＦａｂ’である。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、キメラ抗体、ヒト抗体、部分的ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、または半合成抗体である。抗体及び／または抗体断片は、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ化抗体可変ドメイン及びヒト化型、サメ抗体可変ドメイン及びヒト化型、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来し得る。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体または二重特異性Ｆａｂ、二重特異性ｓｃＦｖ、抗体－Ｆｃ融合タンパク質Ｆｖなど）または三重特異性分子（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨまたはＦｃ融合タンパク質などからなる三重特異性抗体）である。
いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体定常領域などの１つ以上の抗体定常領域を含む。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭから選択されるアイソタイプのものである。いくつかの実施形態において、ヒト軽鎖定常領域は、κ及びλから選択されるアイソタイプのものである。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常領域などのＩｇＧ定常領域を含む。いくつかの実施形態において、エフェクター機能が望ましい場合、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域またはヒトＩｇＧ３重鎖定常領域を含む抗体が選択され得る。いくつかの実施形態において、エフェクター機能が望ましくない場合、ヒトＩｇＧ４もしくはＩｇＧ２重鎖定常領域、またはＦｃγＲ結合に負の影響を与えるＮ２９７Ａ／Ｑなどの変異を含むＩｇＧ１重鎖を含む抗体が選択され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域にＳ２４１Ｐ変異を含む。
いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆｃドメインを含む。「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端非抗原結合領域を指す。この用語は、天然型Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から重鎖のカルボキシル末端にわたる。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、Ｆｃ領域の構造または安定性に影響を与えない限り、存在してもしなくてもよい。本明細書で特に指示がない限り、ＩｇＧまたはＦｃ領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるＥＵインデックスとも呼ばれる抗体のためのＥＵナンバリングシステムに従う。いくつかの実施形態において、抗体は、野生型ＩｇＧまたは野生型抗体のＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有するバリアントＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、抗体は、抗体のグリコシル化の程度が増加または減少するように変更される。抗体に対するグリコシル化部位の付加または除去は、１つ以上のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、簡便に達成され得る。
標的タンパク質に特異的に結合する抗体は、当該技術分野において知られている方法を使用して、例えば、非ヒト哺乳動物を免疫化してそこからハイブリドーマを得ることによって、または当該技術分野において知られている分子生物学技術を使用して抗体のライブラリーをクローニングした後に選択することによって、またはファージディスプレイを使用することによって、得ることができる。
ｉｉ．核酸薬剤
いくつかの実施形態において、異種核酸は、標的タンパク質を下方制御する核酸である。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、標的タンパク質の発現（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現）を阻害する。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または遺伝子編集システムである。
いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ＲＮＡｉ分子である。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ｍｉＲＮＡである。
当業者であれば、標的タンパク質を下方制御するＲＮＡｉ分子またはＲＮＡｉ分子をコードする核酸を容易に設計することができる。本明細書で使用される「ＲＮＡｉ」または「ＲＮＡ干渉」という用語は、ＲＮＡ分子が標的ｍＲＮＡ分子に特異的に結合することによって遺伝子の発現または翻訳を阻害する生物学的プロセスを指す。例えば、Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５－３３：Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８－４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４－４９８；ならびにＫｒｅｕｔｚｅｒらの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ－Ｇｏｅｔｚらの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋらの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０１８４６号；Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ－Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０７４０９号；ならびにＬｉらの国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８－１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３－１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５－２２１８；ならびにＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２－２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６－６０；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２－８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．，１６，１６１６－１６２６；ならびにＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１）を参照されたい。例示的なＲＮＡｉ分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡが挙げられる。
ｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部分中のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的ヌクレオチド配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１つ以上のヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡのスカフォールドで構築され得る。ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定されるものではなく、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを更に包含する。
ＲＮＡｉは、当該技術分野において知られている方法を使用して設計され得る。例えば、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ配列、例えば、１０００の配列を機能性に基づいて分類し、８５％を超えるノックダウン活性を有するものを機能性グループ、８５％未満のノックダウン活性のものを非機能性グループに分類することで設計することができる。機能性グループ及び非機能性グループの両方について、全体のＲＮＡｉ標的配列の全体にわたる塩基組成の分布が計算された。次いで、機能性グループと非機能性グループの塩基分布の比を使用して、ＲＮＡｉ配列の各位置のスコアマトリックスを構築することができる。所与の標的配列について、各位置の塩基をスコア化し、次いで、全ての位置の乗算の対数比を最終スコアとする。このスコアシステムを使用すると、機能性ノックダウン活性と対数比スコアとの間の非常に強い相関関係が見出され得る。標的配列が選択されたら、遺伝子特異的なＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡを同定するために、Ｕｎｉｇｅｎｅデータベースに対して、高速ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔ及び低速Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎの両方のアルゴリズム検索によりフィルタリングがなされ得る。最後の１２塩基中に少なくとも１つのミスマッチを含む配列が選択され得る。
いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡである。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、リボザイムである。「アンチセンス」核酸は、標的タンパク質または断片をコードする「センス」核酸に相補的（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に対して相補的またはｍＲＮＡ配列に対して相補的）であるヌクレオチド配列を指す。アンチセンス核酸は、コーディング鎖全体、またはその一部分もしくは実質的に同一の配列に相補的であり得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域、例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の－１０～＋１０の間の領域に対して相補的であり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」に対するアンチセンスである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０以上のヌクレオチド長であり得る。アンチセンス核酸は、標準的な手順を使用する化学合成または酵素ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性の増大もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性の増大をもたらすように設計された様々に改変されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができる（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に生産することもできる。
アンチセンス核酸は、いくつかの実施形態において、リボザイムである。標的ヌクレオチド配列に対して特異性を有するリボザイムは、かかるヌクレオチド配列に対して相補的な１つ以上の配列と、ｍＲＮＡ切断を担うことが知られている触媒領域を有する配列とを含み得る（例えば、米国特許第５，０９３，２４６号またはＨａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５－５９１（１９８８））。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ－１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体が利用されることがあり、この活性部位のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に対して相補的である（例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号；及びＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号）。標的ｍＲＮＡ配列を使用して、特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択することができる（例えば、Ｂａｒｔｅｌ＆Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１－１４１８（１９９３））。
いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮ遺伝子編集システム、ジンクフィンガー遺伝子編集システムなどの遺伝子編集システムである。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、標的タンパク質を、例えば、組織特異的にノックダウンする遺伝子編集システムである。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、標的タンパク質の発現をサイレンシングする遺伝子編集システムである。
いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、標的タンパク質をコードする標的配列（例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）の遺伝子編集を誘導するように操作された（例えば、プログラム可能または標的化可能）ヌクレアーゼなどのガイドヌクレアーゼを含む。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンド型またはエキソ型ヌクレアーゼ、それらのバリアント、それらの断片、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の好適なガイドヌクレアーゼを使用することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、転写抑制因子に融合されたガイドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、標的タンパク質をコードする標的配列にハイブリダイズする、操作された核酸を更に含む。いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）及びガイドＲＮＡ（すなわち、ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。
３．異種タンパク質または核酸の発現のためのプロモーター
本明細書に記載される異種タンパク質（例えば、シアリダーゼ）または核酸をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも、シアリダーゼをコードする第１のヌクレオチド配列及び追加の異種タンパク質または核酸をコードする第２のヌクレオチド配列が同じプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、異種タンパク質または核酸をコードする核酸の全ては、同じプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、異種タンパク質または核酸をコードする核酸の全ては、異なるプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。ウイルスプロモーターには、ＶＶプロモーター、ポックスウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、Ｃｏｗｐｏｘ ＡＴＩプロモーター、またはＴ７プロモーターが含まれ得るが、これらに限定されない。プロモーターは、ワクシニアウイルスプロモーター、合成プロモーター、少なくとも感染初期中に転写を誘導するプロモーター、少なくとも感染中期中に転写を誘導するプロモーター、少なくとも感染初期／後期中に転写を誘導するプロモーター、または少なくとも感染後期中に転写を誘導するプロモーターであり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプロモーターは、誘導性プロモーターである。
哺乳動物細胞における構成的発現に好適なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター（ＵＳ５，１６８，０６２）、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（Ａｄｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ６０：６５－７４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）－１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター及びＴ７ポリメラーゼプロモーター（ＷＯ９８／１００８８）が含まれるが、これらに限定されない。ワクシニアウイルスプロモーターは、腫瘍溶解性ポックスウイルスにおける発現に特に適合している。代表例としては、限定するものではないが、ワクシニア７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５（Ｅｒｂｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５（１）：１８－２８）、ＴＫ、ｐ２８、ｐｌｌ、ｐＢ２Ｒ、ｐＡ３５Ｒ及びＫ１Ｌプロモーター、ならびにＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０９４－７；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６６：１３５－８；及びＫｕｍａｒ ａｎｄ Ｂｏｙｌｅ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：１５１－８）に記載されるものなどの合成プロモーターならびに初期／後期キメラプロモーターが挙げられる。腫瘍溶解性麻疹ウイルスに好適なプロモーターには、限定するものではないが、麻疹転写単位の発現を誘導する任意のプロモーターが含まれる（Ｂｒａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｔａｎｇｙ，２００８，ＣＩＭＩＤ ３１：２７１）。
誘導性プロモーターは、制御性プロモーターの分類に属する。誘導性プロモーターは、物理的状態、宿主細胞の微小環境、もしくは宿主細胞の生理学的状態などの１つ以上の条件、誘導因子（すなわち、誘導剤）、またはこれらの組み合わせによって誘導され得る。
発現に適切なプロモーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、好適な培養細胞株において）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、好適な動物モデルまたは対象において）で試験することができる。コードされる免疫チェックポイント調節剤（複数可）が抗体、特にｍＡｂを含む場合、当該免疫チェックポイント調節剤の重鎖構成成分を発現するのに好適なプロモーターの例には、ＣＭＶ、ＳＶ及びワクシニアウイルスのｐＨ５Ｒ、Ｆ１７Ｒ及びｐｌｌＫ７．５プロモーターが含まれ、当該免疫チェックポイント調節剤の軽鎖構成成分を発現するのに好適なプロモーターの例には、ＰＧＫ、ベータアクチンならびにワクシニアウイルスのｐ７．５Ｋ、Ｆ１７Ｒ及びｐＡ３５Ｒプロモーターが含まれる。
プロモーターは、より強いプロモーターまたはより弱いプロモーターに置き換えることができ、その置き換えによってウイルスの弱毒化に変化が生じる。本明細書で使用される場合、プロモーターをより強いプロモーターに置き換えることは、ゲノムからプロモーターを除去し、置き換えるプロモーターと比べて転写開始レベルが増加するように作用するプロモーターに置き換えることを指す。典型的に、より強いプロモーターは、置き換えるプロモーターと比べて、ポリメラーゼ複合体へ結合する能力が改善している。結果として、より強いプロモーターに作動可能に連結されるオープンリーディングフレームは、より高い遺伝子発現レベルを有する。同様に、プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることは、ゲノムからプロモーターを除去し、置き換えるプロモーターと比べて転写開始レベルが減少するプロモーターに置き換えることを指す。典型的に、より弱いプロモーターは、置き換えるプロモーターと比べて、ポリメラーゼ複合体へ結合する能力が低下している。結果として、より弱いプロモーターに作動可能に連結されるオープンリーディングフレームは、より低い遺伝子発現レベルを有する。ウイルスは、より強いプロモーターと弱いプロモーターを使用した結果として、弱毒化などの特徴の違いを示し得る。例えば、ワクシニアウイルスにおいて、合成初期／後期及び後期プロモーターは、相対的に強いプロモーターであるが、ワクシニア合成初期、Ｐ７．５ｋ初期／後期、Ｐ７．５ｋ初期、及びＰ２８後期プロモーターは、相対的に弱いプロモーターである（例えば、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３（６）１０９４－１０９７参照）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプロモーターは、弱いプロモーターである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプロモーターは、強いプロモーターである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、腫瘍溶解性ウイルスのウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、初期ウイルスプロモーター、後期ウイルスプロモーター、中間ウイルスプロモーター、または初期／後期ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、合成初期、初期／後期、または後期ウイルスプロモーターなどの合成ウイルスプロモーターである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ワクシニアウイルスプロモーターである。本発明における使用のための例示的なワクシニアウイルスプロモーターとしては、Ｐ７．５ｋ、Ｐ１１ｋ、ＰＳＥ、ＰＳＥＬ、ＰＳＬ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、Ｐ２８、Ｃ１１Ｒ、Ｇ８Ｒ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ３Ｌ、Ｉ８Ｒ、Ａ１Ｌ、Ａ２Ｌ、Ａ３Ｌ、Ｈ１Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｈ５Ｌ、Ｈ６Ｒ、Ｈ８Ｒ、Ｄ１Ｒ、Ｄ４Ｒ、Ｄ５Ｒ、Ｄ９Ｒ、Ｄ１１Ｌ、Ｄ１２Ｌ、Ｄ１３Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｐ４ｂまたはＫ１プロモーターを挙げることができるが、これらに限定されない。
例示的なワクシニア初期、中間及び後期プロモーターとしては、例えば、ワクシニアＰ７．５ｋ初期／後期プロモーター、ワクシニアＰＥＬ初期／後期プロモーター、ワクシニアＰ１３初期プロモーター、ワクシニアＰ１１ｋ後期プロモーター及び本明細書に別途列挙されるワクシニアプロモーターが挙げられる。例示的な合成プロモーターとしては、例えば、ＰＳＥ合成初期プロモーター、ＰＳＥＬ合成初期／後期プロモーター、ＰＳＬ合成後期プロモーター、本明細書に別途列挙されるワクシニア合成プロモーターが挙げられる。（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：９４３１－９４３５（１９８８）；Ｄａｖｉｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１０：７４９－７６９（１９８９）；Ｄａｖｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４２８５－４２８６（１９９０）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０９４－１０９７（１９９７））。異なるプロモーターの組み合わせは、同じウイルスまたは２つの異なるウイルスで異なる遺伝子産物を発現するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、少なくとも感染後期中に転写を誘導するプロモーター（配列番号６１に示されるＦ１７Ｒプロモーターなど）が採用される。いくつかの実施形態において、後期プロモーターは、Ｆ１７Ｒ、Ｉ２Ｌ後期プロモーター、Ｌ４Ｒ後期プロモーター、Ｐ７．５ｋ初期／後期プロモーター、ＰＥＬ初期／後期プロモーター、Ｐ１１ｋ後期プロモーター、ＰＳＥＬ合成初期／後期プロモーター、及びＰＳＬ合成後期プロモーターからなる群から選択される。後期ワクシニアウイルスプロモーターＦ１７Ｒは、腫瘍細胞がＶＶ感染した後にのみ活性化されるので、Ｆ１７Ｒプロモーターの使用により、ＶＶからの異種タンパク質または核酸の腫瘍選択的発現が更に増大されることになる。いくつかの実施形態において、本発明の異種タンパク質または核酸の後期発現は、Ｔ細胞活性化及びＴ細胞媒介性腫瘍溶解の前に、十分なウイルス複製を可能にする。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドプロモーターである。いくつかの実施形態において、ハイブリッドプロモーターは、合成初期／後期ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトプロモーターの部分的または完全なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒトプロモーターは、組織または腫瘍特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、腫瘍特異的プロモーターは、腫瘍細胞における発現の増大を駆動するまたは腫瘍細胞における特異的な発現を駆動するプロモーター（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）の発現を駆動するプロモーター）であり得る。いくつかの実施形態において、ハイブリッドプロモーターは、組織または腫瘍特異的プロモーターの部分的または完全ヌクレオチド配列と、組織または腫瘍特異的プロモーターと比べてハイブリッドプロモーターの強度を増加させるヌクレオチド配列（例えば、ＣＭＶプロモーター配列）とを含む。組織または腫瘍特異的プロモーターを含むハイブリッドプロモーターの非限定的な例としては、ｈＴＥＲＴとＣＭＶのハイブリッドプロモーターまたはＡＦＰとＣＭＶのハイブリッドプロモーターが挙げられる。
Ｃ．操作された免疫細胞
本出願のいくつかの態様において、キメラ受容体を発現する操作された免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ－Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＮＫＴ細胞である。
本明細書に記載される操作された免疫細胞のいくつかの実施形態は、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を直接的または間接的に活性化させることが可能である、１つ以上の操作されたキメラ受容体を含む。例示的な操作された受容体としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、操作されたＴ細胞受容体、及びＴＣＲ融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、自己細胞（治療される対象から得られた細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、同種細胞であり、容易に単離できる及び／または市販の様々な細胞／細胞株を含み得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞上に１つ以上の標的結合特異性をグラフトするために使用することができる操作された受容体を指す。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞受容体及び／または他の受容体の細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
本明細書に記載される操作された免疫細胞のいくつかの実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合部分と、ＣＡＲを発現する免疫細胞を直接的または間接的に活性化させる一次免疫細胞シグナル伝達分子または一次免疫細胞シグナル伝達ドメインを含むエフェクタータンパク質またはその断片とを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナルドメインを含む。ＣＡＲを含む操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）も提供される。抗原結合部分及びエフェクタータンパク質またはその断片は、１つ以上のポリペプチド鎖に存在し得る。例示的なＣＡＲコンストラクトは、例えば、ＵＳ９７６５３４２Ｂ２、ＷＯ２００２／０７７０２９、及びＷＯ２０１５／１４２６７５に記載されており、参照により本明細書に援用される。既知のＣＡＲコンストラクトのいずれか１つが本出願に使用され得る。
いくつかの実施形態において、一次免疫細胞シグナル伝達分子または一次免疫細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内のシグナル伝達ドメインは、一次免疫細胞シグナル伝達ドメインからなるか、または本質的になる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、共刺激分子またはその断片を更に含む。いくつかの実施形態において、共刺激分子またはその断片は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドからなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列を含む共刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達配列を含む。
膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明で特に使用される膜貫通領域は、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともその膜貫通領域（複数可）を含む）。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、クローンＦＭＣ６３に由来するＣＤ１９ ｓｃＦｖ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＩＣ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７）、ＣＨ２－ＣＨ３スペーサー、ＣＤ２８－ＴＭ、４１ＢＢ、及びＣＤ３ζを含むＣＤ－１９ ＣＡＲである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、その場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性の残基を主に含み得る。いくつかの実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に存在し得る。いくつかの実施形態において、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー、例えば、約２～約１０アミノ酸長（約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のいずれかなど）の長さを有するものが膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシン－セリンダブレットである。
いくつかの実施形態において、細胞内ドメイン中の配列のうちの１つと天然に関係する膜貫通ドメインが使用される（例えば、細胞内ドメインがＣＤ２８共刺激配列を含む場合、膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインに由来する）。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、かかるドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合しないように、選択されるか、またはアミノ酸置換によって修飾され得る。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つを活性化する役割を果たす。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能のシグナルを伝達し、その細胞に特殊な機能を発揮させるようにするタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用され得るが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインが短縮された部分で使用される限りにおいて、そのような短縮された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、インタクトな鎖の代わりに使用することができる。したがって、「細胞内シグナル伝達配列」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
本出願のＣＡＲに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するＴＣＲ及び共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント及び同じ機能性を有する任意の合成配列が挙げられる。
ＴＣＲを通して生成されるシグナルだけでは、Ｔ細胞の完全な活性化に十分ではなく、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを介して抗原依存的に一次活性化を開始するもの（一次シグナル伝達配列）と、抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを与えるもの（共刺激シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。
一次シグナル伝達配列は、刺激性または抑制性のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激を与えるように作用する一次シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。ＣＡＲコンストラクトは、いくつかの実施形態において、１つ以上のＩＴＡＭを含む。本発明で特に有用である一次シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζに由来する一次シグナル伝達配列を含む。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列のみを含んでもよいし、本明細書に記載されるＣＡＲとの関係において有用な任意の他の望ましい細胞内シグナル伝達配列（複数可）と組み合わせてもよい。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列及び共刺激シグナル伝達を含み得る。共刺激シグナル伝達配列は、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む、共刺激分子の細胞内ドメインの一部分であり得る。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達配列及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達配列及び４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達配列ならびにＣＤ２８及び４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、ｓｃＦｖまたはＦａｂを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、限定するものではないが、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＨ１７、及び臨床上意義のある他の腫瘍抗原などの腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原に対して標的化される。いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、腫瘍細胞に（例えば、組み換え腫瘍溶解性ウイルスによって）送達される外来抗原を指向する。いくつかの実施形態において、外来抗原は、ＤＡＳ１８１またはその誘導体である（例えば、実施例１１及び１５に記載されているようなアンカリングドメインのないＤＡＳ１８１の膜貫通型シアリダーゼドメイン）。
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスを使用して腫瘍細胞に送達されたシアリダーゼドメイン（例えば、非ヒトシアリダーゼまたはその誘導体、例えば、ＤＡＳ１８１のシアリダーゼドメイン）は、腫瘍細胞の表面からシアル酸を除去する機能と、免疫細胞を媒介とした腫瘍細胞の殺傷を増大させる外来抗原としての機能の両方を持つ。いくつかの実施形態において、シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ウイルスは、シアリダーゼドメイン（例えば、ＤＡＳ１８１）を特異的に標的とする操作された免疫細胞と組み合わせることで、腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞の殺傷を増大させる。
本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか１つを発現する操作された免疫細胞（リンパ球、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）も本明細書で提供される。また、本明細書に記載されるＣＡＲのいずれか１つを発現する操作された免疫細胞を産生する方法であって、ＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを免疫細胞に導入することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、ベクターを免疫細胞に導入することは、免疫細胞にベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態において、ベクターを免疫細胞に導入することは、免疫細胞にベクターをトランスフェクトすることを含む。ベクターの免疫細胞への形質導入またはトランスフェクションは、当該技術分野において知られている任意の方法を使用して実施することができる。
操作されたＴ細胞受容体
いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞がＴ細胞である場合、Ｔ細胞受容体は、内因性Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲを含む操作された免疫細胞が予め選択される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞受容体は、組み換えＴＣＲである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、腫瘍抗原に特異的である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、フィブリン－３、ＣＤＨ１７、及び臨床上意義のある他の腫瘍抗原からなる群から選択される。腫瘍抗原（腫瘍関連抗原を含む）に特異的なＴＣＲは、数多く記載されており、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１がん精巣抗原、ｐ５３腫瘍抑制抗原、黒色腫（例えば、ＭＡＲＴＩ、ｇｐ１００）、白血病（例えば、ＷＴ１、マイナー組織適合抗原）、及び乳癌（例えば、ＨＥＲ２、ＮＹ－ＢＲ１）の腫瘍抗原に対するＴＣＲが含まれる。当該技術分野において知られているＴＣＲのいずれかも本出願に使用され得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、腫瘍抗原に対する親和性が増大している。例示的なＴＣＲ及びＴＣＲを免疫細胞に導入する方法は、例えば、ＵＳ５８３０７５５及びＫｅｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，９５７－９６１（２００１）に記載されている。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞である。
ＴＣＲ融合タンパク質（ＴＦＰ）
いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＴＣＲ融合タンパク質（ＴＦＰ）を含む。本明細書で使用される「ＴＣＲ融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、またはＣＤ３γを含む、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体のサブユニットまたはその一部分に融合した細胞外標的結合ドメインを含む操作された受容体を指す。ＴＣＲ－ＣＤ３複合体のサブユニットまたはその一部分は、天然に存在するＴＣＲ－ＣＤ３サブユニットの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの少なくとも一部分を含む。ＴＦＰは、ＴＣＲ－ＣＤ３サブユニットの細胞外ドメインまたはその一部分を含む。
標的結合部分として抗体断片を含む例示的なＴＦＰコンストラクトは、例えば、ＷＯ２０１６１８７３４９及びＷＯ２０１８０９８３６５に記載されており、参照により本明細書に援用される。
操作された免疫細胞の腫瘍関連抗原への標的化
操作された免疫細胞は、様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または免疫細胞受容体のいずれかに対して標的化することができ、限定するものではないが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＤ－Ｌ１、ＥｐＣＡＭ、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ－１９などが含まれる。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、本明細書で提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスを、これらまたは任意数の既知のがん抗原を発現するがん細胞に送達するために使用することができる。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを使用して腫瘍細胞に送達される外来抗原（例えば、細菌ペプチドまたは細菌シアリダーゼ）に対して標的化することができる。操作された免疫細胞は、限定されるものではないが、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、フィブリン－３、ＣＤＨ１７、及び臨床上意義のある他の腫瘍抗原などの様々な免疫細胞抗原を発現する様々な免疫細胞に対して標的化することができる。
操作された免疫細胞は、操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲＴ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、またはＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）を送達する当該技術分野において知られている任意の方法で患者に送達することができる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼを発現する操作された免疫細胞によって表面上に発現されるまたは分泌されるシアリダーゼは、免疫細胞及び／または腫瘍細胞上に発現されるシアログリカンからシアル酸を除去することができる。腫瘍細胞上のシアル酸が除去されると、Ｓｉｇｌｅｃ／シアル酸軸及び他のセレクチン相互作用を介した腫瘍細胞の抑制性シグナルとのかかわりがなくなった樹状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が更に活性化し得る。これらの相互作用は、がんに対する免疫活性化を更に増大させ、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を変化させ得る。腫瘍細胞に関して、腫瘍細胞は、脱シアリル化されると、活性化されたＮＫ細胞及びＴ細胞ならびに他の免疫細胞による攻撃に曝されるようになり、腫瘍サイズが縮小する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される操作された免疫細胞は、シアリダーゼが膜に結合するように、膜貫通ドメインに融合されたシアリダーゼ、例えば、限定するものではないが、ＤＡＳ１８１のシアリダーゼドメインを免疫細胞表面膜上に発現するように操作することができる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、例えば、膜貫通ドメインに融合され得る。
いかなる理論または仮説に束縛されることなく、膜に結合したシアリダーゼは、自由に循環することはなく、ＣＡＲ－Ｔの標的細胞、すなわち、ＣＡＲ－Ｔ受容体が標的とする抗原を発現する腫瘍細胞にのみ接触する。例えば、ＣＡＲ－ＴがＣＤ－１９受容体またはＣＤ１９に対するｍＡｂを発現するＣＡＲ－Ｔである場合、膜に結合したシアリダーゼは、主にＣＤ－１９を発現する腫瘍細胞にのみ接触する。このようにして、シアリダーゼは、赤血球などの非標的細胞を脱シアリル化することなく、主に腫瘍細胞からのみシアル酸を除去する。本明細書に記載されるＣＡＲ－Ｔはまた、限定するものではないが、分泌型のＤＡＳ１８１などの分泌シアリダーゼを発現するように操作することができる。
Ｄ．腫瘍溶解性ウイルス及びキャリア細胞
いくつかの実施形態において、本出願は、本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つを含むキャリア細胞を提供する。いくつかの実施形態において、キャリア細胞は、免疫細胞または幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、上記のサブセクションＣに記載される操作された免疫細胞のいずれかなどの操作された免疫細胞である。
キャリア細胞（例えば、免疫細胞または幹細胞）の集団は、腫瘍溶解性ウイルスに感染し得る。シアリダーゼ含有ウイルスは、任意の適切な生理学的に許容される細胞キャリアで投与され得る。多重感染度は、一般に、約０．００１～１０００の範囲、例えば、０．００１～１００の範囲である。ウイルス含有細胞は、１回以上投与され得る。あるいは、ウイルスＤＮＡを使用して、リポソーム、当該技術分野においてよく知られている一般的なトランスフェクション方法（リン酸カルシウム沈殿及びエレクトロポレーションなど）などを利用することで、エフェクター細胞にトランスフェクトすることができる。ウイルスのトランスフェクション効率が高いため、高レベルの改変された細胞を達成することができる。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む操作された免疫細胞は、ウイルスと免疫細胞を一定期間インキュベートすることによって調製することができる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、細胞のウイルス感染、及び１つ以上のウイルスにコードされた異種タンパク質（複数可）（例えば、シアリダーゼ及び／または本明細書に記載される免疫調節タンパク質のいずれか）の発現に十分な時間、ウイルスとインキュベートすることができる。
組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含むキャリア細胞（例えば、免疫細胞または幹細胞）の集団は、レシピエントに注入され得る。本発明の細胞の投与に関する適否の決定は、とりわけ、血清学的指標及び組織生検の組織学検査などの評価可能な臨床パラメータに依存する。一般に、医薬組成物が投与される。投与経路には、全身注射、例えば、血管内、皮下、または腹腔内注射、腫瘍内注射などが含まれる。
ＩＩＩ．治療方法
本出願は、がん（例えば、固形腫瘍）を治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルス、医薬組成物、または操作された免疫細胞のいずれか１つの有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量を個体に投与することを含み、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される、方法が提供される。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、モルビリウイルス属ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、ポックスウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、またはコクサッキーウイルス、またはその派生体である。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃである。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、レオウイルスである。いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス（例えば、Ｅ１ＡＣＲ２欠失を有するアデノウイルス）である。
いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、ポックスウイルスである。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスは、ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、Ｄｒｙｖａｘ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｍ６３、ＬＩＶＰ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （ＮＹＣＢＯＨ）、Ｄａｉｒｅｎ、Ｉｋｅｄａ、ＬＣ１６Ｍ８、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、ＩＨＤ－Ｊ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、Ｄａｉｒｅｎ Ｉ、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＣＬ、Ｌｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ、もしくはＡＳなどの株、またはその派生体のものである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅである。
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、キャリア細胞（例えば、免疫細胞または間葉系幹細胞などの幹細胞）を介して投与される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ネイキッドウイルスとして投与される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内注射を介して投与される。
いくつかの実施形態において、方法は、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含み、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結され、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、対応する野生型株と比較して、ウイルスの免疫原性を減少させる１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ワクシニアウイルス（例えば、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）であり、１つ以上の変異は、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ及びＬ１Ｒからなる群から選択される１つ以上のタンパク質または他の免疫原性タンパク質（例えば、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１３、Ｌ１、Ｈ３、Ｄ８、Ａ３３、Ｂ５、Ａ５６、Ｆ１３、Ａ２８、及びＡ２７）にある。いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、Ａ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ及びＬ１Ｒからなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある。いくつかの実施形態において、ウイルスは、（ａ）配列番号６６～６９のいずれか１つに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質、（ｂ）配列番号７０～７２または８５のいずれか１つに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質、（ｃ）配列番号７３に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ａ２７Ｌタンパク質、及び（ｄ）配列番号７４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、方法は、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含み、シアリダーゼは、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）－ＧａｌシアリダーゼまたはＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）－Ｇａｌシアリダーゼである。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、細菌シアリダーゼ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼまたはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ）またはその誘導体である。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、大型細菌シアリダーゼのアミノ酸配列の全部または一部を含むか、あるいは、大型細菌シアリダーゼのアミノ酸配列の全部または一部に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、シアリダーゼドメインは、配列番号２もしくは２７を含むか、または配列番号１２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するシアリダーゼ配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼドメインは、配列番号２６のアミノ酸２７４～６６６にわたるＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼの触媒ドメインを含み、配列番号２６のアミノ酸２７４～６６６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ヒトシアリダーゼ（例えば、ＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、またはＮＥＵ４）、またはその誘導体である。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、天然に存在するシアリダーゼである。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、シアリダーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、アンカリング部分を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、アンカリングドメインに融合されたシアリダーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、生理学的ｐＨで正に帯電する。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインである。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号１～３３または５３～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、９０％、または９５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、９０％、または９５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１である。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、分泌ペプチド（例えば、シアリダーゼに作動可能に連結されるシグナル配列またはシグナルペプチド）を含む。いくつかの実施形態において、分泌配列は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインまたは膜貫通ドメインは、シアリダーゼのカルボキシ末端に位置する。
いくつかの実施形態において、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含むキャリア細胞（例えば、免疫細胞または間葉系幹細胞などの幹細胞）の有効量を個体に投与することを含み、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、細菌シアリダーゼ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼまたはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ）またはその誘導体である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼに由来する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１またはその誘導体である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼに作動可能に連結される分泌配列（例えば、分泌配列または分泌ペプチド）を更に含む。いくつかの実施形態において、分子は、膜貫通ドメインに連結されたシアリダーゼを含む。いくつかの実施形態において、キャリア細胞は、操作された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、ＣＡＲなどのキメラ受容体を発現する。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、腫瘍関連抗原、及び抗腫瘍免疫応答及び腫瘍殺傷機能を刺激することができるコードされた他の分子を特異的に認識する。
いくつかの実施形態において、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、（ａ）シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量、または組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含むキャリア細胞の有効量；及び（ｂ）キメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、細菌シアリダーゼ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼまたはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ）である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、アンカリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、ＧＡＧ結合タンパク質ドメイン、例えば、ヒトアンフィレグリンの上皮アンカリングドメインである。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、生理学的ｐＨで正に帯電する。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、ＧＰＩリンカーである。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原を認識する。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、（ａ）シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量、または組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含むキャリア細胞の有効量；及び（ｂ）シアリダーゼを特異的に認識するキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、細菌シアリダーゼ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼまたはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ）である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、アンカリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、ＧＡＧ結合タンパク質ドメイン、例えば、ヒトアンフィレグリンの上皮アンカリングドメインである。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、生理学的ｐＨで正に帯電する。いくつかの実施形態において、アンカリングドメインは、ＧＰＩリンカーである。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、シアリダーゼ（例えば、ＤＡＳ１８１）を特異的に認識し、ヒト天然型アンフィレグリンまたは任意の他のヒト抗原と交差反応しない。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、ＣＡＲである。
いくつかの実施形態において、個体のがん細胞に外来抗原を送達する方法であって、外来抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量を個体に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、外来抗原は、細菌タンパク質である。いくつかの実施形態において、外来抗原は、シアリダーゼである。いくつかの実施形態において、外来抗原は、細菌シアリダーゼ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼまたはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ）である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１のシアリダーゼ触媒ドメインである。いくつかの実施形態において、方法は、操作された免疫細胞を投与することを更に含む。いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞は、外来抗原または治療される腫瘍の任意の該当する腫瘍関連抗原もしくは腫瘍特異的抗原を特異的に認識するキメラ受容体を発現する。
いくつかの実施形態において、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、（ａ）外来抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量；及び（ｂ）当該外来抗原を特異的に認識するキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、がんを治療する方法であって、（ａ）シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量；及び（ｂ）免疫療法の有効量を個体に投与することを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、個体の腫瘍を免疫療法に感作させる方法であって、上記シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つの有効量を個体に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、細菌シアリダーゼ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼまたはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ）またはその誘導体である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼに由来する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１である。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、シアリダーゼに作動可能に連結される分泌配列（例えば、分泌シグナルペプチド）を更にコードする。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、膜貫通ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、免疫療法の有効量を個体に投与することを更に含む。いくつかの実施形態において、免疫療法は、多重特異性免疫細胞エンゲージャー（例えば、二重特異性分子）、細胞療法、がんワクチン（例えば、樹状細胞（ＤＣ）がんワクチン）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、アルファ受容体への結合のないまたは結合が減少した改変ＩＬ－２、ＩＬ－１８ ＢＰへの結合のないまたは結合が減少した改変ＩＬ－１８、ＣＸＣＬ１０、またはＣＣＬ４）、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、またはＨＬＡの阻害薬）、マスタースイッチ抗ＬＩＬＲＢ、及び二重特異性の抗ＬＩＬＲＢ－４－１ＢＢ、抗ＦＡＰ－ＣＤ３、ＰＩ３Ｋガンマ阻害薬、ＴＬＲ９リガンド、ＨＤＡＣ阻害薬、ＬＩＬＲＢ２阻害薬、ＭＡＲＣＯ阻害薬などである。
いくつかの実施形態において、免疫療法は、細胞療法である。細胞療法は、有効量の生細胞（例えば、免疫細胞）を個体に投与することを含む。非限定的な例において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、サイトカイン誘導ナチュラルキラー（ＣＩＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、細胞療法は、本明細書に記載される免疫細胞種のいずれか１つの発達中の中間体（例えば、前駆細胞）を投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞療法剤は、ｅｘ ｖｉｖｏ培養で増殖して殺傷活性を獲得した拡大ＰＢＭＣなどの独立した不均質の細胞集団を含む。好適な細胞療法は、例えば、Ｈａｙｅｓ，Ｃ．“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．”Ｉｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ（２０２０）に記載されている。いくつかの実施形態において、細胞療法は、エフェクターＴ細胞（ＣＤ３、ＣＤ３８及びＩＬ－２）またはいくつかの場合にはＴ細胞及びＮＫ細胞（ＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１）を活性化するために、様々なサイトカインと抗体の組み合わせで刺激したＰＢＭＣ細胞を含む。実施例３、５、及び６は、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスと細胞療法の組み合わせを使用することにより、腫瘍細胞の殺傷が増大したことを示す結果を提供する。
いくつかの実施形態において、細胞療法は、免疫細胞の有効量を個体に投与することを含み、免疫細胞は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで抗原に曝露することによって、腫瘍抗原に応答するように感作されている。
いくつかの実施形態において、細胞療法は、上記「操作された免疫細胞」のセクションに記載されるキメラ受容体のいずれか１つなどのキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞療法は、有効量のＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、またはＣＡＲ－ＮＫＴ細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、内因性腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原などの腫瘍細胞によって発現される抗原を認識する。非限定的な例において、キメラ受容体は、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、フィブリン－３、ＣＤＨ１７、及び臨床上意義のある他の腫瘍抗原などの腫瘍抗原を認識することができる。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、本明細書で提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つを介して腫瘍細胞に送達される異種タンパク質などの、腫瘍細胞によって発現される外来抗原を認識する。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスによって送達される外来抗原は、細菌ペプチドまたは細菌シアリダーゼ、例えば、ＤＡＳ１８１（配列番号２）である。いくつかの実施形態において、外来抗原は、膜貫通ドメインを含むシアリダーゼである。いくつかの実施形態において、外来抗原は、ＡＲタグのないＤＡＳ１８１であり、Ｃ末端膜貫通ドメインに融合される（例えば、配列番号３１）。
いくつかの実施形態において、免疫療法を必要とする個体における免疫療法の有効性を増加させる方法であって、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量及び免疫療法の有効量を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、免疫療法は、多重特異性免疫細胞エンゲージャー（例えば、ＢｉＴＥ）、細胞療法、がんワクチン（例えば、樹状細胞（ＤＣ）がんワクチン）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、改変ＩＬ－２、改変ＩＬ－１８、ＣＸＣＬ１０、またはＣＣＬ４）、及び免疫チェックポイント阻害薬（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３またはＨＬＡ－Ｇの阻害薬）である。いくつかの実施形態において、免疫療法は、細胞療法、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、サイトカイン－誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、サイトカイン誘導ナチュラルキラー（ＣＩＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、またはこれらの組み合わせを含む細胞療法である。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、免疫療法の前、後、または同時に投与される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを投与することは、腫瘍細胞の殺傷を、免疫療法単独と比較して少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％増加させる。
いくつかの実施形態において、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含み、免疫細胞は、異種タンパク質をコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスを発現する、方法が提供される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、がんに関連する標的分子を特異的に認識するキメラ受容体を発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ウイルスによってコードされるシアリダーゼを特異的に認識するキメラ受容体を発現する。
いくつかの実施形態において、がんを治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含み、免疫細胞は、異種タンパク質をコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスを発現し、異種タンパク質は、シアリダーゼである、方法が提供される。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、がんに関連する標的分子を特異的に認識するキメラ受容体を発現する。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ウイルスによってコードされるシアリダーゼを特異的に認識するキメラ受容体を発現する。
本出願の一態様は、個体のがん細胞のシアル化を減少させる方法であって、上記の組み換え腫瘍溶解性ウイルス、医薬組成物、または操作された免疫細胞のいずれか１つの有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、腫瘍細胞上の表面シアル酸を減少させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、腫瘍細胞上の表面シアル酸を、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％減少させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは腫瘍細胞の細胞表面からα２，３とα２，６の両方のシアル酸を切断する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、α２，３とα２，６の両方のシアル酸の切断を、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％増加させる。
いくつかの実施形態において、個体の免疫応答を促進させる方法であって、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、個体の腫瘍微小環境における局所的な免疫応答を促進する。いくつかの実施形態において、個体における樹状細胞（ＤＣ）の成熟を促進させる方法であって、シアリダーゼ（例えば、ＤＡＳ１８１）をコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量を投与することを含む、方法が提供される。ＤＣ成熟は、ＣＤ８０ならびにＤＣ ＭＨＣＩ及びＭＨＣ－ＩＩタンパク質などの樹状細胞マーカーの発現に基づいて決定することができる。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＤＣ成熟を、少なくとも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させる。実施例９は、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与後にＤＣ成熟が増加したことを示す結果を提供する。
いくつかの実施形態において、個体における免疫細胞による腫瘍細胞の殺傷を増加させる方法であって、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＮＫ細胞による殺傷を増加させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＮＫ細胞による殺傷を、少なくとも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＮＫ細胞による殺傷を、シアリダーゼを欠く組み換え腫瘍溶解性ウイルスと比較して、少なくとも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させる。実施例３は、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与により、ＮＫ細胞を媒介とした腫瘍細胞の殺傷が増大したことを示している。いくつかの実施形態において、方法は、Ｔ細胞による殺傷を増加させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、Ｔ細胞による殺傷を、少なくとも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、Ｔ細胞による殺傷を、シアリダーゼを欠く組み換え腫瘍溶解性ウイルスと比較して、少なくとも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させる。実施例１０は、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与により、ＮＫ細胞を媒介とした腫瘍細胞の殺傷が増大したことを示している。いくつかの実施形態において、方法は、ＰＢＭＣによる殺傷を増加させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＰＢＭＣによる殺傷を、少なくとも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＰＢＭＣによる殺傷を、シアリダーゼを欠く組み換え腫瘍溶解性ウイルスと比較して、少なくとも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させる。実施例６は、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与により、ＰＢＭＣを媒介とした腫瘍細胞の殺傷が増大したことを示している。
いくつかの実施形態において、個体の腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解性殺傷を増加させる方法であって、シアリダーゼの有効量を個体に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスによる腫瘍溶解性殺傷は、シアリダーゼを欠く組み換え腫瘍溶解性ウイルスと比較して、少なくとも、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％増加させる。実施例５は、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスにより、腫瘍溶解性殺傷が増大したことを示す結果を提供する。
いくつかの実施形態において、個体におけるサイトカイン産生及び腫瘍溶解性活性を増大させる方法であって、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、Ｔリンパ球によるサイトカイン産生を増大させる。いくつかの実施形態において、方法は、個体の腫瘍微小環境において、Ｔリンパ球を媒介としたサイトカイン産生を局所的に増大させる。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＬ２及びＩＦＮ－ガンマを含む。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスを投与することは、サイトカイン産生を、シアリダーゼを欠く腫瘍溶解性ウイルスを投与することと比較して、少なくとも、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％増大させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスを投与することは、ＩＬ２産生を、シアリダーゼを欠く腫瘍溶解性ウイルスを投与することと比較して少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、または少なくとも４倍増加させる。いくつかの実施形態において、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスを投与することは、ＩＦＮ－ガンマ産生を、シアリダーゼを欠く腫瘍溶解性ウイルスを投与することと比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％増大させる。実施例１０は、シアリダーゼをコードする組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与後にＴリンパ球によるサイトカイン産生及び殺傷が増大したことを示す。
本明細書で使用される場合、がんは、転移性癌、固形腫瘍、リンパ性腫瘍、及び血液癌を含む、任意の種類の悪性腫瘍または血液悪性腫瘍によって引き起こされるまたは特徴付けられる疾患のための用語である。
がんには、白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、肉腫、黒色腫、腺癌、乳癌及び膵癌を含む固形組織の癌腫、低酸素性腫瘍、口腔、咽頭、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、頸癌及び膀胱癌などの泌尿生殖器系癌、造血器癌、頭頸部癌、ならびにグリオーマ、星状細胞腫、髄膜腫などの神経系癌など、パピローマなどの良性病変などが含まれる。
いくつかの実施形態において、シアリダーゼの送達は、腫瘍細胞上に存在するシアル酸を減少させ、免疫細胞、免疫細胞ベースの治療法及びがん細胞の高シアル化によって有効性が低下する他の治療薬による殺傷に対して、腫瘍細胞を脆弱化させることができる。
いくつかの実施形態において、方法は、個体に有効量の免疫療法剤を投与することを更に含む。非限定的な例において、免疫療法剤は、多重特異性免疫細胞エンゲージャー、細胞療法、がんワクチン、サイトカイン、ＰＩ３Ｋガンマ阻害薬、ＴＬＲ９リガンド、ＨＤＡＣ阻害薬、ＬＩＬＲＢ２阻害薬、ＭＡＲＣＯ阻害薬、または免疫チェックポイント阻害薬であり得る。好適な免疫細胞エンゲージャー及び免疫チェックポイント阻害薬は、上記の「他の異種タンパク質または核酸」のサブセクションに記載されている。
いくつかの実施形態において、がんは、固形腫瘍を含む。本明細書で提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは、腺癌、転移性癌及び／または難治性癌である。前述の方法のいずれかのある特定の実施形態において、がんは、乳癌、結腸もしくは結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、腎癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌または尿路上皮癌である。前述の方法のいずれかのある特定の実施形態において、がんは、上皮癌、例えば、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌、卵管癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、泌尿器癌、膀胱癌、頭頸部癌、口腔癌または肝癌である。いくつかの実施形態において、がんは、ヒト肺胞基底上皮腺癌、ヒト乳頭上皮腺癌、及び膠芽腫から選択される。
いくつかの実施形態において、方法は、上記組み換え腫瘍溶解性ウイルス、医薬組成物、または操作された免疫細胞のいずれか１つの有効量、及びキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスによって発現される異種タンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、シアリダーゼ（例えば、ＤＡＳ１８１またはその誘導体、膜結合型のＤＡＳ１８１など）であり、キメラ受容体は、シアリダーゼを特異的に認識する。いくつかの実施形態において、シアリダーゼは、ＤＡＳ１８１またはその誘導体であり、キメラ受容体は、ヒト天然型アンフィレグリンまたは任意の他のヒト抗原と交差反応しない抗ＤＡＳ１８１抗体を含む。
一態様において、本出願は、腫瘍を治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、（ａ）外来抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量、及び（ｂ）当該外来抗原を特異的に認識するキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、外来抗原は、非ヒトタンパク質（例えば、細菌タンパク質）である。
いくつかの実施形態において、操作された免疫細胞及び組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、併用療法として、別々に（例えば、単剤療法として）または同時に（例えば、同じまたは別個の製剤において）投与される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、操作された免疫細胞の投与前に投与される。非限定的な例において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、キメラ受容体を含む操作された免疫細胞の１時間以上、２時間以上、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、または４８時間以上前に投与され得る。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを発現する操作された免疫細胞の集団は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスによって発現される異種タンパク質を標的とするキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞の集団の前に投与される。非限定的な例において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む操作された免疫細胞は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスによって発現される異種タンパク質を標的とするキメラ受容体を含む操作された免疫細胞の１時間以上、２時間以上、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、または４８時間以上前に投与することができる。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス（例えば、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物またはキャリア細胞）の投与とキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の投与との間の時間は、ウイルスが腫瘍細胞において異種タンパク質または核酸を発現するのに十分な時間である。
組み換え腫瘍溶解性ウイルス、またいくつかの実施形態においては、操作された免疫細胞及び／または追加の免疫療法剤（複数可）は、任意の好適な投与経路及び好適な投薬量を使用して投与され得る。適切な投薬量または投与経路の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。動物実験は、ヒトの治療法での有効量を決定するための信頼性の高い指針を提供する。有効量の種間スケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，”Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９，ｐｐ．４２－４６に記載の原則に従って実施することができる。
いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、操作された免疫細胞及び／または追加の免疫療法剤（複数可）は、順次投与される（例えば、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、操作された免疫細胞の前及び／または上記のような他の治療薬、例えば、ＦＡＰ／ＣＤ３の二重特異性抗体、ＬＩＬＲＢ－４－１ＢＢの二重特異性または三重特異性抗体、ＰＤ－１抗体などの前に投与することができる）。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、操作された免疫細胞及び／または追加の免疫療法剤（複数可）は、同時にまたは並行して投与される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、操作された免疫細胞及び／または追加の免疫療法剤（複数可）は、単一製剤で投与される。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、操作された免疫細胞及び／または追加の免疫療法剤（複数可）は、別個の製剤として投与される。
本発明の方法は、がん治療の従来の化学療法、放射線療法及び／または外科的方法と組み合わせてもよい。
ＩＶ．医薬組成物、キット及び製造品
本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルス、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含むキャリア細胞、及び／または操作された免疫細胞（複数可）のいずれか１つと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本出願によって更に提供される。
いくつかの実施形態において、本出願は、シアリダーゼ及び／または本明細書に記載される他の異種タンパク質もしくは核酸のいずれか１つをコードする第１のヌクレオチド配列を含む腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶなど）と、キメラ受容体（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、またはＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）または抗ＬＩＬＲＢ、抗葉酸受容体ベータ、抗ＬＩＬＲＢ／４－１ＢＢなどの二重特異性抗体などの免疫細胞機能を調節及び増大させることができる本明細書に記載される異種タンパク質もしくは核酸のいずれか１つを発現する操作された免疫細胞とを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本出願は、シアリダーゼ及び／または本明細書に記載される他の異種タンパク質もしくは核酸のいずれか１つをコードする第１のヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルス（ＶＶなど）及び任意選択により薬学的に許容される担体を含む、第１の医薬組成物と、キメラ受容体（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、またはＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）を発現する操作された免疫細胞及び任意選択により薬学的に許容される担体を含む、第２の医薬組成物とを提供する。
医薬組成物は、所望の純度を有する本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルス及び／または操作された免疫細胞を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合して凍結乾燥製剤または水溶液の形態にすることによって調製することができる。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、二亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化剤；保存剤、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）、安定剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；ＥＤＴＡなどのキレート剤及び／または非イオン性界面活性剤が含まれる。
製剤は、担体を含み得る。担体は、循環系に可溶であり、生理学的に許容される巨大分子である。ここで、生理学的に許容されるとは、治療レジームの一部として当該担体の患者への注射を当業者が認めることを意味する。担体は、好ましくは、循環系で比較的安定であり、クリアランスにとって許容可能な血漿半減期を有する。そのような巨大分子には、大豆レシチン、オレイン酸及びトリオレイン酸ソルビタンが含まれるが、これらに限定されない。
製剤はまた、ｐＨ維持、溶液安定化、または浸透圧の調節に有用な他の剤を含み得る。剤の例としては、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの塩、及びグルコース、ガラクトースまたはマンノースなどの炭水化物などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、シングルユース密封バイアルなどのシングルユースバイアルに封入される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、マルチユースバイアルに封入される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、容器にバルクで封入される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、凍結保存される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、安定的かつ無期限に、例えば、－８０℃などの凍結保存条件下で保存することができ、投与前に必要に応じてまたは所望に応じて解凍することができる。例えば、本明細書で提供されるシステムは、－２０℃または－８０℃などの保存温度で、少なくとも約数時間、１、２、３、４もしくは５時間、もしくは数日またはその間、例えば、少なくとも約数年またはその間、例えば、限定するものではないが、１、２、３年以上、例えば、少なくとももしくは約１、２、３、４もしくは５時間～少なくとももしくは約６、７、８、９、１０、１１，１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１，４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１もしくは７２時間、または４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５もしくは３０日または１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５もしくは１２ヶ月または１、２、３、４もしくは５年以上、投与のための解凍前に、保存することができる。本明細書で提供されるシステムはまた、安定的に、４℃などの冷蔵条件下で保存することができ、及び／または治療のために投与する場所へ氷上で運ぶことができる。例えば、本明細書で提供されるシステムは、４℃または氷上で、少なくとも約数時間またはその間、例えば、限定するものではないが、１、２、３、４または５時間～少なくともまたは約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７または４８時間以上、治療のための投与の前に、保存することができる。
本出願は、本明細書に記載される治療方法の任意の実施形態における使用のためのキット及び製造品を更に提供する。キット及び製造品は、本明細書に記載される製剤及び医薬組成物のいずれか１つを含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つを発現させるための１つ以上の核酸コンストラクト、及び組み換え腫瘍溶解性ウイルスを生産するための説明書を含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、がんを治療するための説明書を更に含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つ、及びがんを治療するための説明書を含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、免疫療法剤（例えば、細胞療法または本明細書に記載される免疫療法のいずれか１つ）を更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、がんを治療するための１つ以上の追加の治療薬を更に含む。いくつかの実施形態において、アンタゴニスト、組み換え腫瘍溶解性ウイルス及び／または１つ以上の免疫療法剤は、単一組成物（例えば、細胞療法及び組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物）である。いくつかの実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス及び任意選択により１つ以上の追加の免疫療法剤及び／またはがんを治療するための追加の治療薬は、別個の組成物である。
本発明のキットは、好適な包装がなされる。好適な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、軟包装（例えば、密閉されたマイラーまたはプラスチックバッグ）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、任意選択により、緩衝剤及び説明的情報などの追加の構成要素を備えてもよい。したがって、本出願は、バイアル（密封したバイアルなど）、ボトル、ジャー、軟包装などを含む製造品も提供する。
本明細書に開示される特徴は全て任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同一、同等、または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別途明示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の例に過ぎない。
以下の実施例は、本発明の純粋な例示であることを意図しており、したがって、決して本発明を限定するものであるとみなされるものではない。以下の実施例及び詳細な説明は、例示として提供されるものであり、限定するためのものではない。
実施例１：ＤＡＳ１８１処理は腫瘍細胞上の表面シアル酸を減少させる
本試験において、ある特定の腫瘍細胞のシアル酸負荷に対するＤＡＳ１８１の影響を試験した。簡潔に述べると、Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌）及びＭＣＦ（ヒト乳頭上皮腺癌）腫瘍細胞におけるα－２，３及びα－２，６のシアル酸修飾について、ＦＡＣｓ及び画像に基づく定量を実施した。Ａ５４９細胞及びＭＣＦ７細胞におけるシアル酸除去後のガラクトース露出を、フローサイトメトリー解析及びイメージング法を使用するＰＮＡ－ＦＩＴＣによって検出した。上述のように、α－２，３連結またはα－２，６連結によって最後から２番目の糖に結合していることが最も多い２つのシアル酸があり、それぞれＭａａｃｋｉａ ＡｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンＩＩ（ＭＡＬ ＩＩ）及びＳａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ）によって検出することができる。また、表面ガラクトース（例えば、シアル酸除去後に露出したガラクトース）は、ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）を使用して検出することができる。
図１は、ＦＩＴＣ－ＳＮＡによるＡ５４９及びＭＣＦ細胞におけるα－２，６シアル酸の検出を蛍光イメージングにより示す。
Ａ５４９細胞を様々な濃度のＤＡＳ１８１で処理し、次いで、染色して、２，６連結シアル酸（ＦＩＴＣ－ＳＮＡ）、α－２，３連結シアル酸（ＦＩＴＣ－ＭＡＬＩＩ）またはガラクトース（ＦＩＴＣ－ＰＮＡ）を撮像した。図２にみられるように、ＤＡＳ１８１は、２，３及び２，６連結シアル酸の両方を効果的に除去し、ガラクトースを露出させた。
対照的に、Ｙ３４８Ｆ変異に起因してシアリダーゼ活性を欠くＤＡＳ１８１のバリアントのＤＡＳ１８５は、α－２，６連結シアル酸もα－２，３連結シアル酸も除去することができなかった。図３に示されるように、Ａ５４９細胞とＤＡＳ１８５のインキュベーションは、表面α－２，３連結シアル酸に本質的な影響を与えなかったが、ＤＡＳ１８１は、表面α－２，３連結シアル酸を濃度依存的に減少させた（ＦＩＴＣ－ＭＡＬＩＩで染色した細胞；図３に結果を示す）。同様に、Ａ５４９細胞とＤＡＳ１８５のインキュベーションは、表面α２，６連結シアル酸に本質的な影響を与えなかったが、ＤＡＳ１８１は、表面α－２，６連結シアル酸を濃度依存的に減少させた（ＦＩＴＣ－ＳＮＡで染色した細胞；図４に結果を示す）。これらの結果と一致して、Ａ５４９細胞のＤＡＳ１８５とのインキュベーションは、表面ガラクトースに本質的な影響を与えなかったが、ＤＡＳ１８１は、表面ガラクトースを濃度依存的に増加させた（ＦＩＴＣ－ＰＮＡで染色した細胞；図５に結果を示す）。
実施例２：ＤＡＳ１８１処理はＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞殺傷を増加させる
実施例１により、ＤＡＳ１８１が幅広い特異性（例えば、α－２，３とα－２，６連結の両方の切断）で腫瘍細胞のシアル酸負荷を効果的に減少させることが実証された。実施例２は、腫瘍細胞をＤＡＳ１８１で処理すると、未処理の腫瘍細胞と比較して、処理した腫瘍細胞のＰＢＭＣを媒介とした殺傷が有意に増大することを示す。
簡潔に述べると、α－２，３及びα－２，６シアル酸のＦＡＣｓ及び画像に基づく定量。
Ａ５４９細胞を赤色蛍光タンパク質（Ａ５４９－ｒｅｄ）で遺伝子標識した。新鮮なヒトＰＢＭＣを採取し、様々なサイトカインと抗体の組み合わせで刺激して、エフェクターＴ細胞（ＣＤ３、ＣＤ３８及びＩＬ－２）またはいくつかの場合には、Ｔ細胞及びＮＫ細胞（ＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１）を活性化した。次いで、活性化したＰＢＭＣを、ＤＡＳ１８１（１００ｎＭ）に曝露させたＡ５４９－ｒｅｄ細胞と共培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅによる生細胞イメージング及び定量によって、ＰＢＭＣによる腫瘍細胞殺傷をモニタリングした。細胞培養培地を回収し、ＥＬＩＳＡによって解析してＰＢＭＣによるサイトカイン産生を評価した。
図６は、ＰＢＭＣを刺激するために使用した処理も、ＰＢＭＣを刺激するために使用した処理と組み合わせたＤＡＳ１８１も、Ａ５４９－ｒｅｄ細胞の増殖に影響しないことを示す。
図７は、ＤＡＳ１８１が、ビヒクルのみの対照と比較して、ＰＢＭＣ（ドナー１）によって媒介されるＴ細胞媒介及びＮＫ細胞媒介の両方の腫瘍細胞毒性を有意に増加させることを示す。異なるドナーに由来するＰＢＭＣを使用しても同様の結果が観察された（ドナー２；図８）。図９Ａ～Ｃは、図７に示されるデータの定量を提示する。図９Ａは、指定のエフェクター細胞：腫瘍細胞の比で、ＤＡＳ１８１を含めてまたは含めずにＰＢＭＣで処理した後のＡ５４９－ｒｅｄ細胞の定量を示す。図９Ｂは、指定のエフェクター細胞：腫瘍細胞の比で、ＤＡＳ１８１を含めてまたは含めずに、エフェクターＴ細胞を活性化するためにＣＤ３、ＣＤ３８及びＩＬ－２で刺激したＰＢＭＣで処理した後のＡ５４９－ｒｅｄ細胞の定量を示す。図９Ｃは、指定のエフェクター細胞：腫瘍細胞の比で、ＤＡＳ１８１を含めてまたは含めずに、エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞を活性化するためにＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１で刺激したＰＢＭＣで処理した後のＡ５４９－ｒｅｄ細胞の定量を示す。図１０Ａ～１０Ｃは、異なるドナー（ドナー２）に由来するＰＢＭＣを使用した、同じ定量をそれぞれ示す。
実施例３：腫瘍溶解性ワクシニアウイルス及びＤＡＳ１８１によるＮＫ細胞を媒介とした腫瘍細胞の殺傷
本試験において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＶＶ）及びＤＡＳ１８１のＮＫ細胞媒介性殺傷に対する影響を調べた。シアリダーゼ活性を欠くバリアントタンパク質ＤＡＳ１８５を対照として使用した。本実施例は、ＤＡＳ１８１への曝露により、腫瘍溶解性ウイルスによる腫瘍細胞の殺傷が増加することを示す。
簡潔に述べると、腫瘍細胞（Ｕ８７－ＧＦＰ）を、ＤＭＥＭ中、９６ウェル組織培養プレートに１ウェルあたり５×１０４細胞（１００ｕｌ）でプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。２日目に、ウシ胎児血清不含培地中で、細胞にＶＶをＭＯＩ ０．５、１、または２で２時間感染させ、次いで、１ｎＭのＤＡＳ１８１または１ｍＭのＤＡＳ１８５に曝露した。次いで、精製したＮＫ細胞と腫瘍細胞をエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）＝１：１、５：１、１０：１で混合した。ノイラミニダーゼ／シアリダーゼバックグラウンドを減少させるために、２％ＦＢＳを添加した培地で細胞を培養した。２４時間後、ＭＴＳアッセイ（９６ウェルプレート）によって腫瘍殺傷を測定し、細胞培養培地を回収した。ＩＦＮガンマの発現をＥＬＩＳＡによって測定した。本試験の結果を図１１及び図１２に示す。不活性なＤＡＳ１８５ではなく、ＤＡＳ１８１が腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる腫瘍細胞の殺傷を増加させたことがわかる。
実施例４：腫瘍細胞の存在下におけるＤＣ成熟及びマクロファージ活性に対するＤＡＳ１８１の影響
本試験において、単球由来樹状細胞またはマクロファージに対するＤＡＳ１８１の影響を試験した。シアリダーゼ活性を欠くバリアントタンパク質ＤＡＳ１８５を対照として使用した。
簡潔に述べると、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を添加した３ｍｌの培地に５×１０６個の付着性ＰＢＭＣを再懸濁することによって、単球由来樹状細胞（ＤＣ）を調製した。４８時間後、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を添加した新鮮な培地２ｍｌを各ウェルに加えた。更に７２時間後、腫瘍細胞（Ｕ８７－ＧＦＰ）をＤＭＥＭ中の２４ウェルプレートにプレーティングした。ＦＢＳ不含培地中で、腫瘍細胞にＶＶを様々なＭＯＩで２時間感染させた。１ｎＭのＤＡＳ１８１またはＤＡＳ１８５の存在下で培養したＤＣを、１：１の腫瘍細胞：ＤＣの比で腫瘍細胞と混合した。樹状細胞成熟（ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ－ＩＩ、ＭＨＣ－Ｉの発現）。
加えて、ＴＨＰ－１細胞を１０％熱不活性化ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。６ウェルプレート中のＴＨＰ－１細胞（３×１０ｅ６細胞／ウェル）を、１ｎＭのシアリダーゼＤＡＳ１８１またはＤＡＳ１８５の非存在下及び存在下でＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）により刺激した。細胞培養培地の体積は、２ｍｌであった。５日目に、腫瘍細胞（Ｕ８７－ＧＦＰ、ＤＭＥＭ細胞培養培地）を２４ウェル組織培養プレートにプレーティングした。ＦＢＳ不含培地中で、腫瘍にＶＶを様々なＭＯＩ（すなわち、０．５、１、２）で２時間感染させた。ＴＨＰ－１細胞培養については、１．５ｍｌの細胞培養培地をピペットで除去した。分化したＴＨＰ－１細胞を、イオノマイシン（１ｕｇ／ｍｌ）及びＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）により、また、１ｎＭのシアリダーゼＤＡＳ１８１またはＤＡＳ１８５の非存在下及び存在下、ならびに１：１の腫瘍：マクロファージ比の腫瘍細胞－ＶＶで１２時間更に刺激した。ノイラミニダーゼバックグラウンドを減少させるために、２％ＦＢＳを添加した培地でＴＨＰ－１細胞を培養した。６日目に、培養培地中のサイトカインの濃度をＥＬＩＳＡアレイによって測定した。
図１３にみられるように、ＤＡＳ１８１は、細胞が単独で培養されたか、ワクシニアウイルス感染腫瘍細胞とともに培養されたかにかかわらず、樹状細胞成熟マーカーの発現を有意に増大させた。
更に、本試験の結果は、ＤＡＳ１８１への曝露が、ＴＨＰ－１由来マクロファージによるＴＮＦ－アルファ分泌を増加させることを示している（図１４）。
実施例５：ＤＡＳ１８１は免疫細胞の非存在下における腫瘍溶解性アデノウイルスの腫瘍細胞殺傷を増加させる
本実施例は、ＤＡＳ１８１による処理が、免疫細胞がない状態であっても、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍細胞殺傷を増加させることを示す予想外の結果を提供する。
Ａ５４９細胞を赤色蛍光タンパク質（Ａ５４９－ｒｅｄ）で遺伝子標識した。腫瘍細胞の増殖及びＤＡＳ１８１の存在下または非存在下における腫瘍溶解性アデノウイルス（Ａｄ５）による殺傷を、ＩｎｃｕＣｙｔｅによる生細胞イメージング及び定量によって、モニタリングした。ＰＢＭＣによるサイトカイン産生のＥＬＩＳＡ測定のために、細胞培養培地を回収した。図１５に示されるように、ＤＡＳ１８１は、腫瘍溶解性アデノウイルスを媒介とした腫瘍細胞殺傷及び成長阻害を増加させた。
実施例６：ＤＡＳ１８１はＰＢＭＣの存在下における腫瘍溶解性アデノウイルスの腫瘍細胞殺傷を増加させる
実施例５に示されるように、ＤＡＳ１８１による処理は、免疫細胞の非存在下で、腫瘍溶解性ウイルスによる腫瘍細胞の殺傷を増加させる。実施例６は、ＤＡＳ１８１による処理が、ＰＢＭＣの存在下で腫瘍溶解性ウイルスと一緒に存在する場合も、腫瘍細胞の殺傷を増加させることを示す結果を提供する。
Ａ５４９細胞を赤色蛍光タンパク質（Ａ５４９－ｒｅｄ）で遺伝子標識した。新鮮なヒトＰＢＭＣを採取し、適切なサイトカイン及び抗体の組み合わせで刺激して、エフェクターＴ細胞を活性化した。次いで、活性化したＰＢＭＣを、腫瘍溶解性アデノウイルス（Ａｄ５）を含めてまたは含めずに、ＤＡＳ１８１で処理したＡ５４９－ｒｅｄ細胞と共培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅによる生細胞イメージング及び定量によって、ＰＢＭＣによる腫瘍細胞殺傷をモニタリングした。ＰＢＭＣによるサイトカイン産生のＥＬＩＳＡ測定のために、細胞培養培地を回収した。図１６に示されるように、ＤＡＳ１８１は、ＰＢＭＣの存在下で腫瘍溶解性アデノウイルスと一緒に存在する場合、腫瘍細胞の殺傷を有意に増加させた。
実施例７：ＤＡＳ１８１を発現する腫瘍溶解性ウイルスの構築及び特性評価
ＤＡＳ１８１の発現のために設計されたコンストラクトは、図１７に模式的に示される。
ＤＡＳ１８１を発現する組み換えＶＶを作製するために、ｐＳＥＭ－１ベクターを、ＤＡＳ１８１をコードする配列及びＧＦＰタンパク質をコードする配列（ＧＦＰコーディング配列は配列番号６３に示される）を挟む同じ向きの２つのｌｏｘＰ部位（ｌｏｘＰ部位配列は配列番号６２に示される）を含むように改変した。（ｐＳＥＭ－１－ＴＫ－ＤＡＳ１８１－ＧＦＰ）。ＤＡＳ１８１発現は、腫瘍組織内での発現を制限するために、Ｆ１７Ｒ後期プロモーターの転写制御下とした。例示的なコンストラクトの一部の配列は、配列番号６５に示される。
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＶＶを親ウイルスとして使用した。ｐＳＥＭ－１－ＴＫ－ＤＡＳ１８１－ＧＦＰをＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＶＶのＴＫ遺伝子に組み換えてＶＶ－ＤＡＳ１８１を作製することによって、ＤＡＳ１８１を発現するＶＶを作製した。
組み換えウイルスは、以下のように作製することができる。
トランスフェクション：
ＣＶ－Ｉ細胞を６ウェルプレートに５×１０５細胞／２ｍｌ ＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳ／ウェルで播種し、一晩成長させる。ウイルスストックをＭＯＩ ０．０５でＤＭＥＭ／２％ＦＢＳに希釈することによって、親ＶＶウイルス（１ｍｌ／ウェル）を調製する。ＣＶ－１ウェルから培地を除去し、即座にＶＶを加え、１～２時間培養する。ＣＶ－１細胞は、この時点で６０～８０％のコンフルエントになるはずである。１．５ｍｌチューブ中のトランスフェクションミックス。各トランスフェクションについて、９μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅを９１ｕｌの血清不含ＤＭＥＭに希釈し、室温で５分間インキュベートする。３ｕｇのｐＳＥＭ－１－ＴＫ－ＤＡＳ１８１－ＧＦＰ ＤＮＡを、上下に２または３回穏やかにピペッティングして加える。室温で１５分間静置する。ＣＶ－１ウェルからＶＶウイルスを吸引し、細胞を２ｍｌの血清不含ＤＭＥＭで１回洗浄する。２ｍｌのＤＭＥＭ－２％ＦＢＳを加え、ＤＮＡ－Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ溶液を１滴ずつ加える。３７℃で４８～７２時間または全ての細胞が丸くなるまでインキュベートする。ピペッティングを繰り返すことによって、細胞を採取する。採取した細胞をまずドライアイス／エタノール浴に入れ、次いで、３７℃の水浴に入れ、ボルテックスする凍結融解を繰り返して、細胞からウイルスを放出させる。凍結融解のサイクルを３回繰り返す。細胞溶解物は、－８０℃で保存することができる。
プラーク単離：
ＣＶ－１細胞を６ウェルプレートに５×１０５細胞／２ｍｌ ＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳ／ウェルで播種し、一晩成長させる。ＣＶ－１細胞は、細胞溶解物を投入する時点で６０～８０％のコンフルエントである必要がある。超音波変換プローブを備える超音波ディスメンブレーターを使用して、細胞溶解物を氷上で、懸濁液中の物質が分散するまで３０秒サイクルの超音波処理を４回行う。細胞溶解物をＤＭＥＭ－２％ＦＢＳで１０倍連続希釈する。１０－２、１０－３、１０－４の希釈で１ウェルあたり１ｍｌの細胞溶解物培地を加え、３７℃でインキュベートする。ピペットチップを使用して、十分に分離したＧＦＰ＋プラークを採取する。ピペットチップをわずかに揺らしてプラーク中の細胞を削り取り、剥離させる。０．５ｍｌのＤＭＥＭ培地が入ったマイクロ遠心チューブにゆっくり移す。凍結融解を３回行い、超音波処理を行う。プラーク分離の同じ作業を３～５回繰り返す。
ウイルス増幅：
ＣＶ－１細胞を６ウェルプレートに５×１０５細胞／２ｍｌ ＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳ／ウェルで播種し、一晩成長させる。ＣＶ－１は、実験開始時にコンフルエントである必要がある。１つのウェルにプラーク溶解物２５０ｕｌ／ＤＭＥＭ－２％ＦＢＳ １ｍｌを感染させ、３７℃で２時間インキュベートする。プラーク溶解物を除去し、２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ－２％ＦＢＳを加え、細胞が丸くなるまで４８～７２時間インキュベートする。ピペッティングを繰り返すことによって細胞を回収し、凍結融解を３回行い、超音波処理を行う。４ｍｌのＤＭＥＭ－２％ＦＢＳに細胞溶解物の半分を加え、７５ＣＭ２フラスコでＣＶ－１細胞を感染させ、２時間後にウイルスを除去し、１２ｍｌのＤＭＥＭ－２％ＦＢＳを加え、４８～７２時間培養する（細胞が丸くなるまで）。細胞を採取し、１８００Ｇで５分遠心し、上清を捨て、１ｍｌのＤＭＥＭ－２．５％ＦＢＳ中に再懸濁する。
ウイルス力価測定：
ＣＶ－１細胞を６ウェルプレートに５×１０５細胞／２ｍｌ ＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳ／ウェルで播種し、一晩成長させる。ウイルスをＤＭＥＭ－２％ＦＢＳで希釈し、ウイルス５０ｕｌ／ＤＭＥＭ－２％ＦＢＳ ４９５０ｕｌ（Ａ、１０－２）、Ａ５００ｕｌ／培地４５００ｕｌ（Ｂ、１０－３）、及びＢ５００ｕｌ／培地４５００ｕｌ（Ｃ、１０－４）、ウイルスストック１０－７～１０－１０とする。培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍｌのウイルス希釈液で細胞をデュプリケートで感染させた。１０分ごとにプレートを揺すりながら、細胞を１時間インキュベートする。１時間後、ウイルスを除去し、２ｍｌのＤＭＥＭ－１０％ＦＢＳを加え、４８時間インキュベートする。培地を除去し、１ｍｌの２０％エタノール中０．１％クリスタルバイオレットを加え、室温で１５分間置く。培地を除去し、室温で２４時間乾燥させる。プラークをカウントし、１ｍｌあたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）で表示する。
ＶＶ－ＤＡＳ１８１によるＤＡＳ１８１発現の検出：
ＣＶ－１細胞にＶＶ－ＤＡＳ１８１をＭＯＩ ０．２で感染させる。４８時間後、ＣＶ－１細胞を回収した。Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＡＮ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＤＮＡを抽出し、ＤＡＳ１８１ ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ＰＣＲは、標準的なＰＣＲプロトコル及びプライマー配列（ＳｉａｌＦ：ＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡ（配列番号５６）及びＳｉａｌＲ：ＣＣＧＧＴＴＧＣＧＣＣＴＡＴＴＣＴＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣ（配列番号５７））を使用して実施した。予想されるＰＣＲ産物（１２５１ｂｐ）が認められた。
実施例８：ワクシニアウイルスによって発現されたＤＡＳ１８１はｉｎ ｖｉｔｒｏで活性である
実施例８は、腫瘍溶解性ウイルスを使用したＤＡＳ１８１の細胞への送達が、１ｍｌ培地中およそ０．７８ｎＭ～１．２１ｎＭの精製ＤＡＳ１８１である処理と同等のシアリダーゼ活性をもたらすことを示す結果を提供する。
ＣＶ－１細胞を６つのウェルプレートにプレーティングした。細胞にシアリダーゼ－ＶＶまたは対照ＶＶをＭＯＩ ０．１またはＭＯＩ １で形質導入した。２４時間後、トランスフェクトした細胞を回収し、ＰＢＳで３×１０６／５００μｌの単一細胞懸濁液を作製した。タンパク質抽出のために、Ｓｉｇｍａの哺乳動物細胞溶解キット（Ｓｉｇｍａ、ＭＣＬ１－１ＫＴ）を使用して細胞溶解物を調製し、上清を回収した。Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３８８８８）を製造元の説明書に従って使用して、シアリダーゼ（ＤＡＳ１８１）活性を測定した。対照として１ｎＭ、２ｎＭ、及び１０ｎＭのＤＡＳ１８１をＶＶ細胞溶解物に加え、標準曲線を作成した。シアリダーゼ－ＶＶを感染させた１×１０６細胞は、１ｍｌ培地中０．７８ｎＭ～１．２１ｎＭのＤＡＳ１８１に相当するＤＡＳ１８１を発現する。図１８に示されるように、ＤＡＳ１８１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでシアリダーゼ活性を有する。
実施例９：ワクシニアウイルス－シアリダーゼは、樹状細胞成熟を促進する
実施例９は、シアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルスが、シアリダーゼを含まない腫瘍溶解性ウイルスと比較して樹状細胞の成熟を促進することを示す結果を提供する。
シアリダーゼ－ＶＶがＤＣの活性化及び成熟を促進することができるかどうかを決定するために、付着ヒトＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を添加した培地３ｍｌ中に５×１０６細胞で再懸濁し、次いで、同じ濃度のＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を添加した新鮮な培地を１ウェルあたり２ｍｌ含む６ウェルプレートで培養した。細胞培養の６日後、細胞を、シアリダーゼ－ＶＶ感染腫瘍細胞溶解物、ＶＶ感染腫瘍細胞溶解物、ＶＶ感染腫瘍細胞溶解物＋合成ＤＡＳ１８１タンパク質、またはＬＰＳ（陽性対照）の存在下で培養した。更に２４時間後、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ－ＩＩ、ＭＨＣ－Ｉの発現をフローサイトメトリーによって決定した。図１９に示されるように、シアリダーゼ－ＶＶは、ＶＶ単独による処理と比較して、樹状細胞の活性化及び成熟を示すマーカーの発現を促進する。
実施例１０：シアリダーゼ－ＶＶはＴリンパ球媒介性サイトカイン産生及び腫瘍溶解性活性を増大する
ＤＡＳ１８１がＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮｒ）及びＩＬ－２発現を誘導することによってヒトＴ細胞を活性化できるかどうかを評価するために、ヒトＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体を加えることによって活性化し、４８時間ごとにＩＬ－２を加えることによって増殖を更に刺激した。１５日目に、２．５％ＦＢＳ培地中で、腫瘍細胞（Ａ５４９）にＶＶをＭＯＩ ０．５、１、または２で２時間感染させた。活性化Ｔ細胞を、１ｕｇ／ｍｌのＣＤ３抗体の存在下で、５：１または１０：１のエフェクター：標的比で培養物に加えた。更に２４時間後、腫瘍細胞毒性を測定し、サイトカインアレイのために細胞培養培地を回収した。図２０にみられるように、シアリダーゼ－ＶＶは、ＣＤ３活性化Ｔ細胞によるＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマの発現を、ＶＶよりも有意に多く誘導する。加えて、図２１にみられるように、シアリダーゼ－ＶＶは、５：１のＥ：ＴでＶＶよりも強い抗腫瘍応答を惹起する。
実施例１１：分泌及び膜貫通ＤＡＳ１８１の発現コンストラクトの作製
シアリダーゼ活性に対する影響を調べるために、分泌型及び膜貫通型のＤＡＳ１８１を創出した。陰性対照として、シアリダーゼ活性を極めて実質的に減少させる分泌型及び膜貫通型の点変異体も創出した。最後に、代替シアリダーゼである分泌型及び膜貫通型のＮｅｕ２も構築した。
細胞からのＤＡＳ１８１の分泌を促進するために、マウス免疫グロブリンカッパ鎖のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をＤＡＳ１８１配列のＮ末端に遺伝子合成によって付加し、次いで、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４に一緒にクローニングした。ＤＡＳ１８１シアリダーゼ活性を細胞表面上に限定するために、ＤＡＳ１８１触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列を合成し、哺乳動物発現ベクターｐＤｉｓｐｌａｙにヒトＰＤＧＦＲベータ膜貫通ドメインとともにインフレームでクローニングした。対照には、シアリダーゼ活性を欠く変異タンパク質であるＤＡＳ１８５の分泌型及び膜貫通型をコードするＤＮＡ配列を同様に合成し、ｐｃＤＮＡ３．４及びｐＤｉｓｐｌａｙベクターにそれぞれクローニングした。更に、分泌型及び膜貫通型のヒトＮｅｕ２シアリダーゼを発現するコンストラクトを同様に作製した。次のコンストラクトの配列を示す：コンストラクト１（分泌ＤＡＳ１８１；配列番号３４）、コンストラクト４（膜貫通ＤＡＳ１８１；配列番号３７）、コンストラクト２（分泌ＤＡＳ１８５；配列番号３５）、コンストラクト５（膜貫通ＤＡＳ１８５；配列番号３８）、コンストラクト３（分泌ヒトＮｅｕ２；配列番号３６）及びコンストラクト６（膜貫通ヒトＮｅｕ２；配列番号３９）。
実施例１２：分泌及び膜貫通シアリダーゼの酵素活性
異所性発現のために、哺乳動物発現ベクター（実施例１１に詳述）を、ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ＃１１４－１５）を製造元のプロトコルに従って使用して、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。簡潔に述べると、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）を６ウェル組織培養プレートに１ウェルあたり約２×１０５個の生細胞でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２、及び９５％相対湿度でインキュベーションすることによってコンフルエントまで成長させた（典型的に一晩）。２マイクログラムのＤＮＡに相当する２マイクロリットルを、２００マイクロリットルのｊｅｔＰＲＩＭＥ Ｂｕｆｆｅｒに希釈した後、４マイクロリットルのｊｅｔＰＲＩＭＥ試薬を加えた。チューブをボルテックス処理し、１，０００×ｇで短時間（約１０秒）遠心分離にかけ、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション中、全てのウェルの培地に新鮮な培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を補充した。トランスフェクションを個々のウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻して２４時間培養した。インキュベーション後、上清を保存した。非酵素系細胞解離試薬Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ＃１５０４０－０６６）を使用して、単一細胞懸濁液を作成した。単一層をＤＰＢＳで１回洗浄し、５００マイクロリットルのＶｅｒｓｅｎｅを加え、細胞が容器表面から解離するまでプレートをインキュベートした。５００マイクロリットルの完全培地を加え、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離した。酵素アッセイのために、上清を吸引し、細胞を３００マイクロリットルの完全培地中に懸濁した。
得られたトランスフェクション培養物のそれぞれについて、上清及び再懸濁した細胞の活性を、蛍光性基質の２’－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸ナトリウム塩水和物（ＭｕＮａＮａ）を酵素的に切断して蛍光分子の分子４－メチルウンベリフェロン（４－Ｍｕ）を放出するシアリダーゼの能力を利用して評価した。得られた遊離４－Ｍｕは、蛍光プレートリーダーを使用して、３６５ｎＭで励起され、４４５ｎｍで発光が読み取れる。簡潔に述べると、各試料１００μｌを黒色の無処理９６ウェルプレートにプレーティングした。プレートを３７℃の水浴中でおよそ３０分間インキュベートし、その後、プレインキュベートした（３７℃、３０分）１００μＭのＭｕＮａＮａと混合した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅマルチモードプレートリーダーを使用して、蛍光を３０秒間隔で６０分間速度論的に測定した。切断によって生成された４－Ｍｕの量は、１００－５μＭの範囲で純粋な４－Ｍｕの標準曲線との比較によって定量した。反応速度は、各試料について、生成された４－Ｍｕの量（≦２０μＭ）をそれに要した時間（秒）で割ることによって決定した。観察された反応速度を比較して、各試料溶液のおおよその相対活性を決定した（表６）。分泌ＤＡＳ１８１トランスフェクションからの上清及び膜貫通ＤＡＳ１８１トランスフェクションからの再懸濁細胞は、最も活性が高く、ほぼ同等であることが示された。全てのＤＡＳ１８５及びＮｅｕ２の試料溶液は、ＤＡＳ１８１試料溶液と比較して、ごくわずかな活性しか示さなかった。Ｎｅｕ２試料溶液は、バックグラウンドと同等であった。更に、観察された反応速度を、１０００～６０ｐＭの範囲の既知濃度のＤＡＳ１８１の標準曲線と比較した。分泌ＤＡＳ１８１トランスフェクションからの上清及び膜貫通ＤＡＳ１８１トランスフェクションからの再懸濁細胞は、外挿すると、４０００ｐＭのＤＡＳ１８１とほぼ同等であった。他の全ての試料は、９０ｐＭのＤＡＳ１８１とほぼ同等かそれ未満であることが観察された。
Figure 2023511129000008
実施例１３：分泌ＤＡＳ１８１及び膜貫通ＤＡＳ１８１は、腫瘍細胞上の表面シアル酸を減少させる
分泌及び膜貫通シアリダーゼが細胞表面シアル酸除去及びガラクトース露出に与える影響を、製造元が提供する説明書に従ってＦｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、様々な発現コンストラクトをＡ５４９－ｒｅｄ細胞に一過性トランスフェクションした後、イメージング及びフローサイトメトリーによって調べた。簡潔に述べると、Ａ５４９－Ｒｅｄ細胞を６ウェルプレートに２ｍｌのＡ５４９－Ｒｅｄ完全成長培地中１ウェルあたり２×１０５細胞でプレーティングした。トランスフェクションする細胞の各ウェルについて、３μｇのプラスミドＤＮＡ及び９μｌのＦｕｇｅｎｅ ＨＤを１５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに希釈し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートしてＤＮＡ－Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ複合体を形成させた。上記のＤＮＡ－Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ複合体を、細胞を含有する各ウェルに直接加え、細胞をＣＯ２インキュベーターで３７℃で一晩培養した後、更なる実験を行った。
イメージング実験のために、トランスフェクトした細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり８，０００細胞で再播種した。次いで、２４時間、４８時間または７２時間細胞培養した後、細胞を固定し、α２，３－シアル酸、α２，６－シアル酸、及びガラクトースについて染色した。細胞を４０μｇ／ｍｌのＳＮＡ－ＦＩＴＣ、２０μｇ／ｍｌのＰＮＡ－ＦＩＴＣとともに室温で１時間インキュベートして、α２，６－シアル酸及びガラクトースを別々に染色した。α２，３－シアル酸については、細胞を４０μｇ／ｍｌのビオチン化ＭＡ ＩＩとともに１時間インキュベートし、続いて、ＦＩＴＣ－ストレプトアビジンとともに更に１時間インキュベートした。ＨＡタグ発現を検出するために、細胞をＨＡタグウサギｍＡｂ（１：２００）とともに室温で１時間インキュベートし、続いて、ロバ抗ウサギ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７とともに更に１時間インキュベートした。画像をＫｅｙｅｎｃｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙによって撮影する。
トランスフェクションから２４時間後に撮影した画像は、組み換えＤＡＳ１８１処理と同様に、分泌ＤＡＳ１８１（コンストラクト１）及び膜貫通ＤＡＳ１８１（コンストラクト４）トランスフェクションが細胞表面からα２，３及びα２，６の両方のシアル酸を除去し、それに伴いガラクトース染色が増加したことを示した。酵素不活性ＤＡＳ１８５（コンストラクト２、５）またはヒトＮｅｕ２（コンストラクト３、６）をトランスフェクトした細胞は、ビヒクル対照細胞と同様の染色パターンを示し、酵素活性の結果と一致した。
トランスフェクションから７２時間後に撮影した画像は、分泌及び膜貫通ＤＡＳ１８１トランスフェクションのみが腫瘍細胞の表面シアル酸を効果的に除去することができることをより明白に示した。しかしながら、膜貫通コンストラクトに存在するＨＡタグの染色がＤＡＳ１８１及びＤＡＳ１８５コンストラクトをトランスフェクトした細胞でのみ陽性であったことから、ヒトＮｅｕ２は、細胞によってうまく発現しなかった可能性がある。
フローサイトメトリー解析のために、トランスフェクトした細胞を１ウェルあたり１×１０５細胞で２４ウェルプレートに再播種した。次いで、２４時間、４８時間または７２時間細胞培養した後、細胞を固定し、α２，３－シアル酸、α２，６－シアル酸、及びガラクトースについて染色する。Ａｃｅａ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ システムを使用して、結果を解析した。組み換えＤＡＳ１８１処理を対照とした分泌コンストラクトトランスフェクションの結果を図２２Ａ～２２Ｃに示す（α２，３（図２２Ａ）及びα２，６（図２２Ｂ）シアル酸、ならびにガラクトース（図２２Ｃ））。分泌ＤＡＳ１８１トランスフェクションを対照とした膜貫通コンストラクトトランスフェクションの結果を図２３Ａ～２３Ｃに示す（α２，３（図２３Ａ）及びα２，６（図２３Ｂ）シアル酸、ならびにガラクトース（図２３Ｃ））。イメージング試験結果と一致して、分泌ＤＡＳ１８１及び膜貫通ＤＡＳ１８１トランスフェクションは、細胞表面α２，３及びα２，６シアル酸の除去、ならびにガラクトースの曝露をもたらしたが、分泌及び膜貫通ＤＡＳ１８５またはヒトＮｅｕ２とのトランスフェクションではほとんど影響がなかった。
実施例１４：分泌ＤＡＳ１８１及び膜貫通ＤＡＳ１８１はＰＢＭＣ及び腫瘍溶解性ウイルスによって媒介される腫瘍細胞殺傷を増加させる
分泌ＤＡＳ１８１及び膜貫通ＤＡＳ１８１が細胞表面シアル酸を効率的に除去することが示されたため、分泌及び膜貫通ＤＡＳ１８１をトランスフェクトした細胞で、ＰＢＭＣ及び腫瘍溶解性ウイルス媒介性腫瘍細胞殺傷に対する影響を調べた。一過性トランスフェクションは細胞成長に悪影響を及ぼし得るため、トランスフェクトしたＡ５４９－ｒｅｄ細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で３週間、トランスフェクトしていない対照細胞が完全に死滅するまで培養することによって、分泌及び膜貫通ＤＡＳ１８１の安定したプール細胞を作製した。安定したプールのトランスフェクトしたＡ５４９－ｒｅｄ細胞をＤＡＳ１８１とともに９６ウェルプレートに１ウェルあたり２０００細胞の濃度で播種した。Ａ５４９－ｒｅｄ親細胞を対照として播種した。翌日、完全成長培地を除去し、腫瘍溶解性ウイルスを含むまたは含まない５０ｕｌの培地と交換した。新鮮な単離ＰＢＭＣをカウントし、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／ＩＬ２を含むＡ５４９完全培地に２００，０００／ｍｌで再懸濁し、次いで、５０μｌの新鮮なＰＢＭＣを細胞に加えた。Ｅｓｓｅｎ Ｉｎｃｕｃｙｔｅによって、カウントされた赤色の対象物に基づいて５日まで細胞成長をモニタリングした。図２４に示されるように、分泌ＤＡＳ１８１発現は、１及び５の両方のＭＯＩで、活性化されたＰＢＭＣ媒介性腫瘍細胞殺傷を感作し、腫瘍溶解性ウイルス関連ＰＢＭＣ媒介性細胞殺傷を増加させた。図２５に示されるように、膜貫通ＤＡＳ１８１発現は、Ａ５４９－ｒｅｄ細胞を活性化ＰＢＭＣ殺傷に有意に感作した。ＭＯＩが１の場合よりもＭＯＩが５の場合のほうがはるかに大きな効果が観察された。シアリダーゼ活性及び腫瘍溶解性ウイルスの単剤としての効力は、ある特定の実験条件下で組み合わせた場合、その相加効果を隠してしまう可能性がある。
実施例１５：シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの作製
本実施例は、シアリダーゼをコードする例示的な腫瘍溶解性ウイルスコンストラクトの作製を示す。Ｅｎｄｏ－Ｓｉａｌ－ＶＶ、ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ、及びＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶのコンストラクトを問題なく作製した。
１．１．ｐＳＥＭ－１－シアリダーゼ－ＧＦＰ／ＲＦＰの設計
シアリダーゼを発現する組み換えＶＶを作製するために、遺伝子合成を使用して、ｐＳＥＭ－１ベクターを創出した。コンストラクトは、シアリダーゼをコードする遺伝子、ＧＦＰまたはＲＦＰをコードする遺伝子、およびＧＦＰ／ＲＦＰを挟む同じ向きの２つのｌｏｘＰ部位から構成される（ｐＳＥＭ－１－シアリダーゼ－ＧＦＰ／ＲＦＰ）。挿入されたシアリダーゼは、腫瘍組織内でのシアリダーゼの発現を制限するために、Ｆ１７Ｒ後期プロモーターの転写制御下とした。プラスミドの簡略設計は、図２６に示すとおりである。
１．２．ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ及びＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶの作製
ワクシニアウイルス（ＶＶ）株ＷＲを親ウイルスとして使用してシアリダーゼとの組み換えを行い、ｉ）細胞内区画に拘束されるもの（Ｅｎｄｏ－Ｓｉａｌ－ＶＶ）；ｉｉ）細胞外環境に分泌されるもの（ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ）；またはｉｉｉ）細胞表面に局在するもの（ＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶ）の３つの異なるアイソフォームでシアリダーゼを発現するＶＶを創出した。
シアリダーゼ－ＶＶは、ｐＳＥＭ－１－ＴＫ－シアリダーゼ－ＧＦＰ、ｐＳＥＭ－１－ＴＫ－ＳＰ－シアリダーゼ－ＲＦＰまたはｐＳＥＭ－１－ＴＫ－ＴＭ－シアリダーゼ－ＧＦＰに相同組み換えを介してＶＶのＴＫ遺伝子を挿入することによって作製した。全てのウイルスは、ＣＶ－１細胞上で産生され、滴定により定量された。
１．２．１．力価測定によるＶＶ、ｅｎｄｏ－Ｓｉａｌ－ＶＶ、ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ及びＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶの定量
組み換えウイルスを得、そのストックを増幅させた後、感染性粒子をプラークアッセイによって力価測定した。簡潔に述べると、１２ウェルプレートに播種したＣＶ－１細胞に、ＶＶ、ｅｎｄｏ－Ｓｉａｌ－ＶＶ、ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶまたはＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶの連続希釈液を感染させた。感染の４８時間後、細胞を固定し、２０％エタノール／０．１％クリスタルバイオレットで染色し、ウイルスプラークをカウントした。発送のために、各ウイルスストックの１０６のアリコートを１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０中に調製した。したがって、全てのウイルスは、１０７ｐｆｕ／ｍｌである。
１．２．２ ＰＣＲによるウイルス組み換えの検出
シアリダーゼアイソフォームがＶＶゲノムに問題なく挿入されたことを確認するために、各ウイルスストックを鋳型ＤＮＡとして使用して、標準プロトコルに従ってＰＣＲを実施してコンストラクトを増幅した。そのために、図２に示される領域に特異的に結合するＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーは、ｉ）コンストラクトがＶＶゲノムに問題なく挿入されたこと、ｉｉ）コンストラクトが組み換え時にそれぞれの改変を維持していること（すなわち、分泌および膜貫通ドメイン）を確認することが可能である。使用したプライマー配列は以下のとおりであった。
Ｓｉａｌ－ｆｗｄ：５’－ＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧ（配列番号５６）
Ｓｉａｌ－ｒｅｖ：５’－ＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＧ（配列番号５７）
ＳＰ－Ｓｉａｌ－ｒｅｖ：５’－ＴＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＧ（配列番号８３）
ＴＭ－Ｓｉａｌ－ｆｗｄ：５’－ＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＣＡＴＧ（配列番号８４）
予測されるシアリダーゼのサイズのバンドが３つの全てのアイソフォームで検出され、シアリダーゼＶＶコンストラクトの作製が成功したことが示された（図２７）。ｓｉａｌＦＷＤ＋ＳＰｓｉａｌＲＥＶプライマーペアを使用した場合、ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ及びＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶのみがＳＰ－Ｓｉａｌとして期待されるサイズのバンドを示したことから、これらのウイルスが分泌シグナルを有することが確認される。最後に、ＴＭ－ｓｉａｌ－ｆｗｄ＋ＳＰ－Ｓｉａｌ－ｒｅｖプライマーを使用した場合、ＴＭ－ｓｉａｌ－ＶＶのみが予測されるＴＭ－シアリダーゼのサイズの強いバンドを示した。このデータにより、ＶＶの組み換え体が問題なく作製され、３つのアイソフォームのコンストラクトがウイルスゲノム内でインタクトであることが確認される。
実施例１６：シアリダーゼ－ＶＶはｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞に感染し、複製し、溶解させることができる
本実施例は、Ｅｎｄｏ－Ｓｉａｌ－ＶＶ、ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ、及びＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶが、親ワクシニアウイルスと同等のＣＶ－１及びＵ８７細胞における感染性及び複製活性、ならびにＵ８７及びＡ５４９細胞における同等の溶解活性を有することを示す結果を提供するものであり、これは、導入遺伝子がＶＶの感染性、複製、及び溶解能力を阻害しなかったことを示している。腫瘍細胞をシアリダーゼ－ＶＶまたは親ＶＶに漸増ＭＯＩで感染させた。感染後の様々な時点（２４、４８、７２または９６時間）で細胞を採取し、プラークアッセイ及びＭＴＳアッセイに供してウイルス複製を決定した。
図２８に示されるように、ウイルスの複製能力は、シアリダーゼによる改変の影響を受けなかった。ＣＶ－１またはＵ８７細胞を１２ウェル組織培養プレートにプレーティングし、２．５％ＦＢＳ培地中で、シアリダーゼ－ＶＶまたはＶＶにＭＯＩ ０．１で２時間感染させ、続いて、完全培地で培養した。感染後の様々な時点（２４、４８、７２、または９６時間）で細胞を採取し、ＣＶ－１細胞を使用するプラークアッセイによってウイルス複製を決定した。
更に、図２９に示されるように、改変ワクシニアウイルスの溶解活性は、Ｕ８７及びＡ５４９細胞において、図２９及び以下の表７～９に示されるように親ワクシニアウイルスと同等であった。
Figure 2023511129000009
Figure 2023511129000010
実施例１７：シアリダーゼ－ＶＶは樹状細胞成熟をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させる
本実施例は、ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ及びＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶが成熟マーカーの発現を増大することによってヒトＤＣを活性化することを示す結果を提供する。ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶ及びＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶの両方がＤＣの活性化をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に誘導した。
シアリダーゼをコードする腫瘍溶解性ウイルスのＤＣの成熟に対する効果を評価した。ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ４由来ヒトＤＣ（Ａｓｔａｒｔｅ、ＷＡ）をＶＶ－Ｕ８７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ、ＶＡ）とともに２４時間培養した。ＤＣを回収し、ＤＣ成熟マーカーに対する抗体で染色し、ＤＣ上のＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－Ｄｒをフローサイトメトリーによって決定した。細胞を回収し、ＨＬＡ－Ｄｒ－ＦＩＴＣ（ａｂ１９３６２０、Ａｂｃａｍ、ＭＡ）及びＨＬＡ－ＡＢＣ－ＰＥ（ａｂ１５５３８１、Ａｂｃａｍ、ＭＡ）、またはＣＤ８０－ＦＩＴＣ（ａｂ１８２７９、Ａｂｃａｍ、ＭＡ）及びＣＤ８６－ＰＥ（ａｂ２３４２２６、Ａｂｃａｍ、ＭＡ）抗体で染色し、フロー解析（Ｓｏｎｙ ＳＡ３８００）に供した。
図３０～３３は、ＤＣ成熟マーカーＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の発現をそれぞれ示す。ＳＰ－Ｓｉａｌ－ＶＶまたはＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶに感染させたＵ８７腫瘍細胞とＤＣを一緒に培養すると、ＶＶに感染させたＵ８７またはＵ８７単独とのＤＣ細胞培養と比較して、ＤＣ成熟マーカーの発現が増大した。
実施例１８：シアリダーゼ－ＶＶはＮＫ媒介性腫瘍細胞殺傷をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させる
本実施例は、Ｓｉａｌ－ＶＶがＮＫ媒介性細胞毒性を増大させることを示す結果を提供する。ＶＶに感染した腫瘍細胞をＮＫと共培養し、腫瘍細胞の特異的溶解度を決定した。
プロトコル：陰性選択したヒトＮＫ細胞（Ａｓｔａｒｔｅ、ＷＡ）及びＶＶ－Ｕ８７細胞（ＡＴＣＣ、ＶＡ）を共培養し、腫瘍殺傷有効性をＬＤＨアッセイ（Ａｂｃａｍ、ＭＡ）によって測定した。図３４に示されるように、この結果により、Ｓｉａｌ－ＶＶがＮＫ細胞媒介性Ｕ８７腫瘍殺傷をｉｎ ｖｉｔｒｏで増大させることが示唆された。（＊Ｐ値は、Ｕ８７及びＮＫ培養におけるＳｉａｌ－ＶＶ対モックＶＶ）。特異的溶解度は、以下のとおりに算出した。
Figure 2023511129000011
Figure 2023511129000012
実施例１９：シアリダーゼ－ＶＶは腫瘍成長をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する
上記の実施例は、免疫細胞の活性化及び細胞毒性の促進におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのシアリダーゼ－ＶＶの驚くべき有益な効果を示している。実施例１９は、シアリダーゼ－ＶＶが対照ＶＶと比較してｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍成長を有意に阻害することを示す結果を提供する。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるシアリダーゼ－ＶＶの腫瘍成長に対する効果を試験するために、２×１０５及び２×１０４のＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞をＣ５７マウスの右または左の脇腹に接種した。右または左の脇腹の腫瘍サイズが１００ｍｍに達した時（１４日）に、４×１０７ｐｆｕのＶＶを、右または左の部位の腫瘍に隔日で３回、腫瘍内注入した。腫瘍サイズを測定した。図３５は、右脇腹の腫瘍サイズを示す。この結果により、ＴＭ－ｓｉａｌ－ＶＶが対照ＶＶと比較して腫瘍成長を有意に阻害することが示された。ＳＰ－ｓｉａｌ ＶＶは、小さな程度ではあるが、腫瘍成長を阻害した。図３６は、左脇腹の腫瘍サイズを示す。この結果により、ＴＭ－ｓｉａｌ－ＶＶが対照ＶＶと比較して腫瘍成長を有意に阻害することが示された。
図３７は、様々なＶＶまたはＰＢＳ対照で処理したマウスについて、マウス体重に有意差はなかったことを示す。２×１０５及び２×１０４のＢ１６－Ｆ１０腫瘍細胞をＣ５７マウスの右または左の脇腹に接種した。右の腫瘍サイズが１００ｍｍに達した時（１４日）に、４×１０７ｐｆｕのＶＶを、隔日に３回用量で腫瘍内注入した。シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を有意に増大させる
Ｃ５７マウスの右脇腹に腫瘍細胞を接種し、得られた腫瘍に上記のようにＶＶを腫瘍内注入した（隔日３回用量）。最初のＶＶ処理から７日後に腫瘍組織（ｎ＝６）を採取し、フロー解析に供して、腫瘍内のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤を解析した。＊ｐ値：処理群対対照ＶＶ群。図３８Ａは、シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤を有意に増大させることを示す結果の定量及びｐ値を示す。図３８Ｂは、ＦＡＣＳプロットを示す。この結果により、シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、対照ワクシニアウイルスと比較して、腫瘍内ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を有意に増大させることが示された。
シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内のＴｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を有意に減少させた
Ｃ５７マウスの右脇腹に腫瘍細胞を接種し、得られた腫瘍に上記のようにＶＶを腫瘍内注入した（隔日３回用量）。最初のＶＶ処理から７日後に腫瘍組織（ｎ＝６）を採取し、フロー解析に供して、腫瘍内のＴｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を決定した。図３９に示されるように、ＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶは、対照ＶＶと比較して腫瘍内のＴｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を減少させた。＊ｐ値：処理群対対照ＶＶ群。
シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内ＮＫ及びＮＫＴ細胞浸潤を有意に増大させる
Ｃ５７マウスの右脇腹に腫瘍細胞を接種し、得られた腫瘍に上記のようにＶＶを腫瘍内注入した（隔日３回用量）。最初のＶＶ処理から７日後に腫瘍組織（ｎ＝６）を採取し、フロー解析に供して、ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の数を決定した。図４０に示されるように、シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内ＮＫ及びＮＫＴ細胞浸潤を増大させた。＊ｐ値：処理群対対照ＶＶ群。
シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは腫瘍内ＮＫ及びＮＫＴ細胞浸潤を有意に増大させる
Ｃ５７マウスの右脇腹に腫瘍細胞を接種し、得られた腫瘍に上記のようにＶＶを腫瘍内注入した（隔日３回用量）。最初のＶＶ処理から７日後に腫瘍組織（ｎ＝６）を採取し、フロー解析に供して、ＰＤ－Ｌ１の発現を決定した。図４１に示されるように、膜貫通結合シアリダーゼを備えた腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞内のＰＤ－Ｌ１発現を有意に増加させた（ｐ＜０．０５、ＴＭ－Ｓｉａｌ－ＶＶ対対照ＶＶ）。
Figure 2023511129000013
Figure 2023511129000014
Figure 2023511129000015
Figure 2023511129000016
Figure 2023511129000017
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Figure 2023511129000027
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Figure 2023511129000029
Figure 2023511129000030
Figure 2023511129000031
 ある特定の実施形態を本明細書で示し、記載してきたが、そのような実施形態は、例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変形形態、変更、及び置換を想起するであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する様々な代替が本開示の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物を包含することが意図される。

Claims (73)

  1. シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスであって、前記シアリダーゼをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される、前記腫瘍溶解性ウイルス。
  2. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、ワクシニアウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、モルビリウイルス属ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、ポックスウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、及びその派生体からなる群から選択されるウイルスである、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  3. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、ポックスウイルスである、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  4. 前記ポックスウイルスが、ワクシニアウイルスである、請求項３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  5. 前記ワクシニアウイルスが、Ｄｒｙｖａｘ、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｍ６３、ＬＩＶＰ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＹＣＢＯＨ）、Ｄａｉｒｅｎ、Ｉｋｅｄａ、ＬＣ１６Ｍ８、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、ＩＨＤ－Ｊ、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、Ｄａｉｒｅｎ Ｉ、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＣＬ、Ｌｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ、ＡＳ、及びその派生体からなる群から選択される株のものである、請求項４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  6. 前記ウイルスが、ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅである、請求項５に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  7. 前記組み換え腫瘍溶解性ウイルスが、対応する野生型株と比較して、前記ウイルスの免疫原性を減少させる１つ以上の変異を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  8. 前記ウイルスが、ワクシニアウイルスであり、前記１つ以上の変異が、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１３、Ｌ１、Ｈ３、Ｄ８、Ａ３３、Ｂ５、Ａ５６、Ｆ１３、Ａ２８、及びＡ２７からなる群から選択される１つ以上のタンパク質にある、請求項７に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  9. 前記ウイルスが、
    ａ．配列番号６６～６９のいずれか１つに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｈ３Ｌタンパク質、
    ｂ．配列番号７０～７２または８５のいずれか１つに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｄ８Ｌタンパク質、
    ｃ．配列番号７３に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ａ２７Ｌタンパク質、及び
    ｄ．配列番号７４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントワクシニアウイルス（ＶＶ）Ｌ１Ｒタンパク質
    からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、請求項８に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  10. 前記腫瘍溶解性ウイルスが、Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃである、請求項２に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  11. 前記ウイルスが、レオウイルスである、請求項２に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  12. 前記ウイルスが、Ｅ１ＡＣＲ２欠失を有するアデノウイルスである、請求項２に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  13. 前記シアリダーゼが、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，６）－Ｇａｌシアリダーゼ、Ｎｅｕ５Ａｃアルファ（２，３）－Ｇａｌシアリダーゼ、またはＮｅｕ５Ａｃアルファ（２，８）－Ｇａｌシアリダーゼである、先行請求項のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  14. 前記シアリダーゼが、エクソ型シアリダーゼ活性を有するタンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  15. 前記シアリダーゼが、細菌シアリダーゼまたはその誘導体である、先行請求項のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  16. 前記細菌シアリダーゼが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ及びＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼからなる群から選択される、請求項１５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  17. 前記シアリダーゼが、ヒトシアリダーゼまたはその誘導体である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  18. 前記シアリダーゼが、ＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、またはＮＥＵ４である、請求項１７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  19. 前記シアリダーゼが、天然に存在するシアリダーゼである、先行請求項のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  20. 前記シアリダーゼが、アンカリングドメインを含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  21. 前記アンカリングドメインが、生理学的ｐＨで正に帯電する、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  22. 前記アンカリングドメインが、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインである、請求項２０または２１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  23. 前記シアリダーゼが、配列番号１～２８、３１、または５３～５４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  24. 前記シアリダーゼが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  25. 前記シアリダーゼが、ＤＡＳ１８１である、請求項２４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  26. 前記ヌクレオチド配列が、前記シアリダーゼに作動可能に連結される分泌配列を更にコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  27. 前記分泌配列が、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  28. 前記シアリダーゼが、膜貫通ドメインを含む、請求項２７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  29. 前記アンカリングドメインまたは前記膜貫通ドメインが、前記シアリダーゼのカルボキシ末端に位置する、請求項１９～２７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
  30. 前記プロモーターが、ウイルス初期プロモーターである、先行請求項のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  31. 前記腫瘍溶解性ウイルスがポックスウイルスであり、前記プロモーターがポックスウイルス初期プロモーターである、請求項２９に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  32. 前記プロモーターが、ウイルス後期プロモーターである、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  33. 前記プロモーターが、Ｆ１７Ｒ後期プロモーターである、請求項３１に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  34. 前記プロモーターが、ハイブリッドプロモーターである、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  35. 前記プロモーターが、ウイルス初期タンパク質及びウイルス後期タンパク質のハイブリッドである、請求項３４に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  36. 異種タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  37. 前記第２のヌクレオチド配列が、異種タンパク質をコードする、請求項３６に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  38. 前記異種タンパク質が、免疫チェックポイント阻害薬である、請求項３７に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  39. 前記免疫チェックポイント阻害薬が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、またはＨＬＡ－Ｇの阻害薬である、請求項３８に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  40. 前記免疫チェックポイント阻害薬が、抗体である、請求項３９に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  41. 前記異種タンパク質が、免疫抑制性受容体の阻害薬である、請求項３７に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  42. 前記免疫抑制性受容体が、ＬＩＬＲＢ、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬ、またはＭＥＲＴＫである、請求項４１に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  43. 前記免疫抑制性受容体の阻害薬が、抗ＬＩＬＲＢ抗体である、請求項４２に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  44. 前記異種タンパク質が、多重特異性免疫細胞エンゲージャーである、請求項３７に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  45. 前記異種タンパク質が、二重特異性分子である、請求項４３に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  46. 前記異種タンパク質が、サイトカイン、共刺激分子、腫瘍抗原提示タンパク質、抗血管新生因子、腫瘍関連抗原、外来抗原、及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）からなる群から選択される、請求項３７に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  47. 前記異種タンパク質が、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ４、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、及びその誘導体からなる群から選択される、請求項４６に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  48. 前記異種タンパク質が、細菌ポリペプチドである、請求項４６に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  49. 前記異種タンパク質が、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、フィブリン－３、ＣＤＨ１７、及び臨床上意義のある他の腫瘍抗原からなる群から選択される腫瘍関連抗原である、請求項４６に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  50. 前記ウイルスが、２つ以上の追加のヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、異種タンパク質をコードする、請求項３６～４９のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス。
  51. 先行請求項のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  52. 請求項１～５０のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む、キャリア細胞。
  53. 前記キャリア細胞が、請求項１～５０のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む免疫細胞である、請求項５２に記載のキャリア細胞。
  54. 前記免疫細胞が、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、またはＣＡＲ－ＮＫＴ細胞である、請求項５３に記載の免疫細胞。
  55. がんを治療することを、それを必要とする個体において行うための方法であって、請求項１～５０のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス、請求項５１に記載の医薬組成物、または請求項５２に記載のキャリア細胞の有効量を前記個体に投与することを含む、前記方法。
  56. 免疫療法剤の有効量を前記個体に投与することを更に含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記免疫療法剤が、多重特異性免疫細胞エンゲージャー、細胞療法、がんワクチン、サイトカイン、ＰＩ３Ｋガンマ阻害薬、ＴＬＲ９リガンド、ＨＤＡＣ阻害薬、ＬＩＬＲＢ２阻害薬、ＭＡＲＣＯ阻害薬、及び免疫チェックポイント阻害薬からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記免疫療法剤が、細胞療法である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記細胞療法が、キメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を前記個体に投与することを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含み、キメラ受容体を発現する、操作された免疫細胞の有効量を前記個体に投与することを含む、請求項５５に記載の方法。
  61. 前記キメラ受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 前記ＣＡＲを発現する免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ細胞である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記キメラ受容体が、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＭＵＣ１６、サバイビン、グリピカン－３、Ｂ７ファミリーメンバー、ＬＩＬＲＢ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、フィブリン－３、及びＣＤＨ１７からなる群から選択される１つ以上の腫瘍抗原を特異的に認識する、請求項５９～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記キメラ受容体が、前記シアリダーゼを特異的に認識する、請求項５９～６２のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記シアリダーゼが、ＤＡＳ１８１またはその誘導体であり、前記キメラ受容体が、ヒト天然型アンフィレグリンまたはノイラミニダーゼと交差反応しない抗ＤＡＳ１８１抗体を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記操作された免疫細胞及び前記組み換え腫瘍溶解性ウイルスが、同時に投与される、請求項５９～６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記組み換え腫瘍溶解性ウイルスが、前記操作された免疫細胞の投与前に投与される、請求項５９～６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 腫瘍を治療することを、それを必要とする個体において行う方法であって、（ａ）外来抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量、及び（ｂ）当該外来抗原を特異的に認識するキメラ受容体を発現する操作された免疫細胞の有効量を個体に投与することを含む、前記方法。
  69. 前記外来抗原が、細菌タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記外来抗原が、シアリダーゼを含む、請求項６８または６９に記載の方法。
  71. 前記キメラ受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項６８～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 請求項１～５０のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス、請求項５１に記載の医薬組成物、または請求項５２に記載のキャリア細胞の有効量を個体に投与することを含む、腫瘍を免疫療法に感作させる方法。
  73. 個体のがん細胞のシアル化を減少させる方法であって、請求項１～５０のいずれか１項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルス、請求項５１に記載の医薬組成物、または請求項５２に記載のキャリア細胞の有効量を前記個体に投与することを含む、前記方法。
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