KR20220145655A

KR20220145655A - 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20220145655A
Application number: KR1020210052488A
Authority: KR
Inventors: 오승현; 김선여; 정현진; 강주희
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2022-10-31
Also published as: KR102591153B1

Abstract

본 발명의 견우자 추출물은 HSC (hepatic stellate cells)에서 TGFβ1에 의해 유도된 SMAD2/3 활성화의 조절을 통해 NASH (non-alcoholic steatohepatitis)와 관련된 간 섬유증을 약화시킴을 확인하였으므로, 본 발명의 견우자 추출물은 간 섬유증을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatic fibrosis, comprising extract of Pharbitis nil extract as an active ingredient}

본 발명은 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)은 전 세계적으로 심각한 질환으로, 지방증, 간세포 팽창, 염증 및 섬유증과 관련되어 있다. NASH의 유병률은 1.5 ~ 6.45 %로 추정되며, NASH 환자의 약 41 %가 간 섬유증을 앓고 있다. NASH 환자는 간경변 및 간세포 암종에 걸릴 위험이 높은데, 이는 돌이킬 수 없는 진행성 간 질환이다. 진행성 섬유증이 있는 NASH 환자의 약 20 %가 2 년에 걸쳐 간경변에 걸린다. NASH에 대한 치료제의 필요성이 증가함에도 불구하고, 아직까지 이 질병을 치료하기 위한 약리학적 제제의 승인은 없는 실정이다. 비타민 E, 메트포르민(metformin), 실리마린(silymarin)과 같은 몇 가지 잠재적인 분자가 항 섬유화 효과를 나타내지만, 이들은 임상에서 유의한 효과가 없는 것으로 알려져 있다 (Sanyal et al., N Engl J Med 362, 1675-1685, 2010; Freedman et al., Aliment Pharmacol Ther 33, 127-137, 2011; Lavine et al., JAMA 305, 1659-1668, 2011). 따라서 현재 만성 간 질환 환자는 장기 생존을 위한 유일한 방법으로 간 이식을 받게 된다. 불행히도 간 이식은 매우 비싸고, 적절한 기증자 조직을 찾는데 시간이 오래 걸리므로 다른 대안의 필요성이 대두되고 있다.

NASH 환자의 사망률은 주로 섬유증의 중증도에 의해 결정된다. 질병에 걸리게 되면, 간 성상 세포 (hepatic stellate cell; HSC)는 근섬유 모세포 유사 세포(myofibroblast-like cell)로 분화된다. 이렇게 활성화된 HSC는 간 섬유증을 일으키는 세포 외 기질 (extracellular matrix; ECM) 단백질의 주요 공급원이 된다. 간 섬유증을 조절하는 주요 기능 때문에 HSC는 간 섬유증을 예방하고 치료하는 직접적인 표적으로 주목을 받았다. HSC는 ECM 침착을 조절하는 상처 치유 과정 (wound healing process)에서 역할을 한다. 정상적인 조건에서 이 과정은 엄격하게 규제되지만, 반복적이고 과도한 간 손상이 일어나면 HSC는 비정상적인 ECM 축적을 가속화한다. 과도한 ECM 축적은 결과적으로 간 섬유화를 초래하여 결국 간부전 (liver failure)으로 이어지게 된다.

견우자 (Pharbitis nil, Ipomoea nil (L.) Roth) 종자의 추출물은 항염증, 항산화 및 항종양 효과를 포함한 여러 약리학적 활성을 발휘한다. 견우자와 현호색 (Corydalis tuber)으로 제조된 Motilitone (DA-9701)은 소화 불량 환자를 치료하기 위해 상업적으로 판매되고 있다 (Lee et al., Phytomedicine 15, 836-843, 2008). 에탄올을 만성적으로 처리한 마우스에 견우자를 먹인 결과 혈청 및 간 중성 지방 (triglyceride; TG) 수치가 감소하였는데, 이는 견우자가 에탄올로 유발된 간 손상에 대해 보호 효과를 발휘함을 나타낸다 (Suk-Heung Oh, Journal of Biochemistry and Molecular Biology 34, 166-171, 2001). 또한 견우자 추출물에 대한 선행기술로는 견우자를 포함한 3 가지 한약재로 구성된 소체환의 NAFLD에서 지질과 포도당 대사를 조절함을 개시한 문헌 (Lim et al., Sci Rep 9, 9055, 2019), 에탄올을 만성적으로 처리한 마우스에 견우자를 먹인 결과 혈청 및 간 TG 수치가 감소함을 개시한 문헌 및 견우자를 포함한 혼합 추출물(해마, 대황, 견우자, 청피, 숙지황, 택사, 목향, 및 파두)의 간섬유화 치료 또는 개선 용도에 대해 개시하고 있는 문헌 (대한민국 등록특허 10-1954891)은 있으나, 본 발명의 견우자 단독 추출물의 간섬유화 치료 용도는 개시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 고지방식이 (high fat diet; HFD)를 먹인 마우스에서 NASH의 다양한 매개 변수에 대한 견우자 추출물의 영향을 조사하였다. 견우자 추출물은 지질 대사 경로와 염증 세포의 침윤에는 영향을 미치지 않았으나, 섬유화를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 이는 HSC에서 TGFβ1에 의해 유도된 SMAD2/3 활성화의 조절을 통해 이루어짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증의 예방 또는 개선용 건강식품조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증의 예방 또는 개선용 건강식품조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제를 제공한다.

도 1a는 견우자 추출물의 마우스 독성 시험 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 본 발명에 사용한 마우스 모델을 나타낸 도이다.
도 2a는 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 및 시리우스 레드 염색에 의한 간 조직의 대표적인 이미지를 나타낸 도이다.
도 2b는 H & E 염색을 기반으로 평가한 NAFLD 활성 점수를 분석한 도이다.
도 2c는 시리우스 레드 염색을 기반으로 섬유증 영역을 정량화하여 나타낸 도이다.
도 2d는 지질 대사와 관련된 유전자의 상대적 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 2e는 간 조직의 TG 축적을 측정하여 나타낸 도이다.
도 2f는 AML12 세포를 이용하여 Oil Red O 염색을 수행한 대표적인 이미지를 나타낸 도이다.
도 2g는 AML12 세포를 이용하여 BODIPY 염색을 수행한 대표적인 이미지를 나타낸 도이다.
도 2h는 마우스 간에서 염증 관련 유전자를 분석한 도이다.
도 2i는 ALT, AST 및 CHO 수준을 나타낸 도이다.
도 3a는 마우스에서 하이드록시프롤린의 수준을 나타낸 도이다.
도 3b는 마우스에서 섬유화 관련 유전자의 발현을 분석한 도이다.
도 3c는 마우스에서 αSMA 및 GAPDH 발현을 나타낸 도이다.
도 3d는 마우스에서 αSMA (녹색) 및 DAPI (파란색)의 발현을 면역 형광 염색으로 분석한 도이다.
도 3e는 마우스에서 COL1A1 (녹색) 및 DAPI (파란색)의 발현을 면역 형광 염색으로 분석한 도이다.
도 4 a는 마우스에서 TGFβ1의 상대적 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 4b는 마우스에서 ELISA를 이용하여 TGFβ1의 수준을 나타낸 도이다.
도 4c는 AML12 세포에서 TGFβ1의 상대적 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 4d는 골수 유래 대식세포에서 TGFβ1의 상대적 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 4e는 마우스 1 차 HSC에서 TGFβ1의 상대적 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 4f는 마우스 1 차 HSC에서 TGFβ및 GAPDH의 단백질 발현을 면역 블롯으로 분석한 도이다.
도 4g는 LX-2 세포에서 TGFβ및 GAPDH의 단백질 발현을 면역 블롯으로 분석한 도이다.
도 5a는 마우스 1 차 HSC에서 섬유화 관련 유전자의 상대적 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 5b는 마우스 1 차 HSC에서 αSMA, COL1A1 및 액틴 (actin)의 발현을 면역 블롯으로 분석한 도이다.
도 5c는 LX-2 세포에서 섬유화 관련 유전자의 상대적 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 5d는 LX-2 세포에서αSMA, COL1A1 및 액틴 (actin)의 발현을 면역 블롯으로 분석한 도이다.
도 5e는 마우스 1 차 HSC에서 αSMA (녹색) 및 DAPI (파란색)의 면역 형광 염색을 수행한 도이다.
도 6a는 마우스에서 pSMAD2, pSMAD3, SMAD2/3 및 GAPDH의 단백질 발현을 면역 블롯으로 분석한 도이다.
도 6b는 마우스 1 차 HSC에서 pSMAD2, pSMAD3, SMAD2/3 및 GAPDH의 단백질 발현을 면역 블롯으로 분석한 도이다.
도 6c는 LX-2 세포에서 pSMAD2, pSMAD3, SMAD2/3 및 액틴 (actin)의 단백질 발현을 면역 블롯으로 분석한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 조성한다.

상기 견우자 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 상기 C1 내지 C2 의 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하고, 50 % 에탄올인 것이 더욱 바람직하다. 추출 온도는 20℃ 내지 40℃인 것이 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 2 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 간 섬유증은 비알코올성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis; NASH)관련 간 섬유증인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 견우자 추출물은 TGFβ1의 발현을 감소시키고, HSC 활성화를 억제시켜, COL1A1, COL1A2, COL3A1, αSMA, FN1 및 TIMP1의 발현을 감소시키고, SMAD2 및 SMAD3 의 활성화를 억제시키는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명의 견우자 추출물은 간 섬유증의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed. Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등 과 같은 부형제가 포함될 수 있다.

상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 내지 수회일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다.

본 발명의 견우자 추출물은 TGFβ1의 발현을 감소시키고, HSC활성화를 억제시켜, COL1A1, COL1A2, COL3A1, αSMA, FN1 및 TIMP1의 발현을 감소시키고, SMAD2 및 SMAD3의 활성화를 억제시키는 효과가 있음을 확인함으로써, 간 섬유증의 예방 및 치료용 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예 및 실험예에서, 마우스에 견우자 추출물을 투여하여 독성을 확인한 결과, 견우자 추출물의 독성이 나타나지 않음을 확인하였다 (도 1a).

또한, HFD를 섭취한 마우스 모델 또는 세포주를 이용하여 견우자 추출물(PNE)이 간 지방증, 염증 또는 간 섬유증에 미치는 영향 확인하기 위한 실험을 수행한 결과, 간 지방증 및 염증에는 영향을 미치지 않았으나, 간 섬유화 영역의 감소를 확인하였다 (도 2a 내지 2e).

또한, HFD를 섭취한 마우스 모델에서 견우자 추출물(PNE)이 간 섬유증에 미치는 영향 확인하기 위한 실험을 수행한 결과, 견우자 추출물이 콜라겐 함량을 현저하게 감소시키고, 섬유화 관련 유전자 (fibrogenic gene)인 COL1A1, COL1A2, COL3A1, αSMA, FN1 및 TIMP1의 발현을 감소시키고, αSMA 및 COL1A1 단백질 발현도 감소시킴을 확인하였다 (도 3a 내지 3e).

또한, 대표적인 섬유화 관련 사이토카인 (cytokine)인 TGFβ1의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행한 결과, 견우자 추출물(PNE)이 간세포, 대식세포 및 HSC에서 TGFβ1발현을 조절함을 확인하였다 (도4a 내지 4g).

또한, 견우자 추출물(PNE)이 HSC 활성화에 미치는 영향 확인하기 위한 실험을 수행한 결과, 마우스 1 차 HSC 및 LX-2 (human HSC line) 세포에서 견우자 추출물(PNE)은 섬유조직발생 마커 (fibrogenic marker)인 COL1A1, COL1A2, COL3A1, αSMA, FN1 및 TIMP1의 발현을 감소시키고, αSMA 및 COL1A1 단백질 발현도 감소시킴을 확인하였다 (도 5a 내지 5b).

아울러, 견우자 추출물(PNE)이 TGFβ1 수용체의 활성화에 의해 인산화되고, HSC 활성화 및 섬유 생성에 필요한 전사 인자 역할을 하는 SMAD2 및 SMAD3 활성에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행한 결과, 견우자 추출물은 SMAD2 및 SMAD3의 인산화를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다 (도 6a 내지 6d).

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 견우자 추출물(PNE)의 제조

견우자(Ipomoea nil (L.) Roth)는 중도 한약 회사(대한민국, 서울)에서 구입하여 김선여 교수님의 인증을 받았다. 표본은 대한민국 가천대학교 약학대학 식물표본실에 기탁되었다(GCU-PN-2016). 건조된 견우자(10kg)는 50% 에탄올을 사용하여 실온에서 3회(3 x 4 L) 추출되었다. 추출물(PNE)을 여과하고 여과액을 회전 증발기를 사용하여 농축하여 1.4kg의 에탄올 조추출물(crude extract)을 수득하였다.

<실시예 2> 세포주의 배양

인간 간선상세포 (Hepatic stellate cell;HSC, LX-2)는 2% FBS와 100μg/ml의 스트렙토마이신 (streptomycin) 및 100unit/ml의 페니실린 (penicillin)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양하였다(대한민국, 대구, Welgene). AML12 (마우스 간세포, hepatocyte cell)는 ATCC에서 얻은 후 10% FBS, ITSP 용액 (Welgene), 100μg/ml의 스트렙토마이신 (streptomycin) 및 100unit/ml의 페니실린 (penicillin)이 보충된 DMEM:F12 (1:1) 배지에서 배양하였다.

<실시예 3> 동물 모델 및 실험

동물 실험은 가천대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받은 후 수행되었다. 6 주령의 수컷 C57BL/6 마우스는 Koatech (대한민국, 경기도)에서 구입하였다. 마우스는 20 내지 24℃ 온도 및 50 내지 55% 습도에서 12 시간 명/암 주기로 보관하였다. 1주 동안 적응한 후, 16 마리의 마우스를 무작위로 실험그룹 [n=5, 일반 식이 (ND); n=6, 고지방식이 (HFD) 및 비히클 (vehicle); n=5, HFD 및 견우자 추출물 (PNE)으로 나누었다. 마우스에게 41주 동안 ND 또는 HFD (지방 40%, 과당 20% 및 콜레스테롤 2%)를 먹였다. 견우자 추출물 (5 mg/kg)은 물에 용해시키고 마지막 6주 동안 매일 경구 투여하였다 (도 1b). 실험 기간이 끝나면 동물을 안락사시키고 후속 실험을 위해 간 조직을 수득하였다.

<실험예 1> 견우자 추출물(PNE)의 독성 여부의 확인

PNE의 생체 내 치료 효과를 확인하기 전에, PNE의 독성을 확인하였다.

구체적으로, C57BL/6 마우스를 대조군 3마리, 저용량의 PNE 투여군 (2mg/kg/day) 3마리, 고용량 PNE (10mg/kg/day) 투여군 3마리로 무작위로 나눈 후, 14주동안 매일 PNE를 투여하였다. 실험동물로부터 간 조직을 수득한 후, 간과 신장 손상의 바이오 마커인, ALT (alanine aminotransferase, 알라닌 아미노전이효소), AST (aspartate transferase, 아스파테이트 전이효소), 빌리루빈(bilirubin) 및 크레아티닌(creatinine)을 관찰하였다.

그 결과, 대조군과 PNE 처리한 실험군의 차이가 나타나지 않았다(도 1a). 상기 결과는 PNE의 독성이 없음을 보여준다.

<실험예 2> 견우자 추출물 (PNE)이 지질 대사 경로에 미치는 영향 확인

<2-1> 마우스 모델에서 견우자 추출물 (PNE)이 간 지방증, 염증 또는 간 섬유증에 미치는 영향 확인

PNE의 지질 생성 경로에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 헤마톡실린과 에오신 염색(H&E staining) 및 시리우스 레드 염색(sirius red staining)을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 3에서 수득한 간 조직을 10% 중성 완충 포르말린 (formalin)에 고정시키고 파라핀 (paraffin) 블럭을 제작하였다. 상기 간 조직 절편을 탈 파라핀화하고 재수화 (rehydrated)시켰다. 간 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신 (H& E) 및 시리우스 레드 (sirius red)로 염색 한 후 조직 병리학적 평가를 수행하였다. H&E로 염색된 간 절편은 지방증, 간세포 팽창 및 염증에 대해 점수를 매겼다. Image J는 시리우스 레드 (sirius red)로 염색된 간 절편에서 간 섬유화 영역을 정량화하기 위해 적용되었다.

데이터는 평균 ± 표준 편차 (standard deviation; SD) 또는 평균의 표준 오차 (standard error of the mean; SE)로 표시되었다. 두 그룹 간의 차이는 양측 Student 's t-test를 통해 평가하였다. 데이터의 유의성은 p-값 <0.05 (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.005)으로 표시되었다.

그 결과, 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, HFD 섭취는 간 지방증과 염증을 유의적으로 유도하였으나, PNE의 투여는 HFD 단독 그룹과 간 지질 축적 및 면역 세포 침윤 정도가 유사하였으며, 비알코올성지방간 활동 점수 (NAFLD activity score)도 유사하였다 (^*** p <0.005).

그러나, 도 2a 및 2c에 나타난 바와 같이, PNE의 처리는 섬유증 영역을 크게 줄여주었다 (^** p <0.01, ^*** p <0.005).

상기 결과는 견우자 PNE가 간 섬유증 억제에 특이적인 효과를 나타냄을 입증한다.

<2-2> 마우스 모델에서 견우자 추출물 (PNE)이 간 지방증 관련 유전자 발현에 미치는 영향 확인

우리는 간 지방증 (hepatic steatosis)과 관련된 대사 경로를 조사하고 지방산 (fatty acid) 흡수, 지방 생성 및 지방산 산화에 관여하는 유전자의 발현을 분석하기 위해 qRT-PCR 실험을 수행하였다.

구체적으로, 간조직으로부터 TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 제조업체의 지침 (Takara, Kyoto, Japan)에 따라 상보적 DNA 합성을 위한 역전사 주형으로 사용하였고, DNase1 (Takara)은 게놈 DNA 오염을 방지하기 위하여 사용하였다. qRT-PCR은 CD36, PPAR, CPT1A 또는 PPARA 프라이머를 이용하여 GCFX Connect Real-Time System (Biorad Laboratories Hercules, CA, USA)으로 수행하였다. mRNA의 수준은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 기준으로 정량하였다.

그 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이, 견우자 추출물 (PNE)을 투여한 마우스의 지방산 흡수 (CD36), 지방 생성 (PPARG) 및 지방산 산화 (CPT1A 및 PPARA)와 관련된 mRNA 발현은 HFD를 섭취한 마우스와 유사하였다 (^* p < 0.05, ^*** p <0.005).

상기의 결과는 PNE의 간세포의 지방 분해에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.

<2-3> 마우스 모델에서 견우자 추출물 (PNE)이 중성지방에 미치는 영향 확인

PNE가 중성 지방의 축적에 미치는 영향을 확인하기 위하여 간 내 중성지방 함량을 평가하였다.

구체적으로, 간 내 중성지방(triglyceride; TG) 함량은 triglyceride colorimetric assay kit (Caman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 간 조직을 균질화하고 분석 시약으로 희석한 후, 원심 분리하고 상층액에 효소 혼합액을 넣어주었다. 혼합물을 실온에서 60분 동안 배양하고 각 샘플의 광학 밀도 (optical density)를 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 2e에 나타난 바와 같이, PNE 투여군과 HFD를 섭취한 마우스의 간 내 TG의 함량은 차이가 없었다 (^*** p <0.005).

<2-4> AML12 세포에서 견우자 추출물(PNE)이 지질 축적에 미치는 영향 확인

AML12 세포 (hepatocyte cell lines)을 이용하여 지질 축적에 대한 견우자 추출물 (PNE)의 효과를 조사하기 위하여, Oil Red O 염색을 수행하였다.

구체적으로, AML12 세포를 12-well plate의 커버 슬립에 배양한 다음, 세포에 150 μM의 PA (palmitic acid, 팔미트산)를 17시간 동안 처리하고, 0, 5 또는 10μm/ml의 농도의 견우자 추출물(PNE)을 처리하고, 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 실온에서 20분 동안 4% 파라포름 알데히드로 (paraformaldehyde) 고정한 다음, 60% 이소프로판올 (isopropanol)에서 여과된 Oil Red O로 20분 동안 염색하였다. 염색된 세포를 PBS로 3회 세척한 후 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 2f에 나타난 바와 같이, AML12 세포의 세포 내 지질 함량은 PA 처리 후 증가하였으나, PNE를 처리한 경우에 세포 내 지질의 축적은 억제되지 않았다.

Oil Red O 염색이 인접한 지질 방울의 인공적인 융합을 유발하여 부정확한 결과를 초래할 수 있음을 보여주는 이전의 보고가 있었다. 따라서 상기의 결과를 확인하기 위해 지질 방울을 표지하는 친유성 형광 염료인 보디피 (bodipy)를 이용하여 염색하였다.

구체적으로, AML12세포를 커버 슬립에 배양하고 150μM의 PA 및 견우자 추출물(PNE)로 처리하였다. 세포를 37℃에서 15분 동안 10μM의 보디피 (bodipy) 용액과 함께 배양하고 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 고정하였다. 핵을 염색하고 커버 슬립을 Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, CA, USA)으로 마운팅하였다.

그 결과, 도 2g에 나타난 바와 같이, 보디피 (bodipy) 양성 지질 축적이 PNE 처리에 의해 감소되지 않았음을 관찰하였다.

<2-5> 마우스 모델에서 견우자 추출물(PNE)이 염증과 관련된 유전자의 발현에 미치는 영향 확인

PNE가 염증과 관련된 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 qRT-PCR실험을 수행하였다.

구체적으로 ADGRE1, CXCL1, IL1b, TNFa 프라이머를 사용한 것을 제외하고, 실험예 <2-2>와 동일한 방법으로 qRT-PCR 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 2h에 나타난 바와 같이, NASH 병인에서 염증에 기여하는 유전자의 발현은 일반 식이 섭취 그룹과 비교하여 HFD를 섭취한 마우스의 간에서 극적으로 증가하였으나, PNE 처리는 염증 관련 유전자 발현에 영향을 미치지 않았다 (^* p < 0.05, ^*** p <0.005).

<2-6> 견우자 추출물(PNE)이 간기능지표에 미치는 영향 확인

PNE가 간기능지표인 혈청 알라닌 아미노전이효소 (alanine aminotransferase; ALT), 아스파테이트 전이효소 (aspartate transferase; AST) 및 콜레스테롤 (cholesterol; CHO) 수준에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 혈액화학분석 (Blood chemistry analysis)을 수행하였다.

구체적으로, 혈액 샘플은 마우스의 심장에서 심장 채혈하였고, 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 이후 ALT, AST 및 CHO 수준을 분석하였다.

그 결과, 도 2i에 나타난 바와 같이, ALT, AST 및 CHO의 혈청 수준은 HFD 그룹과 비교하여 PNE 처리에서 의해 변경되지 않았다 (^*** p <0.005).

상기의 결과들은 PNE가 간섬유증에 특이적인 역할을 하는 것을 시사한다.

<실험예 3> 견우자 추출물 (PNE)이 간 섬유증에 미치는 영향 확인

PNE가 간조직의 간 섬유증의 지표인 콜라겐 축적에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하이드록시프롤린 분석 (Hydroxyproline assay) 실험을 수행하였다.

구체적으로, 하이드록시프롤린 컬러메트릭 분석 키트 (hydroxyproline colorimetric assay kit)를 사용하여 제조업체의 지침 (Biovision, Milpitas, CA, USA)에 따라 간 조직에서 하이드록시프롤린 (hydroxyproline)의 수준을 측정하여 콜라겐 축적을 평가하였다. 간 조직을 물에서 균질화한 후에, HCl에서 가수분해하였다. 혼합물을 120℃에서 3시간 동안 배양하고 96-웰 플레이트 (96-well plate)로 옮겼다. 가수분해물의 하이드록시프롤린 (hydroxyproline) 함량은 마이크로 플레이트 리더 (microplate reader; Thermo Fisher Scientific)로 측정하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, HFD만 섭취한 마우스와 비교하여 PNE의 처리는 콜라겐 함량의 현저하게 감소시키는 효과를 나타내었다 (^* p < 0.05, ^*** p <0.005).

COL1A1, COL1A2 및 COL3A1 (Collagen type 1, 2, 3; 콜라겐 유형 1, 2, 3) 및 αSMA(α-smooth muscle actin; α- 평활근 액틴)는 섬유성 간에서 가장 풍부한 ECM 단백질이며, 간 성상 세포 활성화의 마커이다. 또한, FN1 (fibronectin 1; 피브로넥틴 1)과 TIMP1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1; 금속 단백 분해 효소 1의 조직 억제제)는 간 섬유증 발생 중에 유도된다. PNE 처리된 마우스 간 조직에서 섬유화 관련 유전자인 COL1A1, COL1A2, COL3A1, αSMA, FN1 및 TIMP1의 발현을 확인하기 위해 qRT-PCR 실험을 수행하였다.

구체적으로 COL1A1, COL1A2, COL3A1, αSMA, FN1 또는 TIMP1의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실험예 <2-2>와 동일한 방법으로 qRT-PCR 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 모든 ECM (extracellular matrix; 세포외기질) 및 ECM 관련 단백질의 mRNA 발현은 일관되게 HFD를 먹인 마우스의 간 조직에서 상승했으며 PNE 처리에 의해 감소되었다 (^* p < 0.05, ^** p <0.01, ^*** p <0.005).

αSMA의 발현을 단백질 수준에서 확인하기 위하여, 면역 블롯 분석을 수행하였다.

구체적으로, 간 조직을 RIPA 완충액으로 균질화하고 용해시켰다. 용해물을 원심 분리하고 상층액을 얻었다. 용해물에서 동등한 양의 단백질을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ge) 전기 영동에 의해 분리하였다. 폴리 비닐리덴 플루오라이드 막(Polyvinylidene fluoride membrane)을 사용하여 단백질을 전달하고 고정시켰다. 블롯은 αSMA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 GAPDH (Millipore, Schwalbach, Germany)에 대한 1차 항체를 처리하였다. 이어서, 프로브된 블롯에 2 차 항체를 처리하였고, 생성된 단백질-항체 복합체를 화학 발광 시약 (Abclon, Seoul, Korea)으로 검출하였다.

그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, αSMA의 발현에 대한 PNE의 억제 효과를 추가로 확인하였다.

PNE가 αSMA 및 COL1A1 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 면역 형광 분석을 수행하여 간조직을 분석하였다.

구체적으로, 간 절편의 파라핀을 제거하고, 수화한 다음, 차단 용액 (blocking solution)에서 30분 동안 배양하였다 (Life Technologies, MD, USA). αSMA (Sigma-Aldrich) 및 COL1A1 (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 1 차 항체를 각각 1 : 200 및 1 : 100으로 희석하여 4℃에서 밤새 간 절편과 반응시켰다. 그리고 결합된 항체는 1 : 300으로 희석하여 AlexaFluore 488을 사용하여 검출하였다. 염색된 슬라이드를 Vectashiled 장착 매체 (Vector Laboratoreis)로 장착하고 공 초점 현미경 (Nikon Instruments Inc., NY, USA)으로 분석하였다.

그 결과, 도 3d 및 3e에 나타나나 바와 같이, PNE가 αSMA 및 COL1A1 발현을 감소시키는 것을 관찰하였다.

상기의 결과는 PNE가 NASH 관련 섬유증의 완전한 발달을 억제한다는 것을 시사한다.

<실험예 4> 견우자 추출물 (PNE)이 TGFβ1 발현에 미치는 영향 확인

TGFβ1 (transforming growth factor beta1)은 대표적인 섬유화 관련 사이토카인 (cytokine)으로 TGFβ1의 발현은 간 섬유화과 양의 상관 관계가 있다. TGFβ1의 생체 내 mRNA 발현을 조사하기 위하여 TGFβ1의 프라이머를 사용한 것을 제외하면 실험예 <2-2>와 동일한 방법으로 qRT-PCR 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, HFD의 섭취는 간에서 TGFβ1의 발현을 극적으로 증가시킨 반면, PNE의 처리는 TGFβ1의 mRNA 발현을 현저하게 감소시켰다 (^* p < 0.05, ^*** p <0.005).

또한, 상기의 결과를 확인하기 위하여, ELISA 분석을 수행하였다.

구체적으로, 간 조직을 용해 완충액 (lysis buffer)에서 균질화하고 원심 분리 후 상층액을 수득하였다. DuoSet mouse TGFβELISA kit (R&D systems, MN, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 TGFβ1함량에 대해 상층액을 분석하였다. 먼저, 포획 항체를 PBS에 희석하고 96 웰 플레이트로 옮기고 밤새 배양하여 플레이트를 코팅하였다. 0.05 % Tween 20이 포함된 PBS로 세척한 후 블로킹 버퍼 (blocking buffer)로 플레이트를 블로킹하였다. 간 균질물을 플레이트로 옮기고 검출 항체와 함께 배양하였다. 각 웰의 광학 밀도는 마이크로 플레이트 리더 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 간조직의 TGFβ1 생산은 PNE를 처리한 경우 현저하게 감소하였다 (^* p < 0.05).

초기 질병 단계에서 TGFβ1은 주로 HSC를 순차적으로 활성화시키는 간세포와 대식세포를 포함한 염증 세포에서 분비된다. 활성화된 HSC는 더 많은 TGFβ1을 합성하고자가 분비 루프에서 활성화 상태를 영속시킨다. HSC의 활성화를 위해서는 TGFβ1의 자가분비 (autocrine) 및 측분비 (paracrine) 효과가 모두 중요하다.

따라서 AML12 세포 및 골수 유래 대식세포 (bone-marrow derived macrophages; BMDM)를 이용하여 TGFβ1의 mRNA 발현을 평가하기 위해 하기 표4의 프라이머를 사용한 것을 제외하고, 실험예 <2-2>와 동일한 방법으로 qRT-PCR 실험을 수행하였다. AML12 세포는 24 시간 동안 PNE의 처리 또는 무처리하에 150 μM의 PA (palmitic acid; 팔미트산)으로 처리하였고, BMDM는 24 시간 동안 PNE의 처리 또는 무처리하에 0.5 μg / ml의 LPS로 처리하였다.

그 결과, 도 4c 및 4d에 나타난 바와 같이, PA 처리된 AML12 세포 및 LPS 처리된 BMDM는 증가된 TGFβ1 발현을 나타냈다. 그러나 PNE로 처리하면 간세포와 대식세포 모두에서 TGFβ1의 mRNA 발현이 감소하였다 (^* p < 0.05, ^*** p <0.005).

PNE가 TGFβ1의 자가분비 (autocrine)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 마우스 간 조직에서 1 차 HSC를 분리하고 실험예 <2-2>와 동일한 방법으로 qRT-PCR 실험을 수행하였다.

구체적으로, 마우스 1 차 HSC는 콜라게나 제 간 삼출 (collagenase liver perfusion) 및 밀도 원심 분리 (density centrifugation)에 의해 수컷 C57BL / 6 (8-10 주령) 마우스로부터 분리되었다. 하대 정맥 (inferior vena cava)을 통한 관류는 EGTA 용액으로 수행하였다. 이어서 문맥을 절단하고 콜라게나제 I / DNase I 용액으로 계속 관류하였다. 간 조직을 조심스럽게 제거하고 다진 다음 세포 스트레이너 (cell strainer, 70μm)를 통해 여과하였다. 여과된 용액을 원심 분리하고 상층액을 Percoll 구배 원심 분리 (Percoll gradient centrifugation)로 분리하였다. HSC는 10 % FBS 및 스트렙토마이신 (100μg / ml) / 페니실린 (100 유닛 / ml) (웰진)이 보충된 RPMI1640에서 배양하였다. 마우스 1 차 HSC를 10μg / ml의 PNE 및 10ng / ml의 TGFβ1과 함께 또는 없이 24 시간 동안 배양하고, TGFβ1의 상대적 mRNA 발현을 qRT-PCR로 평가하였다.

그 결과, 도 4e에 나타난 바와 같이, TGFβ1이 HSC에서 자체 합성을 촉진하는 것을 관찰했지만 PNE를 처리한 경우 자가 분비 루프 (autocrine loop)를 억제함을 확인하였다 (^* p < 0.05, ^** p <0.01).

상기 결과를 확인하기 위하여, 면역 블로팅을 이용하여 분석하였다.

구체적으로, 마우스 1 차 HSC 및 LX-2 (human HSC line) 세포를 PNE 및 10ng / ml의 TGFβ1으로 24 시간 동안 처리하고, TGFβ1및 GAPDH의 단백질 발현을 면역 블롯팅으로 검출하였다. 마우스 1 차 HSC 및 LX-2 세포 용해물을 사용한 것과 1차 항체로 TGFβ (Cell Signaling Technology, MA, USA)를 사용한 것을 제외하고는 상기 <실험예3>에 나온 것과 같은 방법으로 면역 블롯팅을 수행하였다.

그 결과, 도 4f 및 4g에 나타난 바와 같이, PNE의 처리는 마우스 1 차 HSC 및 LX-2 세포에서 TGFβ1 단백질 발현을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.

상기의 데이터는 PNE가 간세포, 대식세포 및 HSC에서 TGFβ1발현을 조절함을 시사한다.

<실험예 5> 세포에서 견우자 추출물(PNE)이 HSC 활성화에 미치는 영향 확인

PNE 처리된 마우스 간 조직에서 섬유화 관련 마커의 감소를 기반으로, PNE가 HSC 활성화를 조절할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, HSC 활성화의 대표적인 마커인 COL1A1, COL1A2, COL3A1, αSMA 및 FN1와 같은 표적 유전자의 발현을 확인하기 위해 qRT-PCR 실험 및 면역블롯을 수행하였다.

구체적으로, 마우스 1 차 HSC 및 LX-2 (human HSC line) 세포를 10μg / ml의 PNE 및 10ng / ml의 TGFβ1과 함께 24 시간 동안 배양하였다. qRT-PCR은 상기 표3의 프라이머를 사용하여 실험예<2-2>와 동일한 방법으로 수행하였다. 면역블롯은 αSMA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), COL1A1 (Novusbio, Littleton, CO), Actin (Millipore, Schwalbach, Germany)을 1차 항체로 사용하여 <실험예 3>에 나와있는 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 5a 내지 5d에 나타난 바와 같이, 마우스 1 차 HSC 및 LX-2 세포에서 PNE는 섬유화 관련 마커 (fibrogenic marker)의 mRNA 수준과 αSMA 및 COL1A1의 단백질 발현을 크게 감소시켰다 (^* p < 0.05, ^** p <0.01, ^*** p <0.005).

다음으로, 마우스 1 차 HSC를 이용하여 αSMA의 면역 형광 염색을 수행하였다.

구체적으로, 마우스 1 차 HSC를 멸균 커버 슬립에 시드하고 TGFβ1 및 견우자 추출물(PNE)을 처리하였다. 세포를 고정한 후, αSMA (Sigma-Aldrich)와 함께 배양하였다. 세포를 MeOH / 아세톤 용액으로 20 분 동안 고정한 다음 PBS로 3 회 세척하고 블로킹 버퍼 (blocking solution, Life technologies)으로 블로킹하고 항 -αSMA 항체를 4℃에서 밤새 처리하였다. 염색된 슬라이드를 Vectashiled mounting medium (Vector Laboratoreis)로 마운팅하고 공 초점 현미경 (Nikon Instruments Inc., NY, USA)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 5e에 나타나 바와 같이, TGFβ1 처리된 1 차 마우스 HSC가 αSMA 발현에 의해 입증된 바와 같이 근섬유아세포 (myofibroblasts)로 분화되는 반면, TGFβ1과 PNE의 공동 처리는 αSMA의 발현을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

상기의 결과를 종합하면, PNE는 HSC 활성화를 억제한다.

<실험예 6> 견우자 추출물(PNE)이 SMAD2 및 SMAD3 활성에 미치는 영향

SMAD2 (SMAD Family Member 2)와 SMAD3 (SMAD Family Member 3)는 TGFβ1 수용체의 활성화에 의해 인산화된다. HSC에서 SMAD2 및 SMAD3의 활성화는 중요하며 HSC 활성화 및 섬유 생성에 필요한 전사 인자 역할을 하므로, 간 조직 및 HSC에서 SMAD2 및 SMAD3의 인산화 상태를 관찰하였다.

먼저, HFD를 섭취한 마우스에 PNE를 무처리 또는 처리하고, 추출된 간조직으로부터 SMAD2 및 SMAD3의 인산화 수준을 확인하기 위해 면역 블롯을 수행하였다. 구체적으로, pSMAD2, pSMAD3, SMAD2/3 (Cell Signaling Technology, MA, USA) 및 GAPDH (Millipore, Schwalbach, Germany)를 1차 항체로 사용하여, <실험예 3>에 나타난 방법을 이용하여 면역블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, HFD를 섭취한 마우스에서 PNE는 SMAD2 및 SMAD3의 인산화를 현저하게 감소시켰다.

또한, 마우스 1 차 HSC 및 LX-2 세포에 24 시간 동안 5 또는 10μg / ml의 PNE를 처리하고 4 시간 동안 10ng / ml의 TGFβ1을 처리하였다. pSMAD2, pSMAD3, SMAD2/3 (Cell Signaling Technology, MA, USA) 및 GAPDH (Millipore, Schwalbach, Germany)를 1차 항체로 사용하여, <실험예3>에 나타난 방법을 이용하여 면역블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 6b 및 6c에 나타난 바와 같이, PNE 처리는 마우스 1 차 HSC 및 LX-2 세포에서 TGFβ1에 의해 유도된 SMAD2 및 SMAD3의 인산화를 감소시켰다.

상기의 결과는 PNE가 HSC에서 TGFβ1 수용체 활성화의 하위 경로인 SMAD2 및 SMAD3의 활성화를 감소시킴을 확인한 것으로, PNE의 항섬유화 효과를 설명한다.

Claims

견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 견우자 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는, 간 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 간 섬유증은 비알코올성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis; NASH)관련 간 섬유증인 것을 특징으로 하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 견우자 추출물은 TGFβ1 (transforming growth factor beta 1)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 견우자 추출물은 HSC (hepatic stellate cell) 활성화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 견우자 추출물은 COL1A1 (collagen type 1), COL1A2 (collagen type 2), COL3A1 (collagen type 3), αSMA (α-smooth muscle actin), FN1 (fibronectin 1) 및 TIMP1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 견우자 추출물은 SMAD2 (SMAD Family Member 2) 및 SMAD3 (SMAD Family Member 3)의 활성화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증의 예방 또는 개선용 건강식품조성물.
제9항에 있어서,
상기 견우자 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증의 예방 또는 개선용 건강식품조성물.
제10항에 있어서,
상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는, 간 섬유증의 예방 또는 개선용 건강식품조성물.
견우자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 간 섬유증의 예방 또는 치료용 사료 첨가제.