KR20220145254A

KR20220145254A - Trex1의 유전성 강직성 하반신 마비의 치료 용도

Info

Publication number: KR20220145254A
Application number: KR1020220016648A
Authority: KR
Inventors: 김남순; 할더데바시시; 전수진; 이다용; 김병준; 성덕현; 윤지용; 이정주; 전수영
Original assignee: 한국생명공학연구원; 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2021-04-21
Filing date: 2022-02-09
Publication date: 2022-10-28

Abstract

본 발명은 TREX1 (Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 유전성 강직성 하반신마비의 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 및 상기 유전자의 발현수준 측정을 통한 유전성 강직성 하반신마비의 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.

Description

TREX1의 유전성 강직성 하반신 마비의 치료 용도 {Use of TREX1 for treatment of Hereditary Spastic Paraplegia}

본 발명은 TREX1 (Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 및 상기 유전자의 발현수준 또는 단백질 활성 측정을 통한 유전성 강직성 하반신마비의 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.

유전성 강직성 하반신마비(Hereditary spastic paraplegia, HSP)는 다리의 근육이 점차적으로 약해져 마비되고, 근육의 긴장성이 증가하며, 뻣뻣해지는 증상이 나타나는 유전성 신경계 질환이다. 유전성 강직성 하반신마비와 관련성이 있는 유전자 (Spastic paraplegia loci, SPG)는 70종 이상 알려져 있으며, 관련 돌연변이체도 수십종이 보고되어 있으나, 발병기전은 아직 명확하지 않다. 유전성 강직성 하반신마비의 증상은 SPG 유전자들의 돌연변이에 의한 기능 상실이 척수의 피질 척수로의 점진적인 퇴행성 변화를 유도하기 때문에 나타나는 것으로 추정하고 있다.

유전성 강직성 하반신마비의 유전 양상에 따라 염색체 우성질환 (autosomal dominant, AD type), 염색체 열성질환 (autosomal recessive, AR type) 혹은 X 염색체 링크 (X-chromosome liked type)으로 구분된다. 주로 상염색체 우성으로 나타나지만, 염색체 열성질환 (autosomal recessive, AR type) 혹은 X 염색체 링크 (X-chromosome liked type)로도 확인되고 있다.

또한, 유전성 강직성 하반신마비는 단순형 유전성 강직성 하반신마비(Uncomplicated HSP)와 복합형 유전성 강직성 하반신마비(Complicated HSP)로 나누어질 수 있다. 단순형 유전성 강직성 하반신마비는 진행성의 강직성 하반신 마비가 초기 소견으로 발생되고 근육 강직이 발달될 수 있고, 방광 조절에 어려움을 느낄 수 있다. 복합형 유전성 강직성 하반신마비는 단순형에서 추가적으로 신경학적 이상이 보이는데 시각, 청각장애, 정신 지연, 수의적인 운동 조절의 부전(운동실조) 등의 이상이 나타날 수 있다.

위와 같은 유전성 강직성 하반신 마비에 대하여, 물리 요법 및 운동이나 경직을 완화시키는 약물을 이용한 치료가 일반적으로 이용되고 있다.

물리 치료 및 운동은 이동성 및 근육 강도를 유지하고 이동 범위 및 지구력을 개선하며 피로를 경감하고 경련 및 연축을 예방하는 데에 도움이 된다. 바클로펜(근이완제)은 경직을 완화하기 위해 선택할 수 있는 약물이며, 대안으로서 보툴리늄 독소(근육을 마비시키거나 주름을 치료하기 위해 사용되는 세균 독소), 클로나제팜, 단트롤렌, 디아제팜 또는 티자니딘을 사용할 수도 있다고 알려져 있다.

하지만, 위와 같은 방법들은 유전성 강직성 하반신마비의 근본적인 치료 방법이라고 볼 수 없다. 즉, 단순히 환자의 근육 강직을 도와주는 대증적인 치료가 대안이 되고 있을 뿐이다.

또한, 다양한 유전자들이 유전성 강직성 하반신마비 환자에서 그 발현 수준의 변화 및/또는 돌연변이가 발생되는 것이 알려져 있으나, 이와 같은 유전자가 유전성 강직성 하반신마비의 질환 치료 소재로 연구된 바 없다.

이에, 유전성 강직성 하반신마비를 치료할 수 있는 새로운 기작 또는 근본적인 치료제 연구의 필요성이 대두되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 Three prime repair exonuclease 1(TREX1)의 발현 조절을 통하여 소포체 스트레스(ER stress)로 인해 유도되는 세포 사멸을 억제하여 신경 세포의 분화/생존에 기여할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 TREX1(Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 약학적 조성물을 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 치료에 사용하기 위한 TREX1(Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 TREX1(Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 뉴클레오티드의 변이를 검출하는 단계; 및 (b) 상기 검출이 이루어지는 경우 유전성 강직성 하반신마비의 발병 위험이 높은 위험군으로 결정하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 271번 위치의 구아닌이 알라닌으로 치환된 뉴클레오티드 서열을 검출하는 단계; 및 (b) 상기 검출이 이루어지는 경우 유전성 강직성 하반신마비의 발병 위험이 높은 위험군으로 결정하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 (a) Three prime repair exonuclease 1(TREX1) 단백질의 발현이 저해된 세포에 피검 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 처리된 세포에서 TREX1 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비 예방 또는 치료용 후보물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 (a) Three prime repair exonuclease 1(TREX1) 의 활성을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 TREX1 활성 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비 예방 또는 치료용 후보물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 TREX1(Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 유전성 강직성 하반신 마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물을 이용하면, TREX1의 기능 이상, 변이, 발현 저하가 발생한 세포에서 TREX1의 기능을 회복시켜 신경 세포의 분화능을 회복하여 사멸을 억제하고, 골지체-미세소관(Golgi-Microtubule) 네트워크 파괴를 최소화하며, 신경세포의 소포체 스트레스 활성화 및 칼슘 항상성 저해를 억제함으로써 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서의 "TREX1(Three prime repair exonuclease 1)"은 mammalian cell 내 major 3' DNA exonuclease에 해당한다. 알려진 TREX1 기능은 endogenous retroelement 및 HIV-1 감염 중에 생성되는 HIV DNA인 ssDNA를 분해함으로써 cell-intrinsic autoimmune pathway의 활성을 억제하는 것이다. TREX1의 돌연변이와 관련하여 자가면역 질환 중 일부와 연관성이 연구된 바가 있으나, HSP와 관련해서 알려진 바가 없다. TREX1의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 TREX1 단백질은 이의 야생형 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이의 상동 단백질 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 TREX1 단백질 또는 이의 상동단백질은 천연에서 추출하거나 합성 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에서 TREX1 단백질을 코딩하는 유전자는 TREX1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 의미하며, 이들은 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 TREX1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나, 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, TREX1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 TREX1 단백질을 코딩하는 핵산분자는 서열번호2로 표시되는 핵산 서열을 가지거나, 이의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 TREX1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 단백질을 유효성분으로 사용할 경우, 상기 약학 조성물에 단백질 자체를 유효성분으로 포함할 수도 있고, 개체의 체내에서 TREX1 또는 그의 상동단백질을 보다 용이하게 발현시킬 수 있도록, 상기 단백질을 코딩하는 핵산이 유전자 치료용 발현벡터에 포함된 형태로 상기 약학 조성물에 포함할 수도 있다. 이때, 상기 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등)에서 상기 단백질을 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 단백질이 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동 가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별 마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 구체적으로는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 아데노바이러스 벡터, 아데노부속바이러스 벡터, 배큘로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등에 상기 단백질을 코딩하는 핵산이 도입된 형태가 될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 작제물, 벡터, 플라스미드는 하나 이상의 프로모터의 제어 하에 펩타이드를 발현할 수 있다.

상기 TREX1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명은 바람직하게 TREX1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.

여기서 상기 TREX1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 TREX1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열일 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "작동적으로 연결된"이란, 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합위치의 어레이)과 다른 뉴클레오티드 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서 프로모터 서열은 일반적으로 벡터 발현에서 사용되는 프로모터 서열, 신경 세포 특이적으로 알려져 있는 프로모터 서열 또는 과발현을 목적하는 프로모터 서열 등을 포함할 수 있다. 예를 들어 일반적인 프로모터 서열로 CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터 등을 이용할 수 있다.

또한, 예를 들어, 신경세포 특이 프로모터들로 human synapsin I (SYN) 프로모터, mouse calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) 프로모터, rat tubulin alpha I (Tuba1a) 프로모터, rat neuron-specific enolase (NSE) 및 human platelet-derived growth factor-beta chain (PDGF) 프로모터 등을 이용할 수 있으며, 과발현 프로모터들로 EF-1α 프로모터, CAG 프로모터, CMV 프로모터 등을 이용할 수 있다.

바람직하게 EF-1α, CMV, CAG, CaMKII, 또는 human synapsin I (SYN) 프로모터일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 유전자 작제물, 벡터 또는 플라스미드는 하나 이상의 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 효율적인 RNA 처리 신호, 예컨대 세포질의 mRNA를 안정화시키는 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리A) 신호, 예를 들어 Kozak 서열; 번역 효율을 증대시키는 서열 또는 WPRE; mRNA 안정성을 증대시키는 서열; Central polypyrimidine tract/central termination sequence (cPPT/CTS); Rev-responsive element (RRE) 및 필요에 따라, 암호화된 생성물의 분비를 증대시키는 서열 등을 함유할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 유전자 작제물은 또한 인핸서를 포함할 수 있다. 이러한 인핸서는 CMV 인핸서, WPRE 인핸서, HPRE 인핸서, CTE 인핸서, 또는 이의 유도체 또는 하이브리드를 포함하나 이에 한정되지 않는 바이러스 인핸서이다.

또한 본 발명에 따른 유전자 작제물은 Kozak 서열을 포함할 수 있다.

포장 신호는 5' 역 말단 반복부 (ITR) 및 3' ITR일 수 있다. 예를 들어 유전자 작제물은 AAV 벡터에서 사용을 위한 AAV ITR 서열을 포함한다. 한 구체예에서, ITR은 캡시드를 공급하는 것과는 상이한 AAV로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, ITR 서열은 AAV2로부터 유래하거나, 편리를 위해 및 규제 승인을 가속화하기 위해 사용될 수 있는 그것 (ITR)의 결실된 버전이다. 그러나, 다른 AAV 공급원으로부터 유래되는 ITR이 선택될 수도 있다. ITR의 공급원이 AAV2로부터 유래하고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 공급원으로부터 유래되는 경우에, 그 결과의 벡터는 위형 (pseudotype)으로 명명될 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터 게놈은 AAV 5' ITR, 본 발명에 따른 임의의 코딩 서열 및 임의의 조절 서열, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 요소들의 다른 배치 형태도 적합할 수 있다. ITR로 명명되는, D-서열 및 말단 분해 부위(terminal resolution site) (trs)가 결실되어 있는, 5' ITR의 단축된 버전이 기술되었다. 다른 구체예에서, 전체-길이 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다.

일부 구현예에서, 조절 서열은 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리A 신호는 소(bovine) 성장 호르몬 폴리아데닐화(bovine growth hormone polyadenylation, bGH 폴리A) 신호, 작은 폴리A(small polyA, SPA) 신호, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화(human growth hormone polyadenylation, hGH 폴리A) 신호, SV40 폴리A 신호, SV40 후기(late) 폴리A 신호, 또는 이의 유도체 또는 하이브리드이다.

본 발명에 따른 유전자 작제물은 작제물의 동일성을 유지하는 한도에서 변형 가능하다. 즉, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 하기 기술된 기본 매개변수를 이용한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해(예를 들어, NCBI 웹사이트 등 참조) 측정된 바와 같이 명시된 영역 (예를 들어, 비교 창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 일치에 대하여 비교 및 정렬될 때 본원에서 제공된 변형된 ORF 중 어느 하나)에 걸쳐 같거나 또는 같은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 퍼센트 (즉, 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성)를 갖는 둘 이상의 서열 또는 부분 서열을 말한다. 즉, 목적하는 펩타이드의 작용 효과를 유지하는 한도 내에서 유전자 작제물의 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명은 상기 유전자 작제물을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본원에 기재되는 유전자 작제물 및 발현 벡터는 HSP의 치료 및 개선을 위해 사용될 수 있다.

재조합 발현 벡터는 유전자 작제물을 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 특히, 렌티바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 이용하는 방법이 바람직하다.

아데노-관련 바이러스 (AAV) 바이러스 벡터는 그 안에 표적 세포로의 전달을 위해 핵산 서열이 포장되어 있는 AAV 단백질 캡시드을 가지는 AAV DNase-내성 입자이다. AAV 캡시드는 선택된 AAV에 따라 대략 1:1:10 내지 1:1:20의 비율로 정이십면체 대칭으로 정리된, 60개의 캡시드 (cap) 단백질 하위유닛, VP1, VP2 및 VP3으로 구성된다. AAV 캡시드는, 변종을 포함하여, 기술분야에 공지되어 있는 것들로부터 선택될 수 있다.

“렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 일종이다. 상기 벡터는 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터로 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시킨다. 또한, 상기 벡터는 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.

렌티바이러스는 소 렌티바이러스 군, 말 렌티바이러스 군, 고양이 렌티바이러스 군, 양, 염소 렌티바이러스 군 및 영장류 렌티바이러스 군의 구성원을 포함한다. 유전자 요법을 위한 렌티바이러스 벡터의 개발은 문헌 [Klimatcheva et al. (1999) Frontiers in Bioscience 4:481-496]에 개관되어 있다. 유전자 요법에 적합한 렌티바이러스 벡터의 설계 및 사용은 예를 들어 미국 특허 제6,207,455호 및 미국 특허 제6,615,782호에 기술되어 있다. 렌티바이러스의 예는 HIV-1, HIV-2, HIV-1/HIV-2 슈도형, HIV-1/SIV, FIV, 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스, 및 소 면역 결핍 바이러스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

재조합 렌티바이러스는 본 발명의 렌티바이러스 벡터, 패키징 (packaging) 플라스미드 및 엔벨로프 (envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질 전환시키는 단계; 및 형질 전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득할 수 있다.

상기 용어 "패키징 플라스미드(packaging plasmid)" 및 "엔벨로프플라스미드(envelope plasmid)"는 단백질을 코딩하는 유전자가 적재된 플라스미드이다. 이들 플라스미드는 렌티바이러스 벡터 이외에, 렌티바이러스를 생산하기 위해 필요한 헬퍼 구조물(예를 들어, 플라스미드 또는 단리된 핵산)을 제공할 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 패키징하는데 유용한 요소들을 함유한다. 상기 요소로는 GAG 전구체와 같은 구조 단백질; pol 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제, 외피 단백질, 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을 포함할 수 있다.

재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clonetech Laboratories사의 Lenti-X Lentiviral Expression System이나, Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드(예를 들어, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP, pLVX 등) 또는 엔벨로프 플라스미드(예를 들어, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등)를 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따르면, 렌티바이러스에 위 TREX1을 도입하여 신경세포 분화능의 회복, 신경 세포 사멸의 억제, 소포체 스트레스 감소와 같은 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, pLVX-EF1a-IRES를 포함하는 벡터 시스템을 사용하였다. 이러한 벡터 시스템에서 바이러스 생성 효율을 높여주는 Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE)와 Central polypyrimidine tract/central termination sequence (cPPT/CTS), Rev-responsive element (RRE) 를 더 포함하여 TREX1을 발현하는 벡터 시스템을 구성하였다.

본 발명의 용어 "유전자 치료(gene therapy)"란, 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병 등을 치료하기 위하여, 질병과 관련이 있는 유전자를 환자의 체내에 직접적으로 주입하고 상기 유전자를 세포 내에서 발현시켜 그의 기능을 정상화시키는 방법을 일컫는다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다.

본 발명에서는 신경세포에서 TREX1의 발현을 증가시키는 경우 세포의 사멸을 억제할 수 있고, 골지체-미세소관(Golgi-Microtubule) 네트워크 파괴를 최소화하며, 신경세포의 소포체 스트레스 활성화 및 칼슘 항상성 저해를 억제할 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명의 TREX1을 과발현시키는 물질은 유전성 강직성 하반신마비 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에서의 "유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)"는 다리의 근육이 점차적으로 약해져 마비되고, 근육의 긴장성이 증가하며, 뻣뻣해지는 증상이 나타나는 유전성 신경계 질환이다. 유전성 강직성 하반신마비는 단순형 유전성 강직성 하반신마비(Uncomplicated HSP)와 복합형 유전성 강직성 하반신마비(Complicated HSP)로 나누어진다. 단순형 유전성 강직성 하반신마비는 진행성의 강직성 하반신 마비가 초기 소견으로 발생되고 근육 강직이 발달될 수 있고, 방광 조절에 어려움을 느낄 수 있으나, 복합형 유전성 강직성 하반신마비는 단순형에서 추가적으로 신경학적 이상이 보이는데 시각, 청각장애, 정신 지연, 수의적인 운동 조절의 부전(운동실조) 등의 이상이 나타날 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서의 용어, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 유전성 강직성 하반신마비의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(트윈) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함된 상기 TREX1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 함량은 약학 조성물이 유전성 강직성 하반신마비에 대한 치료 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약제는 혈류, 신경 내로 또는 직접 치료를 필요로 하는 부위 내로 주사에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 혈액-뇌-장벽을 통과하도록 구성된다. 주사는 정맥내(볼루스 또는 주입) 또는 피하(볼루스 또는 주입) 또는 피내(볼루스 또는 주입)일 수 있다. 멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약학적 조성물은, 예를 들어, 뇌간, 근육내, 경막내, 경막외, 척수강내, 복강내, 정맥내 및 피하 주사에 의해 이용될 수 있다. 유전자 작제물 또는 재조합 발현 벡터는 투여 시 멸균수, 식염수, 또는 다른 적절한 멸균 주사용 매질을 사용해서 용해되거나 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물로서 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 약학적 조성물을 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 치료에 사용하기 위한 TREX1(Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어 TREX1(Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 용도를 제공한다.

상기 "약학적 조성물" "유전성 강직성 하반신마비" 및 "치료"는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.

본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 대상체에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 구체적인 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피 내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다.

또한, 본 발명에 따른 조성물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70kg인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적으로 1일 0.01mg 내지 5000mg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물, 특히 렌티 바이러스의 투여는 예를 들어, 1회 이상, 1 내지 4회 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복 투여하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격, 1주, 2주 내지 4주 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 또는 1주 이상 간격으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 렌티바이러스의 경우, 성인 기준 1일 1.0x10⁶ 내지 1.0x10¹² TU, 구체적으로 1.0x10⁸ 내지 1.0x10¹⁰ TU의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 투여를 진행하는 의사의 임상적 판단하에 적절 양에 대한 조절이 가능하다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 뉴클레오티드의 변이를 검출하는 단계; 및 (b) 상기 검출이 이루어지는 경우 유전성 강직성 하반신마비의 발병 위험이 높은 위험군으로 결정하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

변이는 표준 유전체 DNA에 대하여 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 치환, 삽입, 결실, 또는 전좌를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 치환은 예를 들면 단일 뉴클레오티드 변이(Single Nucleotide Variation: SNV)일 수 있다. 또한 상기 뉴클레오티드 서열의 변이는 표준 유전체 DNA에 대하여 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 치환, 삽입, 결실, 또는 전좌를 포함하는 것일 수 있다.

용어 "단일 뉴클레오티드 변이 (Single Nucleotide Variation: SNV)"는 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism: SNP)이 하나의 종 내 다수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 말하는 것에 비해, 하나의 서열 또는 종 내 소수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 의미하는 것으로, 예를 들면 시퀀싱 데이터에서 나타나는 표준염기서열과의 차이를 의미할 수 있다.

용어 "복제수 변이(Copy Number Variation: CNV)"는 특정 염색체의 상대적으로 큰 영역이 결손되거나 증폭되어 반복적으로 나타나는 유전체 DNA의 변이를 의미하는 것으로, 예를 들면 1kB 이상의 DNA 조각이 중첩되어 존재하거나 일부가 결실되는 변이일 수 있다.

TREX1 뉴클레오티드의 변이(치환, 삽입, 결실, 또는 전좌 등)는 유전성 강직성 하반신마비의 발병 또는 질환의 유병과 관련성이 높다. 이에 따라, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 변이를 검출함으로써 유전성 강직성 하반신마비의 발병 위험이 높은 위험군으로 결정할 수 있다.

통상의 기술자라면 GeneBank 상 등록 번호를 이용하여 변이의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. UCSC genome browser 또는 GenBank에 등록되어 있는 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

즉, 본 발명에 따르면, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 변이를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 유전성 강직성 하반신마비 진단용 조성물을 제공한다.

보다 구체적으로, 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 271번 위치의 구아닌이 알라닌으로 치환된 뉴클레오티드 서열을 검출하는 단계; 및 (b) 상기 검출이 이루어지는 경우 유전성 강직성 하반신마비의 발병 위험이 높은 위험군으로 결정하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 서열번호 2의 271번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커(c.271 G>A)를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 유전성 강직성 하반신마비 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 서열번호 2의 271번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커(c.271 G>A)를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 유전성 강직성 하반신마비 진단용 키트를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "n N>M" (이때, n은 정수이고, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다.)은 유전자 염기서열에서 n번째 N 염기가 M 염기로 변이된 것을 의미한다.

여기서, 상기 c.271 G>A는 V91M의 아미노산 치환을 유발한다.

상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한, 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "위험도의 예측"은 질환의 발생가능성, 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다.

상기 서열번호 2를 기반으로 하는 연속된 뉴클레오티드 서열은 바람직하게, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 100개, 200개 또는 그 이상의 연속된 서열일 수 있다.

상기 시료는 머리카락, 혈액, 조직, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

개체(피검체)로부터 분리된 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 것은, 당업계에 알려진 방법을 통해서 수행될 수 있다. 예컨대, 관심 DNA가 세포에 있을 때 순수한 DNA를 제조하기 위하여 먼저 세포 추출물을 제조한 다음, 차등 침강(differential precipitation), 칼럼 크로마토그래피, 유기용매 추출 등을 더 수행할 수 있고, 상기 추출물은 해당 기술분야의 표준기술에 의해서 제조될 수 있다. 상기와 같은 방법으로 세포 또는 조직으로부터 분리한 DNA는 직접적으로 정제하거나 PCR 또는 RT-PCT(real time PCR)과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 DNA는 DNA뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다. 또한, PCR 또는 RT-PCR은 개체의 전체 DNA 서열에 대해 수행될 수도 있지만, 단일염기다형성으로 알려져 있는 부위 주변만에 대해서도 수행될 수 있다.

예를 들어, 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위하여, 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있다.

예를 들면, 디데옥시법에 의하여 직접적인 DNA의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나 단일염기다 형성 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있다. 상기 혼성화의 정도는 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으나, 그 외 전기적 신호검출방법 등이 사용될 수 있다. 구체적으로, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적 탐침 혼성화(allele-specific hybridization), 대립유전자 특이적 증폭 (allele-specific amplification), 서열분석(sequencing), 5' 뉴클라아제 분해(5' nuclease digestion), 분자비콘어세이(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이(oligonucleotide ligation assay), 크기분석(size analysis) 및 단일가닥 배좌 다형성(single-stranded conformation polymorphism)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 유전자형을 확인하기 위하여, 유전자 서열 분석이 수행될 수 있다. 서열분석은 당업계에 공지된 방법을 모두 이용할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 자동염기서열분석기를 사용하거나, 표적 심층 염기서열분석(targeted deep sequencing; TDS), 드랍렛 디지털 중합효소연쇄반응(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법 및 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법 중 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, (a) Three prime repair exonuclease 1(TREX1) 단백질의 발현이 저해된 세포에 피검 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 처리된 세포에서 TREX1 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비 예방 또는 치료용 후보물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

또한, 상기 (b) 단계에서 추가로 TUBB3, MAP2 및/또는 NF-L 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. 위 (b) 단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 TUBB3, MAP2 및/또는 NF-L는 신경 분화의 표지자로 이용될 수 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서 추가로 cleaved caspase 3, cleaved parp, 및/또는 cytochrome C의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. 위 (b) 단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 cleaved caspase 3, cleaved parp, 및/또는 cytochrome C는 세포 사멸의 표지자로 이용될 수 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서 추가로 p-PERK, p-eIf2a, BiP/GRP78 및/또는 ATF6의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. 위 (b) 단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 p-PERK, p-eIf2a, BiP/GRP78 및/또는 ATF6는 소포체 스트레스 표지자로 이용될 수 있다.

또한, 상기 (b) 단계에서 추가로 Chop, ERO1a, IP3R1, 및/또는 p-CaMKII 의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. 위 (b) 단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 Chop, ERO1a, IP3R1, 및/또는 p-CaMKII 는 칼슘 항상성 유지 표지자로 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "후보 물질(test agent)"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소 (element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "TREX1의 발현 수준"이란 TREX1 mRNA의 발현 수준 또는 TREX1 단백질의 발현 수준을 모두 포함하는 개념이며, 본 발명에서 "TREX1의 발현 수준 측정"은 상기 TREX1 단백질의 발현 수준 측정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) TREX1의 활성을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 측정한 TREX1의 활성 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비 예방 또는 치료용 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현 수준 측정", “TREX1의 활성 수준”의 측정이란 TREX1의 발현 정도를 확인하는 과정으로 단백질의 양을 측정한다. 구체적으로 TREX1 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 상기 항체의 단편들도 본 발명의 항체에 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 TREX1 유전자로부터 발현되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F (ab'), F (ab')2 및 Fv 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

이러한 측정 결과에 따라 상기 살핀바와 같이, 유전성 강직성 하반신마비 예방 또는 치료용 후보물질을 스크리닝할 수 있다.

TREX1(Three prime repair exonuclease 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 사용할 수 있으며, 변이를 확인하여 HSP 질환의 위험성을 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 상기 TREX1의 활성을 측정함으로써 유전성 강직성 하반신마비 치료제의 스크리닝에 사용이 가능하다.

도 1은 유전성 강직성 하반신 마비 환자의 가계도에서 단일염기 변이를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 면역형광염색법을 이용하여 siTREX1, V91M에 의한 신경 세포의 분화능 저해를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 생쥐 유래 피질 신경 세포에서 환자 유래 단일변이(V91M)을 포함한 렌티바이러스 감염시 신경 세포의 분화능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입에 의한 신경 세포의 분화 저해를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)에 의한 신경세포 사멸 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 생쥐 유래 피질 신경 세포에 환자 유래 단일염기 변이(V91M)-TREX1 렌티바이러스를 감염시켰을 때, 신경 세포 세포 사멸 촉진을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)시, 골지체 단편화 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)시, 미세소관 아세틸화 손상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 siTREX1을 통해 TREX1 발현 저해시, 미세소관을 통한 골지체 재편성 저해를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)에 인한 소포체 스트레스 유도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 생쥐 유래 피질 신경 세포에서 V91M-TREX1 렌티바이러스를 감염하여, 소포체 스트레스 경로를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 TREX1 발현 저하에 의한 신경 세포에서 소포체 칼슘 항상성 유지 조절자들의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 세포 내 칼슘 이온의 시각화를 통해 세포 내 칼슘 이온의 양이 증가함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 siTREX1을 통해 TREX1 발현 저해하였을 때 CHOP-ERO1a-IP3R 경로가 활성화되는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 Lentivirus-TREX1-WT 및 Mock의 제조 및 이의 세포에 감염에 의한 TREX1 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 Lentivirus-TREX1-WT 처리를 통해 TREX1의 발현을 증진함으로써 신경 세포의 신경돌기의 길이 증가를 확인하여 TREX1 결손에 의해 저해된 신경 세포의 분화능의 회복을 확인한 결과를 나타낸다.
도 17은 Lentivirus-TREX1-WT 처리를 통해 TREX1의 발현을 증진함으로써 신경 분화 지표자 TUBB3, MAP2 및/또는 NF-L의 회복을 확인하여 TREX1 결손에 의해 저해된 신경 세포의 분화능의 회복을 확인한 결과를 나타낸다.
도 18은 Lentivirus-TREX1-WT 처리를 통해 TREX1의 발현을 증진함으로써 세포 사멸 표지자인 cytochrome C, cleaved caspase 3 및 cleaved PARP의 감소를 확인하여 TREX1 결손에 의한 신경 세포 사멸에 대한 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 19는 Lentivirus-TREX1-WT 처리를 통해 TREX1의 발현을 증진함으로써 소포체 스트레스 표지자인 ATF6, p-PERK, p-eIF2a 및 BiP의 발현 감소를 확인하여 TREX1 결손에 의해 유도된 소포체 스트레스의 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 20은 Lentivirus-TREX1-WT 처리를 통해 TREX1의 발현을 증진함으로써 CHOP-ERO1a-IP3R1 경로의 유전자들의 활성 억제를 확인하여 TREX1 결손에 의해 저해된 칼슘 항상성 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유전성 강직성 하반신 마비 환자의 가계도에서 단일염기 변이 확인

1-1. 유전성 강직성 하반신 마비 환자의 가계도에서 단일염기 변이 확인

유전성 강직성 하반신 마비로 진단된 환자와 그 가족의 혈액에서 DNA를 추출하여 전장 엑솜 시퀀싱을 수행한 후, Burrows-Wheeler Aligner software를 통해 유전자 위치 지정(gene mapping)을 수행하였다. 단일 염기 변이 또는 유전자 삽입/삭제를 Genome Analysis Toolkit(GATK)를 통해 확인한 후, ANNOVAR 소프트웨어를 활용하여, 유전자 주석 달기(gene annotation)를 수행하였다. 또한 환자의 대뇌 MRI를 통해 대뇌 손상 및 이상 여부를 확인하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환자의 MRI에서 뇌백질 이상 및 뇌실주의 및 내부 캡슐이 관찰되었으며, 중뇌의 위축증이 확인되었다(도 1의 가). 또한, 전장 엑손 시퀀싱 결과 환자의 가계도(도 1의 나)에서 특이적인 단일염기변이(c.271G>A, V91M)를 확인하였고, 그 변이를 생거 시퀀싱으로 확인하였다(도 1의 다).

상기 결과를 통해서, TREX1의 변이가 HSP 질환과 연관이 있음을 확인하였다. 특히, 단일염기변이(c.271G>A, V91M)가 HSP 질환과 연관이 있음을 확인하였다.

실시예 2: TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)에 의한 신경 세포 분화능 저해

2-1. 세포의 배양

shsy5y 세포는 DMEM-high glucose modified (피루브산 첨가, 엘글루타민 미첨가; Hyclone, USA)에서 배양되었으며, 상기 세포주는 10% 우태아 혈청, 1% 비필수아미노산 (non-essential amino acids), 1% GlutaMAX, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, USA)를 첨가한 기본 배양액에서 배양되었다. 세포주는 37 ℃의 온도와 5%의 이산화탄소 농도에서 배양되었다.

2-2. 세포의 분화

shsy5y 세포의 신경세포로의 분화는 레티노산(RA)과 뇌유래신경영양인자(BDNF)를 통해 수행하였다. DMEM-high glocose modified 배양액에 3% 우태아혈청, 1% 비필수아미노산, 1% GlutaMAX, 그리고 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨부한 후, 10uM의 레티노산을 첨가하였다. 24 시간의 레티노산 처리 후, 배양액의 절반을 레티노산을 재 첨가한 새로운 배양액으로 교체하였다. 72 시간의 레티노산 처리 후, 세포는 기본 배양액에 50ng/ml의 뇌유래신경영양인자를 첨가하고, 우태아혈청을 제거한 배양액에서 배양한다. 신경세포의 분화를 확인한 후 분석에 이용하였다.

2-3, TREX1 발현 저해를 위한 small-interfering RNA 제조

TREX1 유전자의 발현 억제에 의한 세포 내 기능을 조사하기 위하여, TREX1의 염기서열 (서열번호 2, TREX1 (NM_033629.6)) 중에서 20개의 뉴클레오티드로 이루어진 siRNAs (서열번호 3와 4)를 제작하였다.

siCont (서열번호 3): 5'-AUGAACGUGAAUUGCUCAATT-3'

siTREX1 (서열번호 4): 5'-GACCAAGCCAAGACCAUCU-3'

2-4. TREX1 단일염기 변이 플라스미드 제작 및 과발현

TREX1의 전체 cDNA를 GFP 형광이 중합된 pEGFP-N3에 클로닝하여 GFP-중합-TREX1 플라스미드 제작하였다. 환자 유래의 단일염기는 TREX1의 cDNA에 유도되어 GFP-중합 플라스미드에 넣어 제작하였다. 제작된 GFP-중합-TREX1 플라스미드 또는 GFP-중합 TREX1-단일염기 변이 플라스미드(3 ug)는 Lipofectamine 2000(invitrogen, USA)을 이용하여 과발현하였다.

2-5. 면역형광염색법을 이용한 siTREX1에 의한 신경 세포의 분화능 저해 확인

분화 과정이 완료된 shsy5y 세포를 4%의 파라포름알데하이드에서 20분간 고정하였다. 인산완충식염수 (PBS)로 3번 세척 후, 비특이적 항체 결합을 막기 위해 블로킹 용액 (0.5% 우태아혈청이 첨가된 인산완충식염수)에서 실온 1시간 배양하였다. 블로킹 용액에 1차 항체를 희석한 후 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 인산완충식염수로 3번 세척 후, Alexa Fluor-결합 2차 항체에 배양하였다. 세포핵은 4',6-dianidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI; Vector Laboratories, USA)로 1분간 염색하였다. 염색이 완료된 세포는 Nikon Eclipse TE2000 형광현미경으로 촬영하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1 처리 세포(도 2의 가) 또는 V91M 도입 세포(도 2의 나)에서 신경 분화 표지자인 TUBB3, MAP2, NF-L이 감소함을 확인하였다. 하지만 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제(RTi)인 라미부딘 및 스타부딘을 처리하였을 때, siTREX1 또는 V91M 세포에 비해 신경 세포의 신경돌기가 길어진 것을 확인하였다.

2-6. 생쥐 유래 피질 신경세포 획득 및 렌티바이러스 감염하여 신경세포의 분화능 확인

배아 16일째의 태아 생쥐에서 대뇌를 분리해내어 단일 세포로 분리한 후, Matrigel 코팅이 된 플레이트에서 neurobasal media(Gibco, USA)에 B-27(Gibco, USA) 및 1% GlutaMAX(Gibco, USA)를 첨가하여 배양하였다. 24시간 후 야생형-TREX1 또는 환자 유래 단일변이(V91M)-TREX1을 포함하는 렌티바이러스를 이용해 감염시켰다. 야생형 및 환자 유래 단일변이(V91M)-TREX1 렌티바이러스는 pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 벡터에 클로닝하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 생쥐 유래 피질 신경 세포에서 환자 유래 단일변이(V91M)을 포함한 렌티바이러스를 감염하였을 때, 야생형 TREX1 렌티바이러스를 감염하였을 때 보다 신경 세포의 분화가 저해됨을 확인하였고(도 3의 가), 각 실험군에서 신경세포의 축삭길이를 측정하여 그래프로 나타내었다(도 3의 나).

2-7. 총 RNA 분리 및 역전사 반응물 (cDNA) 생성

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy RNA extraction kit (Qiagen, USA)를 사용하여, 분화가 완료된 shsy5y 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 이후, 1ug의 RNA를 주형으로 하여, 상업적으로 판매되는 시스템인 iscript cDNA synthesis kit (Biorad, USA)를 사용하여 역전사 반응을 수행하였다.

2-8. 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (quantitative real-time PCR)

생성된 역전사 반응물 및 아래에 제시된 프라이머(표 1(human), 표 2(mouse))를 이용하여, 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였으며 조성(20ul)은 다음과 같다: 2X premix PCR mixture SYBR (Biorad, USA) 10ul, 10pmol 포워드 및 리버스 프라이머 각 1ul, 주형 cDNA 1ul, 완충액 7ul. 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응의 조건은 95 ℃에서 2분 30초간 초기변성 시행 후, 95 ℃ 20초, 60 ℃ 1분, 72 ℃ 30초간 증폭반응을 45회 반복수행 하였고, 72 ℃에서 5분간 증폭산물을 안정화 시켰다. 생성된 증폭산물에서 발산되는 사이버그린 형광을 측정한 후 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머 서열 (human)

Gene Name	Forward primer	Reverse primer
Human
TREX1	GGCTCCCAGCAGTGTGTAAG (서열번호 5)	GCTCAGACCTGTGATCTCGC (서열번호 6)
TUBB3 (Tuj1)	CTGGCCATCCAGAGCAAGAA(서열번호 7)	CGTACATCTCGCCCTCTTCC(서열번호 8)
MAP2	TAGACCTAAGCCATGTGACA(서열번호 9)	AGAACCAACTTTAGCTTGGG (서열번호 10)
Neurofilament-L	CTGGAAATCGAAGCATGCCG(서열번호 11)	GCGGGTGGACATCAGATAGG (서열번호 12)
BiP/GRP78	CCCGAAAAGCATTTGGGCAG(서열번호 13)	AACCTAGGTAGGTGTGATTTGTGT (서열번호 14)
Calreticulin	GACTTCCTGCCACCCAAGAA(서열번호 15)	CTCAGCGTATGCCTCATCGT (서열번호 16)
IP3R1	AAGCGAGTTCCTGTTCTCCG(서열번호 17)	ACATCTCCTACTCCACCCCC (서열번호 18)
ERO1α	TCTTCGAGCGCCCAGATTTT(서열번호 19)	GAAGCTTTCCCCACAGACGA (서열번호 20)
Bcl-2	TCATGTGTGTGGAGAGCGTC(서열번호 21)	GGGCCAAACTGAGCAGAGTC (서열번호 22)
CHOP	GAATGAACGGCTCAAGCAGG (서열번호 23)	GGCAGACAAGAACGAGGTTG(서열번호 24)
Calnexin	AGCCCTTCCTGTTTGACACC(서열번호 25)	CTGGCTTGACAGCTTCTGGA (서열번호 26)
PERK	AGTGACTGCAATGGACCAGG(서열번호 27)	CTTGGCAAAGGGCTATGGGA (서열번호 28)
XBP1	TCCCCCTTTTTGGCATCCTG(서열번호 29)	GGTGGAAAAGCCTTCAGTCAC (서열번호 30)
ATF6α	CAGCAGGAACTCAGGGAGT (서열번호 31)	TCAGGGATGGTGCTGACAAC(서열번호 32)
CHOP	GAATGAACGGCTCAAGCAGG(서열번호 33)	GGCAGACAAGAACGAGGTTG(서열번호 34)
IRE1α	TGGGTGGCCTTCATCATCAC(서열번호 35)	AACATGCCCCGGTACACAAT (서열번호 36)
CaMKII	CTCAAGGGAGCCATCCTCAC(서열번호 37)	GGGCTTGACTCCATCTGCTT (서열번호 38)
GADD34	GCTGAGTCAGACCCACATCC(서열번호 39)	TCCGGATCATGAGTAGGGGT (서열번호 40)
ATF4	CCGTGAGCGTCCATTTTGTG(서열번호 41)	GTAGGAGGCCCCTAACCCTA (서열번호 42)
BIM	GCTACCAGATCCCCGCTTTT(서열번호 43)	CAATACGCCGCAACTCTTGG (서열번호 44)
TREX1	CTGGATGGTGCCTTCTGTGT(서열번호 45)	AGATCCTTGGTACCCCTGCT (서열번호 46)
GAP43	GTGCCACTAAAGCTTCCACT(서열번호 47)	GGGCACTTTCCTTAGGTTTG (서열번호 48)
GAPDH	GACCACAGTCCATGCCATCA(서열번호 49)	GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG (서열번호 50)

중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머 서열 (mouse)

Gene Name	Forward primer	Reverse primer
Mouse
Trex1	CTTCCTCAGCCACACTGCTG (서열번호 51)	CCTGGAGCAATGCACAGAGA (서열번호 52)
ERO1α	TGGCTATGTCCTCTGTCCCTC(서열번호 53)	TGTAAAGCCTTGAACGGTGC (서열번호 54)
CaMKII	CCCCAAAGTCACAGAGCCAT(서열번호 55)	ACGTGTCGTCTTCCACTGTC (서열번호 56)
IP3R1	TAGGAGCTGTCCCCTTAGGA(서열번호 57)	GCTTCGGAACTCTGCATACG (서열번호 58)
Calnexin	GCTAGGGAGAATGAATTGCCG (서열번호 59)	ATGGAGCAGTCTCTAGGGCA(서열번호 60)
BiP/GRP78	TGTGTGTGAGACCAGAACCG(서열번호 61)	TAGGTGGTCCCCAAGTCGAT (서열번호 62)
PERK	CCGAATCACCTGACGGTTCA(서열번호 63)	GAGGGTTGCTTGTTTGCAGG (서열번호 64)
Chop	GCAGCGACAGAGCCAGAATA (서열번호 65)	TTCCTCCTCTTCCTCCTGGG(서열번호 66)
eIF2α	CACGGTGCTTCCCAGAGAAT(서열번호 67)	GGCAAACTGCTTTTGGGAGG (서열번호 68)
ATF4	CCTATAAAGGCTTGCGGCCA(서열번호 69)	ATCTCGGTCATGTTGTGGGG (서열번호 70)
ATF6α	GGTGGAAGTGGGAAGATCGG (서열번호 71)	GCCACAGGTCCTCTTTAGGC(서열번호 72)
Gapdh	CCCTTAAGAGGGATGCTGCC(서열번호 73)	ACTGTGCCGTTGAATTTGCC (서열번호 74)

2-9. 웨스턴 블럿을 이용한 siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입에 의한 신경 세포의 분화 저해 확인

shsy5y 세포에서 siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입에 의한 신경 세포의 분화 저해 정도를 웨스턴 블럿을 기반을 두어 다음의 방법을 통해 확인하였다. 분화가 완료된 shsy5y 세포를 RIPA 용액 (invitrogen, USA)를 이용해 터트린 후, 동일한 양의 단백질을 정량한다. 단백질을 95 ℃에서 10분간 끓여 3차 구조를 변성 시킨 후, SDS-PAGE를 이용한 웨스턴 블럿을 통해 분리한다. 분리된 단백질을 TREX1, TUBB3, MAP2, NF-L 및 b-actin 항체를 이용하여 단백질을 검출하였다.

상기 2-8 및 2-9를 통한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1 처리 실험군(도 4의 가, 나) 또는 V91M 변이체 도입 실험군(도 4의 다, 라)에서 신경세포 분화 지표자인 TUBB3, MAP2, NF-L이 감소되고, 역사효소 저해제를 처리하였을 때, 분화 지표자의 발현이 회복됨을 역전사 중합효소 연쇄반응 (도 4의 가, 다) 및 웨스턴 블럿 (도 4의 나, 라)을 통해 확인하였다.

실시예 3: TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)에 의한 신경세포 사멸

3-1. 말단 디옥시뉴클레오티드 전달 효소 분석 (TUNEL assay)

터널 에세이는 시판되고 있는 시스템인 DeadEnd^TM Coloimetric TUNEL system kit (Promega, USA)를 이용하여 신경 세포의 사멸을 확인하였다. 염색이 완료된 세포는 Nikon Eclipse TE2000 형광현미경을 통해 촬영되었다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1 또는 V91M 변이체를 분화하는 신경세포에 도입하였을 때, 면역형광염색법을 이용하여, 세포 사멸 표지자인 caspase-3 염색이 증가된 것을 확인할 수 있었으며(도 5의 가), 터널 에세이를 통해서 사멸된 세포의 수가 증가하였음을 확인하였다(도 5의 나). 웨스턴 블럿을 이용하여, shsy5y 세포에서 세포 사멸 표지자인 cytochrome C, cleaved caspase9, cleaved caspase 3 및 cleaved PARP가 증가함을 확인하였다. 또한, 항-세포사멸 표지자인 Bcl-xL 및 Bcl-2가 감소함을 확인하였다(도 5의 다).

3-2. 생쥐 유래 피질 신경 세포에 환자 유래 단일염기 변이(V91M)-TREX1 렌티바이러스를 감염시켰을 때, 신경 세포 세포 사멸 촉진

생쥐 유래 피질 신경 세포에 환자 유래 단일염기 변이(V91M)-TREX1 렌티바이러스를 감염시켰을 때, 신경 세포의 사멸 현상을 확인하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, V91M-TREX1 렌티바이러스를 감염시킨 세포에서, 세포 사멸의 표지자인 PI가 증가됨을 면역형광염색법으로 확인하였고(도 6의 가), PI 양성 세포의 비율을 통계적으로 추출하여 그래프로 나타내었다(도 6의 나). 또한, 웨스턴 블럿을 이용하여, V91M-TREX1 렌티바이러스 감염 세포에서 세포 사멸 표지자인 cleaved caspase3, cytochrome C 그리고 cleaved PARP가 증가함을 확인하였고, 항-세포 사멸 표지자인 Bcl-2의 발현이 감소함을 확인하였다.

실시예 4: TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)는 신경 세포의 골지체 단편화 증가 및 미세소관 에세틸화 감소 초래

4-1. TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)시, 골지체 단편화 증가

shsy5y 세포에 siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입으로 TREX1 단백질 발현을 저해하고, 역전사효소 저해제 (RTi)를 처리한 후 면역형광염색법을 이용해 골지체 표지자인 GM-130으로 골지체를 염색하여 단편화를 확인하였고, TREX1 항체를 통해 siTREX1의 효용성을 확인하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, TREX1의 저해가 되면 골지체의 단편화가 증가되어 반점으로 관찰되었으며(도 7의 가, 나), 역전사효소 저해제를 처리하였을 때, 증가된 골지체의 단편화가 감소되며 골지체 모양이 정상화됨을 확인하였다(도 7의 가).

4-2. TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)시, 미세소관 아세틸화 손상

shsy5y 세포에 siTREX1 처리 또는 V91M 변이체를 도입하여, TREX1 단백질 발현을 저해하고, 역전사효소 저해제(RTi)를 처리한 후, 면역형광염색법 또는 웨스턴 블럿을 이용해 α-tublin 및 아세틸-α-tublin 항체로 미세소관을 염색하여 미세소관 손상 여부를 확인하였다.

그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, siTREX1 처리(도 8의 가, 나) 또는 V91M 변이체 도입(도 8의 다, 라)에 의해 TREX1 단백질 발현이 저해되었을 때, 미세소관의 아세틸화가 크게 감소함을 면역형광염색법(가, 다), 및 웨스턴 블럿(나, 라)를 통해 확인하였다. 또한, 역전사효소 저해제를 처리하였을 때, 미세소관의 아세틸화가 회복됨을 확인하였다(도 8의 가, 나).

4-3. siTREX1을 통해 TREX1 발현 저해시, 미세소관을 통한 골지체 재편성 저해

shsy5y 세포에 siTREX1을 이용해 TREX1 단백질 발현 저해시, 골지체와 미세소관의 상호 위치를 면역형광염색법으로 확인하였다.

그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, TREX1이 저해된 신경세포에서 미세소관 아세틸화가 줄어듦과 동시에, 미세소관이 골지체 표지자인 GM-130과 같은 위치에서 관찰되지 않음을 확인하였다.

실시예 5: TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)에 인한 소포체 스트레스 유도

5-1. TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)에 인한 소포체 스트레스 유도 확인

shsy5y 세포에 siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입으로 TREX1 발현 저해한 후, 소포체 스트레스 유도 여부를 웨스턴 블럿 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용해 확인하였다.

그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 웨스턴 블럿 (도 10의 가, 다) 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (도 10의 나, 라)을 활용하여, siTREX1(도 10의 가, 나) 또는 V91M 변이체 도입(도 10의 다, 라)으로 TREX1 발현이 저해되었을 때, 소포체 스트레스 표지자인 Calnexin, p-PERK, p-eIF2a, ATF4, ATF6a, Truncated-ATF6a, XBP1, 및 chop이 증가되었음을 확인하였다. 반면 GFP-중합-TREX1 플라스미드를 과발현 또는 RTi 처리하였을 때, 증가된 소포체 스트레스 표지자들의 발현이 감소함을 확인하였다.

5-2. 생쥐 유래 피질 신경 세포에서 V91M-TREX1 렌티바이러스를 감염하여, 소포체 스트레스 경로 확인

생쥐 유래 피질 신경 세포에서 환자 유래 단일변이 V91M-TREX1 렌티바이러스를 감염한 후, 소포체 스트레스 표지자들의 발현변화를 웨스턴 블럿 또는 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인하였다.

그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, V91M-TREX1 렌티바이러스가 감염된 세포에서, 소포체 스트레스 반응 단백질들의 발현량이 증가한 것을 웨스턴 블럿(도 11의 가) 그리고 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(도 11의 나)를 통해 확인하였다.

실시예 6: TREX1 발현 저해(siTREX1 처리 또는 V91M 변이체 도입)는 CHOP-ERO1α-IP3R1 경로를 통해 소포체 칼슘 항상성 파괴

6-1. 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 TREX1 발현 저하에 의한 신경 세포에서 소포체 칼슘 항상성 유지 조절자들의 발현 확인

분화가 완료된 신경세포에 siTREX1으로 TREX1을 발현 저해하거나 V91M 변이체를 도입하였을 때, 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 ERO1a, IP3R1, CaMKII, CHOP, Calpine, BIM, GADD34, Nucleobindin1와 같은 칼슘 항상성 유지 조절 유전자들의 발현량을 확인하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1으로 TREX1의 발현량을 저해하였을 때(도 12의 가) 또는 V91M 변이체를 도입하였을 때(도 12의 나) 또는 생쥐 유래 피질 신경 세포에 V91M-TREX1 렌티바이러스를 감염하였을 때(도 12의 다), CHOP의 발현 뿐만 아니라 소포체 칼슘 항상성 경로와 관련된 타겟 유전자들의 발현을 유도한 것을 확인하였고, TREX1의 발현 저해시 소포체의 칼슘 항상성이 훼손됨을 확인하였다.

6-2. 세포 내 칼슘 이온의 검출

shsy5y 세포를 96웰 플레이트에 배양한 후, 칼슘이온 형광 표지자인 5uM Fluo-4-AM (invitrogen, USA)를 HBSS에 넣어 37 ℃에서 45분 배양하였다. 시간별 세포 내 Fluro-3-칼슘 착물 농도는 Spark Multimode Microplate Reader(Tecan, Switzerland)을 이용하여 526nm에서 측정하였다.

6-3. 세포 내 칼슘 이온의 시각화

shsy5y 세포를 커버슬립위에 배양한 후, 5uM Fluo-4-AM을 넣어 37 ℃에서 45분 동안 배양한다. 소포체 내 칼슘 이온 수준을 추적하기 위해, 3uM 형광 소포체 추적자 (Blue-White DPX dye: Life Technologies, USA)와 5uM Fluo-4-AM을 37 ℃에서 45분간 배양하였다. HBSS로 2번 세척 후, 공초점 현미경(LSM 510 Meta and 800: Zeiss, Germanay)으로 40x 또는 100x의 배율로 촬영하였다.

그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1으로 TREX1 발현이 저해되었을 때(도 13의 가, 나) 또는 V91M 변이체를 도입하였을 때(도 13의 다, 라), 세포 내 칼슘 이온의 양이 증가함을 면역형광염색법(도 13의 가, 다)으로 확인 후, Microplate reader(도 13의 나, 라)로 시간대 별로 확인하였다.

6-4. siTREX1을 통해 TREX1 발현 저해하였을 때, CHOP-ERO1α-IP3R 경로가 활성화

분화가 완료된 신경세포에 siTREX1 또는 siERO1a 또는 siTREX1와 siERO1a를 함께 처리하였을 때, 역전사 중합효소 연쇄반응 또는 웨스턴 블럿을 통해 IP3R1, CaMKII, CHOP 그리고 GADD34 와 같은 소포체 스트레스 표지자 및 칼슘 경로 관련 유전자들의 발현을 조사하였고, 세포 내 칼슘 이온의 농도를 측정하였다.

그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1를 이용한 TREX1 발현 저해시, ERO1α-IP3R 경로의 유전자들은 활성화 되지만, siERO1a를 이용해 ERO1a 발현 저해시, TREX1 저해로 인해 나타난 활성화를 상쇄시킴을 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(도 14의 가) 및 웨스턴 블럿(도 14의 나)를 통해 확인하였다. 상기 (도 14의 가), (도 14의 나)에서 확인된 현상을 실시간 세포 내 칼슘 이온 측정을 통해 재확인 하였다(도 14의 다).

실시예 7. Lentivirus-TREX1-WT의 제조

TREX1의 전체 cDNA를 Zsgreen 형광이 중합된 Lentivirus vector (pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1)에 클로닝하여 Lentivirus-Zsgreen1-TREX1-WT 바이러스 벡터를 제작하였다. 제작한 lentivirus는 Helper vector (PAX2 및 Pmd2g)와 배합하여, HEK293FT 세포에 lipofectamine 3000을 이용하여 트랜스펙션하였다. 트랜스팩션 6시간 후, 배지를 교체하고, 24시간 후 배양액을 수거하여 4'C에 냉장보관하였다. 동시에 새 배양액을 첨가하여 24시간 더 배양한 후, 배양액을 수거하였다. Lenti-X concentrator (Takara, Japan)을 사용하여 배양액에서 lentivirus를 농축을 위하여, 먼저 500g로 10분간 원심분리한 후, 배양액의 1/3 부피로 시약을 첨가하여 잘 흔들어 밤새 4'C에서 냉장 배양하였다. 그리고나서, 1500g에서 45분간 원심 분리한 후, 백색의 펠렛을 PBS로 희석하여 즉시 -80'C에 보관하였다. 세포에 처리하기 직전에 냉동고에서 꺼내 세포에 처리하였다.

이의 감염을 확인한 결과를 도 15에 나타내었다. shsy5y 세포에서 Lentivirus-Mock 및 TREX-WT 벡터가 성공적으로 발현함을 확인하였다.

실시예 8. TREX1 저해 (siTREX1)된 신경세포주에서 Lentivirus-TREX1-WT의 과발현에 의한 신경 세포의 분화 회복 확인

상기 실시예 2와 유사하게 shsy5y 세포의 배양, 분화 및 small-interfering RNA를 활용하여 실험을 수행하였다.

8-1. Lentivirus-TREX1-WT 과발현

상기 실시예 7에서 제조한 Lentivirus-Mock 또는 Lentivirus-TREX1-WT을 shsty5y 세포 배양액에 감염하여 과발현을 수행한 후, 분화능을 비교하였다.

8-2. 면역형광염색법을 이용한 siTREX1에 의한 신경 세포의 분화능 저해 및 Lentivirus-TREX1-WT에 의한 분화능 저해 회복 확인

상기 실시예 2-5와 유사하게 siTREX1를 이용하여 신경 세포의 분화능을 저해시키고 난 후, 여기에 Lentivirus-TREX1-WT을 처리하여 분화능 저해에 대한 회복 효과를 확인하였다.

그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1을 처리한 세포에서 신경 분화 표지자인 TUBB3, MAP2, NF-L이 감소함을 확인하였다. 그러나, 여기에 Lentivirus-TREX1-WT을 감염하였을 때 siTREX1 세포에 비해 신경 세포의 신경돌기가 길어진 것을 확인하였고 분화 표지자의 수준도 회복하여, 신경 세포의 분화능 저해에 대한 회복 효과가 나타난 것을 확인하였다.

8-3. 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (quantatative real-time PCR) 및 웨스턴 블랏을 통한 Lentivirus-TREX1-WT 감염에 의한 신경 세포의 분화 저해 회복 확인

상기 실시예 2-6 내지 2-9와 같이, siTREX1의 처리를 통해 신경 세포의 분화를 저해한 후, 이에 Lentivirus-TREX1-WT 감염하여 신경 세포의 분화 저해 회복 효과를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (quantatative real-time PCR) 및 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.

그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17의 (가)는 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내며, 도 17의 (나)는 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸다.

도 17을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1 처리 실험군에서 신경세포 분화 지표자인 TUBB3, MAP2, NF-L이 감소되는 것을 역전사 중합효소 연쇄반응 (가) 및 웨스턴 블럿 (나)에서 동일하게 확인하였다. 반면, Lentivirus-TREX1-WT을 감염하였을 때 분화 지표자의 발현이 회복됨을 역전사 중합효소 연쇄반응 (가) 및 웨스턴 블럿 (나)에서 동일하게 확인하여, 신경 세포의 분화 저해에 대한 회복 효과를 확인하였다.

실시예 9. TREX1 발현 저해(siTREX1 처리)에 의한 신경세포 사멸 증가 및 Lentivirus-TREX1-WT을 감염하였을 때 신경 세포 사멸 감소 확인

실시예 3-2와 유사하게 실험을 수행하였다.

shsy5y 세포에 siTREX1을 처리하여 TREX1의 발현을 저해 시킨 후, Lentivirus-TREX1-WT을 감염하여 TREX1 발현을 회복하였을 때, 세포 사멸 경로의 단백질 발현 변화를 확인하였다.

그 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1를 분화하는 신경세포에 도입하였을 때, shsy5y 세포에서 세포 사멸 표지자인 cytochrome C, cleaved caspase 3 및 cleaved PARP 가 증가함을 확인하였다. 반면에, Lentivirus-TREX1-WT을 감염하여 TREX1 발현을 회복하였을 때, 세포 사멸 표지 단백질들의 발현이 감소함을 확인하였다.

실시예 10: TREX1 발현 저해(siTREX1 처리)에 인한 소포체 스트레스 유도 및 Lentivirus-TREX1-WT을 통한 회복 확인

실시예 5와 유사하게 siTREX1 처리를 통해 소포체 스트레스를 유도한 후, Lentivirus-TREX1-WT 감염으로 인한 소포체 스트레스 회복 효과를 확인하였다.

구체적으로, shsy5y 세포에 siTREX1 처리를 통해 TREX1 발현 저해한 후, Lentivirus-TREX1-WT을 감염하고 소포체 스트레스에 대한 반응을 웨스턴 블럿을 통해 확인하여 그 결과를 도 19에 나타내었다.

도 19를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1으로 TREX1의 발현이 저해되었을 때, 소포체 스트레스 표지자인 ATF6, p-PERK, p-eIF2a, 그리고 BiP의 발현이 증가함을 확인하였다. 반면 Lentivirus-TREX1-WT을 감염하였을 때, 증가된 소포체 스트레스 표지자들의 발현이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 소포체 스트레스로부터 TREX1이 회복 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 11. TREX1 발현 저해(siTREX1 처리) 및 Lentivirus-TREX1-WT을 통한 발현 회복 시 CHOP-ERO1a-IP3R1 경로의 회복 확인 (칼슘 항상성 회복 확인)

실시예 6과 유사하게 분화가 완료된 신경세포에 siTREX1으로 TREX1을 발현 저해하여 소포체 칼슘 항상성을 파괴하고 난 후, Lentivirus-TREX1-WT를 감염시킴으로써 칼슘 경로가 정상화되는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, 분화가 완료된 신경세포에 siTREX1을 처리하고 난 후, Lentivirus-TREX1-WT를 감염하여 칼슘 경로에 대한 반응 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다.

그 결과를 도 20에 나타내었다.

도 20을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, siTREX1를 이용한 TREX1 발현 저해시, ERO1a-IP3R 경로의 유전자들(IP3R1, CaMKII, ERO1a)은 활성화되었다. 그러나, Lentivirus-TREX1-WT으로 TREX1의 발현을 회복하였을 때 TREX1 저해로 인해 나타난 활성화를 상쇄시킴으로써 소포체 칼슘 항상성의 회복 효과를 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Use of TREX1 for treatment of Hereditary Spastic Paraplegia <130> 1.97P <150> KR 10-2021-0051703 <151> 2021-04-21 <160> 74 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TREX1 <400> 1 Met Gly Ser Gln Ala Leu Pro Pro Gly Pro Met Gln Thr Leu Ile Phe 1 5 10 15 Phe Asp Met Glu Ala Thr Gly Leu Pro Phe Ser Gln Pro Lys Val Thr 20 25 30 Glu Leu Cys Leu Leu Ala Val His Arg Cys Ala Leu Glu Ser Pro Pro 35 40 45 Thr Ser Gln Gly Pro Pro Pro Thr Val Pro Pro Pro Pro Arg Val Val 50 55 60 Asp Lys Leu Ser Leu Cys Val Ala Pro Gly Lys Ala Cys Ser Pro Ala 65 70 75 80 Ala Ser Glu Ile Thr Gly Leu Ser Thr Ala Val Leu Ala Ala His Gly 85 90 95 Arg Gln Cys Phe Asp Asp Asn Leu Ala Asn Leu Leu Leu Ala Phe Leu 100 105 110 Arg Arg Gln Pro Gln Pro Trp Cys Leu Val Ala His Asn Gly Asp Arg 115 120 125 Tyr Asp Phe Pro Leu Leu Gln Ala Glu Leu Ala Met Leu Gly Leu Thr 130 135 140 Ser Ala Leu Asp Gly Ala Phe Cys Val Asp Ser Ile Thr Ala Leu Lys 145 150 155 160 Ala Leu Glu Arg Ala Ser Ser Pro Ser Glu His Gly Pro Arg Lys Ser 165 170 175 Tyr Ser Leu Gly Ser Ile Tyr Thr Arg Leu Tyr Gly Gln Ser Pro Pro 180 185 190 Asp Ser His Thr Ala Glu Gly Asp Val Leu Ala Leu Leu Ser Ile Cys 195 200 205 Gln Trp Arg Pro Gln Ala Leu Leu Arg Trp Val Asp Ala His Ala Arg 210 215 220 Pro Phe Gly Thr Ile Arg Pro Met Tyr Gly Val Thr Ala Ser Ala Arg 225 230 235 240 Thr Lys Pro Arg Pro Ser Ala Val Thr Thr Thr Ala His Leu Ala Thr 245 250 255 Thr Arg Asn Thr Ser Pro Ser Leu Gly Glu Ser Arg Gly Thr Lys Asp 260 265 270 Leu Pro Pro Val Lys Asp Pro Gly Ala Leu Ser Arg Glu Gly Leu Leu 275 280 285 Ala Pro Leu Gly Leu Leu Ala Ile Leu Thr Leu Ala Val Ala Thr Leu 290 295 300 Tyr Gly Leu Ser Leu Ala Thr Pro Gly Glu 305 310 <210> 2 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREX1 <400> 2 atgggctcgc aggccctgcc cccggggccc atgcagaccc tcatcttttt cgacatggag 60 gccactggct tgcccttctc ccagcccaag gtcacggagc tgtgcctgct ggctgtccac 120 agatgtgccc tggagagccc ccccacctct caggggccac ctcccacagt tcctccacca 180 ccgcgtgtgg tagacaagct ctccctgtgt gtggctccgg ggaaggcctg cagccctgca 240 gccagcgaga tcacaggtct gagcacagct gtgctggcag cgcatgggcg tcaatgtttt 300 gatgacaacc tggccaacct gctcctagcc ttcctgcggc gccagccaca gccctggtgc 360 ctggtggcac acaatggtga ccgctacgac ttccccctgc tccaagcaga gctggctatg 420 ctgggcctca ccagtgctct ggatggtgcc ttctgtgtgg atagcatcac tgcgctgaag 480 gccctggagc gagcaagcag cccctcagaa cacggcccaa ggaagagcta tagcctaggc 540 agcatctaca ctcgcctgta tgggcagtcc cctccagact cgcacacggc tgagggtgat 600 gtcctggccc tgctcagcat ctgtcagtgg agaccacagg ccctgctgcg gtgggtggat 660 gctcacgcca ggcctttcgg caccatcagg cccatgtatg gggtcacagc ctctgctagg 720 accaagccaa gaccatctgc tgtcacaacc actgcacacc tggccacaac caggaacact 780 agtcccagcc ttggagagag caggggtacc aaggatcttc ctccagtgaa ggaccctgga 840 gccctatcca gggaggggct gctggcccca ctgggtctgc tggccatcct gaccttggca 900 gtagccacac tgtatggact atccctggcc acacctgggg agtag 945 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCont <400> 3 augaacguga auugcucaat t 21 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTREX1 <400> 4 gaccaagcca agaccaucu 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREX1 Forward primer <400> 5 ggctcccagc agtgtgtaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREX1 Reverse primer <400> 6 gctcagacct gtgatctcgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TUBB3 (Tuj1) Forward primer <400> 7 ctggccatcc agagcaagaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TUBB3 (Tuj1) Reverse primer <400> 8 cgtacatctc gccctcttcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP2 Forward primer <400> 9 tagacctaag ccatgtgaca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP2 Reverse primer <400> 10 agaaccaact ttagcttggg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neurofilament-L Forward primer <400> 11 ctggaaatcg aagcatgccg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neurofilament-L Reverse primer <400> 12 gcgggtggac atcagatagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BiP/GRP78 Forward primer <400> 13 cccgaaaagc atttgggcag 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BiP/GRP78 Reverse primer <400> 14 aacctaggta ggtgtgattt gtgt 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calreticulin Forward primer <400> 15 gacttcctgc cacccaagaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calreticulin Reverse primer <400> 16 ctcagcgtat gcctcatcgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IP3R1 Forward primer <400> 17 aagcgagttc ctgttctccg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IP3R1 Reverse primer <400> 18 acatctccta ctccaccccc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERO1a Forward primer <400> 19 tcttcgagcg cccagatttt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERO1a Reverse primer <400> 20 gaagctttcc ccacagacga 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 Forward primer <400> 21 tcatgtgtgt ggagagcgtc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 Reverse primer <400> 22 gggccaaact gagcagagtc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHOP Forward primer <400> 23 gaatgaacgg ctcaagcagg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHOP Reverse primer <400> 24 ggcagacaag aacgaggttg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calnexin Forward primer <400> 25 agcccttcct gtttgacacc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calnexin Reverse primer <400> 26 ctggcttgac agcttctgga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PERK Forward primer <400> 27 agtgactgca atggaccagg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PERK Reverse primer <400> 28 cttggcaaag ggctatggga 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP1 Forward primer <400> 29 tccccctttt tggcatcctg 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XBP1 Reverse primer <400> 30 ggtggaaaag ccttcagtca c 21 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF6a Forward primer <400> 31 cagcaggaac tcagggagt 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF6a Reverse primer <400> 32 tcagggatgg tgctgacaac 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHOP Forward primer <400> 33 gaatgaacgg ctcaagcagg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHOP Reverse primer <400> 34 ggcagacaag aacgaggttg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRE1a Forward primer <400> 35 tgggtggcct tcatcatcac 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRE1a Reverse primer <400> 36 aacatgcccc ggtacacaat 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaMKII Forward primer <400> 37 ctcaagggag ccatcctcac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaMKII Reverse primer <400> 38 gggcttgact ccatctgctt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GADD34 Forward primer <400> 39 gctgagtcag acccacatcc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GADD34 Reverse primer <400> 40 tccggatcat gagtaggggt 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4 Forward primer <400> 41 ccgtgagcgt ccattttgtg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4 Reverse primer <400> 42 gtaggaggcc cctaacccta 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIM Forward primer <400> 43 gctaccagat ccccgctttt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIM Reverse primer <400> 44 caatacgccg caactcttgg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREX1 Forward primer <400> 45 ctggatggtg ccttctgtgt 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TREX1 Reverse primer <400> 46 agatccttgg tacccctgct 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAP43 Forward primer <400> 47 gtgccactaa agcttccact 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAP43 Reverse primer <400> 48 gggcactttc cttaggtttg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward primer <400> 49 gaccacagtc catgccatca 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse primer <400> 50 gtcaaaggtg gaggagtggg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trex1 Forward primer <400> 51 cttcctcagc cacactgctg 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trex1 Reverse primer <400> 52 cctggagcaa tgcacagaga 20 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERO1a Forward primer <400> 53 tggctatgtc ctctgtccct c 21 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERO1a Reverse primer <400> 54 tgtaaagcct tgaacggtgc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaMKII Forward primer <400> 55 ccccaaagtc acagagccat 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaMKII Reverse primer <400> 56 acgtgtcgtc ttccactgtc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IP3R1 Forward primer <400> 57 taggagctgt ccccttagga 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IP3R1 Reverse primer <400> 58 gcttcggaac tctgcatacg 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calnexin Forward primer <400> 59 gctagggaga atgaattgcc g 21 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Calnexin Reverse primer <400> 60 atggagcagt ctctagggca 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BiP/GRP78 Forward primer <400> 61 tgtgtgtgag accagaaccg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BiP/GRP78 Reverse primer <400> 62 taggtggtcc ccaagtcgat 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PERK Forward primer <400> 63 ccgaatcacc tgacggttca 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PERK Reverse primer <400> 64 gagggttgct tgtttgcagg 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chop Forward primer <400> 65 gcagcgacag agccagaata 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chop Reverse primer <400> 66 ttcctcctct tcctcctggg 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eIF2a Forward primer <400> 67 cacggtgctt cccagagaat 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eIF2a Reverse primer <400> 68 ggcaaactgc ttttgggagg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4 Forward primer <400> 69 cctataaagg cttgcggcca 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4 Reverse primer <400> 70 atctcggtca tgttgtgggg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF6a Forward primer <400> 71 ggtggaagtg ggaagatcgg 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF6a Reverse primer <400> 72 gccacaggtc ctctttaggc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh Forward primer <400> 73 cccttaagag ggatgctgcc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh Reverse primer <400> 74 actgtgccgt tgaatttgcc 20

Claims

Three prime repair exonuclease 1(TREX1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TREX1의 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전성 강직성 하반신마비의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TREX1의 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TREX1의 단백질을 코딩하는 유전자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 렌티 바이러스 또는 AAV(Adeno-associated virus)인 것을 특징으로 하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 렌티 바이러스인 것을 특징으로 하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 뉴클레오티드의 변이를 검출하는 단계; 및 (b) 상기 검출이 이루어지는 경우 유전성 강직성 하반신마비의 발병 위험이 높은 위험군으로 결정하는 단계;를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 271번 위치의 구아닌이 알라닌으로 치환된 뉴클레오티드 서열을 검출하는 단계; 및
(b) 상기 검출이 이루어지는 경우 유전성 강직성 하반신마비의 발병 위험이 높은 위험군으로 결정하는 단계;를 포함하는,
유전성 강직성 하반신마비를 진단하거나 발병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
(a) Three prime repair exonuclease 1(TREX1) 단백질의 발현이 저해된 세포에 피검 물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 처리된 세포에서 TREX1 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는,
유전성 강직성 하반신마비 예방 또는 치료용 후보물질 스크리닝 방법.
(a) Three prime repair exonuclease 1(TREX1)의 활성을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정한 TREX1의 활성 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는,
유전성 강직성 하반신마비 예방 또는 치료용 후보물질 스크리닝 방법.