KR20220144005A - 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법 및 이를 함유하는 면역증강 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법 및 상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 함유하는 면역증강 조성물에 관한 것으로, 상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말은 종래 알로에 추출액에 비하여 현저하게 향상된 면역세포 증식 및 촉진활성을 나타내므로, 더 향상된 면역증강 효과를 나타내는 건강기능식품의 개발에 활용할 수 있다.

Description

틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법 및 이를 함유하는 면역증강 조성물{Method for producing fermented tindall aloe lactic acid bacteria powder and immunity enhancing composition containing the same}
본 발명은 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법 및 상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 함유하는 면역증강 조성물에 관한 것이다.
2020년 이후 전 세계적으로 코로나-19(Covid-19, coronavirus disease)와 같은 신종 전염병들이 등장하면서 인체의 방어능력인 면역력의 중요성이 더욱 대두되고 있다. 인체의 체내 항상성이 깨지거나 병원균의 침입과 같이 위협이 되는 것들에 대한 생체방어력인 면역력은 대식세포나 자연살해(Natural killer, NK) 세포 등이 관련된 비특이적 면역과 T 세포나 B 세포가 관여하는 특이적 면역으로 분류할 수 있다. 병원균이 인체에 침입했을 때 neutrophile(호중구), monocyte(단핵구), macrophage(대식세포)와 같은 탐식세포(phagocytes)들은 가장 먼저 인체를 병원균들로부터 방어하는 선천 면역반응의 주요 세포군이다. 특히, 대식세포는 상피세포 장벽 이후의 생체방어에 있어 최초 대응세포로 항원제시세포(antigen presenting cell)로써의 기능도 수행하며, 적응면역과 관련하여 T 세포에 작용에도 영향을 주고, 병원균에 감염된 세포나 암세포 등도 제거하고, 면역반응에 기여하는 NO(nitric oxide) 와 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 사이토카인 등도 분비한다.
인체는 항상성을 유지하려고 하는 상기와 같은 특징을 가지고 있으며 이는 면역 시스템에서도 작용을 하게 된다. 특히, 비장에서는 면역조절에 관여하며 IFN(interferon)-γ, TNF(tumor necrosis factor)-α과 IL(interleukin)-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 및 PGE2 등의 사이토카인을 분비한다. 이런 사이토카인은 면역반응의 실행단계에서 작용을 나타내며, 면역 세포와 염증계간의 신호 전달 과정에서도 중요한 역할을 한다.
최근에는 인체의 적응면역이 작동하기 전에 질병들로부터 대응할 수 있는 선천성 면역기능을 담당하는 대식세포의 활성인자를 찾기 위한 천연물질들의 연구가 활발히 진행되고 있다.
알로에는 백합과에 속하는 다년초 식물로 다즙성의 다육질 잎을 갖는 CAM(Crassulacean Acid Metabolism) 식물로 정의되며, 전 세계적으로 약 600여종이 존재하는데 그 중 식품으로 사용할 수 있는 것은 알로에 베라(Aloe vera Linne), 알로에 아보레센스(Aloe arborsecens), 알로에 사포나리아(Aloe saponaria)가 있다. 상기 알로에 베라는 주스나 겔이 대표적인 건강기능성 식품의 하나이며, 제약이나 화장품 원료로서도 가장 널리 사용되어 온 천연 소재의 하나이다.
알로에의 주요성분으로는 알로인(aloin), 알로에-에모딘(aloe-emodin), 알로에닌(aloenin), 알로에신(aloesin) 등 안트라퀴논(anthraquinone)류가 많이 보고되어 왔으며, 고분자 다당체, 당단백질, 아미노산 및 미네랄 등이 밝혀져 있다. 알로에 액즙에 함유되어 있는 총 다당체의 양은 건조 중량을 기준으로 약 10% 내외이다. 이들 다당체의 분자량 크기는 매우 다양하며, 평균 분자량은 2백만 dalton 이상인 것으로 알려져 있다. 이 다당체들은 다양한 생리활성효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 알로에 베라의 경우는 인간과 동물의 장건강 및 면역활성에 대한 항염증 및 항종양효과가 의학적으로 입증되어 식품의약품안전처가 공식적으로 광고문구로 허용한 면역 소재로 고시되어 사용되고 있다.
알로에를 이용한 건강식품과 관련하여, 대한민국 공개특허 제1998-0038705호 및 제2003-0046798호에 알로에 아보레센스 분말을 이용한 제품에 관하여 개시하고 있으나, 알로에 제품을 섭취하는 데에는 알로에 특유의 쓴맛과 특유의 취로 인해 기호도가 떨어지는 문제점이 있다. 또한 캡슐, 정제로 섭취할 경우 반드시 물과 함께 섭취해야 하는 단점이 있으며 변비증상을 개선하기 위하여 일반적인 자극성 하제나 마그네슘 등의 다른 이온성 삼투압성 하제를 변비약으로 장기 복용하면 생기는 내성 등으로 인하여 부작용이 발생하기도 한다.
상기와 같은 문제점들로 인하여 우수한 기호도를 가지고, 섭취가 간편하며 부작용이 없으면서 누구나 섭취할 수 있는 유산균 발효 제품의 개발이 시급한 실정이다.
유산균은 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 젖산(lactic acid)을 생성하며, 소비되는 당의 50% 이상을 대사산물로 생성하지 않고 부패를 방지하는 유익균이다. 유산균은 그람양성균으로 통성혐기성 또는 혐기성 미생물이며 운동성은 없고 대부분이 카탈라아제 음성이며 생육에는 각종 비타민, 아미노산, 펩티드 등을 요구한다. 일반적으로 유산균의 섭취는 장내 미생물들이 음식물의 소화, 흡수, 분해와 배설 등을 돕는 유익균의 증가를 유도하여 소화작용을 도와 소화기계 질환에 개선 효과를 나타낸다. 또한, 유산균 발효를 통한 유용 물질의 합성에 의한 영양 및 건강 증진 효과가 있으며, 정장 작용, 면역증강 작용, 간경화 개선, 항암 작용, 피부미용 효과 등 영양학적인 효과 등 다양한 효능이 보고되어 있다. 따라서 최근 천연 식품 소재를 발효시킴으로써 기능성 강화 특성을 향상시킬 뿐 아니라 생체이용률이 높은 유용성분으로 전환하는 기술이 지속적으로 개발되고 있다. 그러나 현재까지 알로에에 유산균을 접종 후 발효시켜 면역 활성을 증진시킨 기술에 관하여는 공지된 바 없다.
대한민국공개특허 제1998-0038705호 대한민국공개특허 제2003-0046798호
본 발명은 알로에에 발효 특성이 있는 유산균을 접종하여 면역활성이 현저히 증진된 틴달화 알로에 유산균 발효분말 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여,
본 발명은 일실시예에서, (a) 알로에베라에서 취득한 알로에 다당체 추출액에 MRS 배지 성분을 첨가하고 멸균하여 알로에 다당체 추출액 발효배지를 제조하는 단계; (b) 유산균 전배양을 위한 MRS 배지를 제조하여 유산균 전배양액을 제조하는 단계; (c) 상기 알로에 다당체 추출액 발효배지에 상기 유산균 전배양액을 접종하고 발효시켜 알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액을 제조하는 단계; (d) 상기 유산균 발효액을 틴달화(tyndallization)하는 단계; (e) 상기 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성하는 단계; 및, (f) 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 제조하는 단계;를 포함하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법을 제공한다.
상기 (a)단계에서 알로에 다당체 추출액를 취득하는 것은, 알로에베라를 수확 및 전처리하는 단계; 및 상기 전처리 알로에베라에서 점액질의 알로에 다당체 추출액을 취득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (a)단계에서 알로에 다당체 추출액에 MRS 배지 성분을 첨가하고 멸균하기 전 pH를 pH6으로 보정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (b)단계는 유산균 전배양을 위한 MRS 배지를 멸균하고 유산균을 접종 및 배양하여 유산균 전배양액을 제조하는 것을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 락토코커스(Lactococcus sp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium sp), 스트렙토코커스(Streptococcus sp.), 와이셀라(Weisella sp.), 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 및 루코노스톡(Leuconostoc sp.)속으로 구성된 군에서 선택된 유산균을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 스트렙코커스 뮤탄스(Streptococus mutans), 와이셀라 시바리아(Weisella cibaria)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 것일 수 있다.
상기 (c)단계에서, 상기 유산균 전배양액은 1 내지 5 중량%를 접종하는 것일 수 있다.
상기 (d)단계에서 유산균 발효액을 틴달화하는 단계는, 상기 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60 분 동안 가열; 및 40℃ 이하로 급속 냉각하여 상기 유산균 발효액 중 살아있는 유산균을 사멸시키는 것을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 일실시예에서, 상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법에 따라 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 제공한다.
더불어, 본 발명은 일실시예에서, 상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강 조성물을 제공한다.
상기 면역증강 조성물 100 중량부에 대하여 상기 탄달화 알로에 유산균 발효분말을 0.01 내지 30 중량부 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말은 종래 알로에 추출액에 비하여 현저하게 향상된 면역세포 증식 및 촉진활성을 나타내므로, 더 향상된 면역증강 효과를 나타내는 건강기능식품의 개발에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조과정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 처리농도에 따른 72 시간 후 면역세포의 증식수준의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 틴달화 알로에 유산균발효 분말의 처리농도에 따른 72 시간 후 마우스의 비장세포의 증식수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말, Con A 또는 LPS의 다양한 농도 조합에 따른 24 시간 후 비장세포에서 분비되는 IL-2 또는 IL-4 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 처리수준 및 처리시간의 변화에 따른 비장세포의 증식수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 구체적으로 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명은 면역증강 활성을 나타내는 면역증강 조성물을 천연물로부터 제조하기 위한 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 알로에를 대상으로 유산균을 발효하여 수득된 유산균 발효액이 기존의 알로에 추출액보다 우수한 면역증강 활성을 나타내며, 알로에를 유산균으로 배양한 후에 유산균에 의해 생성된 알로에 대사산물뿐만 아니라 유산균 자체를 함께 파쇄하는 틴달화 공정을 통해 더욱 효과적인 면역증강 활성을 보유하여 기존기술에서는 기대할 수 없었던 강력한 면역효과를 나타낸다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 알로에베라에서 취득한 알로에 다당체 추출액에 MRS 배지 성분을 첨가하고 멸균하여 알로에 다당체 추출액 발효배지를 제조하는 단계; (b) 유산균 전배양을 위한 MRS 배지를 제조하여 유산균 전배양액을 제조하는 단계; (c) 상기 알로에 다당체 추출액 발효배지에 상기 유산균 전배양액을 접종하고 발효시켜 알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액을 제조하는 단계; (d) 상기 유산균 발효액을 틴달화(tyndallization)하는 단계; (e) 상기 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성하는 단계; 및, (f) 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 제조하는 단계;를 포함하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 틴달화 알로에 유산균 발효액은 유산균의 발효 및 대사과정에서 알로에의 성분들이 저분자 또는 고분자 물질로 분해되어 소화 흡수율을 높이고, 새로운 풍미 생성으로 기호성이 증대되며, 면역활성을 갖는 성분이 함유된 것을 의미하고, 유산균 파쇄액은 상기 틴달화한 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 수득되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법을 도 1을 참조하여 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법은 (a) 알로에베라에서 취득한 알로에 다당체 추출액에 MRS 배지 성분을 첨가하고 멸균하여 알로에 다당체 추출액 발효배지를 제조하는 단계; (b) 유산균 전배양을 위한 MRS 배지를 제조하여 유산균 전배양액을 제조하는 단계; (c) 상기 알로에 다당체 추출액 발효배지에 상기 유산균 전배양액을 접종하고 발효시켜 알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액을 제조하는 단계; (d) 상기 유산균 발효액을 틴달화(tyndallization)하는 단계; (e) 상기 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성하는 단계; 및, (f) 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
우선, 상기 (a)단계에서 알로에 다당체 추출액를 취득하는 것은, 알로에베라를 수확 및 전처리하는 단계; 및 상기 전처리 알로에베라에서 점액질의 알로에 다당체 추출액을 취득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 (a)단계에서 알로에 다당체 추출액에 MRS 배지 성분을 첨가하고 멸균하기 전 알로에 다당체 추출액의 pH를 pH6으로 보정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 pH6으로 보정한 알로에 다당체 추출액에 영양원으로 MRS 배지 성분을 첨가하고 pH를 pH6으로 보정한 후, 100 내지 130℃에서 10 내지 20분 동안 멸균하여 알로에 다당체 추출액 발효배지를 제조한다.
상기 (a)단계와 별도로 (b)단계에서는 유산균 전배양액을 제조한다.
상기 (b)단계는 유산균 전배양을 위한 MRS 배지를 멸균하고 유산균을 접종 및 배양하여 유산균 전배양액을 제조하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 MRS 배지를 멸균하는 것은 100 내지 130℃에서 10 내지 20분 동안 수행하는 것일 수 있고, 유산균 균주를 접종하여 37℃에서 바람직하게는 24 내지 32 시간, 가장 바람직하게는 28 시간 동안 진탕 배양하여 유산균 전배양액을 제조할 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 락토코커스(Lactococcus sp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium sp), 스트렙토코커스(Streptococcus sp.), 와이셀라(Weisella sp.), 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 및 루코노스톡(Leuconostoc sp.)속으로 구성된 군에서 선택된 유산균을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 스트렙코커스 뮤탄스(Streptococus mutans), 와이셀라 시바리아(Weisella cibaria)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 것일 수 있다.
상기 (c)단계에서는, 상기 (a)단계에서 제조된 알로에 다당체 추출액 발효배지에 상기 (b)단계에서 제조된 유산균 전배양액을 접종하고 37℃에서 68 내지 76 시간 동안 발효시켜 알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액을 제조한다.
상기 (c)단계에서, 상기 유산균 전배양액은 1 내지 5 중량%를 접종하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 유산균 전배양액은 1 내지 4 중량%, 1 내지 3 중량%, 1 내지 2 중량% 또는 2 내지 5 중량%를 접종하는 것일 수 있다.
상기 유산균 발효액을 제조한 후, 상기 (d)단계에서 유산균 발효액을 틴달화한다.
유산균의 틴달화(tyndallization) 공정은 널리 공지되어 있다. 틴달화는 80 내지 100℃의 온도에서 30 분간의 열처리가 배치(batch) 방식으로 적용되는 간헐 멸균법(fractional sterilization method)이다. 1차 열처리는 유산균 발효액 중 영양형(vegetative form)을 사멸시키며, 이후 24 시간의 인큐베이션 기간을 두어 유산균의 불활성화를 촉진한다. 이렇게 처리된 유산균 대사물질을 다시 30 분간 80 내지 100℃의 온도에 방치 후 유산균 세포를 완벽하게 사멸시킨다. 틴달화 공정은 2회 이상 반복하며 틴달화된 유산균은 복제능과 효소적 능력이 불활성화 된다. 그러나, 틴달화 세포는 세포 구조와 세포벽이 변형되지 않은 상태로 유지되어 활성 측면에서 생리학적으로 무손상 세포로서 정의될 수 있다. 그래서 틴달화 과정을 거치지 않은 세포들 보다 월등히 면역학적으로 활성을 나타낸다고 보고된 바 있다. 이는 본 발명의 유산균 발효액을 틴달화하여 수득되는 틴달화 무손상 세포가 장-관련 림프 조직(Gut-associated lymphoid tissue, GALT)에 대해 특이적인 면역자극성을 유지한다는 것을 내포한다. 즉, 소화관(특히, 장) 수준에서 존재하는 면역계 부위의 1차 반응 및 2차 반응에서 병원체 공격에 대한 점막 방어를 담당하는 점막-관련 림프 조직의 강력한 면역 시스템을 갖게 된다.
상기 (d)단계에서 틴달화는, 상기 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60 분 동안 가열; 및 40℃ 이하로 급속 냉각하여 상기 유산균 발효액 중 살아있는 유산균을 사멸시키는 것을 포함하는 것일 수 있다.
상기 (e)단계에서는 상기 (c)단계에서 제조한 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성한다. 상기 파쇄는 상기 유산균 발효액을 원심분리하여 발효액과 균체로 분리한 다음, 분리된 균체를 파쇄하는 것일 수 있으며, 초음파분쇄기를 이용하는 것일 수 있다.
상기 유산균 발효액 중에 존재하는 유산균 세포를 파쇄하게 되면 실제로 유산균의 세포벽 구성 성분과 세포내에 중요한 면역물질들이 모두 빠져나와 발효 시 생성된 대사성분들과 함께 잠재적인 병원성 미생물들에 저항할 수 있는 획득면역(acquired immunity)의 효율성을 더욱 증대시킬 뿐만 아니라 보다 강력한 면역 시스템을 가질 수 있다.
마지막으로, 상기 (f)단계에서는 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 제조한다.
상기 건조는 동결건조 또는 분무건조하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법에 따라 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 제공한다.
더불어, 본 발명은 상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강 조성물을 제공한다.
상기 면역증강 조성물 100 중량부에 대하여 상기 탄달화 알로에 유산균 발효분말을 0.01 내지 30 중량부, 0.01 내지 20 중량부, 0.01 내지 10 중량부, 0.01 내지 5 중량부, 1 내지 30 중량부, 5 내지 30 중량부, 10 내지 30 중량부 또는 20 내지 30 중량부 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말은 종래 알로에 추출액에 비하여 현저하게 향상된 면역세포 증식 및 촉진활성을 나타내므로, 더 향상된 면역증강 효과를 나타내는 건강기능식품의 개발에 활용할 수 있다.
상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강 조성물은 면역, 피부건강, 장건강을 위한 식품 또는 건강기능식품을 포함할 수 있다.
상기 면역증강 조성물은 다양한 경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 예를 들면 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 면역증강 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중, 질환의 중증도에 따라 조절할 수 있고, 예를 들어, 환자의 무게 1 kg 당 300 mg 이하, 바람직하게는 100 내지 200 mg을 1일 1 내지 4회 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강 조성물은 활성용 건강기능식품을 제조할 수 있다.
상기 면역증강 조성물을 포함하는 건강기능식품은 음식물 섭취만으로는 부족할 수 있는 영양소를 보충하거나 인체에 유용한 기능성 원료를 보충할 목적으로 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 및 바로 이루어진 군에서 선택되어 1회 섭취가 용이하게 제조 및 가동된 것이다.
또한, 상기 건강기능식품은 제형에 따라 포도당, 구연산, 액상 올리고당, 옥수수 시럽(corn syrup), 대두 레시틴, 버터, 식물성 경화류, 탈지우유, 설탕, 마가린, 식염, 전분, 밀가루, 물엿, 맥아당, 중조 및 당 에스테르 등의 통상적으로 사용되는 성분들을 추가 포함할 수 있다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 등을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1: 알로에 다당체 추출액 취득
3 내지 5년 생육한 알로에 생잎을 (주)김정문알로에 제주 농공장으로부터 채취하여 KGMP 시설에서 정제수로 3회 세척 후 제피하여 알로에를 수득하였다. 수득한 알로에는 마쇄단계를 거쳐 U-tech 특허 공법을 적용하여 점질상의 다당체 추출액을 취득하였다(품목신고 및 제조번호: 1992063113512, 기타가공품).
본 제조예에서 알로에의 약 98% 이상은 수분이며 고형부분의 대부분이 섬유질이나 다당류 등으로 구성되어 있어 보관상 알로에를 분말화하여 사용하는 것이 바람직하나, 유산균 발효공정을 위해서는 100%의 알로에를 액상화하여 점질상의 다당체 추출액을 사용하는 것이 좋다. 액상화하는 방법으로는 알로에 잎의 껍질 부분을 제거한 후 얻은 생겔을 U-tech 특허 공법으로 추출한 후, 활성탄 컬럼을 이용하여 안트라퀴논계 화합물 및 기타 색소들을 제거하여 알로에 다당체 추출액을 수득한다.
알로에 함유 건강기능식품에서 알로에 일일섭취량은 총 다당체 함량으로 100 내지 420 mg를 함유하고 있어야 한다. 따라서 제품에 배합 시 처방량의 한계가 생기므로 수분과 섬유질을 제거한 알로에 다당체 추출액을 사용하면 기호도가 상승하고 배합량도 증가시킬 수 있는 장점이 있다.
추후 실시예에서 면역증강 조성물의 제조 시, 알로에 중 다당체(총 다당체 함량으로서 100 내지 200 mg/20 내지 30 g)를 함유하기 위하여 10 중량% 이상의 함유량을 가진 알로에 다당체 추출액을 사용하는 것이 바람직하다.
제조예 2: 유산균 전배양액 제조
유산균 전배양액을 제조하기 위하여, 유산균 전배양 배지는 MRS 배지(1.00% Pancreatic digest of gelatin, 0.80% Beef extract, 2.00% Dextrose, 0.20% Dipotassium phosphate, 0.10% Polysorbate 80, 0.50% Sodium acetate, 0.20% Ammonium citrate, 0.02% Magnesium sulfate, 0.01% Manganese sulfate, 95.18% Water)를 제조하여 121℃에서 15 분 동안 멸균 후 냉각시키고, (주)비피도의 자사균주인 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 또는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum BGN4; 균주 기탁번호는 KCCM12754P) 중에서 선택된 1종의 유산균주를 상기 배지에 접종하여 37℃, 90 rpm에서 28 시간 동안 진탕배양하여 1×1010 내지 1×1012 UFC/㎖ 이상의 유산균 수를 확보한 발효 유산균 전배양액을 수득하였다.
제조예 3: 알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액 제조
알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액은 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 알로에 다당체 추출액의 pH를 6.0으로 보정 후 농도를 10 내지 20° Brix로 조정하였다. 상기 제조예 1에서 얻은 95.18%의 알로에 다당체 추출액에 MRS 배지성분(1.00% Pancreatic digest of gelatin, 0.80% Beef extract, 2.00% Dextrose, 0.20% Dipotassium phosphate, 0.10% Polysorbate 80, 0.50% Sodium acetate, 0.20% Ammonium citrate, 0.02% Magnesium sulfate, 0.01% Manganese sulfate)을 첨가하고 121℃에서 15 분 동안 고압멸균 하였다. 이렇게 제조된 알로에 다당체 추출액 발효배지를 냉각하고, 상기 제조예 2에서 얻은 발효 유산균 전배양액을 1 내지 5% 접종하고 37℃, 90 rpm에서 68 내지 76 시간 동안 진탕배양하여 알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액을 수득하였다.
제조예 4: 유산균 발효액의 틴달화 및 유산균체 파쇄 후 발효분말의 제조
상기 수득된 유산균 발효액의 틴달화는 유산균 발효액 중 발효 후 살아있는 유산균을 사균화하는 방법으로서, 기존에 알려진 틴달화 방법 중 어느 방법이든 무방하게 사용할 수 있으나, 본 제조예에서는 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60 분간 가열하고, 20 내지 40℃ 또는 20℃ 이하로 급속 냉각하여 사멸시키는 방법인 간헐멸균법으로 틴달화하는 방법을 사용하였다.
또한, 상기 제조예 3으로부터 얻은 유산균 발효액 중의 유산균 파쇄는 유산균의 총 균수가 5 내지 8×109 CFU/㎖ 이상이 되었을 때 발효액을 8,000 rpm으로 30 분간 연속식 원심분리기(Continuous Centrifuge, J-075AT, MDM Co., Ltd, Korea)에 연결하여 원심분리 후 발효액과 균체를 각각 분리한 다음, 분리된 균체를 5 내지 10 배수의 멸균수로 희석하여 균체를 40% amplitude, pulse on 20sec, off 10sec, 15℃, 25 분(Vibracell, VCX2500, SONICS, USA)의 조건으로 파쇄하였다. 여기서 얻어진 파쇄물은 상기와 같은 방법으로 다시 한 번 원심분리하여 세포 침전물(cell debris)은 제거하고 상등액을 최종적인 유산균 파쇄물로 획득하여 상기 제조예 3의 유산균 발효액과 합쳐서 알로에 유산균 발효분말을 제조하는데 사용하였다.
이때, 세포 침전물을 이루는 성분은 소수성의 세포벽 성분들이 대부분이고, 상등액을 이루는 성분은 유산균 세포를 구성하는 성분으로, 뮤레인(murein)이라 불리는 펩티도글리칸(peptidoglycan), 세포막 성분인 다당류(polysaccharide), 세포내 단백질(intercellular protein), 여러 종류의 세포내 효소(intercellular enzymes) 등으로 면역증강 효과와 관련한 중요한 물질들이었다.
또한, 상기 틴달화 알로에 유산균 발효액과 유산균 파쇄 혼합액 중량의 0.01~0.1%로 감압 농축하여 동결건조(freeze drying)하거나 말토덱스트린(maltodextrin) 등과 같은 포접제를 사용하여 분무건조(spray drying)하였고 상기 건조된 분말을 최종 틴달화 알로에 유산균 발효분말 시료로 사용하였다.
제조예 5: 면역활성 증진 기능성 조성물
하기에 본 발명의 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 함유하는 면역증강 조성물의 제조예를 제시하였으나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제조예 5-1: 산제의 제조
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말 500 mg, 유당 100 mg, 탈크 10 mg, 상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제조예 5-2: 정제의 제조
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말 300 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제조예 5-3: 캅셀제의 제조
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말 200 mg, 결정성 셀룰로오스 3 mg, 락토오스 14.8 mg, 마그네슘 스테아레이트 0.2 mg, 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제조예 5-4: 액제의 제조
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말 4 g, 이성화당 10 g, 만니톨 5 g, 정제수 적량, 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적정량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하고 정제수를 가하여, 전체를 정제수를 가하여 전체 100 g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
제조예 5-5: 과립제의 제조
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말 1,000 mg, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 mg, 비타민 E 1.0 mg, 비타민 B1 0.13 mg, 비타민 B2 0.15 mg, 비타민 B6 0.5 mg, 비타민 B12 0.2 mg, 비타민 C 10 mg, 비오틴 10 mg, 니코틴산아미드 1.7 mg, 엽산 50 mg), 판토텐산 칼슘 0.5 mg, 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 mg, 산화아연 0.82 mg, 탄산마그네슘 25.3 mg, 제1인산칼륨 15 mg, 제2인산칼슘 55 mg, 구연산칼륨 90 mg, 탄산칼슘 100 mg, 염화마그네슘 24.8 mg), 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 과립을 제조하였고, 통상의 방법에 따라 상기 과립제를 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제조예 5-6: 기능성 음료의 제조
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말 1,000 mg, 구연산 1,000 mg, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g, 정제수를 가하여 전체 900 mL, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균하여 냉장 보관 후 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용하였다. 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
실험예 1: 마우스 비장세포 증식 활성평가
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 비장세포 증식 촉진활성 검증을 위해서 Balb/c 특정 병원체 부재 마우스(Samtako, Korea)로 부터 비장을 적출하고, 적출된 비장에 RPMI 1640 배지(Biolegend, USA)를 가한 다음, stainless mesh(0.038 aperture, Sigma-aldrich, Korea)를 사용하여 비장을 분쇄하여 비장세포 분쇄물을 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 수득한 침전물에 RBC 용혈완충액(Red Blood Cell, Biolegend, USA)을 가하여 침전물에 포함된 적혈구를 용혈시킨 다음 이를 원심분리하여 적혈구 용혈층이 제거된 비장세포를 수득 후 비장세포를 세척하고 10% FBS(Fetal Bovine Serum, ThermoFisher, USA)를 포함하는 RPMI 1640 배지에 현탁시킨 후 배양하였다.
상기 배양된 비장세포에 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 서로 다른 농도(0, 25, 50 및 100 ㎍/㎖)로 처리하고 72 시간 동안 배양한 다음 세포계수기(hemocytometer) 및 트립신 추출법(trypan blue exclusion method)을 이용하여 배양된 비장세포의 수를 계수하고 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 처리농도에 따른 마우스의 비장세포의 증식수준의 변화를 나타내는 그래프로서 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 처리농도가 증가할수록 비장세포의 수가 증가함을 확인하였다.
실험예 2: MTT 분석법을 이용한 세포증식 평가
상기 실험예 1에서 배양된 비장세포를 RPMI 1640 배지에 현탁시키고, 상기 현탁액을 96웰 플레이트에 웰당 1×106 세포수가 되도록 접종한 다음 틴달화 알로에 유산균 발효분말, Con A(Concanavalin A) 또는 LPS(Lipopolysaccharide)를 다양한 농도(0, 15, 25, 50 및 100 ㎍/㎖)로 처리하고, 5% CO2 및 37℃의 조건에서 72 시간 동안 배양하여 각각의 배양물을 수득하였다. 상기 수득한 각 배양물에 MTT 용액(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 5 mg/㎖) 20 ㎕를 가하고 4 시간 동안 반응시킨 다음, 반응물을 원심분리하여 침전물을 수득하고, 상기 수득한 침전물에 용출액 100 ㎕를 가하여 침전물에 포함된 세포에서 생성된 포르마잔 결정을 용해시킨 다음, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성대조군으로서 Con A 또는 LPS를 처리한 것을 사용하였다. Con A는 림프구 중에서도 T 림프구의 증식과 활성증가를 초래하는 물질로 알려져 있다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 처리농도에 따른, 면역세포의 증식수준의 변화를 시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타내는 그래프로서 틴달화 알로에 유산균 발효분말은 농도 의존적으로 면역세포의 증식수준을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 면역관련 사이토카인의 분비량 평가
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말, Con A 또는 LPS를 다양한 농도(0, 15, 25, 50 및 100 ㎍/㎖)의 조합으로 처리하는 것을 제외하고 상기 실험예 2와 동일한 방법을 수행하여 각각의 배양물을 수득하였다. 배양물의 배양 상등액을 면역관련 사이토카인(IL-2 또는 IL-4)의 분비량을 측정하기 위한 ELISA 키트에 적용하여 배양된 각 비장세포에서 분비된 면역관련 사이토카인(IL-2 또는 IL-4)의 분비량 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 틴달화 알로에 유산균 발효분말, Con A 또는 LPS의 다양한 농도의 조합에 따른 비장세포에서 분비되는 IL-2 또는 IL-4 수준의 변화를 나타내는 그래프로서 Con A 또는 LPS의 처리에 의하여 영향을 받는 경향을 나타내었으나, 대체로 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 처리양이 증가할수록 비장세포에서 분비되는 면역관련 사이토카인(IL-2 또는 IL-4)의 수준이 증가함을 알 수 있었다.
실험예 4: 면역증강 활성평가
상기 제조예 1 내지 4의 방법으로 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 다
다양한 농도(0, 25, 50 및 100 ㎍/㎖)로 처리하여 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 세포 증식수준을 측정하였다. 이때, 대조군으로는 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 처리하지 않고 배양한 비장세포를 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 처리수준 및 처리시간의 변화에 따른 비장세포의 증식수준의 변화를 나타내는 그래프로서 25 ㎍/㎖의 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 처리하여 24 내지 72 시간 동안 배양된 비장세포의 수준은 대조군에 비하여 약 1.2배 증가되었고, 50 ㎍/㎖의 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 처리하여 24 내지 72 시간 동안 배양된 비장세포의 수준은 대조군에 비하여 약 1.5배 증가되었으며, 100 ㎍/㎖의 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 처리하여 24 내지 72 시간 동안 배양된 비장세포의 수준은 대조군에 비하여 약 2 내지 3배 증가됨을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. (a) 알로에베라에서 취득한 알로에 다당체 추출액에 MRS 배지 성분을 첨가하고 멸균하여 알로에 다당체 추출액 발효배지를 제조하는 단계;
    (b) 유산균 전배양을 위한 MRS 배지를 제조하여 유산균 전배양액을 제조하는 단계;
    (c) 상기 알로에 다당체 추출액 발효배지에 상기 유산균 전배양액을 접종하고 발효시켜 알로에 다당체 추출액의 유산균 발효액을 제조하는 단계;
    (d) 상기 유산균 발효액을 틴달화(tyndallization)하는 단계;
    (e) 상기 유산균 발효액 중의 유산균을 파쇄하여 유산균 파쇄액을 형성하는 단계; 및,
    (f) 상기 틴달화한 유산균 발효액 및 상기 유산균 파쇄액을 혼합한 후 건조하여 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 제조하는 단계;를 포함하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 알로에 다당체 추출액를 취득하는 것은,
    알로에베라를 수확 및 전처리하는 단계; 및
    상기 전처리 알로에베라에서 점액질의 알로에 다당체 추출액을 취득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 알로에 다당체 추출액에 MRS 배지 성분을 첨가하고 멸균하기 전 pH를 pH6으로 보정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b)단계는 유산균 전배양을 위한 MRS 배지를 멸균하고 유산균을 접종 및 배양하여 유산균 전배양액을 제조하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 락토코커스(Lactococcus sp.), 비피도박테리움(Bifidobacterium sp), 스트렙토코커스(Streptococcus sp.), 와이셀라(Weisella sp.), 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 및 루코노스톡(Leuconostoc sp.)속으로 구성된 군에서 선택된 유산균을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 스트렙코커스 뮤탄스(Streptococus mutans), 와이셀라 시바리아(Weisella cibaria)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c)단계에서, 상기 유산균 전배양액은 1 내지 5 중량%를 접종하는 것을 특징으로 하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 (d)단계에서 유산균 발효액을 틴달화하는 단계는,
    상기 유산균 발효액을 60 내지 150℃에서 10 내지 60 분 동안 가열; 및
    40℃ 이하로 급속 냉각하여 상기 유산균 발효액 중 살아있는 유산균을 사멸시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 틴달화 알로에 유산균 발효분말의 제조방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 틴달화 알로에 유산균 발효분말.
  9. 제 8 항에 따른 틴달화 알로에 유산균 발효분말을 유효성분으로 포함하는 면역증강 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 면역증강 조성물 100 중량부에 대하여 상기 탄달화 알로에 유산균 발효분말을 0.01 내지 30 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강 조성물.
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