KR20220142700A - 모링가 올레이페라 발효물을 포함하는 항염증 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (Bifidobacterium animalis subsp. Lactis; B. lactis)로 발효시킨 모링가 올레이페라(Moringa oleifera Lam) 및 이의 항염증 용도에 관한 것이다.

Description

모링가 올레이페라 발효물을 포함하는 항염증 조성물{ANTI-INFLAMMATORY COMPOSITION COMPRISING FERMENTED PRODUCT OF MORINGA OLEIFERA LAM}
본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (Bifidobacterium animalis subsp. Lactis; B. lactis)로 발효시킨 모링가 올레이페라(Moringa oleifera Lam) 및 이의 항염증 용도에 관한 것이다.
모링가 올레이페라(Moringa oleifera Lam; MO)는 모링가과에 속하는 수천년간 잘 알려진 전통 허브로서 열대 및 아열대 지역에서 널리 재배되고 있다. 모링가 올레이페라는 항암, 항균, 항염, 항산화, 간보호 및 신경보호와 같은 치료 효과가 있는 페놀, 플라보노이드, 페놀산, 이소시아네이트 등의 생활성 화합물이 풍부하다. 최근, 모링가 올레이페라의 풍부한 생활성 화합물 때문에 항염 활성에 대한 생의학자들의 관심이 증가하고 있다. 모링가 올레이페라가 지질다당류-활성 RAW 264.7 세포 및 IL-6(cytokines interleukin-6), IL-8 및 TNFα(tumor necrosis factor alpha)의 생산을 억제하고 염증 과정에서 NF-κB(nuclear factor-kappa B) 시그널링 경로를 억제함이 보고되었다 (Kooltheat et al., 2014; Kou et al., 2018). 그러나, 모링가 올레이페라의 항염 효과는 식물의 순수 추출물에 대해서만 연구되고 있어, 모링가 올레이페라의 항염 효과를 개선하기 위한 여러 전략의 개발이 필요하다.
장내미생물군은 매우 다양하고 많으며 인간의 면역 및 대사 시스템에서 중요한 역할을 한다. 그중에서, 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (Bifidobacterium animalis subsp. Lactis; B. lactis)는 인체에 가장 효과적인 프로바이오틱스로 여겨진다. 인체 건강에 큰 이점이 있는 면역반응, 항노화, 항염, 항병원성 활성 및 항종양과 같은 B. lactis의 기능이 발견되었다.
한국등록특허 제10-2109234호
이에, 본 발명의 발명자는 항염제로서 B. lactis로 발효시킨 모링가 올레이페라 발효물을 제조하고, LPS-자극 마우스 마크로파지에서 다양한 염증 중재자 및 NF-κB, MAPKs 및 PI3K/AKT 시그널링 경로의 생성을 통해 모링가 올레이페라 추출물, B. lactis 및 B. Lactis에 의한 생전환 사이의 항염 활성을 비교하여 이의 치료학적 잠재성을 확인하였다.
이에 따라 본 발명의 목적은 모링가 올레이페라(Moringa oleifera Lam) 발효물을 포함하는, 항염증 조성물 및 이를 포함하는 기능성 건강식품과 이를 이용한 염증 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 모링가 올레이페라(Moringa oleifera Lam) 발효물을 포함하는, 항염증 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항염증 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항염증 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 천연물 유래 성분으로서 모링가 올레이페라를 사용하여 생체친화적이고 부작용이 없으며, 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (Bifidobacterium animalis subsp. Lactis; B. lactis)를 사용하여 모링가 올레이페라를 발효시킴으로서 항염증 효과를 개선함으로써, 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 유망한 항염 치료제 및 건강기능성식품으로서 사용될 수 있다.
도 1은 LPS-처리 RAW 264.7 세포에서 MO-B, MO, B. lactis의 처리시 염증 종료 산물의 저해를 나타낸 것이다. (a) LPS-자극 RAW 264.7 마크로파지에서 MO-B, MO, B. lactis의 독성; (b) LPS-자극 RAW 264.7 마크로파지에서 MO-B, MO, B. lactis의 NO 생산에 대한 효과; (c) LPS-유도 RAW 264.7 세포 분화에 대한 MO-B, MO, B. lactis의 효과로서, 분화된 세포의 형태는 빨간색 화살표로 표시함; (d) LPS-활성화 RAW 264.7 세포에서 reactive oxygen species (ROS, 녹색)에 대한 MO-B, MO, B. lactis의 효과. 실험은 독립적으로 3회 반복하고 수치는 평균 ± SEM으로 나타냈다. *** p < 0.001은 비-처리 대조와 비교하였다. # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001은 LPS 대조와 비교하였다.
도 2는 LPS-활성화 RAW 264.7 세포에서 PI3K/AKT에 대한 MO-B, MO, B. lactis의 효과를 나타낸 것이다. (a) LPS 1μg/mL로 전처리된 RAW 264.7 세포에서 MO-B, MO, B. lactis의 mRNA 발현 결과; (b) LPS 1μg/mL로 전처리된 RAW 264.7 세포에서 MO-B, MO, B. lactis의 단백질 발현 결과. GAPDH를 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯팅에서 내부 대조로 사용하였다. 수치는 비-처리 대조에 대해 상대적으로 표시하였으며 수치는 평균 ± SEM으로 나타냈다. *** p < 0.001은 비-처리 대조와 비교하였다. # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001은 LPS 대조와 비교하였다.
도 3은 JNK, p38, ERK로 구성된 MAPK 시그널링 경로에서 MO-B, MO, B. lactis의 효과를 나타낸 것이다. LPS(1μg/mL)로 전처리된 RAW 264.7 세포에서 MO-B, MO, B. lactis의 처리에 의한 단백질 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 결과. 실험은 독립적으로 3회 반복하고 수치는 평균 ± SEM으로 나타냈다. *** p < 0.001은 비-처리 대조와 비교하였다. # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001은 LPS 대조와 비교하였다.
도 4는 Nrf2/HO-1 시그널링 경로에서 MO-B, MO, B. lactis의 효과를 나타낸 것이다. (a) LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 Nrf2 및 HO-1 유전자의 qRT-PCR 결과; (b) LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 Nrf2 및 HO-1 관련 단백질의 웨스턴 블롯 결과. 실험은 독립적으로 3회 반복하고 수치는 평균 ± SEM으로 나타냈다. *** p < 0.001은 비-처리 대조와 비교하였다. # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001은 LPS 대조와 비교하였다.
도 5. NF-κB 시그널링 경로에서 MO-B, MO, B. lactis의 효과를 나타낸 것이다. (a) MO-B, MO, B. Lactis가 처리된 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 IKKα 및 NF-κB 유전자의 mRNA 발현; (b) LPS-처리 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 시그널링 경로의 단밸질 발현. 실험은 독립적으로 3회 반복하고 수치는 평균 ± SEM으로 나타냈다. *** p < 0.001은 비-처리 대조와 비교하였다. # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001은 LPS 대조와 비교하였다.
도 6은 LPS로 처리된 마크로파지(RAW 264.7 세포)에서 MO-B가 M1 분극화(전-염증)을 저해하고 M2 표현형(항-염증)을 유도함을 나타낸 것이다. (a) LPS-처리 RAW 264.7에 MO-B, MO, B. lactis 처리시 IL-6, TNF-α, IL-1β 과 같은 M1 마크로파지의 mRNA 발현; (b) LPS-활성화 RAW 264.7 세포에 MO-B, MO, B. lactis 처리시 IL-4, IL-10, IL-13, Arg-1과 같은 M2 표현형의mRNA 발현. 실험은 독립적으로 3회 반복하고 수치는 평균 ± SEM으로 나타냈다. *** p < 0.001은 비-처리 대조와 비교하였다. # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001은 LPS 대조와 비교하였다.
도 7은 LPS-자극 RAW 264.7 세포의 저해 시 MO-B의 작용을 나타낸 도이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 모링가 올레이페라(Moringa oleifera Lam) 발효물을 포함하는, 항염증 조성물에 관한 것이다.
상기 모링가 올레이페라는 모링가 올레이페라의 잎, 열매, 뿌리 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 모링가 올레이페라의 잎일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 모링가 올레이페라는 모링가 올레이페라의 잎, 열매, 뿌리 등의 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 모링가 올레이페라 추출물은 모링가 올레이페라의 잎, 열매, 뿌리 등을 적절한 용매로 추출한 것으로, 상기 추출하기 위한 적절한 용매는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 추출 용매로서 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 클로로포름, 디에틸 에테르, 디클로로 메탄, 헥산, 에테르, 벤젠, 메틸렌 클로라이드, 및 시클로헥산 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 모링가 올레이페라는 모링가 올레이페라 잎의 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 모링가 올레이페라 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
상기 모링가 올레이페라 발효물은 모링가 올레이페라를 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (Bifidobacterium animalis subsp. Lactis; B. lactis)로 발효시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 모링가 올레이페라 발효물은 도 7에 도시된 바와 같이, PI3K/AKT 및 MAPK 시그널링 경로를 방지하여 NF-κB 시그널 경로를 차단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 모링가 올레이페라 발효물은 M1 마크로파지를 저해하고 M2 마크로파지를 자극하여 면역 균형을 이룰 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항염증 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있으며, 본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 모링가 올레이페라 발효물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 모링가 올레이페라 발효물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 모링가 올레이페라 발효물 또는 항염증 조성물을 유효성분으로 포함하는 염증 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 암 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모링가 올레이페라 발효물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 모링가 올레이페라 발효물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 모링가 올레이페라 발효물물 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모링가 올레이페라 발효물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 모링가 올레이페라 발효물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한 본 발명은 개체에게 모링가 올레이페라 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 예를 들어, 인간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 모링가 올레이페라 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예>
물질
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 페니실린-스트렙토마이신, 및 fetal bovine serum (FBS) GenDEPOT (Katy, TX, USA)에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO), 및 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. MRS (deMan, Rogosa, 및 Sharp) 브로스는 Becton, Dickinson and Company (BD, San Jose, CA USA)에서 구입하였다. IL-6, TNFα, IL-4, IL-13, Arg-1, IL-1β, NF-κB, IKKα, Nrf2 및 HO-1 프라이머는 Macrogen (Geumcheon-gu, Seoul)에서 설계하였다. P38, p-P38, ERK, p-ERK, Nrf2, HO-1, JNK, p-JNK에 대한 일차 항체는 abcam (Cambridge, UK)에서 구입하고 항 NF-κB, IκBα, p-IκBα, p-NF-κB 및 β-액틴은 Cell Signaling Technology (CST, MA, United States)에서 구입하였다.
제조예 1. 모링가 올레이페라( Moringa oleifera ; MO)의 추출
모링가 올레이페라(Moringa oleifera Lam.; MO)의 잎을 인도(Coimbatore, Tamil Nadu, India)의 지역 마켓에서 구입하고 P. Jayaraman 교수 (Plant Anatomy Research Centre)에게 확인받았다. 견본 바우처 번호(Specimen voucher number)는 PARC/2017/3906이다. 우선, 모링가 올레이페라 잎을 세척하고 건조한 후 분쇄하였다. 암 조건 하 37℃에서 24시간 동안 10 g의 분말을 50 mL의 에탄올(70%)에 함침시키고, 이를 3회 반복하였다. 추출된 용액을 여과하고 50℃의 회전 진공 증발기에서 증발시킨 후 4℃에서 보관하였다. 사용전에 추출물을 증류수에 용해시켰다.
제조예 2. 모링가 올레이페라(MO) 및 B. lactis 생전환(MO-B)
B. lactis의 확인된 16S rRNA는 NCBI GenBank에 수탁번호 CP001606로 기탁된 것이다. B. Lactis는 37℃의 인큐베이터에서 48시간 동안 0.05% L-cysteine-HCl (Sigma-Aldrich, Singapore) 함유 멸균 MRS 브로스에서 무산소 배양되었다. 모링가 올레이페라(MO) (2 mg/mL)을 37℃에서 B. lactis로 발효시키고 무-진탕 인큐베이터에 두었다. 24시간 후, 추가 실험을 위해 각 샘플(MO-B)을 수집하였다. MRS 브로스 및 0.05% L-cysteine-HCl 중의 모링가 올레이페라 및 B. lactis 세포로 이루어진 음성 대조를 MRS 브로스 및 0.05% L-cysteine-HCl에 배양하였다. 모든 음성 샘플 조건은 MO-B 샘플 생전환과 동일하게 유지하였다. 대조 및 MO-B 샘플을 45분간 초음파처리하고 원심분리(4,000 rpm, 4℃, 10분)하여 발효를 끝내고 추가 연구를 위한 상청액을 수집하였다.
실시예 1.
MO-B, MO 및 B. lactis 의 분석
1.0g의 MO-B, MO 및 B. lactis 건조 분말을 5% DMSO/MeOH에 첨가하여 혼합하고, 이 혼합물을 Ultimate 3000 system (Thermo Scientific, USA)을 이용하여 HPLC 분석하였다. 분리를 위해 Waters Cortex C18 (2.1 mm × 150 mm, 1.6 um)의 컬럼 온도를 45℃로 설정하였다. 이동상은 물 중 0.1% 포름산(solvent A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산(solvent B)을 포함하고 유속은 0.3 mL/min이었다. HPLC 장비는 MS 검출기와 접속되어 핑거프린트 피크를 검출하였다. LC/MS mass spectrometer(Triple TOF 5600+, AB Sciex, USA) 및 electrospray ionization (ESI) 소스로 분석하였다. ESI-MS 분석 조건은 다음과 같다: negative ion mode, temperature 500℃, Nebulizer pressure 50 psi, floating ion spray voltage 4.5 kV.
LC/MS 분석은 MO-B, MO 및 B. Lactis의 화합물을 확인하기 위한 것이다. 약 2000개의 공통적인 화합물이 MO-B, MO 및 B. Lactis의 TIC(total negative/positive ion current)에서 나타났다. 결과를 표 1에 나타냈으며, 25개의 특별한 화합물이 MO-B에서 확인되었다.
Figure pat00001
실시예 2.
세포 배양 및 세포 생존도 분석
RAW 264.7 세포(ATCC, Manassas, VA)를 37℃의 5% CO2 습식 인큐베이터에서 10% 열-불활성화 FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 DMEM 배지에 각각 배양하였다. MTT 분석으로 세포에 대한 MO-B, MO 및 B. lactis의 세포독성을 확인하였다. RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1 × 105 cells/well의 밀도로 접종하고 밤새 배양하였다. 세포에 LPS (1 μg/mL)를 첨가하여 1시간 동안 자극하고 다양한 농도의 MO-B, MO, 및 B. lactis (50, 75, 100, 150 및 200 μg/mL)를 LPS-활성화 RAW 264.7 세포에 처리하였다. 24시간 후, 100 μL MTT (0.5 mg/mL)를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 100 μL DMSO를 보충하여 포르마잔 결정을 용해하고 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다(SpectraMax® ABS plus).
MO-B를 RAW 264.7 세포에 처리한 후, 세포독성을 MTT 분석으로 확인하였다. 그 결과, 도 1a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다양한 농도(50 내지 200 μg/mL)의 MO-B, MO 및 B. Lactis는 RAW 264.7 세포 및 LPS(1 μg/mL)로 처리된 RAW 264.7 세포에 대해 독성을 보이지 않았다.
실시예 3.
산화질소 확인
다양한 농도의 MO-B, MO, 및 B. lactis (50, 75, 100, 150 및 200 μg/mL)를 LPS (1 μg/mL)로 1시간 동안 자극한 RAW 264.7 세포에 처리하였다. 24시간 후, 100 μL의 배양 배지 상청액을 다른 96 웰 플레이트로 옮긴 후 100 μL Griess reagent (Thermo Fisher Scientific)을 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 10분간 실온에서 유지시킨 후 570 nm에서의 흡광도를 spectrophotometric microplate로 측정하였다. 질소 생산(NaNO2)을 산화질소(NO) 산화를 측정하기 위한 표준으로 사용하였다.
질소 수준을 Griess reagent로 측정하여 LPS-활성화 RAW 264.7 세포에서 MO-B의 NO 생산 저해를 확인하였다. LPS (1 μg/mL)은 확실히 과량의 NO를 발생시켰으나, MO-B (50 μg/mL 내지 200 μg/mL)의 처리 후에 마크로파지에서 NO 수준은 동일 농도의 MO 및 B. Lactis에 비해 상당히 감소되었다(도 1b).
ROS 생산
RAW 264.7 세포를 작은 플레이트의 글라스 슬라이드로 분리하고 LPS (1 μg/mL)와 함께 MO-B (100, 150 및 200 μg/mL) 및 MO, B. lactis (200 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 세척하고 Cellular ROS/Superoxide Detection Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK)를 첨가해 ROS를 검출하였다. Leica DMLB fluorescence microscope (Wetzlar, Germany)를 사용하여 형광을 측정하고 fluorescein (Ex/Em = 490/525nm) 및 rhodamine (Ex/Em = 550/620nm) 필터를 표준으로 설정하였다.
ROS는 LPS-유도 염증에서 필수 인자로 여겨진다. RAW 264.7 세포를 LPS로 처리한 후, ROS는 대조군에 비해 ROS 그린 염색이 상당히 증가하였다(도 1c). LPS-자극 RAW 264.7 세포에 MO-B를 처리했을 때, MO 또는 B. lactis 처리군에 비해 ROS 생산에서 형광 강도가 상당히 감소되어 더 강한 효과를 가짐을 확인하였다.
실시예 4.
Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR)
RAW 264.7 세포를 MO, MO-B, B. lactis 및 LPS (1 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 후, 총 RNA를 TRIsureTM(Bioline,Luckennwalde,Germany)로 추출하였다. 총 RNA를 500 ng으로 희석한 후 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEOT, TX, USA)와 혼합하여 cDNA로 전사시켰다. 각각의 qRT-PCR 반응은 20 μl 용적의 500ng cDNA, 프라이머 및 amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix (GenDEOT,TX,USA)함유 혼합물을 사용하여 진행되었다. 실험한 염증 관련 유전자는 표 2에 나타냈다. 상대적 유전자 발현은 2-ΔΔCt method으로 결정하였다. The housekeeping gene encoding GAPDH를 코딩하는 하우스키핑 유전자를 관련 유전자의 발현 수준을 분석하기 위한 표준으로 사용하였다.
Figure pat00002
웨스턴 블롯 분석
RAW 264.7 세포를 60 mm 디쉬에서 24시간 동안 배양한 후 다양한 농도의 MO, MO-B, B. lactis 및 LPS (1 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척하고 스크랩퍼로 세포를 수집한 후 Pierce™ RIPA Buffer (Thermo Scientific, Rockford, USA)로 용균시켰다. 세포 용해물을 4℃에서 12,000 rpm로 20분간 원심분리하고 Bradford reagent (Sigma-Aldrich Co.)로 단백질 함량을 확인하였다. 동량의 총 단백질(50 μg)을 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 PVDF 맴브레인으로 옮겼다. 1시간 후에 5% 탈지유로 차단하고 4℃에서 밤새 적절한 일차 항체를 사용하여 맴브레인을 탐침한 후, 실온에서 1시간 동안 horseradish peroxidase-linked secondary antibody (goat anti mouse/rabbit IgG 1:2000)와 함께 유지시켰다. 마지막으로, ECL detection system (GenDEOT, TX, USA)을 사용하여 Alliance Mini HD9 (UVItec, Cambridge, UK) 중의 단백질 발현 수준을 검출하고 밴드 밀도를 ImageJ software (National Institutes of Health, Maryland, USA)로 정량하였다.
통계
결과는 one-way ANOVA를 사용하여 분석하였으며, 뒤이은 다중 비교를 위해 Bonferroni’s post hoc test를 사용하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SEM)로 나타냈다. SPSS 17.0 Statistics (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계를 분석하였다. # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001의 p 값은 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 간주되었다.
결과
PI3K/AKT 시그널링 경로에 대한 MO-B의 효과
PI3K/AKT는 NF-κB 경로의 활성화를 통해 전-염증에서 중요한 역할을 한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석 결과는 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 MO 또는 B. lactis 처리군에 비해 여러 농도의 MO-B 처리군에서 AKT 및 PI3K의 발현을 억제함을 보였다. 특히 PI3K에 대한 웨스턴 블롯 결과에서, MO-B 처리 군의 단백질 발현이 상당히 감소되었으나, MO 또는 B. lactis 처리군에서는 이러한 효과를 보이지 않았다. 이러한 결과는 MO-B가 성공적으로 PI3K/AKT 시그널링 경로를 저해할 수 있음을 나타낸다.
MAPKs 시그널링 경로에 대한 MO-B의 효과
MO-B가 MAPKs 경로를 저해할 수 있는지를 연구하기 위해, ERK, JNK 및 P38을 비롯한 MAPKs 패밀리의 여러 단백질을 사용하여 LPS-자극 RAW 264.7 세포에 대한 MO-B의 효과를 확인하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 웨스턴 블롯 결과는 인산화된 JNK, p38 및 ERK가 MO-B (100, 150, 200 μg/mL)로 처리된 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 상당히 억제됨을 보였다. MO 또는 B. lactis 처리군은 MAPKs 경로 저해에 대해 미미한 효과만을 보였다.
NF-κB 시그널링 경로에 대한 MO-B의 효과
NF-κB 경로를 통한 항염증에서 MO-B의 메커니즘을 연구하기 위해, IKKα는 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 투여량 증가에 따라 MO-B에 의해 하향조절되는 IκBα를 조절할 수 있다. LPS 자극 RAW 264.7 세포는 IκBα 및 NF-κB의 인산화를 활성화시킬 수 있다. 이러한 결과는 단백질 및 mRNA 발현에 의해 확인되었다 (도 4). MO-B 처리군에서, 인산화된 IκBα 및 NF-κB은 강하게 저해되었다. 200 μg/mL의 MO-B 처리군에서 IκBα의 단백질 발현은 현저하게 감소하였으며, 이는 IκBα가 NF-κB를 보호하기 위해 저해됨을 제시하는 것이다. 이러한 결과는 MO-B가 NF-κB 시그널링 경로를 차단하여 항염증 효능을 매개할 수 있음을 나타낸다.
Nrf2/HO-1 시그널링 경로에 대한 MO-B의 효과
Nrf2는 세포의 항암 반응의 조절에서 중요한 인자이다. MO-B가 LPS-유도 RAW 264.7 세포에서 Nrf2 시그널링 경로를 조절할 수 있는지를 확인하기 위해, qRT-PCR 및 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, MO-B, MO 및 B. Lactis를 24시간 동안 처리한 후, MO-B에 의해 Nrf2 및 HO-1의 mRNA 발현이 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 증가하였다. 한편, MO 또는 B. lactis가 처리된 RAW 264.7 세포는 효과가 없었다. 또한, HO-1 단백질 발현 또한 MO-B(100, 150, 200 μg/mL) 처리된 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 상향조절되었다.
전-염증 사이토카인 인자에 대한 MO-B의 효과
IL-6, TNF-α, 및 IL-1β과 같은 전-염증 사이토카인의 인자는 염증 과정에서 필수적인 역할을 한다. mRNA를 MO-B, MO 및 B. lactis 처리한 LPS-자극 RAW 264.7 세포로부터 분리하였다. 도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이, LPS-자극 세포의 IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현은 MO 또는 B. lactis 처리군에 비해 MO-B 처리 군에서 감소되었다. MO-B 처리군에서 IL-6의 mRNA 발현이 상당히 감소되었으며, 이는 MO-B가 IL-6 사이토카인을 상당히 표적으로 하여 작용할 수 있음을 제시하는 것이다.
항-염증 사이토카인 인자 에 대한 MO-B의 효과
LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 MO-B 처리의 효과를 연구하기 위해, IL-4, IL-10, IL-13 및 Arg-1의 mRNA 발현을 통한 M2 분극화를 검출하였다. 도 6b에서, MO-B 처리군은 투여량 의존적으로 증가하였다. MO 또는 B. lactis 처리군은 효과를 보이지 않았다. MO-B 200 μg/mL 처리군에서 IL-13의 mRNA 발현은 현저하게 증가하였다. 이러한 결과는 MO-B가 항-염증 사이토카인을 촉진할 수 있음을 나타내는 것이다.
결론
MO-B by LC/MS에 의해서 B. Lactis로 발효된 모링가 올레이페라에 리놀렌산, 강글리오사이드 GM1, 카페에이트(Caffeate) 및 캠퍼롤(Kaempferol)과 같은 과량의 이차 대사산물이 있음을 최초로 확인하였다. 이전 연구에서 리놀렌산이 NO 및 IL-1β, IL-8, COX2과 같은 전-염증 사이토카인을 억제할 수 있고, 강글리오사이드 GM1이 PI3K/AKT-Nrf2 경로를 통해 염증 및 산화 스트레스를 저해함이 공개되었다. 또한, 카페에이트 및 캠퍼롤이 강한 항-염증 효과가 있음이 보고되었다. 그러므로, B. Lactis로 발효된 모링가 올레이페라는 잠재적 항-염증 효과를 가지고 있으므로, 항-효과적인 염증 활성을 갖는 식품 첨가제로 사용될 수 있다. 이러한 이전 연구결과로부터 MO-B가 MO 또는 B. Lactis에 비해 강한 활성을 가짐을 짐작할 수 있다.
마크로파지는 염증 질환의 주요 원인이며 만성 염증 관련 질환을 야기할 수 있는 자가면역 및 자동-염증 질환과 관련되어 있다. NO 도입은 신체의 면역 반응에 관련된 시그널링 분자임이 이미 밝혀졌다. NO는 항-염증 효과를 갖지만, NO의 과발현은 염증을 야기하고 전-염증 중개자로서 작용할 수 있다. 본 발명에서는 MO-B가 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 세포독성 없이 NO 생산을 현저히 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
활성화된 마크로파지에서 MO-B 효과의 분자 메커니즘을 연구하기 위해 염증 시그널링 경로를 연구하였다. NF-κB 단백질은 일반적으로 IκB 패밀리의 세포질 멤버에서 분리된다. IκBα는 NF-κB 활성화로 야기되는 다중-서브유닛 IκB kinase (IKK) 복합체에 의한 특정 위치에 따른 인산화를 통해 유도적으로 분해된다. IKK 복합체는 IκBα 분해를 통해 NF-κB의 활성화를 자극한다. NF-κB 및 IκBα의 단백질 발현이 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 상당히 증가하는 본 발명의 결과가 이전 연구 결과와 일치하였다. 본 발명자의 예상과 같이, NF-κB 및 IKKα의 mRNA 발현은 MO-B의 투여량-의존적 처리에 의해 감소하였다. NF-κB 및 IκBα의 단백질 활성화 또한 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 MO-B 처리에 의해 방지되었다.
반면에, MAPKs 및 PI3K/AKT 시그널 경로는 NF-κB의 활성화를 통한 염증 반응에서 중요한 역할을 한다. MAPKs 경로의 저해는 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 항-염증의 주요 참여 메커니즘이 될 수 있다. 본 발명의 결과는 LPS-활성화 RAW 264.7에서 JNK, p38 및 ERK 인산화를 상당히 억제하여, NF-kB 활성화의 뒤이은 억제를 촉발할 수 있음을 제시한다. 이전 연구들에서 PI3K/AKT 시그널링 경로가 활성화에 관련되고 염증 중재자의 생산에 기여함이 입증되었다. 본 발명에서, LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 PI3K 및 AKT의 인산화가 상당히 억제함을 발견하였다.
TNF-α, IL-1β, 및 IL-6를 비롯한 M1 마크로파지 사이토카인은 RAW 264.7 세포가 자극된 후에 분비될 것이다. mRNA의 발현은 LPS-유도 RAW 264.7 세포에서 MO-B가 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6를 상당히 억제함을 입증하였다. M1과 반대로, M2 마크로파지는 항-염증성 기능을 한다. M2 분극화는 IL-4, IL-13, IL-10, 및 Arg-1와 같은 여러 사이토카인을 생산한다. 본 발명에서 MO-B가 처리된 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서 IL-4, IL-13, IL-10, 및 Arg-1의 mRNA 발현이 상당히 증가됨을 발견하였다. Heme oxygenase (HO-1)는 마크로파지에서 발현되는 항-염증 유전자 중 하나로, 항-염증 표현형으로서 nuclear factor erythroid 2*?*related factor 2 (Nrf2) 패밀리에 의해 조절될 수 있다. 본 발명의 결과는 HO*?*1 및 Nrf-2의 mRNA 수준이 MO-B가 처리된 활성화 RAW 264.7 세포에서 상당히 증가함을 보였다. HO*?*1의 단백질 발현 또한 MO-B 처리 후에 감소하였다. 이러한 결과는 MO-B가 M1/M2 마크로파지의 균형을 맞추고 항-염증 활성을 이끌어낼 수 있음을 제시한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 모링가 올레이페라(Moringa oleifera Lam) 발효물을 포함하는, 항염증 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 모링가 올레이페라 발효물은 모링가 올레이페라를 비피도박테리움 애니말리스 락티스 (Bifidobacterium animalis subsp. Lactis; B. lactis)로 발효시킨 것인, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 모링가 올레이페라는 모링가 올레이페라 잎인 것인, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 모링가 올레이페라는 모링가 올레이페라 잎의 에탄올 추출물인 것인, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    PI3K/AKT 및 MAPK 시그널링 경로를 방지하여 NF-κB 시그널 경로를 차단하는 것인, 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    M1 마크로파지를 저해하고 M2 마크로파지를 자극하여 면역 균형을 이루는 것인, 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항염증 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 건강기능식품.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항염증 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 염증의 예방 또는 치료방법.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102109234B1 (ko) 2017-10-31 2020-05-11 한동대학교 산학협력단 발효 모링가 올레이페라 추출물 제조 방법

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