KR20220130762A - 아크릴아미드 분해 효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 주로 식품 및 고급 식품, 예를 들면 커피 및 커피 대용 제품의 생산 분야에 있다. 바람직하게는 또한 50℃를 상회하는 온도에서, 특히 커피/커피 대용 제품의 생산에서 발생하는 온도 범위에서 및/또는 커피/커피 대용 제품의 생산에서 일반적인 것처럼, pH 4 내지 pH 7의 pH 값에서 아크릴아미드를 분해할 수 있는 효소가 제공된다. 또한, 반제품 및 완제품 중에서 선택된 제제로부터 아크릴아미드를 분해하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소에 의해 본 발명에 따른 아크릴아미드를 제거하는 방법에 투입되지 않은 제제와 비교하여 아크릴아미드 함량이 감소된 제제에 관한 것이다.

Description

아크릴아미드 분해 효소
본 발명은 식품 및 고급 식품, 특히 커피 및 커피 대용 제품의 생산 분야에 있다. 바람직하게는 50℃를 상회하는 온도에서, 특히 커피/커피 대용 제품의 생산에서 발생하는 온도 범위에서 및/또는 커피/커피 대용 제품의 생산에서 통상적인 것처럼, pH 4 내지 pH 7의 pH 값에서 아크릴아미드를 분해할 수 있는 신규 효소가 제공된다. 또한, 반제품 및 완제품 중에서 선택된 제제로부터 아크릴아미드를 분해하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소에 의해 본 발명에 따른 아크릴아미드를 제거하는 방법에 투입되지 않은 제제와 비교하여 아크릴아미드 함량이 감소된 제제에 관한 것이다.
지속적으로 안전하고 소비하기에 안전한 식품 및 고급 식품에 대한 최종 소비자의 요구는 지속적으로 높으며 생산자에게 특별한 요구 사항을 부과한다.
2018년부터의 신규 EU 규정(EU 2017/2158)은 아크릴아미드를 공정 오염 물질 및 최종 소비자에 대한 잠재적 건강 리스크로서 분류한다. 이에 따라 식품 및 고급 식품 생산자는 식품 및 고급 식품 중의 아크릴아미드 함량을 일정 수준 이하로 유지하거나 감소시켜야 할 의무가 있다. 동물 연구에서 아크릴아미드는 발암성 및 변이원성이다. 아크릴아미드는 전분을 함유한 원료의 모든 프라잉, 베이킹 및 딥-프라잉 과정에서 형성되며, 소위 마이야르 반응의 일부로서 환원당 (예를 들면 포도당 및 과당)과 함께 아스파라긴을 가열한 산물이다.
커피 및 커피 대용 제품 생산의 특정 경우에, 이러한 공정에는 로스팅되고 분쇄된 커피 콩 및 치커리, 보리 또는 호밀과 같은 대용품의 로스팅 또는 추출이 수반된다. 로스팅하는 동안 커피 콩은 전형적으로는 복잡한 화학 반응, 마이야르 반응, 캐러멜화 및 열분해가 일어나는 145℃ 내지 250℃ 범위의 온도에 노출된다. 이들 반응은 음료의 맛에 근본적으로 중요한 로스팅된 제품의 화학적, 물리적 및 감각적 특성을 변화시킨다. 또한 항산화제와 같이 최종 제품에 중요한 기타 물질이 형성된다 (Jin et al., "Relationship between antioxidants and acrylamide formation: A review," Food Research International, 2013, p. 611 - 620). 아크릴아미드는 또한 커피 및 커피 대용품을 로스팅함으로써 바람직하지 않은 공정 오염물질로도 형성된다 (Anese, M. "Acrylamide in Coffee and Coffee Substitutes, Acrylamide in Food, 2016, p.181 - 195). 신규 EU 규정에서의 아크릴아미드에 대한 지침치는 로스팅된 커피의 경우 400 ㎍/kg, 가용성 커피의 경우 850 ㎍/kg, 곡물로만 만든 커피 대용 제품의 경우 500 ㎍/kg, 및 치커리로 만든 제품의 경우 4000 ㎍/kg이다.
아크릴아미드는 식품 및 고급 식품 산업에서의 다수 (기타) 공정에서도 형성된다. 예를 들어, 감자를 유탕할 때 아크릴아미드가 형성된다. 특히 한편으로는 EU 규정 (EU 2017/2158)의 요구 사항을 충족하고 다른 한편으로는 소비자에 무해한 안전한 최종 제품을 수득하기 위해서는 반제품 또는 완제품에서 아크릴아미드를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 것이 유리하거나 심지어는 필요하다.
비록 식품 및 고급 식품 중의 아크릴아미드 함량을 감소시키기 위한 다수의 시도가 있지만 이들 시도로는 경제적으로 정당한 비용으로 아크릴아미드를 거의 완전히 또는 완전히 및 온화하게 제거할 수 없다. 예를 들면, 특허 출원 EP 3254568 A1에서는, 아크릴아미드를 흡수하기 위해 양이온성 수지를 사용함으로써 커피 추출 후에 아크릴아미드 함량을 저하시킨다. 이 공정은 부가적인 공정 단계를 요하며, 흡수가 동역학적으로 느린 단계이기 때문에 시간이 많이 걸린다. 또한, 아크릴아미드의 50%만이 제거될 수 있으며, 양이온성 수지는 공정에서 추가 비용이다.
아크릴아미드를 감소시키는 또 다른 방법은 전구체를 감소시키는 것이다. 이는 특허출원 WO 2013/005145 A1의 주제이다. 여기에서는 로스팅 공정 전에 개시하는 아스파라긴 및 아스파르트산의 감소 공정을 개시하고 있다. 로스팅 전에 아스파라긴 함량을 감소시키면 최종 제품의 아크릴아미드 함량이 감소하지만, 최종 제품의 향미 프로파일이 변성된다. 또한, 이 프로세스를 수행하려면 부가적인 신규 장비가 필요하기 때문에 이 프로세스는 사용자에게 비용이 많이 든다.
또 다른 접근 방식은 특허 EP 1745702 B1의 저자가 취하는 것으로 효소 보조 커피 생산도 다루고 있다. 여기에서 커피 콩의 전분은 최종 제품에서의 개선된 향미 프로파일을 수득하기 위하여 효소 분해시켜 이미 개별 빌딩 블록으로 해체되어 있다. 이 공정에서, 단당류의 높은 가용성으로 해서 표준 커피 제품에서 보다 더 많은 아크릴아미드의 생성으로 귀착된다. 이러한 점은 효소 처리의 올바른 타이밍이 아크릴아미드 함량의 감소에 중요하다는 것을 명백히 보여준다.
WO 2004/083423 A1은 호열성 생물로부터 단리된 열적으로 안정한 아미다제, 특히 슈도노카디아 써모필리아(Pseudonocardia thermophilia)와 같은 호열성 방선균으로부터의 아미다제에 관한 것이다. 여기에 개시된 서열 목록에 따르면, 슈도노카디아 써모필리아로부터 유래한다고 주장되는 아미다제의 아미노산 서열이 WO 2004/083423 A1의 서열번호 3 (본 출원의 서열번호 42에 해당)으로서 개시되어 있다. 슈도노카디아 써모필리아의 게놈이 그 후 완전히 서열분석되어 GenBank 번호 FRAP01000003.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FRAP01000003)하에 기탁되었다. 그 게놈은 50704 내지 52245개 범위로 아미다제의 유전자좌를 가지고 있으며; 그 단백질은 GenBank SHK14489.1하에 기탁되어 있다. 서열번호 2의 야생형 아미다제 (본 발명에 따른 것이 아님)와 비교하여 기탁된 아미다제의 서열 정렬은 단백질의 전체 길이에 걸쳐 100%의 동일성을 나타낸다. 그러나, WO 2004/083423 A1에 따른 아미노산 서열은 특히 처음 대략 100개의 N-말단 아미노산 잔기의 서열 섹션에서 부정확한 것으로 보인다. 이러한 서열 부정확성은 주로 당시 이용 가능한 서열분석 방법으로 인해 발생했을 수 있으므로 WO 2004/083423 A1의 서열번호 3은 현재의 관점에서 보면 오류가 있는 것이다. 따라서, 슈도노카디아 써모필리아로부터의 야생형 아미다제의 정확한 아미노산 서열은 오히려 현재의 (본 발명 아님) 서열번호 2이다. 현재의 서열번호 2에 따른 슈도노카디아 써모필리아로부터의 야생형 아미다제와 비교하여 WO 2004/083423 A1에 따른 서열번호 3을 서열 정렬하면 528개소 중 447개소만이 동일하고 (동일성: 84.7%), 528개소 중 458개소가 유사하며 (유사성: 86.7%); 해당 정렬은 도 1에 도시하였다.
출원 WO 2004/083423과 관련되어 있는 것으로 보이는, "아미노산 및 카르복실산 AZ 13107의 거울상 선택적 합성을 위한 극한성 미생물로부터의 아미다제의 용도"라는 제목의 2005년 12월로부터의 프로젝트에 대한 함부르크 공과 대학의 최종 보고서 (https://www.dbu.de/projekt_13107/01_db_2409.html)에는 보충 정보가 실려 있다. 프로젝트 설명에 따르면, WO 2004/083423 A1의 발명자들은 이 프로젝트에서 협업하였다. 따라서, 슈도노카디아 써모필리아로부터 단리된 아미다제의 단백질 서열의 일부를 서열분석하여, 유기체 중의 추정되는 아미다제 유전자를 PCR로 증폭 및 서열분석하는 데 사용하였다. 대장균 숙주 시스템에서의 발현에 의하여 재조합 아미다제를 생산하는 실험에서, PCR로 증폭한 유전자 서열을 아라비노스-유도 발현 벡터 pBad-Thio-TOPO에 클로닝하였다. 54 kDa 크기의 단백질 발현은 SDS-PAGE에 의해 검출할 수 있었지만 슈도노카디아 써모필리아로부터의 재조합 아미다제의 활성은 천연 단백질에 의해 전환된 기질을 사용한 효소적 분석에서 검출할 수 없었다. 따라서, WO 2004/083423 A1의 개시는 당업자에게 가능하지 않다.
EP 0 272 024 A2는 아미다제를 사용한 아크릴아미드 분해 방법에 관한 것이다.
M. Cha, Eur Food Res Technol (2013) 236:567-571은 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 및 지오바실러스 써모글루카시다시우스 (Geobacillus thermoglucasidasius)로부터의 효소를 사용한 커피 중의 아크릴아미드 함량의 효소적 조절에 관한 것이다. 해당 간행물에서는 특정 효소 서열을 거명하고 있지는 않으며; 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 비교하여 각각, 랄스토니아 유트로파로부터의 현재 알려진 효소는 최대 동일성이 약 36.4%이고, 지오바실러스 써모글루카시다시우스로부터의 현재 알려진 효소는 최대 동일성이 약 53.3%이다.
S. Raghavan et al, Microb Cell Fact (2019) 18:139는 아크릴산의 대장균에서의 이종 생산을 검출하기 위한 전사 센서의 개발 및 응용에 관한 것이다. 본 논문에서는 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 비교하여 약 14%의 동일성을 갖고 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 관련이 없는 지오바실러스 팔리더스 (Geobacillus pallidus)로부터의 아미다제 RAPc8을 거명하고 있다.
T.K. Chung et al, Enzyme and Microbial Technology 26 (2000) 152-158은 대장균에서 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus) BR388로부터의 아미다제의 클로닝에 관한 것이다. 바실러스 스테아로써모필러스 BR388로부터의 아미다제는 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 비교하여 약 14%의 동일성을 가지며 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 관련이 없다.
A. Karmali et al, Molecular Biotechnology, Vol. 17 2001 211-212는 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터의 아미다제에서 Thr-103-Ile 및 Trp-138-Gly의 교환에 관한 것이다. 녹농균으로부터의 아미다제는 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 비교하여 약 15%의 동일성을 가지며 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 관련이 없다.
N.J. Silman et al, J Gen Microbiol (1991) 137 169-178은 성장 선택 및 화학적 돌연변이유발에 의한 아미다제-발현 메틸로필러스 메틸로트로퍼스 (Methylophilus methylotrophus)의 비-방향성 진화에 관한 것이다. 이 아미다제는 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 비교하여 약 14%의 동일성을 가지며 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 관련이 없다.
M.S. Nawaz et al, J Bacteriol 1996 2397-2401은 클렙실라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)로부터의 열안정성 아미다제의 물리적, 생화학적 및 면역학적 특성분석에 관한 것이다. 해당 간행물에서는 특정 효소 서열을 거명하고 있지는 않으며; 클렙실라 뉴모니애로부터의 현재 알려진 효소는 슈도노카디아 써모필리아로부터의 효소와 비교하여 약 51.2%의 최대 동일성을 갖는다.
효소를 사용하는 모든 공정에서, 효소의 사용은 공정 변수의 정확한 설정과 연관되어 있다. 모든 효소에는 각 반응의 촉매 작용이 일어나거나 일어날 수 있는 온도 및 pH 범위 (각각의 최적값 포함)가 있다. 이러한 범위를 벗어나 사용하면 일반적으로 효소가 자신의 촉매 기능을 발현할 수 없거나 목적하는 정도로 발현할 수 없다. 이것은 예를 들어 비-호열성 효소를 사용하는 42℃를 상회하는 온도와 실질적으로 산성이거나 명확히 염기성인 pH 값에서 자주 발생한다. 따라서 효소 공정에서의 한 가지 난제는 항상, 온도 및 pH가 공정 조건에 적합하도록 효소를 올바르게 선택하거나 변형하는 것에 있다.
본 발명의 주요 목적은 제제 중의 아크릴아미드 함량을 처리 전 제제와 비교하여 바람직하게는 적어도 80 중량%까지 감소시킬 수 있는, 아크릴아미드를 함유하는 제제의 처리를 위한 적합한 효소 및 방법을 제공하는 것이며, 여기에서 효소는 바람직하게는, 예를 들어 식품 및 고급 식품의 데우기, 프라잉, 로스팅 단계 후의 지배적인 온도와 같은 고온에서도 및/또는 pH 4 내지 pH 7의 pH 값에서 자신의 효소 활성을 유지하고/하거나 높은 안정성을 보인다. 본 발명의 기초가 되는 추가 목적은 하기 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 유래한다.
본 발명의 과제는 이 역시도 다수의 아미다제에 호적하지 않은 온도 및 pH 값에서, 제제 중의 아크릴아미드의 양을 사실상 현저히 감소시킬 수 있는 효소 (본원에 및 특히 특허청구범위에 기재된 바와 같은), 바람직하게는 아미다제를 제공함으로써 일차적으로 해결된다.
또한, 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명은 50℃ 이상의 온도까지 및 (또한) pH 4 내지 pH 7의 pH 범위에서 촉매적으로 활성을 띠는 그러한 효소 (본원에 및 특히 특허청구범위에 기재된 바와 같은), 바람직하게는 아미다제에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 효소를 사용하여 제제 중의 아크릴아미드를 분해하는 적합한 방법 (본원에 및 특히 특허청구범위에 기재된 바와 같은), 및 아크릴아미드 함량이 감소된 제제의 제조 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 아크릴아미드 함량이 감소된 제제가 추가로 제공된다.
본 발명, 바람직하고 대안적인 실시양태 및 양태의 세부사항은 하기 설명, 첨부된 순서 및 특히 첨부된 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.
도 1은 서열번호 42 ("65"행) 및 서열번호 2 ("02"행)의 정렬을 도시한다: 동일성: 447/528 (84.7%), 유사성: 458/528 (86.7%), 갭: 41/528 (7.8%), 서열 커버리지: 507/513 (98.8%).
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 본 발명에 따른 효소의 아미노산 공통 서열을 기재한다.
서열번호 2는 슈도노카디아 써모필라로부터의 야생형 아미다제의 아미노산 서열 (본 발명에 따른 것이 아님)을 기재한다.
서열번호 3은 서열번호 2와 비교하여 68번 위치에 돌연변이 (D68N)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 4는 서열번호 2와 비교하여 74번 위치에 돌연변이 (A74Y)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 5는 서열번호 2와 비교하여 445번 위치에 돌연변이 (G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 6은 서열번호 2와 비교하여 33번 위치에 돌연변이 (S33F)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 7은 서열번호 2와 비교하여 33번 위치에 돌연변이 (S33R)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 8은 서열번호 2와 비교하여 445번 위치에 돌연변이 (G445S)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 9는 서열번호 2와 비교하여 33, 74, 445 및 453번 위치에 4개의 돌연변이 (S33R, A74Y, S225T, G445S, A453C)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 10은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 445 및 453번 위치에 5개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445S, A453C)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 11은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225 및 445번 위치에 5개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 12는 서열번호 2와 비교하여 68, 74, 445 및 453번 위치에 4개의 돌연변이 (D68N, A74Y, G445S, A453C)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 13은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74 및 225번 위치에 4개의 돌연변이 (S33H, D68N, A74Y, S225T)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 14는 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448, 453 및 507번 위치에 12개의 돌연변이 (S33R, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D, A507P)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 15는 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448, 453 및 507번 위치에 11개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, V94I, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D, A507P)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 16은 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 및 453번 위치에 11개의 돌연변이 (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453D)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 17은 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 201, 225, 424, 445 및 448번 위치에 9개의 돌연변이 (S33R, W41Y, D68N, A74Y, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 18은 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448, 453 및 507번 위치에 12개의 돌연변이 (S33R, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453C, A507P)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 19는 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 및 453번 위치에 11개의 돌연변이 (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453N)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 20은 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 및 453번 위치에 11개의 돌연변이 (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453Q)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 21은 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 및 453번 위치에 11개의 돌연변이 (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453E)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 22는 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 94, 201, 225, 424, 445, 448 및 453번 위치에 11개의 돌연변이 (S33Y, W41Y, D68N, A74Y, V94I, Y201F, S225T, L424V, G445A, M448H, A453K)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 23은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 445 및 454번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, P454N)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 24는 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 445 및 457번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, V457G)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 25는 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 424 및 445번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, L424V, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 26은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 445 및 453번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453D)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 27은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225 및 445번 위치에 5개의 돌연변이 (S33Y, D68N, A74Y, S225T, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 28은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 175 및 445번 위치에 5개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G175A, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 29는 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 445 및 507번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A507P)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 30은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 445 및 453번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453S)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 31은 서열번호 2와 비교하여 위치 33, 68, 74, 94, 225 및 445에서 6개의 돌연변이를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다. 2(S33R, D68N, A74Y, V94I, S225T, G445A).
서열번호 32는 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 317 및 445번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, V317I, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 33은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 201, 225 및 445번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, Y201F, S225T, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 34는 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 445 및 448번 위치에 5개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, M448H)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 35는 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 445 및 453번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445A, A453R)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 36은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 221, 225 및 445번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, P221G, S225T, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 37은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 217, 225 및 445번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, T217R, S225T, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 38은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 328 및 445번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, D328R, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 39는 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225 및 445번 위치에 5개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, G445S)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 40은 서열번호 2와 비교하여 33, 68, 74, 225, 229 및 445번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, D68N, A74Y, S225T, L229C, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 41은 서열번호 2와 비교하여 33, 41, 68, 74, 225 및 445번 위치에 6개의 돌연변이 (S33R, W41Y, D68N, A74Y, S225T, G445A)를 함유하는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 42는 WO 2004/083423에서 "서열번호 3"으로 개시된 바와 같은 슈도노카디아 써모필라의 단백질 서열에 해당한다.
본 발명의 제1 양태에서, 서열번호 1에 따른 아미노산 공통 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 제제 중의 아크릴아미드의 양을 감소시키는 효소가 제공되며, 여기에서 아미노산 공통 서열은 서열번호 2에 따른 서열이 아니며, 효소는 서열번호 3 내지 서열번호 41에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
전술한 바와 같이, 서열번호 1은 본 발명에 따른 효소의 아미노산 공통 서열을 기술한다. 공통 서열은 본 발명에 따른 모든 효소가 보유하는 아미노산 서열을 기술한다. 가변 위치는 Xaa로 표시되며 본 발명에 따른 효소가 상호 상이할 수 있는 위치를 나타낸다.
효소는 특정 화학 반응을 촉매하는 생물학적 촉매이다. 이 경우, 아미다제에 의한 아크릴아미드의 분해에서, 아크릴아미드의 아미드 결합이 가수분해적으로 절단되어 아크릴산과 암모니아를 형성한다. 아크릴산과 암모니아 또는 해당되는 경우 이들에서 기인하는 물질 (아크릴산 또는 암모니아의 추가 반응의 경우에)의 농도는 커피 조제시에 너무 낮아 최종 사용자에게 부정적인 영향을 미치지 않는다. 예를 들면, 암모니아는 즉시 반응하여 무해한 암모늄을 형성하며, 이는 최종 제품에 영향을 미치지 않는다.
본 개시가 백분율로 나타낸 아미노산 서열의 서열 동일성을 언급할 때마다, 그러한 언급은 핵산 서열에 대해서는 EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Nucleotide) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html) 또는 아미노산 서열에 대해서는 EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (Protein) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/)를 사용하여 산출될 수 있는 값을 말한다. European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Institute (EBI)에서 제공하는 국소 서열 정렬 툴의 경우, 수정된 Smith-Waterman 알고리즘이 사용된다 (참조: http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ 및 Smith, T.F. & Waterman, M.S. "Identification of common molecular subsequences" Journal of Molecular Biology, 1981 147 (1):195-197). 또한, 여기에서 수정된 Smith-Waterman 알고리즘을 사용하여 두 서열의 각 쌍별 정렬을 수행하는 경우, 현재 EMBL-EBI에서 제공하는 디폴트 매개변수를 참조한다. 이들은 (i) 아미노산 서열의 경우: 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 개방 페널티 = 10 및 갭 확장 페널티 = 0.5, 및 (ii) 핵산 서열의 경우: 매트릭스 = DNAfull, 갭 개방 페널티 = 10 및 갭 확장 페널티 = 0.5이다. 디폴트 매개변수 외에도, 관심 서열 ("질의 서열 (query sequence)", EMBOSS의 경우 제1 서열)을 참조 서열("대상 서열 (subject sequence) ", EMBOSS의 경우 제2 서열)과 정렬하는 경우, 대상 서열은 단일 정렬의 길이에 대해 적어도 93%를 나타내야 하며 ("서열 커버리지" 적어도 93%); 대상 서열의 더 낮은 서열 커버리지를 갖는 정렬은 본 출원의 목적을 위한 서열 동일성을 결정하기 위해 제외된다. 다만 질의 서열은 정렬의 길이보다 길 수도 있으며, 질의 서열의 정렬에서 표시되는 서열은 93%를 상회할수도 또는 하회할 수도 있다. 예를 들면, 질의 서열로서 서열번호 56을 대상 서열로서 서열번호 2와 정렬시 대상 서열의 총 513개 아미노산 중 507개 아미노산이 발생하며 (도 1); 따라서 서열 커버리지는 507/513 (98.8%)이다.
용어 "서열 동일성"은 따라서 본 발명의 맥락에서 "서열 상동성"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 후자의 "서열 상동성"이란 항상 서열 동일성 또는 서열 상동성이 결정되는 효소의 총 길이와 비교하여 본 발명에 따른 효소의 총 길이를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 제제는 예를 들어 프라이드 또는 딥-프라이드 감자 제품, 로스팅된 시리얼 또는 로스팅된 시리얼을 함유하는 제품, 옥수수 제품, 커피 제품, 예를 들면 고체 또는 액체 커피 추출물 및 생커피, 치커리 추출물, 시리얼 커피 제품, 커피 대용 제품, 스낵, 밀 제품, 화장품, 베이커리 제품 또는 패스트리, 예를 들면 쿠키, 비스킷, 러스크, 시리얼 바, 스콘, 아이스크림 콘, 와플, 크럼펫, 진저 브레드, 크리스프 브레드 및 빵 대용품, 파스타, 쌀, 어류 제품, 육류 제품, 시리얼, 맥주, 견과류, 어린이와 유아를 위한 보조 식품, 헤어 스타일링 제품, 개인 위생 제품, 헤어 케어 제품, 및 페이셜 케어 제품을 비롯한 로푸드(raw food), 반제품 식품 또는 완제품 식품, 고급 식품 또는 화장품을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명에 따른 효소는 서열번호 2에 따른 서열을 포함하거나 이로 구성되지 않는다. 서열번호 2는 본 발명에 따른 효소가 유래하는 슈도노카디아 써모필라로부터의 야생형 효소의 아미노산 서열을 기술한다.
서열번호 2에 따른 아미노산 서열의 상동성 모델, 즉 슈도노카디아 써모필라로부터의 야생형 효소의 상동성 모델을 구축하였다. 이를 위해 YASARA 구조 버전 20.10.4.L.64 소프트웨어가 동봉된 매크로 hm_build.mcr과 함께 사용되었다. 디폴트 설정은 유지시켰다. 결정 구조 3A1K, 3A1I, 3IP4 및 2GI3 (https://www.rcsb.org/)이 최종 상동성 모델을 위한 주형으로 사용되었으며, 이는 주로, 동종이량체로서 촉매적 활성 형태로 존재하는 로도코커스 종 (Rhodococcus sp.) N-771로부터의 아미다제에 기초하는 동종이량체 구조 3A1K를 기반으로 한다 (https://www.rcsb.org/structure/3a1k). 어떠한 과학적 이론에도 구속됨 없이, 서열번호 2에 따른 아미노산 서열, 즉 슈도노카디아 써모필라로부터의 야생형 효소는 타입 PDB 3A1K의 접힘 구조를 갖는다고 생각된다. 촉매성 세린 (194)의 알파-C 원자에 대해 하기 아미노산 잔기는 다음과 같은 공간적 거리를 갖는다. A74 (17.1Å), D68 (21.0Å), A507 (23.2Å), G445 (10.6Å), L424 (11.6Å) 및 S33 (21.8Å). 그 중 하기 잔기는 다음과 같은 공간적 거리를 갖는다. G445 - L424 (13.1Å), G445 - S33 (12.0Å), D68 - A74 (8.3Å), D68 - A507 (16.0Å). 따라서 반경이 약 13Å인 G445 주변의 공간 구 안에 활성 중심과 L424 및 S33이 있다. 잔기 D68과 A74는 (두 아미노산의 기하학적 중심으로부터) 반경이 4.2Å인 공간 구 또는 A74의 C-알파 원자에서 시작하여 반경이 6.5Å인 공간 구 내의 루프 구조에 있다. 모든 거명된 거리는 아미노산의 C-알파 원자를 참조한다.
또한, 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 맥락에서, 일반적으로 슈도노카디아 써모필라로부터의 야생형 효소를 사용할 필요가 없다. 즉, 바람직한 일 실시양태에 따르면, 서열번호 1에 따른 서열은 서열번호 2에 따른 서열이 아닐 뿐만 아니라, 일반적으로 슈도노카디아 써모필라로부터의 야생형 아미다제의 서열도 아니다.
슈도노카디아 써모필라로부터의 다른 (열안정성) 아미다제가 예를 들면 EP 1608746 B1에 기재되어 있지만, 이들은 본 발명에 따른 효소가 아니다. 더욱이, EP 1608746은 여기에 기술된 효소가 본 발명의 의미에서, 특히 본원에 기술된 바와 같은 온도 및/또는 pH 조건이 아닌 조건하에서 식품 또는 고급 식품 부문에서 유리하게 사용될 수 있음을 입증해 보여주고 있지 않다.
본 발명에 따른 효소는 야생형 효소로부터 출발하여 (바람직하게는 방향성 돌연변이 또는 대안적으로 비-방향성 돌연변이, 또는 방향성 및 비-방향성 돌연변이의) 하나 이상의 단계를 수행함으로써 수득될 수 있다. 방향성 돌연변이는 효소 유전자의 하나 이상의 DNA 염기의 표적화된 변경으로, 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 표적화된 효과를 초래한다. 이와는 대조적으로, 비-방향성 돌연변이는 정밀하게 선택되지 않은 전체 DNA 서열의 일부에서의 무작위 돌연변이유발이다. 비-방향성 돌연변이유발 후 생성된 단백질을 검사하여 목적하는 특성이 있는지 밝힌다. 변형될 효소는 야생형 효소일 수 있다. 이는 본 발명에 이르게 한 고려 및 조사의 경우였다. 본 발명의 맥락에서, 야생형 효소는 기능성 효소 또는 이의 서열로서 자연에서 단리된 기술적으로 변형되지 않은 자연 발생 효소로 이해되며, 그 점에서 그 서열 및 따라서 그 기능성 효소도 인간의 손으로 변형되지 않는다. 일 실시양태에서, 효소는 반복적인 비-방향성 돌연변이유발의 생성물일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 효소는 반복적인 방향성 돌연변이유발의 생성물일 수 있다.
본 발명의 기초가 되는 연구 과정에서, 야생형 효소로부터 시작하여 2000개를 넘는 상이한 돌연변이체가 생성되었으며, 이들 모두는 효소 유전자의 상이한 부위에서 상이한 돌연변이를 갖는다. 이들 돌연변이체를 이어서 상이한 pH 값 및 온도에서 활성 및 안정성에 대해 시험하였다. 이로부터, 추가 돌연변이유발 단계에서, 효소는 야생형 효소와 비교하여 증가된 활성 및 안정성이 초래되는 방식으로 변형될 수 있다. 촉매 작용과 관련된 아미노산 잔기는 돌연변이되지 않았으며, 특히 95번 위치의 라이신, 170번 위치의 세린 및 194번 위치의 세린으로 구성된 효소의 촉매 삼잔기는 돌연변이되지 않았다.
본 발명의 맥락에서, 이는 다음과 같은 점에서 일반적으로 본 발명에 따른 효소에 적용되는데, 본 발명에 따른 효소의 아미노산 서열에 있어서 이들 3개 위치 중 하나, 여러 개 또는 모두, 바람직하게는 모두가 돌연변이되지 않으며, 각각 본원에 기재된 본 발명에 따른 서열의 95번 위치에서는 바람직하게는 라이신이고/이거나 본원에 기재된 본 발명에 따른 서열의 170번 위치에서는 바람직하게는 세린이고/이거나 본원에 기재된 본 발명에 따른 서열의 194번 위치에서는 바람직하게는 세린이며, 바람직하게는 95번 위치에서는 라이신이고, 170번 위치에서는 세린이며, 194번 위치에서는 세린이다.
본 발명의 맥락에서, 활성이란 단위 시간당 아미드 결합의 가수분해적 절단을 촉매하는 효소의 능력을 말하며, 반면에 안정성이란 pH 및 온도와 같은 다양한 환경 조건하에서 일정 시간 후 효소의 잔류 활성을 정의한다. 적합한 돌연변이유발 방법 및 필요한 조건과 시약은 당업자에게 충분히 알려져 있다. 돌연변이는 예를 들어 염기의 대체 (치환), 제거 (결실) 또는 부가를 통해 유전자 수준에서 발생한다. 이들 돌연변이는 생성된 단백질의 아미노산 서열에 상이한 영향을 미친다. 치환의 경우, 소위 "넌센스" 돌연변이가 발생할 수 있으며, 그리하여 단백질 생합성이 조기에 중단되고 생성된 단백질이 기능장애로 남게 된다. 소위 "미스센스" 돌연변이에서는 코딩된 아미노산만이 변경되며; 이들 돌연변이는 생성된 단백질의 기능적 변화로 귀결되고 최상의 경우에는 생성된 단백질의 향상된 안정성 또는 활성을 초래할 수도 있다. 일반적인 명명법에서, 아미노산 치환 돌연변이는 예를 들어 A143G와 같이 위치와 치환된 아미노산에 기초하여 명명된다. 이 표기는 N-말단 ® C-말단 아미노산 서열의 143번 위치에서 아미노산 알라닌이 구아닌으로 교체되었음을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 아미노산 서열 (즉, 본 발명에 따른 효소에 포함되거나 본 발명에 따른 효소를 구성하는 아미노산 서열로서, 서열번호 1에 따른 서열 또는 서열번호 1에 따른 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기에서 아미노산 서열은 서열번호 2에 따른 서열이 아님)은 적어도 33, 41, 68, 74, 94, 175, 201, 217, 221, 225, 229, 317, 328, 424, 445, 448, 453, 454, 457 및 507번 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 하나, 그 이상 또는 모든 위치에 서열번호 2에 따른 아미노산 서열의 대응하는 위치(들)의 아미노산에 해당하지 않는 아미노산을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 33, 68, 74, 201, 225, 424, 445, 448 및 453번 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 위치 중 하나, 그 이상 또는 모두에 서열번호 2에 따른 아미노산 서열의 대응하는 위치(들)의 아미노산 이외의 아미노산을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은
33번 위치에서 아르기닌 또는 티로신 또는 히스티딘 또는 페닐알라닌, 및/또는
41번 위치에서 티로신, 및/또는
68번 위치에서 아스파라긴, 및/또는
74번 위치에서 티로신, 및/또는
94번 위치에서 이소류신, 및/또는
175번 위치에서 알라닌, 및/또는
201번 위치에서 페닐알라닌, 및/또는
217번 위치에서 아르기닌, 및/또는
221번 위치에서 글리신, 및/또는
225번 위치에서 트레오닌, 및/또는
229번 위치에서 시스테인, 및/또는
317번 위치에서 이소류신, 및/또는
328번 위치에서 아르기닌, 및/또는
424번 위치에서 발린, 및/또는
445번 위치에서 아르기닌 또는 세린, 및/또는
448번 위치에서 히스티딘, 및/또는
453번 위치에서 아스파르테이트 또는 시스테인 또는 아스파라긴 또는 글루타민 또는 글루타메이트 또는 라이신 또는 아르기닌 또는 세린, 및/또는
454번 위치에서 아스파라긴, 및/또는
457번 위치에서 글리신, 및/또는
507번 위치에서 프롤린을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은
33번 위치에서 아르기닌 또는 티로신, 및/또는
68번 위치에서 아스파라긴, 및/또는
74번 위치에서 티로신, 및/또는
201번 위치에서 페닐알라닌, 및/또는
225번 위치에서 트레오닌, 및/또는
424번 위치에서 발린, 및/또는
445번 위치에서 알라닌, 및/또는
448번 위치에서 히스티딘, 및/또는
453번 위치에서 아스파르테이트 또는 시스테인을 갖는다.
상기 기재된 위치의 바람직한 아미노산으로부터, 서열번호 2에 따른 야생형 서열 2에서 시작할 때 하기 바람직한 실시양태 또는 아미노산 치환이 발생한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 아미노산 서열은 S33R, S33Y, S33H, S33F로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환, 특히 바람직하게는 아미노산 치환 S33R 또는 S33Y를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 W41Y를 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 D68N을 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 A74Y를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 V94I를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 G175A를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 Y201F를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 T217R을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 P221G를 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 S225T를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 L229C를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 V317I를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 D328R을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 L424V를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 G445A 및 G445S로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환, 바람직하게는 아미노산 치환 G445A를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 M448H를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 A453D, A543C, A453N, A453Q, A453E, A453K, A453R, 및 A453S로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환, 특히 바람직하게는 아미노산 치환 A453D 또는 A453C를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 P454N을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 V457G를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 치환 A507P를 갖는다.
본 텍스트로부터, 당업자에게는 본원에 기재된 아미노산 치환 중 하나 이상, 특히 상기 기재된 것들, 또는 바람직하게는 각각의 위치에 존재하는 아미노산이 본 발명에 따른 효소를 수득하기 위해 임의의 목적하는 방식으로, 필요한 경우 본원에 기재되지 않은 추가 치환 또는 서열번호 1에 따른 아미노산 이외의 아미노산과 조합하여 서로 조합될 수 있다는 것이 당연하다 (이 점에서, 본 발명에 따라 기술된 "서열번호 1에 따른 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성" 참조). 본 발명의 맥락에서, 그러한 아미노산 치환은 여기에서는 기능적 영역 외부, 특히 촉매적 (상기 참조) 영역 외부에 있는 것이 바람직하다.
식품 생산 공정에서의 다른 효소(본 발명에 따른 것이 아님)의 용도에 대하여 WO 2006/040345에서 이미 언급했지만, 거기에서는 아크릴아미드-감소 제품의 생산에서의 이들의 효과를 증명해 보이는 것은 불가능했다. 또한, 본 발명에 따른 효소로는 제제 중의 아크릴아미드를 효율적으로 신속하게 분해하는 것이 가능하다. 이는 식품 및 고급 식품 산업에서와 같은 연속 또는 반연속 대규모 공정에서 특히 유리한데, 이는 효소 처리에서 짧은 체류 시간과 부패하기 쉬운 반제품의 신속한 추가 처리를 보장해 주기 때문이다. 매우 바람직하게는 및 유리하게는, 아크릴아미드의 분해가 안전하고 무해한 최종 식품을 수득하기 위한 필수 공정이므로, 본 발명에 따른 효소는 커피 제품/커피 대용품 생산에 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 효소는 아미다제이다. 아미다제 또는 아미도히드롤라제는 아미드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소의 일 부류이다. 아미다제는 자연계에서 많이 발생하며 세제 및 가정용 세제와 같은 기존 제품에 사용된다. 적어도 하나의 아미다제의 사용이 본 발명의 맥락에서 유리한 것으로 나타났는데, 이는 부가적인 제제 또는 보조인자를 필요로 하지 않는 매우 간단한 메커니즘에 의해 아크릴아미드의 아미드 결합을 절단하기 때문이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 효소는 50℃ 이상의 온도까지, 바람직하게는 적어도 60℃의 온도까지, 보다 바람직하게는 적어도 70℃의 온도까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80℃의 온도까지 촉매적으로 활성인 것이 적합하고, 및/또는 본 발명의 맥락에서는 이러한 온도에서 사용된다. 본 발명의 맥락에서, 촉매 활성이란 아크릴아미드의 아미드 결합의 검출가능한 절단이 일어나는 것을 의미한다. 내열성이 아닌 대부분의 단백질 및 효소는 42℃를 상회하는 온도에서 그들의 활성을 상실하므로 80℃까지의 온도에서의 활성이 본 발명의 맥락에서 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 효소의 도움으로, 유리하게도 80℃까지의 온도에서도 효소의 촉매 활성을 수득하는 것이 가능하다. 이러한 고온은 식품 및 고급 식품 부문에서의 수많은 공정에 요구되는데, 중요한 조리, 데우기 및 가공 공정이 50℃를 상회하는 온도, 경우에 따라서는 80℃ 이상까지의 온도에서 일어나기 때문이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 효소는 pH 4 내지 pH 7의 범위에서 촉매 활성을 나타내는 것이 적합하고 및/또는 본 발명의 맥락에서는 이러한 pH 범위에서 사용된다. 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 효소는 (적어도) pH 4 내지 pH 6.5의 범위, 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 5.5의 범위에서 촉매 활성을 나타낸다. 물론, 효소는 또한 이러한 pH 범위 밖에서도 촉매 활성을 나타낼 수 있거나 본 발명의 범위 내에서 이러한 범위에서 사용될 수 있다. pH는 효소의 안정성과 활성에 중요한 역할을 한다. 최적 pH를 상회하거나 하회하는 pH는 일반적으로 활성의 부분적 상실 내지는 완전한 상실을 초래한다. 따라서, 본 발명에 따른 효소가 약산성 pH를 띠는 제제에 아크릴아미드 분해 단계에서 효율적으로 사용될 수 있다는 것은 더욱 놀라운 일이다.
일 실시양태에서, 효소는 적어도 24시간, 바람직하게는 적어도 48시간, 보다 바람직하게는 적어도 72시간 동안, 50℃ 이상의 온도까지, 바람직하게는 적어도 60℃의 온도까지, 더 바람직하게는 적어도 70℃의 온도까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80℃의 온도까지, (적어도) pH 4 내지 pH 7의 범위, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 6.5의 범위, 보다 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 5.5의 범위에서 촉매 활성을 나타낸다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 효소는 50℃ 이상의 온도까지, 바람직하게는 적어도 60℃의 온도까지, 더 바람직하게는 적어도 70℃의 온도까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80℃의 온도까지, (적어도) pH 4 내지 pH 7의 범위, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 6.5의 범위, 보다 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 5.5의 범위에서 촉매 활성을 나타낸다. 물론, 효소는 또한 언급된 온도까지 이러한 pH 범위 밖에서 촉매 활성을 나타낼 수 있고 그에 따라 이러한 범위에서 사용될 수 있다.
본 발명의 기초가 되는 조사와 관련하여, 촉매 활성이 산성 pH 범위 및 고온에서도 존재하거나 유지되는 효소를 동정하는 것이 놀랍게도 가능하였다. 이러한 효소의 사용은 커피/커피 대용품 제조에서 아크릴아미드의 분해를 위한, 예를 들면 로스팅된 커피/커피 대용품으로부터의 추출물의 처리를 위한 사용에서 매우 특히 유리하다. 추출 후, 이러한 제제의 온도는 50℃를 상회하고, 종종 심지어 70℃를 상회하거나 또는 심지어 80℃를 상회한다. 이러한 추출물은 약산성 pH를 띤다는 것이 잘 알려져 있다. 천연 효소는 종종 이러한 조건하에서 충분한 촉매 활성을 나타내지 않는다. 따라서 이러한 조건 하에서 아크릴아미드를 효율적으로 분해하기 위해 이러한 제제에서 본 발명에 따른 효소를 사용하는 것이 보다 더 유리하다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 효소는 서열번호 3 내지 서열번호 41에 따른 서열로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22에 따른 서열로부터, 특히 바람직하게는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22에 따른 서열로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 효소는 슈도노카디아 써모필라로부터의 변형된 아미다제이다. 슈도노카디아 써모필라 유기체는 배설물 더미, 온천 등과 같은 다소 더운 온도 환경에 분포하는 것을 특징으로 한다. 당해 유기체는 내열성 원핵 생물에 속하며; 40℃ 내지 50℃의 온도에서 생장할 수 있다. 보다 온난한 환경에의 적응에 기인하여, 유기체의 효소 역시도 보다 내열성이지만, 야생형으로부터 시작하여 50℃를 상회하지 않는다. 슈도노카디아 써모필라는 태생적으로 내산성이 아니기 때문에 산성 pH 범위에서의 내성이 슈도노카디아 써모필라 유기체의 효소에서 시작하여 달성될 수 있다는 것은 놀라운 일이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기 단계로 이루어지거나 이들 단계를 포함하는, 아크릴아미드를 분해하는, 바람직하게는 제제 중 아크릴아미드의 양을 감소시키는 방법에 관한 것이다:
(i) 본 발명의 효소를 제공하는 단계 (본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 본원에 바람직하거나 특히 유리한 것으로서 기재된 바와 같이),
(ii) 아크릴아미드를 함유하는 혼합물, 바람직하게는 제제를 제공하고 단계 (i)의 효소를 첨가하는 단계,
(iii) 단계 (ii)로부터 생성된 혼합물을 적어도 20분 동안, 바람직하게는 40℃ 내지 80℃ 범위의 온도, 더욱 바람직하게는 45℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 단계,
(iv) 임의로, 바람직하게는 적어도 90℃의 온도로 가열하고 적어도 15분 동안 90℃를 상회하는 온도를 유지함으로써 효소의 불활성화가 일어나도록 단계 (iii)으로부터 생성된 인큐베이션된 혼합물을 가열하고, 임의로 혼합물을 냉각시켜 단계 (ii)에서 제공된 혼합물 또는 제제에 비해 보다 낮은 아크릴아미드 함량을 갖는 생성물을 수득하는 단계.
본 발명의 의미에서 인큐베이션이란 단계 (ii)로부터의 제공된 혼합물이 소정 시간 동안 일정 온도에서 잔류함을 의미한다. 본 발명의 의미에서 온도를 유지한다는 것은 단계 (iii)에서의 인큐베이션된 혼합물의 온도가 정의된 기간 동안 변하지 않거나 현저하게 변하지 않는다는 것을 의미한다. 온도의 사소한 변동은 이와 관련하여 허용 가능하며 당업자에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 효소는 당업자에게 익숙한 적합한 발현 유기체 및 조건으로 재조합적으로 생산될 수 있다. 또한, 효소는 용해물로서 정제되지 않은 상태로, 부분적으로 정제된 또는 고도로 정제된 상태로 존재할 수 있다. 적합한 정제 공정은 당업자에게 알려져 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 효소는 용액으로서 존재하거나 고정화될 수 있다. 적합한 고정화 공정은 당업자에게 충분히 알려져 있다.
불활성화란 극고온에 의해 초래된 효소의 활성 상실 또는 효소의 아미노산 사슬의 풀림을 말한다. 또 다른 실시양태에서, 불활성화된 효소는 이어서 여과, 흡수 또는 흡착과 같은 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제제로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 방법의 일 실시양태에서, 초기에 제공된 혼합물 또는 제제에 함유된 아크릴아미드는 마이야르 반응의 생성물이다. 마이야르 반응은 예를 들면 식품의 딥-프라잉 또는 프라잉 중에 관찰될 수 있으며 전형적인 갈변으로 나타난다. 마이야르 반응은 전형적인 로스팅 맛을 수득하기 위해 커피 제품을 로스팅할 때도 불가피하다. 마이야르 반응의 생성물은 아크릴아미드이며, 이는 본 발명의 효소를 사용하여 본 발명의 공정 과정에서 절단된다.
본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 제공된 제제의 함유된 아크릴아미드는 마이야르 반응의 생성물이고 제제는 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제, 또는 그러한 제제의 조제를 위한 반제품이며, 바람직하게는 여기에서 제제는 프라이드 또는 딥-프라이드 감자 제품, 로스팅된 시리얼 또는 이를 함유하는 제품, 옥수수 제품, 커피 제품, 예를 들면 고체 또는 액체 커피 추출물 및 생커피, 치커리 추출물, 시리얼 커피 제품, 커피 대용품, 스낵, 밀 제품, 화장품, 베이킹 제품 및 패스트리, 예를 들면 비스킷, 쿠키, 러스크, 시리얼 바, 스콘, 아이스크림 콘, 와플, 크럼펫, 진저 브레드, 크리스프 브레드 및 빵 대용 제품, 파스타, 쌀, 어류 제품, 육류 제품, 시리얼, 맥주, 견과류, 어린이와 유아를 위한 보조 식품, 헤어 스타일링 제품, 개인 위생 제품, 헤어 케어 제품, 및 페이셜 케어 제품으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
반제품과 완제품의 차이는 가공 정도에 있다. 반제품은 추가 가공 단계에 투입되는 모든 제품이다. 반제품으로는 예를 들면, 로스팅된 커피 추출물, 반죽, 생커피, 감자 제품 등이 될 수 있다. 반면에 완제품은 더 이상 가공되지 않고 그 형태로 포장되어 소비자에게 전달된다. 완제품의 예로는 인스턴트 커피, 즉시 사용할 수 있는 커피 분말, 칩, 면류 등이 있다.
본 발명의 방법의 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 수득된 생성물 중 아크릴아미드 함량은 각각의 경우 생성물의 총 중량을 기준으로 하여 < 2000 ㎍/kg, 바람직하게는 < 850 ㎍/kg, 특히 바람직하게는 < 500 ㎍/kg이다. 본 개시에서 ~미만 ("<")인 값이 언급될 때마다, 이러한 값의 범위는 - 가능한 한 및 유용한 한 - 바람직하게는 0도 포함한다. 예를 들면, < 2000 ㎍/kg 표시는 0 내지 2000 ㎍/kg에 이르는 값의 범위이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 아크릴아미드 함량은 본 발명에 따른 공정에 투입되지 않은 제제와 비교하여 60%, 바람직하게는 65%, 특히 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 특히 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 특히 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 및 매우 특히 바람직하게는 100% 감소될 수 있거나 감소된다.
본 발명의 또 다른 양태는 하기 단계로 구성되거나 그들 단계를 포함하는, 아크릴아미드 함량이 감소된 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제의 제조 방법에 관한 것으로, 바람직하게는 여기에서 제제는 프라이드 또는 딥-프라이드 감자 제품, 로스팅된 시리얼 또는 이를 함유하는 제품, 옥수수 제품, 커피 제품, 예를 들면 고체 또는 액체 커피 추출물 및 생커피, 치커리 추출물, 시리얼 커피 제품, 커피 대용 제품, 스낵, 밀 제품, 화장품, 베이킹 제품 또는 패스트리, 예를 들면 비스킷, 쿠키, 러스크, 시리얼 바, 스콘, 아이스크림 콘, 와플, 크럼펫, 진저 브레드, 크리스프 브레드 및 빵 대용 제품, 파스타, 쌀, 어류 제품, 육류 제품, 시리얼, 맥주, 견과류, 어린이와 유아를 위한 보조 식품, 헤어 스타일링 제품, 개인 위생 제품, 헤어 케어 제품, 및 페이셜 케어 제품으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
(I) (a) 본 발명에 따른 공정에 의해 수득된 생성물을 제공하는 단계 (본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 본원에 바람직하거나 특히 유리한 것으로서 기재된 바와 같이), 및
(b) 생성물을 추가 가공하고/하거나 하나 이상의 추가 성분을 첨가하여 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제를 수득하는 단계,
또는
(II) (i) 본 발명의 효소를 제공하는 단계 (본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 본원에 바람직하거나 특히 유리한 것으로서 기재된 바와 같이),
(ii) 아크릴아미드를 함유하는 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제를 제공하고 단계 (i)로부터의 본 발명의 효소를 첨가하는 단계,
(iii) 단계 (ii)로부터 생성된 제제를 적어도 20분 동안, 바람직하게는 40℃ 내지 80℃ 범위의 온도, 더욱 바람직하게는 45℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 단계,
(iv) 임의로, 바람직하게는 적어도 90℃의 온도로 가열하고 적어도 15분 동안 90℃를 상회하는 온도를 유지함으로써 효소의 불활성화가 일어나도록 단계 (iii)으로부터 생성된 인큐베이션된 제제를 가열하고, 임의로 인큐베이션된 제제를 냉각시켜 단계 (ii)에서 제공된 제제에 비해 보다 낮은 아크릴아미드 함량을 갖는 제제를 수득하는 단계. 본 발명에 따른 방법의 일 실시양태에서, 아크릴아미드 함량이 감소된 반제품을 최종 제품으로 추가 가공하여 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제를 수득한다. 추가 실시양태에서, 반제품을 본 발명에 따른 효소로 처리하여 아크릴아미드 함량이 감소된 제제를 수득한다. 당해 제제를 이어서 90℃를 상회하는 온도로 가열하여 효소를 불활성화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 불활성화된 효소는 이어서 여과, 흡수 또는 흡착과 같은 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제제로부터 제거될 수 있다.
추가 양태에 따르면, 본 발명은 아크릴아미드의 분해 및/또는 바람직하게는 각각의 경우 제제의 총 중량을 기준으로 하여 < 2000 ㎍/kg, 바람직하게는 < 850 ㎍/kg, 특히 바람직하게는 < 500 ㎍/kg의 감소된 아크릴아미드 함량을 갖는 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제의 제조를 위한 본 발명에 따른 효소의 용도에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 아크릴아미드 함량은 본 발명에 따른 효소가 사용되지 않은 제제와 비교하여 60%, 바람직하게는 65%, 특히 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 특히 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 특히 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 및 매우 특히 바람직하게는 100% 감소될 수 있거나 감소된다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명에 따른 공정에 의해 제조되거나 제조가능한 쾌락 또는 영양을 위한 제제, 또는 화장품 제제 (바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 제제)에 관한 것이며, 여기에서 아크릴아미드 함량은 각각의 경우에 제제의 총 중량을 기준으로 하여 < 2000 ㎍/kg, 바람직하게는 < 850 ㎍/kg, 특히 바람직하게는 < 500 ㎍/kg이다 (및/또는 여기에서 아크릴아미드 함량은 상기 기재된 바와 같이, 바람직하게는 바람직한 것으로 상기 기재된 바와 같이 감소된다).
본 발명을 선택된 비-제한적 실시예의 도움으로 이하에서 보다 상세히 설명하기로 한다.
실시예
1. 커피 중의 아크릴아미드의 분해용 효소의 개발:
1.1 효소 제제의 제조
아미다제 및 그 변이체를 코딩하는 유전자를 발현 플라스미드 pLE1A17 (Novagen)에 클로닝시킨다. 대장균 BL21(DE3)의 세포를 이어서 이러한 플라스미드로 형질전환시킨다.
세포를 37℃에서 ZYM505 배지 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234)에서 카나마이신 (50 mg/l)을 첨가하여 배양하며, IPTG를 0.1mM 최종 농도로 하여 대수증식기에 도달하면 효소 발현이 유도된다. 세포를 유도 후 약 20시간 동안 30℃에서 추가로 배양한다.
세포를 원심분리에 의해 수확하고 용해 완충액 (50 mM 인산칼륨, pH 7.2; 2 mM MgCl2; 0.5 mg/mL 리소자임; 0.02 U/㎕ 뉴클리나제)에서 소화시킨다. 액체 질소에서의 다중 동결 및 해동에 의하여 또는 초음파에 의하여 소화를 기계적으로 수행하였다. 불용성 성분의 원심분리 및 분리 후, 가용성 효소-함유 조 추출물을 수득하였다.
1.2 효소 활성의 측정
아미다제 활성의 표준 측정을 위해, pH 5.5 및 40℃에서 아크릴아미드로부터 암모니아를 방출시킨다. 1 아미다제 단위는 40℃에서 50 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.5 중 25 mM 아크릴아미드로부터 분당 1 μmol 암모니아의 방출에 해당한다. 방출된 암모니아의 정량화는 예를 들어 Megazymes의 Rapid Ammonia Kit를 사용하여 수행하였다. U/mL로 주어진 활성은 광학 밀도 (600 nm에서 측정)가 100인 조 추출물의 mL를 말한다.
활성은 다른 pH 값 (pH 5.0) 및 온도 (50℃/60℃)에서 유사하게 측정된다. 표준 활성과 비교하여 변경된 매개변수는 별도로 표시된다.
1.3 효소 안정성의 측정
1.3.1 상이한 pH 값에서 Tm 값의 측정
아미다제의 온도 안정성을 기록하기 위해 Tm 50 값이 측정된다. 이를 위해, 효소를 함유하는 조 추출물을 50 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.5 내지 pH 5.5)에서 25℃ 내지 85℃ 범위의 상이한 온도에서 15분 동안 인큐베이션한다. 조 추출물을 이어서 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하고, 원심분리한 다음, 상층액을 사용하여 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 표준 조건하에서 활성 측정을 수행한다. 비-처리 샘플의 활성 값을 100%로 설정하고 다른 모든 값을 이 값으로 정규화한다. Tm 50 값은 효소가 여전히 50% 활성인 온도에 해당한다.
1.3.2 상이한 pH 값 및 온도에서의 안정성 측정
효소의 장기 안정성에 대한 연구를 위하여, 조 추출물을 특정 pH (예를 들면 pH 4.5 내지 5.5의 범위) 및 특정 온도 (예를 들면 50℃ 내지 75℃의 범위)에서 장기간 인큐베이션한다. 정기적인 샘플링이 24시간에 걸쳐서 수행되며, 이 동안 샘플은 100 mM NaAc 완충액 pH 5.5의 1 체적당량과 혼합하여 액체 질소에서 즉시 동결시킨다. 해동 후 샘플을 원심분리하고 상층액을 사용하여 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 표준 조건하에서 활성 측정을 수행한다. 퍼센트 잔류 활성은 인큐베이션 후 측정된 활성 값을 시간 0 h에서의 비-처리 샘플의 활성과 비교하여 산출되며, 여기에서 비-처리 샘플의 활성 값을 100%로 설정하고 인큐베이션 후 측정된 활성 값을 그에 대한 퍼센트 잔류 활성으로 부여한다.
1.4 효소 변이체의 검사
서열번호 2의 야생형 서열을 기반으로, 단일 돌연변이체를 생성하고 이들로부터 아미노산 치환의 선택을 조합하였다.
안정성 및 활성 측정의 결과 (표준 측정)
안정성 안정성 활성
Tm 50 [℃] Tm 50 [℃] 24시간 후 잔류활성 [%] pH 5.0, 40℃ pH 5.5, 40℃
서열번호 pH 5.0 pH 5.5 pH 5.0,
50℃		 pH 5.5,
60℃		 U/mL U/mL
2 33 51 0 0 41 69
3 n.d. 55 n.d. n.d. 50 87
4 n.d. 57 n.d. n.d. 45 87
5 n.d. 58 n.d. n.d. 45 85
6 n.d. 57 n.d. n.d. n.d. n.b
7 n.d. 54 n.d. n.d. 51 100
8 n.d. 52 n.d. n.d. 80 136
9 61 72 61 0 85 121
10 64 73 68 36 67 89
11 64 72 82 45 51 79
12 56 69 37 0 69 108
13 64 74 57 0 53 79
표에 데이터가 제공되지 않거나 용어 n.d. ("미정")가 사용되는 경우, 이들은 해당 효소 변이체에 대해 기록되지 않았다.
50℃를 상회하는 온도에서의 안정성, 및 고온과 산성 pH에서의 활성이 본 발명의 효소에 대해 달성될 수 있음을 알 수 있다.
추가 조사는 본 발명에 따른 효소, 특히 본원에 바람직한 것으로 기재된 효소가 또한 특히 도입을 통해 본원에 기재된 목적 및 요건에 특히 적합하다는 것을 밝혀냈다.
1.5 상이한 아미노산 치환 및 이들이 효소의 안정성과 활성에 미치는 영향에 대한 조사
서열번호 11의 효소를 주형으로 사용하여 그에 기초하여 단일 돌연변이체를 생성하였다. 개별 아미노산 치환은 효소의 활성과 안정성에 대해 상이한 효과를 나타낸다. 이 특성분석을 위해 안정성과 활성의 두 가지 기준에 따라 돌연변이체를 선택하였다. 각각의 특성은 치환된 아미노산과 그 위치에 따라 강력하게 좌우된다. 특히, 이들 연구는 (본원에 기재된 바와 같이) 본 발명에 따라 특히 적합한 효소로 귀결되었다.
서열번호 11의 효소 (본 발명에 따른 것이지만, 특별히 바람직하지는 않음)와 비교한 아미노산 치환의 결과. HIT 기준은 각 경우에 있어서 선택이 이루어진 특성을 기술한다. 이는 한편으로는 서열번호 11의 효소에 비하여 증가된 안정성이고, 다른 한편으로는 서열번호 11의 효소에 비하여 증가된 활성이다.
서열번호 11에 대한 치환 서열번호 Hit 기준 서열번호 11에 대한 [%] 상대 안정성 서열번호 11에 대한 [%] 상대 활성
P454N 23 안정성 226 58
V457G 24 안정성 216 49
L424V 25 안정성 213 65
A453D 26 안정성 198 77
S33Y 27 안정성 172 77
G175A 28 안정성 154 75
A507P 29 안정성 153 83
A453S 30 안정성 147 103
V94I 31 안정성 147 109
V317I 32 안정성 142 78
Y201F 33 안정성 135 100
- 11 주형 100 100
M448H 34 활성 51 186
A453R 35 활성 0 161
P221G 36 활성 0 150
T217R 37 활성 0 135
D328R 38 활성 15 133
G445S 39 활성 36 132
L229C 40 활성 0 130
W41Y 41 활성 68 130
1.6 돌연변이의 상이한 조합 및 이들이 효소 변이체의 활성과 안정성에 미치는 영향에 대한 조사.
서열번호 11부터 시작하여 여러 단일 돌연변이체를 생성하였으며, 아미노산 치환의 선택을 재조합 뱅크에서 조합하였다. 적합한 변이체의 선택을 이어서 안정성 및 활성에 대하여 스크리닝하였다.
아미노산 치환의 상이한 조합의 결과 및 이들이 본 발명에 따른 효소의 안정성과 활성에 미치는 영향
안정성 안정성 활성
　 Tm 50
[℃]		 Tm 50
[℃]		 Tm 50
[℃]		 18시간 후 잔류활성 [%] pH 5.5, 40℃
서열
번호		 pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 4.5, 60℃ pH 5.0, 70℃ U/mL
11 52 64 72 0 2 79
14 65 76 82 21 36 118
15 67 77 84 19 44 88
16 70 80 85 40 58 95
17 57 67 77 2 7 170
18 55 70 79 10 23 184
1.7 453번 위치에서의 포화 돌연변이유발
서열번호 16의 변이체에서 453번 위치에서의 모든 아미노산 치환을 조사하였다. 증가된 활성을 갖는 변이체가 수득되었으며, 이는 대장균에서의 가용성 발현이 향상된 결과이다. 효소의 안정성은 유지되었다.
포화 돌연변이유발의 결과 및 이들이 본 발명에 따른 효소의 안정성과 활성에 미치는 영향
안정성 안정성 활성
　 Tm 50 [℃] Tm 50 [℃] 22시간 후 잔류활성 [%] pH 5.5, 40℃
서열번호 pH 4.5 pH 5.0 pH 4.5, 60℃ pH 5.0, 70℃ U/mL
16 70 80 22 53 95
19 68 80 35 62 191
20 67 79 28 65 168
21 67 79 34 67 102
22 69 80 41 60 161
2. 본 발명에 따른 예시 제품의 생산:
2.1 아크릴아미드-감소 커피 제품의 생산 공정
2.1.1 커피 추출물의 생산
브라질 아라비카 커피 품종의 커피 콩을 Neuhaus Neotec Colortest II에 따라 110의 색상 값으로 로스팅한다. 145℃ 내지 230℃의 온도에서 커피 콩을 로스팅하면 아크릴아미드가 형성된다. 로스팅한 커피를 VT6 커피 그라인더 (Mahlkφnig)에서 레벨 13으로 분쇄시킨다. 분쇄된 커피를 먼저 추출 장치의 여과기에 부은 다음 온도가 85℃인 물 70 L를 채운다. 혼합물을 1시간 동안 팽윤하도록 놔둔다. 이어서 추출을 85℃에서 개시한다. 100 L의 물을 85℃ 및 6 bar 과압에서 여과기를 통해 수집 용기로 통과시킨다. 온수는 아크릴아미드를 비롯한 커피의 가용성 성분을 용해시킨다.
2.1.2 커피 추출물의 효소 처리
추출 후, 수득된 커피 추출물을 수집 용기에서 70℃의 온도로 가열하여 이 온도에서 유지시킨다. 본 발명에 따른 효소, 예를 들면, 서열번호 22에 따른 효소를 이어서 첨가한다. 효소는 1000 U/L의 효소 농도가 사용되는 양으로 첨가된다.
효소를 추출물에 첨가하고, 교반하고, 70℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 추출물을 15분 동안 95℃로 가열하여 아미다제를 불활성화한다. 추출물을 이어서 냉각시키고 동결 건조를 위해 준비시킨다.
커피 추출물의 pH에 따라, 아크릴아미드의 양과 관련하여 상이한 감소율이 달성된다. 사용된 효소의 양에 따라, 검출 한계 미만의 아크릴아미드 농도도 달성할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적은 경제적인 관점에서 커피 매트릭스에 사용하기에도 적합한 효소를 제공하는 것이었다. 예를 들면, 4.8의 pH와 1000 U/L의 사용된 효소에서 60%의 아크릴아미드 감소가 달성되었다. 5.3의 pH와 1000 U/L의 사용된 효소에서 90%의 아크릴아미드 감소가 달성되었다. 따라서 아크릴아미드 함량이 각각 554 ㎍/kg 및 129 ㎍/kg에 불과한 아크릴아미드-감소 제품이 각각 수득되었다.
2.1.3 효소 처리 후 커피 추출물의 추가 가공
추출 및 효소 처리 후, 커피 추출물을 동결 농축 또는 증발을 이용하여 농축시킨다. 농축은 추출 후 수득되는 추출물의 고형분 함량이 약 2 내지 6 중량%이므로 추출물 중의 고형분 함량을 증가시키기 위한 중간 단계이다. 유동층 건조의 경우, 적어도 20 중량%의 고형분 함량이 요구된다. 동결 건조의 경우, 고형분 함량이 높을수록 유리하지만 반드시 필요한 것은 아니다.
농축 추출물을 이어서 동결 건조 또는 유동층 건조에 의하여 건조시켜 아크릴아미드-감소 최종 생성물 (건조된 용해 커피)을 수득하며, 이는 일반적으로 약 96 중량%의 고형분 함량을 갖는다.
2.2 아크릴아미드-감소 커피 대용 제품의 제조 공정
커피 대용 제품으로서 예를 들면 치커리가 사용될 수 있다. 이를 위해서는 치커리 식물의 뿌리가 사용된다. 이것을 건조, 파쇄하여 150℃ 내지 200℃의 온도에서 커피처럼 로스팅한 다음 분쇄한다. 가용성의 아크릴아미드-감소 추출물을 수득하기 위한 추가 가공을 실시예 2.1.2에서 커피에 대해 기술한 것과 동일한 방식으로 수행한다.
건조된 가용성의 치커리 추출물은 최종 제품으로서 사용될 수 있거나 또는 예를 들면 시리얼 커피 또는 커피 믹스 제품을 위한 혼합 첨가제로서 사용될 수 있다.
3. 아크릴아미드 함량 및 아크릴아미드 감소의 측정:
아크릴아미드 감소는 특정 로스팅 커피의 샘플을 온수로 추출함으로써 측정된다. 추출물을 이어서 두 부분으로 나누고 한 부분만 아미다제로 처리하여 인큐베이션한다. 두 번째 부분은 아미다제의 첨가를 제외하고는 동일하게 처리되며 참조 샘플 역할을 한다. 인큐베이션 기간의 말미에, 효소를 안전하게 변성시키는 온도로 한 번 가열하여 반응을 중지시킨다. 두 추출물에서의 아크릴아미드 분석을 LC-MS/MS로 DIN EN ISO 18862에 따라 수행한다. 감소율은 처리 샘플과 참조 샘플에서의 아크릴아미드 함량으로부터 산출된다.
4. 관능 평가:
훈련된 관능 패널에 의한 상이한 커피 추출물 및 커피 대용품 추출물의 비교 관능 테스트 결과 비-처리 추출물과 처리 추출물 사이에 지각할 수 있는 관능적 차이가 없음이 밝혀졌다.
SEQUENCE LISTING <110> ANKA Angewandte Kaffeetechnologie GmbH <120> Enzymes for degradation of acrylamide <130> CA 2046-02WO <140> PCT/EP2021/051282 <141> 2021-01-21 <150> EP 20152853.6 <151> 2020-01-21 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (94)..(94) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (175)..(175) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (217)..(217) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (221)..(221) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (225)..(225) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (229)..(229) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (317)..(317) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (328)..(328) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (424)..(424) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (445)..(445) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (448)..(448) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (453)..(454) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (457)..(457) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (507)..(507) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Met Ser Ile His Met Pro Asp Pro Asp Ala Val Ala Arg Met Ala Ala 1 5 10 15 Glu Gly Arg Phe Gly Ile Pro Glu Ser Asp Leu Pro Thr Tyr His Ala 20 25 30 Xaa Val Thr Gly Leu Leu Gly Ser Xaa Asn Lys Val Glu Glu Leu Tyr 35 40 45 Ala Glu Val Ala Pro Thr Pro Pro Gln Arg Ser Trp Thr Arg Pro Asp 50 55 60 Ala Glu Asp Xaa Lys Leu Gly Ala Trp Xaa Val Gln Thr Ser Ile Thr 65 70 75 80 Glu Thr Ser Glu Gly Pro Leu Ala Gly Arg Thr Val Ala Xaa Lys Asp 85 90 95 Asn Val Ala Val Ala Gly Val Pro Met Met Asn Gly Ser Arg Thr Leu 100 105 110 Glu Gly Phe Val Pro Ala Glu Asp Ala Thr Val Val Ser Arg Leu Leu 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Thr Ile Ala Gly Lys Ser Val Cys Glu Asp Leu Cys 130 135 140 Phe Ser Gly Gly Ser His Thr Ser Lys Pro Gly Pro Val His Asn Pro 145 150 155 160 Trp Asp Met Ser Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser Xaa Ala 165 170 175 Leu Val Ala Ala Gly Glu Val Asp Met Ala Ile Gly Gly Asp Gln Gly 180 185 190 Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ser Ala Xaa Cys Gly Thr Val Gly His Lys 195 200 205 Pro Thr His Gly Leu Val Pro Tyr Xaa Gly Gly Phe Xaa Ile Glu Gln 210 215 220 Xaa Ile Asp His Xaa Gly Pro Ile Thr Arg Thr Val Ala Asp Ala Ala 225 230 235 240 Leu Met Leu Ser Val Ile Ala Gly Arg Asp Gly Leu Asp Pro Arg Gln 245 250 255 Pro Asp Val Val Glu Val Gln Asp Tyr Val Gly Ala Leu Ala Glu Ser 260 265 270 Val Ser Gly Leu Arg Ile Gly Val Leu Gln Glu Gly Phe Gly His Pro 275 280 285 Asn Ser Glu Pro Glu Val Asp Asp Thr Val Arg Ala Ala Val Gly Thr 290 295 300 Leu Arg Glu Ala Gly Phe Thr Val Glu Asp Val Ser Xaa Pro Trp His 305 310 315 320 Leu His Ala Thr Ala Ile Trp Xaa Val Ile Ala Thr Glu Gly Gly Leu 325 330 335 Trp Gln Met Val Glu Gly Asn Ala Tyr Gly Met Asn Trp Lys Gly His 340 345 350 Tyr Asp Pro Ser Leu Ile Ala Tyr Tyr Gly Arg Lys Trp Arg Glu Asp 355 360 365 Pro Ala Gln Phe Ser Glu Thr Val Lys Leu Val Ala Leu Ala Gly Arg 370 375 380 Tyr Ala Leu Thr Thr Gln Tyr Gly Arg His Tyr Ala Met Ala Arg Asn 385 390 395 400 Leu Ala Pro Lys Leu Val Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Leu Ser Asn Tyr 405 410 415 Asp Val Leu Val Met Pro Thr Xaa Pro Met Arg Ala Thr Val Leu Pro 420 425 430 Gly Pro Asp Ala Pro Val Glu Glu Ile Leu Ala Arg Xaa Leu Glu Xaa 435 440 445 Leu Ala Asn Thr Xaa Xaa Phe Asp Xaa Thr Gly His Pro Ala Cys Ser 450 455 460 Val Pro Ala Gly Leu Ala Asp Gly Leu Pro Val Gly Leu Met Ile Val 465 470 475 480 Gly Lys His Phe Asp Asp Ala Thr Val Leu Lys Val Ala Asn Ala Phe 485 490 495 Glu Gln Ala Val Gly Gly Phe Pro Thr Pro Xaa Glu Arg Ser Ser Ala 500 505 510 <210> 2 <211> 513 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila <400> 2 Met Ser Ile His Met Pro Asp Pro Asp Ala Val Ala Arg Met Ala Ala 1 5 10 15 Glu Gly Arg Phe Gly Ile Pro Glu Ser Asp Leu Pro Thr Tyr His Ala 20 25 30 Ser Val Thr Gly Leu Leu Gly Ser Trp Asn Lys Val Glu Glu Leu Tyr 35 40 45 Ala Glu Val Ala Pro Thr Pro Pro Gln Arg Ser Trp Thr Arg Pro Asp 50 55 60 Ala Glu Asp Asp Lys Leu Gly Ala Trp Ala Val Gln Thr Ser Ile Thr 65 70 75 80 Glu Thr Ser Glu Gly Pro Leu Ala Gly Arg Thr Val Ala Val Lys Asp 85 90 95 Asn Val Ala Val Ala Gly Val Pro Met Met Asn Gly Ser Arg Thr Leu 100 105 110 Glu Gly Phe Val Pro Ala Glu Asp Ala Thr Val Val Ser Arg Leu Leu 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Thr Ile Ala Gly Lys Ser Val Cys Glu Asp Leu Cys 130 135 140 Phe Ser Gly Gly Ser His Thr Ser Lys Pro Gly Pro Val His Asn Pro 145 150 155 160 Trp Asp Met Ser Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ala 165 170 175 Leu Val Ala Ala Gly Glu Val Asp Met Ala Ile Gly Gly Asp Gln Gly 180 185 190 Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ser Ala Tyr Cys Gly Thr Val Gly His Lys 195 200 205 Pro Thr His Gly Leu Val Pro Tyr Thr Gly Gly Phe Pro Ile Glu Gln 210 215 220 Ser Ile Asp His Leu Gly Pro Ile Thr Arg Thr Val Ala Asp Ala Ala 225 230 235 240 Leu Met Leu Ser Val Ile Ala Gly Arg Asp Gly Leu Asp Pro Arg Gln 245 250 255 Pro Asp Val Val Glu Val Gln Asp Tyr Val Gly Ala Leu Ala Glu Ser 260 265 270 Val Ser Gly Leu Arg Ile Gly Val Leu Gln Glu Gly Phe Gly His Pro 275 280 285 Asn Ser Glu Pro Glu Val Asp Asp Thr Val Arg Ala Ala Val Gly Thr 290 295 300 Leu Arg Glu Ala Gly Phe Thr Val Glu Asp Val Ser Val Pro Trp His 305 310 315 320 Leu His Ala Thr Ala Ile Trp Asp Val Ile Ala Thr Glu Gly Gly Leu 325 330 335 Trp Gln Met Val Glu Gly Asn Ala Tyr Gly Met Asn Trp Lys Gly His 340 345 350 Tyr Asp Pro Ser Leu Ile Ala Tyr Tyr Gly Arg Lys Trp Arg Glu Asp 355 360 365 Pro Ala Gln Phe Ser Glu Thr Val Lys Leu Val Ala Leu Ala Gly Arg 370 375 380 Tyr Ala Leu Thr Thr Gln Tyr Gly Arg His Tyr Ala Met Ala Arg Asn 385 390 395 400 Leu Ala Pro Lys Leu Val Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Leu Ser Asn Tyr 405 410 415 Asp Val Leu Val Met Pro Thr Leu Pro Met Arg Ala Thr Val Leu Pro 420 425 430 Gly Pro Asp Ala Pro Val Glu Glu Ile Leu Ala Arg Gly Leu Glu Met 435 440 445 Leu Ala Asn Thr Ala Pro Phe Asp Val Thr Gly His Pro Ala Cys Ser 450 455 460 Val Pro Ala Gly Leu Ala Asp Gly Leu Pro Val Gly Leu Met Ile Val 465 470 475 480 Gly Lys His Phe Asp Asp Ala Thr Val Leu Lys Val Ala Asn Ala Phe 485 490 495 Glu Gln Ala Val Gly Gly Phe Pro Thr Pro Ala Ala Glu Arg Ser Ser 500 505 510 Ala <210> 3 <211> 513 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 Met Ser Ile His Met Pro Asp Pro Asp Ala Val Ala Arg Met Ala Ala 1 5 10 15 Glu Gly Arg Phe Gly Ile Pro Glu Ser Asp Leu Pro Thr Tyr His Ala 20 25 30 Ser Val Thr Gly Leu Leu Gly Ser Trp Asn Lys Val Glu Glu Leu Tyr 35 40 45 Ala Glu Val Ala Pro Thr Pro Pro Gln Arg Ser Trp Thr Arg Pro Asp 50 55 60 Ala Glu Asp Asn Lys Leu Gly Ala Trp Ala Val Gln Thr Ser Ile Thr 65 70 75 80 Glu Thr Ser Glu Gly Pro Leu Ala Gly Arg Thr Val Ala Val Lys Asp 85 90 95 Asn Val Ala Val Ala Gly Val Pro Met Met Asn Gly Ser Arg Thr Leu 100 105 110 Glu Gly Phe Val Pro Ala Glu Asp Ala Thr Val Val Ser Arg Leu Leu 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Thr Ile Ala Gly Lys Ser Val Cys Glu Asp Leu Cys 130 135 140 Phe Ser Gly Gly Ser His Thr Ser Lys Pro Gly Pro Val His Asn Pro 145 150 155 160 Trp Asp Met Ser Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser 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Glu Gly Phe Gly His Pro 275 280 285 Asn Ser Glu Pro Glu Val Asp Asp Thr Val Arg Ala Ala Val Gly Thr 290 295 300 Leu Arg Glu Ala Gly Phe Thr Val Glu Asp Val Ser Val Pro Trp His 305 310 315 320 Leu His Ala Thr Ala Ile Trp Asp Val Ile Ala Thr Glu Gly Gly Leu 325 330 335 Trp Gln Met Val Glu Gly Asn Ala Tyr Gly Met Asn Trp Lys Gly His 340 345 350 Tyr Asp Pro Ser Leu Ile Ala Tyr Tyr Gly Arg Lys Trp Arg Glu Asp 355 360 365 Pro Ala Gln Phe Ser Glu Thr Val Lys Leu Val Ala Leu Ala Gly Arg 370 375 380 Tyr Ala Leu Thr Thr Gln Tyr Gly Arg His Tyr Ala Met Ala Arg Asn 385 390 395 400 Leu Ala Pro Lys Leu Val Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Leu Ser Asn Tyr 405 410 415 Asp Val Leu Val Met Pro Thr Leu Pro Met Arg Ala Thr Val Leu Pro 420 425 430 Gly Pro Asp Ala Pro Val Glu Glu Ile Leu Ala Arg Ala Leu Glu Met 435 440 445 Leu Ala Asn Thr Ala Pro Phe Asp Val Thr Gly His Pro Ala Cys Ser 450 455 460 Val Pro Ala Gly Leu Ala Asp Gly Leu Pro Val Gly Leu Met Ile Val 465 470 475 480 Gly Lys His Phe Asp Asp Ala Thr Val Leu Lys Val Ala Asn Ala Phe 485 490 495 Glu Gln Ala Val Gly Gly Phe Pro Thr Pro Ala Ala Glu Arg Ser Ser 500 505 510 Ala <210> 42 <211> 509 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila <400> 42 Met Ile His Met Pro Asp Pro Asp Ala Val Ala Arg Met Ala Ala Glu 1 5 10 15 Gly Arg Phe Gly Ile Pro Val Val Val Ile Cys Arg Thr Tyr His Asp 20 25 30 Leu Gly His Arg Pro Ala Arg Leu Val Glu Gln Gly Arg Arg Ala Val 35 40 45 Arg Gly Gly Gly Pro His Pro Ala Ala Ala Leu Val Asp Pro Pro Arg 50 55 60 Arg Arg Gly Arg Gln Ala Arg Arg Val Gly Gly Ala Asp Leu Asp His 65 70 75 80 Arg Asn Leu Gly Gly Ala Ala Arg Arg Pro His Gly Arg Gly Gln Asp 85 90 95 Asn Val Ala Val Ala Gly Val Pro Met Met Asn Gly Ser Arg Thr Leu 100 105 110 Glu Gly Phe Val Pro Ala Glu Asp Ala Thr Val Val Ser Arg Leu Leu 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Thr Ile Ala Gly Lys Ser Val Cys Glu Asp Leu Cys 130 135 140 Phe Ser Gly Gly Ser His Thr Ser Lys Pro Gly Thr Val His Asn Pro 145 150 155 160 Trp Asp Met Ser Arg Ser Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ala 165 170 175 Leu Val Ala Ala Gly Glu Val Asp Met Ala Ile Gly Gly Asp Gln Gly 180 185 190 Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ser Ala Tyr Cys Gly Thr Val Gly His Lys 195 200 205 Pro Thr His Gly Leu Val Pro Tyr Thr Gly Gly Phe Pro Ile Glu Gln 210 215 220 Ser Ile Asp His Leu Gly Pro Ile Thr Arg Thr Val Ala Asp Ala Ala 225 230 235 240 Leu Met Leu Ser Val Ile Ala Gly Arg Asp Gly Leu Asp Pro Arg Gln 245 250 255 Pro Asp Val Val Glu Val Gln Asp Tyr Val Gly Ala Leu Ala Glu Ser 260 265 270 Val Ser Gly Leu Arg Ile Gly Val Leu Gln Glu Gly Phe Gly His Pro 275 280 285 Asn Ser Glu Pro Glu Val Asp Asp Thr Val Arg Ala Ala Val Gly Thr 290 295 300 Leu Arg Glu Ala Gly Phe Thr Val Glu Asp Val Ser Val Pro Trp His 305 310 315 320 Leu His Ala Thr Ala Ile Trp Asp Val Leu Ala Thr Glu Gly Gly Leu 325 330 335 Trp Gln Met Val Glu Gly Asn Ala Tyr Gly Met His Trp Lys Gly His 340 345 350 Tyr Asp Pro Ser Leu Ile Ala Tyr Tyr Gly Arg Lys Trp Arg Glu Asp 355 360 365 Pro Ala Gln Phe Ser Glu Thr Val Lys Leu Val Ala Leu Ala Gly Arg 370 375 380 Tyr Ala Leu Thr Thr Gln Tyr Gly Arg His Tyr Ala Met Ala Arg Asn 385 390 395 400 Leu Ala Pro Lys Leu Val Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Leu Ser Asn Tyr 405 410 415 Asp Val Leu Val Met Pro Thr Leu Pro Met Arg Ala Thr Val Leu Pro 420 425 430 Gly Pro Asp Ala Pro Val Glu Glu Ile Leu Ala Arg Gly Leu Glu Met 435 440 445 Leu Ala Asn Thr Ala Pro Phe Asp Val Thr Gly His Pro Ala Cys Ser 450 455 460 Val Pro Ala Gly Leu Ala Asp Gly Leu Pro Val Gly Leu Met Ile Val 465 470 475 480 Gly Lys His Phe Asp Asp Ala Thr Val Leu Lys Val Ala Asn Ala Phe 485 490 495 Glu Gln Ala Val Gly Gly Phe Pro Thr Pro Ala Ala Glx 500 505

Claims (16)

  1. 서열번호 1에 따른 아미노산 공통 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는, 제제 중의 아크릴아미드의 양을 감소시키는 효소로서, 여기에서 아미노산 서열은 서열번호 2에 따른 서열이 아니며, 효소는 서열번호 3 내지 서열번호 41에 따른 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 효소.
  2. 제1항에 있어서,
    아미노산 서열은 33번 위치에서 아르기닌 또는 티로신 또는 히스티딘 또는 페닐알라닌, 및/또는
    41번 위치에서 티로신, 및/또는
    68번 위치에서 아스파라긴, 및/또는
    74번 위치에서 티로신, 및/또는
    94번 위치에서 이소류신, 및/또는
    175번 위치에서 알라닌, 및/또는
    201번 위치에서 페닐알라닌, 및/또는
    217번 위치에서 아르기닌, 및/또는
    221번 위치에서 글리신, 및/또는
    225번 위치에서 트레오닌, 및/또는
    229번 위치에서 시스테인, 및/또는
    317번 위치에서 이소류신, 및/또는
    328번 위치에서 아르기닌, 및/또는
    424번 위치에서 발린, 및/또는
    445번 위치에서 아르기닌 또는 세린, 및/또는
    448번 위치에서 히스티딘, 및/또는
    453번 위치에서 아스파르테이트 또는 시스테인 또는 아스파라긴 또는 글루타민 또는 글루타메이트 또는 라이신 또는 아르기닌 또는 세린, 및/또는
    454번 위치에서 아스파라긴, 및/또는
    457번 위치에서 글리신, 및/또는
    507번 위치에서 프롤린을 갖는 효소.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    아미노산 서열은 33번 위치에서 아르기닌 또는 티로신, 및/또는
    68번 위치에서 아스파라긴, 및/또는
    74번 위치에서 티로신, 및/또는
    201번 위치에서 페닐알라닌, 및/또는
    225번 위치에서 트레오닌, 및/또는
    424번 위치에서 발린, 및/또는
    445번 위치에서 알라닌, 및/또는
    448번 위치에서 히스티딘, 및/또는
    453번 위치에서 아스파르테이트 또는 시스테인을 갖는 효소.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 및 서열번호 22의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 효소.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 및 서열번호 22의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대하여 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소가 아미다제인 효소.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소는 50℃ 이상의 온도까지, 바람직하게는 적어도 60℃의 온도까지, 보다 바람직하게는 적어도 70℃의 온도까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80℃의 온도까지 촉매 활성을 나타내는 효소.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소는 pH 4 내지 pH 7의 범위에서 촉매 활성을 가지며, 바람직하게는 효소는 pH 4 내지 pH 6.5의 범위, 보다 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 5.5의 범위에서 촉매 활성을 갖는 효소.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소는 50℃ 이상의 온도까지, 바람직하게는 적어도 60℃의 온도까지, 더 바람직하게는 적어도 70℃의 온도까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 80℃의 온도까지, pH 4 내지 pH 7의 범위, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 6.5의 범위, 보다 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 5.5의 범위에서 촉매 활성을 나타내는 효소.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소는 슈도노카디아 써모필라 (Pseudonocardia thermophila)로부터의 변성 아미다제인 효소.
  11. 하기 단계로 구성되거나 이들 단계를 포함하는, 아크릴아미드를 분해하는, 바람직하게는 제제 중 아크릴아미드의 양을 감소시키는 방법:
    (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 효소를 제공하는 단계;
    (ii) 아크릴아미드를 함유하는 혼합물, 바람직하게는 제제를 제공하고, 단계 (i)의 효소를 첨가하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)로부터 생성된 혼합물을 적어도 20분 동안, 바람직하게는 40℃ 내지 80℃ 범위의 온도, 더욱 바람직하게는 45℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 단계;
    (iv) 임의로, 바람직하게는 적어도 90℃의 온도로 가열하고 적어도 15분 동안 90℃를 상회하는 온도를 유지함으로써 효소의 불활성화가 일어나도록 단계 (iii)으로부터 생성된 인큐베이션된 혼합물을 가열하고, 임의로 혼합물을 냉각시켜 단계 (ii)에서 제공된 혼합물 또는 제제에 비해 보다 낮은 아크릴아미드 함량을 갖는 생성물을 수득하는 단계.
  12. 제11항에 있어서,
    단계 (ii)에서 아크릴아미드를 함유하는 제제가 제공되고, 함유된 아크릴아미드는 바람직하게는 마이야르 반응의 생성물이고, 제제는 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제, 또는 그러한 제제의 제조를 위한 반제품이며, 바람직하게는 여기에서 제제는 프라이드 또는 딥-프라이드 감자 제품, 로스팅된 시리얼 또는 이를 함유하는 제품, 옥수수 제품, 커피 제품, 예를 들면 고체 또는 액체 커피 추출물 및 생커피, 치커리 추출물, 시리얼 커피 제품, 커피 대용 제품, 스낵, 밀 제품, 화장품, 베이킹 제품 또는 패스트리, 예를 들면 비스킷, 쿠키, 러스크, 시리얼 바, 스콘, 아이스크림 콘, 와플, 크럼펫, 진저 브레드, 크리스프 브레드 및 빵 대용 제품, 파스타, 쌀, 어류 제품, 육류 제품, 시리얼, 맥주, 견과류, 어린이와 유아를 위한 보조 식품, 헤어 스타일링 제품, 개인 위생 제품, 헤어 케어 제품, 및 페이셜 케어 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    수득된 생성물 중 아크릴아미드 함량은 각각의 경우 생성물의 총 중량을 기준으로 하여 < 2000 ㎍/kg, 바람직하게는 < 850 ㎍/kg, 특히 바람직하게는 < 500 ㎍/kg인 방법.
  14. 하기 단계로 구성되거나 그들 단계를 포함하는, 아크릴아미드 함량이 감소된 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제의 제조 방법으로서, 바람직하게는 여기에서 제제는 프라이드 또는 딥-프라이드 감자 제품, 로스팅된 시리얼 또는 이를 함유하는 제품, 옥수수 제품, 커피 제품, 예를 들면 고체 또는 액체 커피 추출물 및 생커피, 치커리 추출물, 시리얼 커피 제품, 커피 대용 제품, 스낵, 밀 제품, 화장품, 베이킹 제품 또는 패스트리, 예를 들면 비스킷, 쿠키, 러스크, 시리얼 바, 스콘, 아이스크림 콘, 와플, 크럼펫, 진저 브레드, 크리스프 브레드 및 빵 대용 제품, 파스타, 쌀, 어류 제품, 육류 제품, 시리얼, 맥주, 견과류, 어린이와 유아를 위한 보조 식품, 헤어 스타일링 제품, 개인 위생 제품, 헤어 케어 제품, 및 페이셜 케어 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
    (I) (a) 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 수득된 생성물을 제공하는 단계; 및
    (b) 생성물을 추가 가공하고/하거나 하나 이상의 추가 성분을 첨가하여 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제를 수득하는 단계,
    또는
    (II) (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 효소를 제공하는 단계;
    (ii) 아크릴아미드를 함유하는 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제를 제공하고, 단계 (i)의 효소를 첨가하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)로부터 생성된 제제를 적어도 20분 동안, 바람직하게는 40℃ 내지 80℃ 범위의 온도, 더욱 바람직하게는 45℃ 내지 75℃ 범위의 온도에서 인큐베이션하는 단계;
    (iv) 임의로, 바람직하게는 적어도 90℃의 온도로 가열하고 적어도 15분 동안 90℃를 상회하는 온도를 유지함으로써 효소의 불활성화가 일어나도록 단계 (iii)으로부터 생성된 인큐베이션된 제제를 가열하고, 임의로 제제를 냉각시켜 단계 (ii)에서 제공된 제제에 비해 보다 낮은 아크릴아미드 함량을 갖는 제제를 수득하는 단계.
  15. 아크릴아미드의 분해 및/또는 바람직하게는 각각의 경우 제제의 총 중량을 기준으로 하여 < 2000 ㎍/kg, 바람직하게는 < 850 ㎍/kg, 특히 바람직하게는 < 500 ㎍/kg의 감소된 아크릴아미드 함량을 갖는 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제의 제조를 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 효소의 용도.
  16. 아크릴아미드 함량이 각각의 경우 제제의 총 중량을 기준으로 하여 < 2000 ㎍/kg, 바람직하게는 < 850 ㎍/kg, 특히 바람직하게는 < 500 ㎍/kg인 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 제조되거나 제조 가능한 쾌락 또는 영양을 제공하는 제제 또는 화장품 제제.
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