KR20220129468A - 배양육 제조용 플레이트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 배양육 제조용 플레이트에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 가축 유래의 근육위성세포를 근육세포(myocyte) 및 근관세포(myotube)로 분화시키는 과정을 통해 만들어지는 배양육의 제조를 위한 맞춤형 플레이트에 관한 것이다. 본 발명의 배양육 제조용 플레이트는 배양액이 수용될 수 있는 수용공간과 더불어 근세포가 붙어서 자랄 수 있는 복수의 지지부를 포함하고 있으며, 특히, 상기 수용공간 및 지지부 표면에 구기자 추출물 코팅층을 포함함으로써 근육세포(myocyte)의 증식과 더불어 근관세포(myotube)로의 분화를 효과적으로 이끌어낼 수 있다. 또한, 본 발명의 배양육 제조용 플레이트는 근육세포가 부착할 수 있는 조건을 형성해주며, 근조직이 형성되면서 근섬유의 형성이 쉽고 균일한 크기의 조직이 형성될 수 있는 이점을 갖는다.
Description
본 발명은 배양육 제조용 플레이트에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 가축 유래의 근육위성세포를 근육세포(myocyte) 및 근관세포(myotube)로 분화시키는 과정을 통해 만들어지는 배양육의 제조를 위한 맞춤형 플레이트에 관한 것이다.
최근 국제연합식량농업기구(FAO)에서 발간한 보고서에 따르면, 세계 인류는 2018년 7월 기준 76억 4천만 명에서 2050년에는 92억 명으로 매년 0.6% 증가할 것으로 예측되며, 이러한 인구의 증가와 맞물려 인류의 육류 소비량 역시 465백만 톤에 달할 것으로 추정되고 있다.
이에 국제연합식량농업기구(FAO)는 증가하는 육류 수요를 맞추기 위해 매년 2억 톤의 추가 생산이 필요함을 발표한 바 있다. 또한, 최근 들어 가축 광우병, 구제역 등의 가축 질병 문제, 가축 내장에 함유되어 있던 병원균이 가공 과정에서 사멸되지 않음으로 인해 각종 질환을 야기시키는 사례가 속속 발생하고 있어 사회적으로 큰 문제점을 야기시키고 있다.
이처럼 인구 증가 및 도축 가축에서 발생되는 질환 발생의 문제 등을 해결하기 위한 방안으로 최근 '배양육'이 주목 받고 있다.
배양육이라 함은 살아있는 동물의 세포를 채취한 뒤 세포 공학 기술로 증식하여 얻게 되는 식용 고기를 의미하며, 가축을 사육하는 과정을 거치지 않고 고기를 얻는 세포농업 (cellular agriculture)의 한 분야라고 할 수 있다. 한국어로는 배양육, 대체육 혹은 인공 고기라는 말로 불리며, 영어로는 시험관에서 키운다는 의미로 in vitro meat, 천연이 아닌 인간이 줄기세포를 이용하여 합성한다는 의미에서 artificial meat, 전통적인 사육시설이 아닌 청정한 생산시설에서 생산된다는 의미로 clean meat, 일부 시제품은 실험실에서 만들어지기도 해서 lab-grown meat로 불리고 있다.
배양육은 세포공학기술 중 조직배양기술(tissue engineering)을 이용한다. 세포는 살아있는 동물에서 얻지만 고통 없이 확보하고 줄기세포를 배양하는 방법을 이용한다. 따라서 배양육은 동물을 살리면서, 환경오염도 줄이는 이상적인 식량생산 기술에 해당한다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 근육위성세포를 근육세포(myocyte)로 증식시키고 근관세포(myotube)로 분화시킴으로써 배양육 제조하는데 유용하게 사용될 수 있는 세포 배양 용기를 연구하였으며, 그 결과 배양액이 수용될 수 있는 수용공간과 더불어 근세포가 붙어서 자랄 수 있는 복수의 지지부를 포함하는 플레이트를 이용하는 경우 근세포(myocyte)의 증식과 더불어 근관세포(myotube)로의 분화를 효과적으로 이끌어낼 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 가축 유래의 근육위성세포를 근육세포(myocyte)로 증식시키고 근관세포(myotube)로 분화시킴으로써 배양육 제조하는데 유용하게 사용될 수 있는 플레이트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 배양액이 수용될 수 있는 수용공간을 가지며, 세포가 붙어 자랄 수 있는 복수의 지지부를 포함하는, 배양육 제조용 플레이트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수용공간 및 지지부 표면에 코팅제를 형성시킨 코팅층을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코팅제는 구기자 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코팅제는 구기자 추출물 이외에 콜라겐 및 마트리겔을 유효성분으로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수용공간은 복수 개가 형성될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수용공간은 상부에서 하부로 갈수록 좁아질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지지부는 평평한 바닥으로부터 일정 높이를 갖도록 기둥 형태로 돌출된 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기둥은 원통형 기둥, 바형(bar type) 기둥, 벌집형 기둥, 마름모형 기둥 및 사다리형 기둥으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 배양육 제조용 플레이트는 배양액이 수용될 수 있는 수용공간과 더불어 근세포가 붙어서 자랄 수 있는 복수의 지지부를 포함하고 있으며, 특히, 상기 수용공간 및 지지부 표면에 구기자 추출물 코팅층을 포함함으로써 근육세포(myocyte)의 증식과 더불어 근관세포(myotube)로의 분화를 효과적으로 이끌어낼 수 있다. 또한, 본 발명의 배양육 제조용 플레이트는 근육세포가 부착할 수 있는 조건을 형성해주며, 근조직이 형성되면서 근섬유의 형성이 쉽고 균일한 크기의 조직이 형성될 수 있는 이점을 갖는다.
도 1a 내지 1d는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 세포 배양 플레이트의 사시도를 나타낸 것이다.
도 2는 도 1a의 단면도를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3d는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 세포 배양 플레이트의 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 구기자 추출물 코팅층을 포함하는 세포 배양 플레이트의 단면도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 세포 배양 플레이트에서 배양한 한우근육줄기세포의 핵을 염색한 면역형광염색 사진이다(a: 코팅 無 b: 코팅 有).
도 6은 본 발명의 세포 배양 플레이트에서 배양한 한우근육줄기세포의 조직 내 근원섬유 형성을 확인한 사진이다(a: 코팅 無 b: 코팅 有).
도 2는 도 1a의 단면도를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3d는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 세포 배양 플레이트의 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 구기자 추출물 코팅층을 포함하는 세포 배양 플레이트의 단면도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 세포 배양 플레이트에서 배양한 한우근육줄기세포의 핵을 염색한 면역형광염색 사진이다(a: 코팅 無 b: 코팅 有).
도 6은 본 발명의 세포 배양 플레이트에서 배양한 한우근육줄기세포의 조직 내 근원섬유 형성을 확인한 사진이다(a: 코팅 無 b: 코팅 有).
본 발명은 배양육 제조용 플레이트에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 ‘배양육’이란 살아있는 동물의 세포를 채취한 뒤 세포 공학 기술로 증식하여 얻게 되는 인공 고기를 의미하며, 대체육이라고도 불리며, 영어로는 시험관에서 키운다는 의미로 in vitro meat, 천연이 아닌 인간이 줄기세포를 이용하여 합성한다는 의미에서 artificial meat, 전통적인 사육시설이 아닌 청정한 생산시설에서 생산된다는 의미로 clean meat, 일부 시제품은 실험실에서 만들어지기도 해서 lab-grown meat로 불리고 있다.
본 발명의 배양육 제조용 플레이트는 근육위성세포를 근육세포(myocyte) 및 근관세포(myotube)로 분화시키는 과정을 통해 만들어지는 배양육의 제조를 위한 맞춤형 플레이트이다.
본 발명에서 ‘근육위성세포(satellite cell)’라 함은 골격근 외측의 근섬유와 기저막 사이에 낀 방추형의 단핵세포를 의미하며, 근육이 손상되었을 때 위성세포는 분열하여 근육의 재생을 가능하게 하는 기능을 한다.
이하에서는 본 발명의 일실시예에 따른 배양육 제조용 플레이트를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1a 내지 도 1d는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 배양육 제조용 플레이트의 사시도이고, 도 2는 도 1a의 단면도이다.
도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 배양육 제조용 플레이트(1)는 세포 배양을 위한 배양액이 수용되는 수용공간(10)을 가지는 것으로, 세포가 붙어 자랄 수 있는 복수의 지지부(20)를 포함하여 이루어진다.
상기 지지부(20)는 평평한 바닥으로부터 일정 높이를 갖도록 기둥 형태로 돌출된 구조일 수 있으며, 상기 기둥은 다양한 형태의 구조를 가질 수 있다.
상기 기둥의 형태는 원통형 기둥(도 1a 및 1b 참조), 바형(bar type) 기둥(도 1c 참조), 벌집형 기둥(도 1d 참조), 마름모형 기둥 및 사다리형 기둥 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 형태를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따른 배양육 제조용 플레이트(1)는 도 1a 및 도 2에서 도시된 바와 같이, 배양액 수용공간(10) 및 세포 지지부(20)가 모두 복수 개로 형성될 수 있으며 1개의 수용공간(10)에 1개의 지지부(1)가 형성될 수 있다. 이때, 수용공간(10)은 상부에서 하부로 갈수록 좁아지는 깔대기형 구조를 가질 수 있으며, 각각의 수용공간(10)은 하나의 웰(we11) 형태로 플레이트(1) 내에 다수의 웰(we11)이 형성되는 구조일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 배양육 제조용 플레이트(1)는 도 1b에서 도시된 바와 같이, 배양액 수용공간(10) 및 세포 지지부(20)가 모두 복수 개로 형성될 수 있으며, 1개의 수용공간(10)에 다수의 지지부(1)가 형성될 수 있다. 이때, 수용공간(10)은 채널 구조를 가질 수 있으며, 플레이트(1) 내에 다수의 수용공간(10)은 측벽에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 배양육 제조용 플레이트(1)는 도 1c 및 도 1d에서 도시된 바와 같이, 하나의 배양액 수용공간(10)에 세포 지지부(20)가 복수 개로 형성될 수 있다. 이때, 수용공간(10)은 구획이 없는 개방된 형태이며, 다수의 지지부(20)는 바닥으로부터 일정 높이를 갖도록 돌출된 형태의 바형(bar type) 기둥(도 1c)이나 벌집형 기둥(도 1d)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 배양육 제조용 플레이트(1)는 도 4에서 도시된 바와 같이, 수용공간(10) 및 지지부(20) 표면에 코팅제를 형성시킨 코팅층(30)을 더 포함할 수 있다.
상기 코팅제는 구기자 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 구기자 추출물 이외에 콜라겐 및 마트리겔을 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
구기자 추출물 제조
구기자(Lycii fructus)는 건조된 구기자 열매를 분말화하여 구기자 50g을 1L의 에틸 알코올 95%(GR grade)에 첨가하고 실온에서 초음파 추출기(VCX750, SONICS&MATERIALS,INC.)를 사용하여 240 사이클(20KHz, 750W, 80% amplitude,30s/15s pulse, 120분)을 통해 추출하였다. 얻어진 상등액을 여과 후, rotary evaporator (EYELA Co., Tokyo, Japan)를 활용하여 농축시켜 동결건조 하여 9.7g의 구기자 추출물을 수득하였다. 상기 과정을 통해 수득한 구기자 에탄올 추출물은 증류수에 100 mg/㎖ 농도로 용해시켜 코팅액의 시료로 사용하였다.
<실시예 2>
본 발명의 배양육 제조용 플레이트 제조
<2-1> 배양육 제조용 플레이트
배양육 제조용 플레이트는 캐드(오토데스크 인벤터) 프로그램을 이용하여 디자인하였으며 3D 프린터(Makerbot replicator+)를 이용하여 플레이트 몰드를 출력하였다. 출력한 몰드에 Silicone Elastomer Kit를 이용하여 플레이트를 제조하였다.
<2-2> 구기자 추출물로 코팅된 배양육 제조용 플레이트
본 발명의 배양육 제조용 플레이트 상부 표면에 상기 <실시예 1>에서 수득한 구기자 추출물을 분무한 후 실온에서 건조시켜 코팅처리하였다.
<실시예 3>
한우로부터 근육세포 분리 및 배양
<3-1> 근육위성세포 분리
33개월령 거세 한우(충북관내 도축장)에서 도축 후 30분이내 엉덩이 부위에서 약 100g의 근육을 채취하였다. 채취한 근육을 70% 에탄올과 PBS로 각 3회에 걸쳐 세척하고, 세척이 완료된 근육을 1-2mm크기의 조직으로 잘게 잘랐다. 이후 콜라게나아제(type 2, GibcoTM)를 이용하여 45분 동안 조직을 분해하고, 원심분리(1,500 ~ 3,000 rpm)를 하여 근육위성세포를 분리하였다. 획득한 근육위성세포는 액체 질소에 보관한 세포를 P0(Passage 0)으로 하여 세포배양에 사용하였다.
<3-2> 분리된 근육위성세포의 배양
상기 실시예 <3-1>을 통해 준비한 세포(Passage 0)는 상기 <실시예 2>를 통해 준비한 본 발명의 배양육 제조용 플레이트에 웰(wells) 당 5,000/cm2 개씩 분주한 다음, 37℃ 5% CO2 농도의 인큐베이터에서 성장 배지(Ham-F10, Sigma-Aldrich)에 FBS 20%, PSA 1%를 첨가하여 세포가 100% 포화(confluent)될 때까지 배양하였으며, 이후 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 FBS 2%, PSA 1%를 첨가하여 근육세포(myocytes)를 근관세포(myotube)로 분화시켰다.
<실험예 1>
배양육 제조용 플레이트에 따른 근육세포 분화도 확인
본 실험에서는 상기 실시예 <3-2>을 통해 배양한 한우근육세포의 증식력 및 분화 3일차 때 생성된 근관 수준은 면역형광염색을 통해 조사하였다.
자세하게는, 배양액 제거 후 1X PBS로 세척하고, 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 37℃에서 45분간 처리하였다. 1X PBS로 2번 세척 후 0.1% Triton X를 상온에서 20분간 처리하였다. 이후 2% BSA를 상온에서 30분간 처리한 다음, 1X PBS로 2회 세척하고 Pax7 항체를 처리하여, 4℃에 하룻밤 동안 반응시켰다. 1X PBS로 2회 세척 후 2차 항체 (Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross- Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488)를 처리하고, 마지막으로 Hoechst 시약을 분주하여 핵을 염색하였다. 그 후 면역염색된 근육줄기세포의 3D배양조직을 슬라이드 글래스(slide glass)에 옮겨 NIKON ECLIPSE 80i 형광현미경을 통해 면역형광염색된 한우근육줄기세포의 3D 배양 조직을 관찰하였다.
그 결과 분화된 세포가 근육세포임을 확인할 수 있었으며(도 5 참조), 근형성 분화 유도에 따라 한우 유래 근육위성세포는 융합하여 근육 수축에 관여하는 다핵 근관을 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 특히, ‘일반 배양육 제조용 플레이트’에서 배양한 근육세포 대비 ‘구기자 추출물로 코팅된 배양육 제조용 플레이트’에서 배양한 근육세포에서 근육세포 분화가 효과적으로 이루어지며, 근관 형성이 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 근모세포의 근육세포로의 분화 여부를 확인할 수 있는 융해 지수(fusion index)를 분석하였다. 면역형광염색 이미지를 이용하여 근관세포 내에서 융해(fusion)된 핵의 수를 세고, 총 세포의 핵 수를 센 후 융해된 핵 수를 총 세포의 핵 수로 나누어 % 값을 산출하였다.
그 결과 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이, ‘구기자 추출물로 코팅된 배양육 제조용 플레이트’에서 배양한 근육세포가 분화 1일차 및 3일차 모두 융해 지수가 73% 이상으로 나타나, ‘일반 배양육 제조용 플레이트’에서 배양한 근육세포(융해지수 약 42~48%) 대비 융해 지수가 두드러지게 높은 것을 확인할 수 있었다.
한편, 면역형광염색 이미지를 이용하여 분화된 근관의 직경을 측정하였다. 그 결과 하기 표 2에서 나타낸 바와 같이, ‘일반 배양육 제조용 플레이트’ 대비 ‘구기자 추출물로 코팅된 배양육 제조용 플레이트’에서 배양한 경우 근관의 직경이 큰 것을 확인할 수 있었다.
| 분화(일) | 일반 배양육 제조용 플레이트 | 구기자 추출물로 코팅된 배양육 제조용 플레이트 |
| 1 | 42.58 ± 3.21b | 73.40 ± 1.32a |
| 3 | 48.24 ± 1.21b | 88.58 ± 2.40a |
a-b 각 처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
| 분화(일) | 일반 배양육 제조용 플레이트 | 구기자 추출물로 코팅된 배양육 제조용 플레이트 |
| 1 | 100.12 ± 10.01b | 154.32 ± 10.25a |
| 3 | 125.40 ± 12.33b | 202.48 ± 12.25a |
a-b 각 처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
1: 배양육 제조용 플레이트
10: 수용공간
20: 지지부
30: 코팅층
10: 수용공간
20: 지지부
30: 코팅층
Claims (8)
- 배양액이 수용될 수 있는 수용공간을 가지며,
세포가 붙어 자랄 수 있는 복수의 지지부를 포함하는, 배양육 제조용 플레이트. - 제1항에 있어서,
상기 수용공간 및 지지부 표면에 코팅제를 형성시킨 코팅층을 더 포함하는, 배양육 제조용 플레이트. - 제2항에 있어서,
상기 코팅제는 구기자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양육 제조용 플레이트. - 제3항에 있어서,
상기 코팅제는 구기자 추출물 이외에 콜라겐 및 마트리겔을 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양육 제조용 플레이트. - 제1항에 있어서,
상기 수용공간은 복수 개가 형성되는 것을 특징으로 하는, 배양육 제조용 플레이트. - 제1항에 있어서,
상기 수용공간은 상부에서 하부로 갈수록 좁아지는 것을 특징으로 하는, 배양육 제조용 플레이트. - 제1항에 있어서,
상기 지지부는 평평한 바닥으로부터 일정 높이를 갖도록 기둥 형태로 돌출된 구조인 것을 특징으로 하는, 배양육 제조용 플레이트. - 제7항에 있어서,
상기 기둥은 원통형 기둥, 바형(bar type) 기둥, 벌집형 기둥, 마름모형 기둥 및 사다리형 기둥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 배양육 제조용 플레이트.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210034039 | 2021-03-16 | ||
| KR20210034039 | 2021-03-16 |
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
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| KR (1) | KR20220129468A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101851655B1 (ko) | 2017-09-19 | 2018-04-25 | 주식회사 엠비지 | 버섯농축액과 배양액을 이용한 패티 제조 방법 |
-
2022
- 2022-03-04 KR KR1020220028322A patent/KR20220129468A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR101851655B1 (ko) | 2017-09-19 | 2018-04-25 | 주식회사 엠비지 | 버섯농축액과 배양액을 이용한 패티 제조 방법 |
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