KR20220126122A

KR20220126122A - 섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20220126122A
Application number: KR1020210030347A
Authority: KR
Inventors: 김윤희; 김동민; 복주한; 문병곤
Original assignee: 주식회사 한독
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2022-09-15
Also published as: KR102623069B1

Abstract

본 발명은 섬유증의 치료 또는 완화에 유용한 화합물 및 이의 의약 용도에 관한 것이다.

Description

섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating or alleviating fibrosis}

본 발명은 섬유증의 치료 또는 완화를 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 섬유증의 치료 또는 섬유증 증상의 완화를 위한 방법에 관한 것이다.

조직 손상에 대한 세포 외 매트릭스 성분의 축적은 조직 복구에 필수적인 생리학적 과정이다. 불행히도, 손상(injury)을 악화시키는 만성 손상은 섬유아세포(fibroblast) 및 근섬유아세포(myofibroblast)에 의한 세포 외 매트릭스 성분의 과잉 생산을 유발하여, 섬유질 결합 조직의 과도한 축적을 야기하고, 경우에 따라 이는 섬유증으로 알려진 병리학적 상태에 이르게 된다.

섬유증은 심장, 간, 폐, 골격근, 신장, 혈관 및 심장과 같은 다양한 기관에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 섬유증은 골격근 조직 (이영양성 근육 질환), 심장 및 혈관 조직 (심근 경색), 간 조직 (비알콜성 지방간 질환/간경변), 폐 조직 (특발성 폐 섬유증) 및 신장 조직 (만성 신장 질환/신장 섬유증)에서 나타날 수 있다.

구체적으로, 신장 섬유증은 과잉 기질 합성(excess matrix synthesis), 수축 등을 포함하는 다양한 기전으로 인해 발생할 수 있다. Soma Meran 등은 신장 섬유증에 있어 섬유아세포와 근섬유아세포 관련 기전에 대해 설명하고 있으며, 근섬유아세포의 존재는 실험 모델과 인간의 신장 질환 모두에서 섬유화 진행의 예측 인자로 인식된다("Fibroblasts and myofibroblasts in renal fibrosis" Int J Exp Pathol. 2011 Jun; 92(3): 158-167.). 근섬유아세포는 α-SMA(Smooth muscle actin)의 발현으로 특징지워지며, fibronectin 또한 증가함이 특징이다. 이러한 근섬유아세포의 형성에는 ED-A fibronectin, TGF-β1, 기계적 장력 등이 관여한다고 알려져 있으나 아직 명확한 기전은 밝혀지지 않았다.

간 섬유증은 대부분의 만성 간 질환에서 발생하는 콜라겐을 포함한 세포 외 기질 단백질의 과도한 축적을 말한다. 간 섬유화에 관여하는 대표적인 세포는 간성상세포 (Hepatic stellate cell: HSC), 쿠퍼 세포 (Kupffer cell), 내피 세포 (Endothelial cell) 등이다. 간성상세포는 세포외 기질을 생산하는 주 생산원으로 활성화되면 근섬유아세포 유사형태 (myofibroblast-like phenotype)로 바뀌면서 세포증식의 증가, 교원질 (collagen type I and III)을 포함한 각종 세포외 기질의 생성 증가, α-SMA(Smooth muscle actin)의 발현 증가, 세포 수축성의 증가 등이 있게 된다. 이와 관련된 기전으로 TGF-β1, 안지오텐신 II 및 렙틴과 같은 섬유성 사이토카인 등이 활성화되는 것으로 알려져 있으나 아직 명확한 치료 기전은 밝혀져 있지 않다.

세포외 기질(extracellular matrix: ECM)의 과다한 축적으로 정의되는 조직 섬유화는 다양한 원인에 의한 폐 질환에서도 관찰되는 공통적인 병리소견이다. α-α-SMA의 신생합성(de novo synthesis)은 폐 섬유아세포(lung fibroblast)를 근 섬유아세포 표현형으로 변화시키고 근섬유아세포의 표현은 폐 섬유화가 진행되는 부위에서 상향조절되고 지속적으로 표현되기 때문에 폐 섬유화의 발생과 진행에 주 역할을 할 것으로 추정되고 있다. α-SMA의 표현(expression)이 근섬유아세포로의 변화를 특징짓고 있기 때문에 폐 섬유아세포에서의 α-SMA의 표현 조절 기전을 이해하면 폐 섬유화의 발생과 진행을 억제할 수 있는 새로운 치료법을 제시할 수 있을 것으로 생각되고 있다.

국제특허출원 국제공개 WO 2017/123058

따라서 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 섬유증의 치료 또는 완화에 효과적인 약학 조성물을 제공하는 것이다. 즉, 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 섬유증의 치료 또는 완화에 효과적인 성분을 찾아내어 이의 의약 용도를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 개시는 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물을 제공한다. 즉, 본 개시는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염의 섬유증 치료 또는 완화용 의약 용도를 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, m은 1 내지 3의 정수, R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 수소, 할로겐, 또는 CF₃임.

본 명세서에서 사용된, 용어 "할로겐"은 플루오린 (F), 염소 (Cl), 브로민 (Br), 또는 요오드 (I)를 지칭한다.

본 발명자들은 국제특허출원 국제공개 WO 2017/123058에 개시된 일부 화합물들이 섬유증의 치료에 유용함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 개시에 따른 화학식 1로 표시된 화합물은, 예를 들어, 신장 세포의 α-SMA, 1형 Collagen의 단백질의 발현을 억제하는 등 신장의 섬유화를 치료할 수 있으며, 간 성상 세포에서 α-SMA, fibronectin 단백질 등을 감소시킴으로써 간의 섬유화를 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 경구 투여에 바람직한 약동학 물성을 가진다.

본 개시의 화합물들은 국제특허출원 국제공개 WO 2017/123058에 개시된 화합물의 합성 방법을 통해 제조될 수 있으며, 국제특허출원 국제공개 WO 2017/123058의 전체 내용, 특히 본 개시 화합물들의 제조 방법은 본 인용에 의하여 본 명세서에 모두 포함된다.

특정 구현예에서, 화학식 1에 따른 화합물은 산성 작용기를 가진 화합물로 작용할 수 있다. 특정 다른 구현예에서, 화학식 1에 따른 화합물은 염기성 작용기를 가진 화합물로 작용할 수 있다. 따라서, 숙련된 당업자는 화학식 1에 따른 화합물의 염이 제조될 수 있음을 알 것이다. 실제로, 본 발명의 구현예에서, 화학식 1에 따른 화합물의 염은 각각의 유리 염기 또는 유리 산보다 바람직할 수 있는데, 이는, 예를 들면, 그러한 염이 분자에 보다 큰 안정성 또는 용해도를 부여하고 그에 따라서 투여 형태로의 제형을 촉진하기 때문이다. 따라서, 본 발명의 구현예는 추가로 화학식 1에 따른 화합물의 약학적으로 허용가능한 염이다.

산성 염: 적합한 부가 염은 무독성 염을 형성하는 산으로부터 형성되고 예들은 하이드로클로라이드(hydrochloride), 하이드로브로마이드(hydrobromide), 하이드로아이오다이드(hydroiodide), 설페이트(sulphate), 바이설페이트(bisulphate), 니트레이트(nitrate), 포스페이트(phosphate), 하이드로겐 포스페이트(hydrogen phosphate), 아세테이트(acetate), 말리에이트(maleate), 말레이트(malate), 퓨마레이트(fumarate), 말로네이트(malonate), 락테이트(lactate), 타르트레이트(tartrate), 시트레이트(citrate), 포르메이트(formate), 글루코네이트(gluconate), 석시네이트(succinate), 피루베이트(pyruvate), 옥살레이트(oxalate), 옥살로아세테이트(oxaloacetate), 트리플루오로아세테이트(trifluoroacetate), 사카레이트(saccharate), 벤조에이트(benzoate), 메탄설포네이트(methanesulphonate), 에탄설포네이트(ethanesulphonate), 벤젠설포네이트(benzenesulphonate), p-톨루엔설포네이트(toluenesulphonate), 메탄설포닉(methanesulphonic), 에탄설포닉(ethanesulphonic), p-톨루엔설포닉(toluenesulphonic), 및 이세티오네이트(isethionate)이다.

염기성 염: 약학적으로 허용가능한 염기성 염은 암모늄 염, 예를 들어 나트륨 및 칼륨 염 같은 알칼리 금속 염, 예를 들어 칼슘 및 마그네슘 염 같은 알칼리 토금속 염, 및 예를 들어 이소프로필아민(isopropylamine), 디에틸아민(diethylamine), 에탄올아민(ethanolamine), 트리메틸아민(trimethylamine), 디사이클로헥실 아민(dicyclohexyl amine) 및 N-메틸-D-글루카민(N-methyl-D-glucamine) 같은 일차, 이차 및 삼차 아민의 염을 포괄하는, 유기 염기성 염기와의 염을 포함한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 대상 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 원하지 않는 독성 영향을 최소한으로 보이는 염을 지칭한다. 이들 약학적으로 허용 가능한 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 중에 in situ에서 제조되거나, 또는 이의 유리 산 또는 유리 염기 형태의 정제된 화합물을 적합한 염기 또는 산과 별개로 반응시켜 제각기 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 일반적으로 그러한 용도로 안전하다고 간주되거나, 그러한 용도로 국가 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 공식적으로 승인되거나, 또는 미국 약전 (U. S. Pharmacopoeia) 또는 동물, 보다 특별히 인간에서의 사용을 위한 것으로 일반적으로 인정되는 기타 약전에 나열된 약학 제제에서의 사용에 적합한 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "본 개시의 화합물" 또는 "본 발명의 구현예에 따른 화합물"은 특별히 언급되지 않는 한 화학식 1에 따른 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포괄하는 의미이다.

본 발명의 구현예에 따른 화합물은 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 고체 상태에서, 본 발명의 구현예에 따른 화합물은 결정질 또는 비결정질 형태로, 또는 그의 혼합물로 존재할 수 있다. 결정질 형태인 본 발명의 구현예에 따른 화합물의 경우, 숙련된 당업자는 결정화 동안 용매 분자가 결정질 격자 내로 혼입되는 약학적으로 허용 가능한 용매화물이 형성될 수 있다. 용매화물은 예를 들어 에탄올, 이소프로판올, DMSO, 아세트산, 에탄올 아민 및 에틸 아세테이트 같은 비수성 용매를 포함할 수 있거나, 또는 결정성 격자에 혼입되는 용매로서 물을 포함할 수 있다. 물이 결정질 격자에 혼입되는 용매인 용매화물은 전형적으로 "수화물"로 지칭된다. 수화물은 화학량론적 수화물뿐만 아니라 다양한 양의 물을 함유하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 구현예는 이러한 모든 용매화물을 포함한다.

숙련된 당업자는, 결정질 형태로 존재하는 본 발명의 구현예에 따른 특정 화합물이 다형성능(즉, 상이한 결정질 구조에서 발생할 수 있는 능력)을 보일 수 있음을 인식할 것이다. 이들 상이한 결정질 형태는 "다형체(polymorphs)"로 알려져 있다. 본 발명의 구현예는 이러한 모든 다형체를 포함한다. 다형체는 동일한 화학 조성을 갖지만, 패킹, 기하학적 배열 및 결정성 고체 상태의 다른 기술적 특성이 상이하다. 다형체는, 그러므로, 예를 들어 형태, 밀도, 경도, 변형성, 안정성 및 용해 특성과 같은 상이한 물리적 특성을 가질 수 있다. 다형체는 전형적으로 상이한 용융점, IR 스펙트럼 및 X-선 분말 회절 패턴을 보이고, 이는 식별에 사용될 수 있다. 숙련된 당업자는, 예를 들면, 화합물을 제조하는데 사용되는 반응 조건 또는 시약을 변화시키거나 조절하여, 또는 상이한 단리 또는 정제 과정을 사용하여 상이한 다형체가 생성될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들면, 온도, 압력 또는 용제의 변화는 다형성을 초래할 수 있다. 이에 더불어, 하나의 다형체는 특정 조건 하에서 자발적으로 다른 다형체로 전환될 수 있다.

바람직하게, 본 개시의 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 (2S,3R,4S)-2-(8-((2-아이오도벤질)아미노)-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-3-일)테트라하이드로티오펜-3,4-디올이다.

[화학식 2]

상기 화학식 2의 화합물은 섬유증 치료 또는 완화 효과가 매우 우수할 뿐만 아니라, 경구 투여 제제의 유효 성분으로 이용되기 위한 약물동력학적 특성도 매우 우수하다.

본 개시는 또한 본 개시의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약학 조성물을 제공한다.

본 개시의 화합물은 섬유증의 치료 또는 완화에 유용하며, 섬유증으로는 간, 폐, 골격근, 신장, 혈관 및 심장 섬유증을 예시할 수 있다. 본 개시의 일 구현예에서 섬유증은 간, 신장, 또는 폐 섬유증이며, 특히 본 개시의 화합물은 간 또는 신장 섬유증의 치료 또는 완화에 유용하다.

따라서 본 개시는 또한 본 개시의 화합물의 치료학적 유효량을 섬유증의 치료가 필요한 개체(바람직하게는 인간)에게 투여하여 섬유증 증상을 갖거나 갖기 쉬운 개체에서 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 치료는 예방적 치료이다. 또 다른 구현예에서, 치료는 완화적 치료이다. 또 다른 구현예에, 치료는 회복적 치료이다.

본 개시의 화합물은 일반적으로 치료적 유효량으로 투여된다. 본 개시의 화합물은 임의의 적합한 경로에 의해, 이러한 경로에 적합한 약학 조성물의 형태로, 및 의도된 치료에 유효한 용량으로 투여될 수 있다. 유효 투여량은, 단회 또는 분할 용량으로, 전형적으로 체중 kg당 일일 약 0.0001 내지 약 100 mg 범위이고, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 30mg/kg/일 이다. 나이, 종 및 치료되는 병태에 따라, 이 범위의 하한치 보다 더 낮은 투여량 수준이 적합할 수 있다. 다른 경우, 여전히 더 많은 용량이 유해한 부작용 없이 사용될 수 있다. 더 많은 용량은 또한 온종일 투여를 위해 몇 개의 더 작은 투여량으로 나뉠 수 있다.

특정 구현예에서, 투여 빈도는 각각 대상의 필요 및 치료될 질병의 중증도에 따라 크게 변할 수 있고, 이러한 투여는 일주일에 약 일 회 내지 하루에 약 십 회, 예를 들어 일주일에 약 삼 회 내지 하루에 약 삼 회, 또는 하루에 일 회 또는 이 회일 수 있다.

섬유증의 치료 또는 완화를 위해, 본 명세서에 기술된 화합물은 하기와 같이 투여될 수 있다.

경구 투여

본 개시의 화합물은 경구 투여될 수 있고, 따라서 화합물이 위장관으로 들어가거나, 또는 구강으로부터 (예, 협측 또는 설하 투여) 직접 혈류로 흡수된다.

경구 투여에 적합한 조성물은, 액체, 젤 또는 분말을 함유할 수 있는, 예를 들어 알약, 로렌지(lozenge) 및 캡슐 같은 고형 제형을 포함한다.

경구 투여용 조성물은, 지연 또는 서방 방출을 포괄하는, 선택적으로 장용 코팅과 함께, 즉시 또는 변형 방출로서 제형화될 수 있다.

액체 제형은, 연질 또는 경질 캡슐에서 사용될 수 있는, 용액, 시럽 및 현탁액을 포괄할 수 있다. 이러한 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스, 또는 오일을 포괄할 수 있다. 제형은 또한 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다.

알약 투여 형태에서, 존재하는 약물의 양은 투여 형태의 중량으로 약 0.05% 내지 약 95%, 보다 전형적으로 중량으로 약 2% 내지 약 50%일 수 있다. 또한, 알약은 투여 형태의 중량당 약 0.5% 내지 약 35%, 보다 전형적으로 중량당 약 2% 내지 약 25%를 포함하는 붕해제를 함유할 수 있다. 붕해제의 비제한적인 예는 소듐 또는 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스, 크로스카멜로스 소듐(croscarmellose sodium), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 하이드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 전분 등을 포함한다.

알약에 사용하기에 적합한 윤활제는 중량으로 약 0.1% 내지 약 5%의 양으로 존재할 수 있으며, 스테아린산, SiO₂, 칼슘, 아연 또는 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 퓨마레이트 등을 포함한다.

알약에 사용하기에 적합한 결합제는 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 설탕, 검, 전분, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.

알약에 사용하기에 적합한 희석제는 만니톨, 자일리톨, 락토오스, 덱스트로스, 수크로즈, 소르비톨, 마이크로크리스탈린 셀룰로즈, 전분 등을 포함한다.

알약에 사용하기 적합한 계면 활성제 및 활택제는 중량으로 약 0.1% 내지 약 3%의 양으로 존재할 수 있으며, 폴리소르베이트 80, 소듐 도데실 설페이트, 탈크 및 실리콘 디옥사이드를 포함한다.

비경구 투여

본 개시 발명의 화합물은 혈류, 근육 또는 내장 기관에 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적절한 수단은 정맥내, 근육내, 피하 동맥내, 복강내, 척수강내, 두개내, 및 기타 동종을 포함한다. 비경구 투여에 적합한 장치는 주사기 (바늘 및 무-바늘 주사기 포괄) 및 주입 방법을 포함한다.

비경구 투여용 조성물은, 지연 또는 서방 방출을 포괄하는, 즉시 또는 변형 방출로서 제형화될 수 있다.

대부분의 비경구 제형은 염, 완충제 및 탄수화물을 포괄하는 부형제를 함유하는 수용액이다.

비경구 제형은 또한 탈수된 형태 (예, 동결건조) 또는 멸균 비-수용액으로 제조될 수 있다. 이들 제형은 예를 들어 멸균 수 같은 적합한 비히클과 함께 사용될 수 있다. 용해도-향상제는 또한 비경구 용액의 제조에 사용될 수 있다.

본 개시에 따른 화합물은 섬유증, 특히 신장 또는 간 섬유증의 치료 또는 완화에 유용하다. 즉, 본 개시는 본 개시의 화합물의 섬유증 치료 또는 완화 의약 용도를 제공한다. 본 개시의 다른 측면은 본 개시에 따른 화합물의 치료적 유효량을 포함하는 섬유증 치료 또는 완화용 약학 조성물을 제공한다. 본 개시의 또 다른 측면은 본 개시에 따른 화합물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체(바람직하게는 인간)에게 투여하는 단계를 포함하는 섬유증, 바람직하게는, 신장 또는 간 섬유증을 치료 또는 완화하는 방법을 제공한다.

도 1은 TGF-β1 및 고농도의 글루코즈(high glucose)로 유도된 인간 신세뇨관 상피세포인 HK2(human kidney2)에서 화학식 2의 화합물의 항섬유화 활성을 평가한 결과이다.
도 2는 TGF-β1로 유도된 인간 일차 간 성상세포(primary human hepatic stellate cell)에서 화학식 2의 화합물의 항섬유화 활성을 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명 화학식 2 화합물의 정맥 또는 경구 투여 후 마우스 혈중 농도를 측정한 실험 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 인간 신세뇨관 상피세포인 HK2 (human kidney2) 세포주에서 화학식 2 화합물의 신장 섬유화 억제 효과 확인

1.1. 세포의 배양

인간의 신세뇨관 상피세포인 HK-2(ATCC, VA, USA)는 5 ng/ml recombinant epidermal growth factor와 0.05 mg/ml bovine pituitary extract가 함유된 keratinocyte-SFM(GIBCO, NY, USA) 배지에서 5 % CO₂ 및 37 ℃ 조건으로 배양하였다.

1.2. 웨스턴 블롯 분석 (Western blot assay)

신장 섬유화에 대한 화학식 2의 화합물의 효과를 확인하기 위해 섬유화 표지자인 α-SMA, collagen1 및 fibronectin의 발현을 웨스턴 블롯 분석법으로 분석하였다. 상기와 같이 배양된 HK-2 세포를 6 well-plate에 well당 1×10⁵개 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군은 5.5 mM의 glucose(GIBCO, NY, USA)만 처리하였다. 실험군에 대해서는 60 mM의 glucose와 10 ng/ml의 human recombinant TGF-β1(R&D systems, MN, USA)와 함께 화학식 2의 화합물을 미처리 혹은 0.01, 0.1, 1 μM의 농도로 병용처리하여 48시간 추가로 배양하였다. 비교군으로 아데노신 A3 길항제 화합물로 알려진 MRS1220을 사용하였다. MRS1220은 당뇨병성 랫드에서 섬유화 마커인 α-SMA를 감소시켜 신장 손상을 회복시킨다는 것으로 알려져 있다. 이에, 동일 농도에서 비교를 위해 MRS1220 1 μM 농도를 추가 군으로 진행하였다. 배양된 세포는 protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) 및 phosphatase inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 첨가한 RIPA buffer(Cell Signaling Technology, MA, USA)를 처리하여 용해시켰다. 세포용해물은 4 ℃, 14,000 g에서 15분 동안 원심분리하여 상층액만 획득하였으며, SDS-PAGE로 분리하여 Bio-rad transfer system(Bio-rad, CA, USA)를 통해 PVDF membrane으로 트랜스퍼하였다. Membrane을 5% skim milk에 1시간 동안 blocking한 다음, anti-α-SMA antibody(1:1000; Abcam, MA, USA), anti-fibronectin antibody(1:1000; Abcam, MA, USA), anti-collagen1 antibody(1:1000; Abcam, MA, USA), 및 anti-GADPH antibody(1:10000; FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan)와 함께 배양하였다. 그 후 membrane을 세척하고 HRP 복합 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)에 1시간 배양한 후, ECL(Bio-rad, CA, USA) 발색시약을 사용하여 해당 단백질들의 발현 정도를 확인하였다. 각 밴드의 밀도 분석(Densitometric analysis)은 GAPDH로 표준화하여 image lab(Bio-rad, CA, USA) 프로그램을 사용해 정량화하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 나타난 바처럼, TGF-β1에 의해 HK-2 세포주에서 섬유화인자인 fibronectin, collagen1, 및 α-SMA의 발현이 증가되었다. 그러나 화학식 2의 화합물을 처리했을 때, TGF-β1으로 활성화된 HK-2 세포주에서 collagen1과 α-SMA가 감소하였다. 그리고 비교군으로 사용한 MRS1220은 TGF-β1으로 활성화된 HK-2 세포주에서 α-SMA만 감소하는 결과를 보였다. 그러므로 동일 농도에서 화학식 2의 화합물이 MRS1220에 비해, α-SMA 감소효과가 크고, collagen1을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다. 결론적으로 화학식 2의 화합물이 MRS1120에 비해 개선된 항섬유화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 2. 인간 일차 간 성상세포(primary human hepatic stellate cell) 세포에서 화학식 2의 화합물의 간 섬유화 억제 효과 확인

2.1. 세포 배양

인간 일차 간 성상세포(primary human hepatic stellate cell, Innoprot, Bizkaia, Spain)는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)을 미리 코팅한 플레이트에서 배양되었다. 10 ml FBS(fetal bovine serum), 5 ml stellate cell growth supplement 및 5 ml 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 stellate cell medium(Innoprot, Bizkaia, Spain) 배지에서 5 % CO₂ 및 37 ℃ 조건으로 배양하였다.

2.2. 웨스턴 블롯 분석 (Western blot assay)

간 섬유화에 대한 화합물1 의 효과를 확인하기 위해 섬유화 표지자인 α-SMA와 fibronectin의 발현을 웨스턴블롯 분석법으로 분석하였다. 상기와 같이 배양된 인간 일차 간 성상세포를 6 well-plate에 well당 7×10⁴개 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실험군에 10 ng/ml의 human recombinant TGF-β1(R&D systems, MN, USA)을 단독 혹은 0.1, 1, 10 μM의 농도의 화학식 2의 화합물과 병용처리하여 48시간 추가로 배양하였다. 웨스턴블롯 방법은 상기 실시예 1.2.에 기재된 바와 동일하게 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 나타난 바처럼, TGF-β1에 의해 Primary HSC 세포주에서 섬유화인자인 fibronectin 및 α-SMA의 발현이 증가되었다. 그러나 화학식 2의 화합물을 처리했을 때, TGF-β1으로 활성화된 Primary HSC 세포주에서 α-SMA의 발현이 감소하였다.

실시예 3. 동물실험을 통한 화학식 2의 화합물의 경구 투여 가능성 확인

3.1. ICR 마우스에서 약동학 시험

18-22g 무게의 6-8 주령 수컷 ICR 마우스에 화학식 2의 화합물을 정맥과 경구 투여하였다. 아래 표 1과 같이 시간대별로 채혈을 실시하여 혈중 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

군	동물수	용량 (mg/kg)	투여볼륨 (μl/g)	투여경로	Schedule	채혈시간
1	9	3	1	i.v.	Single dose	0.0833, 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12h (9 points)
2	9	30	10	p.o.	Single dose	0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24h (9 points)
3	9	60	10	p.o.	Single dose	0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24h (9 points)

3.2. 약동학 Parameter 분석

ICR 수컷 마우스에서 화학식 2의 화합물의 약동학 분석을 실시하였다. 약동학 분석은 Phoenix 7.0 (Pharsight, Sunnyvale, CA, USA)의 noncompartmental analysis 방식을 사용하여 분석하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

Route/Dose	AUC_last (ng*h/mL)	AUC_inf (ng*h/mL)	CL (L/h/kg)	V_d (L/kg)	T_1/2 (h, median)
IV bolus/ 3 mg/kg	2516.0	2543.5	1.2	3.5	2.0

Route/Dose	AUC_last (ng*h/mL)	AUC_inf (ng*h/mL)	C_max (ng/mL)	T_max (hr)	%F
Oral/ 30 mg/kg	23269.3	23285.8	10073.3	0.25	92.5
Oral/ 60 mg/kg	54446.51	54522.86	17166.67	0.50	107.2

표 2에 나타나는 바와 같이, 화학식 2의 화합물은 경구 투여 시 빠르게 잘 흡수되는 것을 확인하였다. 생체이용율은 100%이며, Cmax는 투여 후 1시간 이내에 도달하는 것을 확인하여 경구제로 개발 가능성을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물.
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, m은 1 내지 3의 정수, R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로 수소, 할로겐, 또는 CF₃임.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 (2S,3R,4S)-2-(8-((2-아이오도벤질)아미노)-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피라진-3-일)테트라하이드로티오펜-3,4-디올인, 섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 섬유증은 간 또는 신장 섬유증인, 섬유증의 치료 또는 완화용 약학 조성물.