KR20220125075A - 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물 - Google Patents

곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물에 관한 것으로, 본원발명 조성물에 의하는 경우, 유해균 생성 억제 활성을 나타내어 사료의 보존성을 향상시키며, 항바이러스 활성을 통해 동물의 생존 및 생장 향상 활성을 나타낼 수 있다.

Description

곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물{FEED ADDITIVE COMPOSITION FOR INHIBITING MOLD AND MOLD PRODUCTS}
본 발명은 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 점토광물 및 유산균을 포함하여, 유해균 생성을 억제를 통해 사료의 보존성을 높이고, 동물의 생존 및 생장 향상 활성을 나타낼 수 있는 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다.
곰팡이독소(mycotoxin)는 곰팡이에 의해 생성되는 2차 대사 산물로, 현재까지 아플라톡신(Aflatoxin), 오크라톡신(Ochratoxin A), 푸모니신(Fumonisin), 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol) 및 제랄레논(Zearalenone)등 약 400여종의 곰팡이독소가 밝혀졌다. 곰팡이 독소는 곡류, 두류 및 서류 등의 농작물에서 생산, 수확 및 저장 과정 중에서 주로 발생하고, 열에 매우 안정하며 가공과정에서도 잘 파괴되지 않는데, 이는 대부분의 사료가 옥수수, 콩 및 등 곡류와 부산물을 주원료로 만들어지므로, 사료의 제조공정 및 유통과정에서 큰 문제점으로 작용한다.
또한, 최근 곡물가격의 지속된 상승으로 인하여 저급한 원료를 사용함으로써 곰팡이 독소에 노출될 우려가 크며, 최근 연구자료에 따르면 배합사료 내의 데옥시니발레놀과 제랄레논의 오염농도가 2009년에 비해 2010년에 2 배 정도 높아졌다는 보고가 있다. 이러한 곰팡이독소를 제거하기 위한 방안으로 광물질을 이용한 흡착제거와, 미생물을 이용한 무독화방법 등 수많은 연구들이 진행되어 왔으며 그 검증 방법에 대한 연구들이 함께 진행되고 있으나, 아직까지 탁월한 해결책이 제시되지 않고 있는 실정이다.
종래에는 사료에 곰팡이 성장을 억제하기 위해 프로피온산이 약 60%이상 첨가되어 있는 곰팡이 성장 억제제가 사용되어 왔다. 하지만 프로피온산 60% 이상으로 구성된 곰팡이 성장 억제제는 곰팡이 성장 억제효과는 우수하지만 높은 산도로 인하여 사료 생산 시설의 부식을 초래하고 높은 휘발성과 자극적인 냄새로 인하여 가축의 기호성 감소, 사료 생산 작업자의 작업 불편 등의 단점이 있었다. 이를 보완하기 위해 프로피온산을 암모니아수 등의 염기성 물질로 중화하여 pH를 높이고 프로피온산 특유의 냄새를 줄이는 노력이 이루어져 왔으나 중화로 인하여 곰팡이 성장 억제력이 떨어지는 결과를 초래하여 사용량이 증가하는 단점이 있다.
한편, 가축이나 애완동물 사육에 있어서 세균성 질병, 바이러스성 질병, 기생충성 질병, 곰팡이성 질병 등 다양한 질병에 대한 예방 및 치료가 중요한 문제가 되고 있다. 이중 병원성 곰팡이(진균류)는 전 세계적으로 분포하며, 사람을 포함한 동물에 질병을 유발하고 있다는 점에서 곰팡이성(진균류) 질병의 예방 및 치료에 대한 수요가 증가하고 있다.
병원성 곰팡이는 항상 접촉에 의해 병을 유발시키는 것이 아니고, 감염 곰팡이의 종류, 숙주의 나이, 면역상태, 합병증 유무, 피부 건강도, 영양이나, 호르몬 상태에 따라 감염여부가 달리 나타난다. 이러한 까닭에 곰팡이로 인한 피부질환 발병 후 외용에 의한 치료보다는 사료 첨가제로서 가축 또는 애완동물에게 공급함으로써 이러한 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 대한 연구가 진행되고 있다.
이러한 예로는 대한민국 공개특허공보 10-2010-0112328호에서 항곰팡이제, 항균제를 첨가한 젤 형태의 사료를 이용하여 동물이 섭취하기 용이하면서도 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 사료 제품이 개발되어 있다. 그러나 이러한 항생제를 혼합하는 종래의 기술들은 항생제의 남용으로 인한 문제 및 환경 오염의 문제가 있기 때문에, 이러한 항생제를 대체할 목적으로 생약 성분의 제제가 연구되고 있다.
이에, 부작용의 문제가 적으면서도 곰팡이 및 곰팡이 생성물을 억제하여 사료의 보존성을 향상시키고, 항바이러스 활성을 통해 가축 또는 동물의 생존성 및 생장성이 향상되는 사료 첨가제 조성물에 대한 요구가 높아지고 있다.
KR 10-2150843 B1 KR 10-1677119 B1
본 발명의 목적은 점토광물 및 유산균을 유효성분으로 포함하여, 유해균 생성 억제 활성을 나타내어 사료의 보존성을 향상시키며, 항바이러스 활성을 통해 동물의 생존 및 생장 향상 활성을 나타내는 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본원발명의 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료첨가제 및 사료를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물은 점토광물 및 유산균을 유효성분으로 포함하며, 유해균 생성 억제 활성을 나타내어 사료의 보존성이 향상되는 것이다.
상기 점토광물은 규조토, 맥반석, 몬모릴로나이트, 벤토나이트, 세피올라이트, 일라이트, 제올라이트, 흑운모, 버미큘라이트 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 루코노스톡(Leuconostoc) 속, 바실러스(Bacillus) 속 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 균을 포함하는 것이다.
상기 조성물은 항바이러스 활성을 통해 동물의 생존 및 생장 향상 활성을 나타내는 것이다.
상기 동물은 소, 말, 돼지, 닭, 오리, 개, 양, 고양이 또는 토끼를 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 사료 첨가제는 상기 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 이용하여 제조한 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 사료는 상기 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 이용하여 제조한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 식물 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한 외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 식물 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 추출물은 감압 증류 및 동결 건조, 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 '유효성분'이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물은 점토광물 및 유산균을 유효성분으로 포함하며, 유해균 생성 억제 활성을 나타내어 사료의 보존성이 향상되는 것이다.
상기 본 발명에 포함하는 점토광물(clay mineral)은 토양 중의 점토 부분을 이루며, 주로 2차적으로 생성된 것으로서 입경이 0.002mm이하의 극히 미세한 광물 입자로 된 토상 광물의 총칭으로써 토양이나 풍화작용을 받은 암석에서 산출되며, 화산대가 발달한 지대의 화산재 등의 퇴적물이나 퇴적암에서 산출된다. 점토광물은 내부에 무수히 많은 기공이 형성되어 있어 표면적이 넓으며, 다량의 광물질을 함유하고 있어 이를 포함하여 가축의 성장을 촉진하고, 병에 대한 저항력을 높일 수 있다.
상기 점토광물은 규조토, 맥반석, 몬모릴로나이트, 벤토나이트, 세피올라이트, 일라이트, 제올라이트, 흑운모, 버미큘라이트 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명에서 포함할 수 있는 점토광물 중, 규조토(diatomaceous earth)는 규산(SiO2)가 주 성분이며, 이외에 Al2O3과 Fe2O3이 소량 첨가되어 있다. 규조토는 단세포 식물인 규조류의 유해가 호수나 바다에 가라앉아 형성된 퇴적물로서, 퇴적되는 과정에서 유기물질, 모래 및 산화철 등이 포함되고 있으며, 규조류의 종류와 퇴적 당시의 상황에 따라 산지별로 성분의 차이가 있다. 주로, 백색 또는 회백색을 띄고 가벼우며, 손가락으로 만지면 분말이 묻을 정도로 연하고 미세한 다공질이기 때문에 흡수성이 강하다. 규조토는 거의 비정질(non-crystal)이지만, 1,000 내지 1,600℃로 가열하면 1,000 내지 1,600℃로 가열하면 Cristallite 또는 tridymite가 된다.
맥반석(barley stone)은 명반석이라고도 하며, 화학성분은 KAl3(SO4)2(OH)6으로, SiO2 및 Al2O3가 대부분이며 Fe, Mg, Ca, Na, K, Mn, Ge 등의 미량 광물질이 소량 함유되어 있다. 육각 판상 또는 인상의 결정으로 나타나는데, 대개는 괴상 또는 입상이다. 굳기 3.5 내지 4, 비중 2.6 내지 2.9이다. 결정형의 것은 밑면에 완전한 쪼개짐이 있고, 쪼개짐 면에 진주광택이 난다. 괴상의 것은 광택이 없다. 백색, 회색이며 때로는 홍색, 황색, 적갈색을 띠기도 한다. 염산에 녹지 않고, 수산화칼륨이나 더운 황산에 녹는다. 열수변질작용을 받은 화산암 지대에서 산출된다. 맥반석의 함유되어 있는 미량 광물질은 가축 체내에서 유리되어 이용될 가능성이 있다.
몬모릴로나이트(montmorillonite)는 화학성분은 (AI, Mg)2Si4O10(OH)2 ·4H2O로 점토 광물의 일종이다. 괴상, 토상을 이룬다. 굳기 1∼1.5, 비중 2∼2.5, 굴절률 1.48∼1.6이다. 수분을 흡수하여 원래 부피의 7 내지 10배로 팽윤하는 성질이 있으며, 이온 교환성이 높다. 함수량 150 %에서 점착력이 생기고 약 500 %의 함수량에서 점착력을 잃으며, 내부 마찰저항이 작은 점 등 특수한 성질을 가진 점토이다. 백색, 회색, 담홍색인 것이 많고, 때로 청색, 녹색을 띠며 광택이 없다. 알루미늄이 풍부한 광물이나 암석의 변질로 인하여 생기며 점토가 함유된다.
벤토나이트(bentonite)는 석영, 장석, 제올라이트 등을 포함한 것이 많다. 빛깔은 백색, 회색, 담갈색, 담녹색 등을 나타낸다. 진주광택, 납상광택을 가지며 지방감이 있는 치밀한 괴상으로 산출되는데, 물을 흡착하여 팽윤하고, 양이온 교환성이 뚜렷한 것 등 몬모릴로나이트의 성질과 흡사하다. 응회암과 유리질 유문암이 변질된 것이다. 용도는 매우 넓어 석유정굴진용 이수의 주성분, 주물형의 결합제, 요업원료의 혼입제, 연고의 기초제로서 사용되기도 한다. 상기 벤토나이트는 사료 입자 상호간 점결력을 증가시켜 사료 형성에 도움이 되며, 가축의 장 내 수분을 흡수하여 자체 부피의 몇 배 되는 양으로 불어 가축의 위장관 내 영양소의 체류시간을 연장시킴으로 효소에 의한 소화시간을 개선시켜 영양소 소화를 촉진시켜줄 수 있는 특징이 있다.
세피올라이트(Sepiolite)는 해포석이라고도 한다. 화학성분은 Mg4Si6O15(OH)2·6H2O이며, 굳기 2∼2.5, 비중 2이다. 섬유상의 결정도 있으나 보통은 토상의 미세한 결정의 집합체로 전자현미경으로만 관찰할 수 있다. 백색, 회색, 녹색, 황색을 띠며 건조한 덩어리로 된 것은 물에 뜰 만큼 가볍다. 미국에서는 염호의 바닥에 다량으로 존재한다. 탐사보링용 이수나, 구워서 건조제로 사용한다.
일라이트(illite)는 화학조성은 (K,H3O)Al2(Si,Al)4O10(H2O,OH)2이며, 백운모에 가까운 것도 있으나 비교적 SiO2, MgO, H2O가 많고, K2O는 적다. 수백운모 등과 같은 계열의 광물이다. 굳기 1 내지 2, 비중 2.6 내지 2.9이다. 쪼개짐은 ［001］로 완전하며, 조흔색은 백색이며, 토상 광택이 있다. 알루미늄이 풍부한 이질 또는 응회암질 퇴적암 중에 산출되며, 열수성 광상모암의 변질광물로서 산출된다.
제올라이트(zeolite)는 비석이라고도 불리며, 종류는 많으나 함수량이 많은 점, 결정의 성질, 산상 등에 공통성이 있다. 굳기는 6을 넘지 않으며, 비중은 약 2.2이다. 일반적으로 무색 투명하거나 백색 반투명하다. 대개의 종류는 염산에 녹아 흔히 아교 모양이 되지만, 소수의 종류는 염산에 녹지 않는다. 주요한 종류로서 방비석, 어안석, 캐버자이트, 소다비석·휼란다이트, 스틸바이트, 로몬타이트, 이네사이트 등이 있다. 현무암이나 휘록응회암 등 염기성 화성암의 공동(空洞) 속이나 열극에서 산출되며, 때로는 화강암, 편마암 중에 2차광물로서 존재한다. 또한, 금광맥 그 밖의 광맥 중에 산출되는 경우도 있다. 결정구조적으로 각 원자의 결합이 느슨하여, 그 사이를 채우고 있는 수분을 고열로 방출시켜도 골격은 그대로 있으므로 다른 미립물질을 흡착할 수 있다. 이 성질을 이용해서 흡착제로 사용하며, 크기가 다른 미립물질을 분리시키는 분자체로 사용한다. 상기 제올라이트는 결정격자점인 사면체자리(T-site)를 중심으로 TO4(T는 Si 또는 Al)가 반복단위로 구성된 3차원적 골격구조를 이루어 골격 내부에 물질이동이 가능한 동공을 가지고 있다. 상기 제올라이트는 유해한 균체, 독소, gas 및 잉여수분을 흡착하고 배설하여 연변(軟便)과 하리(Diarrhoe)를 방지하며 미량 공물 공급원이 될 수 있으며, 소화율 개선과 정장작용 개선 효과도 있다고 한다.
흑운모(biotite)는 많은 화성암, 변성암에서 산출되며, 퇴적암에도 드물지 않다. 흑운모는 게르마늄 함유량이 36ppm에 이르며, 황토와 맥반석 보다 약 3배 이상 원적외선 방사율(94%)이 높아 면역력 강화, 인터페론 생성, 바이러스 감염, 체내 중금속 배출 등 생체 보호 활성이 나타나는 것으로 알려져 있다. 또한, 인체나 가축에 해로운 가스를 흡착하는 성질이 있고, 돈사, 우사 등 가축을 기르는 곳의 암모니아 가스 흡착제로 이용 가능하다.
버미큘라이트(vermiculite)는 질석이라고도 하며, 화강암 속의 흑운모가 분해된 것으로, 금운모나 흑운모의 변질산물인 함수 운모이며 흡습수, 층간수, 결정수 형태의 3가지 수분을 모두 함유하고 있는 특징이 있다. 색은 회백색 또는 갈색이며 진주광택이 나고 양이온교환능력이 크다. 상토로 사용되는 버미큘라이트는 800℃ 내지 1,000℃ 정도의 고온에서 약 1분 동안 가열하여 15 내지 20배 팽창된 것을 사용하며 형태적 변화를 통해 높은 통기성과 공기-수분 친화력을 갖는다. 또한, 동물의 분비물 흡수, 흡착 능력이 뛰어나 돈분, 계분, 우분의 악취를 제거하는 효과를 갖는다.
상기 기재된 점토광물은 항곰팡이, 항바이러스 활성 및 동물의 생장성을 향상시키기 위해 포함되는 것으로, 그 종류는 제한하지 않으나 일라이트 및 벤토나이트를 포함하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 일라이트와 벤토나이트를 1:1로 포함하는 것일 수 있으나 그 중량비율에 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 점토광물은 정제수에 넣고 초음파 처리하여 내부 기공 내 불순물이 제거된 것일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 루코노스톡(Leuconostoc) 속, 바실러스(Bacillus) 속 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 균을 포함하는 것이다.
상기 유산균(Lactic acid bacteria)은 발효에 의해 생장하는 세균 중 발효 결과, 유산을 주된 산물로 생산하는 미생물을 의미한다. 유산균은 일반적으로 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코쿠스(Pediococcus) 속, 웨이셀라(Weissella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 등 다양한 균종을 포함하고 있다.
상기 기재한 유산균 중에서 본원발명에서는 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 웨이셀라(Weissella) 속 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유산균을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 락토바실러스(Lactobacillus) 속은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 애시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 김치아이(Lactobacillus kimchii), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillu plantarum), 락토바실러스 쿠르바투스 서브시피. 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus subsp. curvatus), 락토바실러스 사케이 서브시피. 사케이(Lactobacillus sakei sibsp. sakei) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이다.
상기 류코노스톡(Leuconostoc) 속은 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메젠테로이드 서브스피. 덱스트라니쿰(Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum), 류코노스톡 메젠테로이드 서브스피. 메젠테로이드(Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides), 류코노스톡 아르젠티눔(Leuconostoc argentinum), 류코노스톡 카르노숨((Leuconostoc carnosum), 류코노스톡 젤리둠(Leuconostoc gellidum), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 인해(Leuconostoc inhae), 류코노스톡 가시코 미타툼(Leuconostoc gasicomitatum) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이다.
상기 웨이셀라(Weissella) 속은 웨이셀라 코레엔시스(Weissella koreensi), 웨이셀라 하니아이(Weissella hanii), 웨이셀라 김치아이(Weissella kimchii), 웨이셀라 솔리(Weissella soli), 웨이셀라 콘푸사(Weissella confusa) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이다.
보다 바람직하게, 본원발명의 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 류코노스톡 메젠테로이드 서브스피. 메젠테로이드(Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides) 및 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)를 모두 포함하는 복합 유산균으로 포함하는 경우, 항곰팡이 활성을 통해 사료의 보존성 향상이 가능하며, 항바이러스활성 및 동물의 생장성 개선 효과를 나타낼 수 있다.
보다 구체적으로, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 류코노스톡 메젠테로이드 서브스피. 메젠테로이드(Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides) 및 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)를 각각 1:1:1의 비율로 포함할 수 있으며, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물은 개보리뺑이 추출물, 각시개서실 추출물 및 고산부전바디 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 개보리뺑이(Lapsana apogonoides (Maxim.) J.H.Park & K. Bremer)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 두해살이풀로 장뚝갈 또는 보리뺑풀 이라고도 한다. 논밭 근처에서 자라며, 높이 4 내지 20cm이다. 전체에 털이 많이 나나 점차 없어지고 연한 줄기는 뭉쳐나며 가지를 친다. 뿌리에 달린 잎은 뭉쳐 사방으로 퍼지고, 줄기에 달린 잎은 어긋나며 잎은 긴 타원형으로 민들레잎 같다. 줄기에 달린 잎은 1 내지 3개가 서로 떨어지고 밑쪽 잎은 뿌리에 달린 잎과 비슷하다. 잎 길이 4 내지 10cm, 나비 1 내지 2cm이며 위쪽으로 갈수록 점차 작아진다. 3 내지 6월에 노란색 꽃이 피는데, 처음에는 엉성한 산방상(揀房狀)이지만 가지가 자라서 밑으로 처지며 꽃대는 1.5 내지 5cm이다. 총포는 원뿔형으로 바깥조각은 짧고 털이 나며, 안조각은 5개이고 가장자리가 막질이다. 작은꽃은 6 내지 9개이고 화관은 길이 5 내지 6mm이다. 열매는 수과로서 길이 3 내지 4.5mm이며 긴 타원형이고 갈색이다. 한국(제주, 전남, 전북), 일본, 중국 중부 등지에 분포한다.
상기 각시개서실(Chondria dasyphylla)은 홍조식물 비단풀목 빨간검둥이과의 해초로, 간조선(干潮線) 부근의 바위 위에 자란다. 높이 10∼20cm, 아랫부분 지름 1∼1.5mm이다. 원기둥 모양이며 차츰 위쪽으로 가늘어진다. 3∼6회 겹깃꼴로 갈라져서 피라미드 모양이 된다. 몸의 아랫부분에 나는 가지는 약간 뭉쳐서 나며 기는가지와 같아서 새싹이 나오기도 한다. 가지는 매우 넓게 펼쳐지고 수평으로 나기도 한다. 4분포자낭(四分胞子囊)은 작은가지 꼭대기 아래 또는 가운데보다 조금 위쪽에 모여서 생긴다. 낭과(囊果)는 작은가지의 옆면에 1개 또는 2∼3개가 모여서 생기는데, 달걀 모양이고 자루가 없다. 빛깔은 자줏빛을 띤 갈색이거나 노란색이다.
상기 고산부전바디(Coelopleurum saxatile DRUDE.)는 부전바디라고도 불리며, 산형과의 여러해살이풀로 뿌리는 굵고 둥글고 목질이며 갈색을 띈다. 줄기는 곧추서고 높이 30cm 정도이며 둥글고 질은 굳으며 홈이 있고 담녹색이며 마디에는 흔히 짧은 털이 있으며 속은 비었고 가지를 친다. 잎은 어긋나기하고 3출 복엽이며, 열편은 넓은 피침형이고 예리한 톱니가 있으며, 잎 밑동은 넓은 싸개골로 되어 줄기를 감싼다. 꽃은 백색으로 복산형 꽃차례를 이루고, 소산형 꽃차례가 20여 개의 꽃이 되며, 총포조각은 송곳 모양이다. 꽃은 7~8월에 피며 과실은 분과로 9월에 성숙한다. 상기 고산부전바디는 식용으로 쓰이거나 뿌리는 약용으로 쓰이기도 한다.
바람직하게, 상기 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물은 상기 점토광물 및 복합 유산균 이외에 개보리뺑이 추출물, 각시개서실 추출물 및 고산부전바디 추출물을 추가로 더 포함하는 경우, 상기 복합 유산균과 상기 추출물의 혼합 사용에 따른 상승효과로 유산균 만을 포함한 경우에 비해 보다 우수한 항곰팡이 활성을 나타내어 사료의 보존성을 향상시키고, 항바이러스 활성을 통해 동물의 생존 및 생장 향상 활성을 나타낼 수 있으며, 보다 우수한 기호성을 나타낼 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물은 점토광물 100 중량부에 대하여, 복합 유산균 1 내지 10 중량부, 개보리뺑이 추출물 10 내지 30 중량부, 각시개서실 추출물 10 내지 30 중량부 및 고산부전바디 추출물 10 내지 30 중량부를 포함할 수 있다.
상기 중량부 범위 내로 포함하는 경우, 각 구성의 상호 작용에 의한 상승효과로 임계적 의의가 있는 정도의 상승효과가 발현되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 상승 효과가 급격히 저하되거나 거의 없게 된다.
상기 천연추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용하여 추출되는 것일 수 있다.
상기 추출물을 제조하는 방법은 초음파 추출법, 침출법 및 환류 추출법 등 당업계의 통상적인 추출 방법일 수 있다. 구체적으로 세척 및 건조로 이물질이 제거된 천연물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 상기 용매들을 순차적으로 시료에 적용하여 추출한 추출물일 수 있다.
상기 초음파 추출법은 30 내지 50℃, 0.5 내지 2.5시간 동안 반응을 진행하며, 추출용매는 물 또는 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다. 구체적으로는 40 내지 50℃, 1 내지 2.5시간 동안 추출하며, 추출용매로 물 또는 70 내지 80%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다.
상기 침출법은 15 내지 30℃, 24 내지 72시간 동안 진행하며, 추출 용매로 물 또는 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올을 이용한다. 보다 구체 적으로는 20 내지 25℃, 30 내지 54시간 동안 진행하며, 추출 용매는 물 또는 70 내지 80%의 탄소수 1 내지 6의 알코올에 의한 것이다.
상기 환류 추출법은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 100mL기준으로, 천연물의 분쇄물 10 내지 30g, 환류 시간 1 내지 3시간 및 50 내지 100%의 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 물에 의한다. 보다 구체적으로, 탄소수 1 내지 6의 알코올100Ml 또는 물 100mL 기준으로, 천연물의 분쇄물 10 내지 20g, 환류 시간 1 내지 2 시간 및 70 내지 90%의 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 물에 의한 것이다.
상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72 시간 동안 방치될 수 있으며, 보다 구체적으로 24 내지 48시간 동안 방치될 수 있다.
추출 후, 추출물은 새로운 분획 용매를 순차적으로 적용하여 분획할 수 있다. 분획시 사용하는 분획 용매는 상기 용매는 물, 헥산, 부탄올, 에틸아세트산, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이며, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 메틸렌클로라이드이다.
추출물 또는 분획물을 얻은 후에는 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 유해균 및 유해균의 생성물 억제 활성을 나타내어 사료의 보존성이 향상되는 것을 특징으로 하는 것이다.
상기 유해균은 특별히 한정된 것은 아니며, 효모, 사상균, 곰팡이, 녹병균 및 버섯으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 유해균의 생성물 또한 상기 기재한 유해균으로부터 생성된 생성물인 것으로, 바람직하게는 곰팡이 및 곰팡이 생성물일 수 있다.
상기 곰팡이는 진균(fungus, fungi)이라고도 불리며, 모양에 따라 효모 모양 진균과 실 모양 진균으로 나뉜다. 본원발명에서 억제하고자 하는 곰팡이는 Aspergillus(아스퍼질러스) 속, Penicillium(페니실리엄) 속 및 Fusarium(푸사리엄) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 곰팡이일 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 곰팡이 생성물은 곰팡이 독소이며, 이는 진균 독소(mycotoxin)라고도 불린다. 상기 진균 독소는 곰팡이로부터 생성되는 이차대사산물로, 생산균의 속명에서 Aspergillus 속 진균독소(아플라톡신, 스테리그마토시스틴, 오크라톡신 등), Penicillium 속 진균독소(티토레오비리딘, 티토리닌, 루테오스카이린, 루굴로신, 루브라독소 등), Fusarium 속 진균독소(트리코데센류, 제랄레논 등) 등으로 분류한다.
본원발명의 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물은 상기 기재한 곰팡이 및 곰팡이 생성물로부터 선택된 하나 이상을 억제할 수 있다.
상기 조성물은 항바이러스 활성을 통해 동물의 생존 및 생장 향상 활성을 나타내는 것이다.
상기 항바이러스는 인플루엔자, 조류 인플루엔자, 뉴캐슬바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 콕사키바이러스(Cossackievirus), 엔테로바이러스71형 (Enterovirus-71), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus), 구제역바이러스(Foot and mouth disease, FMD), 콜로라도참 진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 간염바이러스 B형 C형, 돼지열병바이러스, 소바이러스성 설사병(Bovine Viral Diarrhea Virus), 돼지생식기호흡기증후군(.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 돼지오제스키병, 로타바이러스, 파보바이러스, 돼지유행성설사(Porcine epidemic diarrhea viru)를 포함할 수 있으나 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 항바이러스 활성은 대식 세포를 활성화시켜 다양한 바이러스의 증식을 억제 활성을 통해 나타낼 수 있다.
상기 동물은 소, 말, 돼지, 닭, 오리, 개, 양, 고양이 또는 토끼를 포함하는 것이다.
상기 본원발명 조성물의 항바이러스 활성을 통해 생존 및 생장 향상 활성을 나타낼 수 있는 동물은 소, 말, 돼지, 닭, 오리, 개, 양, 고양이, 토끼를 포함할 수 있으며, 이에 제한하는 것은 아니며, 사료를 섭취하는 동물의 경우 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 사료 첨가제는 상기 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 이용하여 제조된 것이다.
상기 사료 첨가제는 동물의 사료 내 유해균 생성 억제 활성을 나타내어 사료의 보존성이 향상될 수 있으며, 항바이러스 활성을 통해 동물의 생존 및 생장 향상 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 사료는 상기 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 이용하여 제조된 것이다.
본 발명의 곰팡이 및 곰팡이의 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물에 의하면 점토광물 및 유산균을 유효성분으로 포함하여, 유해균 생성 억제 활성을 통한 사료의 보존성 향상 및 항바이러스 활성을 통한 동물의 생존 및 생장성이 향상될 수 있다.
또한, 본 발명의 곰팡이 및 곰팡이의 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료첨가제 및 사료를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 본원발명 조성물의 RA264.7 세포 및 HUVEC 세포에서의 세포생존율에 대한 실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 천연추출물의 RA264.7 세포 및 HUVEC 세포에서의 세포생존율에 대한 실험 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스(PR-8) 접종에 대한 본원발명 조성물의 항바이러스 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스(VSV) 접종에 대한 본원발명 조성물의 항바이러스 실험 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스(EV-71) 접종에 대한 본원발명 조성물의 항바이러스 실험 결과이다.
[제조예: 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물의 제조]
1. 점토광물 분말(CM)의 제조
일라이트 및 벤토나이트를 각각 1:1의 중량비율로 혼합하고, 평균 직경이 5 내지 10 ㎛ 이며, 평균 직경의 표준 편차가 1 내지 3 ㎛가 되도록 분쇄한 뒤, 정제수에 혼합하여 내부 기공 내 불순물 제거한 후 건조하여 점토광물 분말(CM)로 제조하였다.
2. 유산균의 제조
본원발명의 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물에 첨가하기 위한 복합유산균은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei, L1), 류코노스톡 메젠테로이드 서브스피. 메젠테로이드(Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides, L2) 및 웨이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis, L3)을 포함하도록 하였으며, 상기 균주를 각각 유산균 배양 배지인 MRS에 37℃에서 12시간 증균배양하여 사용하였다.
3. 천연추출물의 제조
개보리뺑이 추출물의 제조
개보리뺑이를 세척 및 건조하고, 분쇄한 뒤 추출 용매인 증류수를 1:15(w:v)의 비율로 가한 다음 완전히 침지 시킨 후, 80℃에서 환류시키면서 2시간씩 3회 반복 추출하였다. 추출액은 Whatman No. 2 여과지로 여과하였다. 여과액은 60℃에서 감압 농축하여 분말 시료를 제조하여 실험에 사용하였다. 열수 추출하고, 농축 여과하여 개보리뺑이 추출물(LE)을 제조하였다.
기타 추출물의 제조
상기 개보리뺑이 추출물(LE)과 동일한 방법으로, 각시개서실 추출물(CE) 및 고산부전바디 추출물(SE)을 제조하였다.
4. 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물
점토광물 분말(CM)과 유산균(L1 내지 3)을 하기 표 1과 같이 혼합하여 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물(M1 내지 M5)을 제조하였다.
또한, 천연추출물(LE, CE 및 SE)을 더 포함하는 M6 내지 M13의 경우, 점토광물 분말(CM)과 천연추출물(LE, CE 및 SE)을 정제수에 함께 넣고 가열하여 점토광물 분말(CM)에 천연추출물이 흡착되도록 하였다. 이후, 점토광물 분말(CM)을 분리하여 건조시킨 후, 유산균(L1 내지 L3)을 표 2와 같은 중량부로 혼합하여 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물(M6 내지 M13)을 제조하였다.
M1 M2 M3 M4 M5
CM 100 100 100 100 100
L1 - 6 - - 2
L2 - - 6 - 2
L3 - - - 6 2
LE - - - - -
CE - - - - -
SE - - - - -
(단위 : 중량부)
M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13
CM 100 100 100 100 100 100 100 100
L1 2 2 2 2 2 2 2 2
L2 2 2 2 2 2 2 2 2
L3 2 2 2 2 2 2 2 2
LE 20 - - 1 10 20 30 40
CE - 20 - 1 10 20 30 40
SE - - 20 1 10 20 30 40
(단위 : 중량부)
[실험예 1 : 세포독성 검사]
1-1. 세포 배양
RAW264.7 세포는 10% 소태혈청(fetal bovine serum; FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillinstreptomycin)이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였으며, HUVEC 세포는 EGMTM-2 SingleQuotsTM Kit가 첨가된 EGMTM-2 Medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였으며, 2-3일 주기로 계대 배양하여 실험을 진행하였다.
1-2. 세포 생존율 측정
곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물의 안전성 평가를 위하여 세포독성을 측정하는 시험을 진행하였다. 96 well plate에 RAW264.7 세포, HUVEC 세포를 1.5Х105cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다 실험을 하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, 곰팡이 및 곰팡이 억제용 사료 첨가제 조성물을 각각 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 EZ-Cytox 용액을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였으며, 그 결과는 하기 도 1과 같다.
하기 도 1을 참조하면, 본원발명 곰팡이 및 곰팡이 억제용 사료 첨가제 조성물 M1 내지 M5의 RA264.7 세포 및 HUVEC 세포에서 세포생존율을 측정한 결과, 본원발명의 조성물이 세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
[실험예 2 : 곰팡이 성장 억제 및 곰팡이 생성물 억제 활성 실험]
본원발명 조성물의 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제 활성을 평가하기 위해 하기의 실험을 진행하였다.
2-1. 곰팡이 성장 억제 활성
곰팡이에 대한 본원발명 조성물의 최소저해농도((minimal inhibitory concentration, MIC))를 결정하기 위해, 기체의 항균력 측정장치 및 기체의 항균력 측정방법(한국 등록특허 제10-1406387호)을 사용하였다.
먼저 곰팡이 포자 추출액을 제조하기 위해, 곰팡이를 배양한 Dichloran 18% Glycerol agar(DG18) 한천배지에 10 mL의 0.1% peptone water with 30% glycerol(0.1% PW30G)을 분주하고, 스프레더를 이용하여 진균을 배양한 배지 위의 집락을 분리시킨 후, 멸균된 거즈를 이용하여 곰팡이의 집락과 0.1% PW30G가 혼합된 현탁액을 여과하였다. 현탁액의 포자 수는 Neubauer counting chamber(hemocytometer)와 현미경을 이용하여 계수하였다. 상기 포자 현탁액은 0.1% PW30G를 이용하여 105 또는 106 spores/mL의 농도로 희석한 후, 희석된 포자 현탁액을 5 mL씩 혼합하여 실험에 사용할 10 mL의 곰팡이 포자 추출액을 준비하였다. DG18을 제조하여 고압 멸균시켰다. 액상의 상기 배지를 항균력 측정장치의 상부 용기에 0.35 mL씩 넣고 굳힌 후, 곰팡이 포자 추출액(ca. 106 spores/mL) 10 ㎕를 분주하여 미생물이 배지에 흡착되도록 laminal flow biosafety hood (22±2℃)에서 30분간 유지하였다.
본원발명 곰팡이 및 곰팡이 억제용 사료 첨가제 조성물(M1 내지 M5)은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 이용하여 단계별로 이진 희석하였다. 상기 본원발명 조성물(M1 내지 M5) 희석액을 각각 paper disc(Advantec Toyo Kaisha. Ltd., Tokyo, Japan)가 들어있는 항균력 측정장치의 하부 용기에 10 ㎕씩 분주한 후, 상부 용기와 하부 용기를 빠르게 결합하여 밀봉시켜 주었다. 밀봉된 용기들은 25℃ 배양기에서 120시간 동안 배양한 후, 배지 위의 집락 형성 유 무를 육안으로 관찰하여 집락이 형성되지 않은 본원발명 조성물(M1 내지 M5)의 최소 농도를 최소저해농도(MIC)로 설정하였고, 실험 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
최소저해농도(Minimal inhibitory concentration(㎕/ml))
Aspergillus niger Aspergillus flavus Fusarium
oxysproum		 Penicillium pinophilum
M1 0.7540 0.6980 0.7280 0.7960
M2 0.1650 0.1170 0.1240 0.1380
M3 0.1280 0.0790 0.1140 0.1130
M4 0.1340 0.0620 0.0980 0.0970
M5 0.0318 0.0340 0.0490 0.0510
(단위 : ㎕/ml)
상기 표 3을 참조하면, 본원발명 조성물에 의한 곰팡이 최소저해농도(MIC)가 유산균 L1 내지 L3을 각각 포함하는 M2 내지 M4의 경우 M1에 비해 낮은 정도의 농도를 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 유산균 L1 내지 L3을 모두 포함하는 M5의 경우 0.510㎕/ml 이하의 낮은 최소저해농도(MIC)를 보이는 것을 통해, 본원발명 조성물의 곰팡이 4종(Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Fusarium oxysproum, Penicillium pinophilum)에 대한 항진균 효과가 우수함을 확인하였다.
2-2. 실제 사료에서 본원발명 조성물의 곰팡이 성장 억제 효과 확인
상기 2-1에서 곰팡이 4종(Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Fusarium oxysproum, Penicillium pinophilum)에 대한 강한 항균력을 보인 M1 내지 M5를 사료에 첨가하여 사료에 대한 곰팡이 성장 억제 활성을 측정하였다.
원형의 폴리스틸렌 용기를 이용하여 상기 실험을 위한 밀폐용기를 제조하였다. 밀폐용기 내부에 사료를 놓기 위해 작은 페트리 접시 뚜껑을 위치시켰다. MIC를 측정하는데 사용되는 본원발명 조성물(M1 내지 M5)의 상부 부분을 뒤집어 작은 페트리 접시 뚜껑 옆에 위치시키고, 멸균된 8 mm paper disc를 본원발명 조성물 틀의 상부 부분 내부에 위치시켰다. 밀폐용기의 내부 상대 습도를 93%로 유지시키기 위해, 실험을 진행하기 최소 12시간 전 20 mL의 포화 질산칼륨을 밀폐용기 바닥에 넣은 후, 25℃에서 보관하였다.
사료를 실온(22±2℃)에서 자외선 살균한 뒤, 사료 위에 100㎕의 상기 곰팡이 4종 포자 혼합액 (ca. 105spores/mL)을 각각 10점 점 접종(spot inoculation)하고 laminar flow biosafety hood(22±2℃)에서 1시간동안 건조시켰다. 건조된 사료를 밀폐용기 내부의 작은 페트리 접시 뚜껑 위에 놓고, 액상의 본원발명 조성물(M1 내지 M5)를 각각 paper disc에 분주하였다. 분주된 액상의 본원발명 조성물(M1 내지 M5)이 밀폐용기에서 모두 기화되었을 때의 본원발명 조성물의 최종 농도가 0.01㎕/mL, 0.05 ㎕/mL, 0.1㎕/mL가 되도록 하였다. 액상의 본원발명 조성물(M1 내지 M5)을 분주한 후, 밀폐용기를 파라필름을 이용하여 밀봉시키고, 25℃에서 120시간 동안 배양하였다.
곰팡이 4종이 각각 배양된 사료를 10 mL의 0.1% PW30G를 포함한 Whirl-pak bag에 넣은 뒤, 균질화 기기(Stomacher)를 이용하여 1분간 pummeling하였다. 0.1% PW30G를 이용하여 사료와 0.1% PW30G 혼합액을 십진 희석한 후, 이를 DG18 한천 배지에 평판 도말하였다. DG18 한천 배지는 25℃에서 48시간 동안 배양시킨 후, 곰팡이로 추정되는 집락(진녹색 집락)을 계수하여 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다. 평판 도말의 이론적인 검출한계는 0.1 log CFU/cm2이었다.
곰팡이 개체 수(log CFU/cm2)
Aspergillus niger Aspergillus flavus
초기값 본원발명 조성물 농도 (㎕/mL) 초기값 본원발명 조성물 농도 (㎕/mL)
0 0.01 0.05 0.1 0 0.01 0.05 0.1
M1 2.8±0.1 6.4±0.1 6.1±0.2 5.6±0.2 5.3±0.1 2.6±0.2 5.8±0.1 5.6±0.3 5.2±0.2 5.0±0.2
M2 2.8±0.1 6.4±0.1 5.7±0.1 5.2±0.2 3.5 ±0.2 2.6±0.2 5.8±0.1 5.3±0.1 4.8±0.1 3.4±0.3
M3 2.8±0.1 6.4±0.1 5.3±0.3 4.9±0.1 3.4±0.3 2.6±0.2 5.8±0.1 5.2±0.1 4.5±0.2 3.0±0.3
M4 2.8±0.1 6.4±0.1 5.4±0.2 5.0±0.3 3.4±0.4 2.6±0.2 5.8±0.1 5.2±0.1 4.6±0.2 3.2±0.3
M5 2.8±0.1 6.4±0.1 4.8±0.2 3.5±0.1 2.9±0.3 2.6±0.2 5.8±0.1 4.7±0.2 3.1±0.1 2.7±0.1
(단위 : log CFU/cm2)
곰팡이 개체 수(log CFU/cm2)
Fusarium oxysproum Penicillium pinophilum
초기값 본원발명 조성물 농도 (㎕/mL) 초기값 본원발명 조성물 농도 (㎕/mL)
0 0.01 0.05 0.1 0 0.01 0.05 0.1
M1 2.9±0.2 6.0±0.3 5.7±0.1 5.5±0.1 5.2±0.1 2.4±0.1 5.6±0.1 5.3±0.2 5.1±0.1 5.0±0.3
M2 2.9±0.2 6.0±0.3 5.5±0.3 4.9±0.1 4.1±0.3 2.4±0.1 5.6±0.1 4.9±0.2 3.4±0.1 2.9±0.2
M3 2.9±0.2 6.0±0.3 5.2±0.2 4.9±0.3 3.9±0.2 2.4±0.1 5.6±0.1 5.0±0.1 4.0±0.3 3.0±0.1
M4 2.9±0.2 6.0±0.3 5.3±0.1 4.8±0.3 4.0±0.2 2.4±0.1 5.6±0.1 4.9±0.1 3.7±0.2 2.9±0.1
M5 2.9±0.2 6.0±0.3 4.9±0.1 3.9±0.2 3.0±0.1 2.4±0.1 5.6±0.1 4.7±0.2 3.6±0.1 2.6±0.2
(단위 : log CFU/cm2)
상기 표 4 및 표 5를 참조하면, 사료에 접종된 곰팡이 4종 각각의 초기 개체수는 Aspergillus niger 2.8±0.1 log CFU/cm2, Aspergillus flavus 2.6±0.2 log CFU/cm2, Fusarium oxysproum 2.9±0.2 log CFU/cm2, Penicillium pinophilum 2.4±0.1 log CFU/cm2이었으며, 본원발명 조성물(M1 내지 M5)를 처리하지 않고 120 시간 배양한 경우의 개채수는 각각 Aspergillus niger 6.4±0.1 log CFU/cm2, Aspergillus flavus 5.8±0.1 log CFU/cm2, Fusarium oxysproum 6.0±0.3 log CFU/cm2, Penicillium pinophilum 5.6±0.1 log CFU/cm2으로 증가하였다.
이와 비교하여, 본원발명 조성물(M1 내지 M5)을 농도별 처리한 결과, 점토광물만을 포함하는 M1의 경우 곰팡이 개체 수가 줄어드는 정도가 미미한 것을 확인할 수 있었으나,
추가적으로 유산균 L1 내지 L3을 각각 포함하는 M2 내지 M4, 그리고 유산균 L1 내지 L3을 모두 포함하는 M5의 경우 유의미하게 사료에서의 곰팡이 생육을 억제할 수 있음을 확인하였다. 특히 M5의 경우 곰팡이 4종에 대한 실험 결과 모두 초기값과 유사한 정도의 곰팡이 개체 수를 나타내는 것을 확인하였다.
결과적으로, 본원발명 조성물을 사료에 처리하는 경우, 낮은 농도에서도 사료에 존재하는 곰팡이 4종의 생육을 억제할 수 있음을 나타낸다.
또한, 이는 곰팡이 생육을 억제함으로써 곰팡이로부터 배출되는 곰팡이 생성물(곰팡이 독소) 억제가 가능함을 의미하여, 본원발명 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물(M1 내지 M5)에 의하는 경우 곰팡이를 포함하여 곰팡이 생성물 또한 억제할 수 있음에 따라, 사료 내 곰팡이 독소 축적을 방지할 수 있음을 의미한다.
결과적으로, 상기 실험예 2-1 및 2-2에 따라, 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제활성을 통해 곰팡이 생성억제에 의해 사료 보존성이 향상될 수 있음을 확인할 수 있다.
[실험예 3 : 항바이러스 활성 실험]
본원발명 조성물의 항바이러스 활성을 평가하기 위해 인플루엔자 바이러스(Swine Influenza virus, PR8), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV), 엔테로바이러스71형(enterovirus-71, EV-71)에 대한 항바이러스 활성 실험을 진행하였다. 상기 인플루엔자 바이러스(PR8) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)는 마우스 대식세포주인 Raw 264.7, 엔테로바이러스71형(EV-71)은 헬라세포주(HELA cell line)을 키워 실험에 사용하였다.
3-1. 바이러스 접종 전 본원발명 조성물 전처리
6-웰 TC 플레이트에 세포를 배양한 후, 1% FBS가 첨가된 DMEM에 상기 제조예 1에서 제조된 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물(M1 내지 M5, pH 조정)을 처리하였다. 음성 대조군은 1% FBS가 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조군(Positive control)은 Mouse IFN-B(500units/㎖)를 처리하였다.
본원발명 조성물(M1 내지 M5) 처리 12시간 후, PR8-gfp(MOI:1), VSV-gfp(MOI:1), EV-71(MOI:0.5)을 각각 접종하였다. 접종 2시간 후 접종액을 제거한 후, PBS로 3회 세척하고 12 내지 24시간 후 바이러스 감염 정도를 측정하였고, 그 결과는 하기 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
하기 도 3은 PR 8-GFP 접종에 대한 실험결과이며, 도 4는 VSV-GFP 접종에 대한 실험결과이고, 도 5는 EV-71 접종에 대한 실험결과이다. 이를 참조하면 본원발명의 M2 내지 M4의 경우 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 및 엔테로바이러스 감염율 이 현저히 떨어졌으며, 특히 유산균 L1 내지 L3을 모두 포함하는 M5의 경우 바이러스에 대한 감염율이 모두 매우 낮아진 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본원발명 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 전처리 하는 경우 항바이러스 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있다.
3-2. 바이러스 접종과 본원발명 조성물 동시처리
상기 3-1의 실험과 동일하게 진행하되, 본원발명 조성물 M1 내지 M5 처리 후, 바로 PR8-gfp(MOI:1), VSV-gfp(MOI:1), EV-71(MOI:0.5)을 각각 접종하였으며, 접종 2시간 후 접종액을 제거한 후, PBS로 3회 세척하고 12 내지 24시간 후 바이러스 감염 정도를 측정하여 그 결과를 하기 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
하기 도 3 내지 도 5를 참조하면, 본원발명 조성물 M1 내지 M5를 전처리한 경우와 유사한 정도의 항바이러스 활성이 나타냄을 확인하였다.
결과적으로 바이러스 접종 전 본원발명 조성물을 전처리하거나, 바이러스 접종과 본원발명 조성물을 동시처리하는 경우 모두 항바이러스 활성이 모두 우수하게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 4 : 동물의 생장성 향상 실험]
본원발명 조성물(M1 내지 M5)의 동물 생존 및 생장 향상 실험을 확인하기 위해 하기의 실험을 진행하였다.
본원발명 조성물에 대한 효과를 확인하기 위해 이유자돈 60두를 대상으로 실험을 진행하였다. 시중에 판매되고 있는 사료만을 섭취하도록 하는 비교군, 본원발명 조성물 M1 내지 M5를 각각 사료의 5%로 포함하여 섭취하도록 하는 실험군 1 내지 5로 나누어 실험을 진행하였으며, 실험 기간은 총 6주간 수행하였고, 사료와 음수는 자유 급수하도록 하였다.
실험 결과는 이유자돈의 몸무게(kg) 및 일평균 증체량(g/day)을 측정하여 0일 내지 21일, 22일 내지 42일 및 0 내지 42일의 일평균 증체량(g/day)을 측정하여 각각의 평균값으로 하여 하기 표 6에 나타내었다.
비교예 실험군 1
(M1)		 실험군 2
(M2)		 실험군 3
(M3)		 실험군 4 (M4) 실험군 5
(M5)
몸무게(kg) 개시체중 8.54 8.34 8.88 8.50 9.01 8.92
종료체중 31.01 31.52 32.86 32.46 33.16 34.08
일평균증체량(g/day) 0일 내지 21일 430 432 451 455 453 468
22일 내지 42일 640 672 691 686 697 730
0일 내지 42일 535 552 571 571 575 599
(단위 : kg, g/day)
상기 표 6을 참조하면, 본원발명 조성물 M1 내지 M5를 포함하는 사료를 섭취한 실험군 1 내지 5의 경우 42일까지의 일평균 증체량이 비교예에 비해 모두 높은 값을 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 특히, 유산균 L1 내지 L3을 모두 포함하는 실험군 5(M5)의 경우 6주동안의 일평균 증체량이 599 g/day로 가장 우수한 일평균 증체량을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 본원발명 조성물을 함께 섭취함으로써 이유자돈의 생장성이 향상됨을 나타낸다.
[실험예 5 : 천연추출물을 포함하는 본원발명 조성물의 세포 독성, 항진균 및 항바이러스 및 동물의 생장성 향상 실험 평가]
5-1. 세포 독성 평가
천연추출물을 포함하는 본원발명의 가축의 면역력 증진용 조성물(M6 내지 M13)의 항진균, 항바이러스 및 동물의 생장성 향상을 평가하기 전, 천연추출물에 대한 세포 독성 평가를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하여, 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.
하기 도 2를 참조하면, RA264.7 세포 및 HUVEC 세포에서 세포생존율을 측정한 결과, 본원발명의 천연추출물 개보리뺑이 추출물(LE), 각시개서실 추출물(CE) 및 고산부전바디 추출물(SE)이 세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
5-2. 항곰팡이, 항바이러스 및 가축 생장성 평가
본원발명 천연추출물을 더 포함하는 곰팡이 및 곰팡이 생성 억제용 사료 첨가제 조성물(M6 내지 M13)의 항곰팡이, 항바이러스 및 가축의 생장성을 평가하기 위해 상기 실험예 2 내지 4의 실험방법과 동일하게 진행하였으며, 실험 결과의 비교를 위해 M5의 실험 값을 3으로 고정하여 비교평가하도록 하였으며, M6 내지 M13의 실험결과를 지수 1 내지 10의 범위 내에서 하기 표 7에 종합적으로 나타내었다.
M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13
항곰팡이 활성 3 3 4 4 6 8 9 8 7
항바이러스 활성 3 4 4 4 6 8 9 9 7
가축의 생장성 증가 3 4 4 3 5 8 8 8 6
(단위 : 지수)
상기 표 7을 참조하면, 천연추출물을 포함하는 M6 내지 M13의 경우 M5에 비해 모두 높은 지수 값을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, 천연추출물을 각각 포함하는 경우에 비해 모두 포함하는 M9의 경우 활성이 소폭 더 향상되었으며, 천연추출물의 바람직한 중량부로 포함하고 있는 M10 내지 M12의 경우 그 활성이 더욱 향상됨을 확인하였다.
결과적으로, 본원발명 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물에 의해 항곰팡이 활성을 통한 사료의 보존성 향상, 항바이러스 활성으로 가축의 생존성 개선 및 가축의 생장성 향상 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
[실험예 6 : 기호성 평가]
본 발명의 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물(M5 내지 M13)의 기호성 평가를 위해 사료 첨가제로 제조하여 시중에 판매되는 사료에 첨가함으로써 이유자돈의 기호성을 평가하였다.
실험은 평균 몸무게 7.21kg인 이유자돈 90마리를 대상으로, 2주 동안 시중에 판매중인 돈용 사료에 본원발명 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료, 포함하지 않는 사료(대조군)을 동시에 같은량 급여하여 기호성 시험을 실시하였다. 사료 첨가제 종류마다 이유자돈 10두를 배치하였으며, 매일 아침 9시 30분에 사료 소진률을 측정하여 2주간의 사료 소진률을 평균으로 나타냄으로써 기호성을 평가하였고, 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13
첨가군 65.18 67.74 67.11 71.84 75.13 83.11 86.13 84.23 76.22
무첨가군(대조군) 67.86 64.24 65.48 65.28 62.96 61.01 59.77 60.57 62.11
(단위 : %)
상기 표 8을 참조하면, 본원발명의 조성물을 포함하는 첨가군의 경우 무첨가군에 비해 모두 높은 정도의 사료 소진률을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 점토광물 및 유산균만을 포함하는 M5와 비교하여 천연추출물을 각각 포함하는 M6 내지 M8의 경우, 보다 높은 정도의 사료 소진률을 나타내어 천연추출물을 포함함으로써 사료에 대한 기호도를 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 상기 개보리뺑이 추출물(LE), 각시개서실 추출물(CE) 및 고산부전바디 추출물(SE)을 모두 포함하는 M9 내지 M13의 경우 약 75% 이상의 사료 소진률을 나타내어, 천연추출물을 포함함으로써 사료의 기호도가 향상될 수 있으며, 특히 M10 내지 M12의 경우 약 83% 이상의 사료 소진률을 나타냄을 확인할 수 있다.
따라서, 본원발명의 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물(M9 내지 M13)을 포함하여 제조된 사료 첨가제를 기존의 사료에 포함함으로써, 사료의 기호도를 상승시킬 수 있으면서도 사료 내 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제, 항바이러스 활성 및 가축의 생장성 향상 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (7)

  1. 점토광물 및 유산균을 유효성분으로 포함하며,
    유해균 생성 억제 활성을 나타내어 사료의 보존성이 향상되는
    곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 점토광물은 규조토, 맥반석, 몬모릴로나이트, 벤토나이트, 세피올라이트, 일라이트, 제올라이트, 흑운모, 버미큘라이트 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인
    곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 루코노스톡(Leuconostoc) 속, 바실러스(Bacillus) 속 및 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 균을 포함하는
    곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 항바이러스 활성을 통해 동물의 생존 및 생장 향상 활성을 나타내는
    곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 동물은 소, 말, 돼지, 닭, 오리, 개, 양, 고양이 또는 토끼를 포함하는 것인
    곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 포함하는
    사료 첨가제.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 곰팡이 및 곰팡이 생성물 억제용 사료 첨가제 조성물을 포함하는
    사료.
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