KR20220123475A

KR20220123475A - 암 요법을 위한 치료 결정에서 pd-l1 발현을 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20220123475A
Application number: KR1020227029136A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 애덤스; 차-메이 탕
Original assignee: 크리에티브이 마이크로테크, 인크.
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2022-09-06
Also published as: AU2017250284A1; KR102548385B1; US11353459B2; KR20180133465A; EP3443013A4; CA3020854A1; WO2017181073A1; JP7128399B2; EP3443013A1; KR102436984B1; CN109311989A; US20220252605A1; AU2017250284B2; JP2019514028A; US20190128892A1

Abstract

대상체에서의 암의 스크리닝, 모니터링, 치료 및 진단에서 순환 암 세포에 의한 PD-L1의 발현 검출을 사용하는 방법을 개시한다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 순환 종양 세포 (CTC), 상피 간엽 이행 CTC (EMTCTC), 암 연관 대식세포 유사 세포 (CAML), 및 암 연관 혈관 내피 세포 (CAVE) 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 것을 기반으로 한다.

Description

암 요법을 위한 치료 결정에서 PD-L1 발현을 사용하는 방법{METHODS OF USING PD-L1 EXPRESSION IN TREATMENT DECISIONS FOR CANCER THERAPY}

본 발명은 대상체에서의 암의 스크리닝, 모니터링, 치료 및 진단에서 순환 암 세포에 의한 PD-L1의 발현 검출을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 순환 종양 세포 (CTC), 상피 간엽 이행 CTC (EMTCTC), 암 연관 대식세포 유사 세포 (CAML), 및 암 연관 혈관 내피 세포 (CAVE) 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 것을 기반으로 한다.

미국에서 암은 두 번째로 높은 사망 원인이고, 남성 중 42% 및 여성 중 38%에서는 그들 일생 동안 암이 발생하게 될 것이다 ^[51-54]. 면역요법은 암을 그의 기원과는 상관없이 공격하는 환자 자신의 면역계를 이용한다. 면역계는 박테리아 및 바이러스와 같은 외부 침입자를 공격하도록 진화된 견제 및 균형 네트워크에 의해 조절된다. 그러나, 암은 면역계가 암 세포를 공격하지 못하게 억제시키는 단백질, 예컨대, PD-L1 및 PD-L2를 발현함으로써 면역계를 회피할 수 있다.

특히, 종양 세포와 T 세포 사이의 상호작용은 종양 세포 상의 주조직적합성 복합체 (MHC)와 T 세포 상의 T 세포 수용체 (TCR) 사이의 접촉을 포함한다 ^[54]. MHC와 T 세포 수용체 사이의 접촉시, T 세포는 활성화되고, 종양 세포는 파괴된다.

종양 세포가 그의 표면 상에 면역 관문 단백질 PD-L1을 발현한다면, 이는 T 세포 면역감시를 회피할 수 있다. PD-L1은 존재시 T 세포에 의해 발현되는 PD-1에 결합하고, T 세포 활성화를 차단함으로써 T 세포 면역감시를 억제시킨다.

PD-L1/PD-1 상호작용을 차단시킬 수 있는 면역 관문 억제제가 개발되어 왔다. 상기 약물은 T 세포 면역감시 기전이 다시 정상적으로 작용할 수 있도록 허용하고, 이로써, 종양 세포는 대상체에서 정상적인 면역 반응을 통해 파괴될 수 있다.

T 세포 상의 CTLA-4의 차단도 유사한 효과를 가질 수 있다. CTLA-4에 기반한 제1 면역요법제는 2011년 흑색종용으로서 FDA의 승인을 받았다. FDA 면역요법 승인 속도는 2014년부터 2016년 말까지 증가하였고, 흑색종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 신장 세포 암종 (RCC), 두부경부암, 방광암 및 호지킨 림프종용으로 18개의 면역요법이 승인을 받았다 ^[55-59]. 현재 100개 초과의 개방 면역요법 임상 시험이 진행되고 있으며, 이는 다중 종양 간의 광범위한 효능의 잠재성을 나타낸다.

면역 관문 억제제의 효과적인 사용에 대한 비결은 암을 앓는 특정 대상체가 상기 약물에 반응하는지 여부를 측정하는 것이다. PD-L1 또는 PD-1에 결합하고, 면역 관문 억제제로서 작용하는 항체를, 환자의 종양 세포가 PD-L1을 발현하지 않는 환자에게 투여하였다면, 치료는 효과가 없을 것이다. 상기 항체 기반 치료는 매우 고가이기 때문에, 환자가 치료에 반응하게 되는 적어도 일부 적응증을 앓는 것이 중요하다.

PD-L1 발현 조사를 위해 종양 생검을 통해 암 세포를 수득하는 것은 환자에게 통증 및 불쾌감을 준다는 점, 단리된 종양 부위 이상은 조사하지 못한다는 점, 및 단백질 발현 프로파일이 종양 미세환경에서 시간이 경과함에 따라 변할 수 있는 잠재성을 가지고 있다는 점을 비롯한, 심각한 단점을 가지고 있다.

혈액 기반 생검은 종양에 의해 박리되거나, 또는 다르게는 분리된 세포를 실시간으로 순차적으로 추적할 수 있다는 점에서 조직 생검보다 개선된 것이다. 혈액 샘플은 더욱 쉽게 수득할 수 있고, 환자로부터 더 자주 수득될 수 있다. 추가로, 단백질 발현 프로파일 변화를 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 순환 종양 세포 (CTC)는 말초 혈액으로부터 쉽게 단리될 수 있고, 조직 생검으로부터 수득된 종양 세포에 대한 대체물로서 사용될 수 있는 암 연관 세포 유형 중 하나이다 ^[1-4]. CTC는 고형 종양으로부터 혈류 내로 분리된 종양 세포이다. CTC는 암종, 육종, 신경아세포종 및 흑색종 환자의 혈액에서 발견될 수 있다.

혈액 기반 생검으로부터 수득될 수 있는 추가의 세포 유형을 확인하는 것이, 면역 관문 억제제를 이용하는 치료가 도움이 되는 암 환자를 확인하는 상기 기술의 용도를 추가로 개발하는 데 중요할 것이다.

본 발명은 암을 앓는 대상체가 면역 관문 억제제를 이용하는 치료로부터 이익을 얻게 되는지 여부를 측정하기 위한 것 뿐만 아니라, 다른 중요한 목적을 위한 효과적인 수단을 제공하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 대상체에서의 암의 스크리닝(screening), 모니터링, 및 진단에서 사용하기 위한, 말초 기반 바이오마커 및 그를 발현하는 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 바이오마커의 존재 또는 부재, 또는 그의 발현의 변화에 기반하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 정의된 방법을 통해 종래 세포독성 및 면역요법의 더욱 우수한 조합 및 순서를 선택할 수 있을 뿐만 아니라, 면역요법에 대하여 지속가능한 반응을 보일 가능성이 있는 환자를 확인할 수 있을 것이다.

제1 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체를 면역 관문 억제제에 대한 감수성에 대하여 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 순환 종양 세포 (CTC), 상피 간엽 이행 CTC 세포 (EMTCTC), 암 연관 대식세포 유사 세포 (CAML), 및 암 연관 혈관 내피 세포 (CAVE) 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계로서, 여기서, PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체는 면역 관문 억제제에 대하여 감수성인 것으로 간주되는 것인 단계를 포함한다.

제2 실시양태에서, 본 발명은 면역 관문 억제제를 이용하는 치료에 대한 암을 앓는 대상체의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계로서, 여기서, PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체는 면역 관문 억제제를 이용하는 치료에 대하여 반응성인 것으로 예측되는 것인 단계를 포함한다.

제3 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체를 위한 치료를 선택하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계로서, 여기서, PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체에게 치료학상 유효량의 면역 관문 억제제를 투여하는 것이 대상체를 위한 치료로서 선택되는 것인 단계를 포함한다.

제4 실시양태에서, 본 발명은 면역 관문 억제제 치료를 받게 될 암을 앓는 대상체를 확인하는 검정법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계로서, 여기서, PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체는 면역 관문 억제제 치료를 받게 될 대상체인 것으로 확인되는 것인 단계를 포함한다.

제5 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, 및 (b) PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체에게 치료학상 유효량의 면역 관문 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.

제6 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체에게 치료학상 유효량의 면역 관문 억제제를 투여하는 단계로서, 여기서, 상기 면역 관문 억제제는, 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것에서 PD-L1 발현이 검출된 이후에 투여되는 것인 단계를 포함한다.

제7 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체에서 PD-L1 발현에 대해 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 암을 앓는 대상체로부터 제1 시점에 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, (b) 암을 앓는 대상체로부터 제2 시점에 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, 및 (c) 제1 및 제2 시점에 단리된 세포에서 검정된 PD-L1 발현을 비교하는 단계를 포함한다. 본 실시양태의 특정 측면에서, 대상체는 암 치료를 받고 있는 중인 대상체이다.

제8 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체에서 치료에 대해 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 암 치료를 받고 있는 중인 대상체로부터 제1 시점에 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, (b) 암 치료를 받고 있는 중인 대상체로부터 제2 시점에 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, 및 (c) 제1 및 제2 시점에 단리된 세포에서 검정된 PD-L1 발현을 비교하여 암을 앓는 대상체에서 치료에 대해 모니터링하는 단계를 포함한다. 본 실시양태의 특정 측면에서, 대상체는 면역 관문 억제제를 이용하여 치료받고 있는 중인 대상체이다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, 면역 관문 억제제는 PD-L1 길항제, PD-1 길항제, 및 CTLA-4 길항제 중 하나 이상의 것이다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, 면역 관문 억제제는 (i) PD-L1과 PD-1 사이의 결합, (ii) PD-L1의 그의 결합 파트너로의 결합, (iii) PD-1의 그의 결합 파트너로의 결합, 및 (iv) CTLA-4의 그의 결합 파트너로의 결합 중 하나 이상의 것을 억제시킨다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, 면역 관문 억제제는 항체, 예컨대, 단일클론 항체이다. 특정 측면에서, 면역 관문 억제제는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체이다.

구체적인 면역 관문 억제제의 예로는 니볼루맙(Nivolumab) (옵디보(Opdivo)), 이필리무맙(Ipilimumab) (여보이(Yervoy)), 펨브로리주맙(Pembrolizumab) (키트루다(Keytruda)), 아테졸리주맙(Atezolizumab) (테센트리크(Tecentriq)), 트리멜리무맙(Tremelimumab), 및 더발루맙(Durvalumab) (MED14736) 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, 본 방법은 대상체에게 치료학상 유효량의 하나 이상의 추가의 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 항암제로는 면역요법제, 화학요법제, 방사선요법제, 기존의 암 약물, CCR5 및 CXCR4를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

구체적인 항암제의 예로는 T-VEC, AM-0010, CXCR4 길항제, TGF-베타 키나제 억제제 갈루니서팁, 항-CSF-1R 단일클론 항체, 아베마시클립(Abemaciclib), 파슬로덱스(Faslodex), 네시투무맙, AZD9291, 사이람자(Cyramza) (라무시루맙), TPIV 200, 갈루니서팁(Galunisertib), 암 백신, 시토카인, 세포 기반 요법, 이중특이적 및 다중특이적 항체, 종양 표적화 mAb, 리투시맙(Rituximab), 종양용해성 바이러스, 레오바이러스, 블리나투모맙(Blinatumomab), 시푸류셀-T(Sipuleucel-T), T-Vec, IL-2, IFN-α, 트라스투주맙(Trastuzumab), 세툭시맙(Cetuximab), 베바시주맙, Tim-3, BTLA, 항-IL-10, GM-CSF, 항-혈관신생 치료, VEGF 차단제, HMGB1, Nrp1, TAM 수용체 티로신 키나제, Axl, MerTK, ALT-803, IL-15, 면역억제성 리간드 포스파티딜세린(PS), 바비투시맙, 베바시주맙 (항-VEGF), 코비메티닙 (MEK 억제제), 베무라페닙 (BRAF 억제제), 엘로티닙 (EGFR), 알렉티닙 (ALK 억제제), 베바시주맙 (항-VEGF), 파조파닙 (티로신 키나제 억제제), 다브라페닙 (BRAF 억제제), 트라메티닙 (MEK 억제제), 더발루맙 (항-PD-L1), 수니티닙 (RTK 억제제), 파조파닙 (RTK 억제제), 사그라모스팀, VISTA, TIM-3, LAG-3, PRS-343, CD137 (4-1BB)/HER2 이중특이적 제제, USP7, 항-HER2, SEMA4D, CTLA-4, PD-1, PD-L1, 및 PD-L2 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, PD-L1 발현에 대하여 검정하는 것은 PD-L1 단백질 발현을 검출하는 것, 또는 PD-L1 mRNA 생산을 검출하는 것 중 하나 이상의 것에 의해 이루어질 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 예를 들어, 면역조직화학법 (IHC)에 의해 검출될 수 있다. IHC는 막 염색, 세포질 염색, 또는 그의 조합에 의해 수행될 수 있다. IHC는 항-PD-L1 항체를 사용하여, 즉, PD-L1에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 사용함으로써 수행될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 IHC에 의해 약한 염색 강도, 중간 정도의 염색 강도, 또는 강한 염색 강도로서 검출될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 또한 IHC에 의해 낮은 염색 강도, 중간 정도의 염색 강도, 또는 높은 염색 강도로서 검출될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 또한 낮은 염색 강도에서 높은 염색 강도로 유도가능한 것으로, 또는 낮은 염색 강도에서 중간 정도의 염색 강도로 유도가능한 것으로, 또는 중간 정도의 염색 강도에서 높은 염색 강도로 유도가능한 것으로 검출될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 단리된 세포의 임의의 염색으로서 검출될 수 있다.

특정 측면에서, IHC는 PD-L1에 대하여 결합 특이성을 가지는 하나 이상의 항체가 사용되는 면역형광 (IF) 염색을 사용하여 수행된다. 항-PD-L1 항체의 PD-L1로의 결합은 항-PD-L1 항체에 접합된 형광성 화합물을 통해 검출될 수 있거나, 또는 항-PD-L1 항체에 대하여 결합 특이성을 가지는, 검출가능한 표지-접합된 2차 항체를 통해 검출될 수 있다. 적합한 검출가능한 표지로는 형광단을 포함한다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, PD-L1 발현 수준이, 암을 앓지 않는 동일한 종의 대상체로부터의 기질 세포의 집단의 PD-L1 발현보다 더 클 때, PD-L1 발현이 검출되는 것이다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE는 암을 앓는 대상체로부터 수득되는 혈액으로부터 단리된 것이다. 특정 측면에서, 혈액은 말초 혈액이다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, 암을 앓는 대상체는 표적화된 작용제, 화학요법, 또는 방사선 요법 중 하나 이상의 것을 사용하는 치료를 받고 있는 중인 대상체일 수 있다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 방광암, 신장암, 두부경부암, 결장직장암, 간암, 난소암, 신경아세포종, 육종, 골육종, 식도암, 뇌암 & ONS 암, 후두암, 기관지암, 구강암 및 인두암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁경부암, 또는 자궁체부암이다. 암은 고형 종양, 예컨대, I기, II기, III기, 또는 IV기 암인 고형 종양 일 수 있다. 고형 종양은 암종, 육종, 신경아세포종 또는 흑색종일 수 있다. 폐암의 예로는 비소세포 폐 암종 (NSCLC)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, 적어도 하나의 CTC, EMTCTC, CAML, 또는 CAVE는 적어도 하나의 RAD50 포커스들(foci)을 나타낸다.

상기 내용은 하기의 본 발명의 상세한 설명을 더욱 잘 이해될 수 있도록 하기 위해 본 발명의 특징 및 기술상의 이점을 다소 광범위하게 개요하였다. 본 발명의 추가의 특징 및 이점이 본원에서 기술될 것이며, 이는 본 발명의 특허청구범위의 대상을 형성한다. 본원에 개시된 임의의 개념 및 구체적인 실시양태는 본 발명의 동일한 목적을 수행하기 위해 다른 구조를 변형시키거나, 또는 디자인하기 위한 기반으로서 쉽게 이용될 수 있다는 것을 당업자는 이해하여야 한다. 그러한 등가의 구성은 첨부된 특허청구범위에 기술된 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않는다는 것 또한 당업자는 이해하여야 한다. 추가의 목적 및 이점과 함께, 본 발명의 조직화 및 작동 방법, 둘 모두에 관한, 본 발명의 특징이 되는 것으로 간주되는 신규한 특징은 첨부된 도면과 함께 관련하여 고려될 때, 하기 설명으로부터 더욱 잘 이해될 것이다. 그러나, 임의의 설명, 도, 실시예 등은 단지 예시 및 설명 목적으로 제공되는 것이며, 결코 본 발명의 한계를 정의하는 것으로 의도되지 않음을 명백히 이해하여야 한다.

I. 정의

본원에서 사용되는 바, "하나"("a" 또는 "an")란, 하나 이상이라는 것을 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, "하나"라는 단어는 하나 또는 1개 초과를 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바 "또 다른"이란, 적어도 제2 또는 그 초과의 것을 의미할 수 있다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 형태의 용어는 복수 개의 것을 포함하고, 복수 형태의 용어는 단수 개의 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "약"이란, 명확하게 명시되었건 아니건 간에, 예를 들어, 정수, 분수 및 백분율을 비롯한 수치 값을 지칭한다. "약"이라는 용어는 일반적으로 당업계의 숙련가가 언급된 값과 등가인 것으로 (예컨대, 동일한 기능 또는 결과를 가지는 것으로) 간주하게 되는 수치 값의 범위 (예컨대, 언급된 값의 +/- 5-10%)를 지칭한다. 일부 경우에서, "약"이라는 용어는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림되는 수치 값을 포함할 수 있다.

II. 본 발명

지질 생검은 말초 혈액 중에서 발견되는 순환 종양 세포 (CTC)의 실시간의 순차적 추적을 제공하고, 상기 검정법은 조직 생검에 대한 대용으로서 사용될 수 있다 ^[1-4]. 말초 혈액 중 순환 종양 세포 (CTC)를 검정하는 것은, 둘 모두 암 진단제로서, 또는 스크리닝하기 위한, 치료를 모니터링하기 위한, 및 특정 대상체에서의 특정 치료에 대한 종양의 감수성을 측정하기 위한 수단으로서, 상피 간엽 이행 (EMTCTC) 중인 CTC 서브타입 ^{[2, 3, 5-9]} 및 예후적으로 관련된 병리적으로 정의가능한 CTC (PDCTC) ^[6-10]를 포함하는 CTC의 이종성 집단을 질의할 수 있는 능력을 가진다.

최근, 본원에서 정의된 방법에서 검정될 수 있는 암과 연관된 또 다른 순환 세포가 암 환자의 말초 혈액에서 확인되었다. 이러한 암 기질 세포 서브타입은 암 연관 대식세포 유사 세포 또는 CAML로 명명되어 왔다. CAML은, CTC 및 CAML, 둘 모두를 포획하고, 이들 암 특이적 순환 세포 서브타입의 단일 또는 동시 분석을 허용하는 비친화성 정밀여과 기반 방법을 사용하여 혈액 중에서 확인되었다 ^{[1, 6-16]}. CAML은 모든 병기의 침윤성 악성 종양에서 및 각종 고형 악성 종양 (예컨대 유방 종양, 전립선 종양, 비소세포 폐 암종 (NSCLC), 및 췌장 종양)에서 발견되는, 최근 정의된 순환 골수성 유래 기질 세포이다 ^{[11, 13, 14, 17]}. CAML은 모든 병기의 고형 종양에서 혈액 중의 분화된 골수성 배수체 세포이다. 이는 그의 큰 크기 (25 ㎛ 초과), 배수성 핵 및 형태: 1개의 테일 또는 180도 떨어져 있는 2개의 테일을 가지는 둥근 막대 형상으로 쉽게 확인된다. CAML은 전형적으로 CD31, CD14, CD45 및 시토케라틴을 발현하고, 이는 또한 EpCAM, CD146, CD11c 및 tie2도 발현할 수 있다 ^{[11, 13, 14, 17]}. CAML은 암 특이적이고, 악성 종양의 기관 부위로부터 파종될 수 있는 반면, 그가 실제로 원발성 종양 부위에 상주하는지 여부 또는 그가 임상적 유용성을 가지고 있는지 여부에 대해서는 여전히 알려지지 않은 상태이다.

CTC의 다른 하위군은 종양 진행, 종양 확산, 및 종양 치료에 대한 반응과 관련하여 표현형을 상향조절 및/또는 하향조절한다. 개별 암 세포의 상태 이행 능력, 예컨대, 상피 간엽 이행 능력은 본원에서 정의된 방법에서 검정될 수 있는 추가의 순환 암 세포 서브타입, 즉, 상피 간엽 이행 CTC (EMTCTC)를 유도한다. EMT는 점진적인 형태발생 프로세스이고, EMTCTC는 다양한 이행 단계의 세포를 포함한다 ^[6]. EMTCTC는 일반적으로, 상피 단백질, 예컨대, EpCAM 및 CK의 하향조절, 및 간엽 줄기 세포 단백질, 예컨대, 비멘틴 및 CD34의 상향조절에 의해 기술될 수 있다 ^[13]. EMTCTC 서브타이핑은 전형적으로 비-프로테오믹 방법, 즉, mRNA 발현 또는 DNA 분석과 같은 방법을 사용하여 수행된다 ^[13].

본원에 정의된 방법에서 검정될 수 있는, 암과 연관된 추가의 순환 세포 유형으로는 암 연관 혈관 내피 세포 또는 CAVE가 있다. CAVE는 순환 내피 세포의 서브타입이다. 종양은 종양 내피 세포에 의해 제공되는 혈액 공급을 필요로 한다. CAVES는 종양 부위로부터 혈류 내로 분리된 종양 내피 세포이다. CAVE는 대개 클러스터로 발견된다. CAVE는 시토케라틴 및 각종 서브타입 내피 세포 마커, 예컨대, CD31, CD146, CD144, CD105를 발현하지만, CD14 또는 CD45는 발현하지 않는다 ^[50].

지질 생검에서 상기 순환 세포를 이용하는 것은 제대로 연구되지 않았고, 본 발명은, 상이한 암, 특히, 연관된 CTC, CAML, CAVE 및 EMTCTC가 그의 표면 상에 PD-L1을 발현하는 것인 암의 스크리닝, 모니터링, 진단 및 치료에서 CTC, CAML, CAVE 및 EMTCTC를 이용하는 방법에 관한 것이다.

면역 관문 억제제에 대한 감수성을 스크리닝하는 방법

상기 명시된 바와 같이, 본 발명은 암을 앓는 대상체를 면역 관문 억제제에 대한 감수성에 대하여 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 순환 종양 세포 (CTC), 상피 간엽 이행 CTC (EMTCTC), 암 연관 대식세포 유사 세포 (CAML), 및 암 연관 혈관 내피 세포 (CAVE) 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계로서, 여기서, PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체는 면역 관문 억제제에 대하여 감수성인 것으로 간주되는 것인 단계를 포함한다.

면역 관문 억제제에 대한 반응성을 예측하는 방법

본 발명은 또한 면역 관문 억제제를 이용하는 치료에 대한 암을 앓는 대상체의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계로서, 여기서, PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체는 면역 관문 억제제를 이용하는 치료에 대하여 반응성인 것으로 예측되는 것인 단계를 포함한다.

면역 관문 억제제 치료를 선택하는 방법

추가로, 본 발명은 암을 앓는 대상체를 위한 치료를 선택하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계로서, 여기서, PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체에게 치료학상 유효량의 면역 관문 억제제를 투여하는 것이 대상체를 위한 치료로서 선택되는 것인 단계를 포함한다.

면역 관문 억제제 치료를 받게 될 대상체를 확인하는 검정법

더욱이, 본 발명은 면역 관문 억제제 치료를 받게 될 암을 앓는 대상체를 확인하는 검정법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계로서, 여기서, PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체는 면역 관문 억제제 치료를 받게 될 대상체인 것으로 확인되는 것인 단계를 포함한다.

면역 관문 억제제를 이용하여 치료하는 방법

본 발명은 또한 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, 및 (b) PD-L1 발현이 검출되었을 때, 대상체에게 치료학상 유효량의 면역 관문 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 면역 관문 억제제는 면역 관문 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제로서 투여될 수 있다.

관련된 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암을 앓는 대상체에게 치료학상 유효량의 면역 관문 억제제를 투여하는 단계로서, 여기서, 상기 면역 관문 억제제는, 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것에서 PD-L1 발현이 검출된 이후에 투여되는 것인 단계를 포함한다. 면역 관문 억제제는 면역 관문 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제로서 투여될 수 있다.

치료 방법과 관련된 본 발명의 각 실시양태 및 측면에서, 본 방법은 단독으로 면역 관문 억제제를 사용하여 수행될 수 있거나, 또는 대상체에서 암을 치료 및 억제시킬 수 있는 추가 수단 (예컨대, 본원에서 정의된 추가의 항암제)과 함께 공동으로 면역 관문 억제제를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 추가 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있을 수 있고, 이는 수단, 예컨대, 항암 화학요법제 및 방사선요법제 및 종양의 외과적 절제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "치료하다," "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 그의 일반적이고, 통상적인 의미를 가지며, 이는 대상체로부터 종양 또는 암을 완전히 또는 부분적으로 제거하는 것, 대상체에서 종양의 크기를 축소시키는 것, 대상체에서 종양 또는 암 세포를 사멸시키는 것, 및 대상체에서 암 또는 종양의 증상을 호전시키는 것 중 하나 이상의 것을 포함한다. 치료는 면역 관문 억제제를 투여받지 않은 대상체 대비 약 1% 내지 약 100%만큼 제거, 축소, 사멸 또는 호전시키는 것을 의미한다. 바람직하게, 제거, 축소, 사멸 또는 호전시키는 것은 약 100%, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5% 또는 약 1%인 것이다. 치료 결과는 영구적일 수 있거나, 또는 수일 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 수주 (예컨대, 1, 2, 3 또는 4주), 수개월 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 이상) 또는 수년 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6년 이상)의 기간 동안 계속 진행될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "억제시키다," "억제하는" 및 "억제"라는 용어는 그의 일반적이고, 통상적인 의미를 가지며, 이는 암 또는 종양의 확립, 암 또는 종양의 발생, 암 또는 종양의 성장 및 전이를 방해하거나, 그의 진행을 지연시키거나, 차단하거나, 저지하거나, 또는 제지시키는 것 중 하나 이상의 것을 포함한다. 억제란, 면역 관문 억제제를 투여받지 않은 대상체 대비 약 1% 내지 약 100%만큼 방해하는 것을 의미한다. 바람직하게, 방해는 약 100%, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5% 또는 약 1%인 것이다. 억제 방법은 암 또는 종양의 임상적 증상이 발병되기 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 대상체에서 수행될 수 있다. 따라서, 대상체는 암 또는 종양을 앓는 대상체일 수 있거나, 또는 단지 암 또는 종양이 발생하기 쉬운 대상체일 수 있다. 억제 결과는 영구적일 수 있거나, 또는 수일 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 수주 (예컨대, 1, 2, 3 또는 4주), 수개월 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 이상) 또는 수년 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6년 이상)의 기간 동안 계속 진행될 수 있다.

면역 관문 억제제, 및 면역 관문 억제제를 포함하는 제약 제제는, 고려하여야 하는 몇 가지 인자만을 예를 들자면, 방법의 특정 목표 또는 목적; 대상체의 연령 및 크기; 및 대상체의 일반적인 건강 상태에 의존하여 대상체에게 상이한 스케줄로 투여될 수 있다. 일반적으로, 면역 관문 억제제 및 제약 제제는 치료 또는 억제 과정 동안에 걸쳐 1회, 또는 2, 3회, 4회, 5회, 6회 이상 투여될 수 있다. 투약 스케줄에서 각 투약 사이의 타이밍은 수일, 수주, 수개월 또는 수년 범위일 수 있고, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30주 이상의 기간 마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 투약 스케줄의 매회 투약시에 동일한 정량을 면역 관문 억제제를 투여할 수 있거나, 매회 투약시의 양은 달라질 수 있다. 투약 스케줄에서 각 투약시 면역 관문 억제제의 아이덴티티 또한 달라질 수 있거나, 동일한 상태로 유지될 수 있다.

본 발명의 각각의 방법들에서, 면역 관문 억제제, 또는 면역 관문 억제제를 포함하는 제약 제제는 "치료학상 유효량"으로 대상체에게 투여된다. 치료학상 유효량은 대상체마다 달라질 것이다. 그러나, 치료학상 유효량은 본 방법의 목표 또는 목적이 억제시키고자 하는 것이든, 또는 치료하고자 하는 것이든 그와 상관 없이, 그를 달성하는 데 충분한 양이다. 예로서, 본 발명의 방법에서 사용되는 면역 관문 억제제의 치료학상 유효량은 전형적으로 펩티드를 투여받는 대상체의 체중 1 kg당 면역 관문 억제제 약 0.1 ㎍ 내지 약 10,000 ㎍이다. 치료학상 유효량은 또한 대상체의 체중 1 kg당 면역 관문 억제제 약 0.5 ㎍ 내지 약 5,000 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 200 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 5,000 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 100 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 2,500 ㎍, 약 500 ㎍ 내지 약 2,000 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 800 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 300 ㎍, 및 약 10 ㎍ 내지 약 300 ㎍을 포함한다.

적절한 용량 및 투약 스케줄은 과도한 실험 없이, 당업계의 숙련가에게 널리 공지된 기술에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 상기 결정은 부분적으로는 특정 용량의 내약성 및 효능에 기초하여 이루어질 것이다.

면역 관문 억제제 또는 제약 제제의 투여는 펩티드 전달 분야에 보편적으로 공지되어 있는 수단 중 임의의 것을 통해 이루어질 수 있다. 상기 경로로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 및 진피내 투여 경로 뿐만 아니라, 비강 적용, 흡입에 의한 것, 안과적으로, 경구적으로, 직장으로, 질로 이루어지는 것, 또는 면역 관문 억제제 또는 제약 제제가 점막 조직과 접촉할 수 있도록 하는 임의의 다른 모드에 의한 것을 포함한다.

본 발명의 제약 제제는 하나 이상의 면역 관문 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 담체의 적합한 예는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 물, 주사용수, 염수, 완충처리된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트 80 (트윈-80(Tween-80)™), 폴리(에틸렌)글리콜 300 및 400 (PEG 300 및 400), PEG화된 피마자유 (예컨대, 크레모포르(Cremophor) EL), 폴록사머 407 및 188, 친수성 및 소수성 담체, 및 그의 조합을 포함한다. 소수성 담체로는 예를 들어, 지방 에멀젼, 지질, PEGy화된 인지질, 중합체 매트릭스, 생체적합성 중합체, 지방구, 소포체, 입자, 및 리포솜을 포함한다. 상기 용어는 구체적으로 세포 배양 배지는 배제시킨다. 제제는 안정화제, 완충제, 항산화제 및 보존제, 장성제, 벌크화제, 유화제, 현탁화제 또는 점성제, 불활성 희석제, 충전제, 및 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 개시된 방법을 수행하는 데 필요한 성분을 포함하는 키트 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 키트는 하나 이상의 면역 관문 억제제 및 사용 설명서를 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 면역 관문 억제제는 면역 관문 억제제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제로 존재한다.

PD-L1 발현을 모니터링하는 방법

본 발명은 또한 암을 앓는 대상체에서 PD-L1 발현에 대해 모니터링하는 방법을 포함한다. 본 방법은 (a) 암을 앓는 대상체로부터 제1 시점에 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, (b) 암을 앓는 대상체로부터 제2 시점에 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, 및 (c) 제1 및 제2 시점에 단리된 세포에서 검정된 PD-L1 발현을 비교하는 단계를 포함한다. 본 실시양태의 특정 측면에서, 대상체는 암 치료를 받고 있는 중인 대상체이다.

치료에 대해 모니터링하는 방법

본 발명 추가로 암을 앓는 대상체에서 치료에 대해 모니터링하는 방법을 포함한다. 본 방법은 (a) 암 치료를 받고 있는 중인 대상체로부터 제1 시점에 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, (b) 암 치료를 받고 있는 중인 대상체로부터 제2 시점에 단리된 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, 및 (c) 제1 및 제2 시점에 단리된 세포에서 검정된 PD-L1 발현을 비교하여 암을 앓는 대상체에서 치료에 대해 모니터링하는 단계를 포함한다. 본 실시양태의 특정 측면에서, 대상체는 면역 관문 억제제를 이용하여 치료받고 있는 중인 대상체이다.

면역 관문 억제제

본원에서 사용되는 바, "면역 관문 억제제"라는 용어는 면역계의 세포, 예컨대, T 세포, 및 일부 유형의 암 세포에 의해 발현되는 단백질을 억제시키거나, 또는 차단하는 화합물, 예컨대, 약물 (항체 포함)을 지칭한다. 이들 단백질은 면역 반응을 억제시키고, T 세포가 암 세포를 사멸시키지 못하게 차단할 수 있다. 이들 단백질이 차단되었을 때, 면역계의 억제는 극복되고, T 세포는 암 세포를 사멸시킬 수 있다. T 세포 또는 암 세포 상에서 발견되는 관문 단백질의 예로는 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2를 포함한다. 따라서, 면역 관문 억제제는 면역계 공격에 대한 암의 주요 방어 중 하나 (즉, T 세포)를 극복하고자 한다.

본 발명의 면역 관문 억제제로는 PD-L1 길항제, PD-1 길항제, 및 CTLA-4 길항제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 면역 관문 억제제는 또한 (i) PD-L1과 PD-1 사이의 결합, (ii) PD-L1의 그의 결합 파트너(들)로의 결합, (iii) PD-1의 그의 결합 파트너(들)로의 결합, 및 (iv) CTLA-4의 그의 결합 파트너(들)로의 결합 중 하나 이상의 것에 대한 억제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 면역 관문 억제제는 항체, 예컨대, 단일클론 항체를 추가로 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 면역 관문 억제제는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체이다. 면역 관문 억제제는 또한 항체의 억제 활성을 보유하는 항체의 단편을 포함한다. 상기 항체 단편으로는 Fab 단편, F(ab')2 단편, 및 단일 쇄 Fv (scFv)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 측면에서, 면역 관문 억제제는 PD-L1, PD-1 또는 CTLA-4에 대하여 결합 특이성을 가지는 항체, 또는 그의 항체 단편이다.

구체적인 면역 관문 억제제의 예로는 니볼루맙 (옵디보), 이필리무맙 (여보이), 펨브로리주맙 (키트루다), 아테졸리주맙 (테센트리크), 트리멜리무맙, 및 더발루맙 (MED14736) 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

항암제

암 치료에 관한 본 발명의 실시양태 및 측면에서, 본 방법은 대상체에게 면역 관문 억제제 이외에 치료학상 유효량의 하나 이상의 항암제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

항암제는, 이 또한 대상체에게 투여되는 것인 면역 관문 억제제와 상기 항암제가 화합성이어야 한다는 점에서만 오직 제한된다.

추가의 항암제로는 면역요법제, 화학요법제, 방사선요법제, 기존의 암 약물, CCR5 및 CXCR4를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 항암제의 예로는 T-VEC, AM-0010, CXCR4 길항제, TGF-베타 키나제 억제제 갈루니서팁, 항-CSF-1R 단일클론 항체, 아베마시클립, 파슬로덱스, 네시투무맙, AZD9291, 사이람자 (라무시루맙), TPIV 200, 갈루니서팁, 암 백신, 시토카인, 세포 기반 요법, 이중특이적 및 다중특이적 항체, 종양 표적화 mAb, 리투시맙, 종양용해성 바이러스, 레오바이러스, 블리나투모맙, 시푸류셀-T, T-Vec, IL-2, IFN-α, 트라스투주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, Tim-3, BTLA, 항-IL-10, GM-CSF, 항-혈관신생 치료, VEGF 차단제, HMGB1, Nrp1, TAM 수용체 티로신 키나제, Axl, MerTK, ALT-803, IL-15, 면역억제성 리간드 포스파티딜세린(PS), 바비투시맙, 베바시주맙 (항-VEGF), 코비메티닙 (MEK 억제제), 베무라페닙 (BRAF 억제제), 엘로티닙 (EGFR), 알렉티닙 (ALK 억제제), 베바시주맙 (항-VEGF), 파조파닙 (티로신 키나제 억제제), 다브라페닙 (BRAF 억제제), 트라메티닙 (MEK 억제제), 더발루맙 (항-PD-L1), 수니티닙 (RTK 억제제), 파조파닙 (RTK 억제제), 사그라모스팀, VISTA, TIM-3, LAG-3, PRS-343, CD137 (4-1BB)/HER2 이중특이적 제제, USP7, 항-HER2, SEMA4D, CTLA-4, PD-1, PD-L1, 및 PD-L2 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

PD-L1 발현을 검정하기 위한 수단

자명한 바와 같이, 본 발명의 방법은 세포에서 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 것, 즉, 그에 대해 검출 및/또는 측정하는 것에 기초한다. 본 발명의 한 측면에서, 본원에서 정의된 각각의 방법들은 간단하게는 선택된 세포가 PD-L1을 발현하는지 여부를 측정함으로써 사용될 수 있다. 따라서, 이들 방법은 세포에서의 PD-L1 발현량을 정량할 필요 없이 수행될 수 있다. 그러나, 및 본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에서 정의된 각각의 방법들은 세포에 의한 PD-L1 발현의 상대적인 양 또는 비의 양(specific amount)을 측정함으로써 사용될 수 있다. 상대적인 양은 예를 들어, 세포가 또 다른 세포 또는 표준보다 PD-L1을 더 많이 또는 더 적게 발현하는지 여부를 측정함으로써 측정될 수 있다. 비의 양은 예를 들어, 세포에서 PD-L1 발현의 수준을 정량화함으로써 측정될 수 있다.

PD-L1 발현은 PD-L1 단백질 발현을 검출/측정하는 것, 및 PD-L1 mRNA 생산을 검출/측정하는 것 중 하나 이상의 것에 의해 검정될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 예를 들어, 면역조직화학법 (IHC)에 의해 검출/측정될 수 있다. IHC는 막 염색, 세포질 염색, 또는 그의 조합에 의해 수행될 수 있다. IHC는 항-PD-L1 항체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, E1L3N, SP142.2, 28-8, 22C3, EPR19759, MIH2, MIH5, MIH6, ABM4E54, 130021, EPR20529, 10F.9G2, 및 CD274를 사용하여 수행될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 약한 염색 강도, 중간 정도의 염색 강도, 또는 강한 염색 강도로서 검출/측정될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 또한 낮은 염색 강도, 중간 정도의 염색 강도, 또는 높은 염색 강도로서 검출될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 또한 시간이 경과함에 따라 낮은 염색 강도에서 높은 염색 강도로 유도가능한 것으로, 또는 시간이 경과함에 따라 낮은 염색 강도에서 중간 정도의 염색 강도로 유도가능한 것으로, 또는 시간이 경과함에 따라 중간 정도의 염색 강도에서 높은 염색 강도로 유도가능한 것으로 검출될 수 있다. PD-L1 단백질 발현은 또한 단리된 세포가 무엇이든 간에 간단하게 임의의 염색으로서, 예를 들어, 배경을 초과하는 임의의 염색량으로서 검출/측정될 수 있다.

특정 측면에서, IHC는 면역형광 (IF) 염색을 사용하여 수행된다. PD-L1에 대하여 결합 특이성을 가지는 하나 이상의 항체는 PD-L1 단백질 발현을 검출하는 데 사용될 수 있다. 항-PD-L1 항체의 PD-L1로의 결합은 항-PD-L1 항체에 접합된 형광성 화합물, 또는 다른 검출가능한 표지를 통해 검출될 수 있거나, 또는 결과적으로는 항-PD-L1 항체에 대하여 결합 특이성을 가지는, 2차 항체에 접합된 형광단 또는 다른 검출가능한 표지를 통해 검출될 수 있다.

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, PD-L1 발현은 PD-L1 발현 수준이, 암을 앓지 않는 동일한 종의 대상체로부터의 기질 세포의 집단의 PD-L1 발현보다 더 클 때, 검출되는 것으로 측정되는 것이다.

세포 공급원

본 발명의 방법에서 사용되는 세포로는 CTC, EMTCTC, CAML, 및 CAVE 중 하나 이상의 것을 포함한다. 따라서, 본 방법은 상기 유형의 순환 세포 중 1, 2, 3개 또는 4개 모두를 사용하여 수행될 수 있다.

세포는 혈액, 예컨대, 말초 혈액을 비롯한, 세포가 발견될 수 있는 임의의 체액으로부터 수득될 수 있다. 혈액 샘플은 예를 들어, 셀세이브 보존 튜브(CellSave preservative tube)™에 수집될 수 있고, 혈액은 예를 들어, 저압 진공 시스템을 이용하여 셀시브™를 사용하여 프로세싱될 수 있다.

대상체

본 발명의 방법에서 언급되는 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 조류, 말, 소, 염소, 양, 반려 동물, 예컨대, 개, 고양이 또는 설치류, 또는 다른 포유동물일 것이다.

암을 앓는 대상체는 암 치료를 받고 있는 중인 대상체일 수 있다. 상기 치료로는 표적화된 작용제, 화학요법, 및 방사선 요법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 방광암, 신장암, 두부경부암, 결장직장암, 간암, 난소암, 신경아세포종, 육종, 골육종, 식도암, 뇌암 & ONS 암, 후두암, 기관지암, 구강암 및 인두암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁경부암, 또는 자궁체부암 중 하나 이상의 것일 수 있다. 암은 고형 종양, 예컨대, I기, II기, III기, 또는 IV기 암인 고형 종양일 수 있다. 고형 종양은 암종, 육종, 신경아세포종 또는 흑색종일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 폐암의 예로는 비소세포 폐 암종 (NSCLC)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

RAD50 포커스들

상기 정의된 특정의 관련된 실시양태 및 측면에서, 적어도 하나의 CTC, EMTCTC, CAML, 또는 CAVE는 적어도 하나의 RAD50 포커스들을 나타낸다.

종양 및 기질 세포를 비롯한, 부위 지정 방사선을 받은 종양으로부터 기원하는 세포는 이온화 방사선 유도성 DNA 손상을 특징으로 한다 ^[18-24]. 따라서, 방사선 요법 동안 종양 부위에서 기원하는 순환 세포는 예컨대, RAD50으로 시각화될 수 있는 이온화 방사선 유도성 포커스들 (IRIF)과 같은 DNA 손상의 증거를 보여야 한다 ^[18-24]. RAD50은 단백질 NBS1 및 MRE11과 복합체를 형성하는 단백질이고, 이는 방사선 및/또는 화학제 처리 이후 DNA 이중 가닥 수복 프로세스에서 중요한 것이다. 정상적인 포유동물 세포에서, RAD50은 세포질 및 핵, 둘 모두의 전역에 걸쳐 분포되어 있다. DNA에서의 이중 가닥 파단 후, RAD50/NBS/MRE11 복합체는 신속하게 파단 부위로 이동하여 파단이 수복될 때까지 응집된 핵 포커스들 , 예컨대, IRIF를 형성한다 ^{[18, 20, 23, 25]}. 따라서, RAD50은 고수준의 방사선에 노출된 세포의 특이적인 식별자로서 사용될 수 있고 - 종양 종괴로 표적화된 방사선에 직접 노출된 환자로부터의 세포의 생물학적 태그로서 작용할 수 있다 ^{[18-24, 26-28]}.

본 발명은 대상체에서의 암의 스크리닝, 모니터링, 치료 및 진단에서 순환 암 세포에 의한 PD-L1의 발현 검출을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 암을 앓는 대상체로부터 단리된 순환 종양 세포 (CTC), 상피 간엽 이행 CTC (EMTCTC), 암 연관 대식세포 유사 세포 (CAML), 및 암 연관 혈관 내피 세포 (CAVE) 중 하나 이상의 것을 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 것을 기반으로 한다.

도 1. 혈액 기반 생검은 DAPI, 시토케라틴, EpCAM 및 CD45에 의해 순환 세포를 확인하고, 서브타이핑하고; 이어서, RAD50 및 PD-L1로 세포를 재염색시키기 위해 QUAS-R 형광 소광 기술이 사용된다. (도 1a) 시토케라틴에 대하여 약한 양성, EpCAM에 대하여 음성, 및 CD45에 대하여 음성인 세포의 EMTCTC 클러스터의 예. 박스 눈금 = 90 ㎛. (도 1b) 샘플을 단백질 에피토프는 손상시키지 않으면서, 플루오르를 소광시키는 QUAS-R에 의해 소광시킨다 ^[13]. 이어서, 샘플을 PD-L1, RAD50 및 PD-1로 재염색한다. 박스 눈금 = 90 ㎛. (도 1c) 각 세포 또는 세포 클러스터의 평균 강도를 계산한 젠(Zen) 소프트웨어에서 세포를 추적함으로써 PD-L1을 측정한다. 박스 눈금 = 35 ㎛. (도 1d) 각 핵 (시안(Cyan))에서 RAD50 포커스들 (적색)을 계수한다. 박스 눈금 = 35 ㎛.
도 2. 도 3으로부터의 DAPI, 시토케라틴 및 CD45의 개별 영상 및 확대된 영상. (도 2a) 필라멘트형 시토케라틴 신호, 병리학상 비정상적인 핵은 보이며, CD45는 나타내지 않는 PDCTC. 흰색 화살표 표시는 DAPI 및 CD45에 대하여 양성인 전형적인 백혈구를 나타낸다. (도 2b) 확산형 시토케라틴 신호를 보이며, CD45는 나타내지 않고, 비정상적인 핵을 나타내는 EMTCTC. (도 2c) 둘 모두가 CD45⁺ 및 시토케라틴⁺인 다중 응집된 핵 및 비대된 세포를 나타내는 CAML. 박스 = 65 ㎛.
도 3. 기준선 (T0)에서 및 방사선요법 유도 이후 (T1)에 PD-L1을 정량화하는 데 사용될 수 있는 세포를 포함하는 샘플의 백분율(%). 혈액 기반 생검은 2가지 서브타입의 순환 종양 세포 및 순환 기질 세포를 포함한다. 표준 생검은 오직 초기 기준선 시점만을 가지고, 상기 샘플 중 단지 22%만이 PD-L1에 의한 분석을 위해 충분한 양의 종양을 가졌다. 갈색 염색은 PD-L1이고/청색은 헤마톡실린이다. 혈액 기반 생검에서는 기준선 샘플의 49%에서 및 요법 이후의 샘플의 66%에서 EMT 종양 세포가 확인되었다. 추가로, 순환 기질 세포 (CAML)는 기준선 샘플의 81%에서, 및 추적 샘플의 100%에서 이용가능하였다. 청색 = DAPI, 녹색 = 시토케라틴, 보라색 = CD45, 박스 = 65 ㎛.
도 4. 다코(DAKO)로부터 입수한, 임상적으로 승인을 받은 IHC PD-L1 클론, 및 BBB PD-L1 클론 시험 및 비교. (도 4a) 종양의 10%에서 점수가 1+인 환자 ID# 8 샘플로부터의 클론 22c3. (도 4b) 종양의 20%에서 점수가 2+인 환자 ID# 8 평행 샘플로부터의 클론 28-8. (도 4c) BBB를 위해 최적화된 PD-L1 클론을 사용하여 PD-L1에 대하여 양성인 세포의 개수, 및 셀시브(CellSieve)™ 마이크로필터 상에서 발견된 각 세포의 강도를 측정하였다. SI = 픽셀 강도 사분위수, % = 최대 픽셀 강도 사분위수에 대하여 양성인 세포의 비율(%), N/A = 시험하기에 이용불가능한 샘플.
도 5. 순환 세포에서의 PD-L1 발현을 점수화하기 위한 임계값 결정. 각각의 BBB 세포 (n=374)의 PD-L1 신호를 젠 블루(Zen Blue)에 의해 측정하고, 각 영상에 대한 그의 상대적 배경으로부터 감산하였다. 배경의 표준 편차 (n=373)가 BBB IHC 점수가 0인 것 (전체 세포의 26%)에 대한 임계값으로 사용되었다. 표준 편차의 2배 값이 BBB IHC 점수가 1인 것 (전체 세포의 42%)에 대한 임계값으로 사용되었다. 배경의 2배 값이 BBB IHC 점수가 2인 것 (전체 세포의 22%)에 대한 임계값으로 사용되었다. 배경의 2X-6X인 나머지 모든 강도가 ≥3인 것으로 점수화되었다 (전체 세포의 10%).
도 6. 혈액 기반 생검 접근법을 사용한 치료 전 기간 동안 순환 종양 세포 및 기질 세포, 둘 모두에서 분석된, 핵 내의 RAD50 로커스들(loci) 형성의 역학적 변화 및 세포 상에서의 PD-L1의 상향조절. (도 6a) RAD50 포커스들 형성을 정확하게 계수할 수 있고, 방사선요법 유도 이후에 RAD50 로커스들이 명백하게 증가된 것으로 관찰되었다. 이는 EMTCTC 및 CAML, 둘 모두가 방사선 부위로부터 기원하는 것임을 제안한다. (도 6b) PD-L1은 원발성 종양 부위로부터 기원하는 EMTCTC 및 CAML, 둘 모두에서 평가될 수 있다. 오차 막대 = 표준 오차.
도 7. 세포 유형에 의해 분리된, 방사선요법 유도 이전 및 이후의 각 개별 환자에서의 평균 PD-L1 및 RAD50 변화. (도 7a 및 7b) CAML 세포에서의 RAD50 증가는 환자 중 59%에서 관찰되었고, 환자 중 15%에서는 어떤 변화도 없었고, 환자 중 27%는 시점 중 어느 한 시점에도 CAML을 가지지 않았다. EMTCTC에서의 RAD50 증가는 환자 중 44%에서 관찰되었고, 환자 중 2%에서는 어떤 변화도 없었고, 환자 중 54%는 시점 중 어느 한 시점에도 EMTCTC를 가지지 않았다. (도 7c 및 7d) CAML 세포에서의 평균 PD-L1 증가는 환자 중 51%에서 관찰되었고, 감소는 22%에서 관찰되었고, 27%의 환자는 시점 중 어느 한 시점에도 CAML를 가지지 않았다. EMTCTC 세포에서의 평균 PD-L1 증가는 환자 중 29%에서 관찰되었고, 감소는 17%에서 관찰되었고, 54%의 환자는 시점 중 어느 한 시점에도 CAML를 가지지 않았다.
도 8. 방사선요법 이전 및 이후의 PD-L1 고발현/저발현 또는 RAD50 로커스들 형성에 기초한 환자의 PFS 비교. (도 8a) T0에서의 PD-L1 저발현 (0-1 BBB IHC)을 보이는 환자 대비 PD-L1 고발현 (2-3 BBB IHC)을 보이는 환자의 PFS, PFS 중간값 16개월 대 >24개월. (도 8b) T1에서의 PD-L1 저발현을 보이는 환자 대비 PD-L1 고발현을 보이는 환자의 PFS, PFS 중간값 16개월 대 18개월, p=0.958. (도 8c) T0에서의 순환 세포 1개당 RAD50 로커스들이 평균 ≤ 1인 환자의 PFS, PFS 중간값 19개월 대 18개월, p=0.246. (도 8d) T1에서의 순환 세포 1개당 RAD50 로커스들이 평균 ≤ 1인 환자의 PFS, PFS 중간값 10개월 대 19개월, p=0.034.
도 9. 상부에서부터 하부로 영상화된, 도 1로부터의 EMTCTC의 클러스터의 핵 내의 RAD50의 공초점 영상화. RAD50 로커스들이 세포의 핵 영역 내에 위치한다는 것을 입증하기 위하여, 도 3로부터의 EMTCTC의 클러스터를 자이스(Zeiss) 공초점 현미경 상에서 영상화하였다. 도 9a - 클러스터의 상부에서부터 도 9g - 클러스터의 하부까지 영상화된 것이다. RAD50 포커스들 모두 핵 구조 내로 국재화된 것으로 나타날 수 있고, 이는 RAD50 포커스들이 핵 특이적 성분이라는 것을 입증한다.
도 10. CD31 (도 10c), CD146 (도 10b), 비멘틴(Vimentin) (도 10b), 및 CD144 (도 10c)에 대하여 양성으로 염색된 시토케라틴 양성 CAVE의 대표적인 예로서, 이는 그가 내피 기원임을 확인시켜 주는 것이다. 모든 CAVE는 CD45 음성 (도 10a) 및 CD14 음성 (도 10b)이다. 비록 일부 CAVE가 EpCAM을 발현하는 것으로 나타나기도 했지만, 상기 CAVE는 EpCAM 음성으로 나타난다 (도 10a).
도 11. 병기별 116명의 환자의 샘플 중의 CTC 및 CAVE의 백분율(%).
도 12. CAVE 집단 상의 각 EC 마커의 백분율(%) (n=119 샘플).
도 13. 염색에 의해 CAVE로 확인된 세포 클러스터의 영상. 추가 염색은 조합 면역요법인 PD-L1 및 CXCR4의 능력을 예시한다.
도 14. 조합 면역요법인 PD-L1 및 CCR5에 대하여 염색된 CAML의 영상.
도 15. PD-L1 및 CCR5에 대하여 염색된 CAML의 영상. PD-L1에 대한 염색은 없다.
도 16. PD-L1에 대하여 염색된 CAML의 영상. (도 16a) 펨브로리주맙으로 치료하기 이전의 PD-L1 염색. (도 16b) 펨브로리주맙을 이용하여 1개월 동안 치료한 이후의 PD-L1 염색.
도 17. 핵, PD1, 비멘틴 및 CD45에 대하여 염색된 CAML의 영상.

Ⅲ. 실시예

실시예 1: 혈액 샘플 수집

폐암 I-IV기의 환자 41명을 본 전향 예비 연구에 포함시켰다 (표 1). 사전 동의서 작성 후, 지방 IRB 승인에 따라, 익명처리된 말초 혈액 샘플을 수집하였다. 원발성 폐암에 대한 방사선요법을 시작하기 전 2013년 7월부터 2014년 5월까지 환자를 동원하였다. 4명의 환자는 I기 질환에 대해 정위적 체부 방사선 요법(Stereotactic Body Radiation Therapy: SBRT)을 받았고, 37명의 환자는 II-IV기 질환에 대해 양성자 요법 (n=16) 또는 강도 변조 방사선 요법 (Intensity-modulated radiation therapy: IMRT) (n=21)과 함께 화학방사선조사를 받았다. MD 앤더슨 암 센터(MD Anderson Cancer Center: MDA)에서 익명처리된 혈액 샘플 (7.5 mL)을 채취하고, 현장에서 프로세싱하였다. 슬라이드를 익명처리한 후, 크리에티브이 마이크로테크, 인크.(Creatv MicroTech, Inc.)의 임상 핵심 실험실로 보내고, 거기서 분석하였다. 원발성 종양으로부터의 익명처리된 생검 샘플을 MDA에서 제조사의 프로토콜 (다코)에 따라 프로세싱하였다. 연구 완료시까지 시설로부터의 결과를 공유하거나, 의사 전달하지 않았다.

셀시브™ 저유량 정밀여과 방법

셀세이브 보존 튜브™에 수집된 혈액 샘플 (7.5 mL)을 저압 진공 시스템을 이용하여 셀시브™ 정밀여과 검정법을 사용하여 프로세싱하였다 ^{[1, 12]}. 셀시브™ 정밀여과 검정법은 크기배제, >7 ㎛에 기초하여 순환 세포를 단리시킨다. 숙련된 세포학자는 기술된 ^{[6, 11, 14]} 미리 확립된 세포학적 특징을 사용하여 형태적 특징 및 CD45, EpCAM, 시토케라틴 8, 18, 19 및 DAPI의 표현형 발현에 기초하여 예후적으로 관련된 병리학적으로 정의가능한 CTC (PDCTC), EMTCTC 및 CAML을 확인하였다 (도 1 및 2) ^{[1, 6, 12]}. 칼 자이스 악시오캠(Carl Zeiss AxioCam) 및 젠2011 블루(Zen2011 Blue)가 장착된 올림푸스(Olympus) BX54WI 형광 현미경 (칼 자이스)을 모든 영상화를 위해 사용하였다.

PDCTC/EMTCTC 서브타입 및 CAML 계수

암 환자에서 발견되는 가장 일반적인 CTC 서브타입 2가지 (PDCTCS 및 EMTCTC)를 정의하는 특징 및 CAML 확인을 위한 것은 앞서 기술된 바 있다 ^{[1, 6, 10-14]}. 본 연구를 위해, 오직 무손상 PDCTC, EMTCTC, 및 CAML만을 특징 규명하였다 (도 2 및 3) ^{[1, 6, 10-14]}. 셀서치(CellSearch)®에 따라 CTC의 서브타입으로 분류된 PDCTC는 악성 병리학적 기준에 따르면, 필라멘트형 시토케라틴 양성 및 DAPI 양성 핵을 나타내면서, CD45 양성이다 ^{[1, 6, 10-14]}. EMTCTC는 앞서 정의된 바와 같이 ^{[1, 6-9, 12, 13]}, 병적 이상 기준에 따르면, 확산형 시토케라틴 신호 및 DAPI 양성 핵을 나타내면서, CD45 음성이다. CAML은 확산형 세포질 시토케라틴 염색, 및/또는 CD45+/CD14+을 나타내면서, 비대성 (>30 ㎛), 다핵 세포인 것으로서 기술된다 ^{[6, 11, 14, 17, 22, 43]}. 3가지 세포 유형 모두 숙련된 CTC 세포학자에 의해 확인 및 영상화되었고, 병리학자에 의해 확인받았다. 아폽토시스성 CTC, 및 앞서 기술된 바와 같이 세포학적으로 분류되지 못한 CTC는 포함되지 않았다. 확인 후, 세포를 영상화하였고, 추후 분석을 위해 각 세포의 x-y 축을 마킹하였다. 샘플을 4℃에서 1-3년 동안 보관하였다.

PD-L1 및 RAD50에 대한 QUAS-R 소광 및 재염색

PDCTC, EMTCTC 및 CAML의 초기 확인 및 정량화 후, 형광을 소광시키고, RAD50-다이라이트 550(RAD50-DyLight 550) (피어스 써모(Pierce Thermo)), PD-L1-알렉사플루오르 488(PD-L1-AlexaFluor 488) (R&D 시스템즈(R&D systems)) 및 DAPI 핵 염료로 샘플을 재염색시켰다 (도 1). QUAS-R (소광, 비유도체화, 아민 제거 및 재염색) 기술을 앞서 기술된 바와 같이 사용하였다 ^[13]. 간략하면, 샘플을 영상화하고, 마킹한 후, 필터를 소광 용액, 트리스(Tris)로 순차적으로 화학적으로 처리하고, 필터에 대해 세척 단계를 수행하였다. 화학적 소광 후, 필터를 PBS로 세척하고, XPBS/20%FBS와 인큐베이션시킨 후, 이어서, 실온에서 1시간 동안 RAD50-알렉사플루오르 550 및 PD-L1-알렉사플루오르 488에 대한 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 항체와의 인큐베이션 후, 필터를 1xPBST 중에서 세척하고, 슬라이드에 플루오로마운트-G(Fluoromount-G)/DAPI (써던 바이오테크(Southern Biotech))를 탑재하였다. 샘플을 x/y 축을 따라 배향시키고, 앞서 영상화된 세포를 젠2011 블루 (칼 자이스) 마크 및 파인드 소프트웨어를 사용하여 재배치시켰다. 젠2011 블루 (칼 자이스)를 사용하여 영상을 프로세싱하였다.

원발성 종양 생검에서의 PD-L1 정량화

제조사의 가이드라인에 따라 다코 팜dx(DAKO pharmdx) 클론 22c3 및 다코 팜dx 클론 28-8, 둘 모두를 사용하여, 이용가능한 모든 원발성 종양 생검으로부터의 PD-L1 발현을 분석하였다 (도 4). 본 연구로부터의 8명의 환자는 두 클론 모두를 스크리닝하는 데 충분하고, 이용가능한 보관된 종양 샘플을 가졌고, 한 샘플은 클론 22c3에 대한 단일의 IHC 시험을 위해 충분한 보관된 종양을 가졌다. 두 클론 모두를 앞서 기술된 표준 작업 절차에 따라 염색하였다 ^{[29-31, 38]}.

순환 세포에서의 RAD50 및 PD-L1의 정량화

RAD50 로커스들 형성은 각 세포 중의 핵 국재화된 RAD50 로커스들을 계수함으로써 측정하였다 (도 1 및 5) ^[23]. 각 세포의 PD-L1 픽셀 강도는 젠블루 소프트웨어에 의해 전체 세포의 면적을 사용함으로써 측정하였다. 각 영상에 대한 국부 배경의 평균 픽셀 강도로부터 각 세포의 평균 픽셀 강도를 감산하였다 (도 1c). 세포의 평균 픽셀 강도를 0-음성인 것 (픽셀 평균 0-150), 1-낮은 것 (픽셀 평균 151-300), 2-중간인 것 (픽셀 평균 301-750), 및 3-높은 것 (픽셀 평균 751+)인, 4개의 IHC 군으로 사분위화하였다 (도 5). IHC 점수화를 위한 PD-L1 강도의 IHC 범위 임계값은 하기와 같이 결정되었다: 150 픽셀 강도는 국재화된 배경 신호의 표준 편차였고, 300 픽셀 강도는 국재화된 배경 신호의 표준 편차의 2배 값이었고, 750은 국재화된 배경의 강도의 2배 값이었다 (도 5).

통계 방법

MATLAB R2013A에서 모든 서브타입, 및 공지된 환자 집단으로부터의 계수를 이용하여 분석을 수행하였다. 무진행 생존 분석을 위해, 진행 기간은 T0 혈액 샘플 수득 시점부터 진행일까지의 간격으로 정의하였고, 환자 모두 24개월 종료 시점까지 연구에 그대로 남아 있었고, 즉, 검열받은 환자는 없었다. RAD50 포커스들 형성 및 PD-L1 발현의 평균 변화의 유의도를 스튜던츠 T 검정(Student's T-test)에 의해 측정하였다. 피어슨(Pearson) 계수를 사용하여 개별 측정값에 대한 RAD50 포커스들과 PD-L1 발현 사이의 상관관계를 측정하였다. 로그 순위 분석에 의해 카플란-마이어(Kaplan Meier) 플롯의 유의도를 측정하였다.

결과

LC 환자에서의 PDCTC, EMTCTC 및 CAML

선행 보고에 따르면, 셀서치® 플랫폼을 사용하였을 때, NSCLC 환자에서 CTC 하위집단은 전형적으로 비전이성 사례 중 단지 0-5%에서만 발견되는 것으로 나타났다. 그에 반해, EMTCTC 집단은 전형적으로 비전이성 환자 집단 중 ~80%에서 발견되는 반면, CAML은 NSCLC에서는 광범위하게 평가되고 있지 않다 ^{[3-6, 8, 15, 17, 43-45]}. 방사선 요법을 시작하기 전에 채취된 제1 기준선 혈액 샘플 (T0)에서, 본 발명자들은 41개의 샘플 중 35개에서 (85%) 적어도 하나의 시토케라틴 양성 세포 (즉, PDCTC, EMTCTC 또는 CAML) (도 1 및 3)를 확인할 수 있었다. 이어서, 방사선요법 개시 후, 또는 SBRT 환자에 대한 마지막 분류 이후 2-3주 경과시에 환자로부터 제2 추적 샘플을 채취하였다 (T1). T1의 경우, 41개의 샘플 모두에서 적어도 하나의 시토케라틴 양성 세포 (즉, PDCTC, EMTCTC 또는 CAML)가 발견되었다. 구체적으로, EMTCTC는 T0 샘플 중 49%에서 및 T1 샘플 중 66%에서 발견되었다. CAML은 T0 샘플 중 81%에서, 및 T1 샘플 중 100%에서 발견되었다 (도 3). PDCTC는 T0에서는 단 1개의 샘플에서만 (2%), 및 T1에서는 단 3개의 샘플에서만 (7%) 발견되었다 (도 3). PDCTC는 셀서치® CTC 시스템에 의해 단리된 동일한 CTC 집단 세포인 것으로 나타났는 바, 이에 상기 수치는 선행 보고와 동등한 수준이다 ^{[7-9, 15]}. 셀서치® 시스템은 NSCLC 환자에서 CTC를 III기 NSCLC에서는 ~0-5% 양성, 및 IV기에서는 21-32% 범위로 단리시킨다. 환자 중 35명은 병기가 I-III인 것으로 분류되었는 바, 2-7%가 고전적 CTC 집단의 범위 내에 포함된다 (표 1) ^{[7-9, 15]}. 고전적 PDCTC 집단의 낮은 발병률 (도 3)은 샘플 중 85%로 (T0) 및 100%로 (T1) 존재하는 EMTCTC 및 CAML와 대조를 이룬다. EMTCTC는 단독으로 NSCLC에서 지질 생검에 대하여 일부 증가된 감수성을 제공할 수 있는 것으로 추정된 반면 ^{[7-9, 16]}, 이러한 결과는 EMTCTC 및 CAML, 둘 모두의 조합이 혈액 기반 진단을 위한 종양 유래 세포 분석에 대한 감수성을 개선시킨다는 것을 제안한다.

방사선 조사된 세포의 생물학적 추적자로서의 RAD50

CTC 및 CAML은 원발성 종양 부위로부터 말초 혈액으로 파종되는 것으로 기술되어 왔지만, 이들 세포가 순환 내로 진입하기 이전에 상주하는 정확한 위치는 아직 연구를 통해 확인되지 못한 상태이다. 이와 같이 기원이 알려지지 않은 주된 이유는 환자 중 종양/기질 세포를 표지하고, 그의 파종을 추적하기가 어렵기 때문이며, 이에 실험은 환자에게 위험을 초래한다. 포유동물 세포 중 IRIF 형성부 내의 RAD50 포커스들이 세포로의 직접적인 방사선 노출의 생물학적 추적자인 것으로 밝혀졌는 바, 방사선을 받은 환자에서의 순환 종양 또는 기질 세포에서는 평가되지 않았다. 방사선 조사되지 않은 LC 환자의 경우, T0 기준선에서, EMTCTC 세포에서 RAD50 포커스들 범위는 핵당 0-4개이고, 평균은 0.59±0.97개의 포커스들이고, CAML에서 포커스들 개수는 0-5개 범위이고, 평균은 0.38±1.07개였다 (도 6 및 7). RAD50 포커스들은 소수의 비처리 세포에서 전형적으로 확인되는 정상적인 생물학적 수복 기전이기 때문에, 세포 중에 일부 RAD50 포커스들이 존재한다는 것은 놀라운 것은 아니다 ^{[21, 23, 24]}. 환자를 T1에 종양 지정 방사선요법에 노출시킨 후, EMTCTC에서 RAD50 포커스들은 핵당 0-9개로 유의적으로 증가하였고, 평균은 4.27±2.63개였고, CAML에서 그 개수는 0-20개로 증가하였고, 평균은 핵당 3.9±3.93개였다 (도 6). 이러한 증가는 T0 및 T1 시점, 둘 모두에서 검출가능한 세포를 포함하는 모든 환자에서 관찰되었고 (n=35), 정상적인 CD45+ 백혈구의 어느 배경에서도 거의 발견되지 않았다 (도 1b). 따라서, EMTCTC 및 CAML, 둘 모두에서 RAD50은 T0에 평균이 0.48인 것에서부터 T1에 평균이 4.05 (p<0.0001)인 것으로 증가하였다 (도 6). 이러한 결과는 RAD50이, 종양 부위에서 기원하는 방사선 조사된 세포를 표지화하고, 추적하는 데 사용될 수 있고, 이로써, 종양의 역학적 성질을 추적하는 데 사용될 수 있다는 것을 제안한다.

순환 세포에서의 PD-L1의 역학적 발현

PD-L1은 방사선을 비롯한 각종의 세포독성 요법에 의해 종양에서 유도될 수 있다는 제안이 있었다 ^{[29-34, 36-40, 42]}. 이를 BBB를 사용하여 관찰할 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 T0 및 T1 시점에 PD-L1 염색을 평가하였다. 고전적 0-3 IHC 조직 생검 점수화와 유사한 방식으로 정규화된 비교 점수화 체계가 개발되었다 (도 5 및 8). 염색 및 영상화 후, LC 환자에서 발견되는 373개의 모든 세포에 대한 PD-L1 발현 및 국부 배경을 측정하였다. 각 영상의 국부 배경의 평균은 375±150 픽셀 강도였다 (도 5). 국재화된 배경 효과를 감안하기 위하여, 각각의 측정된 세포로부터 각 영상의 배경을 감산하여 17-3,090의 정확한 PD-L1 픽셀 강도 범위를 얻었다 (도 5). 이어서, 본 발명자들은 배경의 표준 편차가 0-150 픽셀인 것은 점수 0으로 (세포 중 26%), 및 표준 편차의 2배 값 (151-300 픽셀)은 점수 1로 (낮은 발현, 세포 중 42%) 하는 것을 이용하여 정확한 픽셀 강도를 가지는 세포를 군으로 분류하였다. 점수 2인 중간 발현 (세포 중 22%)은 평균 배경 신호의 2배 값 (301-750 픽셀)인 것으로 결정되었고, 높은 발현 또는 점수 3인 것 (세포 중 10%)은 평균 배경 신호의 >2배 값 (>750 픽셀)인 것으로 설정되었다 (도 5).

EMTCTC에서 PD-L1의 픽셀 강도의 평균은 T0에서는 384±484이고, T1에서는 672±669인 반면 (p=0.021), CAML의 평균은 T0에서는 182±89이고, T1에서는 282±169였다 (p=0.004) (데이터는 제시되지 않음). 회귀 분석 결과, T0부터 T1까지 RAD50과 PD-L1 사이에 약하지만, 유의적인 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다 (피어슨 R2=0.079, p<0.0001, n=373). RAD50은 환자들 사이에서 T0부터 T1까지 신뢰할 수 있을 정도로 유도되었지만, 개별 환자에서의 PD-L1 발현 변화는 훨씬 더 가변적이었다 (데이터는 제시되지 않음). 본 발명자들은 T0 및 T1, 두 시점 모두에서 사정가능한 35명의 환자에서 T0과 T1 사이의 PD-L1 발현 패턴에서 3가지 상이한 점을 발견하였다. 18명의 환자 (51%)는 두 시점 모두에서 PD-L1 발현을 보이지 않았거나, 낮은 발현을 보였고, 6명의 환자 (17%)는 두 시점 모두에서 지속적으로 중간/높은 PD-L1을 보였고, 11명의 환자 (32%)는 0/1인 낮은 점수에서부터 2/3 점수로의 증가를 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).

원발성 조직, CTC 및 CAML에서의 PD-L1 수준 비교

본 발명자들은 클론 22c3 및 28-8 (다코)을 이용하여 2개의 상업적으로 이용가능하고, CLIA-인증을 받은 시험을 사용함으로써 IHC에 의해 원래의 진단 생검으로부터 이용가능한 조직을 염색하였다. 본 발명자들은 단지 41명의 환자 중 9명에서의 병적 보관소로부터 이용가능한 조직 또는 세포 블록을 회수할 수 있었고, 상기 9명의 환자 중 1명은 오직 한 IHC 시험에 대해서만 충분한 조직을 가졌다 (도 4). 이는 종양 괴사 또는 소결절의 결과였고, 이로 인해 결과적으로는 PD-L1 IHC 시험을 수행하는 데 종괴는 불충분하였다. 9개의 보관 샘플 중 단 2개만이 양성 PD-L1 염색이었고, 발현 점수 및 두 시험 사이의 백분율(%)에서 일부 가변성을 보였다 (도 4c). 비교 결과, BBB를 사용하였을 때, PD-L1 발현은 T0 환자 샘플 중 85%에서 (n=35/41) 및 T1 환자 샘플 중 100%에서 (n=41/41) 정량화가 가능하였다. 구체적으로, T0에서, EMTCTC 및 CAML은 21명의 환자 (60%)에서는 낮은/음성인 (점수 0/1) PD-L1 발현을, 9명의 환자 (26%)에서는 중간 (점수 2) 발현을, 및 5명의 환자 (14%)에서는 높은 (점수 3) 발현을 보였다 (도 4c).

T0에서, 순환 세포에서의 PD-L1의 발현은 28-8 IHC 클론 결과를 사용하였을 때, 2개의 IHC 양성 염색된 샘플에 대한 IHC 생검 결과와 매우 유사하였다 (도 4c). 3명의 환자는 IHC에 의해 일치하는 음성 PD-L1 조직 및 순환 세포 상에서의 낮은 (0/1) 발현을 보였지만, 3명의 환자는 음성 조직 IHC PD-L1이지만, 순환 세포 상에서는 2/3 점수를 가지는 불일치하는 결과를 보였고, 1명의 환자는 T0 샘플 중에 순환 세포가 부족하였다 (도 4). 샘플 개수가 제한되어 있다는 점을 고려하면, 적절한 통계학적 분석은 불가능하였다. 그러나, 본 결과는 원발성 생검은 PD-L1 발현을 검정하는 데 충분한 조직을 일관성 없이 제공하는 반면, 혈액 기반 생검 (BBB) 접근법은 원발성 폐 종양에서 발견되는 세포 집단으로부터 기원하는 순환 세포 중의 PD-L1 발현의 내재성 수준을 측정할 수 있고, 그의 변화를 모니터링할 수 있다는 것을 제안한다.

잠재적인 예후적 마커로서의, 순환 세포 중의 PD-L1 및 RAD50

조직 생검에서, 바이오마커 PD-L1의 발현이 단독으로는 폐암에서의 생존에 대한 예후 지표가 되지 못하는 반면, RAD50 포커스들 형성은 생존과 양의 상관관계를 가지는 것으로 알려져 왔다 ^{[14, 18, 20, 24, 29, 30, 32, 35, 39, 40, 42]}. 본 발명자들은 T0 및 T1, 두 시점 모두에서 PD-L1의 발현, 또는 RAD50의 평균 개수에 기초하여 환자의 임상 결과를 분석하였다 (도 8). PD-L1의 발현을 사용하여 PFS를 비교하기 위해, 본 발명자들은 2명의 코호트에 대한 컷 오프 기준으로서 중간 발현을 사용, 즉, <2 대 ≥2를 사용하였다. T0에서, 더 낮은 PD-L1을 보인 환자는 1.8인, 약간 더 악화된 위험 비율 (HR)을 보였고, 이는 유의적이지는 않았다 (p=0.305). T1에서, 더 낮은 PD-L1을 보인 환자는 약간 더 우수한 전체 PFS (HR=0.7)를 보였고, 이 역시 유의적이지는 않았다 (p=0.581). 상기 데이터는 T0 또는 T1에서 PD-L1 발현 수준에 기반한 전체 PFS와는 제한된 상관관계 내지 상관관계가 없다는 것을 제안한다. PFS 중간값을 사용하였을 때, 본 발명자들은 더 높은 PD-L1을 보인 세포에서의 T0에서 더 우수한 PFS 중간값으로의 (16개월 대 >24개월) 경미한 경향이 있다는 것을 발견하였지만, 이를 확인하기 위해서는 훨씬 더 큰 크기의 샘플이 요구된다.

조직 생검에서 RAD50 포커스들 형성은 생존과 양의 상관관계를 가지는 것으로 나타났는 바 ^{[18, 20, 24, 26]}, 본 발명자들은 순환 세포에서 그의 예후값에 대해 사정하였다 (도 8). EMTCTC 및 CAML에서의 T0에서 RAD50 포커스들의 개수는 전체 PFS에서 임상적인 차이를 보이지 않았다 (HR=1.0, p=0.775). 그러나, T1에서 더 높은 RAD50 포커스들을 가지는 환자는 더 우수한 전체 PFS로의 비유의적인 경향을 보였다 (HR 2.3, p=0.27) (도 8). 따라서, 전체 PFS는 유의적인 차이는 없었지만, ≤1 RAD50 포커스들/세포인 환자와 비교하여 >1 RAD50 포커스들/세포인 환자에서는 PFS 중간값이 1.9X 더 길었다 (각각 9.8개월 대 18.5개월). 상기 데이터는 방사선요법 이후 순환 세포 중의 RAD50 증가가, 추가 입증 및 더욱 큰 크기의 샘플을 필요로 하는 관찰결과인 예후값을 가질 수 있다는 것을 제안한다.

상기 선행 단락에서 제공된 결과에 의해 명시된 바와 같이, 본 발명자들은 (화학) 방사선요법을 받은 41명의 폐암 환자로부터의 3가지 순환 혈액 세포 서브타입 PDCTC, EMTCTC, 및 CAML 중의 PD-L1 수준 및 RAD50 포커스들을 전향적으로 및 순차적으로 추적하였다. 본 발명자들은 방사선 유도성 RAD50 포커스들 형성에 기초하여 순환 세포의 표현형을 분석하여 원발성 폐 종양 종괴로부터 발산되는 세포에서의 뚜렷한 생물학적 변화를 정량가능한 방식으로 추적하였다. 추가로, 상기와 같은 역학적 변화 추적을 사용하여, 비록 더욱 큰 규모의 연구가 요구되기는 하겠지만, 방사선 요법에 대하여 더욱 크게 감작화될 수 있는 종양을 가지는 환자를 구별지을 수 있다.

많은 그룹들을 통해 IRIF 형성이 방사선 손상된 세포의 핵에서의 RAD50 포커스들 형성에 의해 관찰가능하다는 것이 확립되었고 (도 9) ^{[18, 20, 23]}, 비록 DNA 손상 스트레스 요인을 이용한 선전 감작화이기는 하지만, IRIF 형성의 억제는 다수 암 (즉, NSCLC, 유방암, 편평상피 세포 암종 등)에서의 임상 결과와 양의 상관관계를 가지는 것으로 밝혀져 있다 ^{[18, 20, 23, 24, 26]}. 본 발명자들은 처음에 방사선요법 이전의 비처리된 NSCLC 환자는 낮은 개수의 RAD50 포커스들을 가졌고, RAD50 포커스들은 방사선요법 유도와 함께 나란히 직접적으로 유의적으로 상승하였다는 것을 관찰하였다. 이러한 RAD50 증가는 방사선요법 유도에 의해 유발된 DNA 손상의 결과일 가능성이 있으며, 순환 세포 중의 RAD50 포커스들 형성은 부위 지정 방사선 요법을 받은 암 환자에서의 비침윤성 추적자로서 작용하는 것으로 보인다. 본 발명자들은 RAD50이 지질 생검 분석에서와 같이 순환 세포의 기원의 되는 기관을 확인하는 데 사용될 수 있다는 것을 제안하고, EMTCTC 및 CAML, 둘 모두 환자에서의 원발성 폐 종괴로부터 파종된다는 것을 제안한다.

PD-L1 발현에 대한 생검 조직의 현 승인받은 IHC 시험은 오직 PD-L1 발현 수준이 매우 높은 환자에서의 반응의 예측 변수 뿐이지만, 다수의 PD-L1 음성 환자 또한 이익을 얻을 것이다 ^{[29, 30, 33, 39-42, 46]}. 이러한 차이는 면역 조절 발현의 역학적 성질 및/또는 기질 세포 성분을 분석하지 못하는 무능력함에 기인하는 것일 수 있다. 면역 관문 단백질 발현은 다중 미세환경, 염증성, 및 요법 인자에 의해서 영향을 받음으로써, 이에 역학적이기 때문에, 혈액 기반 분석이 환자에서의 현 PD-L1 발현을 더욱 정확하게 나타낼 수 있을 것이라는 가설이 제기되었다 ^{[29, 30, 39, 42, 43, 47, 48]}. 흥미롭게도, 본 발명자들은 환자의 순환 세포에서 3가지 부류의 PD-L1 반응, 지속적으로 낮거나, 지속적으로 높거나, 또는 낮은 것에부서부터 높은 것으로 유도가능한 반응; (이는 환자의 약 ⅓ (32%)에서 발생한다)을 발견하였다. 이는 환자의 거의 절반 (49%)에서의 내재적으로 높거나, 또는 유도가능한 PD-L1 수준은 면역요법 반응을 예측할 수 있다는 것을 제안하고; 면역요법 및 방사선요법을 조합한 임상 시험에서 전향적 입증을 필요로 할 것이라는 가설을 제안한다.

실시예 2

종양 내피 세포 (TEC) ^[60-62]는 혈관신생 및 신혈관 형성을 위해 필수적인 구조를 형성함으로써 종양 개시, 생존 및 성장을 위해 요구되는 기질 세포 집단이다. TEC는 종양 혈관구조에 요구되는, 모든 종양 부위에 있는 필수적인 구성 성분이고, 전이성 니치를 프라이밍하는 데 도움을 주며, 종양의 분자적 불안정성의 원인이 된다. 순환에서, 공통된 TEC 집단은 그의 큰 크기, 다세포성 클러스터링, 및 고전적 EC 마커 CD31 및 비멘틴에 기반하여 확인되고, 암 연관 혈관 내피 세포 (CAVE)로서 정의되었다 ^[60].

크기 배제는, 순환 종양 EC의 많은 서브타입을 포획할 수 있도록 허용하면서, 큰 세포를 그의 표면 마커 발현과 상관없이, 환자의 말초 혈액으로부터 단리시키는 기술이다. 셀시브™ 마이크로필터는, 악성 질환과 공동으로 발생하고, 그와 관련이 있는 모든 세포 유형을 연구 가능하게 하면서, 전혈로부터 CAVE, CAML 및 CTC를 신속하게 및 효율적으로 단리시킬 수 있는 크기 배제 막이다 ^{[13, 60-62]}. 추가로, 다중 표현형 분석 기술은 단리된 세포 상에서 바이오마커를 서브타이핑하는 것을 대량 스크리닝할 수 있도록 허용하는 셀시브™ 마이크로필터를 사용하여 개발되었다.

이러한 접근법을 입증하기 위하여, 2012년부터 2014년까지 유방암 환자 (n=42), 폐암 환자 (n=39) 및 전립선암 환자 (n=35)를 포함하는 116명의 암 환자 (I-IV기)로부터 말초 혈액 샘플을 채취하였고, 그 뿐만 아니라, 34명의 건강한 대조군으로부터도 채혈하였다. 확립된 여과 접근법, 즉, 셀시브™ 정밀여과 기술 (크리에티브이 마이크로테크)에 의해 혈액을 크기 배제에 의해 여과하고, 세포를 CK 8, 18 & 19, EpCAM 및 CD45에 대하여 염색함으로써 혈액을 프로세싱하였다 (도 10a). 확인 및 영상화 후, QUAS-R (소광, 비유도체화, 아민 제거 및 재염색) 기술을 사용하여 형광 신호를 제거하고, 모든 세포를 CD146, CD14, 비멘틴, & DAPI로 재염색하였다 (도 10b). 재영상화 후, QUAS-R을 다시 사용하여 형광을 제거하고, 세포를 CD144 , CD34 (또는 CD105), CD31, & DAPI에 대하여 재염색하였다 (도 10c). CAVE의 다핵 클러스터는 CAML 경우에 관찰되는 배수체 핵 구조 및 CD14+를 사용하여 암 연관 대식세포 유사 세포로부터 구별되었다.

CAVE는 CD31, CD144 또는 CD146 양성인 것에 기초하여 116명의 환자 중 63명 (54%)에서 확인되었고, 건강한 대조군에서는 발견되지 않았다. CAVE는 I기 환자 중 43%, II기 환자 중 66%, III기 환자 중 74%, 및 IV기 환자 중 82%에서 발견되었다 (도 11). CAVE는 유방 샘플 중 69%, 폐 샘플 중 60%, 및 전립선 샘플 중 77%에서 발견되었다.

CAVE는 CD14 및 CD45에 대해서는 모두 음성을 나타내었다. CD31은 CAVE 중 96%에서 발견이 되는, 가장 많이 존재하는 마커였고, 그 다음은 CD144 (85%), 시토케라틴 (68%), CD34 (64%), CD146 (45%), EpCAM (23%)& CD105 (4%)였다 (도 12).

본 결과는 정밀여과에 의해 단리된 CEC는, 건강한 대조군이 아닌, 고형 종양을 앓는 환자의 순환에서 공통적으로 나타나는 현상인, 시토케라틴에 대해서는 양성이고, CD45에 대해서는 음성이라는 것을 입증한다. 다중 표현형 서브타이핑은 다중 고형 종양 타입을 가지는 암 환자에서 CEC를 적절히 확인하고, 서브타이핑할 수 있다. 상기 데이터는 CEC의 서브세트, 예컨대 CAVE가 순환에서 CK+/CD45-로서 발견되고, 암 특이적 순환 세포의 이종성 집단으로서 존재한다는 것을 제안한다.

실시예 3

도 13은 세포 클러스터에 출현한 CAVE를 입증하기 위한 염색을 보여주는 것이다. 암종 환자로부터 포획된 모든 세포의 초기 염색 동안, 샘플을 DAPI, 시토케라틴 8, 18 & 19, EpCAM 및 CD45로 염색하였다. 도 13의 맨 윗줄은 시토케라틴 발현 및 EpCAM, CD45 비발현을 보이는 클러스터를 보여주는 것이다. 도 13의 두 번째줄은 세포를 DAPI, PD-L1, CD14 및 CD31에 대하여 재염색한 것을 보여주는 것이다. CD31+ 막 염색 및 음성 CD45 및 CD14 염색은 이것이 CAVE 클러스터라는 것을 나타내는 것이다. 이러한 CAVE 클러스터는 PD-L1의 높은 발현을 보인다. 도 13의 세 번째 줄에서, 세포를 CD144, CXCR4 및 비멘틴에 대해 재염색하였다. CXCR4는 또 다른 약물 표적이다. 재염색을 위해 QUAS-R을 사용하였고 ^[13], 이는 형광성 염료의 소광에 이어서, 재염색하는 것으로 구성되었다. 재염색은 조합 면역요법을 분석하는 방법을 나타낸다. 본 실시예에서, PD-L1 및 CXCR4 발현, 둘 모두 높으며, 이는 상기 조합 면역요법이 상기 환자에 대하여 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.

도 14는 초기에 DAPI, 시토케라틴 8, 18 & 19, EpCAM 및 CD45로 염색된 CAML 세포를 보여주는 것이다 (맨 윗줄). 도 14의 두 번째줄은 세포를 DAPI, PD-L1, CCR5 및 PD-1에 대하여 재염색한 것을 보여주는 것이다. 본 실시예에서, PD-L1 및 CCR5 발현, 둘 모두 높으며, 이는 상기 조합 면역요법이 상기 환자에 대하여 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.

도 15는 초기에 DAPI, 시토케라틴 8, 18 & 19, EpCAM 및 CD45로 염색된 CAML세포를 보여주는 것이다 (맨 윗줄). 도 15의 두 번째줄은 세포를 DAPI, PD-L1, CCR5 및 PD-1에 대하여 재염색한 것을 보여주는 것이다. 본 실시예에서, PD-L1 발현은 없고, CCR5 발현이 존재하는데, 이는 상기 조합 면역요법이 상기 환자에 대하여 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4

면역요법용의 현행 동반 진단은 조직 생검 상의 PD-L1 단백질 발현에 기초한다. 그러나, IHC 조직 생검 접근법은 생검 반복의 임상적 실행가능성 및 그 비용, 고유 종양 이질성, 및 PD-L1 IHC 음성 환자가 계속해서 면역요법에 대해 반응할 수 있다는 지식 정보로 인해 제한을 받는다.

PD-L1 발현은 도 16a 및 16b에 제시된 바와 같이, CAML 및 CTC 상에서 검출될 수 있다. PD-L1 발현이 실시간으로 말초 순환 세포로부터 모니터링될 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 항-PD1 면역요법인 펨브로리주맙 개시 이전 및 개시 이후에 RCC 환자로부터의 연속 샘플을 평가하였다. PD-L1 발현을 정량적으로 측정하고, 형광 신호 강도: (신호-배경)/배경, 또는 (S-N)/N에 기초하여 점수화하였다. 본 발명자들은 CAML을 사용하여 치료 동안 PD-L1 단백질 발현의 역학적 변화를 모니터링할 수 있는 능력을 입증하였다.

한 환자의 경우, 펨브로리주맙을 이용한 1차 치료 이전에, CAML 상에서 PD-L1 발현은 약 6 정도였다 (도 16a). 펨브로리주맙 후 1개월 경과하였을 때, CAML 상에서 PD-L1 발현은 배경 수준으로까지 하락하였다 (도 16b). 도 16b는 PD-L1 형광 채널에서는 거의 보이지 않는, (S-N)/N<0.5의, 길이가 74 ㎛인 긴 막대 형상의 CAML이다.

도 17은 세포를 시각화할 수 있는 다른 염색을 포함한다. 이 시점에 환자는 한 튜브의 혈액로부터 여전히 26개의 CAML을 가졌고, 이들 모두 PD-L1은 잡음 수준에 있었다. 환자는 펨브로리주맙 치료가 계속되는 동안에 수 개월 후에 사망하였다. PD-L1 발현 손실은 상이한 RCC 서브클론의 존재, 또는 펨브로리주맙에 대한 반응으로 PD-L1을 저발현하는 서브클론의 분비를 나타낼 수 있다.

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본 발명은 그의 특정의 특별한 실시양태를 참조로 하여 기술되었지만, 당업자는 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남 없이 다양하게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 첨부된 특허청구범위의 범위는 기술된 구체적인 실시양태로 제한되지 않아야 한다.

참고문헌

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개문헌은 본 발명과 관련된 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 인용된 각각의 특허 및 공개문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 하기 참고문헌 모두 본 출원에서 인용되었다:

Claims

암을 앓는 대상체를 면역 관문 억제제에 대한 감수성에 대하여 스크리닝(screening)하는 방법으로서, 상기 방법이 암을 앓는 대상체로부터 단리된 암 연관 대식세포 유사 세포 (CAML), 상피 간엽 이행 순환 종양 세포 (EMTCTC), 및 순환 종양 세포 (CTC)를 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계를 포함하고,
여기서 PD-L1 발현이 검출되는 경우, 대상체가 면역 관문 억제제에 대하여 감수성인 것으로 간주되는, 방법.
면역 관문 억제제를 이용하는 치료에 대한 암을 앓는 대상체의 반응성을 예측하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법이 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CAML, EMTCTC, 및 CTC를 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계를 포함하고,
여기서 PD-L1 발현이 검출되는 경우, 대상체가 면역 관문 억제제를 이용하는 치료에 대하여 반응성인 것으로 예측되는, 방법.
암을 앓는 대상체를 위한 치료의 선택에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법이 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CAML, EMTCTC, 및 CTC를 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계를 포함하고,
여기서 PD-L1 발현이 검출되는 경우, 대상체에게 치료학상 유효량의 면역 관문 억제제를 투여하는 것이 대상체를 위한 치료로서 선택되는, 방법.
면역 관문 억제제 치료를 받게 될 암을 앓는 대상체를 확인하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법이 암을 앓는 대상체로부터 단리된 CAML, EMTCTC, 및 CTC를 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계를 포함하고,
여기서 PD-L1 발현이 검출되는 경우, 대상체가 면역 관문 억제제 치료를 받게 될 대상체인 것으로 확인되는, 방법.
암을 앓는 대상체에서 PD-L1 발현에 대해 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) 암을 앓는 대상체로부터 제1 시점에 단리된 CAML, EMTCTC, 및 CTC를 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계,
(b) 암을 앓는 대상체로부터 제2 시점에 단리된 CAML, EMTCTC, 및 CTC를 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, 및
(c) 제1 및 제2 시점에 단리된 세포에서 검정된 PD-L1 발현을 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
제5항에 있어서, 대상체가 암 치료를 받고 있는 중인, 방법.
암을 앓는 대상체에서 치료를 모니터링하는 것에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) 암 치료를 받고 있는 중인 대상체로부터 제1 시점에 단리된 CAML, EMTCTC, 및 CTC를 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계,
(b) 암 치료를 받고 있는 중인 대상체로부터 제2 시점에 단리된 CAML, EMTCTC, 및 CTC를 PD-L1 발현에 대하여 검정하는 단계, 및
(c) 제1 및 제2 시점에 단리된 세포에서 검정된 PD-L1 발현을 비교하여 암을 앓는 대상체에서 치료에 대해 모니터링하는 단계를 포함하는, 방법.
제7항에 있어서, 대상체가 면역 관문 억제제를 이용하여 치료받고 있는 중인, 방법.
제1항 내지 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 관문 억제제가 PD-L1 길항제, PD-1 길항제, 및 CTLA-4 길항제 중 하나 이상인, 방법.
제1항 내지 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 관문 억제제가 PD-L1과 PD-1 사이의 결합을 억제시키는, 방법.
제1항 내지 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 관문 억제제가 PD-L1의 그의 결합 파트너로의 결합을 억제시키거나, PD-1의 그의 결합 파트너로의 결합을 억제시키거나, 또는 CTLA-4의 그의 결합 파트너로의 결합을 억제시키는, 방법.
제1항 내지 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 관문 억제제가 (a) 항체이거나, (b) 단일클론 항체이거나, 또는 (c) 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체인, 방법.
제1항 내지 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 관문 억제제가 니볼루맙(Nivolumab) (옵디보(Opdivo)), 이필리무맙(Ipilimumab) (여보이(Yervoy)), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab) (키트루다(Keytruda)), 아테졸리주맙(Atezolizumab) (테센트리크(Tecentriq)), 트리멜리무맙(Tremelimumab), 및 더발루맙(Durvalumab) (MED14736) 중 하나 이상인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 발현에 대한 검정이 PD-L1 단백질 발현의 검출, 및 PD-L1 mRNA 생산의 검출 중 하나 이상에 의해 이루어지는, 방법.
제14항에 있어서, PD-L1 단백질 발현이 면역조직화학법 (IHC)을 통해 검출되는, 방법.
제15항에 있어서, IHC가 막 염색, 세포질 염색, 또는 그의 조합에 의해 수행되는, 방법.
제15항에 있어서, IHC가 항-PD-L1 항체를 사용하여 수행되는, 방법.
제15항에 있어서, PD-L1 단백질 발현이 IHC에 의해 낮은 염색 강도로 검출되거나, IHC에 의해 높은 염색 강도로 검출되는, 방법.
제15항에 있어서, PD-L1 단백질 발현이 IHC에 의해 유도가능한 것으로 검출되는, 방법.
제15항에 있어서, PD-L1 단백질 발현이 단리된 세포의 임의의 염색으로서 검출되는, 방법.
제15항에 있어서, IHC가 면역형광 (IF) 염색을 사용하여 수행되고, 여기서 PD-L1에 대하여 결합 특이성을 가지는 하나 이상의 항체가 사용되는, 방법.
제21항에 있어서, 항-PD-L1 항체의 PD-L1에 대한 결합이 항-PD-L1 항체에 접합된 형광성 화합물을 통해 검출되는, 방법.
제21항에 있어서, 항-PD-L1 항체의 PD-L1에 대한 결합이, 항-PD-L1 항체에 대하여 결합 특이성을 가지는 형광단-접합된 2차 항체를 통해 검출되는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 발현 수준이, 암을 앓지 않는 동일한 종의 대상체로부터의 기질 세포 집단의 PD-L1 발현보다 더 큰 경우에 PD-L1 발현이 검출되는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CAML, EMTCTC, 및 CTC가 암을 앓는 대상체로부터 수득되는 혈액으로부터 단리되는, 방법.
제25항에 있어서, 혈액이 말초 혈액인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 앓는 대상체가 표적화된 작용제, 화학요법, 또는 방사선 요법 중 하나 이상의 것을 사용하는 치료를 받고 있는 중인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 고형 종양인, 방법.
제28항에 있어서, 고형 종양이 I기, II기, III기 또는 IV기 암인, 방법.
제28항에 있어서, 고형 종양이 암종, 육종, 신경아세포종 또는 흑색종인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 방광암, 신장암, 두부경부암, 결장직장암, 간암, 난소암, 신경아세포종, 육종, 골육종, 식도암, 뇌 및 ONS 암, 후두암, 기관지암, 구강암 및 인두암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁경부암, 또는 자궁체부암인, 방법.
제31항에 있어서, 폐암이 비소세포 폐 암종 (NSCLC)인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 CAML, EMTCTC, 및 CTC가 적어도 하나의 RAD50 포커스들(foci)을 나타내는, 방법.