KR20220121818A - 표적 핵산의 비대칭 증폭 방법 - Google Patents
표적 핵산의 비대칭 증폭 방법 Download PDFInfo
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Abstract
샘플에서 하나 이상의 표적 핵산의 다중 및 비대칭 증폭을 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 샘플에 존재하는 여러 표적 핵산을 동시에 증폭할 수 있으며 동시에 많은 수의 단일 사슬 제품을 생산할 수 있다.
Description
본 출원은 핵산 분자의 다중 비대칭 증폭에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산들을 동시에 비대칭적으로 증폭하는 방법을 제공하며, 이 방법은 샘플에 존재하는 다중 표적 핵산들을 동시에 비대칭적으로 증폭할 수 있고, 동시에 다량의 단일-가닥 생성물들을 생성할 수 있다.
Gyllensten et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 7652-7656)에 의해 처음 설명된 비대칭 PCR (Asymmetric PCR)은 동일하지 않은 양의 프라이머 쌍을 사용하여 단일-가닥 DNA (ssDNA)를 대량으로 생성하는 방법을 말한다. 비대칭 PCR에 의해 생성된 단일-가닥 (Single-stranded) DNA는 시퀀싱에 사용거나, 프로브로 사용되거나, 또는 리얼-타임 (Real-time) PCR, 마이크로어레이 검출, 및 프로브 용융 곡선 분석에서 검출 신호를 개선하는데 사용할 수 있다. 그러나, 기존의 비대칭 PCR은 특정 단일-가닥 제품의 생산을 최대화하고 비특이적 증폭을 최소화하기 위한 주의 깊은 최적화를 요구한다. 다수의 표적 핵산 서열을 동시에 비대칭적으로 증폭해야 하는 경우, 프라이머쌍의 증가는 프라이머 다이머 (Dimer)와 같은 비특이적 증폭의 증가로 이어지며, 이것은 설계 및 최적화의 어려움을 더욱 증가시킨다.
기존의 비대칭 PCR 증폭에서는, 제한 프라이머 농도의 감소로 인해, 그 녹는점이 PCR 반응의 어닐링 (Annealing) 온도보다 낮으며, 이는 차례로 비대치 PCR 증폭의 비효율로 이어진다. 이에 대한 반응으로, Sanchez et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101: 1933-1938)에서는 LATE-PCR (Linear-After-The-Exponential-PCR)을 제안하였고, 프라이머를 디자인 할 때, 실제 프라이머 농도를 프라이머 녹는점 (Tm) 값에 영향을 미치는 인자로 사용하고, 저농도 제한 프라이머의 Tm이 증가하여 어닐링 온도보다 높을 수 있어 비대칭 PCR의 증폭 효율을 향상시켜 다량의 단일-가닥 생성물을 생성할 수 있을 것으로 기대된다. 이 방법은 비대칭 PCR의 낮은 증폭 효율을 해결하고 비대칭 PCR을 최적화하기 쉽게 만든다. 그러나, 이 방법은 프라이머 쌍의 증가로 인한 비특이적 증폭 증가 문제를 해결하지 못하여 여전히 다중 비대칭 PCR 증폭을 달성하기가 어렵다.
Brownie et al. (Nucleic Acids Research 1997, 26:3235-3241)은 Homo-Tag 지원 비이량체 시스템(HAND System)을 설명한다. 이 시스템에서, 동일한 태그 서열은 두 대상별 (target-specific) 업스트림의 5'끝에 추가되며 꼬리가 달린/태그가 붙은 표적-특이적 프라이머 (tailed/tagged target-specific primer)를 형성한다. PCR 증폭에서는, 초기 PCR 증폭은 먼저 낮은 어닐링 온도에서 꼬리가 달린/태그된 특정 프라이머의 낮은 농도에 의해 시작되고; 여러 사이클 후, 상승된 어닐링 온도, 고농도 범용 프라이머가 초기 PCR 증폭의 증폭 생성물의 후속 증폭을 수행하는데 사용된다. 높은 국소적 농도 (high local concentration) 때문에, 프라이머-다이머와 같은 작은 단편 제품의 단일-가닥은 안정적인 “팬 핸들” 구조를 형성하기 위해 자가 어닐링되는 경향이 있으며, 범용 프라이머의 추가 어닐링을 방지하여, 프라이머-다이머의 증폭을 억제한다. 저농도의 상동성의 태깅된 표적-특이적 프라이머와 고농도의 범용 프라이머의 사용을 결합하여, HAND 시스템은 프라이머-이량체의 증폭을 효과적으로 억제하고 효율적인 다중 PCR 증폭을 달성하며 높은 증폭 효율과 검출 감도를 유지할 수 있다. 그러나, HAND 시스템을 이용한 PCR 증폭은 대칭 증폭으로, 단일-가닥 제품을 생산할 수 없으므로, 유전자 칩 및 프로브 용융 곡선 분석 기술 분야에서 HAND 시스템의 적용이 제한된다.
따라서, 다수의 표적 핵산을 동시에 비대칭적으로 증폭할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요하며, 다중 표적 핵산의 동시 증폭 및 검출에 대한 임상 요구 사항을 충족시키기 위해 효율적인 다중 PCR 증폭 및 비대칭 PCR 증폭을 동시에 실현할 수 있다.
본 출원에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학 기술용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 핵산 화학 실험실 작업 단계 (the nucleic acid chemistry laboratory operation steps)는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 일상적인 단계이다. 한편, 본 발명의 보다 나은 이해를 위하여 관련 용어에 대한 정의 및 설명은 다음과 같다.
본 명세서에 있어서, 용어 “표적 핵산 서열 (Target nucleic acid sequence)”, “표적 핵산” 및 “표적 서열”은 검출될 표적 핵산 또는 그의 서열을 지칭한다. 본 출원에 있어서, 용어 “표적 핵산 서열” 및 “표적 서열”이라는 용어는 동일한 의미를 가지며 혼용되어 사용된다.
본 명세서에 있어서, 용어 “표적 핵산 특이적 서열 (Target nucleic acid-specific sequence)” 및 “표적-특이적 서열 (Target-specific sequence)은 핵산 혼성화 (Hybridization) 또는 어닐링 (Annealing) 또는 증폭 (Amplification )을 허용하는 조건 하에서 표적 핵산에 선택적/특이적으로 혼성화 또는 어닐링 할 수 있는 서열을 지칭하고, 표적 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 출원에서, 용어“표적 핵산 특이적 서열” 및 “표적-특이적 서열”은 동일한 의미를 가지며 혼용되어 사용된다. 표적 핵산 특이적 서열 또는 표적-특이적 서열이 표적 핵산에 특이적이라는 것은 쉽게 이해된다. 다시 말해서, 표적 핵산 특이적 서열 또는 표적-특이적 서열은 핵산의 혼성화, 어닐링 또는 증폭을 허용하는 조건 하에서 특정 표적 핵산에만 혼성화 또는 어닐링 할 수 있고 다른 핵산 서열에는 혼성화할 수 없다. 예를 들어, 본 출원에 있어서, “표적 핵산 특이적 정방향 염기 서열”은 핵산의 혼성화, 어닐링 또는 증폭을 허용하는 조건 하에서 표적 핵산에 선택적으로/특이적으로 혼성화 또는 어닐링 할 수 있는 정방향 핵산을 말하며, 표적 핵산에 상보적인 서열을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 “상보적 (Complementary)”은 두 개의 핵산 서열이 염기쌍의 원리 (Waston-Crick 원리)에 따라 서로 수소 결합을 형성하여 이중체를 형성할 수 있는 것을 의미한다. 본 출원에서, 용어 “상보적인”이라는 용어는 “실질적으로 상보적인 (Substantially complementary)” 및 “완전히 상보적인 (Completely complementary)”을 포함한다. 본 명세서에서, 용어 “완전히 상보적인”은 한 핵산 서열의 모든 염기가 불일치 또는 갭 없이 다른 핵산 가닥의 염기와 짝을 이룰 수 있음을 의미한다. 본 명세서에서, 용어 “실질적으로 상보적인”은 하나의 핵산 서열에 있는 대부분의 염기가 다른 핵산 가닥의 염기와 짝을 이룰 수 있다는 것을 의미하며, 이는 불일치 또는 갭 (예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 불일치 또는 갭)의 존재를 허용한다. 전형적으로, “상보적”인 두 개의 핵산 서열 (예를 들어, 실질적으로 상보적이거나 완전히 상보적)은 핵산의 혼성화, 어닐링 또는 증폭을 허용하는 조건에서 선택적으로/특이적으로 혼성화하거나 어닐링하고 이중체를 형성한다. 따라서, “비-상보적”이라는 용어는 핵산의 혼성화, 어닐링 또는 증폭이 이중체를 형성하도록 하는 조건 하에서 2 개의 핵산 서열이 혼성화 또는 어닐링 될 수 없음을 의미한다. 본 명세서에서, 용어 “완전히 상보적이지 않은”는 하나의 핵산 서열의 염기가 다른 핵산 가닥의 염기와 완전히 쌍을 이룰 수 없고, 적어도 하나의 미스매치 또는 갭이 존재함을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “치환 (Substitution)”은 DNA 분자의 특정 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 대체됨을 의미한다. 일반적으로 대체는 두 가지 범주로 나눌 수 있다: 전이 (Transition) 및 전환 (Transversion), 여기서 전이는 한 퓨린 뉴클레오티드로의 치환 또는 한 피리미딘 뉴클레오티드의 다른 피리미딘 뉴클레오티드로의 치환 (예를 들어, A에서 G로의 치환, G에서 A로의 치환, C에서 T로의 치환, T에서 C로의 치환)을 의미하며; 전환은 피리미딘 뉴클레오티드에 대한 퓨린 뉴클레오티드의 치환 또는 퓨린 뉴클레오티드에 대한 피리미딘 뉴클레오티드의 치환 (예를 들어, A의 T 또는 C로의 치환, G의 T 또는 C로의 치환, T의 A 또는 G로의 치환, C의 A 또는 G로의 치환)을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “혼성화 (Hybridization)” 및 “어닐링 (Annealing)”은 상보적인 단일-가닥 핵산 분자가 이중-가닥 핵산을 형성하는 과정을 의미한다. 본 출원에 있어서, “혼성화”및 “어닐링”은 동일한 의미를 가지며 혼동되어 사용된다. 전형적으로, 완전히 상보적이거나 실질적으로 상보적인 2 개의 핵산 서열은 혼성화하거나 어닐링할 수 있다. 2 개의 핵산 서열의 혼성화 또는 어닐링에 필요한 상보성은 사용된 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 다르다.
본 명세서에서, “핵산 혼성화를 가능하게 하는 조건 (conditions allowing nucleic acid hybridization)”은 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가지며, 통상적인 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상보적 서열을 갖는 2 개의 핵산 분자는 적합한 혼성화 조건 하에 혼성화 할 수 있다. 이러한 혼성화 조건은 혼성화 완충액의 온도, pH, 조성 및 이온 강도 등과 같은 인자를 포함할 수 있고, 상보적인 두 핵산 분자의 길이 및 GC 함량에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 2 개의 상보적 핵산 분자의 길이가 상대적으로 짧고/짧거나 GC 함량이 상대적으로 낮은 경우 엄격한 혼성화 조건이 사용될 수 있다. 매우 엄격한 혼성화 조건은 2 개의 상보적 핵산 분자의 길이가 상대적으로 길고/길거나 GC 함량이 상대적으로 높을 때 사용할 수 있다. 이러한 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); 및 MLM Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. NY (1999)에서 찾을 수 있다. 본 출원에서 “혼성화” 및 “어닐링”은 동일한 의미를 가지며 혼용되어 사용된다. 따라서, “핵산 혼성화를 허용하는 조건” 및 “핵산 어닐링을 허용하는 조건”이라는 표현도 동일한 의미를 가지며 혼용되어 사용된다.
본 명세서에서, 표현 “핵산 증폭을 허용하는 조건 (Conditions allowing nucleic acid amplification)”은 핵산 중합효소 (예를 들어, DNA 중합효소)가 하나의 핵산 가닥을 주형으로 사용하여 다른 핵산 사슬을 합성하고 이중체를 형성하도록 허용되는 조건을 지칭하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 이러한 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며 온도, pH, 조성, 농도 및 혼성화 완충제의 이온 강도와 같은 요인과 관련될 수 있다. 적합한 핵산 증폭 조건은 일상적인 방법에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 참조). 본 발명의 방법에서 “핵산 증폭을 허용하는 조건”은 바람직하게는 핵산 중합효소 (예를 들어, DNA 중합효소)의 작업조건이다.
본 명세서에서, 표현 “핵산 중합효소가 연장 반응을 수행하도록 허용하는 조건 (conditions allowing a nucleic acid polymerase to carry out an extension reaction)”은 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가지며, 이는 핵산 중합효소 (예를 들어, DNA 중합효소)가 핵산 가닥을 주형으로 사용하여 다른 핵산 가닥 (예를 들어, 프라이머 또는 프로브)을 연장하고 이중체를 형성한다. 이러한 조건은 당업자에게 잘 알려져 있으며 온도, pH, 조성, 농도 및 혼성화 완충제의 이온 강도와 같은 인자와 관련될 수 있다. 적합한 핵산 증폭 조건은 일상적인 방법 (예를 들어, Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 참조)에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에서, “핵산 중합효소가 신장 반응을 수행하도록 하는 조건”은 바람직하게는 핵산 중합효소 (예를 들어, DNA 중합효소)의 작동 조건이다. 본 출원에 있어서, 표현 “핵산 중합효소가 신장 반응을 수행하도록 하는 조건” 및 “핵산 신장을 허용하는 조건”이라는 표현은 동일한 의미를 가지며 혼용되어 사용된다.
다양한 효소의 작업 조건은 통상적인 방법에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있고, 일반적으로 다음 요인을 포함할 수 있다: 온도, 완충액의 pH, 조성, 농도, 이온 강도 등. 또는, 효소 제조업체에서 권장하는 조건을 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “핵산 변성 (nucleic acid denaturation)”은 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 가지며, 이중-가닥 핵산 분자가 단일-가닥으로 해리되는 과정을 의미한다. 표현 “핵산 변성을 허용하는 조건”은 이중-가닥 핵산 분자가 단일-가닥으로 해리되는 조건을 지칭한다. 이러한 조건은 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 참조). 예를 들어, 핵산은 가열, 알카리 처리, 요소 처리, 효소적 방법 (예를 들어, 헬리카제를 사용하는 방법)과 같은 통상적인 기술에 의해 변성될 수 있다. 본 출원에 있어서, 핵산은 바람직하게는 가열 하에 변성된다. 예를 들어, 핵산은 80 내지 105 ℃로 가열하여 변성될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “PCR 반응 (PCR reaction)”은 핵산 중합효소 및 프라이머를 이용하여 표적 핵산을 증폭시키는 반응 (중합효소 연쇄반응)을 의미하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에서, 용어 “다중 증폭 (Multiplex amplification)”은 동일한 시스템에서 다중 표적 핵산의 증폭을 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 “비대칭 증폭 (Asymmetric amplification)”은 표적 핵산을 증폭하여 얻은 증폭 생성물에서, 두 개의 상보적 핵산 가닥의 양보다 많다.
본 명세서에서, 그리고 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같이, 용어 “정방향 (Forward)” 및 “역방향 (Reverse)”은 프라이머 쌍에서 두 개의 프라이머를 설명하고 구별하는 편의를 위해서만 사용되며, 상대적인 것으로, 특별한 의미는 없다.
본 명세서에서, 용어 “형광 프로브 (Fluorescent probe)”는 형광기를 보유하고 형광 신호를 생성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 “용융 곡선 분석 (Melting curve analysis)”은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖으며 이중-가닥 핵산 분자의 용융 곡선을 결정하여 이중-가닥 핵산 분자의 존재 또는 동일성을 분석하는 방법을 말하며, 이러한 방법은 가열하는 동안 이중-가닥 핵산 분자의 해리 특성을 평가하는 데 일반적으로 사용된다. 용융 곡선 분석을 수행하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다 (예를 들어, Journal of Molecular Diagnostics 2009, 11(2): 93-101를 참조하라). 본 출원에 있어서, 용어 “용융 곡선 분석” 및 “용융 분석”은 동일한 의미를 가지며 상호 교환적으로 사용된다.
본 출원은 바람직한 특정 일 양태에서, 용융 곡선 분석은 리포터 그룹 (Reporter group)과 퀀처 그룹 (Quencher group)으로 표지된 검출 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 간단히 말해서, 주변 온도에서 검출 프로브는 염기 쌍을 통해 상보적인 서열과 이중체를 형성할 수 있다. 이 경우, 검출 프로브의 리포터 그룹 (예를 들어, 형광단) 및 소광제 그룹 (Quencher group on the detection probe)은 서로 분리되어 있고, 소광제 그룹의 신호 (예를 들어, 형광 신호)를 흡수할 수 없으며, 이때 가장 강한 신호 (예를 들어, 형광 신호)를 감지할 수 있다. 온도가 상승함에 따라, 이중-가닥의 두 가닥이 분리되기 시작하며 (즉, 검출 프로브가 상보적 서열에서 점차적으로 분리됨), 분리된 검출 프로브는 단일-가닥 자유 코일 상태로 존재한다. 이 경우, 해리된 검출 프로브의 리포터 그룹 (예를 들어, 형광단 (Fluorophore)) 및 소광제 그룹은 서로 매우 근접하고, 이로써 리포터 그룹 (예를 들어, 형광단)에 의해 방출된 신호 (예를 들어, 형광 신호 (Fluorescent signal))는 소광제 그룹에 의해 흡수된다. 따라서, 온도가 상승함에 따라 감지된 신호 (예를 들어, 형광성 신호)가 점차 약해진다. 이중-가닥의 두 가닥이 완전히 분리되면, 모든 감지 프로브는 단일-가닥 자유 코일 상태 (Single-stranded free coil state)이다. 이 경우, 검출 프로브의 리포터 그룹 (예를 들어, 형광단)에서 방출되는 모든 신호 (예를 들어, 형광 신호)는 소광제 그룹에 의해 흡수된다. 따라서, 리포터 그룹 (예를 들어, 형광단)에서 방출되는 신호 (예를 들어, 형광 신호)는 본질적으로 감지할 수 없다. 따라서, 가열 또는 냉각 과정에서 검출 프로브를 포함하는 이중체에서 방출되는 신호 (예를 들어, 형광 신호)를 검출함으로써, 검출 프로브 및 그 상보적 서열의 혼성화 및 해리 과정을 관찰할 수 있으며, 신호 강도가 온도에 따라 변할 때 곡선이 형성된다. 또한, 얻어진 곡선의 유도 해석에 의해, 신호 강도의 변화율을 세로축 및 온도를 가로축으로 하는 곡선 (즉, 듀플렉스의 용융 곡선)을 얻을 수 있다. 융해 곡선의 피크는 융해피크이며, 해당 온도는 이중체의 녹는점 (Tm)이다. 일반적으로, 검출 프로브와 상보적 서열 간의 일치 정도가 높을수록 (예를 들어, 일치하지 않는 염기가 적고 염기 쌍이 더 많음), 이중체의 Tm이 더 높아진다. 따라서, 이중체의 Tm을 검출함으로써, 이중체에서 검출 프로브에 상보적인 서열의 존재 및 동일성이 결정될 수 있다. 본 명세서에서, “녹는점”, “녹는점” 및 “Tm”이라는 용어는 동일한 의미를 가지며 혼용되어 사용된다.
증폭 방법
일 측면에서, 본 발명은, 다음을 포함하는, 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산들을 증폭하는 방법을 제공한다,
(1) 하나 이상의 표적 핵산들을 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 및, 범용 프라이머를 제공하고, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해, 표적-특이적 프라이머 쌍을 제공하는 단계; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열을 포함함;
표적-특이적 프라이머 쌍은 표적 핵산을 증폭할 수 있고 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 정방향 염기 서열을 포함하고, 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 역방향 염기 서열을 포함하고, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 및, 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에서, 제1 범용 서열은 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링할 수 있고, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이에 차이점이 있고, 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 것을 포함함; 및, 제1 범용 서열은 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적이지 않음; 및
(2) 샘플 내 표적 핵산들을 범용 프라이머와 표적-특이적 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 통해 핵산 증폭이 가능한 조건에서 증폭하는 단계.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 표적 핵산에 특이적인 정방향 염기 서열 및 역방향 염기 서열을 포함하고, 이로써, PCR 반응 동안, 표적-특이적 프라이머 쌍(정방향 및 역방향 프라이머)이 표적 핵산에 어닐링하고 PCR 증폭을 개시하고, 정방향 및 역방향 프라이머에 각각 상보적인 2 개의 핵산 가닥(핵산 가닥 A 및 핵산 가닥 B)을 포함하는 초기 증폭 생성물이 생성된다.
나아가, 역방향 프라이머와 범용 프라이머 모두 제1 범용 서열을 포함하기 때문에, 역방향 프라이머에 상보적인 핵산 가닥 B도 범용 프라이머에 상보적일 수 있다. 따라서, PCR 반응 동안, 범용 프라이머는 핵산 가닥 B에 어닐링할 수 있고 일반적으로 PCR 증폭을 시작할 수 있다(즉, 일반적으로 핵산 가닥 B의 상보적 가닥을 합성). 동시에, 제1 범용 서열은 핵산 혼성화 또는 어닐링이 가능한 조건하에서 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링될 수 있으므로, PCR 반응 동안, 범용 프라이머(제1 범용 서열을 포함함) 또한 정방향 프라이머(제2 범용 서열을 포함함)에 상보적인 핵산 가닥 A에 어닐링할 수 있다. 그러나, 제2 범용 서열은 제1 범용 서열(여기서, 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 결실 또는 치환됨)과 다르기 때문에, 범용 프라이머들(특히 그들의 3' 말단)은 핵산 가닥 A에 완전히 상보적이지 않아, 범용 프라이머에 의한 핵산 가닥 A의 PCR 증폭이 억제된다(즉, 핵산 가닥 A의 상보적 가닥 합성이 억제됨).
따라서, PCR 반응이 진행됨에 따라, 범용 프라이머는 초기 증폭 생성물의 핵산 가닥 A와 핵산 가닥 B에, 각각, 어닐링하고, 추가로 PCR 증폭을 개시하고, 상기 핵산 가닥 B의 상보적 가닥의 합성은 정상적으로 진행될 것이며, 반면 핵산 가닥 A의 상보적 가닥 합성은 억제된다. 따라서, PCR 증폭이 진행됨에 따라, 핵산 가닥 A의 상보적 가닥(핵산 가닥 B)의 합성 효율은 핵산 가닥 B의 상보적 가닥(핵산 가닥 A)의 합성 효율보다 현저히 낮아지게 되며, 결과적으로 핵산 가닥 B의 상보적 가닥(핵산 가닥 A)은 대량으로 합성 및 증폭되는 반면, 핵산 가닥 A의 상보적 가닥(핵산 가닥 B)의 합성 및 증폭은 억제되어, 다량의 단일-가닥 생성물(정방향 프라이머/제2 범용 프라이머 서열, 및 역방향 프라이머/범용 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 핵산 가닥 A)로, 표적 핵산의 비대칭 증폭을 가능하게 한다. 따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산들의 비대칭 증폭이 가능하다.
또한, 역방향 프라이머의 제1 범용 서열은 핵산의 혼성화 또는 어닐링이 가능한 조건하에서 정방향 프라이머의 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링할 수 있으므로, PCR 반응 동안, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비-특이적 증폭으로 인해 형성된 프라이머-이량체는 변성 후 5' 말단과 3' 말단이 상보적이며 서로 어닐링할 수 있는 단일-가닥 핵산을 생성하고, 그 단일-가닥 핵산은 어닐링 단계 동안 자가-어닐링되어 안정적인 팬핸들 구조를 형성하여, 범용 프라이머가 어닐링되는 것을 방지하고 단일-가닥 핵산을 확장하여, 프라이머-이량체의 추가 증폭을 억제하는 경향이 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 프라이머-이량체의 비-특이적 증폭을 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 다중 증폭을 수행하는 데 특히 적합하다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서는, 범용 프라이머는 하나 이상의 표적 핵산들의 다중 증폭을 달성하기 위해 하나 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍과 조합하여 사용될 수 있다.
따라서, 특정한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 또는 그 이상의 표적 핵산들, 예를 들어, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 8 개, 적어도 10 개, 적어도 12 개, 적어도 15 개, 적어도 18 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50개, 또는 그 이상의 표적 핵산들을 동시에 증폭할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 또는 그 이상의 표적 핵산들을 동시에 비대칭적으로 증폭할 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해 하나의 표적-특이적 프라이머 쌍이 단계 (1)에서 제공된다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 단계 (1)에서 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 또는 그 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍, 예를 들어, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 8 개, 적어도 10 개, 적어도 12 개, 적어도 15 개, 적어도 18 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 또는 그 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍이 제공된다.
상이한 표적 핵산에 대해, 상이한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 사용될 수 있음은 이해하기 쉽다. 그러나, 서로 다른 표적 핵산 사이에 서열 유사성이 있는 경우, 서로 다른 표적-특이적 프라이머 쌍은 동일한 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 가질 수 있다.
다중 비대칭 증폭을 용이하게 하고 프라이머-이량체의 비특이적 증폭을 효과적으로 억제하기 위해, 일부 바람직한 실시양태에서, 범용 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머보다 높은 작업 농도를 갖는다. 특정 바람직한 실시양태에서, 범용 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 작업 농도보다 적어도 1 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 8 배, 적어도 10 배, 적어도 12 배, 적어도 15 배, 적어도 18 배, 적어도 20 배, 적어도 25 배, 적어도 30 배, 적어도 40 배, 적어도 50 배 또는 그 이상 더 높은 작업 농도를 갖는다. 특정 바람직한 실시양태에서, 범용 프라이머는 정방향 및 역방향 프라이머의 작업 농도보다 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 배 또는 그 이상의 작업 농도를 갖는다.
본 발명의 방법에서, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 작업 농도는 동일 또는 상이할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 및 역방향 프라이머의 작업 농도는 동일하다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 및 역방향 프라이머의 작업 농도는 상이하다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머의 작업 농도는 역방향 프라이머의 작업 농도보다 낮다.
특정 바람직한 실시양태에서, 범용 프라이머는 제1 범용 서열로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 범용 프라이머는 제1 범용 서열의 5' 말단에 위치한 추가 서열을 추가로 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 추가 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 출원에서, 범용 프라이머는 PCR 증폭에 사용되므로, 바람직하게는, 제1 범용 서열이 범용 프라이머의 3' 부분에 위치하거나 배열된다.
본 출원의 실시양태에 있어서, 상기 범용 프라이머는 PCR 반응을 수행할 수 있는 길이면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, 범용 프라이머는 5-50 nt, 예를 들어 5-15 nt, 15-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 또는 40-50 nt의 길이일 수 있다.
본 출원의 특정 실시양태에서, 범용 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 변형된 뉴클레오티드, 비천연 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함 또는 이로 이루어질 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 범용 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 천연 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 범용 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 예를 들어 5-메틸시토신 또는 5-히드록시메틸시토신을 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 범용 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 비-천연 뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시하이폭산틴, 이노신, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 5-니트로인돌 또는 잠금 핵산(LNA)를 포함한다. 본 출원의 특정 실시양태에서, 단계 (1)에서, 적어도 1 개의 표적-특이적 프라이머 쌍, 예를 들어, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 8 개, 적어도 10 개, 적어도 12 개, 적어도 15 개, 적어도 18 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50 개, 또는 그 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍이 제공된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 단계 (1)에서 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍이 제공된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 방법은 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 또는 그 이상의 표적 핵산을 동시에 증폭할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 방법은 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 이상의 표적 핵산을 동시에 비대칭적으로 증폭할 수 있다.
예를 들어, 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 샘플에서 2 개의 표적 핵산을 증폭하는 데 사용될 수 있으며, 상기 단계 (1)에서, 범용 프라이머, 제1 표적-특이적 프라이머 쌍 및 제2 표적-특이적 프라이머 쌍이 제공된다; 상기 범용 프라이머는 위에서 정의한 바와 같고, 제1 표적-특이적 프라이머 쌍은 제1 표적 핵산을 증폭할 수 있는 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하고, 제2 표적-특이적 프라이머 쌍은 제2 정방향 프라이머 및 제2 표적 핵산을 증폭할 수 있는 제2 역방향 프라이머를 포함하고; 상기 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머는 위에서 정의한 바와 같다. 유사하게, 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 샘플에서 3 개 이상의 표적 핵산들을 증폭하는 데 사용될 수 있으며, 상기 단계 (1)에서, 범용 프라이머, 및 3 개 이상의 표적 핵산들을 증폭할 수 있는 3 개 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍이 제공된다.
특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머에서 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 직접 연결된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머에서 정방향 염기 서열은 뉴클레오티드 링커에 의해 제2 범용 서열의 3' 말단에 연결된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 5'에서 3'으로의 정방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머는 제2 범용 서열, 뉴클레오티드 링커 및 5'에서 3'으로의 정방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 링커는 하나 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머는 제2 범용 서열의 5' 말단에 위치한 추가 서열을 추가로 포함한다. 따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머는 추가 서열, 제2 범용 서열 및 5'에서 3'으로의 정방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머는 추가 서열, 제2 범용 서열, 뉴클레오티드 링커 및 5'에서 3'으로의 정방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 추가 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 출원에서, 정방향 프라이머는 표적 핵산의 PCR 증폭에 사용되므로, 바람직하게는, 정방향 염기 서열이 정방향 프라이머의 3' 부분에 위치하거나 배열된다.
본 출원의 실시양태에 있어서, 정방향 염기 서열은, 표적 핵산 서열과 특이적으로 혼성화하여 표적 핵산을 증폭시킬 수 있는 한, 그 길이에 제한이 없다. 예를 들어, 정방향 염기 서열은 10-100 nt, 예를 들어 10-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90 nt, 또는 90-100 nt의 길이를 가질 수 있다.
본 출원의 실시양태에 있어서, 정방향 프라이머는 상기 정의된 조건을 만족하는 한 그 길이에 제한이 없다. 예를 들어, 정방향 프라이머는 15-150 nt, 예를 들어 15-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90 nt, 90-100 nt, 100-110 nt, 110-120 nt, 120-130 nt, 130-140 nt, 또는 140-150 nt의 길이를 가질 수 있다.
본 출원의 특정 실시양태에서, 정방향 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함 또는 이로 이루어질 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 천연 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 예를 들어 5-메틸시토신 또는 5-히드록시메틸시토신을 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정방향 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 데옥시히폭산틴, 이노신, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 5-니트로인돌, 또는 잠금 핵산(LNA)을 포함한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머에서, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 직접 연결된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머에서 역방향 염기 서열은 뉴클레오티드 링커에 의해 제1 범용 서열의 3' 말단에 연결된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 5'에서 3'으로의 역방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머는 제1 범용 서열, 뉴클레오티드 링커 및 5'에서 3'으로의 역방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 링커는 하나 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머는 제1 범용 서열의 5' 말단에 위치한 추가 서열을 추가로 포함한다. 따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머는 추가 서열, 제1 범용 서열 및 5'에서 3'으로의 역방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머는 추가 서열, 제1 범용 서열, 뉴클레오티드 링커 및 5'에서 3'으로의 역방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 추가 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 출원에서, 역방향 프라이머는 표적 핵산의 PCR 증폭에 사용되므로, 바람직하게는, 역방향 염기 서열이 역방향 프라이머의 3' 부분에 위치하거나 배열된다.
본 출원의 실시양태에 있어서, 역방향 염기 서열은, 표적 핵산 서열과 특이적으로 혼성화하여 표적 핵산을 증폭시킬 수 있는 한, 그 길이에 제한이 없다. 예를 들어, 역방향 염기 서열은 10-100 nt, 예를 들어 10-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90 nt, 또는 90-100 nt의 길이를 가질 수 있다.
본 출원의 실시양태에 있어서, 역방향 프라이머는 상기 정의된 조건을 만족하는 한 그 길이에 제한이 없다. 예를 들어, 역방향 프라이머는 15-150 nt, 예를 들어 15-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90 nt, 90-100 nt, 100-110 nt, 110-120 nt, 120-130 nt, 130-140 nt, 또는 140-150 nt의 길이를 가질 수 있다.
본 출원의 특정 실시양태에서, 역방향 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함 또는 이로 이루어질 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 천연 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 예를 들어 5-메틸시토신 또는 5-히드록시메틸시토신을 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 역방향 프라이머(또는 그의 임의의 성분)는 데옥시히폭산틴, 이노신, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 5-니트로인돌, 또는 잠금 핵산(LNA)을 포함한다.
본 출원의 실시양태에 있어서, 정방향 프라이머의 제2 범용 서열은 범용 프라이머의 제1 범용 서열과 상이하고, 그 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 것을 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이의 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드)가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 점에 있거나 이를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이의 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 점에 있거나 이를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이의 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 있는 마지막 뉴클레오티드가 결실 또는 치환된다는 점에 있거나 이를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이의 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 마지막 2 개의 뉴클레오티드가 결실 또는 치환된다는 점에 있거나 이를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이의 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에서 마지막 뉴클레오티드가 결실되고 끝에서 두 번째 뉴클레오시드가 치환된다는 점에 있거나 이를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이의 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 있는 마지막 뉴클레오티드가 치환되고 끝에서 두 번째 뉴클레오시드가 결실된다는 점에 있거나 이를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이의 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 마지막 3 개, 마지막 4 개 또는 마지막 5 개 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 점에 있거나 이를 포함한다. 본 출원에서, 치환은 변환 또는 전환일 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 치환은 변환이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 치환은 전환이다.
본 출원의 실시양태에서, 제1 범용 서열은 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적이지 않다. 특정 바람직한 실시양태에서, 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드는 정방향 프라이머의 상보적 서열에 상보적일 수 없다. 따라서, PCR 반응 중, 제1 범용 서열/범용 프라이머가 정방향 프라이머에 상보적인 핵산 가닥(핵산 가닥 A)에 어닐링할 수 있더라도, 핵산 가닥(핵산 가닥 A)의 상보성 가닥의 확장 합성은 여전히 억제된다.
본 발명의 방법에서, 샘플은 핵산을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 예를 들어, 특정 바람직한 실시양태에서, 샘플은 DNA(예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA)를 포함하거나 DNA이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 샘플은 RNA(예를 들어, mRNA)를 포함하거나 RNA이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 샘플은 핵산들의 혼합물(예를 들어, DNA의 혼합물, RNA의 혼합물, 또는 DNA와 RNA의 혼합물)을 포함하거나 핵산들의 혼합물이다.
본 발명의 방법에서 증폭하고자 하는 표적 핵산은 서열 조성이나 길이에 의해 한정되지 않는다. 예를 들어, 표적 핵산은 DNA(예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자(예를 들어, mRNA)일 수 있다. 또한, 증폭될 표적 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다.
샘플 또는 표적 핵산이 mRNA인 경우, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 수행하기 전에, 역전사 반응을 수행하여 mRNA에 상보적인 cDNA를 얻는다. 역전사 반응에 대한 자세한 설명은, 예를 들어, Joseph Sam-brook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)에서 찾을 수 있다.
본 발명의 방법에서, 샘플 또는 표적 핵산은, 원핵생물, 진핵생물(예를 들어, 원생동물, 기생충, 진균, 효모, 식물, 및 포유동물 및 인간을 포함하는 동물) 또는 바이러스(예를 들어, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, EB 바이러스, 간염 바이러스, 소아마비 바이러스 등) 또는 바이로이드를 포함하나 이에 한정되지 않는, 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 샘플 또는 표적 핵산은 또한, 게놈 핵산, 인공적으로 단리되거나 단편화된 핵산, 합성 핵산, 등과 같은, 임의의 형태의 핵산일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 임의의 핵산 중합효소(특히 주형-의존적 핵산 중합효소)를 사용하여 PCR 반응을 수행할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 핵산 중합효소는 DNA 중합효소이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 핵산 중합효소는 열안정성 DNA 중합효소이다. 열안정성 DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종, 예를 들어, 써무스 아쿠아티쿠스 [Thermus aquaticus (Taq)], 써무스 써모필루스[Thermus thermophiles (Tth)], 써무스 필리포미스(Thermus filiformis), 써무스 플레부스(Thermis flavus), 써모코커스 리터랠리스(Thermococcus literalis), 써무스 안트라닐다니(Thermus antranildanii), 써무스 칼도필러스(Thermus caldophllus), 써무스 실리아로필루스(Thermus chliarophilus), 써무스 플레부스(Thermus flavus), 써무스 이그니테레(Thermus igniterrae), 써무스 락테우스(Thermus lacteus), 써무스 오쉬마이(Thermus oshimai), 써무스 루베르(Thermus ruber), 써무스 루벤스(Thermus rubens), 써무스 스코토덕투스(Thermus scotoductus), 써무스 실바누스(Thermus silvanus), 써무스 써모필루스(Thermus thermophllus), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 써모토가 나폴리타나(Thermotoga neapolitana), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 써모코커스 바로씨(Thermococcus barossi), 써모코커스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 써모시포아프리카누스(Thermosiphoafricanus), 파이로코커스 우에세이(Pyrococcus woesei), 파이로코커스 호리코쉬(Pyrococcus horikoshii), 파이로코커스 아비씨(Pyrococcus abyssi), 파이로딕티움 오큘텀(Pyrodictium occultum), 아퀴펙스파이로필루스(Aquifexpyrophilus) 및 아퀴펙스 애오리우스(Aquifex aeolieus) 로부터 얻을 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 바람직하게는, DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
특정 바람직한 실시양태에서, 표적 핵산은 3-단계 과정으로 증폭된다. 이러한 실시양태에서, 핵산 증폭의 각 라운드는 3단계를 필요로 한다: 제1 온도에서의 핵산 변성, 제2 온도에서의 핵산 어닐링, 및 제3 온도에서의 핵산 확장. 특정 바람직한 실시양태에서, 표적 핵산은 2-단계 과정으로 증폭된다. 이러한 실시양태에서, 핵산 증폭의 각 라운드는 2단계를 필요로 한다: 제1 온도에서의 핵산 변성, 및 제2 온도에서의 핵산 어닐링 및 확장. 핵산 변성, 핵산 어닐링, 및 핵산 확장에 적합한 온도는 일상적인 방법들로 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. (예를 들어, Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) 참조).
특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 (1) 내지 (2)는 다음 단계 (a) 내지 (f)를 포함하는 프로토콜에 의해 수행될 수 있다:
(a) 하나 이상의 표적 핵산들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및, 범용 프라이머를 제공하고, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해, 표적-특이적 프라이머 쌍을 제공하는 단계; 상기 범용 프라이머 및 표적-특이적 프라이머 쌍은 제1항에 정의된 바와 같음;
(b) 샘플을 범용 프라이머 및 표적-특이적 프라이머 쌍, 및 핵산 중합효소와 혼합하는 단계 (예를 들어, 주형-의존적 핵산 중합효소; 예를 들어 DNA 중합효소, 특히 열안정성 DNA 중합효소);
(c) 이전 단계의 생성물을 핵산 변성을 허용하는 조건하에서 인큐베이션하는 단계;
(d) 이전 단계의 생성물을 핵산 어닐링 또는 혼성화를 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계;
(e) 이전 단계의 생성물을 핵산 확장을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계; 및
(f) 선택적으로, 단계 (c) 내지 (e)를 1 회 이상 반복하는 단계.
이러한 실시양태에서, 단계 (c)에서, 샘플의 모든 핵산 분자들은 단일-가닥 상태로 해리되고; 그런 다음, 단계 (d)에서, 상보적 핵산 분자들(예를 들어, 정방향 프라이머 및 표적 핵산 또는 역방향 프라이머의 확장 생성물, 역방향 프라이머 및 표적 핵산 또는 정방향 프라이머의 확장 생성물, 범용 프라이머 및 제1 범용 서열의 상보적 서열을 포함하는 증폭 생성물, 범용 프라이머 및 제2 범용 서열의 상보적 서열을 함유하는 증폭 생성물)은 함께 어닐링 또는 혼성화하여 이중체를 형성하고; 그런 다음, 단계 (e)에서, 핵산 중합효소(특히 주형-의존적 핵산 중합효소)는 상보적 서열에 혼성화하는 정방향/역방향 프라이머 및 범용 프라이머를 확장한다. 이 과정에서, 위에서 논의한 바와 같이, 핵산 중합효소는 핵산 가닥 B를 주형으로 사용할 수 있고, 일반적으로 범용 프라이머를 확장하고, 핵산 가닥 B의 상보적 가닥을 합성할 수 있다. 그러나, 범용 프라이머(특히 3' 말단)는 핵산 가닥 A에 완전히 상보적일 수 없기 때문에, 핵산 가닥 A를 주형으로 사용하는 핵산 중합효소에 의한 범용 프라이머의 확장은 억제된다(즉, 핵산 가닥 A의 상보적 가닥의 합성이 억제됨). 따라서, 단계 (c) 내지 (e)의 사이클을 통해, 표적 핵산 서열의 증폭(비대칭 증폭)을 달성할 수 있고, 이로써 본 발명의 방법의 단계 (1) 내지 (2)를 완성할 수 있다.
단계 (c)의 인큐베이션 시간 및 온도는 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에서, 단계 (b)의 생성물은 80-105 ℃ (예를 들어, 80-85 ℃, 85-90 ℃, 90-95 ℃, 91 ℃, 92 ℃, 93 ℃, 94 ℃, 95 ℃, 96 ℃, 97 ℃, 98 ℃, 99 ℃, 100 ℃, 101 ℃, 102 ℃, 103 ℃, 104 ℃ 또는 105 ℃)의 온도에서 인큐베이션됨으로써, 핵산 변성을 허용한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에서, 단계 (b)의 생성물은 10 초 내지 5 분, 예를 들어 10-20 초, 20-40 초, 40-60 초, 1-2 분 또는 2-5 분 동안 인큐베이션된다.
단계 (d)의 인큐베이션 시간 및 온도는 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 단계 (d)에서, 단계 (c)의 생성물은 35-70 ℃ (예를 들어, 35-40 ℃, 40-45 ℃, 45-50 ℃, 50-55 ℃, 55-60 ℃, 60-65 ℃ 또는 65-70 ℃)의 온도에서 인큐베이션됨으로써, 핵산 어닐링 또는 혼성화를 허용한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 단계 (d)에서, 단계 (c)의 생성물은 10 초 내지 5 분, 예를 들어 10-20 초, 20-40 초, 40-60 초, 1-2 분 또는 2-5 분 동안 인큐베이션된다.
단계 (e)의 인큐베이션 시간 및 온도는 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 단계 (e)에서, 단계 (d)의 생성물은 35-85 ℃ (예를 들어, 35-40 ℃, 40-45 ℃, 45-50 ℃, 50-55 ℃, 55-60 ℃, 60-65 ℃, 65-70 ℃, 70-75 ℃, 75-80 ℃, 80-85 ℃)의 온도에서 인큐베이션됨으로써, 핵산 확장을 허용한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 단계 (e)에서, 단계 (d)의 생성물은 10 초 내지 30 분, 예를 들어 10-20 초, 20-40 초, 40-60 초, 1-2 분, 2-5 분, 5-10 분, 10-20 분 또는 20-30 분 동안 인큐베이션된다.
특정 실시양태에서, 단계 (d) 및 (e)는 상이한 온도에서 수행될 수 있으며, 즉, 핵산 어닐링 및 확장은 상이한 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (d) 및 (e)는 동일한 온도에서 수행될 수 있으며, 즉, 핵산 어닐링 및 확장은 동일한 온도에서 수행된다. 이 경우, 단계 (d)와 (e)를 하나의 단계로 결합할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 단계 (c) 내지 (e)는 1 회 이상, 예를 들어 2 회 이상, 5 회 이상, 10 회 이상, 20 회 이상, 30 회 이상, 40 회 이상, 또는 50 회 이상 반복될 수 있다. 그러나, 단계 (c) 내지 (e)가 1 회 이상 반복되는 경우, 각 사이클의 단계 (c) 내지 (e)에서 사용된 조건이 동일할 필요는 없음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 하나의 조건을 사용하여 사이클의 이전 부분(예를 들어, 처음 5 개, 처음 10 개, 처음 20 개 사이클)의 단계 (c)에서 (e)를 수행한 다음, 다른 조건을 사용하여 나머지 주기의 단계 (c)에서 (e)를 수행할 수 있다.
본 발명의 방법은 표적 핵산의 다중, 비대칭 증폭을 가능하게 하여 다량의 단일-가닥 핵산 생성물을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 특정 상황에서 특히 유리하다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 증폭 생성물은 시퀀싱, 유전자 칩 검출, 또는 용융 곡선 분석에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 더 포함한다: (3) 단계 (2)에서 생성물을 시퀀싱하는 단계. 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 더 포함한다: (3) 단계 (2)에서 생성물을 검출하기 위해 유전자 칩을 사용하는 단계. 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 더 포함한다: (3) 단계 (2)에서 생성물에 대한 용융 곡선 분석을 수행하는 단계.
검출 방법
한 측면에서, 본 출원은, (i) 본 발명의 방법을 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산들을 증폭하는 단계; (ii) 단계 (i)의 생성물에 대해 용융 곡선 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 하나 이상의 표적 핵산들을 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 및, 범용 프라이머를 제공하고, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해, 표적-특이적 프라이머 쌍을 제공하는 단계; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열을 포함함;
표적-특이적 프라이머 쌍은 표적 핵산을 증폭할 수 있고 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 정방향 염기 서열을 포함하고, 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 역방향 염기 서열을 포함하고, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 및, 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에서, 제1 범용 서열은 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링할 수 있고, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이에 차이점이 있고, 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 것을 포함함; 및, 제1 범용 서열은 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적이지 않음;
검출 프로브는 표적 핵산에 특이적인 프로브 염기 서열을 포함하고, 리포터 그룹 및 소광제 그룹으로 표지되며, 상기 리포터 그룹은 신호를 방출할 수 있고 소광제 그룹은 리포터 그룹에 의해 방출된 신호를 흡수하거나 소광할 수 있음; 및 상보적 서열에 혼성화할 때 검출 프로브에 의해 방출되는 신호는 상보적 서열에 혼성화되지 않을 때 방출되는 신호와 상이함;
(2) 샘플 내 표적 핵산들을 범용 프라이머와 표적-특이적 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 통해 핵산 증폭이 가능한 조건에서 증폭하는 단계.
(3) 상기 검출 프로브를 이용하여 상기 (2) 단계의 생성물에 대한 용융 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 상기 용융 곡선 분석 결과에 따라 상기 샘플에 표적 핵산이 존재하는지 여부를 판단하는 단계;
본 발명의 특정 실시양태에서, 샘플, 표적 핵산, 범용 프라이머 및/또는 표적-특이적 프라이머 쌍은 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 단계 (2)에서, 샘플은 범용 프라이머 및 표적-특이적 프라이머 쌍, 및 핵산 중합효소와 혼합되어, PCR 반응을 수행한다. 이후, PCR 반응이 완료된 후, (2) 단계에서 생성물에 검출 프로브를 추가하고, 용융 곡선 분석을 수행한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 단계 (2)에서, 범용 프라이머 및 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브, 및 핵산 중합효소와 혼합되어, PCR 반응을 수행한다. 이후, PCR 반응이 완료된 후, 용융 곡선 분석을 수행한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 검출 프로브는 천연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA) 또는 잠금 핵산), 또는 이들의 임의의 조합을 포함 또는 이로 이루어질 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 천연 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 포함 또는 이로 이루어진다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 예를 들어 5-메틸시토신 또는 5-히드록시메틸시토신을 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 비-천연 뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시히폭산틴, 이노신, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 5-니트로인돌 또는 잠금 핵산(LNA)을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 검출 프로브는 그 길이에 의해 한정되지 않는다. 예를 들어, 검출 프로브는 15-1000 nt, 예를 들어 15-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90 nt, 90-100 nt, 100-200 nt, 200-300 nt, 300-400 nt, 400-500 nt, 500-600 nt, 600-700 nt, 700-800 nt, 800-900 nt, 900-1000 nt의 길이를 갖는다.
특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 3'-OH 말단을 갖는다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브의 3'-말단은 그의 확장을 억제하기 위해 차단된다. 핵산(예를 들어, 검출 프로브)의 3'-말단은 다양한 방법으로 차단될 수 있다. 예를 들어, 검출 프로브의 3'-말단은 검출 프로브의 마지막 뉴클레오티드의 3'-OH를 변형함으로써 차단될 수 있다. 특정 실시양태에서, 검출 프로브의 3'-말단은 검출 프로브의 마지막 뉴클레오티드의 3'-OH에 화학적 모이어티(예를 들어, 비오틴 또는 알킬기)를 추가함으로써 차단될 수 있다. 특정 실시양태에서, 검출 프로브의 3'-말단은 검출 프로브의 마지막 뉴클레오티드의 3'-OH를 제거하거나, 마지막 뉴클레오티드를 디데옥시뉴클레오티드로 대체함으로써 차단될 수 있다.
전술한 바와 같이, 검출 프로브는 리포터 그룹 및 소광제 그룹으로 표지되며, 상기 리포터 그룹은 신호를 방출할 수 있고, 소광제 그룹은 리포터 그룹에 의해 방출된 신호를 흡수하거나 소광할 수 있고; 상보적 서열에 혼성화할 때 검출 프로브에 의해 방출되는 신호는 상보적 서열에 혼성화되지 않을 때 방출되는 신호와 상이하다.
특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 자가-소광된 프로브이다. 이러한 실시양태에서, 검출 프로브가 다른 서열에 혼성화되지 않은 경우, 소광제 그룹은 리포터 그룹의 신호를 흡수하거나 소광할 수 있는 위치에 위치하므로(예를 들어, 소광제 그룹은 리포터 그룹에 인접하게 위치함), 리포터 그룹에서 방출되는 신호를 흡수하거나 소광시킨다. 이 경우, 검출 프로브는 신호를 방출하지 않는다. 또한, 검출 프로브가 이의 상보적인 서열에 혼성화될 때, 소광제 그룹은 리포터 그룹의 신호를 흡수하거나 소광할 수 없는 위치에 위치하므로(예를 들어, 소광제 그룹은 리포터 그룹에서 멀리 위치함), 리포터 그룹에서 방출되는 신호를 흡수하거나 소광시킬 수 없다. 이 경우, 검출 프로브는 신호를 방출한다.
이러한 자가-소광된 검출 프로브의 설계는 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 리포터 그룹은 검출 프로브의 5' 말단에 표지될 수 있고 소광제 그룹은 3' 말단에 표지될 수 있거나, 리포터 그룹은 검출 프로브의 3' 말단에 표지될 수 있고 소광제 그룹은 5' 말단에 표지될 수 있다. 따라서, 검출 프로브가 단독으로 존재하는 경우, 리포터 그룹과 소광제 그룹은 서로 근접하여 상호 작용하여, 리포터 그룹에서 방출되는 신호가 소광제 그룹에 흡수되어, 검출 프로브가 신호를 방출하지 않고; 검출 프로브가 이의 상보적인 서열과 혼성화할 때, 리포터 그룹과 소광제 그룹이 서로 떨어져 있어, 리포터 그룹에서 방출된 신호가 소광제 그룹에 의해 흡수될 수 없으므로, 검출 프로브가 신호를 방출한다.
그러나, 리포터 그룹과 소광제 그룹은 검출 프로브의 말단에 표지될 필요가 없음을 이해해야 한다. 리포터 그룹 및/또는 소광제 그룹은, 검출 프로브가 이의 상보적 서열에 혼성화될 때, 상보적인 서열에 혼성화되지 않을 때 방출되는 신호와 다른, 신호를 방출하는 한, 검출 프로브에서 내부적으로 표지될 수도 있다. 예를 들어, 검출 프로브의 업스트림(또는 다운스트림)에 리포터 그룹이 표시될 수 있고, 검출 프로브의 다운스트림(또는 업스트림)에 소광제 그룹이 표지될 수 있으며, 둘은 충분한 거리(예를 들어, 10-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 또는 더 긴 거리)를 두고 떨어져 있다. 따라서, 검출 프로브가 단독으로 존재하는 경우, 프로브 분자의 자유 코일링 또는 프로브의 2차 구조(예를 들어, 헤어핀 구조)의 형성으로 인해 리포터 그룹과 소광제 그룹이 서로 근접하고 상호작용하며, 리포터 그룹에서 방출된 신호가 소광제 그룹에 의해 흡수되어, 검출 프로브가 신호를 방출하지 않도록 하고; 검출 프로브가 이의 상보적 서열에 혼성화될 때, 리포터 그룹과 소광제 그룹이 충분한 거리만큼 서로 떨어져 있어 리포터 그룹에서 방출된 신호가 소광제 그룹에 의해 흡수될 수 없어, 검출 프로브가 신호를 방출한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹은 10-80 nt 이상의 거리, 예를 들어 10-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50 nt -60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt의 거리만큼 떨어져 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹은 80 nt 이하, 70 nt 이하, 60 nt 이하, 50 nt 이하, 40 nt 이하, 30 nt 이하, 또는 20 nt 이하의 거리만큼 떨어져 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹은 적어도 5 nt, 적어도 10 nt, 적어도 15 nt, 또는 적어도 20 nt의 거리만큼 떨어져 있다.
따라서, 검출 프로브가 이의 상보적인 서열에 혼성화될 때, 상보적 서열에 혼성화되지 않을 때 방출되는 신호와 다른, 신호를 방출하는 한, 리포터 그룹 및 소광제 그룹은 검출 프로브의 임의의 적절한 위치에 표지될 수 있다. 그러나, 특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹 중 적어도 하나는 검출 프로브의 말단(예를 들어, 5' 또는 3' 말단)에 위치한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹 중 하나는 검출 프로브의 5' 말단 또는 이로부터 1-10 nt의 위치에 위치하며, 리포터 그룹 및 소광제 그룹은 적절한 거리만큼 떨어져 있어서 검출 프로브가 이의 상보적인 서열에 혼성화되기 전에 소광제 그룹이 리포터 그룹에서 방출된 신호를 흡수하거나 소광할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹 중 하나는 검출 프로브의 3' 말단 또는 이로부터 1-10 nt의 위치에 위치하며, 리포터 그룹 및 소광제 그룹은 적절한 거리만큼 떨어져 있어서 검출 프로브가 이의 상보적인 서열에 혼성화되기 전에 소광제 그룹이 리포터 그룹에서 방출된 신호를 흡수하거나 소광할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹은 상기 정의된 바와 같은 거리(예를 들어, 10-80 nt 이상의 거리)만큼 떨어져 있을 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹 중 하나는 검출 프로브의 5' 말단에 위치하고 다른 하나는 3' 말단에 위치한다.
본 발명의 방법에서, 리포터 그룹 및 소광제 그룹은 당업계에 공지된 임의의 적합한 그룹 또는 분자일 수 있으며, 이들의 특정 예들은 Cy2™ (506), YO-PRO™-l (509), YOYO™-l (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-l (533), TOTOl (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), PyroninY (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582 ), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), T0T03 (660), DiD DilC (5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705), and Quasar 705 (610)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 괄호 안의 숫자는 최대 방출 파장을 나타내며 단위는 nm이다.
또한, 리포터 그룹 및 소광제 그룹의 다양한 적합한 쌍이 당업계에 공지되어 있다, 예를 들어, Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Oiganic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Peigamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, RP, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); U.S. Patents 3,996,345 and 4,351,760 참조.
특정 바람직한 실시양태에서, 리포터 그룹은 형광성 그룹이다. 이러한 실시양태에서, 리포터 그룹에 의해 방출된 신호는 형광이고, 소광제 그룹은 형광을 흡수/소광할 수 있는 분자 또는 그룹이다(예를 들어, 형광을 흡수할 수 있는 다른 형광 분자, 또는 형광을 소광할 수 있는 소광제). 특정 바람직한 실시양태에서, 형광단은, ALEX-350, FAM, VIC, TET, CAL Fluor® Gold 540, JOE, HEX, CAL Fluor Orange 560, TAMRA, CAL Fluor Red 590, ROX, CAL Fluor Red 610, TEXAS RED, CAL Fluor Red 635, Quasar 670, CY3, CY5, CY5.5, Quasar 705, 등과 같은 다양한 형광 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 바람직한 실시양태에서, 소광제 그룹은, DABCYL, BHQ (예를 들어, BHQ-1 or BHQ-2), ECLIPSE, 및/또는 TAMRA, 등과 같은 다양한 소광제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서, 검출 프로브는 또한, 예를 들어, 뉴클레아제 활성(예를 들어, 5' 뉴클레아제 활성, 예를 들어, 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성)에 대한 내성을 부여하도록, 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 활성에 내성이 있는 변형은 검출 프로브의 골격에 도입될 수 있으며, 그 예로는 포스포로티오에이트 에스테르 결합(phosphorothioate ester bond), 알킬포스포트리에스테르결합(alkyl phosphotriester bond), 아릴포스포트리에스테르결합(aryl phosphotriester bond), 알킬포스포네이트에스테르결합(alkyl phosphonate ester bond), 아릴포스포네이트에스테르결합(aryl phosphonate ester bond), 수소화포스페이트에스테르결합(hydrogenated phosphate ester bond), 알킬포스포르아미데이트에스테르결합(alkyl phosphoramidate ester bond), 아릴포스포르아미데이트에스테르결합(aryl phosphoramidate ester bond), 2'-O-아미노프로필 변형(2'-O-aminopropyl modification), 2'-O-알킬 변형(2'-O-alkyl modification), 2'-O-알릴 변형(2'-O-allyl modification), 2'-O-부틸 변형(2'-O-butyl modification), 및 1-(4'-티오-PD-리보푸라노실) 변형(1-(4'-thio-PD-ribofuranosyl) modification)을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 검출 프로브는 선형일 수 있거나, 또는 헤어핀 구조를 가질 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 선형이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 헤어핀 구조를 갖는다. 머리핀 구조는 자연적이거나 인공적으로 도입될 수 있다. 또한, 헤어핀 구조의 검출 프로브는 당업계의 통상적인 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 예를 들어, 검출 프로브는 검출 프로브의 두 말단(5' 및 3' 말단)에 2 개의 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 추가함으로써 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 2 개의 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열은 헤어핀 구조의 팔들(줄기들)을 구성한다. 헤어핀 구조의 팔들은 임의의 원하는 길이일 수 있으며, 예를 들어 팔들은 2-15 nt, 예를 들어 3-7 nt, 4-9 nt, 5-10 nt, 또는 6-12 nt의 길이를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 단계 (2)의 생성물은 점진적으로 가열될 수 있고 검출 프로브 상의 리포터 그룹에 의해 방출된 신호는, 단계 (2)에서 생성물의, 온도의 변화에 따라 변하는 신호 강도의 곡선을 얻기 위해, 실시간으로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 단계 (2)에서 생성물은 45 ℃ 이하의 온도(예를 들어, 45 ℃ 이하의 온도, 40 ℃ 이하의 온도, 35 ℃ 이하의 온도, 30 ℃ 이하의 온도, 또는 25 ℃ 이하의 온도)에서 75 ℃ 이상의 온도(75 ℃ 이상, 80 ℃ 이상, 85 ℃ 이상, 90 ℃ 이상, 또는 95 ℃ 이상)로 점진적으로 가열될 수 있고, 검출 프로브에서 리포터 그룹이 방출하는 신호를 실시간으로 모니터링하여, 온도 변화에 따라 변하는 리포터 그룹의 신호 강도 곡선을 얻는다. 가열 속도는 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 가열 속도는 다음과 같을 수 있다: 온도는 단계당 0.01-1 ℃씩(예를 들어, 0.01-0.05 ℃, 0.05-0.1 ℃, 0.1-0.5 ℃, 0.5-1 ℃, 또는 0.04-0.4 ℃, 예를 들어 0.01 ℃, 0.02 ℃, 0.03 ℃, 0.04 ℃, 0.05 ℃, 0.06 ℃, 0.07 ℃, 0.08 ℃, 0.09 ℃, 0.1 ℃, 0.2 ℃, 0.3 ℃, 0.4 ℃, 0.5 ℃, 0.6 ℃, 0.7 ℃, 0.8 ℃, 0.9 ℃ 또는 1.0 ℃씩) 상승하고, 각 단계는 0.5-15 초(예를 들어, 0.5-1 초, 1-2 초, 2-3 초, 3-4 초, 4-5 초, 5-10 초, 또는 10-15 초) 동안 유지됨; 또는 온도가 초당 0.01-1 ℃씩(예를 들어, 0.01-0.05 ℃, 0.05-0.1 ℃, 0.1-0.5 ℃, 0.5-1 ℃, 또는 0.04-0.4 ℃, 예를 들어 0.01 ℃, 0.02 ℃, 0.03 ℃, 0.04 ℃, 0.05 ℃, 0.06 ℃, 0.07 ℃, 0.08 ℃, 0.09 ℃, 0.1 ℃, 0.2 ℃, 0.3 ℃, 0.4 ℃, 0.5 ℃, 0.6 ℃, 0.7 ℃, 0.8 ℃, 0.9 ℃ 또는 1.0 ℃씩) 상승함.
특정 실시양태에서, 단계 (2)의 생성물은 점진적으로 냉각될 수 있고 검출 프로브 상의 리포터 그룹에 의해 방출된 신호는, 단계 (2)에서 생성물의, 온도의 변화에 따라 변하는 신호 강도의 곡선을 얻기 위해, 실시간으로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 단계 (2)에서 생성물은 75 ℃ 이상의 온도(75 ℃ 이상, 80 ℃ 이상, 85 ℃ 이상, 90 ℃ 이상, 또는 95 ℃ 이상)에서 45 ℃ 이하의 온도(예를 들어, 45 ℃ 이하의 온도, 40 ℃ 이하의 온도, 35 ℃ 이하의 온도, 30 ℃ 이하의 온도, 또는 25 ℃ 이하의 온도)로 점진적으로 냉각될 수 있고, 검출 프로브에서 리포터 그룹이 방출하는 신호를 실시간으로 모니터링하여, 온도 변화에 따라 변하는 리포터 그룹의 신호 강도 곡선을 얻는다. 냉각 속도는 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 냉각 속도는 다음과 같을 수 있다: 온도는 단계당 0.01-1 ℃씩(예를 들어, 0.01-0.05 ℃, 0.05-0.1 ℃, 0.1-0.5 ℃, 0.5-1 ℃, 또는 0.04-0.4 ℃, 예를 들어 0.01 ℃, 0.02 ℃, 0.03 ℃, 0.04 ℃, 0.05 ℃, 0.06 ℃, 0.07 ℃, 0.08 ℃, 0.09 ℃, 0.1 ℃, 0.2 ℃, 0.3 ℃, 0.4 ℃, 0.5 ℃, 0.6 ℃, 0.7 ℃, 0.8 ℃, 0.9 ℃ 또는 1.0 ℃씩) 하강하고, 각 단계는 0.5-15 초(예를 들어, 0.5-1 초, 1-2 초, 2-3 초, 3-4 초, 4-5 초, 5-10 초, 또는 10-15 초) 동안 유지됨; 또는 온도가 초당 0.01-1 ℃씩(예를 들어, 0.01-0.05 ℃, 0.05-0.1 ℃, 0.1-0.5 ℃, 0.5-1 ℃, 또는 0.04-0.4 ℃, 예를 들어 0.01 ℃, 0.02 ℃, 0.03 ℃, 0.04 ℃, 0.05 ℃, 0.06 ℃, 0.07 ℃, 0.08 ℃, 0.09 ℃, 0.1 ℃, 0.2 ℃, 0.3 ℃, 0.4 ℃, 0.5 ℃, 0.6 ℃, 0.7 ℃, 0.8 ℃, 0.9 ℃ 또는 1.0 ℃씩) 하강함.
이어서, 얻어진 곡선을 미분하여 단계 (2)에서 생성물에 대한 용융 곡선을 얻을 수 있다. 용융 곡선에서 용융 피크(녹는점)에 따라, 용융 피크(녹는점)에 해당하는 표적 핵산의 존재를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용된 검출 프로브는 각각 독립적으로 동일 또는 상이한 리포터 그룹들을 사용할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 사용된 검출 프로브는 동일한 리포터 그룹을 갖는다. 이 경우, 단계 (2)에서 생성물에 대한 용융 곡선 분석을 수행할 수 있으며, 상기 용융 곡선의 용융 피크(녹는점)에 따라 특정 표적 핵산의 존재 여부를 결정할 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 사용된 검출 프로브는 상이한 리포터 그룹을 갖는다. 이 경우, 단계 (2)의 생성물을 용융 곡선 분석하면, 각 리포터 그룹의 신호를 실시간으로 모니터링할 수 있어, 하나의 리포터 그룹의 신호에 해당하는 복수의 용융 곡선을 얻을 수 있다. 이어서, 특정 표적 핵산의 존재는 리포터 그룹의 신호 종류 및 용융 곡선의 용융 피크(녹는점)에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개 이상)의 표적 핵산 서열들의 동시 검출(다중 검출)을 달성할 수 있다.
이론적 한계에 얽매이지 않고, 동일한 하나의 리포터 그룹(동일한 용융 곡선)에 대해, 용융 곡선 분석의 분해능 또는 정밀도는 0.5 ℃ 이상에 도달할 수 있다. 즉, 용융 곡선 분석은 동일한 용융 곡선에서 단 0.5 ℃ 또는 그 이하(예를 들어, 0.1 ℃, 0.2 ℃, 0.3 ℃, 0.4 ℃, 0.5 ℃)의 용녹는점 차이로 두 개의 용융 피크를 구별할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 다양한 표적 핵산들 및 그의 검출 프로브들에 의해 형성된 다양한 이중체들 사이의 녹는점 차이는 동일한 리포터 그룹을 사용하여 적어도 0.5 ℃일 수 있으므로, 상이한 이중체들(따라서 상이한 표적 핵산들)은 용융 곡선 분석에 의해 구별되고 식별될 수 있다. 그러나 두 이중체의 녹는점 차이가 더 큰 경우에는 구별과 식별을 용이하게 하기 위해 경우에 따라 선호된다. 따라서, 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 녹는점 차이가 녹는점 곡선 분석에 의해 구별되고 식별될 수 있는 한, 2 개의 이중체 사이의 녹는점 차이는 임의의 원하는 값(예를 들어, 적어도 0.5 ℃, 적어도 1 ℃, 적어도 2 ℃, 적어도 3 ℃, 적어도 4 ℃, 적어도 5 ℃, 적어도 8 ℃, 적어도 10 ℃, 적어도 15 ℃, 또는 적어도 20 ℃) 일 수 있다.
특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 (1) 내지 (3)은 다음 단계 (a) 내지 (g)를 포함하는 프로토콜에 의해 수행될 수 있다:
(a) 하나 이상의 표적 핵산들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및 범용 프라이머를 제공하고, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해, 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브를 제공하는 단계; 상기 범용 프라이머, 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브는 상기 정의된 바와 같음;
(b) 샘플을 범용 프라이머, 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브, 및 핵산 중합효소(예를 들어, 주형-의존적 핵산 중합효소; 예를 들어 DNA 중합효소, 특히 열안정성 DNA 중합효소)와 혼합하는 단계;
(c) 이전 단계의 생성물을 핵산 변성을 허용하는 조건하에서 인큐베이션하는 단계;
(d) 이전 단계의 생성물을 핵산 어닐링 또는 혼성화를 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계;
(e) 이전 단계의 생성물을 핵산 확장을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계;
(f) 선택적으로, 단계 (c) 내지 (e)를 1 회 이상 반복하는 단계; 및
(g) 이전 단계의 생성물에 대해 용융 곡선 분석을 수행하는 단계.
(a) ~ (g) 단계에 대해서는 상기 자세히 설명되어 있다.
프라이머 세트 및 키트
한 측면에서, 본 발명은, 다음을 포함하는 프라이머 세트를 제공한다: 범용 프라이머, 및 하나 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열을 포함하고;
각각의 표적-특이적 프라이머 쌍은 표적 핵산을 증폭할 수 있고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 정방향 염기 서열을 포함하고, 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 역방향 염기 서열을 포함하고, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에서, 제1 범용 서열은 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링할 수 있고, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이에 차이점이 있고, 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 것을 포함함; 및, 제1 범용 서열은 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적이지 않다.
특정 바람직한 실시양태에서, 프라이머 세트는 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 또는 그 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍, 예를 들어, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 8 개, 적어도 10 개, 적어도 12 개, 적어도 15 개, 적어도 18 개, 적어도 20 개, 적어도 25 개, 적어도 30 개, 적어도 40 개, 적어도 50개, 또는 그 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍들을 포함한다.
이러한 프라이머 세트는 위에서 상세히 설명된 바와 같이 본 발명의 방법을 구현하기 위해 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서, 상기 범용 프라이머, 표적-특이적 프라이머 쌍, 표적 핵산 및 샘플에 대해 상술한 다양한 기술적 특징은 본 출원의 프라이머 세트를 포함하는 기술적 솔루션에도 적용될 수 있다. 따라서, 특정 바람직한 실시양태에서, 프라이머 세트는 상기 정의된 바와 같은 범용 프라이머 및/또는 표적-특이적 프라이머 쌍을 포함한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 프라이머 세트는 샘플에서 하나의 표적 핵산을 증폭하는 데 사용될 수 있으며, 이는 다음을 포함한다: 범용 프라이머, 및 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하는 제1 표적-특이적 프라이머 쌍; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열을 포함하고;
제1 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 정방향 염기 서열을 포함하고, 제1 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 위치하며; 핵산 혼성화 또는 어닐링 조건 하에서, 제1 범용 서열은 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링할 수 있고, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이에 차이점이 있고, 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 것을 포함하고;
제1 역방향 프라이머는 제1 범용 서열, 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 역방향 염기 서열을 포함하고, 제1 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치하고; 그리고,
제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머는 제1 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고; 그리고,
제1 범용 서열은 제1 정방향 프라이머의 상보적인 서열에 완전히 상보적이지 않다.
특정 바람직한 실시양태에서, 다음을 포함하는 프라이머 세트는 샘플에서 2 개의 표적 핵산을 증폭하는 데 사용될 수 있다: 범용 프라이머, 제1 표적-특이적 프라이머 쌍 및 제2 표적-특이적 프라이머 쌍; 상기, 범용 프라이머는 위에서 정의한 바와 같고, 제1 표적-특이적 프라이머 쌍은 제1 표적 핵산을 증폭할 수 있는 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하고, 제2 표적-특이적 프라이머 쌍은 제2 표적 핵산을 증폭할 수 있는 제2 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머를 포함한다; 상기 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머는 위에서 정의한 바와 같다. 유사하게, 특정 바람직한 실시양태에서, 다음을 포함하는 본 발명의 프라이머 세트는 샘플에서 3 개 이상의 표적 핵산들을 증폭하는 데 사용될 수 있다: 범용 프라이머, 및 3 개 이상의 표적 핵산들을 증폭할 수 있는 3 개 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍.
또한, 편의상, 본 발명의 프라이머 세트는 본 발명의 방법(증폭 방법 또는 검출 방법)을 수행하는데 필요한 하나 이상의 시약들과 조합하여 키트를 제조할 수 있다. 이러한 키트는 위에서 상세히 설명된 본 발명의 방법을 구현하는데 사용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 따라서, 다양한 구성 요소들에 대해 위에서 설명한 다양한 기술적 기능들은 키트의 다양한 구성 요소에 동일하게 적용된다. 더욱이, 이러한 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 다른 시약들을 함유할 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 출원은, 상기 기재된 프라이머 세트, 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는, 키트를 제공한다: 핵산 중합효소, 핵산 증폭용 시약, 시퀀싱용 시약, 유전자 칩 검출용 시약, 용융 곡선 분석용 시약, 또는 이들의 임의의 조합.
특정 바람직한 실시양태에서, 핵산 중합효소는, DNA 중합효소, 특히 열안정성 DNA 중합효소와 같은, 주형-의존적 핵산 중합효소이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 핵산 중합효소는 상기 정의된 바와 같다.
핵산 증폭을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 효소(예를 들어, 핵산 중합효소)의 작업 완충액, dNTP들(표지 또는 비표지된), 물, 이온(예를 들어, Mg2+)을 함유한 용액, 단일-가닥 DNA-결합 단백질(SSB), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
시퀀싱을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 효소(예를 들어, 핵산 중합효소)의 작업 완충액, dNTP들(표지 또는 비표지된), ddNTP들(표지 또는 비표지된), 물, 이온(예를 들어, Mg2+)을 함유한 용액, 단일-가닥 DNA-결합 단백질(SSB), 리가아제, 핵산 링커, 시퀀싱 프라이머, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유전자 칩 검출을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 효소(예를 들어, 핵산 중합효소)의 작업 완충액, dNTP들(표지 또는 비표지된), 물, 혼성화 완충액, 세척 완충액, 표지 시약, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
용융 곡선 분석을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 검출 프로브를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 자가-소광된 프로브, 예를 들어 자가-소광된 형광 프로브이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출 프로브는 상기 정의된 바와 같다.
본 출원에서 상세하게 설명된 원리에 기초하여, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 기술적 솔루션의 다양한 기술적 특징을 수정, 대체 또는 결합할 수 있다. 이러한 모든 기술적 솔루션 및 그 수정은 본 출원 또는 그 균등물의 범위 내에 포함된다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명의 기술적 해결책은 다음과 같은 유익한 효과들을 가진다:
(1) 기존의 HAND 시스템 및 기존의 HAND 시스템을 이용한 증폭 방법과 비교하여, 본 발명의 기술적 솔루션은 다중 표적 핵산의 동시 및 비대칭 증폭(다중, 비대칭 증폭)을 실현할 수 있다.
(2) 기존의 다중 및 비대칭 PCR 증폭 방법과 비교하여, 본 발명의 기술적 솔루션은 프라이머-이량체의 비-특이적 증폭을 효과적으로 억제할 수 있고, 증폭 특이성 및 검출 감도를 현저히 개선할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 효과적인 다중 PCR 증폭 및 비대칭 PCR 증폭을 동시에 달성할 수 있고, 다중 표적 핵산들의 증폭 및 검출을 동시에 수행하기 위한 임상적 요구사항들을 만족시킬 수 있는, 다중 표적 핵산들을 동시에 및 비대칭적으로 증폭할 수 있는 새로운 방법을 개발한다.
이하, 본 발명의 일 양태를 하기 도면 및 실시예를 참조하여 상세히 설명할 것이나, 당업자는 하기 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하기보다는 본 발명을 예시하기 위해 사용되었음을 이해할 것이다. 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 측면은 첨부된 도면 및 바람직한 일 양태에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명의 기본 원리를 설명하기 위해 본 발명의 방법의 예시적인 일 양태를 개략적으로 보여준다.
도 1A는 다음을 포함하는 일 양태에서 사용된 프라이머 세트를 개략적으로 보여준다: 범용 프라이머, 및 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하는 제1 표적-특이적 프라이머 쌍; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열 (Tag1)을 포함하고;
제1 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 (Tag2) 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 정방향 염기 서열을 포함하고, 제1 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3'말단에 위치하고;
제1 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 역방향 염기 서열을 포함하고, 제1 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3'말단에 위치하며; 그리고,
제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머는 제1 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고; 그리고,
제1 범용 서열은 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링 할 수 있고, 제2 범용 서열 및 제1 범용 서열 사이에는 차이점이 있으며, 이 차이점은 제1 범용 서열의 3'말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실되거나 치환된다는 것을 포함하고; 그리고, 제1 범용 서열은 제1 정방향 프라이머의 상보적인 서열에 완전히 상보적이지 않다.
도 1B는 도 1A의 프라이머 세트를 증폭에 사용하는 경우 프라이머-이량체의 비특이적 증폭이 억제되는 원리를 개략적으로 나타낸 것이고, 상기 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머의 비특이적 증폭으로 인해 형성된 프라이머-이량체는 변성 후 5'말단 및 3'말단이 상보적이며 서로 어닐링할 수 있는 단일-가닥 핵산을 생성하며, 단일-가닥 핵산은 어닐링 단계 동안 안정적인 팬핸들 구조를 형성하여 범용 프라이머가 단일-가닥 핵산을 어닐링 및 확장하는 것을 방지하여 프라이머-이량체의 추가 증폭을 억제한다.
도 1C는 도 1A의 프라이머 세트를 사용한 다중, 비대칭 증폭의 원리를 개략적으로 나타낸 것이다. 본 일 양태에서, 먼저, 저농도의 제1 표적-특이적 프라이머 쌍은 PCR 증폭을 개시하여 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머/범용 프라이머에 각각 상보적인 2 개의 핵산 가닥 (핵산 가닥 A 및 핵산 가닥 B)을 포함하는 초기 증폭 생성물을 생성하는데 사용되고; 그 후, 고농도의 범용 프라이머는 초기 증폭 생성물의 후속 PCR 증폭을 수행하는데 사용된다.
제1 역방향 프라이머와 범용 프라이머는 모두 제1 범용 서열을 포함하므로, 제1 역방향 프라이머에 상보적인 핵산 가닥 B는 범용 프라이머에도 상보적일 수 있다. 따라서, PCR 반응 동안, 범용 프라이머는 핵산 가닥 B에 어닐링할 수 있고 정상적으로 PCR 증폭을 시작할 수 있다 (즉, 일반적으로 핵산 가닥 B의 상보적 가닥을 합성).
동시에, 제1 범용 서열은 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에서 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링 할 수 있기 때문에, PCR 반응 동안, 범용 프라이머 (제1 범용 서열을 포함함)는 또한 제1 정방향 프라이머 (제2 범용 서열에 포함)에 상보적인 핵산 가닥 A에 어닐링할 수 있다. 하지만, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 (여기서 제1 범용 서열의 3'말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 결실 또는 치환됨)사이에는 차이가 있기 때문에, 범용 프라이머 (특히 3'말단)는 핵산 가닥 A에 완전히 상보적이지 않으며, 이는 범용 프라이머 (즉, 핵산 가닥 A의 상보적 가닥의 합성이 억제됨)에 의한 핵산 가닥 A의 PCR 증폭을 억제한다.
따라서, PCR 증폭이 진행됨에 따라, 핵산 가닥 B의 상보적 가닥 (핵산 가닥 B)의 합성 효율은 핵산 가닥 B의 상보적 가닥 (핵산 가닥 A)의 합성 효율보다 현저히 낮고, 그 결과, 핵산 가닥 B의 상보적 가닥 (핵산 가닥 A)이 대량으로 합성 및 증폭되나, 핵산 가닥 A의 상보적 가닥 (핵산 가닥 B)의 합성 및 증폭은 억제되고, 따라서 많은 양의 표적 단일-가닥 생성물 (핵산 가닥 A, 제1 정방향 프라이머/제2 범용 서열 및 제1 역방향 프라이머/범용 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 포함하는)에 의해 비대칭 증폭을 달성한다. 더 나아가, 상기 정의된 바와 같은 범용 프라이머는 또한 상기 정의된 바와 같은 적어도 2 개 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍과 조합하여 사용될 수 있으며, 상기 각각의 표적-특이적 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 하나의 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고, 상기 정방향 프라이머는 표적 핵산에 특이적인 제2 범용 서열 및 정방향 염기 서열을 포함하고, 역방향 프라이머는 표적 핵산에 특이적인 제1 범용 서열 및 역방향 염기 서열을 포함하며, 이로써 본 발명의 일 양태 (프라이머 세트)는 둘 이상의 표적 핵산의 다중 비대칭 증폭을 달성하는데 사용될 수 있다.도 1C에 보여주는 예시적인 일 양태에서, 상기 정의된 범용 프라이머는 2 개의 표적-특이적 프라이머 쌍과 조합하여 사용되며, 상기 제1 표적-특이적 프라이머 쌍은 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하고, 제1 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고, 제1 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 정방향 염기 서열을 포함하고, 제1 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 역방향 염기 서열을 포함하고; 제2 표적-특이적 프라이머 쌍은 제2 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머를 포함하고, 제2 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고, 제2 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 제2 표적 핵산에 특이적인 제2 정방향 염기 서열을 포함하고, 제2 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 제2 표적 핵산 서열에 특이적인 제2 역방향 염기 서열을 포함한다. 따라서, 프라이머 세트를 사용하여 제1 및 제2 표적 핵산의 동시 비대칭 증폭을 달성할 수 있다.
도 2는 실시예 1에서 HAND 시스템, 기존의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템을 사용한 실시간 PCR 증폭 결과를 보여준다; 상기, 검정 및 회색 점선은 HAND 시스템을 사용하여 인간 게놈 DNA 및 음성 대조군을 각각 증폭하는 증폭 곡선을 나타내고; 검정 및 회색 점선은 각각 인간 게놈 DNA 및 음성 대조군을 증폭하기 위해 기존의 비대칭 PCR 시스템을 사용한 증폭 곡선을 나타내며; 검정색 및 회색 실선은 각각 인간 게놈 DNA 및 음성 대조군을 증폭하기 위해 본 발명의 시스템을 사용하는 증폭 곡선을 나타낸다.
도 3은 HAND 시스템을 이용한 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 보여주며, 실시예 1의 종래의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템; 상기, 검정 점선 및 회색 점선은 HAND 시스템을 사용하여 인간 게놈 DNA를 증폭한 후 및 음성 대조군을 각각 사용한 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타내고; 검정 점선 및 회색 점선은 각각 기존의 비대칭 PCR 시스템을 사용하여 인간 게놈 DNA를 증폭한 후, 음성 대조군을 사용한 용융 곡선 분석 결과를 나타내며; 검정 실선 및 회색 실선은 각각 본 발명의 시스템을 이용하여 인간 게놈 DNA를 증폭시킨 후, 음성 대조군을 사용한 용융 곡선 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 HAND 시스템, 기존의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템을 사용하여 얻은 증폭 생성물의 아가로스 겔 전기영동 결과를 보여준다; 상기, 레인 M은 분자량 마커를 나타내고; 레인 1 내지 3은 각각 HAND 시스템 (레인 1), 본 발명의 시스템 (레인 2) 및 기존의 비대칭 PCR 시스템 (레인 3)을 사용하여 인간 게놈 DNA를 증폭한 생성물을 보여주고; 레인 4 내지 6은 각각 HAND 시스템, 본 발명의 시스템 및 기존의 비대칭 PCR 시스템을 사용하여 음성 대조군을 증폭한 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 2에서 서로 다른 정방향 프라이머를 이용한 증폭 후 용융곡선 분석 결과를 보여주며, 상기 회색 점선, 검정 실선, 검정 점선, 회색 실선 또는 검정 점선은 각각 rs2252992-F-A, rs2252992-F-C, rs2252992-F-G, rs2252992-F-T 또는 rs2252992-F-D을 사용하여 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 보여준다.
도 6은 실시예 3에서 본 발명의 시스템을 이용하여 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과를 보여주며, 상기, 검정 실선 (샘플 1), 검정 파선 (샘플 2), 회색 실선 (샘플 3), 회색 점선 (샘플 4)는 본 발명의 시스템을 이용하여 샘플 1 내지 4를 각각 증폭시킨 후의 용융 곡선 분석 결과를 보여준다.
도 7은 실시예 7에서 본 발명의 시스템을 이용하여 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과를 보여주며, 상기, 검정 실선 (샘플 5), 검정 파선 (샘플 6), 검정 점선 (샘플 7), 회색 실선 (샘플 8), 회색 파선 (샘플 9) 및 회색 점선 (샘플 10)은 본 발명의 시스템을 이용하여 샘플 5 내지 샘플 10을 각각 증폭시킨 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 5에서 본 발명의 시스템을 이용하여 증폭 후 용융곡선 분석 결과를 보여주며, 상기, 검은 점선 (black dotted line), 검은 파선 (black dashed line), 회색 점선 (gray dotted line), 회색 파선 (gray dashed line), 검정 실선 및 회색 실선은 각각 10 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 ng/μL, 0.05 ng/μL, 0.01 ng/μL, 또는 0.005 ng/μL의 DNA 농도로 샘플을 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과를 보여준다.
도 9는 실시예 5에서 기존의 다중 비대칭 PCR 시스템을 이용한 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 보여주며, 상기, 검정 점선 (black dotted line), 검정 파선, 회색 점선 (gray dotted line), 회색 파선, 검정 실선 및 회색 실선은 각각 지노믹 DNA 농도가 10 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 ng/μL, 0.05 ng/μL, 0.01 ng/μL, 또는 0.005 ng/μL인 샘플을 증폭한 후 용융 곡선 분석 결과를 보여준다.
도 1은 본 발명의 기본 원리를 설명하기 위해 본 발명의 방법의 예시적인 일 양태를 개략적으로 보여준다.
도 1A는 다음을 포함하는 일 양태에서 사용된 프라이머 세트를 개략적으로 보여준다: 범용 프라이머, 및 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하는 제1 표적-특이적 프라이머 쌍; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열 (Tag1)을 포함하고;
제1 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 (Tag2) 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 정방향 염기 서열을 포함하고, 제1 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3'말단에 위치하고;
제1 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 역방향 염기 서열을 포함하고, 제1 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3'말단에 위치하며; 그리고,
제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머는 제1 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고; 그리고,
제1 범용 서열은 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링 할 수 있고, 제2 범용 서열 및 제1 범용 서열 사이에는 차이점이 있으며, 이 차이점은 제1 범용 서열의 3'말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실되거나 치환된다는 것을 포함하고; 그리고, 제1 범용 서열은 제1 정방향 프라이머의 상보적인 서열에 완전히 상보적이지 않다.
도 1B는 도 1A의 프라이머 세트를 증폭에 사용하는 경우 프라이머-이량체의 비특이적 증폭이 억제되는 원리를 개략적으로 나타낸 것이고, 상기 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머의 비특이적 증폭으로 인해 형성된 프라이머-이량체는 변성 후 5'말단 및 3'말단이 상보적이며 서로 어닐링할 수 있는 단일-가닥 핵산을 생성하며, 단일-가닥 핵산은 어닐링 단계 동안 안정적인 팬핸들 구조를 형성하여 범용 프라이머가 단일-가닥 핵산을 어닐링 및 확장하는 것을 방지하여 프라이머-이량체의 추가 증폭을 억제한다.
도 1C는 도 1A의 프라이머 세트를 사용한 다중, 비대칭 증폭의 원리를 개략적으로 나타낸 것이다. 본 일 양태에서, 먼저, 저농도의 제1 표적-특이적 프라이머 쌍은 PCR 증폭을 개시하여 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머/범용 프라이머에 각각 상보적인 2 개의 핵산 가닥 (핵산 가닥 A 및 핵산 가닥 B)을 포함하는 초기 증폭 생성물을 생성하는데 사용되고; 그 후, 고농도의 범용 프라이머는 초기 증폭 생성물의 후속 PCR 증폭을 수행하는데 사용된다.
제1 역방향 프라이머와 범용 프라이머는 모두 제1 범용 서열을 포함하므로, 제1 역방향 프라이머에 상보적인 핵산 가닥 B는 범용 프라이머에도 상보적일 수 있다. 따라서, PCR 반응 동안, 범용 프라이머는 핵산 가닥 B에 어닐링할 수 있고 정상적으로 PCR 증폭을 시작할 수 있다 (즉, 일반적으로 핵산 가닥 B의 상보적 가닥을 합성).
동시에, 제1 범용 서열은 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에서 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링 할 수 있기 때문에, PCR 반응 동안, 범용 프라이머 (제1 범용 서열을 포함함)는 또한 제1 정방향 프라이머 (제2 범용 서열에 포함)에 상보적인 핵산 가닥 A에 어닐링할 수 있다. 하지만, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 (여기서 제1 범용 서열의 3'말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 결실 또는 치환됨)사이에는 차이가 있기 때문에, 범용 프라이머 (특히 3'말단)는 핵산 가닥 A에 완전히 상보적이지 않으며, 이는 범용 프라이머 (즉, 핵산 가닥 A의 상보적 가닥의 합성이 억제됨)에 의한 핵산 가닥 A의 PCR 증폭을 억제한다.
따라서, PCR 증폭이 진행됨에 따라, 핵산 가닥 B의 상보적 가닥 (핵산 가닥 B)의 합성 효율은 핵산 가닥 B의 상보적 가닥 (핵산 가닥 A)의 합성 효율보다 현저히 낮고, 그 결과, 핵산 가닥 B의 상보적 가닥 (핵산 가닥 A)이 대량으로 합성 및 증폭되나, 핵산 가닥 A의 상보적 가닥 (핵산 가닥 B)의 합성 및 증폭은 억제되고, 따라서 많은 양의 표적 단일-가닥 생성물 (핵산 가닥 A, 제1 정방향 프라이머/제2 범용 서열 및 제1 역방향 프라이머/범용 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 포함하는)에 의해 비대칭 증폭을 달성한다. 더 나아가, 상기 정의된 바와 같은 범용 프라이머는 또한 상기 정의된 바와 같은 적어도 2 개 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍과 조합하여 사용될 수 있으며, 상기 각각의 표적-특이적 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 하나의 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고, 상기 정방향 프라이머는 표적 핵산에 특이적인 제2 범용 서열 및 정방향 염기 서열을 포함하고, 역방향 프라이머는 표적 핵산에 특이적인 제1 범용 서열 및 역방향 염기 서열을 포함하며, 이로써 본 발명의 일 양태 (프라이머 세트)는 둘 이상의 표적 핵산의 다중 비대칭 증폭을 달성하는데 사용될 수 있다.도 1C에 보여주는 예시적인 일 양태에서, 상기 정의된 범용 프라이머는 2 개의 표적-특이적 프라이머 쌍과 조합하여 사용되며, 상기 제1 표적-특이적 프라이머 쌍은 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하고, 제1 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고, 제1 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 정방향 염기 서열을 포함하고, 제1 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 제1 표적 핵산에 특이적인 제1 역방향 염기 서열을 포함하고; 제2 표적-특이적 프라이머 쌍은 제2 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머를 포함하고, 제2 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있고, 제2 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 제2 표적 핵산에 특이적인 제2 정방향 염기 서열을 포함하고, 제2 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 제2 표적 핵산 서열에 특이적인 제2 역방향 염기 서열을 포함한다. 따라서, 프라이머 세트를 사용하여 제1 및 제2 표적 핵산의 동시 비대칭 증폭을 달성할 수 있다.
도 2는 실시예 1에서 HAND 시스템, 기존의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템을 사용한 실시간 PCR 증폭 결과를 보여준다; 상기, 검정 및 회색 점선은 HAND 시스템을 사용하여 인간 게놈 DNA 및 음성 대조군을 각각 증폭하는 증폭 곡선을 나타내고; 검정 및 회색 점선은 각각 인간 게놈 DNA 및 음성 대조군을 증폭하기 위해 기존의 비대칭 PCR 시스템을 사용한 증폭 곡선을 나타내며; 검정색 및 회색 실선은 각각 인간 게놈 DNA 및 음성 대조군을 증폭하기 위해 본 발명의 시스템을 사용하는 증폭 곡선을 나타낸다.
도 3은 HAND 시스템을 이용한 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 보여주며, 실시예 1의 종래의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템; 상기, 검정 점선 및 회색 점선은 HAND 시스템을 사용하여 인간 게놈 DNA를 증폭한 후 및 음성 대조군을 각각 사용한 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타내고; 검정 점선 및 회색 점선은 각각 기존의 비대칭 PCR 시스템을 사용하여 인간 게놈 DNA를 증폭한 후, 음성 대조군을 사용한 용융 곡선 분석 결과를 나타내며; 검정 실선 및 회색 실선은 각각 본 발명의 시스템을 이용하여 인간 게놈 DNA를 증폭시킨 후, 음성 대조군을 사용한 용융 곡선 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 HAND 시스템, 기존의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템을 사용하여 얻은 증폭 생성물의 아가로스 겔 전기영동 결과를 보여준다; 상기, 레인 M은 분자량 마커를 나타내고; 레인 1 내지 3은 각각 HAND 시스템 (레인 1), 본 발명의 시스템 (레인 2) 및 기존의 비대칭 PCR 시스템 (레인 3)을 사용하여 인간 게놈 DNA를 증폭한 생성물을 보여주고; 레인 4 내지 6은 각각 HAND 시스템, 본 발명의 시스템 및 기존의 비대칭 PCR 시스템을 사용하여 음성 대조군을 증폭한 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 2에서 서로 다른 정방향 프라이머를 이용한 증폭 후 용융곡선 분석 결과를 보여주며, 상기 회색 점선, 검정 실선, 검정 점선, 회색 실선 또는 검정 점선은 각각 rs2252992-F-A, rs2252992-F-C, rs2252992-F-G, rs2252992-F-T 또는 rs2252992-F-D을 사용하여 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 보여준다.
도 6은 실시예 3에서 본 발명의 시스템을 이용하여 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과를 보여주며, 상기, 검정 실선 (샘플 1), 검정 파선 (샘플 2), 회색 실선 (샘플 3), 회색 점선 (샘플 4)는 본 발명의 시스템을 이용하여 샘플 1 내지 4를 각각 증폭시킨 후의 용융 곡선 분석 결과를 보여준다.
도 7은 실시예 7에서 본 발명의 시스템을 이용하여 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과를 보여주며, 상기, 검정 실선 (샘플 5), 검정 파선 (샘플 6), 검정 점선 (샘플 7), 회색 실선 (샘플 8), 회색 파선 (샘플 9) 및 회색 점선 (샘플 10)은 본 발명의 시스템을 이용하여 샘플 5 내지 샘플 10을 각각 증폭시킨 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 5에서 본 발명의 시스템을 이용하여 증폭 후 용융곡선 분석 결과를 보여주며, 상기, 검은 점선 (black dotted line), 검은 파선 (black dashed line), 회색 점선 (gray dotted line), 회색 파선 (gray dashed line), 검정 실선 및 회색 실선은 각각 10 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 ng/μL, 0.05 ng/μL, 0.01 ng/μL, 또는 0.005 ng/μL의 DNA 농도로 샘플을 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과를 보여준다.
도 9는 실시예 5에서 기존의 다중 비대칭 PCR 시스템을 이용한 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 보여주며, 상기, 검정 점선 (black dotted line), 검정 파선, 회색 점선 (gray dotted line), 회색 파선, 검정 실선 및 회색 실선은 각각 지노믹 DNA 농도가 10 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 ng/μL, 0.05 ng/μL, 0.01 ng/μL, 또는 0.005 ng/μL인 샘플을 증폭한 후 용융 곡선 분석 결과를 보여준다.
본 발명은 이제 본 발명을 예시하기 위한 것이지만 제한하기 위한 것이 아닌 하기 실시예를 참조하여 설명될 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 원리 및 기술적 효과를 예시하기 위해 사용된 것일 뿐, 본 발명의 모든 가능성을 나타내는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 이들 실시예에서 언급된 물질, 반응 조건 또는 매개변수에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 원리에 따른 다른 유사한 물질 또는 반응 조건을 사용하여 다른 기술적 해결책을 구현할 수 있다. 이러한 기술적 해결방안은 본 발명에서 설명하는 기본 원리 및 개념을 벗어나지 않으며, 본 발명의 범위에 속한다.
실시예 1
본 실시예에 있어서, 증폭하고자 하는 표적 핵산으로 인간 21번 염색체 상의 유전자 다형성 부위 rs2252992를 덮는 DNA 단편을 사용하여, HAND 시스템, 기존의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템 (프라이머 세트)는 단일-가닥 핵산 생성물을 생성하기 위해 조사되었다. 본 실시예에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 표 1에 나타내었다. 본 실시예에 사용된 기기는 SLAN 96 실시간 형광 PCR 기기 (Xiamen Zeesan Biotech Co., Ltd., Xiamen)였다.
간단히 말해서, 이 예에서는 25 uL PCR 반응 시스템을 PCR 증폭 및 용융 곡선 분석에 사용하였다. PCR 반응 시스템은 다음으로 구성된다: 1×Taq PCR 버퍼 (TaKaRa, Beijing), 5.0 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1 U Taq DNA 폴리머라제 (TaKaRa, Beijing), 0.2 μM rs2252992-P probe, 5 μL of 인간 지노믹 DNA (rs2252992 유전자형은 A/A 동형접합체였다) 또는 음성 대조군 (물) 및 프라이머; 상기,
(1) HAND 시스템에 0.03 uM rs2252992-F1, 0.03 μM rs2252992-R, 0.3μM 태그 프라이머 (즉, 범용 프라이머)가 추가되었다;
(2) 기존의 비대칭 PCR 시스템에 0.03 μM rs2252992-F1 및 0.3μM rs2252992-R이 추가되었다.
(3) 본 발명의 방법에 기초한 PCR 시스템에 0.03 μM rs2252992-F2, 0.03 μM rs2252992-R, 0.3 μM Tag 프라이머가 추가되었다.
PCR 증폭 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 5 분 동안 사전 변성; 10 사이클 (95 ℃에서 15 초 동안 변성, 65 ℃ 내지 56 ℃에서 15 초 동안 어닐링(각 사이클에 대해 1 ℃ 강하), 76 ℃에서 20 초 동안 확장); 50 사이클 (95 ℃에서 15 초 변성, 55 ℃에서 15 초 어닐링, 76 ℃에서 20 초 확장); CY5 채널의 형광 신호는 어닐링 단계에서 수집되었다. PCR 증폭 후, 다음 프로그램에 따라 용융 곡선 분석을 수행하였다: 95 ℃에서 1분 동안 변성; 37 ℃에서 3 분 동안 인큐베이션; 그런 다음 0.04 ℃/s의 가열속도로 온도를 40 ℃에서 85 ℃로 상승시키고 CY5 채널의 형광 신호를 수집했다. 마지막으로 각 PCR 생성물을 2 % 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 실험 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.
| 명칭 | 서열 (5'→3') | 서열번호 |
| 프라이머 | ||
| rs2252992-F1 | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGACTCTCCTAAAGTCACTCAATCTTA | 1 |
| rs2252992-F2 | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGCCTCTCCTAAAGTCACTCAATCTTA | 2 |
| rs2252992-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGATGCCCTCACTACTTGGAACT | 3 |
| Tag primer | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGA | 4 |
| 형광 프로브 | ||
| rs2252992-P | CY5-TGGAGCTCACACTTCTTAGACGCAGTGCTCCA-BHQ2 | 5 |
도 2는 실시예 1에서 HAND 시스템, 기존의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템을 이용한 실시간 PCR 증폭 결과를 나타낸 것이다; 상기, 검정 및 회색 파선 (dashed line)은 HAND 시스템을 사용하여 인간 게놈 DNA를 증폭하고 음성 대조군을 각각 사용한 증폭 곡선을 나타내며; 검정 및 회색 점선 (dotted line)은 각각 인간 게놈 DNA 및 음성 대조군을 증폭하기 위해 기존의 비대칭 PCR 시스템을 사용하는 증폭 곡선을 나타내며; 검정 및 회색 실선 (solid line)은 각각 인간 게놈 DNA 및 음성 대조군을 증폭하기 위해 본 발명의 시스템을 사용하는 증폭 곡선을 나타낸다. 결과는 세 가지 시스템 모두가 인간 게놈 DNA를 효과적이고 구체적으로 증폭할 수 있고 상응하는 증폭 신호 (검정 파선, 검은 점선 및 검정 실선); 및 각 시스템의 음성 대조군에는 증폭 신호가 없었다 (회색 점선, 회색 점선 및 회색 실선). 또한, 기존의 비대칭 PCR 시스템의 증폭 곡선 (검정 점선)이 가장 작은 Ct값을 가지는 것을 알 수 있는데, 이는 표적-특이적 프라이머의 고농도에 의한 표적 핵산의 직접 증폭에 기인한다.
도 3은 실시예 1에서 HAND 시스템, 기존의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명 시스템을 이용한 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 나타낸 것이다; 상기 검정 및 회색 파선은 HAND 시스템을 이용하여 인간 게놈 DNA를 증폭시킨 후 음성 대조군을 각각 사용한 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타내고; 검정 및 회색 점선 (dotted line)은 각각 기존의 비대칭 PCR 시스템을 이용하여 인간 게놈 DNA를 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과와 음성 대조군을 나타내며; 검정 및 회색 실선은 각각 본 발명의 시스템을 이용하여 인간 게놈 DNA를 증폭시킨 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타내고, 음성 대조군을 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 HAND 시스템, 기존의 비대칭 PCR 시스템 및 본 발명의 시스템을 이용하여 얻은 증폭 생성물의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이며; 상기, 레인 M은 분자량 마커를 나타내고; 레인 1 내지 3은 HAND 시스템 (레인1)을 이용하여 인간 게놈 DNA를 증폭한 생성물을 나타내고, 본 발명의 시스템 (레인2) 및 기존의 비대칭 PCR 시스템 (레인3); 레인 4 내지 6은 각각 HAND 시스템, 본 발명의 시스템 및 기존의 비대칭 PCR 시스템을 사용하여 음성 대조군을 증폭한 생성물을 나타낸다.
도 3 내지 도 4의 결과는 HAND 시스템이 증폭에 사용할 때, 증폭 생성물이 기본적으로 이중-가닥 핵산이었고 단일-가닥 핵산 생성물을 생산할 수 없었다 (도 4, 레인 1); 따라서, 용융 곡선 분석 과정에서 프로브는 증폭 생성물에 효과적으로 혼성화 할 수 없으며 효과적인 용융 피크를 생성할 수 없으며 (도 3, 검정 파선); 따라서, 증폭을 위해 HAND 시스템을 사용하는 경우 증폭 생성물에 대한 효율적인 프로브 용융 곡선 분석을 수행할 수 없었다. 하지만, 본 발명의 시스템 및 기존의 비대칭 PCR 시스템을 증폭에 사용하는 경우, 단일-가닥 핵산 생성물이 다량으로 생성되었으며 (도 4, 레인 2 및 3); 따라서, 용융 곡선 분석 과정에서 프로브는 증폭 생성물에 효율적으로 혼성화하고 특정 용융 피크를 생성할 수 있다 (도 3, 검정 실선 및 검정 점선). 또한, 도 3 내지 4의 결과는 또한 물을 주형으로 사용하는 음성 대조군 시스템 중 어느 것도 효과적인 용융 피크를 생성할 수 없음을 보여주었으며 (도 3, 회색 파선, 회색 점선 및 회색 실선), 이는 PCR 과정에서 원하는 증폭 생성물이 생성되지 않았기 때문이다 (도 4, 레인 4 내지 6).
이 실시예의 결과는 본 발명의 시스템이 표적 핵산의 비대칭 증폭을 획득하는데 사용될 수 있고, 따라서 프로브 용융 곡선 분석과 함께 사용될 수 있음을 입증하였다.
실시예 2
본 실시예에 있어서, 인간 염색체 21번의 유전자 다형성 부위 rs2252992의 DNA 단편을 증폭하고자 하는 표적 핵산으로 사용하였고, 비대칭 증폭에 대한 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 간의 차이 (즉, 제1 범용 서열에 대한 제2 범용 서열의 다른 변이체 유형)의 효과를 조사하였다. 본 실시예에서 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 표 2와 같으며, 사용된 범용 프라이머 (Tag primer)의 3'말단의 염기는 A; 및 5가지 종류의 정방향 프라이머가 설계되었다: rs2252992-F-C의 제2 범용 서열의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드는 C이고, rs2252992-F-G의 제2 범용 서열의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드는 G이고, rs2252992-F-T의 제2 범용 서열의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드는 T이고, rs2252992-F-A의 제2 범용 서열의 3' 말단에 있는 뉴클레오티드는 A이고, rs2252992-F-D의 제2 범용 서열의 3' 말단에서 두 번째 뉴클레오티드 G가 삭제되었다. rs2252992-F-C, rs2252992-F-G, rs2252992-F-T 및 rs2252992-F-D는 본 발명의 시스템에서 각각 사용되었으며, 그들의 상보적인 서열은 증폭 동안 범용 프라이머와 각각 불일치 A-G, A-C, A-A 및 GA-TA를 형성했다. HAND 시스템에서는 대조군 프라이머 rs2252992-F-A를 사용하였으며 증폭 과정에서 이의 상보적 염기 서열이 범용 프라이머와 완벽하게 일치하였다. 본 실시예에서 사용된 기기는 SLAN 96 실시간 형광 PCR 기기였다.
간단히 말해서, 본 실시예에서는, 25 uL PCR 반응 시스템을 PCR 증폭 및 용융 곡선 분석에 사용하였다. PCR 반응 시스템은 다음으로 구성된다: 1×Taq PCR 완충액, 5.0 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 0.4 μM rs2252992-P 프로브, 0.04 μM rs2252992-R 프라이머, 1.6 μM Tag 프라이머, 5 μL의 인간 게놈형 T9 (9 wasrs /C 이형접합) 또는 음성 대조군(물) 및 0.04 μM 지정된 정방향 프라이머(즉, rs2252992-F-A, 또는 rs2252992-F-C, 또는 rs2252992-F-G, 또는 rs2252992-F-T, 또는 9rs2-F-D 프라이머).
PCR 증폭 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 5 분 동안 사전 변성; 10 사이클 (95 ℃에서 15 초 동안 변성, 65 ℃ 내지 56 ℃에서 15 초 동안 어닐링 (각 사이클에 대해 1 ℃ 강하) 76 ℃에서 20 초 동안 확장); 50 사이클 (95 ℃에서 15 초 변성, 55 ℃에서 15 초 어닐링, 76 ℃에서 20 초 확장. PCR 증폭이 완료된 후 용융 곡선 분석을 수행하였으며 프로그램은 95 ℃에서 1분 동안 변성 (denaturation)하고; 37 ℃에서 3 분 동안 인큐베이션; 그 다음 50 ℃에서 85 ℃로 승온된 온도에서 0.04 ℃/s의 가열 속도로 용융 곡선 분석을 수행하고 CY5 채널의 형광 신호를 수집하였다. 용융곡선 해석 결과를 도 5에 나타내었다.
| 명칭 | 서열 (5'→3') | 서열번호 |
| 프라이머 | ||
| rs2252992-F-A | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGATCTGTTGTCCAATCTGGCA | 6 |
| rs2252992-F-C | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGCTCTGTTGTCCAATCTGGCA | 7 |
| rs2252992-F-G | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGGTCTGTTGTCCAATCTGGCA | 8 |
| rs2252992-F-T | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTTCTGTTGTCCAATCTGGCA | 9 |
| rs2252992-F-D | GTCGCAAGCACTCACGTAGAATCTGTTGTCCAATCTGGCA | 10 |
| rs2252992-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAGGTCTAAAGCCACAAGGACTTA | 11 |
| Tag primer | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGA | 4 |
| 형광 프로브 | ||
| rs2252992-P | CY5-TGGAGCTCACACTTCTTAGACGCAGTGCTCCA-BHQ2 | 5 |
도 5는 실시예 2에서 서로 다른 정방향 프라이머를 이용한 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 보여주는 것이며, 상기, 회색 파선, 검정 실선, 검정 파선, 회색 실선 실선 또는 검정 점선은 각각 rs2252992-F-A, rs2252992-F-C, rs2252992-F-G, rs2252992-F-T 또는 rs2252992-F-D를 사용하여 증폭한 후 용융 곡선 분석 결과를 나타낸다.
도 5의 실험 결과는 rs2252992-F-A 프라이머 (범용 프라이머와 완전히 일치하는 상보적 서열)를 증폭에 사용할 때 전체 반응 시스템이 HAND 시스템과 동등함을 보여주고, 증폭 생성물은 단일-가닥 핵산 생성물을 포함하지 않았다; 따라서 용융 곡선 (회색 파선)에서 목표 용융 피크가 관찰되지 않았으며; 반면 rs2252992-F-C (검정색 실선), rs2252992-F-G (검정색 파선), rs2252992-F-T (회색 실선) 또는 rs2252992-F-D (검정색 점선) 프라이머를 증폭에 사용한 경우, 범용 프라이머는 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적일 수 없기 때문에 (A-G, A-C, A-A 또는 GA-TA 불일치가 범용 프라이머의 3'말단에서 형성됨), 두 핵산 가닥의 증폭 효율이 다르고 비대칭 증폭이 형성되어 단일-가닥 핵산 생성물이 생성되고; 상응하게, 표적 용융 피크는 증폭 생성물의 용융 곡선에서 관찰되었다. 이 실험 결과는 다양한 불일치/대체를 본 발명의 시스템에 적용할 수 있음을 보여준다. 또한 서로 다른 불일치 유형이 증폭 효율의 차이에 기여할 수 있다는 점에 주목할 가치가 있다 (녹는점 피크 높이의 차이에 의해 반영됨). 따라서, 비대칭 증폭을 위해 본 발명의 시스템을 사용할 때, 실제 필요에 따라 정방향 프라이머/제2 범용 서열에서 적절한 미스매치 유형을 선택할 수 있다.
실시예 3
본 실시예에 있어서, 유전자 다형성 부위 rs2252992 및 rs4816597의 타이핑은 본 발명의 시스템이 단일 반응 튜브에서 이중 및 비대칭 증폭을 실현할 수 있고 프로브 용융 곡선 분석에 사용될 수 있음을 예시하기 위해 예로 취하였다. 본 실시예에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 표 3에 나타내었다. 본 실시예에 사용된 기기는 SLAN96 실시간 형광 PCR 기기였다.
간단히 말해서, 이 예에서 25 uL PCR 반응 시스템은 PCR 증폭 및 용융 곡선 분석에 사용되었으며 PCR 반응 시스템은 다음으로 구성되었다: 1× Taq PCR 완충액, 5.0 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 0.05 μM rs4816597-F, 0.05 μM, rs4816597-R, 0.4 μM rs4816597-P, 9rs2-0452-P, 9rs2 0.4 μM rs2252992-P, 1.6 μM 태그 프라이머, 5 μL의 인간 게놈 DNA 또는 음성 대조군(물). 본 실시예에서는, 4개의 샘플이 검출되었으며 (심플 1, 2, 3 및 4; 각 PCR 반응 시스템은 샘플 중 하나를 검출하는데 사용됨), 상기 샘플 1의 rs2252992 및 rs4816597 부위의 유전자형은 T/C, C/C로 시퀀싱되었으며, 샘플 2의 rs2252992 및 rs4816597 부위의 유전자형은 T/C, T/C, 샘플 3의 rs2252992 및 rs4816597 부위의 유전자형은 T/T, C/C로 시퀀싱되었고, 샘플 4의 rs2252992 및 rs4816597 부위의 유전자형은 C/C, C/C로 시퀀싱되었다.
PCR 증폭 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 5 분 동안 사전 변성; 10사이클 (95 ℃에서 15 초 변성, 65 ℃ 내지 56 ℃에서 15 초 동안 어닐링 (각 주기에 대해 1 ℃ 강하), 76 ℃에서 20 초 동안 확장); 50 사이클 (90 ℃에서 15 초 변성, 55 ℃에서 15 초 어닐링, 76 ℃에서 20 초 확장); 그런 다음 용융 곡선 분석이 수행되었으며 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 1분간 변성, 37 ℃에서 3 분간 인큐베이션; 그런 다음 40 ℃에서 85 ℃로 승온된 온도에서 0.04 ℃/s의 가열 속도로 용융 곡선 분석을 수행하고 CY5 채널의 형광 신호를 수집하였다. 용융곡선 해석 결과를 도 6에 나타내었다.
| 명칭 | 서열 (5'→3') | 서열번호 |
| 프라이머 | ||
| rs2252992-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTCTGTTGTCCAATCTGGCA | 12 |
| rs2252992-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAGGTCTAAAGCCACAAGGACTTA | 11 |
| rs4816597-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGGAATCAGGAAGCTTTCTATGAACA | 13 |
| rs4816597-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGATATAGAACGTGCACACTACCA | 14 |
| Tag primer | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGA | 4 |
| 형광 프로브 | ||
| rs2252992-P | CY5-TGGAGCTCACACTTCTTAGACGCAGTGCTCCA-BHQ2 | 5 |
| rs4816597-P | CY5-CGAAAGTCTCCAACGTATAGCATTTCG-BHQ2 | 15 |
도 6은 실시예 3에서 본 발명의 시스템을 이용하여 증폭 후 용융곡선 분석 결과를 나타낸 것이며, 상기, 검정 실선 (샘플 1), 검정 파선 (샘플 2), 회색 실선 (샘플 3), 회색 파선 (샘플 4)은 각각 샘플 1 내지 4를 증폭하기 위해 본 발명의 시스템을 사용한 후의 용융 곡선 분석의 결과를 나타내었다.
도 6의 결과는 샘플 1 (검정 실선)의 유전자 다형성 부위인 rs2252992 및 rs4816597의 유전자형이 각각 T/C 및 C/C였으며; 샘플 2 (검정 파선)의 유전자 다형성 부위 rs2252992 및 rs4816597의 유전자형은 각각 T/C 및 T/C이고; 샘플 3 (회색 실선)의 유전자 다형성 부위 rs2252992 및 rs4816597의 유전자형은 각각 T/T 및 C/C이고; 샘플 4 (회색 점선)의 유전자 다형성 부위 rs2252992 및 rs4816597의 유전자형은 각각 C/C 및 C/C이고; 음성 대조군 (회색 실선)에는 용융 피크가 없으며; 각 샘플의 유전자형 결과는 시퀀싱으로 얻은 결과와 일치하였다. 이러한 결과는 본 발명의 시스템이 단일 반응 시스템에서 두 개의 표적 핵산을 동시에 비대칭적으로 증폭할 수 있음을 보여주었으며, 그리고 각각 효과적이고 신뢰할 수 있는 용융 곡선 분석을 위해 충분한 단일-가닥 핵산 생성물을 생성하여 2 개의 표적 핵산의 식별을 실현한다 (예를 들어, 2 개의 유전자 다형성 부위의 유전자형). 따라서, 용융 곡선 분석 기술과 결합하여, 본 발명의 시스템은 2 개의 표적 핵산의 검출 및 식별 (예를 들어, 유전자형)을 동시에 실현할 수 있다.
실시예 4
본 실시예에 있어서, 8개의 유전자 다형성 부위의 타이핑 (즉, rs979393, rs34521064, rs2835906, rs7275547, rs418298, rs60871880, rs4816597 및 rs2252992)은 본 발명의 시스템이 단일 반응 튜브에서 8-플렉스 (eight-plex), 비대칭 증폭을 실현할 수 있고 프로브 용융 곡선 분석에 사용될 수 있음을 입증하기 위한 예로 취하였다. 본 실시예에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 표 4에 나타내었다. 본 실시예에 사용된 기기는 SLAN 96 실시간 형광 PCR 기기였다.
간단히 말해서, 본 실시예에서, 25 μL PCR 반응 시스템은 PCR 증폭 및 용융 곡선 분석에 사용되었으며 PCR 반응 시스템은 다음으로 구성되었다: 1×Taq PCR 완충액, 5.0 mM MgCl2, 0.24 mM dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 5 μL의 인간 게놈 DNA, 프라이머 및 프로브. 사용된 프라이머 및 프로브의 농도는 표 4에 기재하였다. 본 실시예에 있어서, 총 6개의 샘플이 검출되었다 (샘플 5 내지 10, 각 PCR 반응 시스템은 샘플 중 하나를 검출하였다).
PCR 증폭 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 5 분간 사전 변성; 4 사이클 (95 ℃에서 15 초 변성, 52 ℃에서 15 초 어닐링, 76 ℃에서 20 초 확장); 55 사이클 (95 ℃에서 15 초 동안 변성, 58 ℃에서 15 분 동안 어닐링, 76 ℃에서 20 초 확장); 및 FAM, HEX, ROX 및 CY5 채널의 형광 신호는 어닐링 단계에서 수집되었다. 그런 다음, 용융 곡선 분석을 수행했으며 프로그램은 95 ℃에서 1분간 변성, 37 ℃에서 3 분간 인큐베이션; 그런 다음, 0.04 ℃/s의 가열 속도로 온도를 40 ℃에서 85 ℃로 상승시키고 FAM, HEX, ROX 및 CY5 채널의 형광 신호를 수집하였다. 실험 결과를 도 7에 나타내었다.
| 명칭 | 서열 (5'→3') | 워킹농도(μM) | 서열번호 |
| 프라이머 | |||
| rs979393-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTGGCACTATCCCTTTCAAACA | 0.04 | 16 |
| rs979393-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGACAGCTTTAAGTGAATTTATTGGCA | 0.04 | 17 |
| rs34521064-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTATTTGCTATATCTAGTGACCTGAATC | 0.04 | 18 |
| rs34521064-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGATCGGGGAGCACAGATGA | 0.04 | 19 |
| rs2835906-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTGTTTTTGTGTAAGTCTGATAGGTT | 0.06 | 20 |
| rs2835906-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGATGAGTCCCCGTTAAGCCT | 0.06 | 21 |
| rs7275547-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGCCAGGACATGCCTCAGT | 0.04 | 22 |
| rs7275547-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAGAGGAGGTACAGACATTTGGA | 0.04 | 23 |
| rs418298-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGGAAATTTCAGAATTGTTATGGACCAG | 0.02 | 24 |
| rs418298-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGACAGAGGCAGGTCGTCT | 0.02 | 25 |
| rs60871880-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGCAGGCCCAAATCCATTCTC | 0.04 | 26 |
| rs60871880-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGATCAAGAGGCACAGCCA | 0.04 | 27 |
| rs4816597-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGGAATCAGGAAGCTTTCTATGAACA | 0.04 | 13 |
| rs4816597-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAATATAGAACGTGCACACTACCA | 0.04 | 14 |
| rs2252992-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTCTGTTGTCCAATCTGGCA | 0.05 | 12 |
| rs2252992-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAGGTCTAAAGCCACAAGGACTTA | 0.05 | 11 |
| Tag primer | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGA | 1.60 | 4 |
| Fluorescent probe | |||
| rs979393-P | FAM-CGTCAACTTGAGAGGTTTTTAATATGACG-BHQ1 | 0.40 | 28 |
| rs34521064-P | FAM-TGGGCACGTTTCACAGGGCTGGACACC-BHQ1 | 0.40 | 29 |
| rs2835906-P | HEX-ACATCAAAAGAAGCGTAAAATGATG-BHQ1 | 0.40 | 30 |
| rs7275547-P | HEX-TTGCCTCTGAGTGAATGCCTCTTCGTCACCT-BHQ1 | 0.40 | 31 |
| rs418298-P | ROX-ATGCTCTATGTGTTCAATTTGTTCCGAGCA-BHQ2 | 0.40 | 32 |
| rs60871880-P | ROX-TGTGCTGAAGCTAAGAGCAAAGGGGGCCAGCAC-BHQ2 | 0.40 | 33 |
| rs4816597-P | CY5-CGAAAGTCTCCAACGTATAGCATTTCG-BHQ2 | 0.40 | 15 |
| rs2252992-P | CY5-TGGAGCTCACACTTCTTAGACGCAGTGCTCCA-BHQ2 | 0.40 | 5 |
도 7은 실시예 4에서 본 발명의 시스템을 이용한 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 나타낸 것이며, 상기, 검정 실선 (샘플 5), 검정 파선 (샘플 6), 검정 점선 (샘플 7), 회색 실선 (샘플 8), 회색 파선 (샘플 9) 및 회색 점선 (샘플 10)은 본 발명의 시스템을 사용하여 샘플 5 내지 샘플 10을 각각 증폭시킨 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타낸다.
| 샘플 5 (검정 실선) |
샘플 6 (검정 파선) |
샘플 7 (검정 점선) |
샘플 8 (회색 실선) |
샘플 9 (회색 파선) |
샘플 10 (회색 점선) |
|
| rs979393 | T/G | T/G | G/G | T/G | T/G | G/G |
| rs34521064 | T/T | C/C | T/C | T/C | C/C | T/T |
| rs2835906 | T/T | T/C | T/C | T/C | T/C | T/C |
| rs7275547 | G/C | C/C | G/C | G/C | C/C | G/C |
| rs418298 | A/G | A/A | G/G | A/G | A/A | G/G |
| rs60871880 | T/C | T/C | C/C | C/C | T/C | T/C |
| rs4816597 | C/C | T/C | T/C | T/C | T/C | C/C |
| rs2252992 | T/C | T/C | C/C | C/C | T/C | T/C |
또한, 샘플 5 내지 10의 8개 유전자 다형성 부위의 유전형 분석 결과도 시퀀싱을 통해 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 시스템에 의해 얻어진 각 시료의 유전자형 분석 결과 (도 7 및 표 5)가 시퀀싱에 의해 얻어진 결과와 완전히 일치함을 나타내었다.
이러한 결과는 본 발명의 시스템이 단일 반응 시스템에서 시료 내 8개의 표적 핵산을 동시에 비대칭적으로 증폭할 수 있음을 보여주고, 효과적이고 신뢰할 수 있는 용융 곡선 분석을 위해 충분한 단일-가닥 핵산 생성물을 각각 생성하고, 이는 차례로 다중 표적 핵산의 식별을 가능하게 하였다 (예를 들어, 다중 유전자 다형성 부위의 유전자형). 따라서, 용융 곡선 분석 기술과 결합하여, 본 발명의 시스템은 다중 표적 핵산의 검출 및 식별 (예를 들어, 유전자형)을 동시에 실현할 수 있다.
실시예 5
본 실시예에 있어서, 상이한 농도의 인간 게놈 DNA를 함유하는 샘플의 유전형 분석은 본 발명의 시스템의 분석적 감도를 통상적인 다중 비대칭 PCR 시스템과 비교하기 위한 예로서 취하였다. 본 실시예에서 사용된 게놈 DNA는 8개의 알려진 유전자형 다형성 부위를 가졌으며 구체적으로 다음과 같다: rs979393: T/G; rs34521064: T/C; rs2835906: T/C; rs7275547: G/C; rs1005546: C/C; rs857998: C/C; rs4816597: T/C; rs2252992: C/C). 본 실시예에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 표 6과 같다. 본 실시예에서 사용된 기기는 SLAN 96 실시간 형광 PCR 기기였다.
간단히 말해서, 본 실시예에 있어서, 25 μL PCR 반응 시스템은 PCR 증폭 및 용융 곡선 분석에 사용되었으며 PCR 반응 시스템은 다음으로 구성되었다: 1×Taq PCR 완충액, 5.0 mM MgCl2, 0.24 mM dNTP, 2U Taq DNA 중합효소, 5 μL의 인간 게놈 DNA(10 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 ng/μL, 0.05 ng/μL 농도에서, 0.01 ng/μL 또는 0.005 ng/μL), 프라이머 및 프로브. 사용된 프라이머 및 프로브의 농도는 표 6에 나타내었다.
PCR 증폭 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 5 분 동안 사전 변성; 6 사이클 (15 초 동안 95 ℃에서 변성, 15 초 동안 52.5 ℃에서 어닐링, 20 초 동안 76 ℃에서 확장); 55 사이클 (95 ℃에서 15 초 동안 변성, 58 ℃에서 15 초 동안 어닐링, 76 ℃에서 20 초 동안 확장); 및 FAM, HEX, ROX 및 CY5 채널의 형광 신호는 어닐링 단계에서 수집되었다. 그런 다음, 용융 곡선 분석을 수행하였으며 프로그램은 다음과 같다: 95 ℃에서 1분간 변성, 및 37 ℃에서 3 분간 인큐베이션; 그 다음, 40 ℃에서 85 ℃까지 0.04 ℃/s의 가열 속도로 온도를 상승시켰고 FAM, HEX, ROX 및 CY5 채널의 형광 신호를 수집하였다. 실험 결과는 도 8 및 도 9에 나타내었다.
| 명칭 | 서열 (5'→3') | 작업 농도(μM) | 서열번호 | |
| 1 | 2 | |||
| 프라이머 | ||||
| rs979393-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTGGCACTATCCCTTTCAAACA | 0.04 | 0.04 | 16 |
| rs979393-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGACAGCTTTAAGTGAATTTATTGGCA | 0.04 | 0.4 | 17 |
| rs34521064-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTATTTGCTATATCTAGTGACCTGAATC | 0.04 | 0.04 | 18 |
| rs34521064-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGATCGGGGAGCACAGATGA | 0.04 | 0.4 | 19 |
| rs2835906-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTGTTTTTGTGTAAGTCTGATAGGTT | 0.06 | 0.06 | 20 |
| rs2835906-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGATGAGTCCCCGTTAAGCCT | 0.06 | 0.6 | 21 |
| rs7275547-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGCCAGGACATGCCTCAGT | 0.04 | 0.04 | 22 |
| rs7275547-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAGAGGAGGTACAGACATTTGGA | 0.04 | 0.4 | 23 |
| rs1005546-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGCATTTTGCCAATTTTTCCAACCA | 0.04 | 0.04 | 34 |
| rs1005546-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAGGGAAAGACAGAAGAATTCCACT | 0.04 | 0.4 | 35 |
| rs857998-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGCCAGTTTTCTGAAACCCAGATA | 0.04 | 0.04 | 36 |
| rs857998-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAAGGTCTGAAGGGCTTAGTTAG | 0.04 | 0.4 | 37 |
| rs4816597-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGGAATCAGGAAGCTTTCTATGAACA | 0.04 | 0.04 | 13 |
| rs4816597-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAATATAGAACGTGCACACTACCA | 0.04 | 0.4 | 14 |
| rs2252992-F | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGTCTGTTGTCCAATCTGGCA | 0.05 | 0.05 | 12 |
| rs2252992-R | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGAGGTCTAAAGCCACAAGGACTTA | 0.05 | 0.5 | 11 |
| Tag primer | GTCGCAAGCACTCACGTAGAGA | 1.60 | 0 | 4 |
| 형광 프로브 | ||||
| rs979393-P | FAM-CGTCAACTTGAGAGGTTTTTAATATGACG-BHQ1 | 0.20 | 0.20 | 28 |
| rs34521064-P | FAM-TGGGCACGTTTCACAGGGCTGGACACC-BHQ1 | 0.20 | 0.20 | 29 |
| rs2835906-P | HEX-ACATCAAAAGAAGCGTAAAATGATG-BHQ1 | 0.20 | 0.20 | 30 |
| rs7275547-P | HEX-TTGCCTCTGAGTGAATGCCTCTTCGTCACCT-BHQ1 | 0.20 | 0.20 | 31 |
| rs1005546-P | ROX-TCTTTGTTGTCATGTCTCTCAAAG-BHQ2 | 0.20 | 0.20 | 38 |
| rs857998-P | ROX-ACGCAGCTCTCCCAGCAGATAGGCAAGCCCCTGCG-BHQ2 | 0.20 | 0.20 | 39 |
| rs4816597-P | CY5-CGAAAGTCTCCAACGTATAGCATTTCG-BHQ2 | 0.20 | 0.20 | 15 |
| rs2252992-P | CY5-TGGAGCTCACACTTCTTAGACGCAGTGCTCCA-BHQ2 | 0.20 | 0.20 | 5 |
참고: 1, 본 발명의 시스템; 2, 기존의 다중 비대칭 PCR
도 8은 실시예 5에서 본 발명의 시스템을 이용하여 증폭 후 용융곡선 분석 결과를 보여주는 것이며, 상기, 검정 점선, 검정 파선, 회색 점선, 회색 파선은 각각 10 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 ng/μL, 0.05 ng/μL, 0.01 ng/μL 또는 0.005 ng/μL의 DNA 농도로 샘플을 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 5에서 기존의 다중 비대칭 PCR 시스템을 이용하여 증폭 후 용융 곡선 분석 결과를 보여주는 것이며, 상기, 검정 점선, 검정 파선, 회색 점선, 회색 파선, 검정 실선 및 회색 실선은 각각 10 ng/μL, 1 ng/μL, 0.1 ng/μL, 0.05 ng/μL, 0.01 ng/μL 또는 0.005 ng/μL의 지노믹 DNA 농도의 샘플을 증폭한 후의 용융 곡선 분석 결과를 나타낸다.
도 8의 결과는 인간 게놈 DNA의 농도도 0.05 ng/uL (회색 점선) 정도로 낮았으며, 본 발명의 시스템은 모든 8개의 유전자 다형성 부위의 유전자형을 여전히 안정적이고 정확하게 검출할 수 있었다. 대조적으로, 도 9의 결과는 기존의 다중 비대칭 PCR 시스템은 인간 게놈 DNA의 농도가 10 ng/uL (검정 점선) 및 1 ng/uL (검정 파선)인 경우에만 8개 유전자 다형성 부위의 유전자형을 모두 검출할 수 있었으며; 인간 게놈 DNA의 농도가 0.1 ng/uL (회색 점선)일 때, 일부 유전자 다형성 부위 (예를 들어, 부위 rs34521064, rs4816597)의 유전자형은 더 이상 검출 및 식별할 수 없었다 (분별할 수 있는 용융 피크가 생성되지 않음). 이것은 기존의 다중 비대칭 PCR 반응 시스템에서 고농도의 여러 종류의 프라이머와 프로브가 상호 작용하기 때문일 수 있으며, 결과적으로 일부 유전자 다형성 부위의 비대칭 증폭이 효과적으로 수행될 수 없었고 용융 곡선 분석을 위한 충분한 양의 단일-가닥 생성물을 생성할 수 없었다.
이상의 결과로부터 본 발명의 시스템의 검출 감도가 기존의 다중 비대칭 PCR 시스템의 검출 감도보다 현저히 높음을 알 수 있었다. 이는 주로 본 발명의 시스템이 증폭을 위해 저농도의 타겟-특이성 프라이머와 고농도의 범용 프라이머를 사용하여 프라이머 간의 간섭을 효과적으로 감소시키고, 이량체의 비특이적 증폭을 감소시키는 등의 효과를 나타내었기 때문이며, 반응계 내의 각 표적 핵산의 증폭이 평형에 도달하도록 하여 전체 반응계의 검출 감도를 향상시켰다.
본 발명의 특정 실시예가 상세하게 설명되었지만, 당업자는 개시된 모든 교시에 비추어 상세에 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 인식할 것이며, 그리고 이러한 변경은 모두 본 발명의 범위 내에 있음을 알 수 있다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구범위 및 그 등가물에 의해 제공된다.
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<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2252992-F1
<400> 1
gtcgcaagca ctcacgtaga gactctccta aagtcactca atctta 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2252992-F2
<400> 2
gtcgcaagca ctcacgtaga gcctctccta aagtcactca atctta 46
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2252992-R
<400> 3
gtcgcaagca ctcacgtaga gatgccctca ctacttggaa ct 42
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tag primer
<400> 4
gtcgcaagca ctcacgtaga ga 22
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2252992-P
<400> 5
tggagctcac acttcttaga cgcagtgctc ca 32
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2252992-F-A
<400> 6
gtcgcaagca ctcacgtaga gatctgttgt ccaatctggc a 41
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2252992-F-C
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gtcgcaagca ctcacgtaga gctctgttgt ccaatctggc a 41
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtcgcaagca ctcacgtaga ggtctgttgt ccaatctggc a 41
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
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<223> rs2252992-F-T
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gtcgcaagca ctcacgtaga gttctgttgt ccaatctggc a 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2252992-F-D
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gtcgcaagca ctcacgtaga atctgttgtc caatctggca 40
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<213> Artificial Sequence
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gtcgcaagca ctcacgtaga gaggtctaaa gccacaagga ctta 44
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2252992-F
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gtcgcaagca ctcacgtaga gtctgttgtc caatctggca 40
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs4816597-F
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gtcgcaagca ctcacgtaga ggaatcagga agctttctat gaaca 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtcgcaagca ctcacgtaga gatatagaac gtgcacacta cca 43
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs4816597-P
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cgaaagtctc caacgtatag catttcg 27
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> rs979393-F
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gtcgcaagca ctcacgtaga gtggcactat ccctttcaaa ca 42
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs979393-R
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gtcgcaagca ctcacgtaga gacagcttta agtgaattta ttggca 46
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtcgcaagca ctcacgtaga gtatttgcta tatctagtga cctgaatc 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtcgcaagca ctcacgtaga gatcggggag cacagatga 39
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gtcgcaagca ctcacgtaga gtgtttttgt gtaagtctga taggtt 46
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<213> Artificial Sequence
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gtcgcaagca ctcacgtaga gatgagtccc cgttaagcct 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7275547-F
<400> 22
gtcgcaagca ctcacgtaga gccaggacat gcctcagt 38
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7275547-R
<400> 23
gtcgcaagca ctcacgtaga gagaggaggt acagacattt gga 43
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gtcgcaagca ctcacgtaga ggaaatttca gaattgttat ggaccag 47
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs418298-R
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gtcgcaagca ctcacgtaga gacagaggca ggtcgtct 38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtcgcaagca ctcacgtaga gcaggcccaa atccattctc 40
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs60871880-R
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gtcgcaagca ctcacgtaga gatcaagagg cacagcca 38
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<213> Artificial Sequence
<220>
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cgtcaacttg agaggttttt aatatgacg 29
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs34521064-P
<400> 29
tgggcacgtt tcacagggct ggacacc 27
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs2835906-P
<400> 30
acatcaaaag aagcgtaaaa tgatg 25
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs7275547-P
<400> 31
ttgcctctga gtgaatgcct cttcgtcacc t 31
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs418298-P
<400> 32
atgctctatg tgttcaattt gttccgagca 30
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs60871880-P
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tgtgctgaag ctaagagcaa agggggccag cac 33
<210> 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1005546-F
<400> 34
gtcgcaagca ctcacgtaga gcattttgcc aatttttcca acca 44
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1005546-R
<400> 35
gtcgcaagca ctcacgtaga gagggaaaga cagaagaatt ccact 45
<210> 36
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs857998-F
<400> 36
gtcgcaagca ctcacgtaga gccagttttc tgaaacccag ata 43
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs857998-R
<400> 37
gtcgcaagca ctcacgtaga gaaggtctga agggcttagt tag 43
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs1005546-P
<400> 38
tctttgttgt catgtctctc aaag 24
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rs857998-P
<400> 39
acgcagctct cccagcagat aggcaagccc ctgcg 35
Claims (10)
- 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산들을 증폭하는 방법으로서, 다음을 포함,
(1) 하나 이상의 표적 핵산들을 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 및, 범용 프라이머를 제공하고, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해, 표적-특이적 프라이머 쌍을 제공하는 단계; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열을 포함함;
표적-특이적 프라이머 쌍은 표적 핵산을 증폭할 수 있고 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 정방향 염기 서열을 포함하고, 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 역방향 염기 서열을 포함하고, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 및, 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에서, 제1 범용 서열은 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링할 수 있고, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이에 차이점이 있고, 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 것을 포함함; 및, 제1 범용 서열은 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적이지 않음; 및
(2) 샘플 내 표적 핵산들을 범용 프라이머와 표적-특이적 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 통해 핵산 증폭이 가능한 조건에서 증폭하는 단계. - 제1항에 있어서, 상기 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 기술적 특징을 갖는 방법:
(1) 방법은 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 또는 그 이상의 표적 핵산들을 증폭하는 데 사용됨;
(2) 방법의 단계 (1)에서, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 또는 그 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍이 제공됨;
(3) 방법의 단계 (2)에서, 범용 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 작업 농도보다 더 높은 작업 농도를 가짐; 예를 들어, 범용 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 작업 농도보다 1-5배, 5-10배, 10-15배, 15-20배, 20-50 배 또는 그 이상의 높은 작업 농도를 가짐;
(4) 방법의 단계 (2)에서, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 동일 또는 상이한 작업 농도를 가짐;
(5) 샘플 또는 표적 핵산은 mRNA를 포함, 및 상기 방법의 단계 (2)를 수행하기 전에, 샘플에 대해 역전사 반응이 수행됨; 및
(6) 방법의 단계 (2)에서, 핵산 중합효소(특히 주형-의존적 핵산 중합효소)를 사용하여 PCR 반응을 수행함; 바람직하게는, 핵산 중합효소는, 열안정성 DNA 중합효소와 같은, DNA 중합효소이고; 바람직하게는, 열안정성 DNA 중합효소는 써무스 아쿠아티쿠스 [Thermus aquaticus (Taq)], 써무스 써모필루스[Thermus thermophiles (Tth)], 써무스 필리포미스(Thermus filiformis), 써무스 플레부스(Thermis flavus), 써모코커스 리터랠리스(Thermococcus literalis), 써무스 안트라닐다니(Thermus antranildanii), 써무스 칼도필러스(Thermus caldophllus), 써무스 실리아로필루스(Thermus chliarophilus), 써무스 플레부스(Thermus flavus), 써무스 이그니테레(Thermus igniterrae), 써무스 락테우스(Thermus lacteus), 써무스 오쉬마이(Thermus oshimai), 써무스 루베르(Thermus ruber), 써무스 루벤스(Thermus rubens), 써무스 스코토덕투스(Thermus scotoductus), 써무스 실바누스(Thermus silvanus), 써무스 써모필루스(Thermus thermophllus), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 써모토가 나폴리타나(Thermotoga neapolitana), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 써모코커스 바로씨(Thermococcus barossi), 써모코커스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 써모토가 나폴리타나(Thermotoga neapolitana), 써모시포아프리카누스(Thermosiphoafricanus), 파이로코커스 우에세이(Pyrococcus woesei), 파이로코커스 호리코쉬(Pyrococcus horikoshii), 파이로코커스 아비씨(Pyrococcus abyssi), 파이로딕티움 오큘텀(Pyrodictium occultum), 아퀴펙스파이로필루스(Aquifexpyrophilus) 및 아퀴펙스 애오리우스(Aquifex aeolieus) 로부터 얻어짐; 바람직하게는, DNA 중합효소는 Taq 중합효소임. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 기술적 특징을 갖는 것인 방법:
(1) 범용 프라이머는 제1 범용 서열로 이루어지거나, 또는 제1 범용 서열 및 추가 서열을 포함하고, 추가 서열은 제1 범용 서열의 5' 말단에 위치함; 바람직하게는, 추가 서열은 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함함;
(2) 제1 범용 서열은 범용 프라이머의 3' 부분에 위치하거나 배열됨;
(3) 범용 프라이머는 5-15 nt, 15-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt 또는 40-50 nt의 길이를 가짐;
(4) 범용 프라이머 또는 이의 모든 구성요소는 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함 또는 이로 이루어짐. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 기술적 특징을 갖는, 방법:
(1) 정방향 프라이머에서, 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 직접 연결되거나, 또는 뉴클레오티드 링커를 통해 제2 범용 서열의 3' 말단에 연결; 바람직하게는, 뉴클레오티드 링커는 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함함;
(2) 정방향 프라이머는, 제2 범용 서열의 5' 말단에 위치하는, 추가 서열을 추가로 포함함; 바람직하게는, 추가 서열은 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함함;
(3) 정방향 프라이머는 제2 범용 서열과 5'에서 3'으로의 정방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어짐; 또는, 제2 범용 서열, 뉴클레오티드 링커 및 5'에서 3'으로의 정방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어짐; 또는, 추가 서열, 제2 범용 서열 및 5'에서 3'으로의 정방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어짐; 또는 추가의 서열, 제2 범용 서열, 뉴클레오티드 링커 및 5'에서 3'으로의 정방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어짐;
(4) 정방향 염기 서열은 정방향 프라이머의 3' 부분에 위치하거나 배열됨;
(5) 정방향 염기 서열은 10-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80 nt-90 nt, 또는 90-100 nt의 길이를 가짐;
(6) 정방향 프라이머는 15-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90 nt, 90-100 nt, 100-110 nt, 110-120 nt, 120-130 nt, 130-140 nt, 또는 140-150 nt의 길이를 가짐;
(7) 정방향 프라이머 또는 그의 임의의 구성요소는 천연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함 또는 이로 이루어짐;
(8) 역방향 프라이머에서, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 직접 연결되거나, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 뉴클레오티드 링커를 통해 연결됨; 바람직하게는, 뉴클레오티드 링커는 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함함;
(9) 역방향 프라이머는, 제1 범용 서열의 5' 말단에 위치하는, 추가 서열을 추가로 포함함; 바람직하게는, 추가 서열은 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함함;
(10) 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 5'에서 3'으로의 역방향 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어짐; 또는 제1 범용 서열, 뉴클레오티드 링커 및 5'에서 3'으로의 역 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어짐; 또는 추가 서열, 제1 범용 서열, 및 5'에서 3'으로의 역 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어짐; 또는 추가 서열, 제1 범용 서열, 뉴클레오티드 링커 및 5'에서 3'으로의 역 염기 서열을 포함 또는 이로 이루어짐;
(11) 역방향 염기 서열이 역방향 프라이머의 3' 부분에 위치하거나 배열됨;
(12) 역 염기 서열은 10-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90nt, 또는 90-100nt의 길이를 가짐;
(13) 역방향 프라이머는 15-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90 nt, 90-100 nt, 100-110 nt, 110-120 nt, 120-130 nt, 130-140 nt, 또는 140-150 nt의 길이를 가짐;
(14) 역방향 프라이머 또는 이의 임의의 구성요소는 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함 또는 이로 이루어짐;
(15) 제1 범용 서열은 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적이지 않음; 예를 들어, 제1 범용 서열의 3' 말단에 있는 적어도 하나 이상의 뉴틀레오티드, 예를 들어1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드는, 정방향 프라이머의 상보적 서열에 상보적이지 않음; 및
(16) 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이의 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에서 1-5, 5-10, 10-15, 15-20 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 점에 있거나 이를 포함함. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 기술적 특징을 갖는 방법:
(1) 샘플은 DNA(예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA), RNA(예를 들어, mRNA), 또는 이들의 조합을 포함함;
(2) 증폭될 표적 핵산은 DNA(예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA), RNA(예를 들어, mRNA), 또는 이들의 임의의 조합임;
(3) 증폭될 표적 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥임; 및
(4) 샘플 또는 표적 핵산은 원핵생물, 진핵생물(예를 들어, 원생동물, 기생충, 진균, 효모, 식물, 및 포유동물 및 인간을 포함한 동물) 또는 바이러스(예를 들어, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, EB 바이러스, 간염 바이러스, 소아마비 바이러스 등) 또는 바이로이드로부터 얻어짐. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계 (1) 내지 (2)는 다음 단계 (a) 내지 (f)를 포함하는 프로토콜에 의해 수행되는 방법:
(a) 하나 이상의 표적 핵산들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및, 범용 프라이머를 제공하고, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해, 표적-특이적 프라이머 쌍을 제공하는 단계; 상기 범용 프라이머 및 표적-특이적 프라이머 쌍은 제1항에 정의된 바와 같음;
(b) 샘플을 범용 프라이머 및 표적-특이적 프라이머 쌍, 및 핵산 중합효소와 혼합하는 단계;
(c) 이전 단계의 생성물을 핵산 변성을 허용하는 조건하에서 인큐베이션하는 단계;
(d) 이전 단계의 생성물을 핵산 어닐링 또는 혼성화를 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계;
(e) 이전 단계의 생성물을 핵산 확장을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계; 및
(f) 선택적으로, 단계 (c) 내지 (e)를 1 회 이상 반복하는 단계;
바람직하게는, 방법은 다음에서 선택된 하나 이상의 기술적 특징을 가짐:
(1) 단계 (c)에서, 단계 (b)의 생성물을 80-105 ℃의 온도에서 인큐베이션하여, 핵산을 변성시키는 단계;
(2) 단계 (c)에서, 단계 (b)의 생성물을 10-20 초, 20-40 초, 40-60 초, 1-2 분 또는 2-5 분 동안 인큐베이션하는 단계;
(3) (d) 단계에서, (c) 단계의 생성물을 35-40 ℃, 40-45 ℃, 45-50 ℃, 50-55 ℃, 55-60 ℃, 60-65 ℃, 또는 65-70 ℃의 온도에서 인큐베이션하여, 핵산 어닐링 또는 혼성화를 수행하는 단계;
(4) 단계 (d)에서, 단계 (c)의 생성물을 10-20 초, 20-40 초, 40-60 초, 1-2 분 또는 2-5 분 동안 인큐베이션하는 단계;
(5) 단계 (e)에서, 단계 (d)의 생성물을 35-40 ℃, 40-45 ℃, 45-50 ℃, 50-55 ℃, 55-60 ℃, 60-65 ℃, 65-70 ℃, 70-75 ℃, 75-80 ℃, 80-85 ℃의 온도에서 인큐베이션하여, 핵산 확장을 허용하는 단계;
(6) 단계 (e)에서, 단계 (d)의 생성물을 10-20 초, 20-40 초, 40-60 초, 1-2 분, 2-5 분, 5-10 분, 10-20 분 또는 20-30 분 동안 인큐베이션하는 단계;
(7) 동일 또는 상이한 온도에서 단계 (d) 및 (e)를 수행하는 단계; 및
(8) 단계 (c) 내지 (e)를 1 회 이상, 예를 들어, 2 회 이상, 5 회 이상, 10 회 이상, 20 회 이상, 30 회 이상, 40 회 이상, 또는 50 회 이상 반복; 바람직하게는, 단계 (c) 내지 (e)를 1 회 이상 반복할 때, 각 사이클의 단계 (c) 내지 (e)에서 사용된 조건은 독립적으로 동일 또는 상이함. - 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산들을 검출하는 방법으로서, 이는 다음을 포함함, (i) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산들을 증폭하는 단계; (ii) 단계 (i)의 생성물에 대해 용융 곡선 분석을 수행하는 단계.
- 제7항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함:
(1) 하나 이상의 표적 핵산들을 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 및 범용 프라이머를 제공하고, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해, 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브를 제공하는 단계; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열을 포함함;
표적-특이적 프라이머 쌍은 표적 핵산을 증폭할 수 있고 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 정방향 염기 서열을 포함하고, 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 역방향 염기 서열을 포함하고, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에서, 제1 범용 서열은 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링할 수 있고, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이에 차이점이 있고, 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 것을 포함함; 및, 제1 범용 서열은 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적이지 않음;
검출 프로브는 표적 핵산에 특이적인 프로브 염기 서열을 포함하고, 리포터 그룹 및 소광제 그룹으로 표지되며, 상기 리포터 그룹은 신호를 방출할 수 있고 소광제 그룹은 리포터 그룹에 의해 방출된 신호를 흡수하거나 소광할 수 있음; 및 상보적 서열에 혼성화할 때 검출 프로브에 의해 방출되는 신호는 상보적 서열에 혼성화되지 않을 때 방출되는 신호와 상이함;
(2) 샘플 내 표적 핵산들을 범용 프라이머와 표적-특이적 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 통해 핵산 증폭이 가능한 조건에서 증폭하는 단계;
(3) 상기 검출 프로브를 이용하여 상기 (2) 단계의 생성물에 대한 용융 곡선 분석을 수행하는 단계; 및 상기 용융 곡선 분석 결과에 따라 상기 샘플에 표적 핵산이 존재하는지 여부를 판단하는 단계;
바람직하게는, 상기 방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 기술적 특징을 가짐:
(1) 샘플 또는 표적 핵산은 제5항에 정의된 바와 같음;
(2) 범용 프라이머는 제3항에 정의된 바와 같음;
(3) 표적-특이적 프라이머 쌍은 제4항에 정의된 바와 같음;
(4) 단계 (2)에서, 상기 샘플을 범용 프라이머, 표적-특이적 프라이머 쌍, 및 핵산 중합효소와 혼합하여, PCR 반응을 수행한 후, PCR 반응이 완료된 후, 검출 프로브를 단계 (2)의 생성물에 추가하고, 용융 곡선 분석을 수행함; 또는, 단계 (2)에서, 상기 샘플을 범용 프라이머, 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브, 및 핵산 중합효소와 혼합하여 PCR 반응을 수행한 후, PCR 반응이 완료된 후, 용융 곡선 분석을 수행함;
(5) 검출 프로브는 자연 발생 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드), 변형 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드(예를 들어, 펩타이드 핵산(PNA) 또는 잠금 핵산), 또는 이들의 임의의 조합을 포함 또는 이로 이루어짐;
(6) 검출 프로브는 15-20 nt, 20-30 nt, 30-40 nt, 40-50 nt, 50-60 nt, 60-70 nt, 70-80 nt, 80-90 nt, 90-100 nt, 100-200 nt, 200-300 nt, 300-400 nt, 400-500 nt, 500-600 nt, 600-700 nt, 700-800 nt, 800-900 nt, 또는 900-1000 nt의 길이를 가짐;
(7) 검출 프로브는 3'-OH 말단을 가짐; 또는, 검출 프로브의 3'-말단은 차단됨; 예를 들어, 검출 프로브의 3'-말단은 검출 프로브의 마지막 뉴클레오티드의 3'-OH에 화학적 모이어티(예를 들어, 비오틴 또는 알킬)를 추가하거나, 검출 프로브의 마지막 뉴클레오티드의 3'-OH를 제거하거나, 마지막 뉴클레오티드를 디데옥시뉴클레오티드로 대체함으로써 차단됨;
(8) 검출 프로브는 자체-소광 프로브임; 예를 들어, 검출 프로브는 5' 말단 또는 상류에서 리포터 그룹으로 표지되고 3' 말단 또는 하류에서 소광제 그룹으로 표지되거나, 또는 3' 말단 또는 하류에서 리포터 그룹으로 표지되고 5' 말단 또는 상류에서 소광제 그룹으로 표지됨; 바람직하게는, 리포터 그룹과 소광제 그룹은 10-80 nt 이상의 거리만큼 떨어져 있음;
(9) 검출 프로브의 리포터 그룹은 형광성 그룹임(예를 들어, ALEX-350, FAM, VIC, TET, CAL Fluor® Gold 540, JOE, HEX, CAL Fluor Orange 560, TAMRA, CAL Fluor Red 590, ROX, CAL Fluor Red 610, TEXAS RED, CAL Fluor Red 635, Quasar 670, CY3, CY5, CY5.5, Quasar 705); 소광제 그룹은 형광을 흡수/소광할 수 있는 분자 또는 기(예를 들어, DABCYL, BHQ(예를 들어, BHQ-1 또는 BHQ-2), ECLIPSE, 및/또는 TAMRA)임;
(10) 검출 프로브는 뉴클레아제 활성(예를 들어, 5' 뉴클레아제 활성, 예를 들어 5'에서 3'로의 엑소뉴클레아제 활성)에 대한 내성을 가짐; 예를 들어, 검출 프로브는 뉴클레아제 활성에 저항하기 위한 변형을 포함하는 백본을 가지며, 그 예로는 포스포로티오에이트 에스테르 결합, 알킬 포스포트리에스테르 결합, 아릴 포스포트리에스테르 결합, 알킬 포스포네이트 에스테르 결합, 아릴 포스포네이트 에스테르 결합, 수소화 인산 에스테르 결합, 알킬 포스포르아미데이트 에스테르 결합, 아릴 포스포르아미데이트 에스테르 결합, 2'-O-아미노프로필 변형, 2'-O-알킬 변형, 2'-O-알릴 변형, 2'-O-부틸 변형, 및 1-(4'-티오-PD-리보푸라노실) 변형이 있음.
(11) 검출 프로브는 선형 또는 헤어핀 구조를 가짐;
(12) 각각의 검출 프로브는 독립적으로 동일 또는 상이한 리포터 그룹을 가짐; 바람직하게는, 검출 프로브는 동일한 리포터 그룹을 갖고, 단계 (2)의 생성물은 용융 곡선 분석을 거친 다음, 용융 곡선의 용융 피크에 따라 표적 핵산의 존재를 결정함; 또는, 검출 프로브들은 서로 다른 리포터 그룹을 갖고, 단계 (2)의 생성물은 용융 곡선 분석을 거친 다음, 리포터 그룹의 신호 유형과 용융 곡선의 용융 피크에 따라 표적 핵산의 존재를 결정함;
(13) 단계 (3)에서, 단계 (2)의 생성물을 서서히 가열하거나 냉각하고 각 검출 프로브에서 리포터 그룹이 방출하는 신호를 실시간으로 모니터링하여, 온도 변화에 따라 변하는 각 리포터 그룹의 신호 강도 곡선을 얻음; 그 다음, 곡선을 미분하여 단계 (2)에서 제품의 용융 곡선을 얻음;
(14) 용융 곡선의 용융 피크(녹는점)에 따라, 용융 피크(녹는점)에 해당하는 표적 핵산의 존재를 결정함; 및
(15) 방법의 단계 (1) 내지 (3)은 다음 단계 (a) 내지 (g)를 포함하는 프로토콜에 의해 수행됨:
(a) 하나 이상의 표적 핵산들을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및 범용 프라이머를 제공하고, 증폭될 각각의 표적 핵산에 대해, 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브를 제공하는 단계; 상기 범용 프라이머, 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브는 제8항에 정의된 바와 같음;
(b) 샘플을 범용 프라이머, 표적-특이적 프라이머 쌍 및 검출 프로브, 및 핵산 중합효소(예를 들어, 주형-의존적 핵산 중합효소; 예를 들어 DNA 중합효소, 특히 열안정성 DNA 중합효소)와 혼합하는 단계;
(c) 이전 단계의 생성물을 핵산 변성을 허용하는 조건하에서 인큐베이션하는 단계;
(d) 이전 단계의 생성물을 핵산 어닐링 또는 혼성화를 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계;
(e) 이전 단계의 생성물을 핵산 확장을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션하는 단계;
(f) 선택적으로, 단계 (c) 내지 (e)를 1 회 이상 반복하는 단계; 및
(g) 이전 단계의 생성물에 대해 용융 곡선 분석을 수행하는 단계. - 다음을 포함하는, 프라이머 세트: 범용 프라이머, 및, 하나 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍; 상기,
범용 프라이머는 제1 범용 서열을 포함함;
각각의 표적-특이적 프라이머 쌍은 표적 핵산을 증폭할 수 있고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 제2 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 정방향 염기 서열을 포함하고, 정방향 염기 서열은 제2 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 역방향 프라이머는 제1 범용 서열 및 표적 핵산에 특이적인 역방향 염기 서열을 포함하고, 역방향 염기 서열은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치함; 핵산 혼성화 또는 어닐링을 허용하는 조건 하에서, 제1 범용 서열은 제2 범용 서열의 상보적 서열에 혼성화 또는 어닐링할 수 있고, 제2 범용 서열과 제1 범용 서열 사이에 차이점이 있고, 차이점은 제1 범용 서열의 3' 말단에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드가 각각 독립적으로 결실 또는 치환된다는 것을 포함함; 및, 제1 범용 서열은 정방향 프라이머의 상보적 서열에 완전히 상보적이지 않음;
바람직하게는, 프라이머 세트는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 기술적 특징을 가짐:
(1) 프라이머 세트는 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-50 개 이상의 표적-특이적 프라이머 쌍을 포함함;
(2) 범용 프라이머는 제3항에 정의된 바와 같음;
(3) 표적-특이적 프라이머 쌍은 제4항에 정의된 바와 같음; 및
(4) 표적 핵산은 제5항에 정의된 바와 같음. - 제9항에 따른 프라이머 세트와, 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 구성 요소를 포함하는, 키트: 핵산 중합효소, 핵산 증폭용 시약, 시퀀싱용 시약, 유전자 칩 검출용 시약, 용융 곡선 분석용 시약, 또는 이들의 임의의 조합;
바람직하게는, 키트는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 기술적 특징을 가짐:
(1) 핵산 중합효소는, DNA 중합효소, 특히 열안정성 DNA 중합효소와 같은, 주형-의존적 핵산 중합효소; 바람직하게는, 핵산 중합효소는 제2항에 정의된 바와 같음;
(2) 핵산 증폭용 시약은 효소(예를 들어, 핵산 중합효소)의 작업 완충액, dNTP들(표지 또는 비표지된), 물, 이온(예를 들어, Mg2+)을 함유한 용액, 단일-가닥 DNA-결합 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함함;
(3) 시퀀싱용 시약은 효소(예를 들어, 핵산 중합효소)의 작업 완충액, dNTP들(표지 또는 비표지된), ddNTP들(표지 또는 비표지된), 물, 이온(예를 들어, Mg2+)을 함유한 용액, 단일-가닥 DNA-결합 단백질(SSB), 리가아제, 핵산 링커, 시퀀싱 프라이머, 또는 이들의 임의의 조합을 포함함;
(4) 유전자 칩 검출용 시약은 효소(예를 들어, 핵산 중합효소)의 작업 완충액, dNTP들(표지 또는 비표지된), 물, 혼성화 완충액, 세척 완충액, 표지 시약, 또는 이들의 임의의 조합을 포함함; 및
(5) 용융 곡선 분석용 시약은 검출 프로브를 포함함; 바람직하게는, 검출 프로브는 청구항 8에 정의된 바와 같음.
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