KR20220121421A - 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체 - Google Patents

다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체 Download PDF

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antibacterial
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서지원
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광주과학기술원
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Abstract

본 발명은 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체에 관한 것이다. 본 발명의 광감작제-펩토이드 공액체는 펩토이드, 링커, 감광제를 포함하는 구성의 화합물로, 가시광선 영역대의 빛을 조사할 경우 체내 산소와 반응하여 일중항 산소 또는 자유라디칼을 생성하여 광역학 치료에서 항균 활성 효과가 증대되고, 박테리아의 세포사멸 및 플라스미드 DNA의 절단을 유도하는 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체{Photosensitizer-peptoid conjugates for photodynamic therapy with multitarget antimicrobial activity}
본 발명은 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 대장균에 대해 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체에 관한 것이다.
1928년 알렉산더 플레밍(1945년 노벨 생리의학상)이 푸른곰팡이에서 페니실린을 발견하고, 1942년부터 기적의 항생제로 사용된 이후, 인류의 병원성 세균 감염으로 인한 사망률이 급격히 감소했다. 이후, 설파제, 테트라사이클린, 퀴놀론, 아미노글리코사이드, 반코마이신, 리파마이신, 뎁토마이신, 카바페넴 등 다양한 계열의 항생제들이 개발되어 다양한 세균 감염증을 치료하였다. 하지만, 병원이나 축산농가에서의 항생제 오남용과 함께 지난 30년간 새로운 항생제 신약 개발이 제약회사에서 외면받으면서, 현존하는 어떤 항생제로도 치료되지 않는 항생제 내성균(pan-resistant)에 의한 감염 환자들이 증가하였다.
슈퍼박테리아라고 일컬어지는 다약제 내성균(multidrug resistant bacteria, MDR)은 자연선택이나 돌연변이를 통해 여러 항생제에 대해 동시에 내성을 획득한 세균을 뜻한다. 항생제 내성에 문제가 되는 주요 병원균으로는 소위 ‘ESKAPE’ 균주들이 있는데, 이는 장내구균(Enterococcus)류, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 엔테로박터(Enterobacter)이다. 여러 항생제에 대한 다약제 내성균의 증가는 21세기 전 세계적으로 인류의 건강을 위협하는 문제가 되고 있지만, 새로운 치료제가 개발되지 않고 있어, 문제가 심각하다. 따라서, 다약제 내성을 갖는 차별화된 항균 메커니즘을 갖는 항생제 개발이 절실히 필요한 상황이다.
항균 펩타이드(AMP; Antimicrobial peptides)는 대부분의 생물체가 가지고 있는 선천적 면역체계(innate defense system)의 일원으로, 10~50개의 아미노산으로 구성된 작은 크기의 펩타이드로서, 생물체가 병원균에 감염되었을 때 1차 방어물질로 작용하는 천연물질이다. 상기 항균 펩타이드는 기존 항생제에 내성이 있는 균에도 항균력이 뛰어나 항생제 내성 문제를 해결할 차세대 치료제로 주목받고 있다.
상기 항균 펩타이드는 세포막의 지질 성분에 대한 친화력을 갖는 구조를 지니고 주로 양전하를 띠므로, 세균의 세포막 지질과 결합하여 세균의 세포막을 파괴하거나, 음전하를 띤 세균의 세포막과 접촉하여 세포막 전위를 소실시켜 세균을 죽이는 것으로 알려져 있다. 자연에 존재하는 천연 항균 펩타이드인 마가이닌-2(magainin-2), 멜리틴(melittin), 카델리시딘(cathelicidin) 및 디펜신(defensin) 등이 있다. 이러한 천연 항균 펩타이드들은 in vitro에서 다약제 내성균에 우수한 항균활성을 보였다. 하지만, 천연 항균 펩타이드들은 아미노산의 펩타이드 결합으로 구성되어 있어서 생체 내에서 효소에 의해 빠르게 분해되어 생체 내 반감기가 짧고, 독성 문제로 임상 적용에 어려움이 있다. 또한, 천연 항균 펩타이드를 상업적으로 이용하기 위해서는 생산 비용이 많이 든다는 한계점이 있다. 따라서, 연구자들은 비천연 아미노산을 통합하거나, 펩타이드의 길이를 조절하거나, 또는 아미노산 서열을 순환시킴으로써 항균 펩타이드의 한계를 극복하기 위한 다양한 전략을 시도하고 있다.
항균 펩타이드를 구조적으로 모방한 항균 펩토이드(Antimicrobial peptoids)는 항균 펩타이드의 한계점을 보완한 유망한 항균제이다. 펩토이드(peptoids)는 인공적으로 합성된 펩타이드 유사체(peptidomimetics)로서, 치환기가 아민에 붙어있는 3차 아미드가 반복된 골격, 즉, N-alkylated glycine의 올리고머 형태의 구조를 갖는다. 펩토이드는 펩타이드와는 달리 단백질 분해 효소에 대한 저항성이 높아 생체 내 안정성이 매우 뛰어나고, 고체상 합성법으로 비교적 간단히 합성할 수 있다는 이점이 있다. 따라서, 항균 펩토이드는 생체 내에서 효소에 의한 가수분해가 현저히 지연되어 천연 항균 펩타이드보다 더 안정적으로 항균 활성을 나타낼 수 있다.
항균 광역학 치료(aPDT; Antimicrobial photodynamic therapy)는 빛, 산소 및 광감작제(photosensitizer)를 이용하여 대상 특성세포나 세균을 사멸시키는 치료방법이다. 광감작제를 세균의 적정부위에 위치시키고, 적절한 파장의 빛이 조사되면 광감작제는 들뜬 상태가 된다. 산소는 들뜬 상태의 광감작제로부터 에너지를 받아 라디칼 종(·OH), 슈퍼옥사이드(O2 ·-)와 같은 활성 산소 종(ROS; Reactive oxygen species) 또는 일중항 산소(1O2)가 된다. 그 중, 일중항 산소(1O2)는 매우 반응성이 커서 세포 내 단백질, 지질 및 핵산 등에 치명적인 손상을 주어 세포사멸을 유도한다. 즉, 항균 광역학 치료(aPDT)는 빛의 조사를 통해 일중항 산소(1O2)의 생성으로 광 독성을 유발하고, 박테리아의 산화 스트레스를 극대화할 수 있다. 항균 광역학 치료에 사용되는 광감작제로는 페노티아지늄, 테트라피롤(예를 들어, 포르피린, 클로린 및 프탈로시아닌) 및 리보플라빈을 사용할 수 있다. 그러나, 대부분의 광감작제들은 세포핵에 집합되지 않기 때문에, 일반적으로는 박테리아의 DNA 손상을 초래하지 않고, 세포막 파괴에 한정된 활성을 보인다는 한계점이 있다. 이에, 효과적으로 다중 표적의 항균 활성을 위한 광감작제의 개발은 미비한 실정이다.
따라서, 박테리아의 세포막 및 DNA 손상을 모두 야기할 수 있는 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체 및 이를 포함하는 조성물의 개발은 시급하며, 산업적, 임상적으로도 매우 중요한 파급효과를 가진다 할 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 대장균에 대하여 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체(PsPC; Photosensitizer-peptoid conjugate)를 제공하는 것이다.
상술한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명은, 빛에 반응하여 일중항 산소를 생성하는 광감작제; 상기 광감작제를 박테리아에 선택적으로 접근시키는 펩토이드; 및 상기 광감작제 및 상기 펩토이드를 접합하는 링커;를 포함하고, 박테리아 세포막의 손상 및 DNA 절단 효과의 다중 표적 항균 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체를 제공한다.
상기 펩토이드는 하기 화학식 1 내지 4 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[화학식 1]
H-(NLys-Nspe-Nspe)4-NH2;
[화학식 2]
H-NLys-Npm-Npm-(NLys-Nspe-Nspe)2-NLys-Npm-Npm-NH2;
[화학식 3]
H-NLys-Npm-Nspe-(NLys-Npm-Npm)3-NH2; 및
[화학식 4]
H-(NLys-Npm-Npm)4-NH2.
상기 광감작제는 포피린류(porphyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes) 중 선택되는 어느 하나일 수 있고, 자세하게는, 포피린류(phophyrins) 또는 클로린류(chlorins)일 수 있다.
또한, 상기 광감작제는 가시광선 영역의 파장(380nm 내지 780nm)의 빛에 반응할 수 있고, 자세하게는, 청색 파장(400nm 내지 500nm)의 빛에 반응할 수 있다.
상기 링커는 글리신(glycine), 디글리신(diglycine), 폴리에틸렌 글리콜4(PEG4), 폴리에틸렌 글리콜8(PEG8) 및 6-아미노헥실(ahx; 6-aminohexyl) 중 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 링커는 카르복실산(carboxylic acid), 아민(amine) 및 히드록시기(hydroxyl group) 중 선택되는 1종 또는 2종의 작용기를 포함할 수 있다.
더욱이, 상기 링커는 펩토이드의 고체상 합성에서 안정적으로 반응하기 위해 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 Boc(tert-Butyloxycarbonyl)을 포함하는 보호기를 포함할 수 있다.
상기 펩토이드는 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균 활성을 가질 수 있고, 자세하게는, 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli)이고, 상기 그람 양성균은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)일 수 있다.
상술한 본 발명에 따르면, 본 발명의 광감작제-펩토이드 공액체(PsPC; Photosensitizer-peptoid conjugate)는 가시광선 영역대의 빛을 조사할 경우 체내 산소와 반응하여 일중항 산소 또는 자유라디칼을 생성하여 박테리아의 세포사멸 및 플라스미드 DNA의 절단을 유도하게 되어 광역학 치료에서 항균 활성 효과가 증대된다. 따라서, 본 발명의 광감작제-펩토이드 공액체는 대장균에 대하여 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체를 이용한 박테리아의 세포사멸 과정 및 DNA 절단 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 펩토이드를 제조하는 고체상 펩토이드 합성법(SPPS; Solid-phase peptoid synthesis)의 과정을 도시한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시 예 9 및 비교 예 5에 대한 UV-vis 흡수 스펙트럼이며, 내부에 삽입된 그래프는 475 nm 내지 715 nm 영역에서 나타난 4개의 Q-밴드의 UV-vis 흡수 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 실시 예 9(0.75 μM) 및 비교 예 5(0.50 μM; D2O, 20 ℃, λex = 405 nm)에 대한 형광 방출 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 실시 예 9(0.75 μM) 및 비교 예 5(0.5 μM; D2O, 20℃, λex = 425 nm)에 대한 인광 방출 스펙트럼이다.
도 6의 (a) 내지 (e)는 본 발명의 실시 예 9의 광감작제-펩토이드 공액체(PsPC)에 대하여 0 μM 내지 1.6 μM까지의 농도에 대한 유동 세포(FCM) 밀도 결과(530 nm vs. 670 nm)이며 (박테리아 세척단계 포함), (f) 내지 (j)는 세척 단계를 포함하지 않는 유동 세포(FCM) 밀도 결과이다.
도 7은 (a) 빛의 조사가 없는 경우 및 (b) 청색광 조사 하에 15분 배양한 경우에서, 실시 예 9, 비교 예 3 및 5을 적용한 pUC19 플라스미드 DNA의 겔 전기 영동 분석 결과이다.
표 1은 본 발명의 화학식 1 내지 4의 펩토이드 화학구조를 나타낸 것이다.
표 2는 본 발명의 제조 예 1 내지 4에서 제조한 펩토이드의 종류 및 일차 아민 치환 순서를 나타낸 것이다.
표 3은 본 발명의 제조 예 5 내지 9에서 제조한 광감작제의 종류 및 화학구조를 나타낸 것이다.
표 4는 본 발명의 실시예 1 내지 11 및 비교예 1 내지 5를 나타낸 것이다.
표 5는 본 발명의 실시 예 1 내지 11 및 비교 예 1 내지 5에서 제조한 광감작제-펩토이드 공액체에 대하여 그람 음성균인 E. coli ATCC 25922 균주에 처리한 광반응성 항균 활성을 확인한 결과이다.
표 6은 본 발명의 실시 예 1 내지 11 및 비교 예 1 내지 5에서 제조한 광감작제-펩토이드 공액체에 대하여 그람 양성균인 S. aureus ATCC 25923 균주에 처리한 광반응성 항균 활성을 확인한 결과이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1 내지 4 중 선택되는 어느 하나의 화학식을 가지는 펩토이드를 제공한다.
[화학식 1]
H-(NLys-Nspe-Nspe)4-NH2;
[화학식 2]
H-NLys-Npm-Npm-(NLys-Nspe-Nspe)2-NLys-Npm-Npm-NH2;
[화학식 3]
H-NLys-Npm-Nspe-(NLys-Npm-Npm)3-NH2; 및
[화학식 4]
H-(NLys-Npm-Npm)4-NH2.
본 발명에서 사용하는 용어 “펩토이드”란, N-alkylated glycine의 올리고머 형태를 갖는 펩타이드 유사체를 의미한다. 펩토이드는 치환기(R)가 아민에 붙어있으므로 카이랄 중심(chiral center)과 아미드 수소(amide hydrogen)가 없는 형태를 갖는다. 이러한 펩토이드는 펩타이드와는 달리 비자연성(unnatural)이기 때문에 단백질 분해 효소에 의해 쉽게 분해되지 않으므로 생체 내 안정성이 매우 뛰어나다. 따라서, 펩토이드는 생체 내에서 쉽게 분해되는 펩타이드의 단점을 극복할 수 있다.
또한, 펩토이드는 펩타이드와 마찬가지로 고체상(solid-phase) 합성법을 이용하여 손쉽게 합성이 가능하다. 아민기를 갖는 폴리머 비드(polymer beads)를 시작 물질로 하여 브로모아세틸화(bromoacetylation) 반응 및 아민 치환 반응의 두 단계의 반응을 여러번 반복함으로써 원하는 서열을 갖는 펩토이드를 얻을 수 있다. 상기 펩토이드는 카이랄(Nspe; (S)-(-)-1-phenylethylamine), 아카이랄(Npm; benzylamine) 및 양이온성(NLys(Boc); mono-Boc protected 1,4-butanediamine)의 세 가지 종류의 서브모노머들로 구성될 수 있다.
상기 화학식 1 내지 4의 펩토이드 화학구조를 하기 표 1에 나타내었다.
구분
[화학식]		 펩토이드 화학구조
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 4]
Figure pat00004
본 발명에서 사용하는 용어 “NLys”란, N-(4-aminobutyl)glycine을 의미한다. 상기 NLys는 하기 화학식 5의 구조를 가진다.
[화학식 5]
Figure pat00005
본 발명에서 사용하는 용어 “Npm”이란, N-(benzyl)glycine을 의미한다. 상기 Npm은 하기 화학식 6의 구조를 가진다.
[화학식 6]
Figure pat00006
본 발명에서 사용하는 용어 “Nspe”란, (S)-N-(1-phenylethyl)glycine을 의미한다. 상기 Nspe는 하기 화학식 7의 구조를 가진다.
[화학식 7]
Figure pat00007
본 발명의 펩토이드는 박테리아 세포막에 대하여 항균 활성을 가지는 최적의 펩토이드 나선형 구조를 파악하기 위해 일차 아민의 서열을 제어하여 펩토이드 나선 구조를 변화시켰다. 상기 화학식 1은 완전 나선형의 펩토이드, 상기 화학식 2는 중간 나선형의 펩토이드, 상기 화학식 3은 약한 나선형의 펩토이드, 마지막으로 상기 화학식 4는 비 나선형의 펩토이드의 나선구조를 가진다. 자세하게는, 대장균에 대하여 항균 활성을 가지는 최적의 나선형을 가지는 구조의 펩토이드로, 약한 나선형을 가지는 상기 화학식 3을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “광감작제(photosensitizer)”란, 빛에 예민한 반응을 보이는 물질로서, 상기 광감작제를 체내에 주입하면 외부에서 빛을 조사하였을 때 활성화되고, 산소와 화학반응하여 일중항 산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)이 생성된다. 상기 일중항 산소 또는 상기 자유 라디칼은 각종 병변 부위나 암세포 등의 세포사멸을 유도하여 파괴한다.
본 발명에서 사용하는 상기 광감작제는 포피린류(porphyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes) 중 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으며, 자세하게는 포피린류(porphyrins) 또는 클로린류(chlorins)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 광감작제는 카르복실산(carboxylic acid), 아민(amine) 등의 작용기를 가질 수 있고, 화학적으로 개질될 수 있다.
상기 광감작제는 TMPyP, TPP, HPPH, verteporfin 및 chlorin e6 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 링커는 글리신(glycine), 디글리신(diglycine), 폴리에틸렌 글리콜4(PEG4), 폴리에틸렌 글리콜8(PEG8) 및 6-아미노헥실(ahx; 6-aminohexyl) 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 링커는 카르복실산(carboxylic acid), 아민(amine) 및 히드록시기(hydroxyl group) 중 선택되는 1종 또는 2종의 작용기를 포함할 수 있다.
상기 링커는 펩토이드의 고체상 합성에서 안정적으로 반응하기 위해 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 Boc(tert-Butyloxycarbonyl)을 포함하는 보호기를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 링커는 상기 광감작제 및 상기 펩토이드를 연결하는 가교제로서 사용될 수 있다. 상기 링커는 상기 광감작제의 N-말단 위치와 공액 구조를 형성하고, 동시에 상기 펩토이드와 아미드 결합을 통해 접합되어 커플링 반응을 함으로써 광감작제-펩토이드 공액체를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 펩토이드, 상기 광감작제 및 상기 링커를 결합한 형태로 구성된 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체를 제공한다.
본 발명의 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체는 광감작제의 체내 독성을 최소화할 수 있음과 동시에 특정 레이저 파장에 의해 일중항 산소 또는 자유라디칼을 생성하여 박테리아의 세포사멸을 유도하여 광역학 치료의 효능을 최대화할 수 있는 효과를 갖는다.
본 발명에서 사용하는 용어 “항균”이란, 균에 저항하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이, 효모 등과 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “그람 양성균”이란, 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 결과, 크리스탈 바이올렛에 물들어 보라색으로 보이는 세균을 의미한다. 상기 그람 양성균의 세포벽은 80 내지 90% 정도가 펩티도글리칸(peptidoglycan)으로 구성되어 있으며, 상기 펩티도글리칸은 두꺼운 층을 이루어 세포벽의 크기와 형태를 유지하며, 세포벽을 단단하게 만드는 역할을 한다.
상기 그람 양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.) 또는 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.) 균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 그람 양성균은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 퀴놀론 내성 스타필로코커스 아우레우스(Quinolone-resistant Staphylococcus aureus, QRSA), 반코마이신 내성 엔테로코커스(vancomycin resistant enterococcus, VRE), 반코마이신 내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin intermediateresistant Staphylococcus aureus, VISA), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium) 또는 스타필로코커스 에피데르미스(Staphylococcus epidermidis) 일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 그람 양성균은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “그람 음성균”이란, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 결과, 크리스탈 바이올렛이 염색되지 않고 에탄올 세정에 의해 탈색되어 자주색을 띠는 세균을 의미한다. 그람 음성균의 세포벽은 비교적 얇고(10nm), 세포벽 외측에 지질다당류(lipopolysaccharide)를 가지고 있다.
상기 그람 음성균은 살모넬라 속(Salmonella sp.), 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.), 에스케리아 속(Escherichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 엔테로박터 속 (Enterobacter sp.) 또는 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.) 균일 수 있다.
구체적으로, 상기 그람 음성균은 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 에스케리아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae) 또는 크렙시엘라 아에로제네스(Klebsiella aerogenes)일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 그람 음성균은 에스케리아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있다.
본 발명의 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체는 그람 양성균 또는 그람 음성균에 대한 항균 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체는 대장균에 항균 활성을 갖는 물질을 개발하기 위해 광감작제, 링커 및 펩토이드의 종류를 변화시킨 광감작제-펩토이드 공액체를 합성하였다. 또한, 본 발명의 광감작제-펩토이드 공액체는 항균 활성이 우수하고 플라스미드 DNA가 제거되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체를 이용할 경우, 청색광 조사 하에 체내 산소와 반응하여 일중항 산소 또는 자유라디칼을 생성하여 박테리아의 세포사멸 및 플라스미드 DNA의 절단을 유도하게 되어 광역학 치료에서 항균 활성 효과가 증대되므로, 다중 표적을 가지는 항균 광역학 치료용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 상세하게 설명하고자 한다.
도 1은 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체를 이용한 박테리아의 세포사멸 과정 및 DNA 절단 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1을 참조하여, 본 발명의 다중 표적 항균작용을 갖는 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체를 이용한 항균활성의 기작을 살펴보고자 한다. 본 발명의 광감작제-펩토이드 공액체는 펩토이드, 광감작제 및 링커를 포함하는 화합물로 구성된다. 상기 펩토이드 나선형의 말단이 표적 박테리아의 세포막에 삽입되고, 특정 파장의 빛이 조사되면 산소와 광감작제가 반응하여 일중항 산소(1O2)를 생성하고, 매우 반응성이 큰 일중항 산소의 존재 하에 핵산을 포함한 박테리아의 여러 부위에 치명적인 손상을 주어 광 독성을 유발한다. 일반적으로는 광역학 치료를 통해 세포막 파괴에 한정된 활성을 보이는 한계점이 있지만, 본 발명의 다중 표적의 항균 활성을 위한 광감작제는 박테리아 세포막의 손상 및 DNA 절단 효과의 다중 표적 항균작용을 갖는다는 우수한 효과가 있다.
이와 같이 상기 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체에 대하여 그 구체적인 실시예를 살펴보면 다음과 같다.
Ⅰ. 광감작제-펩토이드 공액체의 제조
1. 펩토이드 제조
도 2는 본 발명의 펩토이드를 제조하는 고체상 펩토이드 합성법(SPPS; Solid-phase peptoid synthesis)의 과정을 도시한 모식도이다.
도 2를 참조하면, 아민기를 갖는 폴리머 비드(polymer beads)를 시작 물질로 하여 브로모아세틸화(bromoacetylation) 반응 및 아민 치환 반응의 두 단계의 반응을 여러 번 반복함으로써 원하는 서열을 갖는 펩토이드를 얻을 수 있다.
<제조예 1 내지 4: 펩토이드 1 내지 4의 제조>
펩토이드는 수지 비드상에서 고체상 서브모노머 프로토콜에 따른 합성법을 이용하며, 마이크로파로 가열하여 합성하였다. 마이크로파를 이용한 가열은 CEM MARS 230/60 마이크로파 반응 시스템(CEM corp.)을 사용하였다. 고분자 수지(0.25mmol, 0.48g)을 DMF 용매에서 20분 동안 팽윤시켰다. 고분자 수지에서 Fmoc 보호기를 제거하기 위해 20%(v/v) 피페리딘(piperidine)을 첨가한 DMF(Dimethylformamide) 용액으로 2회 처리했다.
브로모아세틸화를 위하여, 브로모아세트산(6.25mmol, 1.2M in DMF, 5.21mL) 및 N,N′-디이소프로필카보디이미드(DIC, 0.70g, 5.63mmol, 0.87mL)를 첨가하였다. 상기 반응 용액을 35℃의 마이크로파 오븐(최대 출력 300W, 램프 30초, 유지 1분)에서 교반 및 조사하고, 디클로로메탄 및 DMF를 이용하여 세척했다.
아민 치환반응을 위하여, 3.75 mL의 (S)-(-)-α-methylbenzylamine(Nspe, 3.75 mmol, 1.0 M in NMP), 3.75 mL의 benzylamine(Npm, 3.75 mmol, 1.0 M in NMP), 및 3.75 mL의 mono-Boc protected 1,4-diaminobutane(NLys(Boc), 3.75 mmol, 1.0 M in NMP)을 일차 아민으로 사용하였다. 상기 일차 아민을 브로모아세틸레이트 펩토이드에 첨가하여 아민 치환 반응을 진행하였다. 상기 세 가지 종류의 일차 아민들과 브로모아세틸레이트 펩토이드의 혼합물을 마이크로파 오븐(최대 출력 300W, 80℃, 램프 2분, 유지 90초)에서 교반하고, 디클로로메탄 및 DMF로 완전히 세척하였다. 상기 브로모아세틸화 반응 및 상기 아민 치환반응을 원하는 서열이 얻어질 때까지 반복하였다.
수지로부터 펩토이드의 분리는 트리플루오로아세트산(TFA)/디클로로메탄의 분리 용액으로 실온에서 30분 동안 수행하였다. 상기 분리 용액은 20μPE 프릿이 있는 고체상 추출(SPE; Solid-phase extraction) 카트리지에서 여과되었고, 휘발성 물질은 질소에 의해 제거된다. 정제되지 않은 펩토이드의 추가 정제 단계를 위해 50%(v/v)의 H2O/아세토니트릴(MeCN)에 용해시켰다.
상기 제조예 1 내지 4에서 제조한 펩토이드의 종류 및 일차 아민 치환 순서를 하기 표 2에 나타내었다.
구분 화학식
제조예 1 펩토이드 1 H-(NLys-Nspe-Nspe)4-NH2
제조예 2 펩토이드 2 H-NLys-Npm-Npm-(NLys-Nspe-Nspe)2-NLys-Npm-Npm-NH2
제조예 3 펩토이드 3 H-NLys-Npm-Nspe-(NLys-Npm-Npm)3-NH2
제조예 4 펩토이드 4 H-(NLys-Npm-Npm)4-NH2
2. 광감작제의 제조
본 발명의 광감작제로서 포피린류(porphyrins) 및 클로린류(chlorins)를 사용할 수 있다. 상기 광감작제들은 모두 가시광선 영역의 빛을 조사할 시, 활성화하여 일중항 산소 또는 자유 라디칼을 생성할 수 있다.
상기 포피린류의 광감작제로서, TMPyP(α,β,γ,δ-Tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl)porphyrin chloride) 또는 TPP(Tetraphenylporphyrin)을 사용할 수 있다. 상기 TMPyP는 양이온성 광감작제로, 펩토이드와 공액구조를 이룰 때 작용기로 카르복시산을 가지며, 상기 TPP는 소수성 광감작제로, 펩토이드와 공액구조를 이룰 때 작용기로 아민기를 가진다.
상기 클로린류의 광감작제로서, HPPH(2-(1-Hexyloxyethyl)-2-devinyl pyropheophorbide-a, 상품명 Photochlor®), Verterporfin(상품명 Visudyne®) 및 Chlorin e6을 사용할 수 있다. 상기 HPPH는 식도암을 포함한 여러 종양의 치료에 사용된 바 있고, 상기 Verterporfin은 노화 관련 황반 변성 및 리포좀 치료에 사용된 바 있다. 상기 Chlorin e6은 폴리비닐피롤리돈(PVP)으로 제형화 되었으며, chlorin e6-PVP(상품명 Photolon™)은 미토콘드리아와 리소자임에 국소화 후 악성 종양의 세포사멸을 유도할 수 있다. 상기 클로린류의 광감작제는 펩토이드와의 접합을 촉진하기 위해 N-하이드록시숙신이미드(NHS; N-Hydroxysuccinimide) 에스테르로 준비되었다.
<제조예 5: 광감작제 1(TMPyP)의 제조>
① TPyP-CO2Et(5-(1-(4-(Ethoxycarbonyl)butyl)pyridinium-4 -yl)- 10,15,20-tripyridylporphyrin)의 제조
5,10,15,20-Tetrapyridiylporphyrin(TPyP; 1.26g, 2.04mmol) 및 ethyl-5-bromovalerate(4.98g, 23.82mmol, 3.77mL)를 충전하고, CHCl3 에 25% (v/v) 에탄올을 용해시켜 400mL 용액을 제조하였다. 상기 용액을 6일 동안 환류시켰다. 정제되지 않은 생성물을 30%(v/v)의 에탄올/디클로로메탄(CH2Cl2)을 포함한 실리카 겔 칼럼을 이용하여 자주색 고체의 형태를 보이는 원하는 결과물의 TPyP-CO2Et을 수득하였다. 이때, 수율은 54%(0.82g) 이다.
② TMPyP-CO2H(5-(1-(4-(Carboxylic acid)butyl)pyridinium- 4-yl)-10,15,20-tris(1-methylpyridinium-4-yl) porphyrin)의 제조
상기 TPyP-CO2Et(0.32g, 0.43mmol)를 DMF 용매 24mL에 용해시킨다. 그 후, 아이오딘화 메틸 (Iodomethane; 2.08 g, 14.67 mmol, 0.91 mL)을 첨가하고, 이 혼합물을 42℃에서 4시간 교반한다. 교반한 용액을 감압여과한 후 잔여의 고체를 1.0M, 24mL의 HCl 수용액에 재용해시킨다. 재용해시킨 용액을 1시간 환류시킨다. 후속 정제과정으로, 가열된 용액을 실온으로 냉각시키고, 물 56mL로 희석했다. 이어서, 10%의 헥사 플루오로포스페이트 나트륨 용액을 첨가하여 원하는 생성물의 침전을 유도하였다. 현탁액을 원심분리(3000rpm, 5분)하고 남은 고체를 아세톤 80mL에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 아세톤 13mL의 10%(w/w) 테트라부틸암모늄 클로라이드로 처리하고, 원심분리(3000rpm, 5분)하여 생성물을 침전시켰다. 화합물을 메탄올/디에틸에테르(0.29g, 88%)로부터 재결정화하여 추가로 정제하여 TMPyP-CO2H를 수득하고, 광감작제 1을 제조하였다. 이때, 수율은 88%(0.29g) 이다.
<제조예 6: 광감작제 2(TPP)의 제조>
① TPP-NO2(5-(4-Nitrophenyl)-10,15,20-triphenylporphyrin)의 제조
50mL 둥근바닥플라스크에 5,10,15,20-tetraphenylporphyrin (TPP; 1.00 g, 1.63 mmol) 및 트리플루오로아세트산 (TFA) (25 mL)를 충전한 후, 10분간 교반하고, 아질산 나트륨(0.20g, 2.93mmol)을 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3분 동안 교반하고 차가운 물 300mL에 직접 부었다. 담금질을 위해 중탄산나트륨을 혼합물에 서서히 첨가하고 생성물을 디클로로메탄(CH2Cl2; 500mL)으로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 용매를 감압제거하여 생성물 TPP-NO2을 제조하였다. 이 때, 정량 수율은 1.08g이다.
② TPP-NH2(5-(4-Aminophenyl)-10,15,20-triphenylporphyrin)의 제조
1L 둥근바닥 플라스크에 상기 TPP-NO2(1.08g, 1.63mmol)을 채우고, 고체를 디클로로메탄(CH2Cl2; 250mL) 중 25%(v/v) 메탄올에 용해시켰다. 용액을 5% Pd/C(0.20g)로 처리하고 나트륨 보로 하이드라이드(0.62g, 16.30mmol)를 첨가하여 반응을 시작하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 물 500mL를 첨가하여 반응을 ??칭하고, 혼합믈을 셀라이트를 통해 여과하여 잔류 Pd/C를 제거하였다. 생성물을 디클로로메탄(300mL)로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조하고 용매를 감압 제거하였다. 40%(v/v) n-헥산/디클로로메탄을 포함하는 실리카겔 칼럼을 사용하여 정제를 수행하여 원하는 생성물의 자주색 고체인 TPP-NH2를 얻었다. 이 때, 두 단계를 수행한 후 수율은 43%(0.44g) 이다.
③ TPP-Ahx-NH2(5-(4-Carboxypentylaminophenyl)-10,15,20- triphenylporphyrin)의 제조
상기 TPP-NH2(29.5mg, 0.047mmol)을 디클로로메탄 7mL에 용해시켰다. 그 후, 용액을 Boc-6-aminohexyl-OH (21.7 mg, 0.094 mmol), EDC (18.0 mg, 0.094 mmol), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt; 12.7 mg, 0.094 mmol), 및 DIPEA (36.3 mg, 0.281 mmol, 0.05 mL)와 혼합하였다. 생성된 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고 물 50mL로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 감압하에 제거하였다. 20%(v/v) 에탄올/디클로로메탄을 포함하는 실리카겔 칼럼을 사용하여 정제를 수행하여 TPP-Ahx-NH-Boc(37mg, 93%)을 수득하였다. 상기 TPP-Ahx-NH-Boc를 1.8mL의 디클로로메탄에 용해시키고 Boc의 보호기를 제거(deprotection)하기 위해 트리플루오로아세트산(TFA) 0.2mL와 혼합하였으며, 혼합용액을 상온에서 15분간 교반하였다. 포화 중탄산 나트륨 수용액(10mL)을 첨가하여 반응을 ??칭하고, 생성물을 물 100mL로 세척하였다. 유기층을 디클로로메탄 100mL로 추출하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거하고 보라색 고체로 보이는 생성물의 TPP-Ahx-NH2을 수득하고, 광감작제 2를 제조하였다. 이 때, 수율은 90%(29.3mg) 이다.
<제조예 7: 광감작제 3(Chlorin-e6)의 제조>
① Chlorin-e6-DME(Chlorin-e6 173,152-dimethyl ester)의 제조
Chlorin-e6(100.0mg, 0.17mmol)을 메탄올 60mL 중의 5% 황산에 용해시키고 용액을 실온에서 밤새 교반하고, 차가운 포화 중탄산나트륨 용액 100mL을 첨가하여 ??칭하였다. 정제되지 않은 생성물은 디클로로메탄으로 추출하고, 6%(v/v) 메탄올/디클로로메탄을 포함하는 실리카겔 칼럼을 사용하여 정제하여 짙은 녹색 고체(103.6mg, 99%)의 Chlorin-e6-DME를 수득하였다. 이 때, 수율은 99%(103.6mg) 이다.
② Chlorin-e6-NHS ester의 제조
25mL 둥근바닥 플라스크에 N-hydroxysuccinimide (22.6 mg, 0.196 mmol), DCC (40.5 mg, 0.196 mmol), CH2Cl2 (4 mL), 및 Chlorin-e6-DME (48.7 mg, 0.078 mmol)를 충전하고, pyridine (15.5 mg, 0.196 mmol, 0.016 mL) 및 DMAP (0.5 mg, 5 mol%)을 첨가하여 반응을 시작하고, 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 정제되지 않은 생성물을 25%(v/v) 아세트산에틸/디클로로메탄을 갖는 실리카 겔 칼럼을 사용하여 정제하여 광감작제 3을 제조하였다. 이 때, 수율은 91%(51.4mg)이다.
<제조예 8: 광감작제 4(HPPH(photochlor))의 제조>
Chlorin-e6-DME 대신 photochlor(50.0mg, 0.078mmol)을 첨가한 것을 제외하고는 제조예 3과 동일한 방법으로 광감작제 4를 제조하였다. 이 때, 수율은 58%(33.7mg) 이다.
<제조예 9: 광감작제 5(verteporfin)의 제조>
Chlorin-e6-DME 대신 verteporfin(56.1mg, 0.078mmol)을 첨가한 것을 제외하고는 제조예 3과 동일한 방법으로 광감작제 5를 제조하였다. 이 때, 수율은 66%(22.9mg) 이다.
상기 제조예 5 내지 9에서 제조한 광감작제의 종류 및 화학구조를 하기 표 3에 표기하였다.
구분 종류 화학 구조
제조예 5 광감작제 1 TMPyP
Figure pat00008
제조예 6 광감작제 2 TPP
Figure pat00009
제조예 7 광감작제 3 Chlorin-e6
Figure pat00010
제조예 8 광감작제 4 HPPH
(photochlor)
Figure pat00011
제조예 9 광감작제 5 verteporfin
Figure pat00012
3. 펩토이드-링커의 커플링 반응
<제조예 10: 펩토이드 1-Gly 화합물 제조>
0.016mmol의 펩토이드 1을 3mL의 디메틸포름아미드(DMF) 용매에 20분간 현탁시킨 후, 용매를 제거하였다. 링커로서 Fmoc-Gly-OH (14.3mg, 0.048mmol)을 사용하고, DIPEA (16.5mg, 0.128mmol, 22μL), HATU (18.3mg, 0.048mmol) 및 DMF (1mL)을 혼합한 혼합물을 수지 함유 카트리지에 충전한 후, 상기 혼합물을 마이크로파 오븐에서 교반하였다(최대 전력 300W, 80℃, 램프 2분, 18분 유지). 그 후, 수지를 CH2Cl2 및 DMF로 완전히 세척 하였다. 수지 결합 펩토이드에 포함된 Fmoc 보호기를 제거하기 위해, DMF 용매에 포함된 20% (v/v) 피페리딘(piperidine)을 카트리지에 첨가한 후, 마이크로파 오븐에서 교반하였다(최대 전력 300W, 75℃, 램프 2분, 2분 유지). 그 후, 수지를 디클로로메탄 및 DMF로 세척하여 펩토이드 1-Gly 화합물을 제조하였다.
<제조예 11: 펩토이드 1-PEG4 화합물 제조>
링커로서 Fmoc-Gly-OH 대신 Fmoc-N-amido-dPEG®4-acid (23.4mg, 0.048mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 제조예 10과 동일한 방법으로 펩토이드 1-PEG4 화합물을 제조하였다.
<제조예 12: 펩토이드 1-PEG8 화합물 제조>
링커로서 Fmoc-Gly-OH 대신 Fmoc-N-amido-dPEG®8-acid (23.4mg, 0.048mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 제조예 10과 동일한 방법으로 펩토이드 1-PEG8 화합물을 제조하였다.
<제조예 13: 펩토이드 2-Gly 화합물 제조>
펩토이드 1을 대신하여 펩토이드 2를 사용한 것을 제외하고는 제조예 10과 동일한 방법으로 펩토이드 2-Gly 화합물을 제조하였다.
<제조예 14: 펩토이드 3-Gly 화합물 제조>
펩토이드 1을 대신하여 펩토이드 3를 사용한 것을 제외하고는 제조예 10과 동일한 방법으로 펩토이드 3-Gly 화합물을 제조하였다.
<제조예 15: 펩토이드 4-Gly 화합물 제조>
펩토이드 1을 대신하여 펩토이드 4를 사용한 것을 제외하고는 제조예 10과 동일한 방법으로 펩토이드 4-Gly 화합물을 제조하였다.
<제조예 16: 펩토이드 3-PEG4 화합물 제조>
펩토이드 1을 대신하여 펩토이드 4를 사용하고, 링커로서 Fmoc-Gly-OH 대신 Fmoc-N-amido-dPEG®4-acid (23.4mg, 0.048mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 제조예 10과 동일한 방법으로 펩토이드 3-PEG4 화합물을 제조하였다.
4. 광감작제-링커-펩토이드 공액체 제조
<실시예 1: TMPyP-Gly-펩토이드 1 공액체의 제조>
제조예 10의 펩토이드 1-Gly 화합물(0.016mmol)을 3mL의 디메틸포름아미드(DMF) 용매에 20분간 현탁시킨 후, 용매를 제거했다. 광감작제의 접합을 위해, 수지 함유 카트리지에 36.7mg의 TMPyP-CO2H(0.048mmol), 8.6mg의 하이드록시벤조트리아졸(HOBt; 1-hydroxybenzotriazole) (0.064mmol), 10μL의 N,N’-디이소프로필카보디이미드(DIC)(8.1mg, 0.064mmol), 22μL의 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(16.5mg, 0.128mmol) 및 1mL의 디메틸포름아미드(DMF)를 충전하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 수지를 디클로로메탄 및 DMF로 완전히 세척하여 TMPyP-Gly-펩토이드 1의 공액체를 제조하였다.
<실시예 2: TPP-Gly-펩토이드 1 공액체의 제조>
수지가 결합된 펩토이드 (0.016mmol)를 3mL의 디메틸포름아미드(DMF) 용매에 20분간 현탁시킨 후, 용매를 제거했다. 7.8mg의 카보닐디이미다졸(0.048mmol) 및 1mL의 디메틸포름아미드(DMF)를 수지 함유 카트리지에 채우고, 혼합물을 마이크로파 오븐에서 교반 하였다(최대 전력 300W , 95℃, 램프 2분, 90초 유지). 그 후, 수지를 CH2Cl2 및 DMF로 완전히 세척하였다. 광감작제의 접합을 위해, TPP-Ahx-NH2 (35.6 mg, 0.048 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA) (6.2 mg, 0.048 mmol, 8 μL) 및 DMF (1 mL)의 혼합물을 수지와 혼합하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 디클로로메탄 및 DMF로 완전히 세척하여 TPP-Gly-펩토이드 1 공액체를 제조하였다.
<실시예 3: HPPH-Gly-펩토이드 1 공액체의 제조>
수지가 결합된 펩토이드 (0.016mmol)를 3mL의 디메틸포름아미드(DMF) 용매에 20분간 현탁시킨 후, 용매를 제거했다. 수지를 3mL의 CH2Cl2 및 0.1 mL의 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)에 다시 현탁시켜 컨디셔닝을 2분간 진행한 후, 용매를 제거하였다. 그 후, 3mL의 CH2Cl2(15mM)에 포함된 HPPS-NHS ester 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)(7.4mg, 0.057mmol, 10μL)를 수지 함유 카트리지에 채웠다. 상기 혼합물을 밤새 실온에서 교반 하여 커플링 반응을 진행하였다. 수지를 디클로로메탄 및 DMF로 완전히 세척하여 HPPH-Gly-펩토이드 1 공액체를 제조하였다.
<실시예 4: verteporfin-Gly-펩토이드 1 공액체의 제조>
HPPS-NHS ester를 사용하는 대신 verteporfin-NHS ester를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3와 동일한 방법으로 verteporfin-Gly-펩토이드 1 공액체를 제조하였다.
<실시예 5: chlorin e6-Gly-펩토이드 1 공액체의 제조>
HPPS-NHS ester를 사용하는 대신 chlorin e6-NHS ester를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3와 동일한 방법으로 chlorin e6-Gly-펩토이드 1 공액체를 제조하였다.
<실시예 6: TMPyP-PEG4-펩토이드 1 공액체의 제조>
제조예 10의 펩토이드 1-Gly 화합물 대신 제조예 11의 펩토이드 1-PEG4 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 TMPyP-PEG4-펩토이드 1 공액체를 제조하였다.
<실시예 7: TMPyP-PEG8-펩토이드 1 공액체의 제조>
제조예 10의 펩토이드 1-Gly 화합물 대신 제조예 12의 펩토이드 1-PEG8 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 TMPyP-PEG8-펩토이드 1 공액체를 제조하였다.
<실시예 8: TMPyP-Gly-펩토이드 2 공액체의 제조>
제조예 10의 펩토이드 1-Gly 화합물 대신 제조예 13의 펩토이드 2-Gly 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 TMPyP-Gly-펩토이드 2 공액체를 제조하였다.
<실시예 9: TMPyP-Gly-펩토이드 3 공액체의 제조>
제조예 10의 펩토이드 1-Gly 화합물 대신 제조예 14의 펩토이드 3-Gly 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 TMPyP-Gly-펩토이드 3 공액체를 제조하였다.
<실시예 10: TMPyP-Gly-펩토이드 4 공액체의 제조>
제조예 10의 펩토이드 1-Gly 화합물 대신 제조예 15의 펩토이드 4-Gly 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 TMPyP-Gly-펩토이드 4 공액체를 제조하였다.
<실시예 11: TMPyP-PEG4-펩토이드 3 공액체의 제조>
제조예 10의 펩토이드 1-Gly 화합물 대신 제조예 16의 펩토이드 3-PEG4 화합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 TMPyP-PEG4-펩토이드 3 공액체를 제조하였다.
<비교예 1: 펩토이드 1>
제조예 1에서 제조한 펩토이드 1을 사용하였다.
<비교예 2: 펩토이드 2>
제조예 2에서 제조한 펩토이드 2을 사용하였다.
<비교예 3: 펩토이드 3>
제조예 3에서 제조한 펩토이드 3을 사용하였다.
<비교예 4: 펩토이드 4>
제조예 4에서 제조한 펩토이드 4을 사용하였다.
<비교예 5: 광감작제 TMPyP>
제조예 5에서 제조한 광감작제 1(TMPyP)을 사용하였다.
본 발명에서 사용한 상기 실시예 1 내지 11 및 상기 비교예 1 내지 5를 하기의 표 4에 정리하였다.
구성
광감작제 링커 펩토이드
실시예 1 TMPyP Gly 1
실시예 2 TPP Gly 1
실시예 3 HPPH Gly 1
실시예 4 verteporfin Gly 1
실시예 5 chlorin e6 Gly 1
실시예 6 TMPyP PEG4 1
실시예 7 TMPyP PEG8 1
실시예 8 TMPyP Gly 2
실시예 9 TMPyP Gly 3
실시예 10 TMPyP Gly 4
실시예 11 TMPyP PEG4 3
비교예 1 - - 1
비교예 2 - - 2
비교예 3 - - 3
비교예 4 - - 4
비교예 5 TMPyP - -
5. 박테리아 광반응성 항균 활성 분석
제조된 광감작제-펩토이드 공액체들(PsPCs)에 대하여 광반응성 항균 활성을 측정하기 위해, 그람 음성균 E. coli ATCC 25922 또는 그람 양성균 S. aureus ATCC 25923 균주에 처리하여 최소저해농도(MIC; Minimum inhibitory concentration) 및 최소살균농도(MBC; minimal bactericidal concentration)를 측정하였다.
본 발명의 분석 결과에서 사용하는 용어 “최소저해농도(MIC)”란, 항균력을 측정하는 가장 기초적인 지표로, 시험관 내 세균 감수성 검사(in vitro sensitivity test)에서 미생물의 번식을 억제할 수 있는 항균제의 최저농도로 정의한다. 즉, 최소저해농도(MIC)는 세균의 가시적인 성장을 방지하는 화학물질의 최소 농도를 의미한다. 또한, 본 발명의 분석 결과에서 사용하는 용어 “최소살균농도(MBC)”란, 병원균의 양을 적어도 99.9% 이상 감소시키는 항생물질의 최소 농도로 정의한다. 즉, 최소살균농도(MBC)는 세균을 사멸시키는 항균제의 최소 농도를 의미한다.
각 화합물의 최소저해농도(MIC) 분석을 위해, E. coli 또는 S. aureus의 일차 배양물을 37℃의 인큐베이션 Mueller Hinton Broth 2(MHB2, 양이온 조절) 배지에서 밤새 배양시켰다. 다음날, 2차 배양으로 3 내지 4시간 성장시키고, 브로스 희석 분석을 사용하여 측정되었다. 실험에 사용된 박테리아는 성장 정지 단계의 배양액에서 수집되었다. 폴리 프로필렌 96-well plates(corning, corning NY, USA)를 사용하여 100μL의 (2-5)x105 CFU·mL-1 박테리아를 각 화합물에 대해 3중으로 첨가했다. 각 화합물은 2배 연속 희석하여 6가지 다른 농도로 분석되었다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 주변 광을 차단하고 37℃에서 2시간 두었다. 어둠 속에서 배양한 후, 현탁액을 세척 없이 빛에 직접 노출하거나 원심 분리하여 잔여 화합물을 세척하였다. 세척을 위해 상기 혼합물을 10,000G 3분 조건에서 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 세포를 1mL의 MHB2 배치에 재현탁하고, 이 단계를 세 번 반복하였다.
빛 조사를 위해, 박테리아 샘플의 분취량을 96-well plates(100μL/well)로 옮기고, 수제 LED 어레이에서 방출되는 청색광(420nm, 16.8mW·cm-2)을 이용하여 15분간 조사하였다. 광강도는 광학 센서(OP-2 UV, Coherent)가 있는 조도계(FieldMax-II, Coherent, Santa Clara, CA, USA)로 측정되었다. 빛 조사 후, 마이크로 플레이트 리더 (BioTek Instrument, Winooski, VT, USA)에서 600nm에서 OD 값을 측정하여 최소저해농도(MIC) 데이터를 기록하였다.
최소살균농도(MBC) 값을 측정하기 위해, 최소저해농도(MIC) 분석 후 플레이트에 남아있는 모든 박테리아 용액을 각 한천 플레이트에 스프레드한 후, 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하여 박테리아를 성장시켰다. 최소살균농도(MBC) 값은 한천 플레이트에서 박테리아 성장을 방지하는데 필요한 최소 농도로 측정되었다. 콜로니 카운트 분석을 위해, 각 화합물로 처리된 박테리아 현탁액을 MHB2 배지에서 10배 연속 희석하고, 적절한 희석액(100μL)의 분취량을 MHB2 한천에 스프레드하고, 이 단계를 세 번 반복하였다.
6. 유동 세포 계측법(FCM; Flow cytometry analysis)
유동 세포 계측법(FCM; Flow cytometry analysis)이란, 단일 유체 흐름에 존재하는 대량의 세포 및 기타 미소 입자들에 대한 다중 특성을 신속하게 분석하기 위한 기술이다. 본 발명에서는 유동 세포 계측법(FCM)을 통해 손상되지 않은 세포 수(ICC; intact cell count)를 측정하여 세포막의 손상을 평가하였다.
SYBR Green I(SGI, invitrogen, Carlsbad, CA, USA)은 핵산을 착색시키는데 사용되는 비대칭 사이아닌 염색약이며, 청색광을 흡수하여 녹색광을 방출하므로 DNA를 시각화하기 위해 사용한다. 상기 SGI는 DMSO 용매로 100배 희석하여 준비한다. 작업표준용액은 SGI 및 SGI/프로피듐 아이오다이드(PI; propidium iodide)의 혼합물로서, 0.6mM의 최종 PI 농도에서의SGI 및 30mM PI를 혼합하여 준비하였고, 사용 전까지 -20℃에서 보관되었다. 샘플(1mL)은 10μL·mL-1에서 SGI 또는 SGI/PI로 염색하고 36℃에서 12분 동안 암실에서 배양하였다. FCM 분석 전, 샘플을 0.2μm 주사기 필터 (Whatman, Sigma-Aldrich)를 통해 여과 한 오토 클레이브 물로 초기 농도의 1% 또는 10% (v/v)로 희석했다. FCM 분석은 488nm 청색 레이저가 장착된 CyFlow® Cube 6 유동 세포 분석기(Sysmex Korea)를 사용하여 수행되었다.
7. 겔 전기 영동 분석(Gel electrophoresis analysis)
겔 전기 영동 분석은 물질의 구조에 따라 아가로스 겔 내의 이동 속도가 달라지므로, 전기 영동 중 밴드가 나타내는 고유의 위치를 통해 분석 물질의 구조를 파악하는 분석방법이다. 각각 상이한 빛 조사 조건으로 처리된 pUC19 플라스미드(1μg·mL-1)를 겔 전기 영동 방법으로 분석하여 슈퍼코일, 선형화 또는 개방형 원형 형성 등의 플라스미드 DNA에 대한 구조적 변화를 평가하였다. 기준 샘플로서, 선형화된 pUC19를 준비하였다. Ⅱ형 제한 효소인 EcoRI(NEB, USA)을 포함한 플라스미드를 1시간 동안 배양한 후, 65℃에서 20분 동안 효소를 비활성화하였다. 빛 조사 이후, 샘플과 1kb DNA ladder(Enzynomics, Daejeon, South Korea)를 0.8%의 아가로스 겔에 4V·cm-2 35분 조건으로 로드하였다. DNA와 결합하는 성질이 강한 브로민화 에티듐(EtBr; Ethidium bromide) 염색에 의해 밴드가 시각화되었고, 겔 이미지는 UV transilluminator(Universal mutation detection system, UVP, Upland, CA, USA)에서 얻었다.
Ⅱ. 광감작제-펩토이드 공액체(PsPC)의 분석 결과
1. 펩토이드의 광반응성 항균 활성 확인
MIC(μM) MBC(μM)
dark light light
실시예 1 12.5 12.5 12.5
실시예 2 >25 >25 >25
실시예 3 >25 >25 >25
실시예 4 >25 >25 >25
실시예 5 >25 >25 >25
실시예 6 6.3 6.3 6.3
실시예 7 12.5 12.5 12.5
실시예 8 6.3 6.3 6.3
실시예 9 6.3 1.6 1.6
실시예 10 6.3 3.1 3.1
실시예 11 3.1 3.1 3.1
비교예 1 3.1 3.1 3.1
비교예 2 6.3 6.3 6.3
비교예 3 12.5 12.5 6.3
비교예 4 12.5 12.5 12.5
비교예 5 >25 >25 >25
표 5는 실시예 1 내지 11 및 비교예 1 내지 5에서 제조한 광감작제-펩토이드 공액체에 대하여 그람 음성균인 E. coli ATCC 25922 균주에 처리한 광반응성 항균 활성을 확인한 결과이다.
표 5를 참고하면, 실시예 1 내지 5에서 나타나는 양이온성 광감작제인 TMPyP을 사용하여 MIC 및 MBC 값을 측정한 결과, 어둡거나 밝은 조건 모두 항균 활성에 효과적임이 확인되었다. 양이온성 광감작제인 TMPyP를 포함한 광감작제-펩토이드 공액체를 사용한 실시예 1의 MIC 및 MBC 값은 12.5μM으로 낮은 반면, 중성 광감작제들을 사용한 실시예 2 내지 5의 값들은 25μM보다 큰 결과를 확인할 수 있다. 그 이유는, 펩토이드의 항균작용 기작을 고려할 때 설명될 수 있다. 펩토이드 나선형의 말단이 박테리아의 인지질 막에 삽입될 때, 비교적 부피가 큰 중성 감광작제들은 표면이 음의 전하를 가진 박테리아 막 및 펩토이드와의 정전기적 상호작용을 물리적으로 방해하는 역할로 작용한다. 그러나, 4개의 영구적인 양의 전하를 가진 광감작제인 TMPyP는 표면이 음의 전하를 가진 박테리아 막과 더 나은 정전기적 상호 작용을 가질 수 있어, 광감작제-펩토이드 공액체의 항균 활성을 증가시키는 것으로 판단된다. 즉, 양이온성 광감작제인 TMPyP를 포함한 광감작제-펩토이드 공액체는 그람 음성균 E. coli ATCC 25922에 대하여 광반응성 항균 활성에 효과적임이 확인되었다.
한편, 실시예 1, 6 및 7에서 나타낸 바와 같이, 링커의 종류를 변화하는 것은 광반응성 항균 활성의 증가를 유도하지 않는 결과가 확인된다. 다만, 실시예 6에서 PEG4를 포함하는 친수성 사슬을 도입하여 광감작제 TMPyP와 펩토이드 1 간의 상호작용에 기인한 항균 활성이 증가하였다. 그러나, 더 큰 수화 반경이 유도되는 PEG8을 사용할 시 효과가 감소하는 것으로 나타났다. 즉, 광감작제-펩토이드 공액체에서 링커의 종류를 변화하는 것은 광반응성 항균 활성의 증가를 유도하지 않는다.
다른 한편, 실시 예 1, 8, 9 및 10에서 나타난 바와 같이, 펩토이드의 종류를 변화한 실시 예에서는 광반응성 항균 활성의 변화가 확인된다. 실시 예 1, 8, 9 및 10은 순서대로 펩토이드 1 내지 4를 사용한 광감작제-펩토이드 공액체이다. 펩토이드 2 내지 4를 사용한 실시 예 8 내지 10은 6.3μM에서 항균 활성을 보였으며, 이는 펩토이드 1을 사용한 실시 예 1보다 향상된 광반응성 항균 활성을 나타내는 것이다. 이는 펩토이드 나선형의 변화에 대해 박테리아 세포막 고정 또는 침투를 유도하는 형태적 조절의 결과인 것으로 파악되고 있다.
특히, 펩토이드 3을 적용한 실시 예 9의 경우, 광 조사 후 MIC 및 MBC의 값이 1.6μM이고, 펩토이드 4를 적용한 실시예 10의 경우 3.1μM을 나타낸다. 즉, 펩토이드 3 및 4를 사용한 광감작제-펩토이드 공액체의 경우, 다른 종류의 펩토이드를 사용한 경우보다 월등히 향상된 광반응성 항균 활성을 나타내는 것이 확인된다. 펩토이드 1은 완전 나선형의 펩토이드, 펩토이드 2는 중간 나선형의 펩토이드, 펩토이드 3은 약한 나선형의 펩토이드, 및 펩토이드 4는 비 나선형의 펩토이드의 나선 구조를 가지고 있다. 따라서, 약한 나선형의 펩토이드 3을 포함하는 광감작제-펩토이드 공액체는 그람 음성균 E. coli ATCC 25922에 대하여 광반응성 항균 활성에 효과적임이 확인된다.
반면, 비교 예 5에서 나타난 바와 같이, 광감작제-펩토이드 공액체를 형성하지 않은 경우로서 광감작제 단독으로 사용하는 경우에서는, 일중항 산소가 생성됨에도 불구하고 MIC 및 MBC 값이 높은 수준으로 측정되어 항균 활성 특성이 나타나지 않음을 확인할 수 있다.
MIC(μM) MBC(μM)
dark light light
실시예 1 6.3 6.3 6.3
실시예 2 >25 >25 >25
실시예 3 >25 >25 >25
실시예 4 >25 >25 >25
실시예 5 >25 >25 >25
실시예 6 3.1 6.3 6.3
실시예 7 6.3 6.3 12.5
실시예 8 6.3 6.3 12.5
실시예 9 6.3 6.3 6.3
실시예 10 12.5 6.3 25
실시예 11 nd nd nd
비교예 1 1.6 1.6 3.1
비교예 2 3.1 3.1 12.5
비교예 3 6.3 6.3 12.5
비교예 4 6.3 6.3 25
비교예 5 >25 >25 >25
표 6은 실시예 1 내지 11 및 비교예 1 내지 5에서 제조한 광감작제-펩토이드 공액체에 대하여 그람 양성균인 S. aureus ATCC 25923 균주에 처리한 광반응성 항균 활성을 확인한 결과이다. 상기 표 6의 용어 “nd”는 not determined의 약어로서, 계측하지 않았거나 혹은 계측하지 못할 정도로 작거나 큰 수치를 나타냄을 뜻한다.
표 6를 참고하면, 실시 예1 내지 11로 사용된 광감작제-펩토이드 공액체는 그람 양성균인 S. aureus ATCC 25923에 대하여는 향상된 광반응성 항균 활성을 나타내지 못함을 확인하였다. 따라서, 이후의 분석들에는 그람 음성균 E. coli ATCC 25922에 대하여 실시하였다.
도 3은 실시 예 9 및 비교 예 5에 대한 UV-vis 흡수 스펙트럼이며, 내부에 삽입된 그래프는 475nm 내지 715nm 영역에서 나타난 4개의 Q-밴드의 UV-vis 흡수 스펙트럼이다.
도 3을 참고하면, 광감작제-펩토이드 공액체를 포함하는 실시 예 9에 대한 흡수 스펙트럼과, 포피린류의 광감작제를 단독으로 사용한 비교 예 5와 비교할 때, UV-vis 흡수 스펙트럼의 피크가 변하지 않음을 확인된다. 즉, 광감작제인 포피린의 독특한 특징으로 나타나는 427 nm 파장의 Soret 밴드 및 고유한 4개의 Q-band(480 nm 내지 700 nm)를 실시 예 9 및 비교 예 5에서 동시에 확인하였으므로, 실시 예 9는 광감작제로서 포피린의 광 흡수 특성과 유사한 특성을 가진다고 판단할 수 있다.
도 4는 실시 예 9(0.75μM) 및 비교 예 5(0.50μM; D2O, 20 ℃, λex = 405nm)에 대한 형광 방출 스펙트럼이다.
도 4를 참고하면, 실시 예 9의 형광 방출 스펙트럼은 661nm 및 723nm에서 피크가 있는 두 개의 언덕으로 명확히 구분된다. 반면, 비교 예 5의 스펙트럼은 721nm에서 단일 피크를 형성한다. 즉, 실시 예 9의 광감작제-펩토이드 공액체는 TMPyP의 분자 내 전자 전달 경로를 조정하여 다른 형광 특성을 가진 새로운 광감작제 복합체를 형성하는 것으로 유추할 수 있다.
도 5는 실시 예 9(0.75μM) 및 비교 예 5(0.5μM; D2O, 20℃, λex = 425nm)에 대한 인광 방출 스펙트럼이다.
도 5를 참고하면, 인광 방출 스펙트럼에서 일중항 산소의 생성을 확인할 수 있다. 실시 예 9 및 비교 예 5는 모두 1275nm 파장 부근에서 일중항 산소의 복사 이완(radiative relaxation)의 특징적인 방출을 나타낸다(a1Δg → X3Σg -). 즉, 실시 예 9의 광감작제-펩토이드 공액체는 비교 예 5와 유사하게 일중항 산소를 생성하는 특징을 가짐을 확인하였다.
도 6의 (a) 내지 (e)는 실시 예 9의 광감작제-펩토이드 공액체(PsPC)에 대하여 0 μM 내지 1.6 μM까지의 농도에 대한 유동 세포(FCM) 밀도 결과(530nm vs. 670nm)이며 (박테리아 세척단계 포함), (f) 내지 (j)는 박테리아 세척단계를 포함하지 않는 유동 세포(FCM) 밀도 결과이다.
도 6을 참조하면, SGI/PI 염색 조건 하에서 손상되지 않은 세포 수(ICC; intact cell count)를 측정 및 시각화하여 세포막의 손상을 평가하였다. 각각의 그래프에서, 다각형 외부에 위치한 세포는 멤브레인이 손상된 세포를 뜻한다. 즉, 손상되지 않은 세포 수(ICC; intact cell count)를 측정하는 것은 다각형 내부에 위치한 세포의 수를 측정하는 것을 의미한다. 박테리아 세척단계를 포함하는 도 6의 (a) 내지 (e)의 결과에서, 실시 예 9를 적용한 광감작제-펩토이드 공액체(PsPC)의 농도가 증가함에 따라 ICC는 감소함을 보였다. 마찬가지로, 세척 단계를 포함하지 않는 도 6의 (f) 내지 (j)의 결과에서도, 그렇지 않은 경우와 유사한 양상이 확인된다. 다만, 세척 단계를 추가로 포함할 시, 0.16 μM 혹은 0.8 μM 농도에서 ICC의 감소량이 둔화된 것으로 보아, 실시 예 9를 적용한 PsPC가 멤브레인과 약한 결합으로 존재하는 것으로 파악할 수 있다. 결론적으로, 실시 예 9의 광감작제-펩토이드 공액체(PsPC) 농도가 증가함에 따라 멤브레인 근처의 일중항 산소 증가에서 비롯된 박테리아 세포막 손상이 증가함을 확인하였다.
도 7은 (a) 빛의 조사가 없는 경우 및 (b) 청색광 조사 하에 15분 배양한 경우에서, 실시 예 9, 비교 예 3 및 5을 적용한 pUC19 플라스미드 DNA의 겔 전기 영동 분석 결과이다. 도 7의 첫 번째 열(M)은 표준 DNA ladder이고, 마지막 열은 EcoRI의 제한 효소로 처리된 pUC19이다.
도 7을 참조하면, 실시 예 9, 비교 예 3 및 5를 적용할 시 항생제 내성의 주요 형태 중 하나를 유발할 수 있는 플라스미드 DNA(즉, pUC19)에 영향을 미치는 광감작제-펩토이드 공액체의 효과를 나타낸다. 겔 전기 영동 분석은 물질의 구조에 따라 아가로스 겔 내의 이동 속도가 달라지므로, 전기 영동 중 밴드가 나타내는 고유의 위치를 통해 분석 물질의 구조를 파악할 수 있다. 상기 도 7의 pUC19 열에서 나타난 것과 같이, 원본의 플라스미드 DNA인 pUC19는 2kb보다 낮은 밴드를 나타내기에, 슈퍼코일형(supercoiled form)을 가짐을 알 수 있다. 또한, 마지막 열에서 나타난 것과 같이, EcoRI의 제한 효소로 처리된 플라스미드 DNA는 알려진 선형화된 길이(2686 bp)를 보여주는 밴드가 3kb 근처에 나타나기에, 선형(linear form)을 가짐을 알 수 있다. 또한, 포피린류의 광감작제를 단독으로 포함한 비교 예 5 열에서, 플라스미드 DNA는 광반응성 손상을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 펩토이드 3을 단독으로 포함한 비교 예 3 열에서, 빛의 조사 유무에 관계없이 슈퍼코일형의 DNA 구조가 유지됨을 확인하였다.
한편, 포피린류의 광감작제 및 펩토이드 3을 모두 포함한 실시 예 9 열에서는 청색광 처리 후 pUC19 밴드 소실을 나타내었으며, 이를 통해 완전히 DNA의 단편화가 이루어졌음을 확인하였다. 즉, 광감작제-펩토이드 공액체의 실시 예 3은 양으로 하전된 포피린류 광감작제(TMPyP)가 음으로 하전된 DNA에 삽입되어 박테리아 세포막 뿐만 아니라 DNA의 광 반응성 손상을 유도할 수 있다. 결론적으로, 유세포 분석 및 겔 전기 영동실험으로, 가시광선의 빛 조사 시 박테리아 세포막의 손상 및 DNA의 절단을 확인하였다.
상술한 본 발명에 따르면, 본 발명의 광감작제-펩토이드 공액체는 가시광선 영역대의 빛을 조사할 경우 체내 산소와 반응하여 일중항 산소를 생성하여 박테리아의 세포사멸 및 플라스미드 DNA의 절단을 유도하게 되어 광역학 치료에서 다중 표적을 가지는 항균 활성 효과가 증대된다.

Claims (15)

  1. 빛에 반응하여 일중항 산소를 생성하는 광감작제;
    상기 광감작제를 박테리아에 선택적으로 접근시키는 펩토이드; 및
    상기 광감작제와 공액 구조를 형성하고, 동시에 상기 펩토이드와 아미드 결합을 통해 결합되는 가교제로 사용된 링커;를 포함하고,
    박테리아 세포막의 손상 및 DNA 절단 효과의 다중 표적 항균작용을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩토이드는 하기 화학식 1 내지 4 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체;
    [화학식 1]
    H-(NLys-Nspe-Nspe)4-NH2;
    [화학식 2]
    H-NLys-Npm-Npm-(NLys-Nspe-Nspe)2-NLys-Npm-Npm-NH2;
    [화학식 3]
    H-NLys-Npm-Nspe-(NLys-Npm-Npm)3-NH2; 및
    [화학식 4]
    H-(NLys-Npm-Npm)4-NH2;이고,
    상기 화학식 1 내지 4에서, NLys는 N-(4-aminobutyl)glycine, Nspe는 (S)-N-(1-phenylethyl)glycine, 및 Npm은 N-(benzyl)glycine 이다.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 광감작제는 포피린류(porphyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 광감작제는 포피린류(phophyrins) 또는 클로린류(chlorins)인 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 광감작제는 TMPyP, TPP, HPPH, verteporfin 및 chlorin e6 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 광감작제는 가시광선 영역의 파장(380nm 내지 780nm)의 빛에 반응하는 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 광감작제는 청색 파장(400nm 내지 500nm)의 빛에 반응하는 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 글리신(glycine), 디글리신(diglycine), 폴리에틸렌 글리콜4(PEG4), 폴리에틸렌 글리콜8(PEG8) 및 6-아미노헥실(ahx; 6-aminohexyl) 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 링커는 카르복실산(carboxylic acid), 아민(amine) 및 히드록시기(hydroxyl group) 중 선택되는 1종 또는 2종의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 링커는 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 Boc(tert-Butyloxycarbonyl)을 포함하는 보호기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 펩토이드는 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 그람 음성균은 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 에스케리아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 크렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae) 또는 크렙시엘라 아에로제네스(Klebsiella aerogenes)인 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 그람 음성균은 에스케리아 콜라이(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 그람 양성균은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA), 퀴놀론 내성 스타필로코커스 아우레우스(Quinolone-resistant Staphylococcus aureus, QRSA), 반코마이신 내성 엔테로코커스(vancomycin resistant enterococcus, VRE), 반코마이신 내성 스타필로코커스 아우레우스(vancomycin intermediateresistant Staphylococcus aureus, VISA), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium) 또는 스타필로코커스 에피데르미스(Staphylococcus epidermidis) 인 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 그람 양성균은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항균 광역학 치료용 광감작제-펩토이드 공액체.
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