KR20220120517A - 타겟 핵산의 라만 검출을 위한 핵산 기반 자가조립 복합체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 타겟 핵산의 라만 검출을 위한 핵산 기반 자가조립 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가진, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체; 및 액상에서 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체를 통해 타겟 핵산을 라만 신호와 같은 광신호로 검출하는 방법을 제공하다.
본 발명은 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가진, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체; 및 액상에서 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체를 통해 타겟 핵산을 라만 신호와 같은 광신호로 검출하는 방법을 제공하다.
Description
본 발명은 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가진, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체; 및 액상에서 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체를 통해 타겟 핵산을 라만 신호와 같은 광신호로 검출하는 방법에 관한 것이다.
자가조립(self-assembly)은 각각의 성분들이 자발적으로 비공유 결합에 의해 일정한 구조를 이루는 것이다. 분자적 수준의 자가조립은 자발적인 결합에 의해 안정적이고 규칙적인 구조를 갖도록 하는 단위체(building block)을 디자인하는 것을 말한다. 생물 시스템에서도 자가조립 현상을 찾아볼 수 있는데, 뉴클레오티드, 단백질, 지방 등의 분자들을 building block으로 한 actin filament, 바이러스, 크로마틴 등의 자가조립 복합체들이 대표적이다. 자가조립은 일반적인 화학반응과는 반응 진행성과 상호작용에서 다른 특성을 보인다. 침전과 같은 화학 반응과 다른 특성을 갖는데, 일반 화학반응은 무질서도가 높아지는 방향으로 반응이 진행되지만, 자가조립의 경우에는 자발적으로 특정방향으로 정형화된 형태로 반응이 일어난다. 또한 자가조립은 공유결합과 같이 강한 결합에 의해서가 아니라 수소결합, 이온결합, van der Waals 결합 등 비교적 약한 결합들의 집합적 작용에 의해 안정된 구조를 형성하는 특성을 갖는다. 또한 자가조립의 대표적인 예로 block copolymer, DNA 기반 구조체, lipid bilayer, 콜로이드 등의 다양한 형태를 갖는 복합체가 있다.
분자 생물학에서 사용되고 있는 혼성화 또는 교합 프로브(hybrid probe)는 방사성 또는 형광 표지될 수 있는 다양한 길이(일반적으로 20-100개의 염기쌍이 이루는 길이)의 DNA 또는 RNA 단편으로, 프로브의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 물질(타겟 핵산)의 존재를 검출하기 위해 DNA 또는 RNA 함유 검체(sample)에서 사용할 수 있다. 따라서 프로브와 타겟 핵산 사이의 상보성으로 인해 프로브-타겟 염기 쌍을 허용하는 염기서열을 갖는 단일 가닥 핵산(DNA 또는 RNA)에 프로브가 교합한다. 일반적으로, 먼저 (가열 또는 수산화나트륨 노출과 같은 알칼리성 조건 하에서) 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 변성된 다음, 멤브레인 또는 제자리(in situ)에 고정된 타겟 ssDNA(Southern blotting) 또는 RNA(northern blotting)에 표지된 프로브가 혼성화된다. 프로브의 표적 서열에 대한 혼성화를 검출하기 위해 프로브는 방사성 분자 또는 형광 분자의 분자 마커로 태그(또는 "표지")된다. 일반적으로 사용되는 마커는 32P(프로브 DNA의 포스포디에스테르 결합에 통합된 인의 방사성 동위원소) 또는 비방사성 항체 기반 마커인 디곡시제닌(digoxigenin)이다. 프로브와 중간 내지 높은 서열 유사성을 갖는 DNA 서열 또는 RNA 전사체는 자가방사선촬영 또는 기타 영상 기술을 통해 혼성화된 프로브를 시각화함으로써 검출된다. 일반적으로 필터의 X선 사진을 찍거나 필터를 자외선 아래에 놓는다. 중간 또는 높은 유사성을 갖는 서열의 검출은 혼성화 조건이 얼마나 엄격하게 적용되었는지에 달려 있다. 높은 혼성화 온도 및 혼성화 완충액의 낮은 염과 같은 높은 엄격성은 매우 유사한 핵산 서열 간의 혼성화만을 허용하는 반면, 저온 및 고염과 같은 낮은 엄격성 조건은 서열이 덜 유사해도 핵산 서열 간의 혼성화를 허용한다. DNA 마이크로어레이에 사용되는 혼성화 프로브는 코팅된 유리 슬라이드 또는 유전자 칩과 같은 불활성 표면에 공유결합으로 부착된 DNA를 말하며 이동성 cDNA 표적이 혼성화된다.
라만 분광법(Raman Spectroscopy)이란, 레이저광과 같은 단파장의 입사광을 쬐었을 때 입사된 빛의 일부가 분자의 편극성(polarizability)을 변화시키면, 변화된 편극성의 진동수와 분자내 진동수 간의 공명이 일어나는 현상인 라만 효과(Raman effect)에서 분자 고유의 산란 진동수를 측정하는 분광법이다. 라만 분광법은, 측정 대상 시료에 직접 입사광을 조사하는 방법으로 측정이 용이하고, 극미량의 시료도 측정이 가능하며, 수분과 이산화탄소의 간섭이 없고 Visible 영역에서도 사용이 가능하다. 따라서, 라만 분광법은 주로 Visible 레이저를 이용하여 분자에 의해 라만 산란되는 빛을 검출한다.
도 7에 도시된 바와 같이, 산란의 종류(Scattering)로, 입사광과 산란광의 진동수의 변화가 없는 Rayleigh산란; 입사광이 원자와의 충돌로 에너지를 잃고 진동수가 감소하는 Stokes산란; 및 입사광이 원자와의 충돌로 에너지를 얻어 진동수가 증가하는 Anti-Stokes산란이 있다. 산란되는 빛 중에서 원래의 입사광 에너지보다 적거나 많은 에너지를 가지는 빛의 산란을 라만 산란(Raman Scattering)이라 한다. 진동에너지를 직접적으로 측정할 수 없으나, 레일리 산란과 비교하여 에너지를 잃었는지 얻었는지를 관찰할 수 있다.
즉, 라만 분광법은, 단일 파장을 갖는 강력한 빛을 물질에 조사하였을 때 대부분은 탄성 산란(Elastic scattering)을 하게 되지만 빛의 일부가 분자의 공명에 이용되어 다른 진동수를 가지고 산란하게 되는 비탄성산란(Inelastic scattering: 라만 산란) 현상인 라만 효과를 이용하여, 분자의 화학적인 구성과 구조를 분석하는 방법이다. 라만 산란되었을 때 탄성 산란에 비해 쉬프트(shift)된 정도를 라만 쉬프트(Raman shift)라고 하며, 이를 스펙트라(spectra)로 표현하여 매질의 특성을 표현할 수 있다(도 9).
라만 분광법을 이용하면 분자의 유도 편극률 변화가 있는 비극성 분자의 경우에도 신호를 얻을 수 있고, 실제 거의 모든 유기 분자들은 고유의 라만 쉬프트 (Raman Shift, cm-1)를 가지고 있다. 따라서, 라만 방출 스펙트럼의 파장은 시료 내의 광 흡수 분자의 화학 조성 및 구조 특성을 나타내므로, 이러한 라만 산란 신호를 분석하면 분석 대상 물질을 직접적으로 분석할 수 있다.
라만 분광법은, 시료 전처리가 간단하고, 미량의 시료도 측정이 용이하며, 신속하게 측정할 수 있고, 측정 시간(1 ~ 60초)이 짧아 실시간 수준의 분석이 가능하다. 또한, 수분과 이산화탄소의 간섭이 없고 가시광 영역에서도 사용이 가능하다. 따라서, 라만 분광법은 주로 가시광 레이저를 이용하여 분자에 의해 산란되는 빛을 검출한다. 또한, 물 분자에 의한 간섭의 영향을 받지 않으므로, 지질, 단백질, 유전자 등의 생체분자(biomolecules)의 검출에 더욱 적합하다. 또한, 측정 시 물에 의한 간섭이 적으므로, 인간 포함 동물에서 추출한 시료(혈액, 소변, 콧물, 점액 등), 배양액 혹은 환경시료 추출액 등의 액체 시료 그대로 측정이 가능하다.
라만 분광법은 예컨대, 단백질, 지질, 핵산 등의 세포 구성물질을 조사할 수 있으며, 구성물질의 특성에 따라 라만 쉬프트 400~3200 cm-1 구간에서 각각 다른 신호의 세기를 라만 스펙트라(spectra)로 결과값이 표현될 수 있다. 일반적으로 형광에 의한 배경 영향이 가장 적은 파장의 레이저(예: 532nm, 633nm, 785nm)를 사용한다.
532 nm 레이저에 공명(resonance)을 보이는 화학 결합 및 세포 구성물질의 라만 쉬프트 정보는 표 1에 예시되어 있다.
또한, C-C, C-N와 같은 화학 결합과 DNA, 아미노산 등 다양한 구성물질의 특성을 확인할 수 있다.
그러나, 분석 대상 물질을 직접적으로 분석할 수 있다는 이점에도 불구하고, 라만 산란의 신호 세기가 매우 약해, 검출을 위해 고가의 장비를 필요로 하며 신호의 재현성이 낮다. 이러한 문제를 극복할 수 있는 방법 중의 하나로 표면 증강 라만 산란이 보고되었다.
Au와 Ag는 다른 금속들에 비해 높은 자유전자 밀도를 가지고 있고, 상대적으로 이온화 경향성이 낮은 편이어서 매우 안정적이다. 또한 높은 자유전자 밀도는 금속 유전율의 실수부를 음수로 만들고 금속이 큰 편극률을 갖게 하여, 강한 전기장 증강을 유발한다. 그리고 허수부의 경우, 에너지 손실인 빛의 흡수 정도를 가리키므로 효율적인 증강을 위해선 값이 작아야만 한다.
따라서, Au의 경우에는 가시광선 영역 중 약 630 nm에서 비교적 낮은 유전율의 실수부 값을 갖으면서 가장 낮은 허수부 값을 갖는다. Ag의 경우에는 유전율의 실수부와 허수부를 동시에 고려하였을 때, 약 530 nm에서 효율적인 증강을 할 수 있는 값을 갖게 된다.
표면 플라즈몬(도 8)이란 Ag와 Au 같은 0보다 작은 유전율을 갖는 금속과 그 금속이 속해 있는 0보다 큰 유전율을 갖는 유전체의 계면을 따라 전파하는 자유 전자들의 집단적인 진동 현상을 말한다. 이때, 금속에 입사하는 전자기장(일반적으로 가시광선)의 진동수와 표면 플라즈몬의 진동수가 일치하여 공명이 일어나 입사파보다 더욱 증강된 크기를 가지는 현상을 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)이라 일컫는다. 그리고 SPR은 계면으로부터 멀어질수록 기하급수적으로(exponentially) 감소하는 소멸파(evanescent wave) 형태를 갖는다. 이러한 SPR은 (a) 얇은 금속 평면에서 일어나는 전파형 플라즈몬과 (b) 금속나노입자에서 발생하는 국부적 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance, LSPR) 이 있다 (도 8).
표면 증강 라만 분광법(surface enhanced raman spectroscopy, SERS)은 '은이나 금 등의 금속 나노입자의 표면'에 조사된 빛이 물질 표면의 플라즈몬 공명을 일으켜 라만 산란 신호를 증폭시키는 원리를 이용한다. 즉, 금속 나노구조의 주변에 표적 분자가 존재할 경우, 해당 분자의 라만 산란 신호가 크게 증가하는 현상을 이용한 것이다. 표면 증강 라만 산란 분석의 장점 중 하나는 일반적인 라만 분석으로는 얻기 힘든 정보를 제공할 수 있다는 것이다.
표면 증강 라만 분광법(SERS)는 작은 라만 산란 단면적(Raman scattering cross-section)으로 인해 비교적 검출하기 힘든 라만 산란 신호를 증폭시키기 위해 도입될 수 있다. 은(Ag)이나 금(Au)과 같은 금속 나노입자를 이용함으로써, 금속 나노입자와 입사하는 빛의 상호 작용에 의해 나노입자 표면에 흡착된 분자의 라만 산란 신호를 증폭시켜 검출할 수 있다.
이때, 신호의 증폭 정도는 금속 나노입자의 모양 및 크기 그리고 금속 종류에 따라 변하며, 이와 더불어 입사하는 빛의 각도와 파장 그리고 편광에도 영향을 받게 된다. 이처럼 다양한 요인들이 통제가능한 경우, 단일 분자의 라만 산란 신호까지 SERS로 확인할 수 있다.
표면 증강 라만 분광법의 경우, 낮은 검출강도와 미량의 시료만으로도 검출이 가능하다는 특징은 바이오 센서 응용에 있어서 매우 매력적인 부분이다. 또한, 기존의 형광분석기술과는 달리 시료에 대한 화학적 구조에 대한 정보를 좁은 너비의 스펙트럼으로 제공하며, 분자들마다 고유의 라만 산란 신호(라만 쉬프트 값)를 가지고 있기 때문에 동시에 다중 검출이 가능하다. 이러한 표면증강 라만 분광법이 가지고 있는 특징을 활용하여, 바이오 물질(DNA, 단백질, 세포 등) 검출연구 및 질병 진단 소자로 구현한 연구들이 활발히 보고되고 있다.
유전체 검출법은 대부분 형광 신호 또는 형광 이미지를 이용한다. 형광 이미지 신호는 색상과 신호 세기로 확인하기에 형광 물질이 일정 수준 이상 있지 않으면 신호 세기가 강해지는 데에 한계가 있다. 또한, 형광 물질의 종류가 다르더라도 발현되는 색상의 가지 수에 한계(3~5종)가 있어 검출 물질의 구분에 제약이 많다. 이러한 형광 신호의 한계로 인해 나노 크기의 작은 유전체를 형광 신호로 검출하는데 물질을 증폭하는 방식을 사용하며, 이러한 목표 형광을 검출하는 장비(NGS, 마이크로어레이 등)는 대부분 매우 비싸고 정밀하며 운용의 전문성이 필요하다.
바이러스 검출에 주로 쓰이는 기술인 RT-PCR은 비교적 비용은 저렴하나 일반적으로 유전체 증폭에 쓰이는 장비로써 검출 조건이 까다롭고 (예: 미량이라도 오염시에는 타겟이 아닌 물질이 증폭되어 검사 결과에 오류를 가져올 수도 있음), 시간이 오래 걸리며(약 2~3시간 소요), 실험의 숙련도(임상병리사 중에서도 숙련도가 높지 않으면 검사 결과에 오류가 생김)가 필요하다. RT-PCR의 경우 항원, 항체 검사법보다는 정확도가 높으나 유전자 검사를 2회 이상 실시, 검체 채취법 교육, 시약 비교 평가 등의 보완이 필요하는 등 더 복잡하고 시간이 오래 소요된다.
따라서, 유전체 분자 진단법이더라도 RT-PCR와 달리, 간편한 현장 진단 기술이면서도 정량 검출이 필요하므로, 라만 산란 신호를 이용한 체외 분자진단 기술개발이 절실히 필요하다.
한편, 고감도 DNA 분석과 더불어 SERS 센서를 이용하여 다양한 질병과 관련된 유전자, 단백질(바이오 마커)의 조기 진단을 수행하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 라만 분광법은 다른 분석법(적외선 분광법)과는 달리 여러 가지 장점을 가지고 있다. 적외선 분광법은 분자의 쌍극자 모멘트의 변화가 있는 분자의 경우 강한 신호를 얻을 수 있는 반면, 라만 분광법은 분자의 유도 편극률 변화가 있는 비극성 분자의 경우에도 강한 신호를 얻을 수 있으므로, 거의 모든 유기 분자들이 고유의 라만 쉬프트(Raman Shift, cm-1)을 가지고 있다. 또한 물 분자에 의한 간섭의 영향을 받지 않으므로, 단백질, 유전자 등의 생체분자(biomolecules)의 검출에 더욱 적합하다.
이와 같이, 라만 산란 신호는 분자 수준에서 종류별로 검출하기에 가장 적합한 광신호이나, 액상에서는 라만 산란 신호가 불안정하고 미약하여 신호를 증폭할 수 있는 나노 구조체가 필요하다. 또한, 기존에 라만 산란 신호 증폭에 사용되는 방법으로는 크게 표면 증강(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS), 팁 증강(Tip Enhanced Raman Scattering, TERS) 등이 있으나, 주로 건조(Dry) 시료에서 신호 증폭이 되므로 액체 시료에는 안정적으로 적용할 수 없다는 단점이 있다.
한편, 바이오센서는 사람의 건강과 삶의 질, 생명과도 연결되어 있기 때문에 단순히 센서의 감도를 높이는 노력만이 아니라 정확도를 높이고자 하는 노력이 함께 되어야 한다. 센서의 감도가 높아지게 되면 동시에 비특이적 신호를 받아들이는 감도도 높아지게 된다. 따라서, 잘못된 결과를 송출하는 경우가 생길 수 있다. 이로 인해 약물을 남용, 불필요한 치료와 같은 부작용을 낳을 수 있기 때문에 센서를 개발할 때 가장 우선적으로 고려해야 할 것이다.
본 발명은 (1) 센서의 감도가 높아지게 되면 동시에 비특이적 신호를 받아들이는 감도도 높아지는 문제점 및 (2) 정확하게 구조적으로 정의되어 있는 나노 물질 합성 및 제어의 어려움을 우회설계(design around)하면서, (3) 국부적 표면 플라즈몬 공명 현상(LSPR)을 통해 광 신호가 증강될 수 있는 나노 구조체 형성 및 (4) 이로부터 유래되는 광 신호를 재현성 있게 확보하고자 한다.
이를 위해, 본 발명은 타겟 핵산 검출 시약의 주성분으로, 타겟 핵산 존재 여부에 따라 S/N ratio (signal to noise ratio)를 증강시켜 타겟 핵산 정량 해상도를 높일 수 있는 핵산 기반 자가조립 복합체를 설계하고자 한 것이다.
또한, 본 발명은 광조사시 액상에서는 불안정하고 미약한 라만 산란 신호와 같은 광 신호를 재현성 있게 증폭할 수 있도록, 액체 시료에서 구조적으로 안정적인 핵산 기반 자가조립 복합체를 설계하고자 한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 표면 플라즈몬 공명 현상(전자기적 효과)을 발생 및 더욱 강화시키기 위한 금속나노입자 기반 구조체 상의 나노갭 형성시, 금속 나노입자들에 의해 수 나노미터 간격으로 균일한 나노갭을 재현성 있게 제공하도록 미리 합성된 금속 나노입자만을 사용함으로써, 새로운 핵산 기반 자가조립 복합체 설계를 통해 이러한 2개의 금속나노입자 사이에 정확하게 구조적으로 정의되어 있는 나노갭을 형성시키고, 라만 산란 신호를 증폭시키는 국부적 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance, LSPR)을 발휘할 수 있는 나노갭에 라만 표지자(Raman indicator)를 위치시킴으로써, 증강된 라만 산란 신호를 재현성 있게 확보하기 위해 측정하고자 하는 타겟 핵산의 존재 여부에 역으로 연동하여 나노갭 형성 여부가 결정되는 on/off 신호 체계의 센서 역할을 수행할 수 있고 이로인해 타겟 핵산의 정량분석이 가능하도록, 타겟 핵산의 라만 검출을 위한 핵산 기반 자가조립 복합체를 제공하고자 한다.
표면 증강 라만 분광법(SERS)에서 라만 산란 신호의 증폭 정도는 스펙트럼을 측정할 때 사용되는 빛의 파장, 편광 방향에 따른 증강효율의 변화 등으로 인해 재현성 및 신뢰성 측면에서 해결해야할 문제가 많으며, 이러한 문제점을 해결하는 핵산 기반 자가조립 복합체를 새롭게 설계하고 타겟 핵산 검출 센서로서 기능을 분석한 결과, 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가진다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 제1양태는 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가진, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체에 있어서,
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체로서,
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, 선택적으로(optionally) (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이 되도록 설계된 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체를 제공한다.
본 발명의 제2양태는 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 타겟 핵산 검출 시약에 있어서,
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되는 핵산 기반 자가조립 복합체가, 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 형성되지 않거나 해체되는 경우 변화하는 광학적 신호를 측정할 수 있게 설계되어 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출 시약을 제공한다.
본 발명의 제3양태는 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 방법에 있어서,
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체 사이의 자가조립에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체가, 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 형성되지 않거나 해체되는 경우 광학적 신호의 변화값을 측정할 수 있게 설계되어 있는 타겟 핵산 검출 시약을 준비하는 제1단계;
핵산 함유 액상 시료에서 제1단계의 (a) 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체 함유 타겟 핵산 검출 시약과의 교합 반응(hybridization)을 수행하는 제2단계;
제2단계의 교합 반응 전, 후 및/또는 동시에 액상 시료내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호를 측정하는 제3단계; 및
제3단계에서 측정되는 광학적 신호 또는 이의 변화값을 분석하는 알고리즘을 통해 시료 내 타겟 핵산의 검출 및/또는 정량 데이터를 제공하는 제4단계
를 포함하는 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명은 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가진, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체를 제공하는 것이 특징이다. 이를 위해, 본 발명은 최소 10개 염기쌍의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되게 핵산 기반 자가조립 복합체를 설계함으로써, 액체내 브라운 운동을 하더라도 구조적 안정성을 가져 측정 도중 재현성 있는 광학적 신호를 연속적으로 제공할 수 있다.
이러한 본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체는 (a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체로서,
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, 바람직하게는 (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이 되도록 설계된 것이 특징이다.
도 1 및 도 2에 예시된 핵산 기반 자가조립 복합체들 중 NEW 구조체는, (a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되는 것으로, 이때 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상(전자기적 효과)을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이며, (iii) 제2 뉴클레오티드에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)를 상기 나노갭에 위치시킴으로써 광 조사시 검출하는 라만 산란 신호를 증강시키도록 설계된 것이다.
놀랍게도, 브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정 및 시각화하는 나노입자 트래킹 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 통해, 타겟 핵산 검출 시약에서 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 농도를 측정할 수 있을 뿐만아니라, 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체) 내 인접한 2개의 금속 나노입자들이 브라운 운동을 한다는 것을 동영상으로 발견하였다(도 4). 이때, 사용한 나노입자 트래킹 분석기(NTA)는, (1) 입자별 광 산란(particle-by-particle light scattering)을 사용하여 나노입자 추적 분석 후 나노입자 샘플에 대한 고해상도 입자 크기 정보를 제공하며, (2) 용액에서 나노입자의 속도 또는 확산은 산란되는 빛의 지점에서 기록되고, (3) 각 입자 광 산란 지점은 데이터 세트에 포함하기 위해 소프트웨어로 식별하며, (4) 더 작은 나노입자는 더 큰 입자보다 브라운 운동에 의해 더 빨리 움직이고 더 적은 빛을 산란시키는 것을 이용하고, (5) 나노 입자에서 산란된 빛을 수집하여 시각적으로 존재를 확인할 수 있어 시각적 확인 및 결과 검증을 가능하게 하는 장치이다.
나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 통해, 인접한 2개의 금속 나노입자들이 브라운 운동을 하는 동영상과 타겟 핵산 검출 시약에서 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 농도를 측정할 수 있다는 사실은, (a) 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체가 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 경우 금속 나노입자 측면에서 삼량체 이상의 다량체가 아닌 이량체 형성 제어가 가능하는 것을 전제로 하는 것이다. 또한, 이로부터 본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)는 브라운 운동을 하더라도 산란광과 같은 광신호를 재현성 있게 연속적으로 제공할 수 있다는 것을 시사한다.
또한, 놀랍게도 타겟 핵산 검출 시약에서 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)는 액체내 브라운 운동을 하더라도 광조사시 측정 도중 재현성 있는 라만 산란 신호를 연속적으로 제공할 수 있다는 것을 발견하였다(도 3). 이로부터, 수 나노미터 간격으로 균일한 나노갭을 재현성 있게 제공하도록 (i) 미리 균일하게 합성된 금속 나노입자만을 사용하고 (ii) 최소 10개 염기쌍의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되게 핵산 기반 자가조립 복합체를 설계하는 경우, 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)에 의해 제공되는 나노갭은 액체내 브라운 운동을 하더라도 측정 도중 재현성 있게 증강된 광학적 신호를 연속적으로 제공할 수 있는 구조적 안정성을 가진다는 것을 시사한다.
요컨대, 본 발명자는 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 및 이와 상보적인 제2 뉴클레오티드 사이 분자적 수준의 자발적인 비공유 결합, 즉 최소 10개 염기쌍의 상보적인 수소결합에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체는 액체내 브라운 운동을 하더라도 측정 도중 재현성 있는 광학적 신호(예, 산란광)를 연속적으로 제공할 수 있는 구조적 안정성을 가진다는 것을 발견하였으며, 본 발명은 이에 기초한 것이다.
따라서, 본 발명은 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가진, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체뿐만 아니라, 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체에서 포착되는 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 방법 및 타겟 핵산 검출 시약을 제공한다.
이때, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 및 타겟 핵산 검출 시약은 적어도 (a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체를 구비한다.
본 발명에 따른 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 및 타겟 핵산 검출 시약은 핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, 바람직하게는 (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이 되도록 설계된 것이다.
예컨대, 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드는 (i) 조건에 따라 타겟 핵산의 일부 서열과 교합하는 핵산 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe), (ii) 활동 자유도를 높여 10 bp 이상의 상보적인 수소결합을 도와주는 스페이서 및 (iii) 제1금속 나노입자에 부착하는 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)를 포함하고;
제1 뉴클레오티드와 10 bp 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드는 (i) 제1 뉴클레오티드의 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 상보적인 핵산 서열을 가진 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher), (ii) 활동 자유도를 높여 10 bp 이상의 상보적인 수소결합을 도와주는 스페이서 및 (iii) 제2금속 나노입자에 부착하는 제2-2 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)를 포함할 수 있다.
추가적으로, 제2 뉴클레오티드는 라만 시프트 값을 알고 있는 라만 표지자(Raman indicator)를 (i) 제1 뉴클레오티드의 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 상보적인 핵산 서열을 가진 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher) 와 (ii) 스페이서 사이에 연결시킨 것이거나(도 2(A)); 또는
제1 뉴클레오티드는 라만 시프트 값을 알고 있는 라만 표지자(Raman indicator)를 (i) 타겟 핵산의 일부 서열과 교합하는 핵산 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 (ii) 스페이서 사이에 연결시킨 것(도 2(B))일 수 있다.
금속 나노입자에 부착하는 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)는 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드 각각을 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 붙이기 위한 접착자로서의 역할을 수행하는 것이다. poly-adenine (2~30mer)일 수 있고, 예컨대 10mer 일 수 있다.
제1금속 나노입자 및/또는 제2금속 나노입자로 금 나노입자를 사용하는 경우, 금 나노입자와 유기분자인 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)가 안정적으로 결합할 수 있어, 높은 염농도, 높은 온도, 장시간 보관 조건 등에서도 안정한 성능을 나타낸다.
스페이서(spacer)는 제1 뉴클레오티드의 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe) 및 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)의 활동 자유도를 높여 10 bp 이상의 상보적인 교합(hybridization)이 잘 일어날 수 있도록 도와주는 - 베어링 경첩과 같은 - 역할을 하는 것으로, 길이 조정 및 배향을 용이하게 하기 위해 (CH2)n (n= 3 ~ 20) 일 수 있으며, 예컨대 (CH2)12일 수 있다.
본 발명의 타겟 핵산 검출 시약은 본 발명에 따른 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체를 함유하거나 형성하는 것일 수 있다. 농도, 저장 안정성 등 품질 보증을 위해, 본 발명에 따라 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 타겟 핵산 검출 시약은 핵산 기반 자가조립 복합체를 기지의 농도로 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 및 타겟 핵산 검출 시약은 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않거나 해체되는 경우 광학적 신호의 변화값을 측정할 수 있게 설계된 것이 특징이다(도 1, 도 2, 도 5 및 도 6).
따라서, 본 발명의 타겟 핵산 검출 시약을 사용하여, 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체에서 포착되는 재현성 있는 광학적 신호로 핵산 기반 자가조립 복합체 형성여부 및/또는 형성정도(정량)를 확인할 수 있으면, 상기 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않도록 또는 해체되도록 제1 뉴클레오티드와 교합(hybridization)하는 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있다.
본 발명에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 및 이와 상보적인 제2 뉴클레오티드 사이 분자적 수준의 자발적인 수소결합에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체의 개수는 타겟 핵산의 개수와 반대로 연동되는 함수관계에 있다(도 1, 도 5 및 도 6). 즉, (i) 시료내 타겟 핵산이 부존재 또는 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최소치 (핵산 기반 자가조립 복합체 함유 또는 형성 타겟 핵산 검출 시약의 검출 범위의 최소치) 이하로 존재할 때, 서로 상보적인 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 자가조립에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체의 개수는 최대치이고, (ii) 시료내 타겟 핵산이 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최대치 이상으로 존재할 때, 서로 상보적인 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 자가조립에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체의 개수는 최소치이다(도 5).
이때, 제1 뉴클레오티드와의 교합반응에서 타겟 핵산과 경쟁하는 제2 올리고 뉴클레오티드에 기지(already-known)의 광신호를 발휘하는 표지자(indicator)를 연결하면, 핵산 기반 자가조립 복합체 형성 여부/개수/농도를 표지자(indicator)의 광신호로 확인(정량)할 수 있다(도 1 및 도 6). 또한, 나노입자에 연결된 제1 뉴클레오티드와의 교합반응에서 타겟 핵산과 경쟁하는 제2 올리고 뉴클레오티드를 또다른 나노입자에 연결하면, 브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정 및 시각화하는 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 통해, 타겟 핵산 검출 시약에서 핵산 기반 자가조립 복합체 형성 여부/개수/농도를 측정할 수 있다(도 2(C) 및 도 3).
또한, 본 발명은 서로 상보적인 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되어 안정적이고 규칙적인 구조를 형성하는 핵산 기반 자가조립 복합체 설계시, 액체내 브라운 운동을 하도록, 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상을 제1금속 나노입자에, 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상을 제2금속 나노입자에 연결시키는 것이 특징이다.
본 명세서에서, 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자는 금속 소재가 아니라도 액체내 브라운 운동하면서 산란광 신호를 발휘하는 한 본 발명의 범주에 속한다.
즉, 본 발명은 분자적 수준의 자발적인 비공유 결합에 의해 안정적이고 규칙적인 구조를 갖도록 하는 자가조립 단위체로,
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체를 설계하여 제공한다.
이때, 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드가 연결된 제1 나노입자 및/또는 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 연결된 제2 나노입자가 국부적 표면 플라즈몬 공명 현상(LSPR)을 발휘하는 금속 나노입자인 경우, 광 조사시 금속 나노입자 표면의 플라즈몬 공명을 유도해 강한 전자기장 증강을 통한 광 신호를 증폭시킬 수 있다.
따라서, 핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (iii) 제1 뉴클레오티드 또는 제2 뉴클레오티드에 기지의 광신호를 발휘하는 표지자(indicator) 연결시 금속 나노입자로부터 3nm 이하의 거리 내 표지자(label, indicator)가 배치되도록 핵산 기반 자가조립 복합체가 설계되는 경우, 핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 표지자에서 나오는 광신호를 증폭시켜, 최종적으로 타겟 핵산 정량 해상도를 높일 수 있다(도 6). 예컨대, 타겟 핵산 검출 시약에서 최대 형성가능한 핵산 기반 자가조립 복합체 농도를 조절하여(예, 101 개/ml, 102 개/ml, 103 개/ml, 104 개/ml 등) 타겟 핵산 검출 시약 별로 타겟 핵산 정량 구간을 설정할 수 있으므로 진단시 맞춤형 한계 정량 (quantitative threshold)를 적용할 수 있다.
나아가, 본 발명은 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체의 광학적 신호로 핵산 기반 자가조립 복합체 형성여부 및/또는 형성정도(정량)를 확인하는 것이 특징이다.
이를 위해 본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체는 (a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체가 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되는 핵산 기반 자가조립 복합체일 수 있다.
제1 뉴클레오티드가 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 제2 뉴클레오티드가 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체는 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합에 의해 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하므로, (1) 브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정 및 시각화하는 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 통해, 액체내에서 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 측정할 수 있고, (2) 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드 프로브(probe)에 대해 제2 뉴클레오티드는 타겟 핵산과 경쟁하므로, 핵산 기반 자가조립 복합체의 개수는 타겟 핵산의 개수와 반대로 연동되는 함수관계에 있다. 즉, 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 이용하여 타겟 핵산을 정량할 수 있다.
또한, (a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체 사이 분자적 수준의 자발적인 수소결합에 의해 자가조립되는 핵산 기반 자가조립 복합체는 액체내 브라운 운동을 하더라도 측정 도중 재현성 있는 광학적 신호를 연속적으로 제공할 수 있는 구조적 안정성을 가지는 나노갭을 형성시킬 수 있다. 따라서, 핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (iii) 제1 뉴클레오티드 또는 제2 뉴클레오티드에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)를 상기 나노갭에 위치시킴으로써 광 조사시 라만 표지자 유래 라만 산란 신호를 증강시키도록 설계하는 경우, S/N ratio (signal to noise ratio)를 증강시켜 핵산 기반 자가조립 복합체 형성 여부/개수/농도를 확인(정량)할 수 있으며, 이로부터 타겟 핵산의 존재 여부/개수/농도를 확인(정량)할 때 타겟 핵산 정량 해상도를 높일 수 있다.
예컨대, 도 1에 도시된 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명 현상(전자기적 효과)을 발생 및 더욱 강화시키기 위해 금속 나노입자들을 적용한 핵산 기반 자가조립 복합체 상의 나노갭 형성시, 금속 나노입자들에 의해 수 나노미터 간격으로 균일한 나노갭을 재현성 있게 제공하도록 미리 균일하게 합성된 금속 나노입자만을 사용함으로써, 이러한 2개의 금속 나노입자 사이에 정확하게 구조적으로 정의되어 있는 나노갭을 형성시키고, 라만 산란 신호를 증폭시키는 국부적 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance, LSPR)을 발휘할 수 있는 나노갭에 라만 표지자(Raman indicator)를 위치시킴으로써, 재현성 있게 확보된 증강된 라만 산란 신호로부터, 측정하고자 하는 타겟 핵산의 존재 여부에 반대로 연동하여 나노갭 형성 여부/개수를 결정할 수 있고, 타겟 핵산 존재시 turn-off 신호 방식의 센서 역할을 수행할 수 있으며, 이로인해 타겟 핵산의 정량분석이 가능하다. 결론적으로, 본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체에 의해 형성되는 나노갭은 타겟 핵산 정량시 라만 산란의 신호 세기가 매우 약하고, 신호의 재현성이 낮은 문제점을 해결할 수 있다.
본 발명에 따라 (a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체의 자가조립에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체는 타겟 핵산 존재시 turn-off 신호 방식의 센서 역할을 수행하므로, 기지의 농도로 핵산 기반 자가조립 복합체를 함유 또는 형성하는 타겟 핵산 검출 시약은 타겟 핵산 부재시 라만 표지자의 광신호가 최대치인 상태에서, 타겟 핵산이 많아질수록 라만 표지자의 광신호가 낮아져, 기지의 농도의 핵산 기반 자가조립 복합체에 대응되는 과량의 타겟 핵산 존재시 라만 신호가 최소치가 되며, 타겟 핵산 검출 시약 내 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 광신호의 기준점(Min, Max)을 확보 또는 예측할 수 있는 것이 특징이다(도 5).
따라서, (a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체의 자가조립에 의해 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성되는 한, 이러한 Turn-Off 방식으로 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있는 개량된 핵산 기반 자가조립 복합체 역시 본 발명의 범주에 속한다.
[타겟 핵산]
본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체를 타겟 핵산 검출 시약에 적용하는 경우, 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산 사이의 상보적인 수소결합을 통해 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 선택적 및 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체를 타겟 핵산 검출 시약으로 하여 검출할 수 있는 타겟 핵산의 비제한적인 예로는 유전자, 바이러스 RNA 및 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 포유동물 DNA, cDNA, mRNA, RNA 및 DNA 단편, 올리고뉴클레오티드, 합성 올리고뉴클레오티드, 개질된 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산, 자연적 및 합성 핵산 등이 있다.
본 발명에서 타겟 핵산이 유전체 또는 이의 단편인 경우, 유전체 정량 및/또는 정성 분석이 가능하다. 또한, 타겟 핵산의 검출을 통해 바이러스 및/또는 미생물의 동정 또는 질병의 진단할 수 있다.
[액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 방법]
본 발명에 따라 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 방법은
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체 사이의 자가조립에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체가, 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 형성되지 않거나 해체되는 경우 광학적 신호의 변화값을 측정할 수 있게 설계되어 있는 타겟 핵산 검출 시약을 준비하는 제1단계;
핵산 함유 액상 시료에서 제1단계의 (a) 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체 함유 타겟 핵산 검출 시약과의 교합 반응(hybridization)을 수행하는 제2단계;
제2단계의 교합 반응 전, 후 및/또는 동시에 액상 시료내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호를 측정하는 제3단계; 및
제3단계에서 측정되는 광학적 신호 또는 이의 변화값을 분석하는 알고리즘을 통해 시료 내 타겟 핵산의 검출 및/또는 정량 데이터를 제공하는 제4단계
를 포함한다.
이때, 제1단계 및 제2단계는 음전하를 띠는 뉴클레오티드들이 연결된 금속 나노입자들의 응집을 야기하지 않는 염농도에서 수행하거나, 금속 나노입자들의 분산을 위해 콜로이드 안정성(Colloidal stability)을 제공할 정도의 최소한의 밀도로 금속 나노입자에 뉴클레오티드를 결합시킨 나노입자 기반 구조체를 사용할 수 있다.
본 발명의 타겟 핵산 검출 시약에서 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체는 타겟 핵산 존재 여부에 따른 signal/noise 비를 극대화하도록 설계된 것일 수 있다. 예컨대, 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드는 자성 또는 금속 나노입자 및/또는 라만 지시제로 표지(label)될 수 있다.
핵산 함유 액상 시료에서 타겟 핵산 검출 시약과의 교합 반응(hybridization)을 수행하는 제2단계는 해당 핵산 기반 자가조립 복합체의 온도 의존성 자발적인 비공유 결합을 해체 및 형성하도록 하는 각 온도로 가열 및 이어서 냉각시키는 것일 수 있다.
제1단계의 타겟 핵산 검출 시약이 본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체를 함유하거나 형성할 수 있는 것이면, 핵산 함유 액상 시료에서 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약과의 교합 반응(hybridization)을 수행하는 제2단계는 제1 뉴클레오타이드와 제2 뉴클레오타이드 사이의 상보적인 수소결합을 해제시키는 온도로 상승시켜 핵산 기반 자가조립 복합체를 해체시키고 난 후, 제2 뉴클레오타이드와 타겟 핵산이 경쟁하여 제1 뉴클레오타이드 프로브와 교합반응을 수행하는 온도로 낮추면, 제2 뉴클레오티드 대신 타겟 핵산이 제1 뉴클레오티드와 교합되어 핵산 기반 자가조립 복합체가 재 형성되지 않는다(도 1).
이와 같이, 본 발명에 따라 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 방법은 입자들이 브라운 운동을 하는 액상에서 교합반응과 함께, 마커 및 광신호를 검출하는 방법이다.
본 발명의 타겟 핵산 검출 시약은 제1 뉴클레오티드가 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 제2 뉴클레오티드가 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체가 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합에 의해 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하는 것일 수 있다.
액체내 브라운 운동을 하면서 산란광과 같이 광학적 신호를 발휘하는 나노입자의 크기는 20nm ~ 500nm인 것이 바람직하다.
본 발명의 액체내 타겟 핵산 검출 방법에서 측정되는 광학적 신호는 예컨대 탄성 산란광 또는 비탄성 라만 산란 신호일 수 있다.
본 발명의 액체내 타겟 핵산 검출 방법에서 사용하는 타겟 핵산 검출 시약은 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않거나 해체되는 경우 광학적 신호의 변화값을 측정할 수 있게 설계된 것이다
본 발명의 액체내 타겟 핵산 검출 방법에서 사용하는 핵산 기반 자가조립 복합체는 액체내 브라운 운동을 하더라도 측정 도중 재현성 있는 광학적 신호를 연속적으로 제공할 수 있는 구조적 안정성을 가지도록 최소 10개 염기쌍의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되게 설계된 것일 수 있다.
염기쌍(base pair)은 핵산을 이루고 있는 염기들 중에 수소 결합이 가능한 두 염기들이 연결된 것을 가리킨다. Watson-Crick DNA 염기쌍의 경우 아데닌(A)과 티민(T)의 쌍, 구아닌(G)과 사이토신(C)의 쌍이 있다. RNA의 경우 티민은 우라실(U)로 대체된다. 그외에 워블 염기쌍이나 후그스틴 염기쌍도 존재한다. 1 bp는 약 3.4 Å과 맞먹는다.
타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않거나 해체되도록, 제1 뉴클레오티드 서열길이가 제2 뉴클레오티드 보다 더 긴 것이 바람직하다.
뉴클레오티드들 사이의 상보적인 수소결합은 발열반응이므로, 제2 뉴클레오티드와 타겟 핵산 사이의 경쟁시 열역학적으로 제1 뉴클레오티드 프로브가 제2 뉴클레오티드 대신 타겟 핵산과의 교합(hybridization)을 우세하게 하기 위해서, 타겟 핵산 서열과 상보적인 제1 뉴클레오티드 프로브 길이가 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 올리고 뉴클레오티드 길이 보다 더 긴 것이 바람직하다. 또한, 전체 유전체를 단편화하여 타겟 핵산으로 사용하는 경우, 타겟 핵산 서열 길이는 제2 올리고 뉴클레오티드의 길이보다 더 긴 것이 바람직하다.
타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드의 서열길이 및 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드의 서열길이는 Self-folding 되지 않을 정도의 서열 길이인 것이 바람직하다.
예컨대, 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드의 서열길이는 12~40 개 염기이고, 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드의 서열길이는 10~40 개 염기일 수 있다.
액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호가 입자별(particle-by-particle) 광학적 신호가 되도록, 나노입자에 타겟 핵산 검출 시약 내 콜로이드 안정성(Colloidal stability)을 제공할 정도의 최소한의 밀도로 음전하를 띠는 뉴클레오티드로 개질시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 나노입자에 타겟 핵산 검출 시약 내 콜로이드 안정성(Colloidal stability)을 제공할 정도의 최소한의 밀도로 뉴클레오티드를 결합시키면서, 타겟 핵산 검출 시약 또는 교합반응의 완충액(butter) 조건을 조절하여, (a) 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체의 자가조립에 의해 다량체가 아닌 이량체(dimer)-타입 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되도록 제어할 수 있으며, 이로인해, 입자별(particle-by-particle) 광학적 신호가 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체의 개수에 일대일 대응되도록 할 수 있다.
본 발명은 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체의 광학적 신호로 핵산 기반 자가조립 복합체 형성여부 및/또는 형성정도(정량)를 확인하고, 이로부터 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않도록 또는 해체되도록 제1 뉴클레오티드와 교합(hybridization)하는 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있는 것이 특징이다.
예컨대, 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약이 기지의 농도로 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하는 것이면, 제4단계에서 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않도록 또는 해체되도록 제1 뉴클레오티드와 교합(hybridization)하는 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있다.
기지의 농도로 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하는 타겟 핵산 검출 시약으로 측정가능한 타겟 핵산 양이 0 또는 최소치(Minimum) 이하일 때 광학적 신호 강도가 최고치이고 타겟 핵산이 많을수록 광학적 신호 강도가 감소하므로, 제3단계에서 핵산 함유 액상 시료의 광학적 신호를 측정할 때마다, 기준으로 삼을 수 있는 광학적 신호 최대치(Maximum) 확보가 가능하고, 제2단계의 교합반응 후 광학적 신호의 감소 변화값으로부터 타겟 핵산의 정량 검출이 가능하다.
타겟 핵산의 양이 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최저치(Minimum) 이하일 때 신호 강도가 최고치이고, 타겟 핵산의 양이 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최대치 (Maximum) 이상일 때 신호 강도가 최저치이다.
따라서, 제2단계의 교합반응 후, 타겟 핵산 양에 따라 일정 패턴으로 감소하는 광학적 신호 세기 변화로 타겟 핵산의 정량 검출이 가능하다.
따라서, 제4단계의 분석 알고리즘은 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호로부터 산출된 핵산 기반 자가조립 복합체의 검출 및/또는 정량 데이터로부터 핵산 기반 자가조립 복합체 형성을 방해하는 타겟 핵산의 검출 및/또는 정량 데이터를 도출할 수 있다. 또한, 제4단계의 분석 알고리즘은 기계학습 대상이 될 수 있다.
요컨대, 본 발명에서 제3단계 및 제4단계는 제1 뉴클레오티드와 교합하는 타겟 핵산의 개수가 0 또는 제1단계의 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최소치 이하일 때, 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호가 최대치로 기준점이 되고, 핵산 함유 액상 시료 내 제1 뉴클레오티드와 교합하는 타겟 핵산의 개수에 의존하여, 액상 시료내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호가 일정한 패턴으로 감소하는 Turn-Off 방식이다.
본 발명에 따른 Turn-Off 방식은 도 5에 도시된 바와 같이, 타겟 핵산이 Minimum일 때 신호 강도가 최고치이므로, 샘플의 신호를 측정할 때마다 기준으로 삼을 수 있는 신호가 없어 정성 검출(유무 판별)만 가능한 turn-on 방식의 문제점을 해결할 수 있다.
도 5에 예시된 바와 같이, 타겟 핵산의 양이 Minimum일 때 신호 강도가 최고치이고, 타겟 핵산의 양이 Maximum일 때 신호 강도가 최저치일 수 있다.
즉, 타겟 핵산의 양이 제1단계의 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최저치(Minimum) 이하일 때 신호 강도가 최고치이고, 타겟 핵산의 양이 제1단계의 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최대치 (Maximum) 이상일 때 신호 강도가 최저치이다.
제1단계의 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도란, 타겟 핵산 검출 시약 내 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 광신호의 기준점(Min, Max)으로, 기지의 농도의 핵산 기반 자가조립 복합체에 대응되는 과량의 타겟 핵산 존재시 광신호가 최소치가 된다.
또한, 타겟 핵산 검출 시약 내 형성가능한 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 광신호의 최소 및 최대 기준점도 기계학습 대상이 될 수 있다.
제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자가 국부적 표면 플라즈몬 공명 현상(LSPR)을 발휘하는 금속 나노입자이고
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 조사된 빛이 나노입자 표면의 플라즈몬 공명을 일으켜 강한 전자기장 증강을 통해 라만 산란 신호를 증폭시키는 금속 나노입자로부터 3nm 이하의 거리 내 라만 표지자(Raman indicator)가 배치되도록 핵산 기반 자가조립 복합체가 설계된 경우,
본 발명의 일구체예에 따라 타겟 핵산을 검출하는 방법은
상기 라만 표지자의 라만 쉬프트 값을 측정하는 라만 분광법을 통해,
금속 나노입자에 의한 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 이용한 라만 분광법에서 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 쉬프트 값을 측정하되,
타겟 핵산의 개수가 0 또는 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최소치 이하일 때, 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 라만 산란 신호가 최대치로 기준점이 되고, 타겟 핵산이 많을수록 라만 산란 신호 강도가 감소하는 측정법으로서, 제1 뉴클레오타이드 프로브와 상보적 서열을 가진 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있다.
각 타겟 핵산 검출 시약의 최소 감지 농도(threshold)를 통해, 시료 내 타겟 핵산 정량도 가능하다.
본 발명의 일구체예에 따라 타겟 핵산을 검출하는 방법은 브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정하는 나노입자 트래킹 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 통해, (a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되는 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 크기변화로 측정할 수 있으며, 이로부터 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않도록 또는 해체되도록 제1 뉴클레오티드와 교합(hybridization)하는 타겟 핵산을 정량할 수 있다.
본 발명의 액체내 타겟 핵산 검출 방법에서 위음성 결과를 초래하는 저해제의 유무는 검체에 기지(known)의 소량의 타겟 핵산을 넣어주어 확인할 수 있다.
타겟 핵산이 유전체 또는 이의 단편인 경우, 본 발명의 액체내 타겟 핵산 검출 방법은 유전체 정량 및/또는 정성 분석방법으로 활용될 수 있다. 즉, 본 발명의 액체내 타겟 핵산 검출 방법은 교합법을 이용한 유전체 또는 병원체(= 병원균) 동정, 정성 및/또는 정량이 가능한 분석방법이다. 또한, 상기 타겟 핵산의 검출을 통해 바이러스 및/또는 미생물의 동정 또는 질병의 진단을 할 수 있다.
[타겟 핵산 검출 시약]
본 발명은 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 타겟 핵산 검출 시약을 제공한다.
본 발명에 따라 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 타겟 핵산 검출 시약은,
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되는 핵산 기반 자가조립 복합체가, 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 형성되지 않거나 해체되는 경우 변화하는 광학적 신호를 측정할 수 있게 설계되어 있는 것이 특징이다.
따라서, 본 발명의 타겟 핵산 검출 시약은 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체에서 포착되는 재현성 있는 광학적 신호로 핵산 기반 자가조립 복합체 형성여부 및/또는 형성정도(정량)를 확인할 수 있고, 이로부터 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않도록 또는 해체되도록 제1 뉴클레오티드와 교합(hybridization)하는 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있다.
또한, 핵산 기반 자가조립 복합체는 타겟 핵산 존재시 turn-off 신호 방식의 센서 역할을 수행하므로,
기지의 농도로 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하는 타겟 핵산 검출 시약은 타겟 핵산 부재시 광신호가 최대치인 상태에서, 타겟 핵산이 많아질수록 광신호가 낮아져, 기지의 농도의 핵산 기반 자가조립 복합체에 대응되는 과량의 타겟 핵산 존재시 광신호가 최소치가 되며,
타겟 핵산 검출 시약 내 형성가능한 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 광신호의 최소 및 최대 기준점을 확보 또는 예측할 수 있다.
이때 타겟 핵산 검출 시약 내 형성가능한 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 광신호의 기준점(Min, Max)은 기계학습할 수 있다.
[국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발휘하는 금속 나노입자의 특성]
금속 나노입자는 뛰어난 내구성과 함께 크기에 따른 특유의 물리적, 화학, 전기화학성 특성으로 인해 생체 내 및 체외 진단 분야에서 활발하게 사용되고 있다. 금속 나노입자의 재료, 모양, 크기에 기반하여 생성되는 신호는 추가적 표지 물질이 없어도 특유의 신호 송출이 가능하기 때문에 오랜 시간동안 안정적인 신호 생성이 가능하다는 장점을 지니고 있다. 금속 나노입자의 또 하나의 장점은 금속이 지닌 물질 특성에 기반하여 형광물질, 저분자 표지 물질 등의 신호 생성을 증폭시킬 수 있다는 것이다. 예를 들어, 금속 나노입자가 가진 플라즈몬 공명 현상은 라만 산란 신호, 형광 분자 신호와 같이 광학적 특성을 증폭시키는 효과를 얻을 수 있다.
또한, 표면이 개질된 금속 나노입자는 전기화학 신호의 증폭 및 감도, 선택성을 향상시키는 등 센서의 기능을 발전시킬 수 있다. 더불어 금속 나노입자는 센서로써의 활용과 함께 임상, 제약, 암 치료제 전달에도 다양하게 사용되고 있다.
국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발휘하는 금속 나노입자는 금속나노입자 자체, 생체 기능화된 금속 나노입자, 금속 나노 복합체 또는 나노 하이브리드로서 합성될 수 있다.
[핵산 기반 자가조립 복합체]
본 발명에서, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가지는 것이 특징이다.
본 발명의 타겟 핵산 검출 시약에서 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체는 (a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 것이고, Turn-Off 방식으로 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있는 센서 역할을 수행할 수 있는 한, 다양하게 개량된 핵산 기반 자가조립 복합체 역시 본 발명의 범주에 속한다.
타겟 핵산 존재 여부에 따른 signal/noise 비를 극대화하도록 본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체를 설계하기 위해 예컨대, 제1 뉴클레오티드 및/또는 제2 뉴클레오티드에 금속 나노입자를 연결하고/연결하거나, 제1 뉴클레오티드 또는 제2 뉴클레오티드에 라만 지시제를 표지(label)하고/하거나, 제2 뉴클레오티드에 자성 나노입자를 연결할 수 있다.
본 발명의 핵산 기반 자가조립 복합체의 비제한적인 예로 후술할 NEW 구조체, ANEW 구조체, NEW Sight 구조체가 각각 도 1 및 도 2에 예시되어 있다.
NEW 구조체, ANEW 구조체, NEW Sight 구조체는 또한 타겟 핵산 존재 여부에 따른 S/N ratio (signal to noise ratio)를 증강시킨 나노구조체로서, 핵산 기반 자가조립 복합체 형성 여부/개수/농도 측면에서 해상도를 높일 수 있다.
1. NEW (Nanoparticle Enhanced Wad) 구조체
본 발명의 일구체예에 따른 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는, (a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)를 형성하는 것으로,
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이며, (iii) 제2 올리고 뉴클레오타이드에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)를 상기 나노갭에 위치시킴으로써 광 조사시 라만 표지자 유래 라만 산란 신호를 증강시키도록 설계된 것이다.
본 발명의 NEW 구조체에서 나노갭은 제1금속나노입자와 제2금속나노입자가 거의 접촉하여 형성된 틈(crevice)이고, 라만 표지자(Raman indicator)는 간격이 3nm 이하인 나노갭 부위에 배치되고/되거나, 제1금속나노입자 및/또는 제2금속나노입자에 접촉될 수 있도록 배치될 수 있다.
라만 분광법에서 타겟 핵산 존재시 turn-off 신호 방식의 센서 역할을 수행하는 핵산 기반 자가조립 복합체인 NEW 구조체는 라만 산란 신호 측정을 통해 타겟 핵산의 직접 정량이 가능하다. 또한, 라만 산란 신호를 극대화시키는 나노갭 형성이 용이하고 검출 시약 및/또는 표준 시약으로 사용시 구조체가 4℃ ~ 50℃ 범위 내 온도 변화에 안정적이고, 타겟 핵산 서열이 있을 경우 음성 대조군(타겟 핵산 미존재)인 표준 시약의 라만 산란 신호보다 그 세기가 감소하는 측정법을 제공할 수 있다. 타겟 핵산 검출 시약 내 형성가능한 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 정량 구간을 설정할 수 있으므로 진단시 맞춤형 한계 정량 (quantitative threshold)를 적용할 수 있다. 따라서, 위양성 판정 확률 현저히 낮출 수 있고, 약물에 대한 바이러스 증감 추이를 직관적으로 알 수 있다.
본 발명의 일구체예에 따라 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체) 유래 재현성 있는 라만 산란 신호를 이용하여 타겟 핵산을 검출하는 방법은
전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)을 함유 또는 형성시키는 타겟 핵산 검출 시약을 준비하는 제1단계;
제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합을 해제시키는 온도로 상승시킨 후,
제2 뉴클레오티드가, 존재하는 경우 타겟 핵산과 경쟁하여 제1 뉴클레오티드 프로브와 교합반응을 수행하는 온도로 낮추는 제2단계; 및
라만 분광법을 통해 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 산란 신호를 측정하는 제3단계; 및
제3단계에서 측정되는 라만 산란 신호를 분석하는 알고리즘을 통해 시료 내 타겟 핵산의 검출 및/또는 정량 데이터를 제공하는 제4단계
를 포함한다.
1-1. 표면 증강 라만 분광(surface-enhanced Raman spectroscopy; SERS)
전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)는 표면 증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering)으로도 불리는 표면 증강 라만 분광(surface-enhanced Raman spectroscopy; SERS)을 이용하도록 설계된 핵산 기반 자가조립 복합체이므로, 일종의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체에 해당한다.
라만 방출을 가장 효과적으로 향상시키기 위해서는 금속과 입사광 사이에서 금속 표면의 자유 전자들이 집단적으로 진동하는 현상(collective oscillation)이 존재해야 하는데, 이를 전자기적 증강 효과의 기초가 되는 '표면 플라즈몬(Surface Plasmon)'이라 한다. 즉, 입사광은 금속 표면에서 표면 플라즈몬(전자기적 효과)을 발생시키고, 표면 플라즈몬은 금속 표면에 흡착된 라만 표지자(Raman indicator)와의 상호작용(전하 전이 효과)을 통해 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 방출을 크게 향상시킬 수 있다(현상 1).
나아가, 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발휘할 수 있는 금속나노입자들 사이에 형성된 나노갭에서는 표면증강 라만산란(SERS) 현상을 더욱 강하게 나타나게 할 수 있다(현상 2).
따라서, 본 발명은 라만 분석법으로 라만 시프트 값을 알고 있는 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 산란 신호에 연동하여 미량의 물질 측정시, 라만 산란의 신호 세기가 약하기 때문에 미량의 물질을 측정하기 어려운 점을 해결하기 위해, 표면 플라즈몬 공명 현상(전자기적 효과)을 발생 및 더욱 강화시키기도록 이들 두 현상을 이용하여, 라만 표지자의 미약한 라만 산란 신호를 일반 라만 세기에 비해 104 내지 106 배 이상 증가된 세기로 증폭할 수 있을 뿐만 아니라 나노 갭 형성과 반대로 연동된 타겟 핵산 존재 여부에 따른 S/N ratio (signal to noise ratio)를 증강시켜 타겟 핵산 정량 해상도를 높일 수 있도록, 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)를 설계한 것이다.
요컨대, 본 발명에서 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)는 금속 나노입자에 의한 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 이용한 라만 분광법에서 광신호로 라만 표지자의 라만 쉬프트 값을 측정하도록 설계된 핵산 기반 자가조립 복합체이다.
후술하는 ANEW(Advanced Nanoparticle Enhanced Wad) 구조체는 타겟 핵산 존재 여부에 따른 S/N ratio (signal to noise ratio)를 증강시키도록 라만용 NEW 구조체를 개량한 것으로 이들 구조체의 차이점은 도 2B에 예시되어 있다.
본 발명의 일구체예에 따라 라만용 NEW 구조체 또는 이를 개량한 ANEW(Advanced Nanoparticle Enhanced Wad) 구조체를 함유 또는 형성하는 타겟 핵산 검출 시약은 표면 증강 라만 분광법(SERS)을 이용한 것으로, 라만 표지자가 금속 나노입자 기반 구조체가 형성하는 나노갭과 같은 표면에 흡착되거나 수 나노미터 이내의 거리에 위치할 때, 상기 금속 나노입자 기반 구조체의 나노갭에 의해 제공되는 표면 플라즈몬에 의해 나노갭이 없은 일반 라만 세기에 비해 104 내지 106 배 이상 증가된 세기로 라만 표지자의 라만 산란을 측정하는 것이 특징이다.
이때, 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체 및 ANEW 구조체)의 형성 개수, 즉 이의 나노갭 형성 개수 및 이로부터 형성되는 증강된 라만 산란 신호의 강도가 측정하고자 하는 타겟 핵산 개수와 함수관계에 있으므로, 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하는 타겟 핵산 검출 시약은 on/off 신호 체계의 센서 역할을 수행할 수 있으며, 광조사시 측정된 라만 산란 신호의 강도로부터 컴퓨터 알고리즘을 통해 타겟 핵산의 정량분석도 가능하다.
본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체 및 ANEW 구조체)는, (a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되도록 설계된 것이 특징이다. 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체 및 ANEW 구조체)는 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발휘하는 제1금속 나노입자와 제2금속 나노입자 사이에 나노갭이 재현성 있게 형성되고, 나노갭에는 라만 시프트 값을 알고 있는 라만 표지자(Raman indicator)를 위치시켜 라만 표지자의 라만 산란 신호가 나노갭에 의해 더욱 증폭될 수 있고, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 수소결합을 통해 액체내 브라운 운동을 하더라도 나노갭에 의해 더욱 증폭된 라만 산란 신호를 측정 도중 재현성 있게 연속적으로 제공할 수 있는 구조적 안정성을 제공할 수 있다.
또한, 표면 플라즈몬 공명 현상(전자기적 효과)을 발생 및 더욱 강화시키기 위한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자의 나노갭 형성시, 금속 나노입자들에 의해 수 나노미터 간격으로 균일한 나노갭을 재현성 있게 제공하도록 미리 균일하게 합성된 금속 나노입자만을 사용하는 것이 본 발명의 또다른 특징이다.
즉, 본 발명에 따라 새롭게 설계된 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합, 즉 자발적인 비공유 결합에 의한 자가조립에 의해, 제1금속 나노입자와 제2금속 나노입자가 인접하여 표면 플라즈몬 공명 현상(전자기적 효과)을 발생 및 더욱 강화시키는 나노갭을 형성시키고, 이때 금속 나노입자들에 의해 수 나노미터 크기의 틈(crevice)의 형태로 균일한 나노갭을 재현성 있게 제공하도록 미리 균일하게 구형으로 합성된 금속 나노입자만을 사용함으로써, 이러한 2개의 금속 나노입자 사이에 정확하게 구조적으로 정의되어 있는 나노갭을 형성시키는 것이 특징이다.
한편, 도 1 및 도 2에 예시된 바와 같이, 본 발명에 따라 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체를 함유 또는 형성하는 타겟 핵산 검출 시약 내 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드는, 타겟 핵산이 분석 검체 내 있을 경우, 타겟 핵산과 상보적 결합을 하게 되어, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합이 불가능하게 되고, 이로인해, 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발휘하는 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자 사이에 형성된 나노갭이 해체 또는 형성될 수 없어, 제1 뉴클레오티드 또는 제2 뉴클레오티드 중 어느 하나에 연결되어 있는 라만 표지자의 나노갭에 의한 라만 산란 신호 증폭이 turn-off된다.
따라서, 기지의 농도로 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체를 함유 또는 형성하는 타겟 핵산 검출 시약은 타겟 핵산 부재시 라만 산란 신호가 최대치인 상태에서, 타겟 핵산이 많아질수록 라만 산란 신호가 낮아져, 기지의 농도의 핵산 기반 자가조립 복합체에 대응되는 과량의 타겟 핵산 존재시 라만 산란 신호가 최소치가 되며, 타겟 핵산 검출 시약 내 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 라만 산란 신호의 세기 기준점(Min, Max) 확보 또는 예측을 통해(도 5), 타겟 핵산을 정량할 수 있다.
또는, 검출시약으로 사용된 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체와 동일한 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체를 표준 시약으로 사용하여, 표준 시약의 라만 산란 신호보다 그 세기가 감소하는 측정법으로서, 제1 뉴클레오티드 프로브와 상보적 서열을 가지 타겟 핵산(예컨대 유전체 또는 이의 단편)을 정량적으로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는 라만 산란 신호를 증폭시키는 국부적 표면 플라즈몬 공명 현상(LSPR)을 발휘하는 나노갭에 라만 표지자(Raman indicator)를 위치시킴으로써, 증강된 라만 산란 신호를 재현성 있게 확보하기 위해 측정하고자 하는 타겟 핵산의 존재 여부에 역으로 연동하여 나노갭 형성 여부가 결정되는 on/off 신호 체계의 센서 역할을 수행할 수 있는 것이 특징이다. 즉, 본 발명에 따른 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는 단일 DNA 검출에 고도의 민감도와 재현성을 가지는 나노 입자 구조물이다. 이로인해 타겟 핵산의 정량분석이 가능하다.
한편, 본 발명은 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발생시키는 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자의 나노갭에 라만 표지자(Raman indicator)를 정확히 위치시켜 이의 라만 산란 신호를 증폭시키기 위해,
(1) 제1금속 나노입자와 제2금속 나노입자의 크기 및 형상(바람직하게는 완전 구형)을 조절하여 금속 나노입자들이 형성하는 나노갭 거리를 특정 범위로 조절하고,
(2) (a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체 각각에서, 금속 나노입자에 부착하는 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)에 연결된, 활동 자유도를 높여 10 bp 이상의 상보적인 수소결합을 도와주는 스페이서의 길이 조절과 함께, 제1 뉴클레오티드 또는 제2 뉴클레오티드 내 스페이서(spacer) 상 라만 표지자(Raman indicator) 결합 위치를 조절할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체에서 구현되는 (i) 금속 나노입자들 사이에 형성된 나노갭의 구조적 특징과 (ii) 라만 분석시 입사광 사이의 관계에서 발생 및 강화되는 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 현상을 통해, 라만 산란 신호 세기 증폭 현상을 활용함으로써, 라만 분석시 사용된 레이저 입사광의 파장에 해당하는 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 시프트 값에서의 증폭된 라만 산란 신호 세기로부터, 타겟 핵산이 미량이더라도 높은 선택성 및 민감도를 가지고, 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체의 (재)형성 여부, 즉 나노 갭의 (재)형성 여부와 역으로 연동되어 있는 타겟 핵산 물질을 정량 및/또는 정성 분석가능하다. 이로인해, 라만 분석시 사용된 레이저 입사광의 파장에 해당하는 다양한 라만 표지자의 라만 시프트 값들에서의 증폭된 라만 산란 신호 세기들을 이용하여 타겟 핵산의 다중 검지도 가능하다.
또한, 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는, 타겟 핵산의 검출 시약으로 사용할 뿐만 아니라, 라만 분광법 수행시 측정하고자 하는 타겟 핵산이 없는 음성 대조군으로써 사용할 수 있으며, 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 알고 있는 라만 분석시 표준 시약으로도 사용할 수 있다. 한편, 타겟 핵산 검출대상 시료가 첨가되기 전 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 알고 있기 때문에, 타겟 핵산 검출대상 시료가 첨가되기 전에 라만분광 측정하여 이를 위한 표준 시약으로도 사용할 수 있다.
1-2. 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체의 작용원리
본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는, 제1 뉴클레오티드 프로브가 검출하고자 하는 타겟 핵산의 상보적 서열을 가지도록 설계하고 제2 뉴클레오티드가 타겟 핵산의 서열 일부와 동일하도록 설계함으로써, 제1 뉴클레오티드 프로브와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합을 해제시키는 온도로 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 함유 액상 시료를 상승시킨 후, 다시 제2 뉴클레오티드가 타겟 핵산과 경쟁하여 제1 뉴클레오티드 프로브와 교합반응을 수행하게 함으로써, 타겟 핵산이 아닌 제2 뉴클레오티드와 제1 뉴클레오티드 프로브 사이의 상보적인 수소결합을 통해 재형성되는 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체의 개수(이는 나노갭의 개수에 해당)를 통해, 액상 시료 내 타겟 핵산의 존재여부 또는 이의 농도를 도출해 낼 수 있는 것이 특징이다(도 5 및 도 6).
즉, 타겟 핵산이 제1 뉴클레오티드 프로브와 상보적인 수소결합을 통해 교합되는 경우, 제2 뉴클레오티드가 제1 올리고 뉴클레오티드 프로브와 상보적인 수소결합을 하는 기회를 잃어버려, 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체가 재형성되지 아니하여, 나노갭이 소실되어 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 산란 신호 증폭이 사라지고(도 1), 측정 시료내 타겟 핵산의 개수만큼, 제1 뉴클레오티드 프로브와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합을 통해 재 형성되는 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 개수(나노갭 개수에 해당)가 감소하여, 측정 시료내 타겟 핵산의 개수만큼, 라만 분광법을 통해 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 산란 신호가 표준 시약 대비 감소된 정도가 비례한다. 이때, (i) 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 알고 있는 시약을 라만분광 측정 및 재 형성되는 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 개수를 산출하기 위한 표준 시약으로 하거나, (ii) 측정하고자 하는 타겟 핵산이 없는 음성 대조군으로써, 타겟 핵산 검출대상 시료가 첨가되기 전 또는 타겟 핵산 검출대상 시료를 첨가하고 제1 뉴클레오티드 프로브와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합을 해제시키는 온도로 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 함유 시료를 상승시키기 전의 시료를, 라만분광 측정 및 재 형성되는 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 개수를 산출하기 위한 표준 시약으로도 사용할 수 있다. 이경우, 본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체 개수를 산출하기 위한 표준 시약이면서 타겟 핵산 검출 시약 역할을 동시에 수행할 수 있다.
1-3. 라만 표지자(Raman indicator)
본 발명에서, 라만 표지자(Raman indicator)는 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 교합 여부를 확인할 수 있는 표지자 역할을 하는 물질이다. 예컨대 라만 시프트 값을 알고 있는 Cy3, Cy5, Rhodamine 6G, 44DP (4,4'-Bipyridine) 등일 수 있다.
라만 표지자는 라만 검출 장치에 의한 분석물의 검출 및 측정을 용이하게 하는 물질로서, 라만 표지자(Raman indicator)는 라만 시프트 값을 알고 있는 화합물일 수 있다.
본 발명의 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)에서 나노갭은 제1금속 나노입자와 제2금속 나노입자가 접촉하여 형성된 틈(crevice)이고, 라만 표지자(Raman indicator)가 간격이 3nm 이하인 나노갭 부위에 배치되고/되거나, 제1금속 나노입자 및/또는 제2금속 나노입자에 인접하여 배치될 수 있도록, 라만 표지자(Raman indicator)는 스페이서(Oligo nucleotide spacer)에 직접 부착될 수 있거나 다양한 링커 화합물(예, C1~12 화합물)을 통해 부착될 수 있다.
예컨대, 제2 뉴클레오티드는 라만 표지자를 (i) 제1 뉴클레오티드의 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 상보적인 핵산 서열을 가진 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher) 와 (ii) 스페이서 사이에 연결시킨 것이거나; 또는 제1 뉴클레오티드는 라만 표지자를 (i) 타겟 핵산의 일부 서열과 교합하는 핵산 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 (ii) 스페이서 사이에 연결시킨 것일 수 있다.
라만 표지자는, 유기 또는 무기 분자, 원자, 복합체 또는 합성 분자, 염료, 천연발생 염료(피코에리스린 등), C60과 같은 유기 나노구조체, 벅키볼, 탄소 나노튜브, 양자점, 유기 형광 분자 등일 수 있다. 구체적으로, 라만 표지자(Raman indicator)의 비제한적인 예로서, FAM, Dabcyl, TRITC(테트라메틸 로다민-5-아이소티오시아네이트), MGITC(말라키트 그린 아이소티오시아네이트), XRITC(X-로다민-5-아이소티오시아네이트), DTDC(3,3-디에틸티아디카보시아닌 아이오다이드), TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-1,3-다이아졸), 프탈산, 테레프 탈산, 아이소프탈산, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 다이곡시게닌(digoxigenin), 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시, 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌(Cy3, Cy3.5, Cy5), 크산틴, 석신일플루오레세인, 아미노아크리딘, 양자점, 탄소동소체, 시아나이드, 티올, 클로린, 브롬, 메틸, 인 또는 황 등이 있다. 라만 표지자는 뚜렷한 라만 스펙트럼을 나타내어야 하고, 바람직하게는 시아닌 계열 형광 유지분자인 Cy3, Cy3.5, Cy5 또는 FAM, Dabcyl, Rhodamine 계열의 형광분자를 포함하는 유기 형광분자들이다. 유기 형광분자는 라만 분석 시 사용하는 여기 레이저 파장과 공명하여 더욱 높은 라만 산란 신호의 검출이 가능한 장점이 있다.
1-4. 금속 나노입자
상기 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)에서, 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자는, 제1금속 나노입자와 제2금속 나노입자 사이에 형성된 나노갭에 위치한 라만 표지자의 라만 산란 신호를 증폭시키는 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발휘할 수 있는 것이 바람직하다.
라만 산란 신호 증강을 위한 두 가지 기본적인 메커니즘은 전자기적 및 화학적 증강을 유도하는 것이다. 특히 현저한 증강을 위해서는 전자기적 효과가 주도적인 역할을 한다. 이러한 전자기적 증강은 금속 표면의 거칠기 특성, 예컨대 금속 나노입자 기반 구조체가 형성하는 나노갭의 존재에 의존한다. 이러한 이유로 표면 증강 라만 산란 신호는 주로 가시광선 또는 근 가시광선 영역의 여기 파장(excitation wavelength)을 갖는 금, 은, 구리 등의 주화(coinage) 금속 또는 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속 표면에 흡착된 분석물질에서 나타난다.
라만 산란 신호의 세기는 분석물질 상에 가해지는 전자기장의 제곱에 비례하며, 상기 전자기장은 거칠기 부재시 분석물에 가해지는 전자기장과 입자성 금속 거칠기로부터 발생하는 전자기장의 합으로 표현된다. 따라서, 표면 구조 즉, 금속 나노입자의 크기 및 형상을 조절하여 현저히 높은 비율로 증가된 표면 증강 라만 산란 신호를 제공할 수 있다.
즉, 금속 나노입자는 금속이 지닌 물질 특성에 기반하여 형광물질, 저분자 표지 물질과 같은 라만 표지자(Raman indicator)등의 라만 산란 신호 생성을 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 금속 나노입자가 가진 플라즈몬 공명 현상은 라만 산란 신호, 형광 분자 신호와 같이 광학적 특성을 증폭시키는 효과를 얻을 수 있다.
일반적으로 금속 나노입자의 광학적, 전기적 특성 등을 포함한 물리, 화학적 성질들은 크기, 모양, 결정구조 등의 변화를 통해 조절할 수 있다. 특히 금, 은 등으로 이루어진 귀금속 나노입자는 가시광 영역의 빛과 강하게 공명하여 흡광 및 산란이 매우 강하게 나타난다.
표면 플라즈몬 공명의 주파수는 금속 나노입자의 종류(일반적으로 Au, Ag, Cu, Pt, Pd, 등이 사용됨), 크기 및 형태, 분산되어 있는 용매, 레이저(입사광)의 종류 등에 따라 달라진다. 따라서, 이들을 조절하여 보다 민감한 표면증강 라만 산란 신호를 얻을 수 있다.
본 발명에서, 금속 나노입자는 각각 독립적으로 AuNP, AuNNP, CRD, Au@Ag, Ag@Au 일 수 있다. 자성 나노입자 상에 금 또는 은 쉘을 형성한 것일 수 있다.
제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자는 그 크기, 형상, 재질, 구조 면에서 동일 또는 상이할 수 있다.
수 나노미터 수준의 나노갭을 포함하는 핵산 기반 자가조립 복합체 상에서 S/N ratio (signal to noise ratio)를 증가시키기 위한 주목할 만한 라만 산란 신호의 증강을 구현할 수 있으나, 나노입자 간의 간격이 증가할 수록 효과적인 라만 산란 신호 증강 효과를 나타낼 수 없으므로, 표면 증강 라만 분광 나노갭은 10 nm 이하에서, 바람직하게는 3nm 이하에서 형성되는 것이 바람직하다. 이때, 금속 나노입자의 크기를 조절하여 나노갭의 크기를 조절할 수 있다.
금속 나노입자, 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자는 각각 독립적으로 직경이 5 nm 내지 300 nm 인 것이 바람직한데, 이는 직경이 5 nm 미만이면 라만 표면증강 효과가 떨어지는 문제점이 있고, 300 nm를 초과하면 생물학적 응용시 많은 제약을 받는 문제점이 있기 때문이다. 보다 바람직하게는, 직경은 10 nm 내지 40 nm가 바람직하다. 금속 나노입자는 형상면에서 대략 구형일 수 있으나, 임의의 형상 또는 불규칙 형상의 나노입자들이 사용될 수 있다.
제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자의 크기가 상이한 경우 큰 나노입자(Large nano particle)는 평균직경이 30~50nm인 나노입자이고, 작은 나노입자(Small nano particle)는 평균직경이 20~40nm인 나노입자인 것일 수 있다.
바람직하게 상기 금속 나노입자는 금속, 금속 산화물 또는 금속 질화물을 함유하는 나노입자일 수 있다. 또한 표면 플라즈몬 공명에 의해 증가된 전자기장을 제공하여 이에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 산란 신호를 증강시킬 수 있도록 상기 금속 나노입자는 Au, Ag, Cu, Pt 및 Pd, 및 이의 합금으로 구성된 군에서 선택된 것이 바람직하다.
본 발명에서 금속 나노입자는 그 표면에 제1 뉴레오티드 및 제2 뉴레오티드가 직접 연결되어 있는 금속 나노입자이며, 바람직하게는 금 또는 은이다.
금 나노입자의 경우 Au-thiol 반응으로 표면 개질이 용이하고 나노입자 표면에 많은 양의 물질을 부착할 수 있다.
금 나노입자는 표면에 다양한 유기 분자들과 안정한 결합을 형성할 수 있으며, 생체 물질(뉴클레오티드 및 단백질 등)이 본래의 구조를 유지할 수 있는 높은 생리적인 염 농도에서도 안정한 결합 상태를 유지할 수 있는 등 여러 가지 장점을 가지고 있다. 따라서, 제1 뉴클레오티드로 개질된 금 나노입자는 상기 제1 뉴클레오티드가 상보적인 염기서열을 가지는 타겟 핵산과 강한 수소 결합을 형성할 수 있어 타겟 핵산의 검출을 가능하게 한다. 즉, 금 나노입자의 특성 및 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합 특성을 이용하여 여러가지 타겟 핵산 염기서열을 매우 낮은 검출 한계로 검출할 수 있다. 그러나, 금 나노입자의 경우 은 나노입자에 비하여 라만신호 증폭(SERS) 효과가 작다는 단점을 가진다.
반면, 은 나노입자는 라만 산란 효과가 우수하다는 장점을 가지는 대신 생체 물질이 본래의 구조를 유지할 수 있는 높은 염농도 및 높은 온도에서 안정성이 낮다는 단점을 가진다. 금-은 합금 나노입자는 올리고 뉴클레오티드가 혼성이 이루어지는 높은 염농도(0.3 M NaCl) 이상에서는 비가역적 응집이 일어나 안정성이 낮은 단점을 가진다.
금/은 코어쉘의 경우는 은 나노입자가 쉘을 이루고 있어 라만증폭효과를 이용할 수 있다는 장점을 가진다. 은/금 코어쉘 형태의 경우는 라만에서의 신호를 거의 검출할 수 없으나, 금/은 코어쉘 형태의 경우는 라만에서 더욱 민감한 신호를 검출할 수 있음이 보고되어 있다.
예컨대, 금 코어/은 쉘 형태의 금속나노입자를 사용하는 경우,
(i) 타겟 핵산과 교합하는 핵산 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe), (ii) 스페이서 및 (iii) 제1금속 나노입자에 부착하는 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)가 순차적으로 공유결합으로 연결된 제1 뉴클레오티드; 또는
(i) 제1 뉴클레오티드의 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 상보적인 핵산 서열을 가진 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher), (ii) 스페이서 및 (iii) 제2금속 나노입자에 부착하는 제2-2 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)가 순차적으로 공유결합으로 연결된 제2 뉴클레오티드를
제1금속 나노입자에 부착하는 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher) 또는 제2-2 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)를 통해 금 코어에 부착시킨 후 은 쉘을 형성시킬 수 있다.
한편, 일정한 물리 화학적 특징, 표면 전하, 모양을 갖는 고순도의 나노물질을 합성하는 것이 중요하다. 나노입자의 경우 크기 조절이 용이하고 목적에 따라 다양한 재료를 사용할 수 있으며 수용액상에서 합성하는 경우가 많아 상대적으로 쉬운 방법으로 대량의 재료를 합성할 수 있다.
금 나노입자는 표면 안정화제가 첨가된 상태 또는 첨가되지 않은 상태로 이용할 수 있다. 또한, 상기 금 나노입자는 유기용매 또는 수용액에 분산시킨 상태로 이용할 수 있으며, 수용액에 분산시킨 상태로 이용하는 것이 바람직하다. 금 나노입자는 여러 가지 유기 분자와의 친화력이 강하여 유기 분자와 안정한 결합을 형성할 수 있으므로, 올리고 뉴클레오티드 접착자(oligo nucleotide attacher)를 통해 제1 뉴클레오티드 및/또는 제2올리고 뉴클레오티를 금 나노입자 표면에 결합시킬 수 있다.
한편, 금속 나노입자들의 응집을 야기하지 않도록 금속 나노입자들 분산을 위해 금속 나노입자 표면을 보호 올리고 뉴클레오티드로 개질할 수 있다.
NEW 구조체에 대해 전술한 설명 내용 중 공통된 내용은 ANEW 구조체, NEW Sight 구조체에 대한 설명시 일축한다.
2. ANEW (Advanced Nanoparticle Enhanced Wad) 구조체
본 발명의 일구체예에 따른 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(ANEW 구조체)는,
(a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 자성을 띠는 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체로,
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이며, (iii) 제1 올리고 뉴클레오타이드에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)를 상기 나노갭에 위치시킴으로써 광 조사시 라만 표지자 유래 라만 산란 신호를 증강시키도록 설계된 것이다.
ANEW 구조체는 전술한 NEW 구조체의 S/N ratio (signal to noise ratio) 를 증가시킨 나노구조체로써 정량 성능이 개선된 것이다.
예컨대, 자성을 띠는 제2금속 나노입자는 금 코팅된 자성 입자일 수 있다.
제2 뉴클레오티드가 자성을 띠는 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체는, 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 자가조립되든 되지 않든 불문하고 자석을 이용해 수거한다. 자성을 띠는 제2금속 나노입자를 모두 제거한 후 남은 여액 내에는 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체가 제2 뉴클레오티드가 아닌 타겟 핵산과 교합된 것만 함유하므로, 이때 제1금속 나노입자에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 산란 신호만을 측정할 수 있다.
전술한 NEW 구조체를 이용한 액체내 타겟 핵산 검출 방법은 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합이 해체되어 분리된 (b) 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체도 라만 측정 공간에 공존해 있는 반면, ANEW 나노구조체를 이용한 액체내 타겟 핵산 검출 방법은 타겟 핵산과 경쟁하는 제2 뉴클레오티드가 자성을 띠는 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체가 측정 공간에서 자석으로 간단하고 깨끗이 제거됨으로써 라만 측정시 기존 신호-잡음비(Signal to noise ratio)를 높이는 효과를 기대할 수 있다.
4. NEW Sight (Nanoparticle Enhanced Wad Sight Algorithm) 구조체
본 발명의 일구체예에 따른 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW Sight 구조체)는,
(a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체로,
브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정하는 나노입자 트래킹 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 통해, 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 측정할 수 있는 것이다.
NEW Sight 구조체는 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 통해 숫자 기반 나노 물질 농도(number-based nanomaterial concentration) 및 고해상도 크기 분포(high-resolution size distributions)를 제공할 수 있다.
NEW Sight 구조체는 제1금속 나노입자 및/또는 제2금속 나노입자 유래 산란광을 통해 금속 나노입자의 크기별 및 농도를 측정하므로 라만 표지자(Raman indicator)가 별도로 필요하지 않을 뿐만아니라, 제1금속 나노입자 및/또는 제2금속 나노입자가 금속이 아닌 경우에도 소재에 상관없이 나노 입자인 한 본 발명의 범주에 속한다.
NEW Sight 구조체는 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 산란광을 통해 표지자 사용여부와 상관없이 입자별 광신호를 제공할 수 있다. 따라서, 브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 핵산 기반 자가조립 복합체는 입자별 고해상도 입자 크기 데이터와 콜로이드 현탁액 또는 나노입자 용액에 대한 농도 측정을 제공한다.
측정되는 광학적 신호 또는 이의 변화값을 분석하여 시료 내 타겟 핵산의 검출 및/또는 정량 데이터를 제공하는 알고리즘은 크기 변화를 추적하여 판별하는 알고리즘일 수 있다.
NEW 구조체와 달리 라만 산란 신호를 이용하지 않고 NanoSight와 같은 입자 분석기를 이용하여 측정하는 방법으로써 구조체 크기 변화를 추척하기 때문에 라만 표지자가 필요없고 측정이 아주 간편하다. 형광 또는 라만 산란 신호를 이용하지 않기 때문에 라만 표지자(예: Cy3, Cy5 등)가 필요 없다.
제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되는 이합체 (dimer) 구성이 전술한 NEW 구조체보다 간단하다. NanoSight를 이용할 때 간단히 목표 유전체 검출과 정량 결과를 얻을 수 있다.
[광원 및 라만 검출 장치]
레이저 광은 단일 파장 동위상의 빛이다. 일반적으로 레이저 빔은 가늘고 퍼지지 않는다. 레이저는 정확하게 정해지는 단색의 파장 때문에 분광학 분야에 주로 사용된다.
근본적으로 라만 분광법의 단점은 신호의 세기가 약하다는 것이므로, 광원으로 고출력의 입사광 즉, 고밀도의 광자를 제공할 수 있는 레이저를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 검출기로는 검출신호를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 PMT(photomultiplier tube), APD(avalanche photodiode), CCD(charge coupled device) 등을 구비하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, (i) 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 이용한 금속 나노입자들에 의한 라만 표면증강 효과, (ii) 나노 갭으로 인해 더욱 증폭되는 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 산란 신호 세기 증폭 수준 및/또는 (iii) 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 시프트 값은, 라만 분석시 사용된 레이저 입사광의 파장에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 타겟 핵산 검출 방법에서 라만 분광법을 통해 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 산란 신호를 획득하는 제3단계는 임의의 공지된 라만 분광법에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 표면 증강 라만 분광법(SERS, Surface Enhanced Raman Scattering), 표면 증강 공명 라만 분광법(SERRS, Surface enhanced resonance Raman spectroscopy), 하이퍼-라만 및/또는 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS, coherent anti-Stokes Raman spectroscopy)을 사용할 수 있다.
형광신호에 비해 라만 산란 신호는 각 분자 별 지문과 같은 형태로 신호의 패턴이 나타나기 때문에 나노 사이즈의 물질을 종류별로 명확하게 검출하는 것이 가능하다. 이러한 라만 산란 신호를 이용한 분자 검출법은 이미 물리 화학 분야 등에서 널리 사용되는 정밀하고 안정된 비파괴 분자 측정방법이다. 빛(레이저)을 이용하기 때문에 충분한 신호가 나올 경우, 1회 측정시간은 약 1~10초 내외로 비교적 짧다. 유전자 증폭 과정 없이 빛을 이용해 직접 분자를 측정하므로 유전자 증폭을 위한 값비싼 형광 확인자, 중합 효소, 프라이머 등의 재료가 필요 없어 비교적 저렴하다. 나아가, 비숙련자도 간단한 사용법 숙지 후 즉시 이용이 가능하다.
당해 분야에 공지된 임의의 적절한 형태 또는 구성의 라만 분광법 또는 관련 기법이 분석물 검출에 사용될 수 있으며, 이로는 노말 라만 스캐터링, 공명 라만 스캐터링, 표면 증강 라만 스캐터링, 표면 증강 공명 라만 스캐터링, 비간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS), 자극 라만 스캐터링, 역 라만 분광법, 자극 게인 라만 분광법, 하이퍼-라만 스캐터링, 분자 광학 레이저 시험기(molecular optical laser examiner, MOLE) 또는 라만 마이크로탐침 또는 라만 현미경법 또는 공초점 라만 마이크로분광기, 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광법, 시간 분해 공명 라만, 라만 해리 분광법 또는 UV-라만 현미경법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 라만 검출 장치는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 상기 실시양태는 사용되는 컴퓨터 유형에 대해 제한을 두지 않는다. 예시적 컴퓨터는 정보를 상호교환하는 버스 및 정보 처리를 위한 프로세서를 포함할 수 있다. 컴퓨터는 램(RAM) 또는 다른 동적 저장 장치, 롬(ROM) 또는 다른 정적 저장 장치 및 데이터 저장 장치, 예컨대 마그네틱 디스크 또는 광학 디스크 및 이와 상응하는 드라이브를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 컴퓨터는 당해 분야에 공지된 주변 장치, 예컨대 표시 장치(예컨대, 음극 선관 또는 액정 표시), 알파벳 입력 장치(예컨대, 키보드), 커서 조절 장치(예컨대, 마우스, 트랙볼 또는 커서 방향키) 및 커뮤니케이션 장치(예컨대, 모뎀, 네트워크 인터페이스 카드 또는 에더넷, 토큰 링 또는 기타 유형의 네트워크와 결합하는데 사용된 인터페이스 장치)를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 라만 검출 장치는 컴퓨터와 작동가능하게 결합될 수 있다. 검출 장치로부터의 데이터는 프로세서에 의해 처리되고 데이터는 주기억장치에 저장될 수 있다. 표준 분석물에 대한 방출 프로파일 상의 데이터는 또한 주기억 장치 또는 ROM에 저장될 수 있다. 프로세서는 라만 활성 기판에서의 분석물로부터의 방출 스펙트럼을 비교하여 샘플의 분석물 유형을 확인할 수 있다. 프로세서는 검출 장치로부터의 데이터를 분석하여 여러 분석물의 정체 및/또는 농도를 측정할 수 있다. 서로 다르게 구비된 컴퓨터는 특정 이행에 사용될 수 있다. 따라서, 시스템의 구조는 본 발명의 상이한 실시양태에서 다를 수 있다. 데이터 수집 작업 이후, 전형적으로 데이터는 데이터 분석 작업으로 보내질 것이다. 분석 작업을 용이하게 하기 위해, 검출 장치에 의해 수득된 데이터는 상기한 바와 같이 디지털 컴퓨터를 사용하여 전형적으로 분석할 것이다. 전형적으로, 컴퓨터는 검출 장치로부터의 데이터 수용 및 저장뿐만 아니라 수집된 데이터의 분석 및 보고를 위해 적절히 프로그래밍될 것이다.
본 발명은 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출할 수 있다. 따라서, 교합법을 이용하여 유전체 정량 및/또는 정성 분석이 가능하다.
도 1는 본 발명의 일구체예에 따른 라만 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 타겟 핵산 존재시 turn-off 신호 방식의 센서 역할을 수행하는 작동원리도이다.
도 2은 본 발명에 따른 다양한 핵산 기반 자가조립 복합체인 (A) NEW 구조체, (B) ANEW 구조체, (C) NEW Sight 구조체의 설계 및 형성원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3은 실시예 1에서 준비한 NEW 구조체를 이용해 나오는 라만 신호를 100회 반복 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 준비한 NEW 구조체 내 인접한 2개의 금속 나노입자들이 브라운 운동을 한다는 것을 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 통해 보여주는 동영상의 정지 화면이다.
도 5는 실시예 1에서 준비한 NEW 구조체를 이용해 나오는 라만 신호를 나타낸 것이며, 왼쪽 그래프는 타겟 핵산이 없을 경우 NEW 구조체가 해리되지 않고 온전히 존재하는 NC(negative control) 상태이며, 오른쪽 그래프는 과량의 타겟 핵산이 있을 경우 구조체가 완전 해리한 PC(positive control) 상태이다.
도 6은 실시예 1에서 준비한 NEW 구조체를 이용해 나오는 라만 신호를 나타낸 것이며, 타겟 핵산의 존재량에 따라 turn-off 방식으로 그 양이 많아질 수록 신호가 점점 감소하는 것을 보여준다.
도 7은 라만 산란의 원리를 설명하는 모식도이다.
도 8은 전파형 플라즈몬과 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)의 모식도이다.
도 9은 시료의 라만 스펙트럼 정보인 (a) 하나 이상의 라만 쉬프트 값, 각 쉬프트 값에서 (b) 라만 최고점 및 (c) 라만 최저점의 예시도이다.
도 10은 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발휘하는 금속 나노입자를 사용한 바이오센서의 작동원리를 도시한 모식도이다.
도 2은 본 발명에 따른 다양한 핵산 기반 자가조립 복합체인 (A) NEW 구조체, (B) ANEW 구조체, (C) NEW Sight 구조체의 설계 및 형성원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3은 실시예 1에서 준비한 NEW 구조체를 이용해 나오는 라만 신호를 100회 반복 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 준비한 NEW 구조체 내 인접한 2개의 금속 나노입자들이 브라운 운동을 한다는 것을 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 통해 보여주는 동영상의 정지 화면이다.
도 5는 실시예 1에서 준비한 NEW 구조체를 이용해 나오는 라만 신호를 나타낸 것이며, 왼쪽 그래프는 타겟 핵산이 없을 경우 NEW 구조체가 해리되지 않고 온전히 존재하는 NC(negative control) 상태이며, 오른쪽 그래프는 과량의 타겟 핵산이 있을 경우 구조체가 완전 해리한 PC(positive control) 상태이다.
도 6은 실시예 1에서 준비한 NEW 구조체를 이용해 나오는 라만 신호를 나타낸 것이며, 타겟 핵산의 존재량에 따라 turn-off 방식으로 그 양이 많아질 수록 신호가 점점 감소하는 것을 보여준다.
도 7은 라만 산란의 원리를 설명하는 모식도이다.
도 8은 전파형 플라즈몬과 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)의 모식도이다.
도 9은 시료의 라만 스펙트럼 정보인 (a) 하나 이상의 라만 쉬프트 값, 각 쉬프트 값에서 (b) 라만 최고점 및 (c) 라만 최저점의 예시도이다.
도 10은 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 발휘하는 금속 나노입자를 사용한 바이오센서의 작동원리를 도시한 모식도이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 핵산 기반 자가조립 복합체 함유 타겟 핵산 검출 시약의 제조
도 1에 예시된 바와 같이, 실시예 1에서 준비하고자 하는 타겟 핵산 검출 시약은 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)를 함유하며, NEW 구조체는 (a) 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드가 직경 20~30 nm의 구형 금 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 직경 20~30 nm의 구형 금 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 수(水) 기반 용매에서 자가조립되는 것이다.
이때, 타겟 핵산은 현재 유행중인 코로나 바이러스의 유전체임을 동정할 수 있는 염기 서열(12 mer ~ 30 mer)로 합성된 것이다.
타겟 핵산과 교합하는 염기 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe), 활동 자유도를 높여 10 bp 이상의 상보적인 수소결합을 도와주는 하기 화학식 1의 C3 스페이서 및 나노입자에 부착하는 올리고 뉴클레오티드 접착자(poly-adenine 10mer)를 순차적으로 연결시켜 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드를 준비하였다.
또한, 제1 뉴클레오티드의 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 20 ~ 50bp 상보적인 염기 서열을 가진 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher), 활동 자유도를 높여 10 bp 이상의 상보적인 수소결합을 도와주는 하기 화학식 1의 C3 스페이서 및 나노입자에 부착하는 제2-2 올리고 뉴클레오티드 접착자(poly-adenine 10mer)를 순차적으로 연결시켜 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드를 준비하였다. 이때, 라만 표지자로 Cy3는 제2 뉴클레오티드 내 C3 스페이서와 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher) 사이에 위치한다.
다만, 제1 뉴클레오티드와의 교합시 경쟁에서 타겟 핵산이 우위를 점하도록, 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)의 서열 길이는 상기 합성된 타겟 핵산의 서열 길이보다 짧다(도 1 및 도 2).
일말단이 -SH 기로 개질된 제1 뉴클레오티드와 금 나노입자의 혼합용액에 100 mM phosphate buffer, 2M NaCl을 순차적으로 첨가해주고 실온에서 반응시켜, 제1나노입자 기반 구조체를 합성하였다. 마찬가지로 일말단이 -SH 기로 개질된 상기 제2 뉴클레오티드와 금 나노입자의 혼합용액에 100 mM phosphate buffer, 2M NaCl을 순차적으로 첨가해주고 실온에서 반응시켜, 제2나노입자 기반 구조체를 합성하였다.
이어서, 제1나노입자 기반 구조체 함유 수용액과 제2나노입자 기반 구조체 함유 수용액을 섞어, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드 사이의 상보적인 수소결합을 통해 형성된 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체) 함유 타겟 핵산 검출 시약을 준비하였다.
자체 제작한 도립형 라만 검출 장치를 사용하여, 실시예 1에서 준비된 인산 완충액 내 NEW 구조체 함유 타겟 핵산 검출 시약에서 NEW 구조체의 라만 신호, 즉 제2 뉴클레오티드에 연결된 라만 표지자 Cy3의 라만신호를 측정하였으며, 그 결과는 도 3에 도시하였다.
산란된 라만 스펙트럼은 하나의 acquision, 1초간 추적(accumulation), 400μW, 500-2000cm-1의 범위에서 기록하였다. 낮은 강도(intensity)에도 불구하고, 532nm의 레이저 입사광(incident light)에서의 지문 스펙트라(fingerprint spectra)인 1470 및 1580cm-1에서 Cy3의 특징적인 피크가 나타났다.
놀랍게도, 타겟 핵산 검출 시약에서 전술한 NEW 구조체는 연속적으로 1초마다 100회 측정시에도 안정적으로 증강된 라만 산란 신호가 일정한 범위 내에서 재현성 있게 제공되고 있다는 것을 발견하였다.
실시예 2: 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 사용한 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도 측정
실시예 1에서 준비된 NEW 구조체 함유 타겟 핵산 검출 시약에서 NEW 구조체 농도를 확인하기 위해 Malvern Panalytical사의 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 사용하였다.
본 실시예에서 사용한 나노입자 트래킹 분석기(NTA)는, (i) 개별적으로 동시에 각 입자의 브라운 운동을 측정하여 시간 경과에 따른 입자 확산을 생성하여 각 입자를 추적하고, (ii) 스톡스-아인슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)을 사용하여 입자 확산을 크기로 변환하여 크기 편향이 없는 고해상도 데이터 세트를 제공하여 입자 크기를 측정하고, (iii) 스마트 알고리즘을 통해 재현 가능한 농도 관련 고정밀 데이터를 제공하는 것이다. 또한, 나노입자 트래킹 분석기(NTA)에서 사이징 원칙(sizing principle)은 절대적이므로 보정(calibration)이 필요하지 않다. 각 입자는 독립적으로 크기가 지정되고 동시에 측정되므로 매우 복잡한 샘플도 깊이 이해할 수 있으며, 입자 크기의 가장 작은 변화를 정확하게 감지하여 집단(population) 내 응집과 같은 이벤트에 대한 신속한 정보를 제공하는 장치이다. 이 정확도와 감도는 나노 규모에서 크기와 본질적으로 연결된 물질의 물리화학적 특성을 고려할 때 매우 중요하다.
브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정 및 시각화하는 나노입자 트래킹 분석기(NTA)를 통해, 실시예 타겟 핵산 검출 시약에서 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 농도(구체적 농도 수치 삽입바랍니다)를 측정할 수 있을 뿐만아니라, 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에서 준비된 NEW 구조체 함유 타겟 핵산 검출 시약에서 인접한 2개의 금속 나노입자들이 브라운 운동을 한다는 것을 동영상으로 발견하였다.
실시예 3: 타겟 핵산과 교합 반응 후 라만 신호 측정
실시예 1에서 준비된 핵산 기반 자가조립 복합체 (NEW 구조체)는 제1 뉴클레오티드와의 교합반응에서 타겟 핵산과 경쟁하는 제2 뉴클레오티드에 기지(already-known)의 라만 쉬프트값을 발휘하는 라만 표지자(indicator)가 연결되어 있으며, 핵산 기반 자가조립 복합체 (NEW 구조체)는 타겟 핵산 존재시 turn-off 신호 방식의 센서 역할을 수행하므로, 핵산 기반 자가조립 복합체 형성 여부/개수/농도를 라만 표지자(indicator)의 라만 신호로 확인(정량)할 수 있다(도 1 및 도 6).
실시예 1에서 준비된 핵산 기반 자가조립 복합체 (NEW 구조체) 함유 타겟 핵산 검출 시약에 합성된 타겟 핵산(12 mer ~ 30 mer)을 기지의 농도로 첨가하였다(도 6).
(a) 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드가 구형 금 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 구형 금 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 형성된 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)를 해체하는 온도, 즉 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 제거하는 온도(Tm), 72.0 ℃로 상승시킨 후, 상기 합성된 타겟 핵산과 제1 뉴클레오티드를 교합시키는 온도(Ta)로 약 5℃ 온도를 낮추었다.
실시예 1과 동일한 방법으로 자체 제작한 도립형 라만 검출 장치를 사용하여, 제2 뉴클레오티드에 연결된 라만 표지자의 라만신호를 측정하였다.
도 5에서 왼쪽 그래프는 타겟 핵산이 없는 타겟 핵산 검출 시약을 72.0 ℃로 상승 및 약 5℃ 온도를 낮춘 후 측정된 라만 스펙트럼이고, 도 5에서 오른쪽 그래프는 타겟 핵산 검출 시약 내 제1 뉴클레오티드의 개수를 고려하여 합성된 타겟 핵산을 과량으로 넣었을 때 측정된 라만 스펙트럼이다.
실시예 1에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 및 이와 상보적인 제2 뉴클레오티드 사이 분자적 수준의 자발적인 수소결합에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 개수는 타겟 핵산의 개수와 반대로 연동되는 함수관계에 있다(도 1). 즉, (i) 시료내 타겟 핵산이 부존재 또는 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최소치 (핵산 기반 자가조립 복합체 함유 또는 형성 타겟 핵산 검출 시약의 검출 범위의 최소치) 이하로 존재할 때, 서로 상보적인 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 자가조립에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 개수는 최대치이고, (ii) 시료내 타겟 핵산이 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최대치 이상으로 존재할 때, 서로 상보적인 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 자가조립에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 개수는 최소치이다(도 5).
따라서, 실시예 1에서 준비된 타겟 핵산 검출 시약 내 핵산 기반 자가조립 복합체 (NEW 구조체)는 타겟 핵산 존재시 turn-off 신호 방식의 센서 역할을 수행하므로, 기지의 농도로 핵산 기반 자가조립 복합체를 함유하는 타겟 핵산 검출 시약은 타겟 핵산 부재시 라만 신호가 최대치인 상태에서, 타겟 핵산이 많아질수록 라만 신호가 낮아져, 기지의 농도의 핵산 기반 자가조립 복합체에 대응되는 과량의 타겟 핵산 존재시 라만 신호가 최소치가 되며, 타겟 핵산 검출 시약 내 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 광신호의 기준점(Min, Max)을 확보 또는 예측할 수 있다(도 5).
한편, 도 6는 실시예 1에서 준비된 핵산 기반 자가조립 복합체 (NEW 구조체) 함유 타겟 핵산 검출 시약에 합성된 타겟 핵산(12 mer ~ 30 mer)를 기지의 농도(0 M, 10-16 M, 10-12 M)로 첨가한 경우, 측정된 라만 스펙트럼이다.
놀랍게도 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)를 형성하는 타겟 핵산 검출 시약에서 타겟 핵산 미존재시 또는 기지(known) 농도의 타겟 핵산 존재시 타겟 핵산 농도에 반대로 연동하여 광조사시 라만 산란 신호가 일정한 패턴으로 감소하는 것을 발견하였다(도 6). 이는 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)의 형성 개수, 즉 이의 나노갭 형성 개수 및 이로부터 형성되는 증강된 라만 산란 신호의 강도가 타겟 핵산 개수와 함수관계에 있으므로, 전술한 핵산 기반 자가조립 복합체(NEW 구조체)를 형성하는 타겟 핵산 검출 시약은 on/off 신호 체계의 센서 역할을 수행할 수 있고, 광조사시 측정된 라만 산란 신호의 강도로부터 컴퓨터 알고리즘을 통해 타겟 핵산의 정량분석도 가능하다는 것을 유추할 수 있다.
요컨대, 실시예 1의 타겟 핵산 검출 시약은 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않거나 해체되는 경우 라만 표지자의 라만 신호의 변화값(인텐시티 감소)을 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 타겟 핵산을 정량분석할 수 있다(도 1 ~ 도 6).
Claims (33)
- 액체내 브라운 운동을 하더라도 재현성 있는 산란광 신호를 발휘하는 구조적 안정성을 가진, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체에 있어서,
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체로서,
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, 선택적으로(optionally) (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이 되도록 설계된 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체. - 제1항에 있어서,
타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드는 (i) 조건에 따라 타겟 핵산의 일부 서열과 교합하는 핵산 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe), (ii) 활동 자유도를 높여 10 bp 이상의 상보적인 수소결합을 도와주는 스페이서 및 (iii) 제1금속 나노입자에 부착하는 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)를 포함하고;
제1 뉴클레오티드와 10 bp 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드는 (i) 제1 뉴클레오티드의 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 상보적인 핵산 서열을 가진 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher), (ii) 활동 자유도를 높여 10 bp 이상의 상보적인 수소결합을 도와주는 스페이서 및 (iii) 제2금속 나노입자에 부착하는 제2-2 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher)를 포함하며,
선택적으로(optionally), 제2 뉴클레오티드는 라만 시프트 값을 알고 있는 라만 표지자(Raman indicator)를 (i) 제1 뉴클레오티드의 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 상보적인 핵산 서열을 가진 제2-1 올리고 뉴클레오티드 접착자(attacher) 와 (ii) 스페이서 사이에 연결시킨 것이거나; 또는
제1 뉴클레오티드는 라만 시프트 값을 알고 있는 라만 표지자(Raman indicator)를 (i) 타겟 핵산의 일부 서열과 교합하는 핵산 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 프로브(probe)와 (ii) 스페이서 사이에 연결시킨 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체. - 제1항에 있어서, turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체는 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 형성되지 않거나 해체되는 경우 변화하는 산란광 신호를 측정할 수 있게 설계된 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제1항에 있어서, 핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (iii) 제1 뉴클레오티드 또는 제2 뉴클레오티드에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)를 상기 나노갭에 위치시킴으로써 광 조사시 라만 표지자 유래 라만 산란 신호를 증강시키도록 설계된 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제1항에 있어서, 브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정하는 나노입자 트래킹 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 통해, 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 측정할 수 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제1항에 있어서, 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 산란광 신호는 입자별(particle-by-particle) 광학적 신호인 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제1항에 있어서, (a) 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체의 자가조립에 의해 다량체가 아닌 이량체(dimer)-타입 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되도록 제어하여, 이로인해, 입자별(particle-by-particle) 산란광 신호가 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체의 개수에 일대일 대응되도록 하는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제1항에 있어서, 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않거나 해체되도록, 제1 뉴클레오티드 서열길이가 제2 뉴클레오티드 보다 더 긴 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제1항에 있어서, 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드의 서열길이 및 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드의 서열길이는 Self-folding 되지 않을 정도의 서열 길이인 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제8항에 있어서, 타겟 핵산과 교합하는 제1 뉴클레오티드의 서열길이는 12~40 개 염기이고, 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드의 서열길이는 10~40 개 염기인 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제1항에 있어서, 액체내 브라운 운동을 하면서 산란광 신호를 발휘하는 나노입자의 크기는 20nm ~ 500nm인 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체.
- 제1항에 있어서,
(a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체로,
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이며, (iii) 제2 올리고 뉴클레오타이드에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)를 상기 나노갭에 위치시킴으로써 광 조사시 라만 표지자 유래 라만 산란 신호를 증강시키도록 설계된 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체. - 제1항에 있어서,
(a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 자성을 띠는 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체로,
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 (i) 인접한 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자에 의해 나노갭이 형성되고, (ii) 상기 나노갭은 광 조사시 표면 플라즈몬 공명 현상을 발생 및 더욱 강화시키는 공간이며, (iii) 제1 올리고 뉴클레오타이드에 연결된 라만 표지자(Raman indicator)를 상기 나노갭에 위치시킴으로써 광 조사시 라만 표지자 유래 라만 산란 신호를 증강시키도록 설계된 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체. - 제1항에 있어서,
(a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립된 핵산 기반 자가조립 복합체로,
브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정하는 나노입자 트래킹 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 통해, 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 측정할 수 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체. - 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 타겟 핵산 검출 시약에 있어서,
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되는 핵산 기반 자가조립 복합체가, 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 형성되지 않거나 해체되는 경우 변화하는 광학적 신호를 측정할 수 있게 설계되어 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출 시약. - 제15항에 있어서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출용 핵산 기반 자가조립 복합체를 함유하거나 형성하는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출 시약.
- 제15항에 있어서, 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체에서 포착되는 재현성 있는 광학적 신호로 핵산 기반 자가조립 복합체 형성여부 및/또는 형성정도(정량)를 확인할 수 있고, 이로부터 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않도록 또는 해체되도록 제1 뉴클레오티드와 교합(hybridization)하는 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출 시약.
- 제15항에 있어서, 핵산 기반 자가조립 복합체는 타겟 핵산 존재시 turn-off 신호 방식의 센서 역할을 수행하므로,
기지의 농도로 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하는 타겟 핵산 검출 시약은 타겟 핵산 부재시 광신호가 최대치인 상태에서, 타겟 핵산이 많아질수록 광신호가 낮아져, 기지의 농도의 핵산 기반 자가조립 복합체에 대응되는 과량의 타겟 핵산 존재시 광신호가 최소치가 되며,
타겟 핵산 검출 시약 내 형성가능한 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 광신호의 최소 및 최대 기준점을 확보 또는 예측할 수 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출 시약. - 제16항에 있어서, 타겟 핵산 검출 시약 내 형성가능한 핵산 기반 자가조립 복합체 농도별로 광신호의 최소 및 최대 기준점은 기계학습할 수 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 타겟 핵산 검출 시약.
- 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 재현성 있는 광학적 신호를 이용하여 turn-off 방식으로 타겟 핵산을 검출하는 방법에 있어서,
(a) 조건에 따라 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드 하나 이상이 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제1 뉴클레오티드와 10 개 염기쌍(bp) 이상 상보적인 제2 뉴클레오티드 하나 이상이 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체 사이의 자가조립에 의해 형성되는 핵산 기반 자가조립 복합체가, 타겟 핵산 존재시 제1 뉴클레오티드와 타겟 핵산과의 교합(hybridization)에 의해 형성되지 않거나 해체되는 경우 광학적 신호의 변화값을 측정할 수 있게 설계되어 있는 타겟 핵산 검출 시약을 준비하는 제1단계;
핵산 함유 액상 시료에서 제1단계의 (a) 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체 및 (b) 제2 뉴클레오티드가 제2금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체 함유 타겟 핵산 검출 시약과의 교합 반응(hybridization)을 수행하는 제2단계;
제2단계의 교합 반응 전, 후 및/또는 동시에 액상 시료내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호를 측정하는 제3단계; 및
제3단계에서 측정되는 광학적 신호 또는 이의 변화값을 분석하는 알고리즘을 통해 시료 내 타겟 핵산의 검출 및/또는 정량 데이터를 제공하는 제4단계
를 포함하는 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법. - 제20항에 있어서, 핵산 함유 액상 시료에서 타겟 핵산 검출 시약과의 교합 반응(hybridization)을 수행하는 제2단계는 해당 핵산 기반 자가조립 복합체의 온도 의존성 자발적인 비공유 결합을 해체 및 형성하도록 하는 각 온도로 가열 및 이어서 냉각시키는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
- 제20항에 있어서, 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약은 기지의 농도로 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하는 것이고,
제4단계는 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않도록 또는 해체되도록 제1 뉴클레오티드와 교합(hybridization)하는 타겟 핵산을 검출 또는 정량할 수 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법. - 제20항에 있어서, 제4단계의 분석 알고리즘은 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호로부터 산출된 핵산 기반 자가조립 복합체의 검출 및/또는 정량 데이터로부터 핵산 기반 자가조립 복합체 형성을 방해하는 타겟 핵산의 검출 및/또는 정량 데이터를 도출하는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
- 제20항에 있어서, 기지의 농도로 핵산 기반 자가조립 복합체를 형성하는 타겟 핵산 검출 시약으로 측정가능한 타겟 핵산 양이 0 또는 최소치(Minimum)이하일 때 광학적 신호 강도가 최고치이고 타겟 핵산이 많을수록 광학적 신호 강도가 감소하므로,
제3단계에서 핵산 함유 액상 시료의 광학적 신호를 측정할 때마다, 기준으로 삼을 수 있는 광학적 신호 최대치(Maximum) 확보가 가능하고, 제2단계의 교합반응 후 광학적 신호의 감소 변화값으로부터 타겟 핵산의 정량 검출이 가능한 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법. - 제20항에 있어서, 타겟 핵산의 양이 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최저치(Minimum) 이하일 때 신호 강도가 최고치이고, 타겟 핵산의 양이 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최대치 (Maximum) 이상일 때 신호 강도가 최저치일 수 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
- 제20항에 있어서, 제2단계의 교합반응 후, 타겟 핵산 양에 따라 일정 패턴으로 감소하는 광학적 신호 세기 변화로 타겟 핵산의 정량 검출이 가능한 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
- 제20항에 있어서, 제3단계 및 제4단계는 제1 뉴클레오티드와 교합하는 타겟 핵산의 개수가 0 또는 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최소치 이하일 때, 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호가 최대치로 기준점이 되고,
핵산 함유 액상 시료 내 제1 뉴클레오티드와 교합하는 타겟 핵산의 개수에 의존하여, 액상 시료내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 광학적 신호가 일정한 패턴으로 감소하는 turn-off 방식인 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법. - 제20항에 있어서, 제1금속 나노입자 및 제2금속 나노입자는 국부적 표면 플라즈몬 공명 현상(LSPR)을 발휘하는 금속 나노입자이고,
핵산 기반 자가조립 복합체 형성시 조사된 빛이 나노입자 표면의 플라즈몬을 흥분시켜 강한 전자기장 증강을 통해 라만 산란 신호를 증폭시키는 금속 나노입자로부터 3nm 이하의 거리 내 라만 표지자(Raman indicator)가 배치되도록 핵산 기반 자가조립 복합체가 설계된 것이고,
상기 라만 표지자의 라만 쉬프트 값을 측정하는 라만 분광법을 통해,
금속 나노입자에 의한 국부적 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 이용한 라만 분광법에서 라만 표지자(Raman indicator)의 라만 쉬프트 값을 측정하되,
타겟 핵산의 개수가 0 또는 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약의 타겟 핵산에 대한 검출 민감도의 최소치 이하일 때, 액체내 브라운 운동을 하는 핵산 기반 자가조립 복합체 유래 라만 산란 신호가 최대치로 기준점이 되고, 타겟 핵산이 많을수록 라만 산란 신호 강도가 감소하는 측정법으로서, 제1 뉴클레오타이드 프로브와 상보적 서열을 가진 타겟 핵산을 검출 또는 정량하는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법. - 제20항에 있어서, 브라운 운동을 하는 입자에서 산란된 빛을 포착함으로써 입자 크기 및 농도를 측정하는 나노입자 트래킹 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 통해, (a) 타겟 핵산과 교합하는 프로브(probe)인 제1 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제1나노입자 기반 구조체와 (b) 제1 뉴클레오티드와 상보적인 제2 뉴클레오티드가 제1금속 나노입자에 연결된 제2나노입자 기반 구조체로부터, 제1 뉴클레오티드와 제2 뉴클레오티드의 상보적인 수소결합을 통해 자가조립되는 핵산 기반 자가조립 복합체의 농도를 크기변화로 측정할 수 있으며, 이로부터 핵산 기반 자가조립 복합체가 형성되지 않도록 또는 해체되도록 제1 뉴클레오티드와 교합(hybridization)하는 타겟 핵산을 정량하는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
- 제20항에 있어서, 위음성 결과를 초래하는 저해제의 유무는 검체에 기지(known)의 소량의 타겟 핵산을 넣어주어 확인할 수 있는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
- 제28항에 있어서, 제1단계의 타겟 핵산 검출 시약 내 금속 나노입자들의 콜로이드 안전성 또는 분산성을 유지하기 위해, 금속 나노입자 표면에 연결된 뉴클레오티드의 밀도를 조절하고, 제2단계는 상기 금속 나노입자들의 응집을 야기하지 않는 염농도에서 수행하는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
- 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 핵산은 유전체 또는 이의 단편인 것으로, 유전체 정량 및/또는 정성 분석하는 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
- 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 핵산의 검출을 통해 바이러스 및/또는 미생물의 동정 또는 질병의 진단을 위한 것이 특징인 turn-off 방식의 액체내 타겟 핵산 검출 방법.
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