KR20220120428A - Hla 유전자 편집에 의한 면역거절 항원이 없는 인간 유도만능줄기세포의 생산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HLA 유전자 편집에 의한 면역거절 항원이 없는 인간 유도만능줄기세포의 생산에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, HLA-class I의 베타체인인 β2 microglobulin을 발현하는 B2M 유전자를 넉아웃 시킴과 동시에 별도의 B2M 유전자와 HLA-E 유전자를 넉인 (knock in)시킴으로써, T세포와 NK 세포에 대해 모두 면역원성이 제거된 유도만능줄기세포에 관한 것으로, 면역거부반응을 회피할 수 있는 세포치료제의 개발에 이용될 수 있다.

Description

HLA 유전자 편집에 의한 면역거절 항원이 없는 인간 유도만능줄기세포의 생산 {Generation of HLA-edited human induced-pluripotent stem cells by gene modification}

본 발명은 HLA 유전자 편집에 의한 면역거절 항원이 없는 인간 유도만능줄기세포의 생산에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, HLA-class I의 베타체인인 β2 microglobulin을 발현하는 B2M 유전자를 넉아웃 시킴과 동시에 별도의 B2M 유전자와 HLA-E 유전자를 넉인 (knock-in)시킴으로써, T세포와 NK 세포에 대해 모두 면역원성이 제거된 유도만능줄기세포 및 이를 제작할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

재생의학에서 줄기세포는 원천재료로써 매우 중요하다. 하지만 인간배아를 이용한 배아줄기세포는 윤리적 문제로 활용에 제한적이다. 윤리적 문제를 해결하기 위하여 체세포에 역분화유도 유전자 혹은 단백질을 도입하여 역분화 유도만능줄기세포를 제작할 수 있다. 유도만능세포를 이용한 첫 번째 자가이식 수술은 2014년에 실시되었다. 하지만 환자 본인의 세포로부터 유도만능줄기세포를 제작하여 치료에 사용하기 위해서 많은 시간과 비용이 든다는 단점이 있다.

이미 구축되어 있는 타인의 유도만능줄기세포는 환자 자신의 고유 세포가 아니므로 면역거부반응을 일으키게 된다. 면역반응 유도는 동종이계 유도만능줄기세포를 사용하는 데 가장 심각한 문제이다. 우리 몸의 면역체계는 자기 세포와 타인의 세포를 구분할 수 있는데, 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen; HLA)이 면역적합성을 결정한다. HLA 유전자는 HLA-class I과 HLA-class II, 두 개의 클래스가 존재한다. Class I은 HLA-A, B, C, E, F, G, 여섯 개의 유전자로 class II는 HLA-DR, DQ, DP 세 개의 유전자로 구성되어 있다. HLA 단백질은 두 개의 단백질이 이종이량체 (heterodimer)를 이루어 세포막 표면에 표현되어 기능한다. HLA-class I은 HLA-class I 유전자에서 발현되는 알파체인 (alpha chain)과 B2M 유전자에서 발현되는 β2 microglobulin이 결합하고 HLA-class II는 HLA-class II 유전자에서 발현하는 알파체인과 베타체인 (beta chain)이 결합하여 heterodimer를 형성한다. 항원펩타이드와 결합한 HLA-class I과 class II는 각각 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 T 세포 수용체 (T cell receptor; TCR)와 결합하여 면역 반응을 유도한다. 이 때 HLA는 항원을 T 세포에 인식시켜주는 역할을 할 뿐 아니라, 자가세포인지 아닌지를 구분할 수 있게 해준다. 동종이계 (allogeneic) 세포는 HLA 아미노산 서열의 차이에 의해 비자가세포로 인지되어 CD8+ T 세포에게 직접 공격받거나, CD4+ T 세포를 활성화시킨 후 B 세포로부터 항체를 만들게 하여 공격받고 제거된다.

면역학적 관점에서는 자가세포 이식이 이상적이다. 하지만 세포의 분리에서부터 줄기세포로의 역분화와 다시 필요한 세포로의 재분화를 포함한 전 단계는 상당한 시간과 비용이 발생하는 비효율성이 존재한다. 구축되어 있는 유도만능줄기세포의 경우, HLA 일배체형 (halplotype)이 일치하지 않을 경우 이식에 사용할 수 없다. HLA class II는 포식세포 (macrophage), 수상세포 (dendritic cell)와 같은 항원전달세포 (antigen presenting cell)에서만 주로 발현되는 반면, HLA class I은 모든 세포에서 발현된다. 모든 세포에서 발현하는 HLA class I을 제거하여 면역성을 억제하는 기술이 개발되었는데, 유전자편집기술을 사용하여 β2 microglobulin을 발현하는 B2M 유전자를 넉아웃한 유도만능줄기세포가 개발되었다. B2M 유전자를 넉아웃하면 세포표면에 존재해야 하는 HLA-A, B, C, E, F, G의 모든 HLA-class I 단백질이 사라지며 CD8+ T 세포의 공격을 회피할 수 있다. 하지만 모든 세포가 가지고 있어야 하는 HLA-class I이 부재할 경우, 비정상적 세포 (missing-self)로 인식되어 NK (natural killer) 세포가 공격할 수 있다.

따라서 최대한 HLA-class I이 제거되고 NK 세포의 공격을 받지 않는 유도만능줄기세포의 개발이 필요하다. 여섯 개의 HLA-class I 중 면역적합성에는 다형성 (polymorphic) 정도가 높은 HLA-A, B, C가 결정적 역할을 한다. 상대적으로 낮은 다형성 유전자인 HLA-E, F, G 중 HLA-E는 NK 세포막에 있는 CD94/NKG2의 리간드 (ligand)로 작동하며 NK 세포의 활성을 억제하여 세포사멸을 못하게 한다. 따라서 HLA-class I 중 HLA-E 만을 발현하는 세포주를 만듦으로써 T 세포와 NK 세포에 대한 면역원성이 제거된 유도만능줄기세포주를 제작하여 면역거부를 피할 수 있는 세포치료제를 개발하고자 한다.

이에 본 발명자들은 줄기세포의 면역원성을 억제하는 벡터 및 이를 포함하는 조성물을 제작하였고, 이를 통해 제작된 줄기세포는 면역원성이 현저하게 낮아져 이식적합성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 줄기세포의 면역원성 억제용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 줄기세포의 면역원성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포의 면역원성을 억제하는 방법에 대한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역원성이 억제된 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 B2M 및 HLA-E 유전자를 포함하는 벡터의 줄기세포 면역원성 억제 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 HLA 유전자 편집에 의한 면역거절 항원이 없는 인간 유도만능줄기세포의 생산에 관한 것으로, 본 발명에 따라 생산된 줄기세포는 면역원성이 현저하게 억제되고, 높은 이식적합성을 나타낸다.

본 발명자들은 이에 B2M 유전자 및 HLA-E 유전자를 포함하는 벡터를 제작하였고, 이를 통해 제작한 줄기세포는 낮은 면역원성과 높은 이식적합성을 갖는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는, 다음 단계를 포함하는 줄기세포의 면역원성 억제방법이다:

줄기세포를 포함하는 시료를 준비하는 준비 단계;

β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 줄기세포의 B2M 유전자에 도입하여 넉인하는 형질 전환 단계.

본 발명에 있어서 준비 단계는 줄기세포를 포함하는 시료를 준비하는 것으로, 적절한 배지로 줄기세포를 배양하는 배양 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 줄기세포는 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC) 인 것일 수 있다.

본 명세서 상의 용어 “유도만능 줄기세포”는 체세포와 같은 이미 분화된 세포에 역분화 (dedifferentiation)를 유도하여 초기의 미분화된 상태로 돌아가, 전분화능 (pluripotency)을 가지게 된 세포를 의미한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함할 수 있다. 구체적으로, 분화된 세포에 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf-4를 발현하는 레트로바이러스를 도입하는 과정을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 유사한 특성을 가지며, 구체적으로는 유사한 세포 형태를 나타내고, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사할 수 있으며, 예를 들어 Oct4, Sox2, Nanog, TRA-1-60 등의 단백질이 강하게 발현될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 인 비트로 (in vitro) 및 인 비보 (in vivo)에서 분화전능성을 가지고, 생쥐의 피하에 주입할 경우 삼배엽 세포를 포함하는 테라토마 (teratoma)를 형성할 수 있고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능한 특징을 가질 수 있다.

본 명세서 상의 용어 “B2M 유전자”는 HLA-class I 유전자에서 발현되는 알파체인 (alpha chain)과 결합하는 β2 microglobulin을 발현하는 유전자를 의미한다. β2 microglobulin은 HLA-class I의 HLA-A, B, C, E, F, G 여섯 개의 유전자에서 발현된 알파체인과 결합하여 이종 이량체 (heterodimer)를 형성하여 HLA 단백질을 형성하여 세포막 표면에 표현되어 기능하고, 이에 의해 면역체계 내에서 항원을 T 세포에 인식시키거나, 면역적합성을 결정할 수 있다.

본 명세서 상의 용어, "HLA (human leukocyte antigen)"는 조직적합항원 (histocompatibility antigen)과 동의어이며, 주요면역적합항원 (Major Histocompatibility Antigen Complex; MHC)라고도 불리는 세포 표면 단백질이다. HLA 유전자는 HLA-class I과 HLA-class II, 두 개의 클래스가 존재하며, Class I은 HLA-A, B, C, E, F, G, 여섯 개의 유전자로, class II는 HLA-DR, DQ, DP 세 개의 유전자로 구성된다. HLA-class I과 class II는 각각 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 T 세포 수용체 (T cell receptor; TCR)와 결합하여 면역 반응을 유도하며, 항원을 T 세포에 인식시켜주거나, 자가세포 여부를 구분하게 한다. 다만, 줄기세포의 경우 HLA의 일배체형 (halplotype)이 일치하지 않을 경우 이식에 사용할 수 없다. 이와 관련하여 본 발명은, HLA class I 중 HLA-A, B, C, F, G의 발현을 억제하면서 HLA-E의 발현만 가능하게 하는 줄기세포 또는 이에 필요한 벡터 및 조성물을 제공한다.

본 명세서 상의 용어 “면역원성 억제”는 줄기세포 또는 세포의 이식 시에 이식되는 개체 내에서 면역거부 반응을 일으키지 않도록 억제하는 것을 의미한다. 구체적으로, 면역 거부반응의 원인인 유전자의 발현을 감소 또는 억제하여 이식되는 세포, 조직 또는 기관이 이식적합성을 갖도록 할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에 따른 줄기세포의 면역원성 억제용 벡터 또는 조성물은 HLA-A, B, C, F, G의 발현을 감소시켜 이식되는 세포, 조직 또는 기관이 이식적합성을 갖도록 할 수 있다.

본 명세서 상의 용어 “형질전환”은 줄기세포의 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 도입하여 기존의 줄기세포 B2M 유전자를 넉아웃 (knock-out)하고, 새로운 B2M 유전자 및 이에 연결된 HLA-E 유전자를 넉인 (knock-in) 함에 따라, 기존 B2M 유전자를 발현하지 않고, 새롭게 도입된 B2M 유전자 및 이와 연결된 HLA-E 유전자에서 발현되는 B2M 융합 HLA-E 단백질을 발현하는 것을 의미한다. 따라서, 기존의 B2M 유전자에서는 유전자 발현 수준이 감소하여 해당 폴리펩티드가 코딩되지 않거나, 형질주입 전의 상태에 비해 코딩되는 양이 감소할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 형질전환 단계는 벡터에 의해 유전자가 주입되는 것일 수 있고, 구체적으로, 벡터는 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다.

β2 microglobulin이 융합된 HLA-E를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 핵산은 베타체인인 β2 microglobulin을 발현하는 B2M 유전자 및 알파체인을 발현하는 HLA-E 유전자의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 기능적 동등물은 B2M 유전자 및 HLA-E 유전자의 아미노산 서열과 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 기능적 동등물은 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과로 생성될 것일 수 있다. 아미노산의 결실 또는 치환은 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있을 수 있다.

벡터는 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E를 암호화하는 핵산을 줄기세포의 B2M 유전자의 엑손 영역에 도입하는 것일 수 있고, 이에 따라, 본 발명의 벡터를 통해 형질전환된 줄기세포는 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E를 발현하는 동시에, 별도의 β2 microglobulin이 발현하지 않음에 따라 HLA-E를 제외한 HLA class I의 유전자, 즉, HLA-A, B, C, F, G를 발현하지 않거나, 기존에 비해 낮은 수준으로 발현하는 것일 수 있다.

본 명세서 상의 용어 “벡터”는 유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 벡터는 숙주 세포 내에서 핵산을 발현할 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터일수 있으며, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 벡터 내의 B2M 유전자는 줄기세포의 B2M 유전자에 대해 5 내지 20개의 뉴클레오타이드가 변경되어 조용한 돌연변이 (silent mutation)가 유도된 것일 수 있다. 따라서, 유전자 가위를 통해 벡터내의 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 줄기세포로 도입할 때, 유전자 가위에 의해 벡터내의 B2M 유전자가 잘려나가는 경우가 방지될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산은 서열번호 12의 염기서열로 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 B2M 유전자 및 서열번호 14의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 HLA-E 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

이때, β2 microglobulin이 융합된 HLA-E를 암호화하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. '작동 가능하게 연결된다 (operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, 발현 조절 서열 (expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 형질전환 단계는 유전자 편집기술에 의해 줄기세포의 B2M 유전자를 절단하는 절단 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서 상의 용어 “유전자 편집 기술은” 유전자 편집기술이란 생명체의 유전정보를 자유롭게 교정하여 목적하는 유전 형질을 나타내도록 하는 것으로, 유전자 편집기술은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (TALEN) 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문 구조의 반복 서열 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISR 관련 시스템 (CRISPR/Cas9) 등일 수 있다.

본 명세서 상의 용어 "징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease)"란 징크 핑거 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합단백질을 의미하며, 공지의 또는 상용의 징크 핑거 뉴클레아제 모두를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "징크 핑거 뉴클레아제" 와 "ZFN"은 혼용될 수 있다.

"TALEN (Transcription activator-like effector nuclease)"은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 서로 융합하여 제조한 인공의 제한효소를 의미한다. 또한, 본 발명에서 TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인이 링커를 통하여 연결된 형태도 포함한다. 여기서, TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 어떠한 원하는 DNA 서열에도 빠르게 결합하도록 엔지니어링된 것으로, 이를 DNA 절단 도메인과 결합시키는 경우, 원하는 DNA 서열에 특이적으로 결합하여 원하는 DNA 부위를 절단하는 효과를 가져온다.

유전자 가위를 이용하여 넉아웃 또는 넉인을 수행할 때, 뉴클레아제 외에 Donor DNA가 필수적으로 사용되지 않는 넉아웃과 달리, 넉인의 경우, 뉴클레아제와 함께 Donor DNA를 사용한다. Donor DNA는 뉴클레아제에 의해 절단된 염색체 상의 위치에 도입하고자 하는 유전자를 포함하는 DNA로서, 재조합을 위하여 왼쪽 Flanking Arm 및 오른쪽 Flanking Arm을 포함할 수 있으며, 또한 선별마커 (selection marker) 등을 선택적으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 형질전환 단계는 RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA 서열을 포함하는 벡터의 발현을 통해 줄기세포의 B2M 유전자를 절단하는 절단 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서 상의 용어 “RNA 가이드 뉴클레아제”는 목적하는 유전체 상의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제로서, 특히 가이드 RNA에 의해 표적 특이성을 갖는 뉴클레아제를 말한다. RNA-가이드 뉴클레아제는 이에 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 Cas 단백질일 수 있고, 더 구체적으로 Cas9 (CRISPR-Associated Protein 9) 뉴클레아제 (nuclease) 및 이의 변이체인 Cas9 니케이즈 (nickase)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제로 작용할 수 있는 단백질이다. Cas 단백질은 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다.

Cas9 뉴클레아제는 인간 세포를 비롯한 동식물 세포의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킨다. 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 만드는 것을 모두 포함한다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (non-homologous end-joining; NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선되는데 이 과정에 연구자가 원하는 변이를 표적 장소에 도입할 수 있다. RNA-가이드 뉴클레아제는 인공적인, 혹은 조작된 비자연적으로 발생된 (non-naturally occurring)것일 수 있다.

Cas9 니케이즈는 Cas9 뉴클레아제의 촉매적 도메인들 중 1 개에 돌연변이 1 개 이상을 포함하는데, 여기서 돌연변이 1 개 이상은 RuvC 도메인 내 D10A, E762A 및 D986A로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 돌연변이 1 개 이상은 HNH 도메인 내 H840A, N854A 및 N863A로 이루어진 군으로부터 선택된다. Cas9 니케이즈는 Cas9 뉴클레아제와는 달리 단일가닥절단 (single strand break)을 일으킨다. 따라서, Cas9 니케이즈가 작동하기 위해서는 두 개의 가이드 RNA를 필요로 하며, 쌍 (pair)으로서 기능한다. 두 개의 가이드 RNA는 각각의 표적 서열에 대해 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하고, 각 표적 서열 근처의 DNA 듀플렉스의 한 가닥의 절단을 지시하여, 서로 다른 DNA 가닥에 두 개의 틈 (nick)을 유도할 수 있다.

Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 구체적으로, Cas 단백질은 Cas9 단백질일 수 있다. 또한, Cas 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 속 (Campylobacter) 속 유래의 Cas 단백질일 수 있고, 보다 구체적으로 스타필로코커스 속 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, Cas 단백질은 재조합 단백질 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 벡터는 당업계에 공지된 방법, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 줄기세포내로 도입될 수 있고, 예를 들어, 전기천공법에 의해서 도입될 수 있다.

구체적으로, β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 및 RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA 서열을 포함하는 벡터를 전기 천공법을 이용하여, β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 유전자 서열을 줄기세포 내에 도입할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 줄기세포의 면역원성 억제용 벡터다.

본 발명의 일 구현예에서, β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 암호화하는 핵산은 서열번호 12의 염기서열로 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 B2M 유전자 및 서열번호 14의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 HLA-E 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 벡터는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 왼쪽 상동성 (Left Homology Arm) 암 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 오른쪽 상동성 암 (Right Homology Arm) 유전자 서열을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, B2M 유전자 및 HLA-E 유전자는 링커에 의해 연결되는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 G4S 링커에 의해 연결되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 벡터내에서 각 유전자는 왼쪽 상동성 암, B2M 융합 HLA-E 유전자, EF1 프로모터(promoter) 순으로 배열될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터 및 RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA 서열을 포함하는 제2벡터를 포함하는, 줄기세포의 면역원성 억제용 조성물이다.

본 발명의 또 다른 양태는 B2M 유전자의 엑손 (exon) 중 어느 하나의 내부에 βmicroglobulin이 융합된 HLA-E를 암호화하는 핵산이 도입된, 줄기세포이다.

줄기세포는 구체적으로 15:44,711,487-44,718,159의 앞쪽가닥 (forward strand)에 위치에 B2M 유전자 엑손을 포함하고 있으며, 본 발명에 따른 벡터는 해당 위치의 5개의 엑손 중 엑손 1번의 내부에 β2 microglobulin 융합 HLA-E 유전자를 도입할 수 있고, 이에 따라, 기존 B2M을 넉인시켜 HLA-A, B, C, F, G의 발현이 억제되거나 최소화되면서 HLA-E 만 실질적으로 발현이 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 B2M 유전자의 엑손 (exon) 중 어느 하나의 내부에 βmicroglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산이 도입된 줄기세포를 포함하는, 세포치료제이다.

본 명세서 상의 용어, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

세포치료제는 1ml 당 1.0×10개 내지 1.0×10⁹개의 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics)가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다. 또한, 세포치료제는 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton ickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.

세포치료제에는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

제조된 세포치료제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.

세포치료제는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 HLA 유전자 편집에 의한 면역거절 항원이 없는 인간 유도만능줄기세포의 생산에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, HLA-class I의 베타체인인 β2 microglobulin을 발현하는 B2M 유전자를 넉아웃 시킴과 동시에 별도의 B2M 유전자와 HLA-E 유전자를 넉인 (knock-in)시킴으로써, T세포와 NK 세포에 대해 모두 면역원성이 제거된 유도만능줄기세포에 관한 것으로, 면역거부반응을 회피할 수 있는 세포치료제의 개발에 이용될 수 있다.

도 1은 줄기세포 내의 B2M 유전자 위치 및 엑손 (exon) 부위를 나타내는 도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 B2M 유전자가위의 Cas9과 gRNA 발현벡터를 나타내는 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 B2M gRNA-1, gRNA-2 각 벡터를 Off-Spotter 분석을 통해 오프 타겟 사이트 (off-target)를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 B2M gRNA-1, gRNA-2 각 벡터의 T7E1 어세이 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 B2M 1번 엑손에 HLA-E 유전자를 넉인하기 위한 타겟팅벡터 제작과정을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 B2M 1번 엑손에 HLA-E 유전자를 넉인하기 위한 타겟팅벡터를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 B2M 유전자가위가 결합하여 자를 수 있는 타겟팅 벡터 DNA 서열을 바꾸기 위한 조용한 돌연변이 (silent mutation) 부위를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 면역원성 제어된 B2M-HLA-E KI 줄기세포주 제작 과정을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 B2M 정상과 타겟팅된 대립유전자를 PCR을 통해 유전형 분석 (Genotyping)을 진행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 B2M-HLA-E KI 줄기세포주 선택을 위한 PCR 분석결과를 나타내는 도면이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 B2M-HLA-E KI 줄기세포주 선택을 위한 PCR 분석결과를 담은 표를 나타낸다.
도 10은 B2M 유전자 편집을 서던 블롯 (Southern blot)로 확인하기 위한 HindIII 제한효소 위치와 유전자 단편의 크기를 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 B2M 유전자 편집 결과를 확인하기 위해 실시한 서던 블롯 (Southern blot) 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 TAT-Cre 재조합효소를 처리하여 B2M-HLA-E KI-Cre 세포주 확립하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역원성 제어 유도만능줄기세포주, B2M-HLA-E KI와 B2M-HLA-E KI-Cre 세포주의 핵형 (karyotype)을 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역원성 제어 유도만능줄기세포주, B2M-HLA-E KI와 B2M-HLA-E KI-Cre 세포주의 HLA-E와 줄기세포 리프로그래밍인자의 발현을 조사한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 면역형광염색을 사용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 B2M-HLA-E KI와 B2M-HLA-E KI-Cre 세포주의 리프로그래밍 단백질의 발현 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 FACS 분석을 통해 본 본 발명의 일 실시예에 따른 B2M-HLA-E KI와 B2M-HLA-E KI-Cre 세포주의 B2M 유전자의 넉아웃을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

HLA-class I, HLA-A, B, C, E, F 및 G 유전자들은 염색체 6번에 위치하며, 발현 후 β-microglobulin과 결합하여 이종이량체 (heterodimer)를 형성한다. β-microglobulin은 각 HLA-class I 알파체인이 세포막에 표현되는 것을 도와주며 CD8+ T 세포에 항원을 인식시키는 데 매우 중요한 역할을 한다. 이에, β-microglobulin을 발현하는 염색체 15번에 위치한 B2M 유전자에 β-microglobulin이 융합된 HLA-E 유전자를 넉인하여 β-microglobulin이 넉아웃되어 HLA-E를 제외한 모든 HLA-class I의 발현을 없애고자 하였다.

실시예 1: CRISPR/Cas9 유전자가위 제작을 위한 가이드 RNA (Guide RNA; gRNA)의 획득 및 선별

도 1은 15번 염색체의 15:44,711,487-44,718,159 앞쪽가닥(forward strand)에 위치의 B2M 유전자를 도식화한 것이다. 그리고, 도 2와 같이 ATG 시작 코돈이 존재하는 엑손 1번에 HLA-E 발현유전자를 삽입하기 위하여 엑손 1번을 자를 수 있는 CRISPR/Cas9 유전자가위를 획득하였다.

B2M 엑손 1번에 결합할 수 있는 gRNA와 Cas9 단백질을 동시에 발현할 수 있는 pCas-Guide 벡터 B2M gRNA-1, B2M gRNA-2 두 종류를 OriGene (Rockwille, MD, USA)으로 부터 구입하였으며, B2M 유전자가위의 gRNA가 결합하는 B2M 1번 엑손의 DNA 서열 (서열번호 1), gRNA-1 및 gRNA-2 서열 (서열번호 2, 3)을 표 1에 나타내었다.

서열번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
1	B2M_exon1	GAGTAGCGCGAGCACAGCTAAGG
2	gRNA_1	GAGTAGCGCGAGCACAGCTA
3	gRNA_2	ACTCACGCTGGATAGCCTCC

Off-Spotter 분석도구 (https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter)를 사용하여 각 gRNA의 오프 타겟 사이트 (off-target)를 조사하였으며, 이 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b에서 확인할 수 있듯이, gRNA-1은 B2M mRNA 이외의 코딩시퀀스(coding sequence)와는 결합하지 않았다. gRNA-2의 경우 B2M mRNA에 특이적으로 결합하기는 하지만, GJC1, TUBGCP6, ILVBL 유전자의 코딩시퀀스에 4개의 핵산 불일치 (nucleotide mismatch)로 결합할 가능성이 있었다. 오프타겟 분석 결과, gRNA-1이 gRNA-2보다 훨씬 낮은 오프타겟을 가지는 것을 확인하여 B2M 유전자가위 제작에 B2M gRNA-1을 사용하였다.

실시예 2: T7E1 어세이

B2M 유전자가위가 실제 세포내에서 작동하는지 조사하기 위해 T7E1 에세이를 실행하였다.

B2M gRNA-1, gRNA-2 각 벡터 1.5 μg을 100 μl OPTI-MEM 배지에 희석하여 12웰 플레이트 (12 well plate)에 넣고 100 μl OPTI-MEM에 Lipofectamine 2000 4 μl를 넣어 희석된 벡터와 섞었다. 20분 후, 800 μl의 배지에 들어 있는 5X10⁵개의 293T 세포를 Lipofectamine-DNA 복합체가 들어 있는 웰에 넣어 잘 섞어주었다. 37℃배양기에 유전자가위가 작동하도록 3일 동안 배양하였다. 세포를 배양기에서 꺼내어 배양액을 제거한 후 PBS로 세척하고, 800 ng/ml의 proteinase K가 들어있는 lysis buffer [100 mM NaCl, 50 mM Tris·Cl (pH7.5), 10 mM EDTA (pH8.0), 0.5% SDS]를 500 μl를 넣었다. 55 ℃에서 3시간 배양한 후 500 μl의 isopropanol을 넣어 DNA를 침전시켰다. 유리봉으로 genomic DNA를 건져내어 70% 에탄올에 한 번 씻어 말린 후, 100 μl의 TE buffer [10 mM Tris·Cl (pH8.0), 1 mM EDTA (pH8.0)]에 녹였다. 100 ng의 genomic DNA에 하기 표 2의 서열번호 4 및 5의 프라이머를 넣고 Solg Taq DNA polymerase kit (SolGent)를 사용하여 PCR을 실행하였다. PCR 사이클은 95℃30초, 65℃30초, 72℃30초로 40 회 사이클로 세팅하였다.

서열번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
4	Primer1_Forward	CTGGGGCACCATTAGCAAGTC
5	Primer1_Reverse	TCCCCGAGATCCAGCCCT

PCR 합성이 끝난 후 Labo PCR purification kit로 DNA를 정제하고 200 ng의 PCR 합성물을 1 X NEB buffer2 18 μl에 넣고 PCR 기계를 사용하여 95℃에서 25℃까지 서서히 온도를 변화시켜, 정상 B2M 합성 DNA와 유전자가위에 의해 잘려 indel (insertion/deletion) 돌연변이가 일어난 DNA가 더블스트랜드(double strand)를 만들도록 하였다. T7 enolase 1 (T7E1)을 넣어 37℃1시간 반응시켜 유전자가위에 의해 잘린 위치를 2% 아가로즈 젤 (agarose gel)에 내려 확인하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, B2M gRNA_1 벡터에 의해 발현된 B2M 유전자가위가 B2M 엑손1번에 위치한 타겟 DNA를 잘 자르는 것을 404와 196 bp의 절편으로 확인하였다.

실시예 3: 타겟팅 벡터 제작

도 4와 같이, B2M 1번 엑손에 HLA-E 유전자를 넉인하기 위해 gRNA-1 유전자가위가 자르는 위치 양쪽 주위로 781 bp의 왼쪽 상동성 암 (LHA; left homology arm)과 800 bp의 오른쪽 상동성 암 (RHA; right homology arm)을 사람의 genomic DNA로부터 표 3의 프라이머세트를 사용하여 PCR 합성하였다.

서열번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
6	LHA_Primer_Foward	GAGCTCGGGCGCTGGAAGCTCTAAAG
7	LHA_Primer_Reverse	GGTACCAGGCCACGGAGCGAGACATC
8	RHA_Primer_Foward	GTCGACCTGTGCTCGCGCTACTCTCT
9	RHA_Primer_Reverse	CTCGAGGTTTTCAAAATTAAATGACG

넉인할 HLA-E 유전자는 B2M 단백질의 C 터미널에 HLA-E 단백질이 G4S 링커(linker)로 연결된 융합단백질을 발현하는 코딩서열을 제작하였다. HLA-E 넉인하기 위한 타겟팅벡터, B2M-HLA-E KI 벡터는 왼쪽 상동성 암, B2M 융합 HLA-E 유전자, EF1 프로모터(promoter), EF1 프로모터에 의해 발현 조절되는 GFP 형광단백질 (green fluorescence protein), pac (puromycin-N-acetyltransferase) 단백질, Herpes simplex visrus (HSV)의 thymidine kinase (TK) 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 오른쪽 상동성암으로 구성되도록 제작하였다. EF1 프로모터에 의해 발현되는 단백질들은 코딩 서열 사이에 자기절단 펩타이드 (self-cleaving peptide) T2A와 P2A가 각각 삽입되어있도록 제작하였다. HLA-E 넉인 후 불필요한 외부 유전자를 최대한 제거하기 위하여 EF1 프로모터 앞과 TK 단백질 아래쪽에 loxP site 서열을 삽입하였으며, 벡터 제작에 사용된 유전자 서열을 표 5에 나타내었다.

서열번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
10	Left_Homology_Arm	GGGCGCTGGAAGCTCTAAAGCCCTAGCAGTTACTGCTTTTACTATTAGTGGTCGTTTTTTTCTCCCCCCCGCCCCCCGACAAATCAACAGAACAAAGAAAATTACCTAAACAGCAAGGACATAGGGAGGAACTTCTTGGCACAGAACTTTCCAAACACTTTTTCCTGAAGGGATACAAGAAGCAAGAAAGGTACTCTTTCACTAGGACCTTCTCTGAGCTGTCCTCAGGATGCTTTTGGGACTATTTTTCTTACCCAGAGAATGGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCAAGCTGTAGTTATAAACAGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCTGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACATCACGAGACTCTAAGAAAAGGAAACTGAAAACGGGAAAGTCCCTCTCTCTAACCTGGCACTGCGTCGCTGGCTTGGAGACAGGTGACGGTCCCTGCGGGCCTTGTCCTGATTGGCTGGGCACGCGTTTAATATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCT
11	Right_Homology_Arm	CTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCTCTGGTCCTTCCTCTCCCGCTCTGCACCCTCTGTGGCCCTCGCTGTGCTCTCTCGCTCCGTGACTTCCCTTCTCCAAGTTCTCCTTGGTGGCCCGCCGTGGGGCTAGTCCAGGGCTGGATCTCGGGGAAGCGGCGGGGTGGCCTGGGAGTGGGGAAGGGGGTGCGCACCCGGGACGCGCGCTACTTGCCCCTTTCGGCGGGGAGCAGGGGAGACCTTTGGCCTACGGCGACGGGAGGGTCGGGACAAAGTTTAGGGCGTCGATAAGCGTCAGAGCGCCGAGGTTGGGGGAGGGTTTCTCTTCCGCTCTTTCGCGGGGCCTCTGGCTCCCCCAGCGCAGCTGGAGTGGGGGACGGGTAGGCTCGTCCCAAAGGCGCGGCGCTGAGGTTTGTGAACGCGTGGAGGGGCGCTTGGGGTCTGGGGGAGGCGTCGCCCGGGTAAGCCTGTCTGCTGCGGCTCTGCTTCCCTTAGACTGGAGAGCTGTGGACTTCGTCTAGGCGCCCGCTAAGTTCGCATGTCCTAGCACCTCTGGGTCTATGTGGGGCCACACCGTGGGGAGGAAACAGCACGCGACGTTTGTAGAATGCTTGGCTGTGATACAAAGCGGTTTCGAATAATTAACTTATTTGTTCCCATCACATGTCACTTTTAAAAAATTATAAGAACTACCCGTTATTGACATCTTTCTGTGTGCCAAGGACTTTATGTGCTTTGCGTCATTTAATTTTGAAAAC
12	B2M_Coding_Seq	ATGTCTCGCTCCGTGGCCcTtGCaGTctTgGCctTgCTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATG
13	G4S_linker	GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT
14	HLA-E_Coding_Seq	ATGGTAGATGGAACCCTCCTTTTACTCCTCTCGGAGGCCCTGGCCCTTACCCAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCCTTGAAGTATTTCCACACTTCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCTCTGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTGCGCTTCGACAACGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGTGCCGCGGGCGCCGTGGATGGAGCAGGAGGGGTCAGAGTATTGGGACCGGGAGACACGGAGCGCCAGGGACACCGCACAGATTTTCCGAGTGAACCTGCGGACGCTGCGCGGCTACTACAATCAGAGCGAGGCCGGGTCTCATACCCTGCAGTGGATGCATGGCTGCGAGCTGGGGCCCGACAGGCGCTTCCTCCGCGGGTATGAACAGTTCGCCTACGACGGCAAGGATTATCTCACCCTGAATGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGCGGTGGACACGGCGGCTCAGATCTCCGAGCAAAAGTCAAATGATGCCTCTGAGGCGGAGCACCAGAGAGCCTACCTGGAAGACACATGCGTGGAGTGGCTCCACAAATACCTGGAGAAGGGGAAGGAGACGCTGCTTCACCTGGAGCCCCCAAAGACACACGTGACTCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCAGGATGGGGAGGGCCATACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAGAGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTACCCGAGCCCGTCACCCTGAGATGGAAGCCGGCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGGATCTGTGGTCTCTGGAGCTGTGGTTGCTGCTGTGATATGGAGGAAGAAGAGCTCAGGTGGAAAAGGAGGGAGCTACTCTAAGGCTGAGTGGAGCGACAGTGCCCAGGGGTCTGAGTCTCACAGCTTGTAA

도 5에는 전체 B2M-HLA-E KI 벡터 모식도와 주요 제한효소 (restriction enzyme)가 자르는 위치를 나타내었다. 다만, 타겟팅 벡터의 B2M 융합 HLA-E 단백질 코딩서열에 B2M 유전자가위가 자를 수 있는 B2M DNA 서열이 있기 때문에, 줄기세포에 타겟팅 벡터와 B2M 유전자가위벡터를 함께 주입하면 B2M 유전자가위에 의해 타겟팅 벡터가 잘려나가 목표하는 상동성재조합이 일어나지 않을 수 있다. 따라서, 도 6에 나타낸 바와 같이, 유전자가위의 gRNA가 결합하는 위치의 서열을 바꿔 유전자가위가 자르지 못하도록 gRNA가 결합할 수 있는 부위에 뉴클레오타이드 9개를 바꾸는 조용한 돌연변이 (silent mutation)를 유도하였다.

실시예 4: 벡터 도입

줄기세포에 B2M 유전자가위 벡터와 B2M-HLA-E KI 벡터를 도입하기 위하여 도 7과 같이 전기천공법 (electroporation)을 실시하였다. 전기천공을 위한 시약은 Lonza의 P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X kit를, 기계는 4D-Nucleofector를 사용하였다. 전기천공하기 4시간 전 60 mm 매트리겔 (Matrigel)로 코팅된 배양접시에서 배양된 줄기세포에 10 μM Y-27632를 처리하였다. PBS로 한 번 씻은 후 1.5 ml의 아큐타제 (Accutase) (Sigma-Aldrich)를 넣고 37℃ 세포배양기에서 5분 배양하였다. 3.5 ml의 TeSR-E8을 넣고 단일세포로 될 때까지 파이펫팅하고 2 × 10⁶ 개의 세포를 15 ml 튜브에 넣고 1000 rpm, 5분 원심분리하여 배지를 제거하였다. P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X kit에 들어있는 82 μl Nucleofector Solution에 18 μl Supplement를 섞어 상온에 1분간 둔 후 5 μg의 B2M gRNA-1 pCas-Guide 유전자가위 벡터와 5μg B2M-HLA-E KI 타겟팅 벡터를 첨가하고 원심분리된 세포에 넣어 잘 섞었다. 충분히 부유시킨 세포를 Nucleocuvette에 옮겨담아 4D-Nucleofactor에 넣고 프로그램 CB-150을 사용하여 전기천공하였다. 10 μM의 Y-27632가 들어있는 0.9 ml TeSR-E8을 Nucleocuvbette에 넣어 세포를 잘 부유한 다음, TeSR-E8이 들어 있는 100 mm 배양접시 두 개에 각 500 μl의 세포를 넣었다. Y-27632가 최종 10 μM이 되게 첨가한 후 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 10 μM Y-27632가 들어있는 배지로 3일간 매일 갈아주고 4일째에 1 μg/ml의 퓨로마이신 (puromycin)과 10 μM Y-27632가 들어있는 배지를 처리하여 타겟팅이 일어난 세포만을 선택 배양하였다. 5일째부터 1 μg/ml의 퓨로마이신만 있는 배지로 줄기세포 콜로니를 키웠다. 콜로니 크기가 직경 1~2 mm 크기로 자랐을 때 팁으로 콜로니를 두 조각내어 하나는 PCR하여 유전자형 (genotype)이 상동성 재조합이 제대로 되었는지 분석하고 나머지 하나는 더 잘게 부수어 4웰 플레이트에 옮겨 담아 증식시켰다.

실시예 5: PCR을 통한 유전자 넉인 확인

B2M 엑손 1번에 상동성 재조합이 제대로 일어나면 도 8에 나타낸 것과 같은 B2M-HLA-E KI 대립유전자(allele)로 유전자편집이 일어난다. 유전자형을 알아내기 위해 도 8과 같이 PCR 프라이머를 디자인하였으며, 이의 서열을 하기 표 4에 나타내었다.

서열번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
16	P1_Primer	GCCGATGTACAGACAGCAAA
17	P2_Primer	CGTGACTTCCCTTCTCCAAG
18	P3_Primer	TTATGAGTCTTCACACGCGTACGC
19	P4_Primer	CAGGGGATAAATGGCAGCAATCG
20	Gf_Primer	TGATGGGCTACGGCTTCTAC
21	Gr_Primer	CTCAGTCGTCCAATTCTGCC

도 8과 같이, 프라이머 P1과 P2로 PCR하면 정상 대립유전자는 408 bp, B2M-HLA-E KI 대립유전자는 6,162 bp의 PCR 결과물이 생성되고 P3과 P4로 PCR하면 정상 대립유전자는 PCR결과물이 합성되지 않고 B2M-HLA-E KI 대립유전자는 947 bp의 결과물이 합성되게 된다.

줄기세포클론에서 뜯어낸 절반의 세포덩어리를 100 μl의 PBS가 들어있는 바닥이 둥근 96웰 플레이트로 옮겼다. P200 마이크로파이펫으로 힘차게 파이펫을 반복하여 세포덩어리를 잘게 부순 후 원심분리 (1000 rpm, 7분)하고 PBS를 제거하였다. 세포에 25 μl의 DW를 넣어 PCR 튜브로 옮기고 PCR 기계를 사용하여 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 2 mg/ml의 proteinase K를 5 μl 넣고 55℃에서 6분, 95℃에서 10분 반응시켰다. 새로운 PCR 튜브에 10 X Taq reaction buffer 2.5 μl, 10 mM dNTP 0.5μl, 10 μM 앞쪽 뒤쪽 프라이머 각 1.25μl 씩, Taq polymerase (5 U/μl) 0.1 μl, dimethyl sulfoxide 1.25μl, DW 13.15 μl, 세포용해물 5μl를 넣고, 각각의 프라이머를 넣어 95℃ 30초, 65℃ 30초, 72℃ 30초로 40 회 사이클로 PCR 반응하였다. 각 PCR 합성물은 2% 아가로즈 젤에 내려 확인하였다.

실험결과, 도 9a 및 9b에서 확인할 수 있듯이, 총 96개의 puromycin 저항성을 보이는 클론을 분석한 결과 한쪽 대립유전자에 타겟팅된 세포주는 48개로 50%였고 양쪽 대립유전자에 다 들어간 세포주는 3개로 3.1%였다. PCR 유전자형분석에 이용하지 않은 나머지 세포는 다시 증식시켜 일부는 액체 질소에 보관하고 일부는 genomic DNA를 분리하여 2차 PCR 유전자형 분석을 통해 유전자 편집이 제대로 되었는 지 확인하였다. 최종 B2M-HLA-E KI#7과 #57, 2개의 줄기세포주가 증식에 성공하였고 양쪽 대립유전자에 HLA-E 유전자가 넉인된 것을 PCR로 확인하였다.

실시예 6: 서던블랏을 통한 유전자 넉인 확인

타겟팅벡터가 B2M 유전자에 정확히 들어 갔는 지, 다른 위치에 무작위 삽입된 것은 없는 지 서던블랏 (Southern Blot) 분석을 실시하였다. 도 10에 서던블랏분석에 사용될 HindIII 제한효소가 자르는 위치와 DNA단편의 크기를 나타내는 대략적인 모식도를 나타내었다. 분석에는 GFP 프로브(probe)를 사용하였다. 6웰 플레이트에 키워진 세포주를 PBS로 한 번 씻은 후 800 ng/ml의 proteinase K가 들어있는 lysis buffer [100 mM NaCl, 50 mM Tris·Cl (pH7.5), 10 mM EDTA (pH8.0), 0.5% SDS]를 700 μl를 넣었다. 55℃에서 16시간 이상 반응한 후 700 μl의 이소프로판올을 넣어 DNA를 침전시키고 유리봉으로 genomic DNA를 건져내어 70% 에탄올에 한 번 씻어 말렸다. 말린 DNA는 100~300 μl의 TE buffer에 녹였다. 정제된 DNA 5 μg은 1 X NEB CutSmart buffer와 50 units의 HindIII가 있는 반응액에 넣어 37℃ 배양기에서 16시간 두어 충분히 DNA를 잘랐다. 반응이 끝난 DNA에 젤로딩 염료(gel loadig dye)를 넣어 0.7% 아가로즈젤에서 전기영동하였다. DNA 마커는 Rhoche의 DIG-labeled DNA Molecular Weight Marker II를 사용하였다. 전기영동이 끝난 아가로즈젤은 depurination buffer (0.125 M HCl) 30분, denaturation buffer (0.5M NaOH, 1.5 M NaCl) 15분 두 번, neutraliztion buffer [1M TrisCl (pH7.5), 1.5 M NaCl] 15분 두 번, 20×SSC 15분 처리한 후 Hybond-XL 멤브레인 (membrane)에 모세관 이동 (capillary transfer)하여 DNA를 옮겼다. UV-crosslinker에 멜브레인을 넣고 UV 120000 μJ/cm² 조사하여 DNA를 고정시켰다. 멤브레인에 DIG Easy hybridization buffer를 넣고 42℃에서 30분 prehybridization 한 후 Roche의 PCR DIG Probe Synthesis kit을 사용하여 합성한 GFP 프로브가 들어있는 새 hybridiztion buffer로 바꾸어 50℃에서 16시간 이상 반응하였다. 반응이 끝난 멤브레인을 2 X SSC, 0.1% SDS 용액에서 상온 5분 두 번, 0.5 X SSC, 0.1% SDS 용액에서 65℃ 15분 두 번 씻어 결합하지 않은 GFP 프로브를 제거하였다. GFP 프로브가 결합한 DNA 밴드를 확인하기 위하여 Roche의 washing buffer로 간단히 씻은 후 blocking buffer에 30분간 반응한 후 anti-digoxigenin-AP conjugate 항체가 들어있는 buffer에 멤브레인을 반응시켰다. Washing buffer로 상온에서 15분간 3번 buffer를 바꿔가며 씻고 detection buffer에 멤브레인 다시 씻은 후, CDP-Star를 처리하여 발광된 GFP프로브가 결합한 밴드를 ChemiDoc XRS 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 이미지화하였으며, 이를 도 11에 나타내었다.

도 11에서 확인할 수 있듯이, GFP 프로브에 의해 검출될 것이라 예상되는 5.4 kb 밴드를 관찰할 수 있었고 좀 더 작은 무작위 삽입에 의한 밴드가 관찰되는 세포주들도 존재하였다. 따라서 B2M-HLA-E KI 세포주 #57이 무작위 삽입없이 B2M 양쪽 대립유전자에 HLA-E가 제대로 넉인되어 있는 세포주임을 확인하였고 B2M 한쪽 대립유전자만 HLA-E가 넉인된 세포주는 #13, 25. 32, 34, 36. 51, 55, 69로 7개의 세포주를 확립하였다.

실시예 7: loxP 사이트 재조합 확인

B2M-HLA-E KI #57 줄기세포주를 확립할 때 사용하였던 선택마커 및 GFP 등 불필요한 외부 유전자를 제거하기 위하여 Cre 재조합효소(recombinase)를 처리하여 도 12에서와같이 loxP 사이트 사이에 있는 유전자를 제거하였다. Cre 재조합효소는 세포투과성 (cell permeant) TAT-Cre 재조합효소 (EMD Millipore)를 사용하였다.

B2M-HLA-E KI #57 줄기세포를 35 mm 배양접시에 1×10⁵개 심고 10 μM Y-27632가 들어있는 TeSR-E8에서 하루 배양하였다. TAT-Cre 재조합효소 0.5, 1, 1.5 μM의 세 가지 농도로 처리하고 하루 뒤 PBS로 두 번 씻은 후 10 μM Y-27632가 들어있는 TeSR-E8를 넣어 배양하였다. TAT-Cre 재조합효소를 처리한 지 5일이 되었을 때 loxP 재조합이 일어나지 않은 세포를 사멸시키기 위해 200 nM FIAU (1-(2-deoxy-2-fluoro-1-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil, Sigma-Aldrich)를 처리하였다. Cre 재조합효소를 처리하지 않은 B2M-HLA-E KI #57 줄기세포가 완전히 사멸할 때까지 FIAU를 처리하였다. FIAU 0.5, 1 μM 처리한 배양군에서 4개의 클론을 선택해 genomic DNA를 분리하고 PCR로 loxP 재조합을 확인하였다. 이때, 도 8과 같이, loxP 재조합이 일어나게 되면 P1과 P2 프라이머에 의해 2,226 bp의 PCR 합성물이 합성되고 Gf와 Gr에 의한 합성물은 생성되지 않는다.

실험결과, 도 12에서 확인할 수 있듯이, B2M-HLA-E KI-Cre 4개의 세포주 중 3, 4번이 재조합이 성공적으로 일어남을 확인하였다. 이에, 최종적으로 B2M-HLA-E KI #57과 B2M-HLA-E KI-Cre 3번 줄기세포주를 증식시켜 줄기세포의 특성을 분석하였다.

실시예 8: 핵형 분석

유전자편집된 유도만능줄기세포주의 핵형 (karyotype)이 정상인지 분석하였다. 증식이 활발한 상태의 줄기세포주에 KaryoMAX Colcemid 용액 (Thermo Fisher Scientific)을 3시간 처리한 후 저장성 용액 (hypotonic solution)에 30분간 두었다. 세포를 스크래퍼로 긁어 원심분리하여 세포를 모은 후 고정용액 (3:1 메탄올:아세트산)에 담가 고정하였다. 고정된 세포를 슬라이드에 퍼뜨린 후 50% 질산으로 한 번, 차가운 물로 한 번 씻었다. 염색체는 15분간 Giemsa로 염색하고 최소 20개 이상의 metaphase 세포의 염색체를 분석하였다.

그 결과, 도 13에서 확인할 수 있듯이, 유전자 편집된 B2M-HLA-E KI #57과 B2M-HLA-E KI-Cre 세포주 모두 정상 핵형을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 9: 리프로그래밍인자 발현 확인

각 세포주가 줄기세포의 특성을 잘 유지하는지 리프로그래밍 인자의 mRNA와 단백질 발현을 RT-PCR과 면역형광염색으로 분석하였다.

RNeasy Mini kit (Qiagen)을 사용하여 RNA를 분리한 후, SuperScript III Firtst-strand Synthesis SuperMix (Invitrogen)을 사용하여 1 μg RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA 2 μl에 Solg Taq polymerase와 하기 표 6의 프라이머를 넣고, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초로 35 사이클로 DNA를 합성하였다.

서열번호	명명	서열목록 (5'-> 3')	비고
22	LIN28_Foward	ACTTGTCTTCTACCCTGCCC
23	LIN28_Reverse	GGTGACACAGTGAGACTCCA
24	NANOG_Foward	ACCCAGCTGTGTGTACTCAA
25	NANOG_Reverse	GGAAGAGTAAAGGCTGGGGT
26	OCT4_Foward	GGTCCGAGTGTGGTTCTGTA
27	OCT4_Reverse	CGAGGAGTACAGTGCAGTGA
28	SOX2_Foward	ATCAGCATGTATCTCCCCGG
29	SOX2_Reverse	TACCGGGTTTTCTCCATGCT
30	HLA-E_Foward	TGACTTTGTCACAGCCCAAG
31	HLA-E_Reverse	GGTCCTCATTCAGGGTGAGA

실험결과, 도 14와 같이 유전자편집된 줄기세포주 모두 리프로그래밍 인자 mRNA를 잘 발현하고 있었으며, 동시에 B2M 융합 HLA-E 유전자의 발현 또한 확인하였다.

단백질 수준의 발현을 조사하기 위하여 IVF 4웰 플레이트에서 배양된 줄기세포주의 배지를 버리고 PBS로 한 번 씻은 후 고정액 (4% formaldehye)을 처리하였다. 0.5% Triton-X100 10분처리한 후 5% 혈청 (goat serum)과 0.5% 알부민 (bovine serum albumin)이 들어있는 PBS로 1시간처리하였다. Anti-NANOG (Cell Signaling), anti-SOX2 (Cell Signaling), anti-OCT4 (Cell Signaling) 항체를 2시간 상온에서 처리하고 형광이 표지된 2차 항체를 반응시킨 후 DAPI로 핵을 염색하였다. 마운팅액을 떨어뜨리고 커버글라스를 덮어 형광현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

실험 결과, 도 15에서 확인할 수 있듯이, 모든 줄기세포주들이 NANOG, OCT4, SOX2 리프로그래밍인자를 잘 발현하고 있는 것을 확인하였다.

실시예 10: B2M 넉아웃 확인

유전자편집된 줄기세포주들이 B2M이 넉아웃되었는 지 APC가 표지된 anti-HLA-ABC 항체로 세포를 염색하여 FACS 분석하였다.

분석결과, 도 16에서 확인할 수 있듯이, 아큐타제 (Accutase)를 처리하여 단일세포로 얻은 줄기세포 2×10⁵개에 APC-anti-HLA-ABC (BD Pharmingen)를 넣고 20분 반응시켰다. FACS분석기(Beckman Coulter) 분석한 결과, B2M-HLA-E KI#57과 B2M-HLA-E KI-Cre 줄기세포에서 HLA-ABC가 모두 넉아웃된 것을 확인하였다.

<110> biorgan solution. ltd. co <120> Generation of HLA-edited human induced-pluripotent stem cells by gene modification <130> PN200451-D1 <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M_exon1 <400> 1 gagtagcgcg agcacagcta agg 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA_1 <400> 2 gagtagcgcg agcacagcta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA_2 <400> 3 actcacgctg gatagcctcc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer1_Forward <400> 4 ctggggcacc attagcaagt c 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer1_Reverse <400> 5 tccccgagat ccagccct 18 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHA_Primer_Foward <400> 6 gagctcgggc gctggaagct ctaaag 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHA_Primer_Reverse <400> 7 ggtaccaggc cacggagcga gacatc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RHA_Primer_Foward <400> 8 gtcgacctgt gctcgcgcta ctctct 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RHA_Primer_Reverse <400> 9 ctcgaggttt tcaaaattaa atgacg 26 <210> 10 <211> 800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Left_Homology_Arm <400> 10 gggcgctgga agctctaaag ccctagcagt tactgctttt actattagtg gtcgtttttt 60 tctccccccc gccccccgac aaatcaacag aacaaagaaa attacctaaa cagcaaggac 120 atagggagga acttcttggc acagaacttt ccaaacactt tttcctgaag ggatacaaga 180 agcaagaaag gtactctttc actaggacct tctctgagct gtcctcagga tgcttttggg 240 actatttttc ttacccagag aatggagaaa ccctgcaggg aattcccaag ctgtagttat 300 aaacagaagt tctccttctg ctaggtagca ttcaaagatc ttaatcttct gggtttccgt 360 tttctcgaat gaaaaatgca ggtccgagca gttaactggc tggggcacca ttagcaagtc 420 acttagcatc tctggggcca gtctgcaaag cgagggggca gccttaatgt gcctccagcc 480 tgaagtccta gaatgagcgc ccggtgtccc aagctggggc gcgcacccca gatcggaggg 540 cgccgatgta cagacagcaa actcacccag tctagtgcat gccttcttaa acatcacgag 600 actctaagaa aaggaaactg aaaacgggaa agtccctctc tctaacctgg cactgcgtcg 660 ctggcttgga gacaggtgac ggtccctgcg ggccttgtcc tgattggctg ggcacgcgtt 720 taatataagt ggaggcgtcg cgctggcggg cattcctgaa gctgacagca ttcgggccga 780 gatgtctcgc tccgtggcct 800 <210> 11 <211> 800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Right_Homology_Arm <400> 11 ctgtgctcgc gctactctct ctttctggcc tggaggctat ccagcgtgag tctctcctac 60 cctcccgctc tggtccttcc tctcccgctc tgcaccctct gtggccctcg ctgtgctctc 120 tcgctccgtg acttcccttc tccaagttct ccttggtggc ccgccgtggg gctagtccag 180 ggctggatct cggggaagcg gcggggtggc ctgggagtgg ggaagggggt gcgcacccgg 240 gacgcgcgct acttgcccct ttcggcgggg agcaggggag acctttggcc tacggcgacg 300 ggagggtcgg gacaaagttt agggcgtcga taagcgtcag agcgccgagg ttgggggagg 360 gtttctcttc cgctctttcg cggggcctct ggctccccca gcgcagctgg agtgggggac 420 gggtaggctc gtcccaaagg cgcggcgctg aggtttgtga acgcgtggag gggcgcttgg 480 ggtctggggg aggcgtcgcc cgggtaagcc tgtctgctgc ggctctgctt cccttagact 540 ggagagctgt ggacttcgtc taggcgcccg ctaagttcgc atgtcctagc acctctgggt 600 ctatgtgggg ccacaccgtg gggaggaaac agcacgcgac gtttgtagaa tgcttggctg 660 tgatacaaag cggtttcgaa taattaactt atttgttccc atcacatgtc acttttaaaa 720 aattataaga actacccgtt attgacatct ttctgtgtgc caaggacttt atgtgctttg 780 cgtcatttaa ttttgaaaac 800 <210> 12 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M_Coding_Seq <400> 12 atgtctcgct ccgtggccct tgcagtcttg gccttgctct ctctttctgg cctggaggct 60 atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca 120 aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg 180 aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg 240 tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc 300 cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacatg 357 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G4S_linker <400> 13 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttct 45 <210> 14 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-E_Coding_Seq <400> 14 atggtagatg gaaccctcct tttactcctc tcggaggccc tggcccttac ccagacctgg 60 gcgggctccc actccttgaa gtatttccac acttccgtgt cccggcccgg ccgcggggag 120 ccccgcttca tctctgtggg ctacgtggac gacacccagt tcgtgcgctt cgacaacgac 180 gccgcgagtc cgaggatggt gccgcgggcg ccgtggatgg agcaggaggg gtcagagtat 240 tgggaccggg agacacggag cgccagggac accgcacaga ttttccgagt gaacctgcgg 300 acgctgcgcg gctactacaa tcagagcgag gccgggtctc ataccctgca gtggatgcat 360 ggctgcgagc tggggcccga caggcgcttc ctccgcgggt atgaacagtt cgcctacgac 420 ggcaaggatt atctcaccct gaatgaggac ctgcgctcct ggaccgcggt ggacacggcg 480 gctcagatct ccgagcaaaa gtcaaatgat gcctctgagg cggagcacca gagagcctac 540 ctggaagaca catgcgtgga gtggctccac aaatacctgg agaaggggaa ggagacgctg 600 cttcacctgg agcccccaaa gacacacgtg actcaccacc ccatctctga ccatgaggcc 660 accctgaggt gctgggccct gggcttctac cctgcggaga tcacactgac ctggcagcag 720 gatggggagg gccataccca ggacacggag ctcgtggaga ccaggcctgc aggggatgga 780 accttccaga agtgggcagc tgtggtggtg ccttctggag aggagcagag atacacgtgc 840 catgtgcagc atgaggggct acccgagccc gtcaccctga gatggaagcc ggcttcccag 900 cccaccatcc ccatcgtggg catcattgct ggcctggttc tccttggatc tgtggtctct 960 ggagctgtgg ttgctgctgt gatatggagg aagaagagct caggtggaaa aggagggagc 1020 tactctaagg ctgagtggag cgacagtgcc caggggtctg agtctcacag cttgtaa 1077 <210> 15 <211> 10252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target_Vector_Seq <400> 15 cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 60 agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 120 tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca 180 ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca 240 ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 300 acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 360 ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaaact agtatttaaa tgggcgctgg 420 aagctctaaa gccctagcag ttactgcttt tactattagt ggtcgttttt ttctcccccc 480 cgccccccga caaatcaaca gaacaaagaa aattacctaa acagcaagga catagggagg 540 aacttcttgg cacagaactt tccaaacact ttttcctgaa gggatacaag aagcaagaaa 600 ggtactcttt cactaggacc ttctctgagc tgtcctcagg atgcttttgg gactattttt 660 cttacccaga gaatggagaa accctgcagg gaattcccaa gctgtagtta taaacagaag 720 ttctccttct gctaggtagc attcaaagat cttaatcttc tgggtttccg ttttctcgaa 780 tgaaaaatgc aggtccgagc agttaactgg cgggggcacc attagcaagt cacttagcat 840 ctctggggcc agtctgcaaa gcgagggggc agccttaatg tgcctccagc ctgaagtcct 900 agaatgagcg cccggtgtcc caagctgggg cgcgcacccc agatcggagg gcgccgatgt 960 acagacagca aactcaccca gtctagtgca tgccttctta aacatcacga gactctaaga 1020 aaaggaaact gaaaacggga aagtccctct ctctaacctg gcactgcgtc gctggcttgg 1080 agacaggtga cggtccctgc gggccttgtc ctgattggct gggcacgcgt ttaatataag 1140 tggaggcgtc gcgctggcgg gcattcctga agctgacagc attcgggccg agaagcttat 1200 gtctcgctcc gtggcccttg cagtcttggc cttgctctct ctttctggcc tggaggctat 1260 ccagcgtact ccaaagattc aggtttactc acgtcatcca gcagagaatg gaaagtcaaa 1320 tttcctgaat tgctatgtgt ctgggtttca tccatccgac attgaagttg acttactgaa 1380 gaatggagag agaattgaaa aagtggagca ttcagacttg tctttcagca aggactggtc 1440 tttctatctc ttgtactaca ctgaattcac ccccactgaa aaagatgagt atgcctgccg 1500 tgtgaaccat gtgactttgt cacagcccaa gatagttaag tgggatcgag acatgggatc 1560 cggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctgata tcatggtaga 1620 tggaaccctc cttttactcc tctcggaggc cctggccctt acccagacct gggcgggctc 1680 ccactccttg aagtatttcc acacttccgt gtcccggccc ggccgcgggg agccccgctt 1740 catctctgtg ggctacgtgg acgacaccca gttcgtgcgc ttcgacaacg acgccgcgag 1800 tccgaggatg gtgccgcggg cgccgtggat ggagcaggag gggtcagagt attgggaccg 1860 ggagacacgg agcgccaggg acaccgcaca gattttccga gtgaacctgc ggacgctgcg 1920 cggctactac aatcagagcg aggccgggtc tcataccctg cagtggatgc atggctgcga 1980 gctggggccc gacaggcgct tcctccgcgg gtatgaacag ttcgcctacg acggcaagga 2040 ttatctcacc ctgaatgagg acctgcgctc ctggaccgcg gtggacacgg cggctcagat 2100 ctccgagcaa aagtcaaatg atgcctctga ggcggagcac cagagagcct acctggaaga 2160 cacatgcgtg gagtggctcc acaaatacct ggagaagggg aaggagacgc tgcttcacct 2220 ggagccccca aagacacacg tgactcacca ccccatctct gaccatgagg ccaccctgag 2280 gtgctgggcc ctgggcttct accctgcgga gatcacactg acctggcagc aggatgggga 2340 gggccatacc caggacacgg agctcgtgga gaccaggcct gcaggggatg gaaccttcca 2400 gaagtgggca gctgtggtgg tgccttctgg agaggagcag agatacacgt gccatgtgca 2460 gcatgagggg ctacccgagc ccgtcaccct gagatggaag ccggcttccc agcccaccat 2520 ccccatcgtg ggcatcattg ctggcctggt tctccttgga tctgtggtct ctggagctgt 2580 ggttgctgct gtgatatgga ggaagaagag ctcaggtgga aaaggaggga gctactctaa 2640 ggctgagtgg agcgacagtg cccaggggtc tgagtctcac agcttgtaac tcgagtctag 2700 agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 2760 tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 2820 ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 2880 tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 2940 tgcggtgggc tctatggtta attaaggtct ctataacttc gtatagcata cattatacga 3000 agttatgcta gcgagggaca gccccccccc aaagccccca gggatgtaat tacgtccctc 3060 ccccgctagg gggcagcagc gagccgcccg gggctccgct ccggtccggc gctccccccg 3120 catccccgag ccggcagcgt gcggggacag cccgggcacg gggaaggtgg cacgggatcg 3180 ctttcctctg aacgcttctc gctgctcttt gagcctgcag acacctgggg ggatacgggg 3240 aaaagctagc aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc 3300 ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt 3360 ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg 3420 ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg 3480 ccgccagaac acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc 3540 ctacctgagg ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg 3600 cctcctgaac tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgagt ccgggccttt 3660 gtccggcgct cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc 3720 tgcttgctca actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc 3780 tgtgaccggc gcctacgaat tcgccaccat ggagagcgac gagagcggcc tgcccgccat 3840 ggagatcgag tgccgcatca ccggcaccct gaacggcgtg gagttcgagc tggtgggcgg 3900 cggagagggc acccccaagc agggccgcat gaccaacaag atgaagagca ccaaaggcgc 3960 cctgaccttc agcccctacc tgctgagcca cgtgatgggc tacggcttct accacttcgg 4020 cacctacccc agcggctacg agaacccctt cctgcacgcc atcaacaacg gcggctacac 4080 caacacccgc atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg cacgtgagct tcagctaccg 4140 ctacgaggcc ggccgcgtga tcggcgactt caaggtggtg ggcaccggct tccccgagga 4200 cagcgtgatc ttcaccgaca agatcatccg cagcaacgcc accgtggagc acctgcaccc 4260 catgggcgat aacgtgctgg tgggcagctt cgcccgcacc ttcagcctgc gcgacggcgg 4320 ctactacagc ttcgtggtgg acagccacat gcacttcaag agcgccatcc accccagcat 4380 cctgcagaac gggggcccca tgttcgcctt ccgccgcgtg gaggagctgc acagcaacac 4440 cgagctgggc atcgtggagt accagcacgc cttcaagacc cccatcgcct tcgccagatc 4500 ccgcgctcag tcgtccaatt ctgccgtgga cggcaccgcc ggacccggct ccaccggatc 4560 tcgcagtact gagggcagag gaagtctcct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg 4620 ccctatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc 4680 cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc 4740 ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct 4800 cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc 4860 ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag 4920 cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa 4980 ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct 5040 gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt 5100 cctggagaca tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac 5160 cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc 5220 cggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc 5280 tggacctgct tcgtaccccg gccatcaaca cgcctctgcg ttcgaccagg ctgcgcgttc 5340 tcgcggccat agcaaccgac gtacggcgtt gcgccctcgc cggcagcaag aagccacgga 5400 agtccgcccg gagcagaaaa tgcccacgct actgcgggtt tatatagacg gtccccacgg 5460 gatggggaaa accaccacca cgcaactgct ggtggccctg ggttcgcgcg acgatatcgt 5520 ctacgtaccc gagccgatga cttactggcg ggtgctgggg gcttccgaga caatcgcgaa 5580 catctacacc acacaacacc gcctcgacca gggtgagata tcggccgggg acgcggcggt 5640 ggtaatgaca agcgcccaga taacaatggg catgccttat gccgtgaccg acgccgttct 5700 ggctcctcat atcggggggg aggctgggag ctcacatgcc ccgcccccgg ccctcaccct 5760 catcttcgac cgccatccca tcgccgccct cctgtgctac ccggccgcgc ggtaccttat 5820 gggcagcatg accccccagg ccgtgctggc gttcgtggcc ctcatcccgc cgaccttgcc 5880 cggcaccaac atcgtgcttg gggcccttcc ggaggacaga cacatcgacc gcctggccaa 5940 acgccagcgc cccggcgagc ggctggacct ggctatgctg gctgcgattc gccgcgttta 6000 cgggctactt gccaatacgg tgcggtatct gcagtgcggc gggtcgtggc gggaggactg 6060 gggacagctt tcggggacgg ccgtgccgcc ccagggtgcc gagccccaga gcaacgcggg 6120 cccacgaccc catatcgggg acacgttatt taccctgttt cgggcccccg agttgctggc 6180 ccccaacggc gacctgtata acgtgtttgc ctgggccttg gacgtcttgg ccaaacgcct 6240 ccgttccatg cacgtcttta tcctggatta cgaccaatcg cccgccggct gccgggacgc 6300 cctgctgcaa cttacctccg ggatggtcca gacccacgtc accacccccg gctccatacc 6360 gacgatatgc gacctggcgc gcacgtttgc ccgggagatg ggggaggcta actgaggatc 6420 ctgatcgagt ctagagggcc cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 6480 atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 6540 cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 6600 ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagagaata gcaggcatgc 6660 tggggaagat ctttttcccc gtatcccccc aggtgtctgc aggctcaaag agcagcgaga 6720 agcgttcaga ggaaagcgat cccgtgccac cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc 6780 tgccggctcg gggatgcggg gggagcgccg gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg 6840 ctgcccccta gcgggggagg gacgtaatta catccctggg ggctttgggg gggggctgtc 6900 cctagatcta taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatgagtctt cacacgcgta 6960 cgcggccgcc tgtgctcgcg ctactctctc tttctggcct ggaggctatc cagcgtgagt 7020 ctctcctacc ctcccgctct ggtccttcct ctcccgctct gcaccctctg tggccctcgc 7080 tgtgctctct cgctccgtga cttcccttct ccaagttctc cttggtggcc cgccgtgggg 7140 ctagtccagg gctggatctc ggggaagcgg cggggtggcc tgggagtggg gaagggggtg 7200 cgcacccggg acgcgcgcta cttgcccctt tcggcgggga gcaggggaga cctttggcct 7260 acggcgacgg gagggtcggg acaaagttta gggcgtcgat aagcgtcaga gcgccgaggt 7320 tgggggaggg tttctcttcc gctctttcgc ggggcctctg gctcccccag cgcagctgga 7380 gtgggggacg ggtaggctcg tcccaaaggc gcggcgctga ggtttgtgaa cgcgtggagg 7440 ggcgcttggg gtctggggga ggcgtcgccc gggtaagcct gtctgctgcg gctctgcttc 7500 ccttagactg gagagctgtg gacttcgtct aggcgcccgc taagttcgca tgtcctagca 7560 cctctgggtc tatgtggggc cacaccgtgg ggaggaaaca gcacgcgacg tttgtagaat 7620 gcttggctgt gatacaaagc ggtttcgaat aattaactta tttgttccca tcacatgtca 7680 cttttaaaaa attataagaa ctacccgtta ttgacatctt tctgtgtgcc aaggacttta 7740 tgtgctttgc gtcatttaat tttgaaaacg tcgacaccgg tgatatcaag cttggcgtaa 7800 tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 7860 cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 7920 attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 7980 tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 8040 ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 8100 gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 8160 ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 8220 cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 8280 ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 8340 accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 8400 catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 8460 gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 8520 tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 8580 agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 8640 actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 8700 gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 8760 aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 8820 gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 8880 aaaaggatct tcacctagat ccttttgatc cccgccacgg ttgatgagag ctttgttgta 8940 ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg 9000 aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg 9060 tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag 9120 aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca 9180 tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg 9240 atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt 9300 aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa 9360 tccggtgaga atggcaaaag tttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca 9420 ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc 9480 tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc 9540 aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct 9600 tctaatacct ggaatgctgt ttttccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca 9660 ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt 9720 ctgaccatct catctgtaac atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac 9780 tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta 9840 tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc 9900 gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa 9960 gcagacagtt ttattgttca tgatgatata tttttatctt gtgcaatgta acatcagaga 10020 ttttgagaca caattcatcg atgatggttg agatgtgtat aagagacaga ttattgaagc 10080 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 10140 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 10200 attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 10252 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1_Primer <400> 16 gccgatgtac agacagcaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2_Primer <400> 17 cgtgacttcc cttctccaag 20 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3_Primer <400> 18 ttatgagtct tcacacgcgt acgc 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4_Primer <400> 19 caggggataa atggcagcaa tcg 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gf_Primer <400> 20 tgatgggcta cggcttctac 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gr_Primer <400> 21 ctcagtcgtc caattctgcc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIN28_Foward <400> 22 acttgtcttc taccctgccc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LIN28_Reverse <400> 23 ggtgacacag tgagactcca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG_Foward <400> 24 acccagctgt gtgtactcaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG_Reverse <400> 25 ggaagagtaa aggctggggt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4_Foward <400> 26 ggtccgagtg tggttctgta 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4_Reverse <400> 27 cgaggagtac agtgcagtga 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2_Foward <400> 28 atcagcatgt atctccccgg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2_Reverse <400> 29 taccgggttt tctccatgct 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-E_Foward <400> 30 tgactttgtc acagcccaag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-E_Reverse <400> 31 ggtcctcatt cagggtgaga 20

Claims (7)

1. B2M 유전자의 엑손 (exon) 중 어느 하나의 내부에 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산이 도입된 줄기세포에 있어서,
   상기 줄기세포는 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 통해, HLA-class I의 베타체인인 β2 microglobulin을 발현하는 상기 B2M 유전자가 넉아웃 (Knock out)되고 상기 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 유전자가 넉인 (Knock in)되어 T세포 및 NK 세포에 대해 모두 면역원성이 제거된 것이고,
   상기 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 암호화하는 핵산은 서열번호 12의 염기서열로 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 B2M 유전자 및 서열번호 14의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 HLA-E 유전자를 포함하는 것이고,
   상기 벡터는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 것인, 줄기세포.
2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)인 것인, 줄기세포.
3. β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 있어서,
   상기 벡터는 인간 유도만능줄기세포 HLA-class I의 베타체인인 β2 microglobulin을 발현하는 B2M 유전자를 넉아웃 (Knock out)함과 동시에 상기 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 유전자를 넉인 (Knock in)시키는 것이고,
   상기 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 암호화하는 핵산은 서열번호 12의 염기서열로 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 B2M 유전자 및 서열번호 14의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 HLA-E 유전자를 포함하는 것이고,
   상기 벡터는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 것인, T세포와 NK 세포에 대해 모두 면역원성이 제거된 유도만능줄기세포의 생산용 벡터.
4. β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터; 및
   RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA 서열을 포함하는 제2벡터;
   를 포함하는 조성물에 있어서,
   상기 제1벡터 및 상기 제2벡터는 인간 유도만능줄기세포의 HLA-class I의 베타체인인 β2 microglobulin을 발현하는 B2M 유전자를 넉아웃 (Knock out)함과 동시에 상기 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 유전자를 넉인 (Knock in)시키는 것이고,
   상기 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 암호화하는 핵산은 서열번호 12의 염기서열로 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 B2M 유전자 및 서열번호 14의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 HLA-E 유전자를 포함하는 것이고,
   상기 제1벡터는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 것인, T세포와 NK 세포에 대해 모두 면역원성이 제거된 유도만능줄기세포의 생산용 조성물.
5. 다음 단계를 포함하는 줄기세포의 면역원성 억제방법:
   줄기세포를 포함하는 시료를 준비하는 준비 단계;
   서열번호 15의 염기서열로 이루어진 벡터를 통해 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E (Human Leukocyte Antigen-E)를 암호화하는 핵산을 상기 줄기세포의 B2M 유전자에 도입하여 넉인하는 형질 전환 단계,
   상기 β2 microglobulin이 융합된 HLA-E 암호화하는 핵산은 서열번호 12의 염기서열로 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 B2M 유전자 및 서열번호 14의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기 서열로 이루어진 HLA-E 유전자를 포함하는 것임.
6. 제5항에 있어서,
   상기 형질 전환 단계는,
   RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA 서열을 포함하는 벡터의 발현을 통해 상기 줄기세포의 B2M 유전자를 절단하는 절단 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 형질 전환 단계는 전기천공법 (electroporation)에 의해 수행되는 것인, 방법.

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