KR20220119035A - 복합재에 리간드를 커플링하는 방법 - Google Patents
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Abstract
복합재에 리간드를 커플링하는 방법이 개시된다. 리간드 용액이 관능화된 복합재를 통과하여 또는 가로질러 유동함에 따라 복합재와 리간드 사이에 공유 결합이 형성된다. 복합재는 크로마토그래피 분리 매질로서 유용하다.
Description
멤브레인-기반 수 처리 공정은 1970년대에 최초로 도입되었다. 그 이후로, 멤브레인-기반 분리 기술은 많은 다른 산업에서 활용되어 왔다. 제약 및 생명공학 산업에서는, 제조용 크로마토그래피, 직접 유동 여과 (DFF) 및 접선 유동 여과 (TFF), 예컨대 미세-, 한외-, 나노-여과 및 정용여과의 사용이 용해된 분자 또는 현탁된 미립자의 분리를 위한 잘 확립된 방법이다. 한외여과 (UF) 및 미세여과 (MF) 멤브레인은 생체분자의 제조에서 분리 및 정제를 위해 필수적이 되었다. 생체분자 제조는, 그의 규모와 관계 없이, 일반적으로 여과를 사용하는 하나 이상의 단계를 사용한다. 이들 멤브레인 분리의 매력은, 예를 들어, 공급 스트림과 투과물 사이의 압력차의 적용만을 필요로 하는 단순성, 및 높은 분리력을 포함한 여러 특징에 있다. 샘플에서 2개 분획으로의 이러한 간단하고 신뢰성 있는 1-단계 여과는 멤브레인 분리를 분리 및 정제에 대한 가치 있는 접근으로 만든다.
멤브레인과 같은 복합재의 유체-접근가능 표면에 컨쥬게이션된 리간드는 분리 및 정제 방법에서 유용하다. 그러나, 멤브레인의 화학적 개질은 수지보다 더 어렵다. 수지는 용액 중에 쉽게 현탁될 수 있고, 따라서 수지는, 현탁액을 교반함으로써 수지 중으로의 시약의 확산이 촉진되는 대형 반응기에서 개질될 수 있다. 멤브레인은 멤브레인 구조의 손상을 피하기 위해 이들이 개질 공정 동안 지지되어야 함에 따라 개질이 더 어렵다. 이는, 반응의 반응속도가 매우 빠를 때 반응 용액의 트로프를 통과하여 멤브레인이 물리적으로 이동하는 롤-투-롤(roll-to-roll) 공정에서 달성될 수 있다. 활성화된 멤브레인과의 단백질 A 리간드의 커플링과 같은, 보다 느린 반응 화학으로의 멤브레인의 개질은, 보다 긴 반응 시간을 필요로 한다. 보다 긴 반응 시간은 멤브레인의 롤-투-롤 멤브레인 개질 공정을 불가능하게 하고, 이는 극히 느린 이동 및 그에 따라 극히 긴 가공 시간을 필요로 한다.
반응 용액이 장기간에 걸쳐 복합재의 지지된 어셈블리를 통과하여 유동하는 복합재 개질 공정에 대한 필요성이 존재한다. 복합재에 대한 리간드 커플링 증가는 친화성 매질의 결합능을 개선시킨다. 컨쥬게이션 방법은 복합재에 리간드를 커플링하기 위해 빠른, 효율적인, 또한 용이하게 제어가능한 반응을 활용해야 한다.
요약
하나의 측면에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 동연적(coextensive) 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법에 관한 것이다:
a.
i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는 관능화된 복합재를 제공하는 단계; 및
b. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 용액을 제1 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제1 용액은 복수의 제1 리간드를 포함하고, 그에 따라 반응성 관능기와 제1 리간드 사이에 복수의 공유 결합이 형성되는 것인 단계.
도 1a는 관능화된 복합재의 층을 실질적으로 가로지르는 유체 유동 (접선 유동)을 갖는 인터리프(interleaf) (예를 들어, 스크린)의 층 사이에 스택킹된 예시적 복합재의 개략도를 도시한 것이다.
도 1b는 관능화된 복합재의 층을 실질적으로 통과하는 유체 유동 (직접 유동)을 갖는 인터리프 (예를 들어, 스크린)의 층 사이에 스택킹된 예시적 복합재의 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 나선형 권취 구성의 인터리프의 층과의 예시적 복합재를 나타낸다.
도 3은 배치 방법을 사용하여 컨쥬게이션된 멤브레인과 비교한 관통류(flow through) 방법을 사용하여 컨쥬게이션된 단백질 A 친화성 리간드 멤브레인의 10 멤브레인 부피/분의 유속에서의 IgG 동적 결합능을 나타낸다.
도 4는 크로마토그래피 칼럼 내에 어셈블링된 복합재 층 (즉, 멤브레인), 인터리프의 층 (즉, 스크린), 및 유동 분포 층을 예시하는 그림이다. 100개 멤브레인이 어셈블링될 때까지 10개 멤브레인을 함유하는 이 패턴이 추가로 9회 반복되었다. 이어서, 하나의 추가의 유동 분포 층이 첨가되었다.
도 5a는 스택 내의 멤브레인 위치의 함수로서의 IgG 동적 결합능을 나타낸다.
도 5b는 스택 내의 멤브레인 위치의 함수로서의 멤브레인 플럭스(flux)를 나타낸다.
도 6은 스크린과 인터리빙(interleaving)된 나선형 권취 롤 상의 단백질 A 리간드와의 접선 유동 커플링 후 직사각형 멤브레인 시트로부터 복합재의 원형 섹션이 제거된 상이한 위치를 예시하는 그림이다.
도 1b는 관능화된 복합재의 층을 실질적으로 통과하는 유체 유동 (직접 유동)을 갖는 인터리프 (예를 들어, 스크린)의 층 사이에 스택킹된 예시적 복합재의 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 나선형 권취 구성의 인터리프의 층과의 예시적 복합재를 나타낸다.
도 3은 배치 방법을 사용하여 컨쥬게이션된 멤브레인과 비교한 관통류(flow through) 방법을 사용하여 컨쥬게이션된 단백질 A 친화성 리간드 멤브레인의 10 멤브레인 부피/분의 유속에서의 IgG 동적 결합능을 나타낸다.
도 4는 크로마토그래피 칼럼 내에 어셈블링된 복합재 층 (즉, 멤브레인), 인터리프의 층 (즉, 스크린), 및 유동 분포 층을 예시하는 그림이다. 100개 멤브레인이 어셈블링될 때까지 10개 멤브레인을 함유하는 이 패턴이 추가로 9회 반복되었다. 이어서, 하나의 추가의 유동 분포 층이 첨가되었다.
도 5a는 스택 내의 멤브레인 위치의 함수로서의 IgG 동적 결합능을 나타낸다.
도 5b는 스택 내의 멤브레인 위치의 함수로서의 멤브레인 플럭스(flux)를 나타낸다.
도 6은 스크린과 인터리빙(interleaving)된 나선형 권취 롤 상의 단백질 A 리간드와의 접선 유동 커플링 후 직사각형 멤브레인 시트로부터 복합재의 원형 섹션이 제거된 상이한 위치를 예시하는 그림이다.
상세한 설명
개요
친화성 매질의 능력은 주로, 복합재과 같은 매질의 유체-접근가능 표면에 컨쥬게이션될 수 있는 친화성 리간드의 양에 의존한다. 복합재에 대한 리간드 커플링을 증가시키는 컨쥬게이션 방법은 결합능을 증가시킬 것이다. 일부 실시양태에서, 이들 방법은 복합재를 관능화하기 위해 빠른, 효율적인, 또한 용이하게 제어가능한 반응을 활용한다. 일부 실시양태에서, 복합재는 흡착성 거대다공성 크로마토그래피 멤브레인이다. 일부 실시양태에서, 리간드 용액의 멤브레인을 가로지르는 (즉, 접선 유동) 또는 멤브레인을 통과하는 직접 유동 (즉, 폐쇄단(dead-end) 유동)을 수반하는 친화성 리간드 컨쥬게이션의 방법은, 배치 또는 정적 컨쥬게이션 방법에 비해 개선된 동적 결합능을 갖는 친화성 멤브레인을 생성한다.
크로마토그래피 멤브레인은 신속한 정제 또는 분리 작업을 용이하게 하기 위해 빠른 대류적 질량 수송 메커니즘을 이용한다. 그러나, 이들 작업의 생산성을 최대화하기 위해, 표적 화합물에 대한 멤브레인의 결합능이 최대화되어야 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 유속, 완충제 pH 및 농도, 친화성 리간드 농도, 및 노출 시간의 적절한 조건 하에 펜던트 반응성 관능기를 함유하는 멤브레인에 대한 리간드의 컨쥬게이션을 위한 관통류 또는 폐쇄단 유동 공정을 기재한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 유속, 완충제 pH 및 농도, 친화성 리간드 농도, 및 노출 시간의 적절한 조건 하에 펜던트 반응성 관능기를 함유하는 멤브레인에 대한 리간드의 컨쥬게이션을 위한 교차류(crossflow) 또는 접선 유동 공정을 기재한다. 일부 실시양태에서, 방법은 유사한 완충제 조건 및 친화성 리간드를 사용한 배치, 비-유동 컨쥬게이션 방법을 사용함으로써 달성되는 것보다 더 큰 단백질 결합능을 갖는 컨쥬게이션된 친화성 크로마토그래피 멤브레인을 생성한다.
관통류 및 교차류 컨쥬게이션 방법은 일관적으로 보다 높은 멤브레인 결합능을 생성하고, 반응 진행 및 그에 의해 반응 공정 최적화의 실시간 관찰을 가능하게 하는 인라인 측정 도구를 함유하는 장비 상에서 수행될 수 있다. 빠른 결합 반응속도와 조합된, 보다 높은 멤브레인 결합능은, 신속한, 높은 생산성의 크로마토그래피 정제 작업을 가능하게 한다.
정의
편의상, 본 발명의 추가 설명 전에, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 특정 용어가 여기에 수집된다. 이들 정의는 본 개시내용의 나머지 부분에 비추어 읽혀야 하며 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 설명에 있어, 다양한 용어가 설명에서 사용된다. 표준 용어가 여과, 유체 전달, 및 일반적 유체 가공 분야에서 폭넓게 사용된다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 포함적, 개방적 의미로 사용되며, 추가의 요소가 포함될 수 있음을 의미한다.
용어 "포함함"은 "포함하나 제한되지 않음"을 의미하기 위해 사용된다. "포함함" 및 "포함하나 제한되지 않음"은 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "친화성 크로마토그래피"는 부동화 리간드와 그의 결합 파트너 사이의 특정 결합 상호작용에 기초한 분리 방법을 지칭한다. 특정 결합 상호작용의 예는 항체/항원, 효소/기질, 및 효소/억제제 상호작용을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "친화성 매질"은 복수의 부동화 리간드를 포함하는 재료를 지칭한다. 예를 들어, 공유 결합된 리간드를 포함하는 복합재.
용어 "중합체"는 반복 단위 (단량체)의 연합에 의해 형성된 큰 분자를 지칭한다. 용어 중합체는 또한 공중합체를 포함한다.
용어 "공중합체"는 적어도 2개 이상의 상이한 단량체의 중합체를 지칭한다. 공중합체는, 가교제가 이관능성 단량체인 경우, 가교제 및 단량체로 구성될 수 있다.
용어 "관능화된 복합재"는 지지 부재의 세공 내에 위치한 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 거대다공성 가교 겔을 지칭한다.
용어 "펜던트 반응성 관능기"는, 리간드 용액이 관능기와 접촉될 때 리간드와 하나 이상의 공유 결합을 형성할 관능기를 지칭한다. 아민 기를 포함하는 리간드와 공유 결합을 형성할 펜던트 반응성 관능기의 예는 에폭시드, 알데히드, 카르복실산, 반응성 할로겐, 반응성 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 술포닐 할라이드, 카르보니이미드, 아실 아지드, 플루오로벤젠, 카르보네이트, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이미도에스테르, 및 플루오로페닐 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 티올 기를 포함하는 리간드와 공유 결합을 형성할 펜던트 반응성 관능기의 예는 에폭시드, 티올, 디술피드, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 말레이미드, 할로아세틸, 피리딜 디술피드, 티오술페이트, 및 반응성 할로겐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "리간드"는 특정 결합 파트너에 결합하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 단백질, 항체, 호르몬, 또는 약물이 특정 수용체에 결합한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질 A" 또는 "PrA"는 높은 친화성으로 면역글로불린 G (IgG) 클래스의 포유류 항체에 결합하는 능력을 갖는 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 박테리아 단백질, 단백질 A 유도체, 또는 재조합 단백질 A를 지칭한다. 예를 들어, 단백질 A는 그의 네이티브 공급원 (예를 들어, 스타필로콕쿠스 아우레우스)으로부터 회수될 수 있다. 단백질 A는 합성적으로 생성될 수 있고 (예를 들어, 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 기술에 의해), Fc 영역과 같은 CH2/CH3 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 그의 단편 및 변종일 수 있다. 단백질 A는, 예를 들어, 레플리겐(Repligen), 파마시아(Pharmacia), 이엠디 밀리포어(EMD Millipore) 및 페르마텍(Fermatech)으로부터, 상업적으로 구입될 수 있다. 단백질 A에 대한 유전자는 대장균(Escherichia coli)에서 클로닝되고 발현되었고, 이는 다량의 재조합 단백질 A 및 단백질 A 유도체의 생성을 가능하게 한다.
커플링 방법과 관련하여 용어 "세척 용액"은 커플링 반응물을 제거할 용액을 지칭한다. 즉, 임의의 과량의 중합가능 단량체 및 임의의 과량의 리간드를 제거할 용액.
커플링 방법과 관련하여 용어 "켄칭 용액"은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기와 공유 결합하여 비-반응성 기를 형성할 반응성 화합물을 포함하는 용액을 의미하기 위해 사용된다. 즉, 반응성 화합물은 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시킬 것이다.
용어 "비-반응성 기"는 추가의 커플링 반응 및 분리 방법의 조건 하에 공유 결합을 형성하지 않을 기를 지칭한다. 예를 들어, 물질의 혼합물을 포함하는 유체에 대한 비-반응성 기의 노출은 물질과 비-반응성 기 사이의 공유 결합의 형성을 초래하지 않을 것이다.
용어 "완충제"는 그의 산-염기 컨쥬게이션 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 용액을 지칭한다. 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 다양한 완충제는 "완충제"에 기재되어 있다. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). 상이한 완충제는 상이한 범위의 pH를 유지하고, 예를 들어 인산염 완충제는 통상적으로 6.0 내지 8.0의 pH에 대해 사용되지만, 보다 높은 pH에 대해서는, 붕산염 완충제가 사용될 수 있고, 보다 낮은 pH에 대해서는, 탄산염 완충제가 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 유지될 pH에 따라, 사용할 적합한 완충제를 쉽게 식별할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 완충제의 비-제한적 예는 MES, MOPS, MOPSO, 트리스(Tris), HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 카르보네이트, 보레이트, 및 암모늄 완충제, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
유체 유동 및 여과와 관련하여 용어 "교차류"는 유동하는 유체가 복합재 (예를 들어, 여과 매질)의 표면을 따라 지향되는 유체 유동 또는 여과 구성을 의미하기 위해 사용되고, 이러한 복합재를 통과하여 지나가는 유체의 부분은 "횡방향"인, 즉, 이러한 복합재의 표면을 따라 유동하는 유체의 방향에 수직인 속도 성분을 갖는다.
용어 "접선 유동" 또는 "접선 여과"는 유동하는 유체가 복합재 (예를 들어, 여과 매질)의 표면에 실질적으로 평행하게 (즉, 접선) 지향되는 유체 유동 또는 여과 공정을 의미하기 위해 사용되고, 유체의 일부는 이러한 복합재를 통과하여 지나가는 투과물을 제공한다. 용어 "접선 여과" 및 "교차류 여과"는 관련 기술분야에서 종종 상호교환가능하게 사용된다.
유체 유동 및 여과와 관련하여 용어 "폐쇄단"은 유동하는 유체가 복합재 (예를 들어, 여과 매질)을 통과하여 지향되는 유체 유동 또는 여과 구성을 의미하기 위해 사용되고, 이러한 복합재를 통과하는 유체의 부분은 이러한 복합재를 통과하여 유동하는 유체의 방향을 통과하는, 즉, 그에 평행한 속도 성분을 갖는다.
용어 "직접 유동" 또는 "직접 여과"는 유동하는 유체가 복합재 (예를 들어, 여과 매질)의 표면을 실질적으로 통과하여 (즉, 직접) 지향되는 유체 유동 또는 여과 공정을 의미하기 위해 사용되고, 유체의 대부분은 이러한 복합재를 통과하여 지나가 여과물을 제공한다. 용어 "직접 여과" 및 "폐쇄단 여과"는 관련 기술분야에서 종종 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "투과물"은 여과 매질을 통과하여, 또한 이러한 여과 매질에 작동가능하게 연결된 여과 장치 내의 제1 유출구 포트를 통과하여 외부로 지나가는 유체의 부분을 의미하기 위해 사용된다. 용어 "디캔테이트(decantate)"는 여과 매질의 표면을 따라 유동하지만 이러한 여과 매질을 통과하여 지나가지 않고, 이러한 여과 매질에 작동가능하게 연결된 여과 장치 내의 제2 유출구 포트를 통과하여 외부로 지나가는 유체의 부분을 의미하기 위해 사용된다.
교차류 여과 및 접선 여과는 널리 공지된 여과 공정이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,681,464, 6,461,513; 6,331,253, 6,475,071, 5,783,085, 4,790,942를 참조할 수 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 또한, 문헌 ["Filter and Filtration Handbook", 4th Ed., T. Christopher Dickenson, Elsevier Advanced Technology, 1997]을 참조할 수 있으며, 이것의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
"결합-용리 모드"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 표적 단백질 및 원치않는 오염물 둘 다 크로마토그래피 지지체 또는 복합재에 결합하도록 완충제 조건이 확립된 크로마토그래피에 대한 작동적 접근을 지칭한다. 다른 성분으로부터의 표적 단백질의 분별분리는, 이후에 표적 단백질 및 오염물이 별도로 용리되도록 조건을 변화시킴으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 멤브레인은 높은 전도도, 높은 부피 처리량 및 선택성에서의 높은 동적 결합능을 특징으로 하는 "결합-용리 모드"로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 용리액 중의 표적 단백질의 양은 약 50% 내지 약 99%만큼 감소된다. 특정 실시양태에서, 용리액은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%만큼 표적 단백질의 응집물에서 감소된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관통류 모드"는 적용시 온전한 표적 단백질은 멤브레인을 통과하여 유동하지만 오염물은 선택적으로 보유되도록 완충제 조건이 확립된 크로마토그래피에 대한 작동적 접근을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 멤브레인은, 단일 단계에서 DNA, 숙주 세포 단백질 (HCP), 침출 단백질 A, 바람직하지 않은 응집물, 및 바이러스와 같은 핵심 오염물을 제거하기 위한 후-단백질 A 정제 공정에서 "관통류 모드"로 사용될 수 있다.
거대다공성 가교 겔의 "평균 세공 직경"이라는 용어는 임의의 적합한 방법에 의해 결정되는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 평균 세공 직경은 표면의 환경 주사 전자 현미경검사 (ESEM) 이미지에 의해 추정될 수 있다. ESEM은 미세여과 멤브레인을 특성화하기 위한 매우 간단하고 유용한 기술일 수 있다. 멤브레인의 명확하고 간결한 그림이 상단 층, 단면 및 저부 층에 대하여 얻어질 수 있고; 다공도 및 세공 크기 분포가 사진으로부터 추정될 수 있다.
지지 부재의 "부피 다공도"는 간단한 계산에 의해 결정된다. 예를 들어, 폴리프로필렌으로 제조된 지지 부재의 경우, 지지 부재의 외부 치수를 측정하고, 응집물 부피를 계산한다 [예를 들어, 편평한 원형 디스크의 경우: V = πr2h이고, 솔리드이고 다공성이 아닌 경우의 지지 부재의 부피임]. 이어서 지지 부재의 질량을 결정한다. 폴리프로필렌의 밀도는 공지되어 있거나 문헌 [Polymer Handbook, edited by Brandrup et al., Chapter VII, Wiley and Sons, New York, 1999]으로부터 결정될 수 있기 때문에, 부피 다공도는 하기 예에서와 같이 계산된다:
부피 다공도 = {(솔리드인 경우 지지 부재의 부피) - [(지지 부재의 질량) / (폴리프로필렌의 밀도)]} / (솔리드인 경우 지지 부재의 부피).
이 계산에서, 지지 부재의 공극 부피 = (지지 부재의 외부 치수의 부피) - [(지지 부재의 질량) / (폴리프로필렌의 밀도)]이다. 예를 들어, 폴리프로필렌의 밀도 = 0.91 g/cm3.
복합재의 부피 다공도, ε은 각각의 복합재에 대하여 실험적으로 결정된 값이다. 이는 질량 기준으로 계산된다. 거대다공성 가교 겔은 지지 부재의 공극 부피 내로 혼입된다. 혼입된 겔의 질량은 일정한 중량까지 건조 후 측정된다. 중합체의 부분 비부피(specific volume)는 공지되어 있거나 문헌 [Polymer Handbook, edited by Brandrup et al., Chapter VII, Wiley and Sons, New York, 1999]로부터 결정될 수 있다. 겔이 차지할 수 있는 최대 부피는 지지 부재의 공극 부피 (상기에 기재된 바와 같이 계산됨)이다. 겔의 부피 다공도는 하기와 같이 계산된다:
ε = {(지지 부재의 공극 부피) - [(겔의 질량) x (겔 중합체의 부분 비부피 )]} / (지지 부재의 공극 부피)
일부 실시양태에서, 리간드는 단백질 A (PrA)이다. PrA 포획 크로마토그래피는 생물요법 모노클로날 항체 (mAb)의 하류 정제에서 하나의 중요한 단계이다. PrA 리간드는 대부분의 불순물 (숙주 세포 단백질, DNA, 잔류 세포 배지)이 수지를 통과하여 유동할 수 있게 하면서 mAb 상의 Fc 및/또는 Fab 결합 도메인에 선택적으로 결합한다. PrA 매질은 전형적으로 추가 불순물 제거를 위해 로딩 단계 후에 세척되고, 이어서 포획된 mAb가 낮은 pH에서 용리된다. 용리에서 mAb는 현저히 더 순수하고 또한 정화된 세포 배양물에 대하여 농축된 것이다. 그러나, 예를 들어, PrA와의 친화성 매질은 매우 고가이고, 배치 당 비용을 감소시키기 위해 수년에 걸쳐 많은 배치에 사용되어야 한다. 이상적으로 친화성 매질은 표적 물질, 예를 들어, mAb의 단일 배치의 정제를 위해 그의 최대 수의 포획 크로마토그래피 사이클 (~200)에 사용될 수 있고, 이는 단일 배치의 가공에 필요한 PrA 매질의 부피를 현저히 감소시킨다. 이어서 PrA 매질은 mAb의 단일 배치의 정제 후에 처분되어 수지 저장과 관련된 비용을 제거할 수 있다. 현재, 생물요법 mAb의 하류 정제에 사용되는 대부분의 PrA 매질은 수지의 형태이다. 다공성 수지 구조로의 mAb의 느린 질량 전달은 2 내지 10 min 범위의 체류 시간으로 긴 로딩 시간을 필요로 한다. 로딩 단계 동안 체류 시간 감소는, 크로마토그래피 매질 상으로 로딩된 mAb의 질량을 크로마토그래피 매질의 부피로 나눈 것으로 정의되는 PrA 수지의 동적 결합능을 현저히 감소시킨다. 보다 긴 로딩 시간은 PrA 포획 크로마토그래피 단계를 수일까지 연장시키지 않으면서 배치 당 수회 (2-4) 초과로 수지를 사이클링하는 것을 불가능하게 한다.
PrA 멤브레인은 훨씬 더 낮은 체류 시간 (예를 들어, 0.1-1 min)으로 로딩될 수 있고, 그에 따라 포획 크로마토그래피 단계를 신속하게 사이클링하는 기회를 제공한다. 일부 실시양태에서, PrA 멤브레인의 신속한 사이클링은 동일한 부피의 PrA 수지에 대하여 동일한 양의 시간 내에 훨씬 더 많은 mAb가 정제될 수 있게 한다. 그에 따라, 주어진 기간에 걸쳐, 작은 부피의 PrA 멤브레인의 신속한 사이클링을 사용하여 더 적은 횟수로 사이클링된 훨씬 더 큰 부피의 수지와 동일한 양의 mAb를 포획할 수 있다. 일부 실시양태에서, PrA 멤브레인은 mAb의 단일 배치를 가공하는 데 PrA 멤브레인의 전체 수명을 사용할 가능성을 제공하여, mAb 하류 정제 공정의 확립을 위한 선행 비용을 현저히 감소시키고 수지 저장과 관련된 비용을 제거한다.
일부 실시양태에서, 단백질 A는 친화성 리간드이다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 펜던트 반응성 관능기 (예를 들어, Cys의 티올 또는 Lys의 아민)와 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티 및 모노클로날 항체 (예를 들어, IgG 항체)에 결합하는 리간드를 포함하는 단백질, 펩티드, 또는 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 펜던트 반응성 관능기과 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티 및 항체의 Fc 도메인과 결합하는 리간드를 포함하는 단백질, 펩티드, 또는 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 펜던트 반응성 관능기과 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티 및 항체의 Fab 도메인과 결합하는 리간드를 포함하는 단백질, 펩티드, 또는 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 복수의 펜던트 반응성 관능기와 복수의 공유 결합을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 관능화된 복합재에 대한 다수의 공유 결합을 형성한다.
일부 실시양태에서, 단백질 A는 다수의 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개, 또는 그 초과의 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 도메인은 서로 동일하다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 도메인은 서로 상이하다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 분해 저항성이다.
일부 실시양태에서, 단백질 A는 고체 상 지지재 상에 부동화된다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 복합재에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 단백질 A가 공유 부착되는 크로마토그래피 고체 지지체 매트릭스를 함유하는 친화성 크로마토그래피 수지 또는 칼럼을 지칭한다.
복합재의 화학적 개질은 수지에 비해 더 어렵다. 예를 들어, 느린 반응 화학을 갖는 멤브레인의 롤-투-롤 개질 공정은 반응 용액을 통과하는 멤브레인의 극히 느린 이동 및 극히 긴 가공 시간을 필요로 하며, 이는 대규모 개질과 비상용성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 리간드 커플링 방법은 멤브레인과 같은 복합재를 개질하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은
a.
i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는 관능화된 복합재를 제공하는 단계; 및
b. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 용액을 제1 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제1 용액은 복수의 제1 리간드를 포함하고, 그에 따라 반응성 관능기와 제1 리간드 사이에 복수의 공유 결합이 형성되는 것인 단계
를 포함하며, 여기서 관능화된 복합재는 동연적 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 것인, 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법에 관한 것이다.
예시적 관능화된 복합재
겔의 조성물
일부 실시양태에서, 가교 겔은 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 계내 반응을 통해 형성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 겔은 하나 이상의 가교가능 중합체와 하나 이상의 가교제의 반응을 통해 형성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가교 중합체는 거대다공성이다. 중합체 내의 다공도는 가교도, 중합체 네트워크의 형성 동안 중합체 사슬의 용매 배제, 또는 이들 둘의 일부 조합에 의해 중합 동안 촉진될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교제의 증가된 농도는 거대다공성 가교 겔을 생성한다. 일부 실시양태에서, 다공도는 중합체 - (희석제 + 단량체) 상호작용의 정도, 가교제의 양, 희석제의 양, 개시제 농도, 및 중합 온도 변화에 의해 영향받는다.
중합체에서 가교도는 단량체 비율을 조정함으로써 조율될 수 있다. 중합체 네트워크에서의 중합체의 사슬 길이, 및 그에 따라, 가교도는 또한, 최종 중합체 및 멤브레인에 특정 물리화학적 특성을 부여하는 특정 단량체를 사용함으로써 제어될 수 있다. 이들 단량체의 "조율"은 중합체 사슬과 용매 시스템의 상호작용에 영향을 줄 수 있다. 또한, 이들 단량체의 친수성/소수성은 생성된 겔의 최종 수성 팽윤 특성 및 중합체 네트워크의 친수성/소수성 표면 특성에 영향을 줄 수 있다.
세공이 없는 복합재의 형성을 최소화하기 위해, 용매 시스템 및 단량체는 특정 지점에서의 용액으로부터의 중합체 사슬 성장을 배제함으로써 거대세공을 형성하 위해 적절한 구동력이 존재하는 것을 보장하도록 선택된다. 구체적으로, 용매 및 비-용매의 혼합물은 모든 반응물을 초기에 용해시킬 수 있지만 가교 중합체 사슬에 대하여 이들이 특정 분자량 초과로 성장함에 따라 빈용매(poor solvent)로서 작용하는 적합한 반응 시스템을 제공하도록 조율된다. (중합체 사슬에 대하여) 빈용매를 지나치게 높은 비율로 갖는 용매 시스템은 성장하는 중합체 사슬의 급속한 침전을 초래할 수 있고, 이는 다공도를 감소시킨다. 거대세공의 크기는 일반적으로 가교제의 성질 및 농도, 겔이 형성되는 용매 또는 용매들의 성질, 임의의 중합 개시제 또는 촉매의 양, 또한 존재하는 경우, 포로젠의 성질 및 농도에 의존한다. 특정 실시양태에서, 복합재는 좁은 세공-크기 분포를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 거대다공성 가교 겔은 불활성 희석제의 존재 하에 중합가능 단량체의 자유-라디칼 가교 중합 동안 상 분리의 결과로 형성된다. 일부 실시양태에서, 반응 시스템은 거대다공성 가교 중합체를 형성하기 위한 중합체 네트워크, 가용성 중합체, 및 저분자 화합물 (단량체 및 희석제)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 거대다공성 가교 겔은 용매 중에서 단지 약간 팽윤된다.
일반적으로, 많은 고도 다공성 및 비-강성 중합체 재료는 비교적 약하고 전형적인 멤브레인 분리 공정 (예를 들어, 액체 크로마토그래피) 동안 생성되는 압력을 견딜 수 없다. 따라서, 기계적으로 적합한 멤브레인을 제조하기 위해, 특정 실시양태에서는, 중합체를 기재 세공 내에서 직접 합성함으로써 다공성 기재 (예컨대 화학적으로 불활성인 폴리프로필렌으로 제조된 제직 기재) 및 다공성 가교 중합체 둘 다를 포함하는 복합재를 생성한다.
특정 실시양태에서, 환경 주사 전자 현미경검사 (ESEM)를 사용하여 검사시, 복합재는 기재 섬유 내에 혼입된 잘 연결된 겔 네트워크를 나타내었다.
일부 실시양태에서, 또한 중합체 사슬의 번들링 또는 측면 응집으로서 언급되는, 높은 중합체 밀도 영역의 형성은, 높은 중합체 밀도의 영역 사이에 거대세공을 남긴다. 일부 실시양태에서, 거대다공성 가교 겔은 불균질 외관을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 멤브레인으로서 사용되는 복합재는 미국 특허 번호 7,316,919; 8,206,958; 8,187,880; 8,211,682; 8,652,849; 8,192,971; 8,206,982; 8,367,809; 8,383,782; 8,133,840; 9,962,691; 및 10,357,766; 및 미국 특허 출원 일련 번호 14/190,650, 16/055,786, 및 16/516,500에 기재되어 있으며; 이들 모두 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 관능화된 복합재가
i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는 것인, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재의 거대다공성 가교 겔이 약 5 nm 내지 약 10,000 nm의 평균 직경의 거대세공을 갖는 것인, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 거대다공성 가교 겔은 약 10 nm 내지 약 3000 nm의 평균 직경의 거대세공을 갖는다. 특정 실시양태에서, 거대다공성 가교 겔은 약 25 nm 내지 약 1500 nm의 평균 직경의 거대세공을 갖는다. 특정 실시양태에서, 거대다공성 가교 겔은 약 50 nm 내지 약 1000 nm의 평균 직경의 거대세공을 갖는다. 특정 실시양태에서, 거대다공성 가교 겔은 약 50 nm, 약 100 nm, 약 150 nm, 약 200 nm, 약 250 nm, 약 300 nm, 약 350 nm, 약 400 nm, 약 450 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 또는 약 700 nm의 평균 직경의 거대세공을 갖는다.
특정 실시양태에서, 거대세공의 직경은 본원에 기재된 기술 중 하나에 의해 추정된다. 특정 실시양태에서, 거대세공의 직경은 모세관 유동 세공측정에 의해 계산된다. 단지 최대 다공도가 주어진 재료의 특징적 특성이기 때문에, 최대 대공도에 대하여 거대다공도를 정의하는 것이 적절하다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재의 거대다공성 가교 겔이 중성 히드로겔, 대전된 히드로겔, 다가전해질 겔, 소수성 겔, 중성 겔, 또는 관능기를 포함하는 겔인, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재의 거대다공성 가교 겔이 중성 또는 대전된 히드로겔이고; 중성 또는 대전된 히드로겔이 가교된 폴리(비닐 알콜), 폴리(아크릴아미드), 폴리(이소프로필아크릴아미드), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시메틸 아크릴레이트), 폴리(에틸렌 옥시드), 아크릴산 또는 메타크릴산과 아크릴아미드, 이소프로필아크릴아미드, 또는 비닐피롤리돈의 공중합체, 아크릴아미드-2-메틸-1-프로판술폰산과 아크릴아미드, 이소프로필아크릴아미드, 또는 비닐피롤리돈의 공중합체, (3-아크릴아미도-프로필) 트리메틸암모늄 클로라이드와 아크릴아미드, 이소프로필아크릴아미드, 또는 N-비닐-피롤리돈의 공중합체, 및 디알릴디메틸암모늄 클로라이드와 아크릴아미드, 이소프로필아크릴아미드, 또는 비닐피롤리돈의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재의 거대다공성 가교 겔이 다가전해질 겔이고; 다가전해질 겔이 가교된 폴리(아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰산) 및 그의 염, 폴리(아크릴산) 및 그의 염, 폴리(메타크릴산) 및 그의 염, 폴리(스티렌술폰산) 및 그의 염, 폴리(비닐술폰산) 및 그의 염, 폴리(알긴산) 및 그의 염, 폴리[(3-아크릴아미도프로필)트리메틸암모늄] 염, 폴리(디알릴디메틸암모늄) 염, 폴리(4-비닐-N-메틸피리디늄) 염, 폴리(비닐벤질-N-트리메틸암모늄) 염, 및 폴리(에틸렌이민) 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재의 거대다공성 가교 겔이 소수성 겔이고; 소수성 겔이 에틸 아크릴레이트, n-부틸 아크릴레이트, 프로필 아크릴레이트, 옥틸 아크릴레이트, 도데실 아크릴레이트, 옥타데실아크릴아미드, 스테아릴 아크릴레이트, 및 스티렌의 가교 중합체 또는 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재의 거대다공성 가교 겔이 중성 겔이고; 중성 겔이 아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, N-메타크릴로일아크릴아미드, N-메틸-N-비닐아세트아미드, 및 N-비닐피롤리돈의 가교 중합체 또는 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 가교된 복합재 (예를 들어, 멤브레인)는 관능화된 복합재를 제공하기 위해 화학적 관능기 또는 분자 종으로 추가로 그래프팅된다. 특정 실시양태에서, 가교 중합체는 관능화된 복합재를 형성하기 위해 후-중합 개질에 의해 관능화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 관능화된 가교 중합체를 포함하는 관능화된 복합재는 후-중합 개질에 의해 리간드에 커플링될 수 있다. 이러한 2-단계 방법에서, 과량의 펜던트 반응성 관능기가 별도의 그래프팅 단계 동안 개질되고, 예를 들어, 과량의 티올 또는 알켄 기가 티올-알켄 중합 동안 생성된다. 단량체 및 가교제 공급 비율을 제어함으로써, 최종 중합체는 과잉의 펜던트 반응성 관능기를 가질 수 있다. 관능화된 복합재의 펜던트 반응성 관능기가 이후에 커플링 반응, 예컨대 클릭 반응에 사용되어 최종 중합체 화학 또는 관능성을 추가로 개질할 수 있다. 특정 실시양태에서, 복합재 중의 가교 중합체는, 커플링 반응을 통해 다양한 리간드에 부착되기 위해 사용될 수 있는, 티올 또는 불포화 탄소-탄소 결합과 같은, 펜던트 반응성 관능기로서 언급되는 잔류 반응성 기를 함유한다. 특정 실시양태에서, 이러한 접근은 크로마토그래피에 유용한 다양한 리간드를 함유하는 중합체 복합재 (예를 들어, 멤브레인) 제조에서 유용하다. 예를 들어, 생체분자 (예를 들어, 단백질)의 크로마토그래피 분리. 예를 들어, 이러한 접근은 복합재 (예를 들어, 멤브레인) 이온 교환 관능기 (예를 들어, 카르복실레이트, 술포네이트, 4급 암모늄, 아민), 소수성 상호작용 모이어티 (예컨대 1-옥탄티올 또는 1-옥텐 사용에 의한 옥틸 기), 및 생체-친화성 크로마토그래피를 위한 생체분자 (예컨대 모노클로날 항체 정제를 위한 시스테인-단백질 A)의 도입에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 복합재는 높은 선택성 및 높은 유동 속도, 낮은 배압을 나타내고, 저가이며, 긴 칼럼-수명, 짧은 공정-시간, 및 전체적 작업 유연성을 가능하게 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재가 멤브레인인, 상기 언급된 복합재 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재가 약 50° 내지 약 120°의 수 접촉각을 갖는 것인, 상기 언급된 복합재 중 어느 하나에 관한 것이다.
다공성 지지 부재
일부 실시양태에서, 지지 부재는 공극 부피를 갖고; 지지 부재의 공극 부피는 거대다공성 가교 겔로 실질적으로 충전된다. 일부 실시양태에서, 다공성 지지 부재는 약 40% 내지 약 90%의 부피 다공도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 다공성 지지 부재는 약 50% 내지 약 80%의 부피 다공도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 다공성 지지 부재는 약 50%, 약 60%, 약 70%, 또는 약 80%의 부피 다공도를 갖는다.
특정 실시양태에서, 다공성 지지체는 편평하다.
특정 실시양태에서, 다공성 지지체는 디스크 형상이다.
많은 다공성 기재 또는 멤브레인이 지지 부재로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다공성 지지 부재는 중합체 재료로 제조된다. 특정 실시양태에서, 지지체는 폴리올레핀일 수 있고, 이는 저가로 입수가능하다. 특정 실시양태에서, 폴리올레핀은 폴리(에틸렌), 폴리(프로필렌), 또는 폴리(비닐리덴 디플루오라이드)일 수 있다. 열 유도된 상 분리 (TIPS), 또는 비-용매 유도된 상 분리에 의해 제조된 확장된 폴리올레핀 멤브레인이 언급된다. 특정 실시양태에서, 지지 부재는 천연 중합체, 예컨대 셀룰로스 또는 그의 유도체로부터 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적합한 지지체는 폴리에테르술폰 멤브레인, 폴리(테트라플루오로에틸렌) 멤브레인, 나일론 멤브레인, 셀룰로스 에스테르 멤브레인, 섬유유리, 또는 여과지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 지지 부재는 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리페닐렌옥시드, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체 재료를 포함한다.
특정 실시양태에서, 다공성 지지체는 제직 또는 부직 섬유상 재료, 예를 들어, 폴리올레핀, 예컨대 폴리프로필렌으로 구성된다. 이러한 섬유상 제직 또는 부직 지지 부재는 TIPS 지지 부재보다 더 큰, 일부 경우에는 최대 약 75 μm의 세공 크기를 가질 수 있다. 지지 부재의 보다 큰 세공은 거대다공성 겔에서 보다 큰 거대세공을 갖는 복합재의 형성을 가능하게 한다. 비-중합체 지지 부재, 예컨대 세라믹계 지지체가 사용될 수도 있다. 다공성 지지 부재는 다양한 형상 및 크기를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 지지 부재는 멤브레인의 형태이다.
일부 실시양태에서, 지지 부재는 약 10 내지 약 2000 μm, 약 10 내지 약 1000 μm, 또는 약 10 내지 약 500 μm의 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지지 부재는 약 30 μm 내지 약 300 μm의 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 지지 부재의 두께는 약 30 μm, 약 50 μm, 약 100 μm, 약 150 μm, 약 200 μm, 약 250 μm, 또는 약 300 μm이다.
일부 실시양태에서, 지지 부재의 세공은 약 0.1 μm 내지 약 50 μm의 평균 세공 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지지 부재의 세공은 약 0.1 μm 내지 약 25 μm의 평균 세공 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지지 부재의 세공은 약 0.5 μm 내지 약 15 μm의 평균 세공 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지지 부재의 세공은 약 0.5 μm, 약 1 μm, 약 2 μm, 약 3 μm, 약 4 μm, 약 5 μm, 약 6 μm, 약 7 μm, 약 8 μm, 약 9 μm, 약 10 μm, 약 11 μm, 약 12 μm, 약 13 μm, 약 14 μm, 또는 약 15 μm의 평균 세공 직경을 갖는다.
다른 실시양태에서는, 다수의 다공성 지지체 단위가, 예를 들어, 스택킹에 의해, 조합될 수 있다. 하나의 실시양태에서는, 겔이 다공성 지지체의 공극 내에 형성되기 전에, 다공성 지지체 멤브레인, 예를 들어, 2 내지 10개 멤브레인의 스택이 어셈블링될 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 단일 지지 부재 단위가 복합재 멤브레인 형성에 사용되고, 이어서 이것이 사용 전에 스택킹된다.
겔과 지지 부재 사이의 관계
겔은 지지 부재 내에 앵커링될 수 있다. 용어 "앵커링된"은 겔이 지지 부재의 세공 내에서 유지됨을 의미하도록 의도되지만, 용어는 겔이 지지 부재의 세공에 화학적으로 결합됨을 의미하는 것으로 반드시 제한되지는 않는다. 겔은, 실제로 지지 부재에 화학적으로 그래프팅되지 않으면서, 지지 부재의 구조적 요소와 맞물리고 얽힘으로써 그에 부과된 물리적 제약에 의해 유지될 수 있지만, 일부 실시양태에서는, 겔이 지지 부재의 세공의 표면에 그래프팅될 수 있다.
특정 실시양태에서, 가교 겔은 거대다공성이다. 이들 경우, 거대세공은 지지 부재의 세공을 차지하는 겔 내에 존재하기 때문에, 겔의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 작아야 한다. 그 결과, 복합재의 유동 특징 및 분리 특징은 겔의 특징에 의존적이지만, 다공성 지지 부재의 특징에 대해서는 주로 독립적이며, 단, 지지 부재 내에 존재하는 세공의 크기는 겔의 거대세공의 크기보다 더 크다. 복합재의 다공도는, 다공도가 단량체 또는 중합체, 가교제, 반응 용매, 및 포로젠 (사용되는 경우)의 성질 및 양에 의해 부분적으로 또는 완전히 좌우되는 겔로 지지 부재를 충전시킴으로써 맞춤화(tailoring)될 수 있다. 복합재의 특성은, 겔의 특성에 의해, 전적으로는 아니더라도 부분적으로 결정된다. 최종 결과는, 본 발명이 복합재의 거대세공-크기, 투과성 및 표면적에 대한 제어를 제공한다는 것이다.
존재하는 경우, 복합재에서의 거대세공의 크기는 지지재에서의 세공의 수에 의해 좌우되지 않는다. 복합재에서의 거대세공의 수는, 거대세공이 지지 부재에서의 세공보다 더 작기 때문에, 지지 부재에서의 세공의 수보다 훨씬 더 클 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 거대다공성 겔의 세공-크기에 대한 지지재의 세공-크기의 영향은 일반적으로 무시할 만하다. 지지 부재가 세공-크기 및 세공-크기 분포에서 큰 차이를 갖는 경우, 및 매우 작은 세공-크기 및 세공-크기 분포의 좁은 범위를 갖는 거대다공성 겔이 추구되는 경우에 예외가 나타난다. 이들 경우에는, 지지 부재의 세공-크기 분포에서의 큰 변동이 거대다공성 겔의 세공-크기 분포에서 약하게 반영된다. 특정 실시양태에서, 다소 좁은 세공-크기 범위를 갖는 지지 부재가 이들 상황에서 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 비교적 비-독성인, 상기 언급된 복합재 중 어느 하나에 관한 것이다.
복합재의 제조
특정 실시양태에서, 본 발명의 복합재는 단일-단계 방법에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 방법은 물 또는 다른 환경적으로 온화한 용매를 반응 용매로서 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 신속할 수 있고, 따라서, 간단한 및/또는 신속한 제조 공정으로 이어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 복합재의 제조는 저비용이 들 수 있다.
특정 실시양태에서, 복합재는, 단량체 또는 단량체들, 가교제 또는 가교제들, 개시제 또는 개시제들, 및 임의로 하나 이상의 포로젠을, 하나 이상의 적합한 용매 중에서 혼합함으로써 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 생성된 혼합물은 균질할 수 있다. 특정 실시양태에서, 혼합물은 불균질할 수 있다. 특정 실시양태에서는, 이어서 혼합물이 적합한 다공성 지지체 중에 도입될 수 있고, 여기서 겔 형성 반응이 일어날 수 있다.
특정 실시양태에서는, 포로젠이 반응 혼합물에 첨가될 수 있고, 여기서 포로젠은 세공-생성 첨가제로서 광범위하게 기재될 수 있다. 특정 실시양태에서, 포로젠은 열역학적으로 빈용매 및 추출가능 중합체 (예를 들어, 폴리(에틸렌글리콜)), 계면활성제, 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 겔 형성 반응이 개시되어야 한다. 특정 실시양태에서, 겔 형성 반응은 임의의 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 열 활성화 또는 UV 방사선에 대한 노출을 통해 개시될 수 있다. 특정 실시양태에서, 반응은 광개시제의 존재 하에 UV 방사선에 의해 개시될 수 있다. 특정 실시양태에서, 광개시제는 2-히드록시-1-[4-(2-히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 (이르가큐어(Irgacure) 2959), 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산) (ACVA), 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논 (DMPA), 벤조페논, 벤조인 및 벤조인 에테르, 예컨대 벤조인 에틸 에테르 및 벤조인 메틸 에테르, 디알콕시아세토페논, 히드록시알킬페논, 및 α-히드록시메틸 벤조인 술폰산 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 열 활성화는 열 개시제의 첨가를 필요로 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 열 개시제는 1,1'-아조비스(시클로헥산카르보니트릴) (VAZO® 촉매 88), 아조비스(이소부티로니트릴) (AIBN), 과황산칼륨, 과황산암모늄, 및 벤조일 퍼옥시드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 겔-형성 반응은 UV 방사선에 의해 개시될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 광개시제가 겔 형성 반응의 반응물에 첨가될 수 있고, 단량체, 가교제, 및 광개시제의 혼합물을 함유하는 지지 부재가 수초 내지 수시간의 기간 동안 약 250 nm 내지 약 400 nm의 파장에서의 UV 방사선에 노출될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 단량체, 가교제, 및 광개시제의 혼합물을 함유하는 지지 부재가 수초 내지 수시간의 기간 동안 약 350 nm에서의 UV 방사선에 노출될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 단량체, 가교제, 및 광개시제의 혼합물을 함유하는 지지 부재가 약 10분 동안 약 350 nm에서의 UV 방사선에 노출될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 가시 파장 광이 중합 개시에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 지지 부재는, 에너지가 지지 부재를 통해 전송될 수 있도록 사용된 파장에서 낮은 흡광도를 가져야 한다.
특정 실시양태에서는, 중합이 수행되는 속도가 거대다공성 겔에서 얻어지는 거대세공의 크기에 영향을 줄 수 있다. 특정 실시양태에서, 겔 중의 가교제의 농도가 충분한 농도까지 증가되면, 겔의 구성성분은 응집되기 시작하여 높은 중합체 밀도의 영역 및 중합체가 없거나 거의 없는 영역을 생성하고, 이 후자의 영역이 본 명세서에서 "거대세공"으로서 언급된다. 이 메커니즘은 중합 속도에 의해 영향받는다.
특정 실시양태에서, 복합재가 제조되면, 이들은 임의의 미반응 성분 및 지지체 내에 앵커링되지 않은 임의의 중합체 또는 올리고머의 제거를 위해 다양한 용매로 세척될 수 있다. 특정 실시양태에서, 복합재의 세척에 적합한 용매는 물, 산성 (예를 들어, HCl) 또는 염기성 (예를 들어, NaOH) 수용액, 수성 염 용액 (예를 들어, NaCl), 아세톤, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 DMF를 포함한다.
관능화된 복합재에 리간드를 커플링하기 위한 예시적 방법
관능화된 복합재를 가로질러 또는 이를 통과하여 리간드를 포함하는 제1 용액을 유동시킴으로써 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법이 본원에서 제공된다.
하나의 측면에서, 본 발명은
a.
i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는 관능화된 복합재를 제공하는 단계; 및
b. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 용액을 제1 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제1 용액은 복수의 제1 리간드를 포함하고, 그에 따라 반응성 관능기와 제1 리간드 사이에 복수의 공유 결합이 형성되는 것인 단계
를 포함하며, 여기서 관능화된 복합재는 동연적 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 것인, 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 언급된 관능화된 복합재 중 어느 하나의 제공에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 용액이 관능화된 복합재를 실질적으로 가로질러 유동하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 유체 유동로는 관능화된 복합재의 표면에 대해 접선이다 (도 1a). 일부 실시양태에서, 접선 유동은 보다 낮은 압력 강하를 제공하고/거나 복합재의 많은 층으로 구성된 스택이 동시에 커플링될 수 있게 한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 용액이 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 유동하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 유체 유동로는 관능화된 복합재를 직접 통과한다 (도 1b). 일부 실시양태에서, 직접 유동은 복합재의 층 수가 증가함에 따라 압력 강하의 증가를 제공한다. 일부 실시양태에서, 압력 강하는 스택 내의 층 수를 제한한다. 일부 실시양태에서, 인터리프의 하나 이상의 층은 유동을 분포시키도록 작용한다. 일부 실시양태에서, 직접 유동은 다공성 복합재 구조로의 리간드의 질량 전달 속도를 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 가교된 거대다공성 겔은 관능화된 복합재를 제공하기 위해 화학적 관능기 또는 분자 종으로 추가로 그래프팅된다. 특정 실시양태에서, 가교 중합체는 관능화된 복합재를 형성하기 위해 후-중합 개질에 의해 관능화될 수 있다. 이러한 2-단계 방법에서, 과량의 펜던트 반응성 관능기가 별도의 그래프팅 단계 동안 개질되고, 예를 들어, 과량의 티올 또는 알켄 기가 티올-알켄 중합 동안 생성된다. 단량체 및 가교제 공급 비율을 제어함으로써, 최종 중합체는 과잉의 펜던트 반응성 관능기를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 펜던트 반응성 관능기가 알데히드, 아민, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 에폭시드, 히드록실, 티올, 무수물, 아지드, 반응성 할로겐, 산 염화물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
방법의 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 티올 관능기를 포함하는 분자 또는 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 분자로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 티올 관능기를 포함하는 분자로부터 유래되고; 티올 관능기를 포함하는 분자는 3-메르캅토프로피온산, 1-메르캅토숙신산, 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 시스테인 잔기를 포함하는 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 융합 단백질, 시스테아민, 1-티오헥시톨, 폴리(에틸렌 글리콜) 2-메르캅토에틸 에테르 아세트산, 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 티올, 1-티오글리세롤, 2-나프탈렌티올, 비페닐-4-티올, 3-아미노-1,2,4-트리아졸-5-티올, 5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-티올, 1-[2-(디메틸아미노)에틸]-1H-테트라졸-5-티올, 1-프로판티올, 1-부탄티올, 1-펜탄티올, 1-헥산티올, 1-옥탄티올, 8-아미노-1-옥탄티올 히드로클로라이드, 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트리데카플루오로-1-옥탄티올, 8-메르캅토-1-옥탄올, 및 γ-Glu-Cys로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 티올 관능기를 포함하는 분자는 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 시스테인 잔기를 포함하는 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 및 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 티올 관능기를 포함하는 분자는 시스테인 잔기를 포함하는 단백질이다.
일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 분자로부터 유래되고; 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 분자는 1-옥텐, 1-헥신, 4-브로모-1-부텐, 알릴디페닐포스핀, 알릴아민, 알릴 알콜, 3,4-디히드록시-1-부텐, 7-옥텐-1,2-디올, 3-알릴옥시-1,2-프로판디올, 3-부텐산, 3,4-데히드로-L-프롤린, 비닐 라우레이트, 1-비닐-2-피롤리디논, 비닐 신나메이트, 아실아미드, 또는 아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 산 염화물, 아실 아지드, 알데히드, 아민, 무수물, 아지드, 카르보네이트, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 카르보니이미드, 카르복실산, 디술피드, 에폭시드, 플루오로벤젠, 플루오로페닐 에스테르, 할로아세틸, 히드록실, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 피리딜 디술피드, 반응성 에스테르, 반응성 할로겐, 술포닐 할라이드, 티올, 및 티오술페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 알데히드, 아민, 에폭시드, 히드록실, 무수물, 아지드, 반응성 할로겐, 및 산 염화물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 알데히드, 아민, 에폭시드, 및 히드록실로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 에폭시드, 알데히드, 카르복실산, 반응성 할로겐, 반응성 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 술포닐 할라이드, 카르보디이미드, 아실 아지드, 플루오로벤젠, 카르보네이트, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이미도에스테르, 및 플루오로페닐 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 에폭시드, 알데히드, 카르복실산, 반응성 할로겐, 반응성 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 술포닐 할라이드, 카르보니이미드, 아실 아지드, 플루오로벤젠, 카르보네이트, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이미도에스테르, 및 플루오로페닐 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되고, 아민 기와 반응한다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 에폭시드, 티올, 디술피드, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 말레이미드, 할로아세틸, 피리딜 디술피드, 티오술페이트, 및 반응성 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 에폭시드, 티올, 디술피드, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 말레이미드, 할로아세틸, 피리딜 디술피드, 티오술페이트, 및 반응성 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 하나 이상의 단량체는 글리시딜 메타크릴레이트, 아크릴아미독심, 아크릴산 무수물, 아젤라산 무수물, 말레산 무수물, 히드라지드, 아크릴로일 클로라이드, 2-브로모에틸 메타크릴레이트, 및 비닐 메틸 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 알데히드이다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 하나 이상의 단량체는 비닐 메틸 케톤이다.
일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 아민이다.
일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 에폭시드이다. 일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 하나 이상의 단량체는 글리시딜 메타크릴레이트이다.
일부 실시양태에서, 펜던트 반응성 관능기는 히드록실이다.
일부 실시양태에서, 제1 리간드는 제1 관능기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 리간드는 적어도 하나의 그래프팅 말단-기를 추가로 포함하고; 제1 관능기는 양이온성, 음이온성, 소수성, 친수성, 친황성(thiophilic), 수소 결합 공여, 수소 결합 수용, 파이-파이 결합 공여, 파이-파이 결합 수용, 금속 킬레이팅, 생물학적 분자, 및 생물학적 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 관능기는 양이온성, 음이온성, 소수성, 친수성, 친황성, 수소 결합 공여, 수소 결합 수용, 파이-파이 결합 공여, 및 파이-파이 결합 수용으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 개개의 관능기는 관능성 단량체의 혼입을 통해 포함된다. 일부 실시양태에서, 각각의 관능기의 상대적 양은 최적 성능 특징을 위해 용이하고 쉽게 조율될 수 있다.
일부 실시양태에서, 분자는 제1 관능기를 포함하고, 분자는 2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-아미노에틸 메타크릴레이트, 2-카르복시에틸 아크릴레이트, 2-(메틸티오)에틸 메타크릴레이트, 아크릴아미드, N-아크릴옥시숙신이미드, 부틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, N,N-디에틸아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, N-[3-(N,N-디메틸아미노)프로필]메타크릴-아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, 에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 히드록시프로필 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 페닐 에테르 메타크릴레이트, 메타크릴아미드, 메타크릴산 무수물, 프로필 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, N-이소프로필아크릴아미드, 스티렌, 4-비닐피리딘, 비닐술폰산, N-비닐-2-피롤리디논 (VP), 아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰산, 스티렌술폰산, 알긴산, (3-아크릴아미도프로필)트리메틸암모늄 할라이드, 디알릴디메틸암모늄 할라이드, 4-비닐-N-메틸피리디늄 할라이드, 비닐벤질-N-트리메틸암모늄 할라이드, 메타크릴옥시에틸트리메틸암모늄 할라이드, 3-술포프로필 메타크릴레이트, 2-(2-메톡시)에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴아미드, N-(3-메톡시프로필 아크릴아미드), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]아크릴아미드, N-페닐 아크릴아미드, N-tert-부틸 아크릴아미드, 또는 디아세톤 아크릴아미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제1 관능기는 금속 킬레이팅 관능기이다. 일부 실시양태에서, 제1 관능기는 옥타덴테이트, 헥사덴테이트, 테트라덴테이트, 트리덴테이트, 비덴테이트, 이미노디카르복실산, 이미노디아세트산, 및 이미노디아세트산의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속 킬레이팅 관능기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 금속 킬레이팅 관능기는 복수의 금속 이온과 착물화된다. 일부 실시양태에서, 금속 킬레이팅 관능기는 전이 금속 이온, 란타나이드 이온, 빈금속(poor metal) 이온, 및 알칼리 토금속 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 금속 이온과 착물화되는 이미노디카르복실산, 이미노디아세트산, 및 이미노디아세트산의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 금속 킬레이팅 관능기는 니켈, 지르코늄, 란타넘, 세륨, 망가니즈, 티타늄, 코발트, 철, 구리, 아연, 은, 갈륨, 백금, 팔라듐, 납, 수은, 카드뮴 및 금으로 이루어진 군으로부터 선택된 복수의 금속 이온과 착물화되는 이미노디카르복실산, 이미노디아세트산, 및 이미노디아세트산의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 금속 킬레이팅 관능기는 복수의 금속 이온과 착물화되는 이미노디아세트산 또는 이미노디아세트산의 염이고, 여기서 금속 이온은 니켈 또는 지르코늄이다.
일부 실시양태에서, 제1 관능기는 생물학적 분자 또는 생물학적 이온이다. 일부 실시양태에서, 제1 관능기는 알부민, 리소자임, 바이러스, 세포, 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원 둘 다의 면역글로불린, 합성 또는 천연 기원의 폴리펩티드를 포함한 재조합 또는 천연 기원의 단백질, 인터류킨-2 및 그의 수용체, 효소, 모노클로날 항체, 항원, 렉틴, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 트립신 및 그의 억제제, 시토크롬 C, 미오글로불린, 재조합 인간 인터류킨, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 펩티드 H, 핵산 유래 생성물, 합성 또는 천연 기원의 DNA, 및 합성 또는 천연 기원의 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자 또는 생물학적 이온 관능기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 관능기는 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원 둘 다의 면역글로불린, 합성 또는 천연 기원의 폴리펩티드를 포함한 재조합 또는 천연 기원의 단백질, 모노클로날 항체, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자 또는 생물학적 이온 관능기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 관능기는 폴리펩티드, 단백질, 재조합 단백질, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 및 펩티드 H로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자 또는 생물학적 이온 관능기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 관능기는 단백질 A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 관능기는 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 시스테인 잔기를 포함하는 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된, 단백질 A 유도체 및 재조합 단백질 A를 포함한, 단백질 A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 관능기는 펜던트 반응성 관능기와 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티 및 모노클로날 항체 (예를 들어, IgG 항체)에 결합하는 리간드를 포함하는 단백질, 펩티드, 또는 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 관능기는 펜던트 반응성 관능기와 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티 및 항체의 Fc 도메인과 결합하는 리간드를 포함하는 단백질, 펩티드, 또는 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 관능기는 펜던트 반응성 관능기와 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티 및 항체의 Fab 도메인과 결합하는 리간드를 포함하는 단백질, 펩티드, 또는 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 A를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 리간드는 알데히드, 아민, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 에폭시드, 히드록실, 티올, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 그래프팅 말단-기 및 제1 관능기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기는 알데히드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기는 아민이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기는 에폭시드이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기는 히드록실이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기는 티올이다.
특정 실시양태에서, 티올-엔 그래프팅은 생체분자를 멤브레인의 가교 중합체에 부착하기 위한 매력적인 옵션이다. 반응은 빠르고, 수성 매질 중에서 효율적으로 수행될 수 있고, 실온에서 잘 작용하고, 단백질 생체활성에 매우 제한된 영향을 주는 비교적 장파장 광 (365 nm)을 사용하여 광-개시될 수 있다. 추가로, 이는 제어된 생체분자 부착을 가능하게 할 수 있고, 이는 생체분자의 생체활성 및 3D 구조 보존에 있어 유리할 수 있다.
특정 실시양태에서, 유리 티올 관능기를 갖는 임의의 생체분자가 본원에 기재된 복합재 상에 부동화하는 것이 가능하다. 이는 (효소(들)의 부동화에 의해) 생체분리를 위한 생체-친화성 멤브레인 또는 생체-촉매작용 멤브레인 제조에서 매우 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 복합재는 DNA 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브로 관능화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 추가로 포함하는, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다:
c. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 세척 용액을 제2 유속으로 유동시킴으로써, 과량의 제1 리간드를 제거하는 단계.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 추가로 포함하는, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다:
d. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 켄칭 용액을 제3 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 켄칭 용액은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시키기 위한 반응성 화합물을 포함하는 것인 단계; 및
e. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 세척 용액을 제4 유속으로 유동시켜 임의의 잔류 반응성 화합물을 제거하는 단계.
일부 실시양태에서는, 단계 b.의 제1 용액이 복합재를 통과하여 또는 이를 가로질러 재순환된다.
일부 실시양태에서는, 단계 d.의 켄칭 용액이 복합재를 통과하여 또는 이를 가로질러 재순환된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 추가로 포함하는, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다:
c. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 세척 용액을 제2 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제1 리간드를 제거하는 단계;
d. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 용액을 제3 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제2 용액은 적어도 3개의 반응성 기를 포함하는 복수의 제2 리간드, 및 임의로, 적어도 2개의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 중합가능 단량체를 포함하고, 여기서 제2 리간드는 가교제이고, 이로써 반응성 관능기와 제2 리간드 사이의 복수의 공유 결합을 형성하는 것인 단계.
일부 실시양태에서, 제2 리간드는 적어도 두 부분으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 중합가능 단량체는 적어도 두 부분으로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 제2 리간드는 제2 관능기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 리간드는 적어도 하나의 그래프팅 말단-기를 추가로 포함하고; 제2 관능기는 양이온성, 음이온성, 소수성, 친수성, 친황성, 수소 결합 공여, 수소 결합 수용, 파이-파이 결합 공여, 파이-파이 결합 수용, 금속 킬레이팅, 생물학적 분자, 및 생물학적 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 관능기는 양이온성, 음이온성, 소수성, 친수성, 친황성, 수소 결합 공여, 수소 결합 수용, 파이-파이 결합 공여, 및 파이-파이 결합 수용으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 제2 리간드는 아민, 히드록실, 및 티올 관능기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 그래프팅 말단-기를 포함하는 생물학적 분자 또는 생물학적 이온이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온은 알부민, 리소자임, 바이러스, 세포, 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원 둘 다의 면역글로불린, 합성 또는 천연 기원의 폴리펩티드를 포함한 재조합 또는 천연 기원의 단백질, 인터류킨-2 및 그의 수용체, 효소, 모노클로날 항체, 항원, 렉틴, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 트립신 및 그의 억제제, 시토크롬 C, 미오글로불린, 재조합 인간 인터류킨, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 펩티드 H, 핵산 유래 생성물, 합성 또는 천연 기원의 DNA, 및 합성 또는 천연 기원의 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온은 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원 둘 다의 면역글로불린, 합성 또는 천연 기원의 폴리펩티드를 포함한 재조합 또는 천연 기원의 단백질, 모노클로날 항체, 항원, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 및 펩티드 H로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 리간드는 폴리펩티드, 단백질, 재조합 단백질, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 및 펩티드 H이다.
일부 실시양태에서, 제1 리간드 및 제2 리간드는 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 리간드 및 제2 리간드는 상이하다.
일부 실시양태에서, 적어도 2개의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 중합가능 단량체는 폴리(에틸렌 글리콜) 디비닐 에테르이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 추가로 포함하는, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다:
e. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 세척 용액을 제4 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제2 리간드 및, 임의로, 임의의 과량의 중합가능 단량체를 제거하는 단계.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 추가로 포함하는, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다:
f. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 켄칭 용액을 제5 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 켄칭 용액은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시키기 위한 반응성 화합물을 포함하는 것인 단계; 및
g. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제3 세척 용액을 제6 유속으로 유동시켜 임의의 잔류 반응성 화합물을 제거하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은
a.
i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는 관능화된 복합재를 제공하는 단계; 및
b. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 용액을 제1 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제1 용액은 복수의 제1 리간드를 포함하고, 그에 따라 반응성 관능기와 제1 리간드 사이에 복수의 공유 결합이 형성되는 것인 단계;
c. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 세척 용액을 제2 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제1 리간드를 제거하는 단계;
d. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 켄칭 용액을 제3 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 켄칭 용액은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시키기 위한 반응성 화합물을 포함하는 것인 단계; 및
e. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 세척 용액을 제4 유속으로 유동시켜 임의의 잔류 반응성 화합물을 제거하는 단계
를 포함하며, 여기서 관능화된 복합재는 동연적 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 것인, 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은
a.
i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는 관능화된 복합재를 제공하는 단계; 및
b. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 용액을 제1 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제1 용액은 복수의 제1 리간드를 포함하고, 그에 따라 반응성 관능기와 제1 리간드 사이에 복수의 공유 결합이 형성되는 것인 단계;
c. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 세척 용액을 제2 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제1 리간드를 제거하는 단계;
d. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 용액을 제3 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제2 용액은 적어도 3개의 반응성 기를 포함하는 복수의 제2 리간드, 및 임의로, 적어도 2개의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 중합가능 단량체를 포함하고, 여기서 제2 리간드는 가교제이고, 이로써 반응성 관능기와 제2 리간드 사이의 복수의 공유 결합을 형성하는 것인 단계;
e. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 세척 용액을 제4 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제2 리간드 및, 임의로, 임의의 과량의 중합가능 단량체를 제거하는 단계;
f. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 켄칭 용액을 제5 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 켄칭 용액은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시키기 위한 반응성 화합물을 포함하는 것인 단계; 및
g. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제3 세척 용액을 제6 유속으로 유동시켜 임의의 잔류 반응성 화합물을 제거하는 단계
를 포함하며, 여기서 관능화된 복합재는 동연적 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 것인, 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 관능화된 복합재는 습윤화된 멤브레인이다.
일부 실시양태에서, 습윤화된 멤브레인은 크로마토그래피 시스템에 부착된 홀더 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 다양한 용액 및 유체 (예를 들어, 제1 용액, 제1 세척 용액, 제2 용액, 켄칭 용액, 제2 세척 용액, 및 제3 세척 용액)가 멤브레인 홀더를 통과하여 펌핑된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 관능화된 복합재가 동연적 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
멤브레인 스택
일부 실시양태에서, 복합재는 실질적으로 동연적 시트의 실질적으로 동일 평면상의 스택으로 배열된다. 일부 실시양태에서, 복합재는 2 내지 300개의 별도의 지지 부재를 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 35, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 또는 300개의 별도의 지지 부재를 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 5 내지 200개의 별도의 지지 부재를 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 5 내지 100개의 별도의 지지 부재를 갖는다.
일부 실시양태에서, 복합재가 실질적으로 동연적 시트의 실질적으로 동일 평면상의 스택으로 배열된 경우, 하나 이상의 별도의 지지 부재는 인터리프의 하나 이상의 층에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은, 복합재 및 인터리프의 층이 복합재 및 인터리프의 교호 층 (즉, (복합재 - 인터리프)x 또는 (인터리프 - 복합재)x)인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 복합재는 인터리프의 1 내지 250개의 별도의 층과 적층된다. 일부 실시양태에서, 복합재는 인터리프의 1 내지 100개의 별도의 층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 인터리프의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 및 100개의 별도의 층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 인터리프의 1 내지 50개의 별도의 층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 인터리프의 1 내지 25개의 별도의 층을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인터리프는 유동 분포 층이다. 일부 실시양태에서, 인터리프의 층은 복합재의 층의 연부를 지나 연장된다. 일부 실시양태에서, 인터리프의 층은 멤브레인을 통과하는 유동을 가능하게 하면서, 또한 용액이 멤브레인 주위로 또한 유동할 수 있음에 따라 스택을 가로질러 보다 낮은 압력 강하를 제공한다.
일부 실시양태에서, 복합재가 실질적으로 동연적 시트의 실질적으로 동일 평면상의 스택으로 배열된 경우, 하나 이상의 별도의 지지 부재, 및, 임의로, 인터리프의 하나 이상의 층은 하나 이상의 유동 분포 층에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유동 분포 층은 스택 내의 균일한 커플링을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유동 분포 층은, 유동 분포 층이 없는 커플링에 비해 스택 전반에 걸쳐 복합재에 대한 리간드의 보다 균일한 커플링을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 복합재는 1 내지 250개의 별도의 유동 분포 층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 1 내지 100개의 별도의 유동 분포 층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 및 100개의 별도의 유동 분포 층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 1 내지 50개의 별도의 유동 분포 층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복합재는 1 내지 25개의 별도의 유동 분포 층을 갖는다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 유동 분포 층은 비-다공성 시트이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유동 분포 층은 홀을 함유하는 비-다공성 시트이다. 일부 실시양태에서, 유동 분포 층은 멤브레인 스택 내에 주기적으로 분포된다. 일부 실시양태에서, 유동 분포 층은 복합재의 층 및 인터리프의 층을 포함하는 멤브레인 스택 내에 주기적으로 분포된다 (즉, ((복합재 - 인터리프)x(유동 분포)y 또는 (인터리프 - 복합재)x(유동 분포)y).
일부 실시양태에서, 본 발명은, 지지 부재가 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리페닐렌옥시드, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 셀룰로스, 및 셀룰로스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체 재료를 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 복합재는 관형 구성으로 배열된다.
나선형 권취 구성
일부 실시양태에서, 복합재는 실질적으로 나선형 권취 구성으로 배열된다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 나선형 권취 구성은 내부 코어 주위에 랩핑된 복합재 형성 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 나선형 권취 구성은 내부 코어 주위에 랩핑된 복합재 및 인터리프를 포함한다.
나선형 권취 구성의 인터리프
일부 실시양태에서, 본 발명은, 복합재 및 인터리프의 층이 복합재 및 인터리프의 교호 층 (즉, (복합재 - 인터리프)x 또는 (인터리프 - 복합재)x)인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재 및 인터리프의 층이 (인터리프 - 제1 복합재 - 제2 복합재)x 또는 (제1 복합재 - 제2 복합재 - 인터리프)x로 배열된 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재 및 인터리프의 층이 상기 언급된 배열의 조합으로 배열된 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제1 복합재 및 제2 복합재는 동일하다.
일부 실시양태에서, 복합재는 내부 코어 주위에 복합재의 약 3 내지 약 50개 층을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 복합재가 하나 이상의 인터리프 층과 접촉된 것인, 상기 언급된 방법 (예를 들어, 멤브레인 스택 또는 나선형 권취 구성) 중 어느 하나에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 인터리프 층은 복합재에 대한 일부 기계적 지지를 제공한다.
일부 실시양태에서, 인터리프는 배압을 감소시키도록 돕는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 하나 이상의 인터리프 층이 스크린, 메쉬, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 종이, 및 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 (예를 들어, 멤브레인 스택 또는 나선형 권취 구성) 중 어느 하나에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 인터리프는 스크린 또는 부직 재료이다. 일부 실시양태에서, 인터리프는 메쉬이다. 일부 실시양태에서, 인터리프는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌이다. 일부 실시양태에서, 인터리프는 부직 폴리프로필렌이다. 일부 실시양태에서, 인터리프는 종이이다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 셀룰로스이다.
특정 실시양태에서, 인터리프는 메쉬이다. 특정 실시양태에서, 메쉬 인터리프는 압출된 넷팅이다. 특정 실시양태에서, 메쉬 인터리프는 약 0.45-mm 메쉬이다. 특정 실시양태에서, 메쉬 인터리프는 이중평면 열가소성 넷팅이다. 특정 실시양태에서, 메쉬 인터리프는 델스타 테크놀로지스, 인코포레이티드(DelStar Technologies, Inc.)로부터의 날텍스(Naltex) (특정 이중평면 열가소성 넷팅)와 실질적으로 유사하다.
특정 실시양태에서, 인터리프는 스펀바운드(spunbound) 폴리프로필렌이다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 약 0.70 oz/yd2 내지 약 0.95 oz/yd2의 기본 중량의 스펀바운드 폴리프로필렌이다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 약 0.70 oz/yd2, 약 0.75 oz/yd2, 약 0.80 oz/yd2, 약 0.85 oz/yd2, 약 0.90 oz/yd2, 또는 약 0.95 oz/yd2의 기본 중량의 스펀바운드 폴리프로필렌이다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 약 0.86 oz/yd2의 기본 중량의 스펀바운드 폴리프로필렌이다.
특정 실시양태에서, 인터리프는 약 50 μm 내지 약 300 μm 두께이다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 약 50 μm, 약 100 μm, 약 150 μm, 약 200 μm, 약 250 μm, 또는 약 300 μm 두께이다.
특정 실시양태에서, 인터리프는 약 50% 내지 약 99% 부피 다공도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 약 70% 내지 약 95% 부피 다공도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 부피 다공도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 약 80% 내지 약 90% 부피 다공도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 인터리프는 실질적으로 압축성이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 인터리프 층은 하나 이상의 유동 분포 층과 접촉된다.
나선형 권취 구성의 내부 코어
일부 실시양태에서 내부 코어는 플라스틱이다. 일부 실시양태에서 내부 코어는 폴리프로필렌 또는 폴리술폰이다.
일부 실시양태에서, 내부 코어는 실린더이다. 특정 실시양태에서, 내부 코어는 단부 양쪽에서 캡핑 또는 밀봉된 실린더이다.
특정 실시양태에서, 내부 코어는 실린더형 파이프이다. 특정 실시양태에서, 내부 코어는 천공 실린더형 파이프이다. 특정 실시양태에서, 내부 코어는 단부 중 한쪽에서 캡핑 또는 밀봉된 천공 실린더형 파이프이다.
일부 실시양태에서, 내부 코어는 실린더 주위에 랩핑된 스크린이다. 특정 실시양태에서, 스크린은 유체가 유동할 수 있는 경로를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 복합재가 멤브레인인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 가교 겔이 중성 히드로겔, 대전된 히드로겔, 다가전해질 겔, 소수성 겔, 중성 겔, 또는 관능기를 포함하는 겔인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 거대다공성 가교 겔이 10 nm 내지 3000 nm의 평균 크기를 갖는 거대세공을 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 지지 부재의 세공이 약 0.1 μm 내지 약 50 μm의 평균 세공 직경을 갖는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 유체 유동로가 복합재를 실질적으로 통과하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 유체 유동로가 복합재를 실질적으로 가로지르는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
예시적 복합재의 제조 방법
특정 실시양태에서, 본 발명은, 단량체 혼합물 중의 펜던트 반응성 관능기 대 그래프팅 말단 기의 비율이 약 1:10 내지 약 2:1, 예를 들어, 약 1:10, 약 1:9, 약 1:8, 약 1:7, 약 1:6, 약 1:5, 약 1:4, 약 1:3, 약 1:2, 약 1:1, 또는 약 2:1인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 알킨 기는 2개의 알켄 기와 동등하다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 단량체가 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 5% 내지 약 25%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 단량체가 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 5% 내지 약 20%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 단량체가 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 0.1% 내지 약 20%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 가교제가 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 1% 내지 약 20%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 광개시제가 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 0.1% 내지 약 2%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 광개시제가 벤조인 또는 벤조인 에테르, 벤조페논, 디알콕시아세토페논, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논, 디페닐(2,4,6-트리메틸벤조일)포스핀 옥시드, 히드록시알킬페논, 1-히드록시-시클로헥실-페닐-케톤, 4-(2-히드록시에톡시)페닐-(2-히드록시-2-프로필)케톤, 1-[4-(2-히드록시에톡시)-페닐]-2-히드록시-2-메틸-1-프로판-1-온, 2-히드록시-1-[4-(2-히드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논, α-히드록시메틸 벤조인 술폰산 에스테르, 2-히드록시-2-메틸프로피오페논, 리튬 아실포스피네이트, 또는 2-메틸-1-[4-(메틸티오)페닐]-2-(4-모르폴리닐)-1-프로파논, 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산) (ACVA), 또는 이들의 혼합물인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 용매가 N,N'-디메틸아세트아미드 (DMAc), (±)-1,3-부탄디올 (Budiol), 디(프로필렌 글리콜)메틸 에테르 아세테이트 (DPMA), 물, 디(프로필렌 글리콜) 디메틸 에테르 (DPM), 디(프로필렌 글리콜) 프로필 에테르 (DPGPE), 디(프로필렌 글리콜) 메틸 에테르 (DPGME), 트리(프로필렌 글리콜) 부틸 에테르 (TPGBE), 3-메틸-1,3-부탄디올, 3,3-디메틸-1,2-부탄디올, 3-메톡시-1-부탄올, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 에틸렌 글리콜, 디(에틸렌 글리콜), 트리(에틸렌 글리콜), 테트라(에틸렌 글리콜), 헥실렌 글리콜, 나트륨 도데실 술페이트, 또는 N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, N,N'-디메틸아세트아미드 (DMAc)가 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 70%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, N,N'-디메틸아세트아미드 (DMAc)가 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 50%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, N,N'-디메틸아세트아미드 (DMAc)가 총 용매의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 70%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, N,N'-디메틸아세트아미드 (DMAc)가 총 용매의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 50%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, (±)-1,3-부탄디올 (Budiol)이 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 50%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, (±)-1,3-부탄디올 (Budiol)이 총 용매의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 50%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 디(프로필렌 글리콜)메틸 에테르 아세테이트 (DPMA)가 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 60%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 디(프로필렌 글리콜)메틸 에테르 아세테이트 (DPMA)가 총 용매의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 60%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 물이 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 50%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 물이 단량체 혼합물의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 30%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 물이 총 용매의 중량 기준으로 약 0% 내지 약 30%의 양으로 단량체 혼합물 중에 존재하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 커버링된 지지 부재가 약 350 nm에서 광조사되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 기간이 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 45분, 또는 약 1시간인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재가 거대세공을 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 거대세공의 평균 세공 직경이 세공의 평균 세공 직경보다 더 작은 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
세공 크기 결정
SEM 및 ESEM
상기에 언급된 바와 같이, 특정 실시양태에서, 가교 겔은 거대다공성 가교 겔이다. 거대다공성 가교 겔에서의 거대세공의 평균 직경은 많은 방법 중 하나에 의해 추정될 수 있다. 사용될 수 있는 하나의 방법은 주사 전자 현미경검사 (SEM)이다. SEM은 일반적으로 세공 크기 및 다공성 결정을 위한, 또한 특히 멤브레인 특성화를 위한 잘 확립된 방법이다. 문헌 [Basic Principles of Membrane Technology by Marcel Mulder (ⓒ 1996) ("Mulder")], 특히 챕터 IV를 참조한다. Mulder는 멤브레인 특성화를 위한 방법의 개요를 제공한다. 다공성 멤브레인의 경우, 언급된 첫번째 방법은 전자 현미경검사이다. SEM은 미세여과 멤브레인의 특성화를 위한 매우 간단하고 유용한 기술이다. 멤브레인의 명확하고 간결한 그림이 상단 층, 단면 및 저부 층에 대하여 얻어질 수 있다. 추가로, 다공도 및 세공 크기 분포가 사진으로부터 추정될 수 있다.
환경 SEM (ESEM)은, 시험편 챔버 내의 기체상 환경을 가능하게 함으로써, 습윤 상태인 시험편의 비-파괴적 이미징을 가능하게 하는 기술이다. 환경 2차 검출기 (ESD)는 기능하기 위해 기체 백그라운드를 필요로 하고 약 3 토르 내지 약 20 토르에서 작동한다. 이들 압력 규제는 샘플 챔버 내의 습도를 변화시키는 능력을 제한한다. 예를 들어, 10 토르에서, 특정 온도에서의 상대 습도는 하기와 같다:
이는 상이한 온도에서의 샘플 챔버 내의 상대 습도에 대한 유용한 지침이다. 특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 상대 습도는 약 1% 내지 약 99%이다. 특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 상대 습도는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%이다. 특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 상대 습도는 약 45%이다.
특정 실시양태에서, 현미경은 나노미터 해상도 및 최대 약 100,000X 배율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 온도는 약 1℃ 내지 약 95℃이다. 특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 온도는 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 12℃, 약 14℃, 약 16℃, 약 18℃, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 또는 약 85℃이다. 특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 온도는 약 5℃이다.
특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 압력은 약 0.5 토르 내지 약 20 토르이다. 특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 압력은 약 4 토르, 약 6 토르, 약 8 토르, 약 10 토르, 약 12 토르, 약 14 토르, 약 16 토르, 약 18 토르, 또는 약 20 토르이다. 특정 실시양태에서, 이미징 동안 샘플 챔버 내의 압력은 약 3 토르이다.
특정 실시양태에서, 전자 빔의 공급원으로부터 샘플까지의 작동 거리는 약 6 mm 내지 약 15 mm이다. 특정 실시양태에서, 전자 빔의 공급원으로부터 샘플까지의 작동 거리는 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 11 mm, 약 12 mm, 약 13 mm, 약 14 mm, 또는 약 15 mm이다. 특정 실시양태에서, 전자 빔의 공급원으로부터 샘플까지의 작동 거리는 약 10 mm이다.
특정 실시양태에서, 전압은 약 1 kV 내지 약 30 kV이다. 특정 실시양태에서, 전압은 약 2 kV, 약 4 kV, 약 6 kV, 약 8 kV, 약 10 kV, 약 12 kV, 약 14 kV, 약 16 kV, 약 18 kV, 약 20 kV, 약 22 kV, 약 24 kV, 약 26 kV, 약 28 kV, 또는 약 30 kV이다. 특정 실시양태에서, 전압은 약 20 kV이다.
특정 실시양태에서, 평균 세공 직경은 복합재의 상단 또는 저부로부터 이미지의 대표 샘플에서의 세공 직경을 추정함으로써 측정될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 습윤화된 멤브레인의 ESEM 이미지를 얻는 것과 관련된 다양한 실험 변수를 인식하고 인지할 것이며, 그에 따라 실험을 디자인할 수 있을 것이다.
모세관 유동 세공측정
모세관 유동 세공측정은 다공성 재료의 세공 크기(들)를 측정하기 위해 사용되는 분석 기술이다. 이 분석 기술에서는, 액체의 습윤화를 사용하여 시험 샘플의 세공을 충전시키고, 비-반응 기체의 압력을 사용하여 세공으로부터 액체를 변위시킨다. 기체 압력 및 샘플을 통과하는 유속이 정확히 측정되고, 하기 등식을 사용하여 세공 직경이 결정된다: 세공으로부터 액체를 제거하기 위해 필요한 기체 압력은 하기 등식에 의해 세공의 크기와 관련된다:
D = 4 x γ x cosθ / P
D = 세공 직경
γ = 액체 표면 장력
θ = 액체 접촉각
P = 기체 압력차
이 등식은, 습윤화된 샘플로부터 액체를 변위시키기 위해 필요한 압력이 세공 크기에 반비례함을 보여준다. 이 기술은 압력 하에 시험 샘플의 세공으로부터의 액체의 유동을 수반하기 때문에, "관통 세공" (샘플의 한쪽 측면으로부터 다른 쪽으로의 유체 유동을 가능하게 하는 상호연결된 세공)의 특성화를 위해 유용하다. 다른 세공 유형 (닫힌 및 블라인드 세공)은 이 방법에 의해 검출가능하지 않다.
모세관 유동 세공측정은 기체가 그 세공을 통과하여 유동하기 시작할 때 세공의 존재를 검출한다. 이는 단지 기체 압력이 세공의 가장 위축된 부분으로부터 액체를 변위시키기에 충분히 높은 경우에만 일어난다. 따라서, 이 방법을 사용하여 계산된 세공 직경은 가장 위축된 부분에서의 세공의 직경이고, 각각의 세공은 이 위축된 직경의 단일 세공으로서 검출된다. 최대 세공 직경 (기포점이라 불림)은 습윤 샘플을 통과하는 유동을 개시하기 위해 필요한 최저 기체 압력에 의해 결정되고, 평균 세공 직경은 평균 유동 압력으로부터 계산된다. 추가로, 위축된 세공 직경 범위 및 세공 크기 분포 둘 다 이 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
이 방법은 시험 유체 (예를 들어, 물, 완충제, 알콜) 중에 잠긴 작은 멤브레인 샘플 (예를 들어, 약 2.5 cm 직경)에 대해 수행될 수 있다. 적용되는 기체 압력의 범위는 약 0 내지 약 500 psi로 선택될 수 있다.
세공 직경을 결정하는 다른 방법
Mulder는, 원자력 현미경검사 (AFM) (페이지 164), 투과도 계산 (페이지 169), 기체 흡착-탈착 (페이지 173), 열세공측정 (페이지 176), 펌포로메트리(permporometry) (페이지 179), 및 액체 변위 (페이지 181)를 포함한, 다공성 멤브레인의 평균 세공 크기를 특성화하는 다른 방법을 기재한다. Mulder, 및 그에 인용된 참조문헌은 본원에 참조로 포함된다.
복합재의 예시적 용도
특정 실시양태에서, 본 발명은, 유체가 상기 언급된 복합재 중 어느 하나의 가교 겔을 통과하여 지나가는 것인, 방법에 관한 것이다. 결합 또는 분별분리에 대한 조건을 맞춤화함으로써, 우수한 선택성이 얻어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다:
f. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 물질을 포함하는 제1 유체를 제5 유속으로 유동시킴으로써, 물질의 일부를 복합재 상에 흡착 또는 흡수시키는 단계.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
h. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 물질을 포함하는 제1 유체를 제7 유속으로 유동시킴으로써, 물질의 일부를 복합재 상에 흡착 또는 흡수시키는 단계.
특정 실시양태에서, 제1 유체는 단편화된 항체, 응집된 항체, 숙주 세포 단백질, 폴리뉴클레오티드, 내독소, 또는 바이러스를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 유체는 세포의 현탁액 또는 응집물의 현탁액이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체의 유체 유동로가 복합재의 거대세공을 실질적으로 통과하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체의 유체 유동로가 복합재의 거대세공에 실질적으로 수직인 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체가 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 유동한 후 실질적으로 모든 물질이 복합재 상으로 흡착 또는 흡수되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 추가로 포함하는, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다
g. 복합재 상으로 흡착 또는 흡수된 물질과 제2 유체를 제6 유속으로 접촉시킴으로써, 복합재로부터 물질의 일부를 방출시키는 단계.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 추가로 포함하는, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다
i. 복합재 상으로 흡착 또는 흡수된 물질과 제2 유체를 제8 유속으로 접촉시킴으로써, 복합재로부터 물질의 일부를 방출시키는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은
a.
i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는 관능화된 복합재를 제공하는 단계;
b. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 용액을 제1 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제1 용액은 복수의 제1 리간드를 포함하고, 그에 따라 반응성 관능기와 제1 리간드 사이에 복수의 공유 결합이 형성되는 것인 단계;
c. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 세척 용액을 제2 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제1 리간드를 제거하는 단계;
d. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 켄칭 용액을 제3 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 켄칭 용액은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시키기 위한 반응성 화합물을 포함하는 것인 단계;
e. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 세척 용액을 제4 유속으로 유동시켜 임의의 잔류 반응성 화합물을 제거하는 단계;
f. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 물질을 포함하는 제1 유체를 제5 유속으로 유동시킴으로써, 물질의 일부를 복합재 상에 흡착 또는 흡수시키는 단계; 및
g. 복합재 상으로 흡착 또는 흡수된 물질과 제2 유체를 제6 유속으로 접촉시킴으로써, 복합재로부터 물질의 일부를 방출시키는 단계
를 포함하며, 여기서 관능화된 복합재는 동연적 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 것인, 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은
a.
i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는 관능화된 복합재를 제공하는 단계;
b. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 용액을 제1 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제1 용액은 복수의 제1 리간드를 포함하고, 그에 따라 반응성 관능기와 제1 리간드 사이에 복수의 공유 결합이 형성되는 것인 단계;
c. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 세척 용액을 제2 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제1 리간드를 제거하는 단계;
d. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 용액을 제3 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제2 용액은 적어도 3개의 반응성 기를 포함하는 복수의 제2 리간드, 및 임의로, 적어도 2개의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 중합가능 단량체를 포함하고, 여기서 제2 리간드는 가교제이고, 이로써 반응성 관능기와 제2 리간드 사이의 복수의 공유 결합을 형성하는 것인 단계;
e. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 세척 용액을 제4 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제2 리간드 및, 임의로, 임의의 과량의 중합가능 단량체를 제거하는 단계;
f. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 켄칭 용액을 제5 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 켄칭 용액은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시키기 위한 반응성 화합물을 포함하는 것인 단계; 및
g. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제3 세척 용액을 제6 유속으로 유동시켜 임의의 잔류 반응성 화합물을 제거하는 단계;
h. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 물질을 포함하는 제1 유체를 제7 유속으로 유동시킴으로써, 물질의 일부를 복합재 상에 흡착 또는 흡수시키는 단계; 및
i. 복합재 상으로 흡착 또는 흡수된 물질과 제2 유체를 제8 유속으로 접촉시킴으로써, 복합재로부터 물질의 일부를 방출시키는 단계
를 포함하며, 여기서 관능화된 복합재는 동연적 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 것인, 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 유체의 유체 유동로가 복합재의 거대세공을 실질적으로 통과하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 유체의 유체 유동로가 복합재의 거대세공에 실질적으로 수직인 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 물질이 생물학적 분자, 생물학적 이온, 바이러스, 또는 바이러스 입자인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 용액으로부터, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온, 예컨대 단백질 또는 면역글로불린을 분리하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 생물학적 분자 또는 생물학적 이온, 예컨대 단백질 또는 면역글로불린을 정제하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 단백질 또는 모노클로날 항체를 높은 선택성으로 정제하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온이, 생물학적 활성을 보유하는 데 있어 중요할 수 있는, 그의 3급 또는 4급 구조를 보유하는 것인, 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 물질이 알부민, 리소자임, 바이러스, 세포, 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원의 면역글로불린, hIgG, 재조합 및 천연 기원의 단백질, 합성 및 천연 기원의 폴리펩티드, 인터류킨-2 및 그의 수용체, 효소, 모노클로날 항체, 트립신 및 그의 억제제, 시토크롬 C, 미오글로빈, 미오글로불린, α-키모트립시노겐, 재조합 인간 인터류킨, 재조합 융합 단백질, 핵산 유래 생성물, 합성 및 천연 기원의 DNA, 및 합성 및 천연 기원의 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자 또는 생물학적 이온인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 물질이 알부민, 리소자임, 바이러스, 세포, 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원의 면역글로불린, hIgG, 면역글로불린 M, 재조합 및 천연 기원의 단백질, (예를 들어, 재조합 인간 성장 호르몬, 재조합 인간 인슐린, 재조합 난포-자극 호르몬, 재조합 인자 VII (항-혈우병 인자), 재조합 인간 에리트로포이에틴, 재조합 과립구 콜로니-자극 인자, 재조합 알파-갈락토시다제 a, 재조합 이두로니다제, 재조합 갈술파제, 재조합 도르나제 알파, 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제, 재조합 인간 인터페론, 재조합 인슐린-유사 성장 인자 1, 및 재조합 아스파라기나제), 합성 및 천연 기원의 폴리펩티드, 인터류킨-2 및 그의 수용체, 효소, 모노클로날 항체, 트립신 및 그의 억제제, 시토크롬 C, 미오글로빈, 미오글로불린, α-키모트립시노겐, 재조합 인간 인터류킨, 재조합 융합 단백질, 인자 VIII, 인자 IX, 항트로빈 III, 알파-I-항트립신, 핵산 유래 생성물, 합성 및 천연 기원의 DNA, 및 합성 및 천연 기원의 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자 또는 생물학적 이온인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온이 리소자임, hIgG, 미오글로빈, 인간 혈청 알부민, 대두 트립신 억제제, 트랜스퍼라제, 에놀라제, 오발부민, 리보뉴클레아제, 에그 트립신 억제제, 시토크롬 c, 아넥신(Annexin) V, 또는 α-키모트립시노겐인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 물질이 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원 둘 다의 면역글로불린, 합성 또는 천연 기원의 폴리펩티드를 포함한 재조합 또는 천연 기원의 단백질, 모노클로날 항체, 항원, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 및 펩티드 H로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자 또는 생물학적 이온인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 물질이 폴리펩티드, 단백질, 재조합 단백질, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 및 펩티드 H로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자 또는 생물학적 이온인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 관련 변이형, 불순물, 또는 오염물로부터 항체 단편을 회수하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온 분리 또는 정제는 실질적으로 가교 겔에서 일어날 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온 분리 또는 정제는, 가교 겔이 거대세공을 갖는 경우, 실질적으로 가교 겔의 거대세공에서 일어날 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 물질의 가역적 흡착 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 흡착된 물질은 겔을 통과하여 유동하는 액체를 변화시킴으로써 방출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 물질의 흡취(uptake) 및 방출은 가교 겔의 조성 변동에 의해 제어될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체가 정화된 세포 배양 상청액인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 물질이 완충 용액으로부터 복합재에 적용될 수 있는 것인, 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체가 완충제인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체 중의 완충제의 농도가 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 0.1 M, 약 0.11 M, 약 0.12 M, 약 0.13 M, 약 0.14 M, 약 0.15 M, 약 0.16 M, 약 0.17 M, 약 0.18 M, 약 0.19 M 또는 약 0.2 M인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체의 pH가 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 또는 약 9인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체가 인산나트륨을 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체가 염을 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체 중의 염의 농도가 약 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 0.1 M, 약 0.11 M, 약 0.12 M, 약 0.13 M, 약 0.14 M, 약 0.15 M, 약 0.16 M, 약 0.17 M, 약 0.18 M, 약 0.19 M 약 0.2 M, 약 0.25 M, 또는 약 0.3 M인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 염이 염화나트륨인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 물질이 결합 파트너인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 복합재가 커플링된 리간드를 포함하고, 물질이 리간드의 결합 파트너인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체 중의 물질의 농도가 약 0.01 mg/mL 내지 약 1,000 mg/mL인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체 중의 물질의 농도가 약 0.2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유체 중의 물질의 농도가 약 0.2 mg/mL, 약 0.3 mg/mL, 약 0.4 mg/mL, 약 0.5 mg/mL, 약 0.6 mg/mL, 약 0.7 mg/mL, 약 0.8 mg/mL, 약 0.9 mg/L, 약 1 mg/mL, 약 1.2 mg/mL, 약 1.4 mg/mL, 약 1.6 mg/mL, 약 1.8 mg/mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 6 mg/mL, 약 7 mg/mL, 약 8 mg/mL, 약 mg/mL, 또는 약 10 mg/mL인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 1 멤브레인 부피 (MV)/min 내지 약 75 MV/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 3 멤브레인 부피 (MV)/min 내지 약 70 MV/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 5 MV/min 내지 약 50 MV/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 5 MV/min, 약 6 MV/min, 약 7 MV/min, 약 8 MV/min, 약 9 MV/min, 약 10 MV/min, 약 11 MV/min, 약 12 MV/min, 약 13 MV/min, 약 14 MV/min, 약 15 MV/min, 약 16 MV/min, 약 17 MV/min, 약 18 MV/min, 약 19 MV/min, 약 20 MV/min, 약 20 MV/min, 약 21 MV/min, 약 22 MV/min, 약 23 MV/min, 약 24 MV/min, 약 25 MV/min, 약 26 MV/min, 약 27 MV/min, 약 28 MV/min, 약 29 MV/min, 약 30 MV/min, 약 30 MV/min, 약 31 MV/min, 약 32 MV/min, 약 33 MV/min, 약 34 MV/min, 약 35 MV/min, 약 36 MV/min, 약 37 MV/min, 약 38 MV/min, 약 39 MV/min, 약 40 MV/min, 약 40 MV/min, 약 41 MV/min, 약 42 MV/min, 약 43 MV/min, 약 44 MV/min, 약 45 MV/min, 약 46 MV/min, 약 47 MV/min, 약 48 MV/min, 약 49 MV/min, 및 약 50 MV/min으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 10 MV/min 내지 약 20 MV/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min 내지 약 50 L/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min 내지 약 25 L/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min 내지 약 10 L/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min 내지 약 1 L/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min 내지 약 0.5 L/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min 내지 약 100 mL/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min 내지 약 10 mL/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min 내지 약 2 mL/min으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제1 유속, 제2 유속, 제3 유속, 제4 유속, 제5 유속, 제6 유속, 제7 유속, 및 제8 유속이 각각 독립적으로 약 0.5 mL/min, 약 0.6 mL/min, 약 0.7 mL/min, 약 0.8 mL/min, 약 0.9 mL/min, 약 1 mL/min, 약 1.1 mL/min, 약 1.2 mL/min, 약 1.3 mL/min, 약 1.4 mL/min, 약 1.5 mL/min, 약 1.6 mL/min, 약 1.7 mL/min, 및 약 1.8 mL/min으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 물질을 수성 염 용액의 다양한 농도 및 pH를 사용하여 용리할 수 있는 것인, 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 유체가 완충제인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 유체가 글리신-HCl 또는 시트르산나트륨을 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 유체가 글리신-HCl 또는 시트르산나트륨을 약 5 mM 내지 약 2 M의 농도로 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 유체가 글리신-HCl 또는 시트르산나트륨을 약 5 mM, 약 10 mM, 약 20 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 125 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 300 mM, 또는 약 400 mM로 포함하는 것인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 유체의 pH가 약 2 내지 약 8인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 제2 유체의 pH가 약 2, 약 2.2, 약 2.4, 약 2.6, 약 2.8, 약 3, 약 3.2, 약 3.4, 약 3.6, 약 3.8, 약 4, 약 4.2, 약 4.4, 약 4.6, 약 4.8, 약 5, 약 5.2, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 및 약 8.0인, 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 높은 결합능을 나타내는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서는, 배치 또는 폐쇄단 컨쥬게이션 방법이 사용된 것에 비해 관통류 컨쥬게이션 방법이 사용된 경우에 복합재의 결합능이 더 높았다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 10% 돌파(breakthrough)시 약 1 mg/mL멤브레인, 약 2 mg/mL멤브레인, 약 3 mg/mL멤브레인, 약 4 mg/mL멤브레인, 약 5 mg/mL멤브레인, 약 6 mg/mL멤브레인, 약 7 mg/mL멤브레인, 약 8 mg/mL멤브레인, 약 9 mg/mL멤브레인, 약 10 mg/mL멤브레인, 약 12 mg/mL멤브레인, 약 14 mg/mL멤브레인, 약 16 mg/mL멤브레인, 약 18 mg/mL멤브레인, 약 20 mg/mL멤브레인, 약 30 mg/mL멤브레인, 약 40 mg/mL멤브레인, 약 50 mg/mL멤브레인, 약 60 mg/mL멤브레인, 약 70 mg/mL멤브레인, 약 80 mg/mL멤브레인, 약 90 mg/mL멤브레인, 약 100 mg/mL멤브레인, 약 110 mg/mL멤브레인, 약 120 mg/mL멤브레인, 약 130 mg/mL멤브레인, 약 140 mg/mL멤브레인, 약 150 mg/mL멤브레인, 약 160 mg/mL멤브레인, 약 170 mg/mL멤브레인, 약 180 mg/mL멤브레인 , 약 190 mg/mL멤브레인, 약 200 mg/mL멤브레인, 약 210 mg/mL멤브레인, 약 220 mg/mL멤브레인, 약 230 mg/mL멤브레인, 약 240 mg/mL멤브레인, 약 250 mg/mL멤브레인, 약 260 mg/mL멤브레인, 약 270 mg/mL멤브레인, 약 280 mg/mL멤브레인, 약 290 mg/mL멤브레인, 약 300 mg/mL멤브레인, 약 320 mg/mL멤브레인, 약 340 mg/mL멤브레인 mg/mL멤브레인, 약 360 mg/mL멤브레인, 약 380 mg/mL멤브레인, 또는 약 400 mg/mL멤브레인의 결합능을 나타내는 방법에 관한 것이다.
예시
하기 실시예는 예시로서 제공된다. 그러나, 각각의 실시예에 주어진 구체적 상세사항은 예시 목적상 선택된 것이며 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안됨을 이해할 것이다. 일반적으로, 실험은 언급되지 않는 한 유사한 조건 하에 수행되었다.
실시예 1 - 일반적 재료 및 방법
단백질
r단백질 A-cys는 바이오메달 에스.엘(Biomedal S.L) (스페인 세빌)로부터 입수하였다. 폴리클로날 면역 γ-글로불린 IgG는 에퀴테크-바이오 인코포레이티드(Equitech-Bio Inc.) (미국 텍사스주 케르빌)로부터 입수하였다.
멤브레인 제조
프로토콜 A
가교제(들) 및 단량체 (티올 관능화된 단량체 제외, 이는 캐스팅 10 min 전에 첨가됨)를 광개시제 (이르가큐어 2959)와 함께 용매 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 모든 성분을 용해시키기에 충분히 길게 교반하였다. 사전-칭량된 7" x 8" 다공성 지지체 기재 시트 (부직 폴리프로필렌 메쉬)를 폴리에틸렌 시트 상에 배치하고, 이어서 ~15 g의 중합체 용액을 기질 시트 내에 부었다. 이어서, 함침된 기재를 또 다른 폴리에틸렌 시트로 커버링하였다. 과량의 용액 및 임의의 포착 기포를 제거하기 위해 시트를 손으로 원 운동으로 온화하게 가압하였다. 10 min 동안 닫힌 챔버 내에서 폴리에틸렌 시트 사이에 샌드위치 삽입된 중합체 용액/기재에 UV 광 (~350 nm)을 광조사함으로써 중합 공정을 개시하였다. 이어서, 생성된 멤브레인을 폴리에틸렌 시트 사이로부터 제거하고, 교반하며 정제된 (RO) 물 중에서 20-30분 침지 기간을 수반하는 광범위한 세척 사이클 (2-3회)에 적용하였다. 실온에서 ~ 16시간 동안 공기 중에서 자유롭게 매달아 깨끗한 멤브레인을 건조시켰다.
프로토콜 B
아크릴레이트 및 또는 아크릴아미드 단량체 및 가교제를 UV 개시된 반응으로 지지체 메쉬 재료 내에서 중합시킴으로써 멤브레인을 제조하였다. 적합한 관능성 중합가능 기를 겔 중합 용액 중에 도입함으로써 단일 중합 단계에서 단백질 결합 기 (예를 들어, 이온 교환, 소수성 상호작용 및 친수성 상호작용)를 함유하는 다양한 관능성 멤브레인 단백질이 생성될 수 있다. 습윤 세척된 멤브레인을 또한 추가의 열 처리 단계에 적용하여 이들의 성능 및 특성을 조율할 수 있다.
예를 들어, 에폭시-함유 멤브레인이, 표면 상에 다양한 리간드, 예컨대 단백질 A를 공유 앵커링함으로써 생체-친화성 멤브레인으로 전환될 수 있는 반응성 매질 플랫폼의 역할을 할 수 있다. 다른 리간드가 또한 다른 표적 생체-분자 또는 엔티티(entity), 예컨대 바이러스에 컨쥬게이션될 수 있다.
복합 멤브레인의 질량 증가, 습윤화, 및 투과성
건조된 멤브레인의 중량을 측정하고, 이를 사용하여 질량 증가를 계산하였다. 멤브레인 표면 상에 50 μL의 증류수 액적을 분배하고 액적이 멤브레인 내에 흡수되기 위해 필요한 시간을 측정함으로써 멤브레인의 습윤화를 또한 결정하였다. 멤브레인 투과성을 추정하기 위해, 100 kPa 적용 압력을 사용하여, RO 물 (또는 아세테이트 완충제 pH 5) 및 7.7-cm 직경 멤브레인 샘플을 사용하여 각각의 멤브레인의 플럭스를 결정하였다.
멤브레인 투과성을 추정하기 위해, 각각의 멤브레인을 통과하는 이동 상으로서 RO 물 (또는 132 mM 아세테이트 완충제 pH 5)의 플럭스를 결정하였다. 멤브레인을 시험 전에 적어도 10분 동안 시험 유체 중에 사전침지시키고, ~300 mL의 시험 액체로 플러싱하고, 이어서 100 kPa 적용 압력 하에 7.7 cm 직경 (실제 7.3 cm 이용가능 직경)의 원형 멤브레인 쿠폰을 통과하여 지나가는 시험 액체의 양을 결정하였다. 플럭스는 시간 당 표면적 당 액체의 양 (kg/m2h)으로 표현된다.
다공성 구조 이미징
겔 구조 및 다공도를 프로빙하기 위해, 환경 주사 전자 현미경검사 (ESEM)를 사용하여 습윤 상태의 멤브레인을 이미징하였다. 작은 쿠폰 (~7x5 mm)을 10-15분 동안 증류수 중에 침지시킴으로써 습윤화하고, 이어서 ESEM 기기 (FEI 쿠안타(Quanta) FEG 250 ESEM)를 사용하여 검사하였다. 샘플을 냉각 스테이지 상에 배치하여 온도를 5℃로 조정하고, 이미지를 낮은 압력 수준 (4.5-5.5 토르) 및 50-55% 상대 습도에서 검사하였다.
건조 상태의 멤브레인 구조를 프로빙하기 위해, 테스칸 베가(Tescan Vega) II LSU 주사 전자 현미경 (SEM) (테스칸, 미국 펜실바니아주)을 사용하여 10-20 kV로의 전압 셋팅으로 금-코팅된 멤브레인을 이미징하였다.
세공 크기 측정
멤브레인 세공 크기 (직경)을 캡윈(CapWin) 소프트웨어 (V.6)에 의해 작동되는 CFP-1500-AE 모세관 유동 세공측정기(Capillary Flow Porometer) (포러스 머티리얼즈 인코포레이티드(Porous Materials Inc.,), 미국 뉴욕주 이타카)를 사용하여 측정하였다.
멤브레인의 작은 디스크 (2.5-cm 직경)를 10 min 동안 갈윅(Galwick)® 습윤화 액체 (포러스 머티리얼즈 인코포레이티드, 표면 장력=15.9 다인/cm) 중에 침지시키고, 이어서 이를 2개의 사전-습윤화된 여과지 디스크 (와트만(Whatman) 5 - 70 mm) 사이에서 온화하게 스퀴징하여 과량의 용액을 제거하고, 마이크로미터를 사용하여 습윤화된 멤브레인의 두께를 결정하였다. 이어서, 멤브레인 디스크를 2.5-cm 스테인레스 강 메쉬 지지체 디스크 상에 배치하였다. 시험 멤브레인으로 로딩된 지지체 디스크를 멤브레인이 위를 향하게 하여 지정된 홀더 내에 배치하였다. 이어서, 금속 커버를 홀더 상에 온화하게 배치하고, 0-200 psi의 압력 범위 내에서 시험을 실행하였다.
복합 멤브레인 상의 단백질 A 리간드 밀도
커플링된 멤브레인 상의 단백질 A 리간드 밀도를 측정하기 위해, 커플링 반응 후에 남아 있는 커플링되지 않은 단백질의 양을 결정하고, 총 리간드 양으로부터 차감하여 커플링된 리간드의 양을 얻고, 이어서 이를 멤브레인 부피 (mL)로 나누어 밀도를 멤브레인 mL 당 mg 리간드로 표현하였다.
용액 중의 단백질 A 양을 결정하기 위해, 0.1 M 인산염 완충제 (pH 7.2) 중의 일련의 단백질 용액을 제조하고, 각각에 대해 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 기울기가 결정되는 보정 곡선을 구축하였다.
선택된 멤브레인 형식에 대하여, 4 cm x 7 cm의 쿠폰을 절단하고, 이들의 두께를 측정하고, 이로부터 부피를 계산하였다. 커플링 반응을 이전에 요약된 바와 같이 수행하고, 20 mg을 개별적으로 각각의 멤브레인 커플링 반응에 로딩하였다. UV 반응이 완료되면, 반응 용액을 튜브 내에서 수집하고, 이어서 3-5 mL의 0.1 M 인산염 완충제를 반응 백에 첨가하고, 이를 사용하여 20-25 min 동안 진탕시킴으로써 멤브레인을 세척하고, 이어서 생성된 용액을 수집 튜브에 첨가하였다.
세척 사이클을 추가로 2회 반복하고, 이어서 최종 용액 흡광도를 측정하고, 보정 곡선 기울기를 사용하여 커플링되지 않은 단백질의 양을 계산하였다. 반응된 총량과 커플링되지 않은 양 사이의 차이를 구함으로써 커플링된 리간드 양을 결정하였다.
결합능 측정
생체-친화성 IgG 결합능
25-mm 직경 멤브레인 디스크를 25-mm 나트릭스(Natrix)-스테인레스 강 (SS) 홀더 내에 배치하였다. 20 mL의 결합 완충제 (20 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.4)를 통과시켜 평형화하였다 (~ 160-200 층 부피/min). 결합 단계에서, 유출물의 UV 흡광도가 공급 용액의 10%를 초과할 때까지 결합 완충제 중의 0.5 mg/mL 폴리클로날 IgG를 1 mL/min의 유속으로 통과시키고, 이어서 10-15 mL의 완충제를 유속 2 mL/min으로 통과시켜 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 용리 단계에서, 10-14 mL의 용리 완충제 (0.1 M 글리신-HCl, 또는 0.1 M 시트르산나트륨, 둘 다 pH 3)를 유속 2 mL/min으로 통과시킴으로써 결합된 IgG를 용리하였다.
양이온 교환 IgG 결합능
25-mm 멤브레인 디스크를 25-mm 나트릭스-SS 홀더 내에 배치하고, 20 mL의 결합 완충제 (132 mM 아세트산나트륨, pH 5.0)를 통과시켜 평형화를 달성하였다. 이어서, 유출물의 UV 흡광도가 공급 용액의 10%를 초과할 때까지 단백질 용액 (결합 완충제 중의 0.5 mg/mL 인간 폴리클로날 IgG (에퀴테크-바이오 인코포레이티드))을 통과시키고, 이어서 10-15 mL의 완충제를 셀을 통해 지나가게 하여 결합되지 않은 단백질을 세척하였다. 용리 단계에서, 10 mL의 용리 완충제 (132 mM 아세트산나트륨, 1 M NaCl, pH 5.0; 또는 50 mM 트리스, 0.5 M NaCl, pH 8.5)를 통과시킴으로써 결합된 IgG를 용리하였다.
소수성 상호작용 모드 IgG 결합능
25-mm 멤브레인 디스크를 25-mm 나트릭스-SS 홀더 내에 배치하고, 20 mL의 결합 완충제 (50 mM 인산나트륨, 1 M 황산암모늄, pH 6.5)를 통과시켜 평형화를 달성하였다. 이어서, 유출물의 UV 흡광도가 공급 용액의 10%를 초과할 때까지 단백질 용액 (결합 완충제 중의 0.5 mg/mL 인간 폴리클로날 IgG (에퀴테크-바이오 인코포레이티드))을 통과시켰다. 이어서 15-20 mL의 완충제를 셀을 통해 지나가게 하여 결합되지 않은 단백질을 세척하였다. 용리 단계에서, 10 mL의 용리 완충제 (50 mM 인산나트륨, pH 7.0)를 통과시킴으로써 결합된 IgG를 용리하였다.
실시예 2 - 예시적 벌크 커플링 프로토콜
클릭 알켄 멤브레인에 대한 단백질-A 리간드의 컨쥬게이션
히드로티올화 클릭 반응을 통해 알켄 멤브레인에 생체분자 (티올 관능기를 가짐)를 화학적으로 결합하는 것의 실행가능성을 검사하기 위해, 시스테인 잔기를 함유하는 조작된 단백질 A 리간드를 알켄 멤브레인(들) (상이한 화학식을 가짐)에 커플링하고, 부동화 리간드의 생체활성을 검사하였다.
단백질 A 리간드 동결건조된 분말 (r-단백질 A-cys)을 PBS (20 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.4) 중에 용해시켜 50 mg/mL의 모액을 제조하였다. 각각의 멤브레인에 대하여 커플링 용액을 제조하기 위해, 0.4 mL의 리간드 모액을 소형 플라스틱 지퍼백 (5x8 cm) 내로 옮기고, 여기에 1.6 mL의 2 M 인산염 완충제 (pH 7.2)를 첨가하고, 이어서 DMAc (150 mg/mL) 중의 50 μL의 개시제 (4,4'-아조비스(4-시아노발레르산), ACVA)를 첨가하였다. 반응 용액을 잘 혼합하였다. 최종 반응 용액은 ~2.0 mL의 부피를 가졌고, 약 20 mg의 리간드, 및 약 7.5 mg의 개시제를 함유하였다.
대안적으로, ACVA를 5 mg/mL의 농도로 반응 완충제 (2 M 인산염, pH 7.2) 중에 용해시켜 DMAc 사용을 피하였다. 저염 실험에서는, 개시제를 7.5 mg/mL의 농도로 0.5 M 인산염 중에 용해시켰다.
커플링 반응물로 로딩된 백에, 4x7-cm 멤브레인 쿠폰 (물 중에서 사전-습윤화됨)을 첨가하였다. 백을 잠시 진탕시키고, 이어서 UV 광 (~365 nm)을 10분 동안 광조사하였다. 광조사가 완료된 후, 커플링 용액을 디캔팅하고, 이어서 15-20 mL의 세척 완충제 용액 (0.1 M 인산염, pH 7.2)을 첨가하고, 멤브레인을 10-15분 동안 진탕기 상에 배치하였다. 세척 사이클을 3회 반복하고, 그 후 멤브레인을, (i) 8 mL의 트레할로스 용액 (10 wt.%) 중으로 옮기고, 10-15분 동안 진탕시키고, 오븐 (50℃) 내에서 20-30 min 동안 건조시키거나; 또는 (ii) 0.1 M 인산염 완충제 중에서 저장하였다.
첨가제의 존재 하에 커플링을 위해, ACVA를 0.5 M 인산칼륨 (pH 7.2) 중에 용해시켜 7.5 mg/mL의 농도를 갖는 용액을 제조하였다. 단백질 A 리간드를 20 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.2) 중에 용해시켜 50 mg/mL 모액을 제조하였다. 3개의 소형 백 (5x8 cm) 각각에 대해, 0.25 mL의 리간드 모액을 0.25 mL의 개시제 용액과 혼합하고, 50 μL의 첨가제를 첨가하였다 (시스테아민-HCl를 반응 B 백에, 또한 1-메르캅토에탄올을 반응 C 백에).
반응 용액을 잘 혼합한 후, 25-mm 직경 멤브레인 디스크를 각각의 백 내에 배치하고, 반응 백을 잘 진탕시키고, 이어서 UV 광에 의해 10분 동안 광조사하였다. 반응 용액을 디캔팅하고, 이어서 0.1 M 인산나트륨 완충제 (pH 7.2)를 사용하여 멤브레인 쿠폰을 3회 세척하고, 10-15분 동안 진탕시켰다. 복합 멤브레인 쿠폰을 완충제 (0.1 M 인산나트륨, pH 7.2) 중에서 저장하고, 상기에 요약된 바와 같이 IgG 단백질에 대한 생체-친화성에 대하여 시험하였다.
실시예 3 - 관통류 리간드 컨쥬게이션 효과
펜던트 반응성 관능기를 함유하는 습윤화된 멤브레인의 샘플 디스크를 스테인레스 강 홀더 내에 배치하고 AKTA 크로마토그래피 시스템에 부착하였다. 친화성 리간드 용액을 미리 정해진 길이의 시간 동안 정의된 유속으로 멤브레인 홀더를 통과하여 펌핑하였다. 이어서, 세척 용액을 홀더를 통과하여 펌핑한 후, 잔류 멤브레인 펜던트 기를 비-반응성 기로 전환시키는 반응성 화합물을 함유하는 켄칭 용액을 펌핑하였다. 최종적으로, 세척 용액을 홀더를 통과하여 펌핑하였다. 펌프를 멈추고, 홀더를 AKTA로부터 제거하고, 홀더를 분해하여 컨쥬게이션된 멤브레인의 제거를 가능하게 하였다. 컨쥬게이션된 멤브레인 (단백질 A 친화성 리간드)의 인간 IgG 동적 결합능을 10 멤브레인 부피/분의 유속에서 측정하고, 배치, 비-관통류 공정에서 컨쥬게이션된 멤브레인과 비교하였다 (도 3 참조). 멤브레인 동적 결합능은 관통류 컨쥬게이션 사용시 일관적으로 더 높은 것으로 관찰되었다.
실시예 4 - 주기적 유동-우회 플레이트가 없는 멤브레인의 스택을 통과하는 유동에 의한 단백질 A 커플링
44 mm의 내경을 갖는 유리 크로마토그래피 칼럼 (밴티지(VANTAGE)® L 실험실 칼럼 VL 44 x 250, 카탈로그 번호: 96440250)의 저부에 다공성 프릿을 함유하는 헤더를 부착하였다. 이어서, 30 mm의 직경 및 대략 350 마이크로미터의 두께 (부피 0.25 mL)를 갖는 원형 멤브레인을, 이것이 칼럼 벽으로부터 동일한 거리에 있도록, 칼럼 내부 프릿 상에 배치하였다. 멤브레인은 에폭시드 기를 함유하는 표면을 가졌다. 이어서, 44 mm의 직경을 갖는 폴리프로필렌 스크린 (1:2 능직, 500 마이크로미터 메쉬 개구)의 원형 섹션을 칼럼 내에 배치하고, 이것이 멤브레인 상에 편평하게 놓이고 칼럼의 내부 벽에 접촉하도록 하강시켰다. 이어서, 또 다른 30 mm 직경 멤브레인을 칼럼 내에 배치하고, 이것이 스크린 상에 편평하게 놓이고 칼럼의 벽으로부터 동일한 거리에 있도록 하강시켰다. 칼럼이 99개 스크린 사이에 적층된 100개의 멤브레인 (총 부피 25 mL)을 함유할 때까지, 멤브레인 상에 스크린을 놓고, 이어서 스크린 상에 멤브레인을 놓는 공정을 반복하였다. 이어서, 헤더를 칼럼의 상단에 첨가하고, 멤브레인 및 스크린 층이 9.5 cm의 높이로 압축될 때까지 하강시켰다.
다음으로 칼럼의 저부의 유입구에 튜빙을 첨가하고, 또한 칼럼의 상단의 유출구에 튜빙을 첨가하였다. 유입구 튜빙을 연동 펌프를 통과하여 연결하여 칼럼을 통과하는 용액의 제어된 유동을 가능하게 하였다.
칼럼 및 튜빙 내의 공기를 pH 7.4의 150 mM 염화나트륨과 20 mM 인산나트륨으로 구성된 PBS 완충제로 치환하였다. 유입구 튜빙을 400 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하고, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 이어서, 펌프를 가동시키고, 200 mL의 PBS 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다. 펌프를 멈추고, 칼럼을 뒤집었다. 이어서, 칼럼에 대한 유입구 튜빙 및 유출구 튜빙의 연결을 교환하여 유입구가 다시 칼럼의 저부에 있고 유출구가 칼럼의 상단에 있게 하였다. 펌프를 가동시키고, 추가의 200 mL의 PBS 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
펌프를 멈추고, 유입구 튜빙을 pH 9.0의 1.35 M 인산칼륨으로 구성된 500 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유리병 내로 이동시켰다. 유출구 튜빙은 폐기로 지향시켜 유지하였다. 펌프를 가동시키고, 200 mL의 커플링 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다. 펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 남아 있는 300 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유입구 튜빙과 동일한 유리병 내에 배치하였다. 유입구 튜빙 및 유출구 튜빙이 동일한 병 내에 있는 이 구성에서, 용액은 다수회 칼럼을 통과하여 재순환될 수 있다. 칼럼을 통과하는 용액의 재순환은 용액의 부피 증가를 필요로 하지 않으면서 연장된 반응 시간을 가능하게 한다.
남아 있는 300 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유리병에 물 중의 25.8 g/L의 농도를 갖는 82.4 mL의 PrA 리간드 모액을 첨가하였다. 펌프를 가동시키고, 이어서 PrA 용액을 50 mL/min의 유속으로 4시간 동안 칼럼을 통과하여 재순환시켰다. 칼럼을 통과하여 재순환되는 총 PrA 용액 부피는 422.4 mL인 것으로 계산되었고, 이는 유리병 내에 남아 있는 300 mL의 커플링 완충제, 칼럼/튜빙 내에 남아 있는 40 mL의 커플링 완충제, 및 첨가된 82.4 mL의 PrA 모액으로 구성되었다. 2.12 g의 PrA 리간드를 함유하는 82.4 mL의 PrA 리간드 모액이 422.4 mL의 부피로 희석된 것을 고려하면, 시스템 내에서 재순환된 PrA 용액은 5 g/L의 농도를 갖는 것으로 계산되었다. 멤브레인 상의 리간드 로딩은, 2.12 g의 PrA 리간드의 총 질량을 총 멤브레인 부피 25 mL로 나누어 85 g/L의 리간드 로딩을 얻음으로써 계산되었다.
펌프를 멈추고 4시간 후, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시키고, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 유입구 튜빙을 200 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 펌프를 가동시키고, PBS 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
이어서, 펌프를 멈추고, 유입구 튜빙을 800 mL의 1 M 에탄올아민을 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 유출구 튜빙은 폐기로 지향시켜 유지하였다. 펌프를 가동시키고, 200 mL의 1 M 에탄올아민을 4 min 동안 50 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켜 폐기하였다. 펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 남아 있는 600 mL의 1 M 에탄올아민 용액을 함유하는 유리병 내로 지향시켰다. 이어서, 펌프를 가동시키고, 남아 있는 600 mL의 1 M 에탄올아민 용액을 50 mL/min의 유속으로 3시간 동안 칼럼을 통과하여 재순환시켰다.
펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 유입구 튜빙을 200 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 펌프를 가동시키고, PBS 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
펌프를 멈추고, 상단 칼럼 헤더를 제거하였다. 멤브레인을 제거하고 PBS 완충제 중에서 저장하였다. 스택 내의 상이한 위치에서의 여러 멤브레인의 플럭스 및 IgG 동적 결합능을 결정하였다. 위치 #1은 칼럼 유입구에 가장 근접한 것이며, 위치 #100은 칼럼 유출구에 가장 가까운 것이다. 위치가 달라짐에 따라 멤브레인 플럭스에서의 유의한 편차는 없는 것으로 나타났다 (표 1). 위치 60 및 80에서의 멤브레인은 훨씬 더 낮은 IgG 동적 결합능을 갖는 것으로 나타났고, 이는 칼럼 내의 유동 분포가 균일하지 않았음을 시사한다.
표 1. 스택 내의 멤브레인의 위치를 기준으로 한 멤브레인 플럭스 및 IgG 동적 결합능.
실시예 5 - 주기적 유동-우회 플레이트를 갖는 멤브레인의 스택을 통과하는 유동에 의한 단백질 A 커플링
44 mm의 내경을 갖는 유리 크로마토그래피 칼럼 (밴티지® L 실험실 칼럼 VL 44 x 250, 카탈로그 번호: 96440250)의 저부에 다공성 프릿을 함유하는 헤더를 부착하였다. 이어서, 6 mm의 직경을 갖는 중심 내의 홀을 갖는 44 mm의 직경을 갖는 대략 0.025 인치 두께의 원형 불투과성 플라스틱 시트로 구성된 유동 분포 층을, 이것이 다공성 프릿 상에 편평하게 놓이도록 하강시켰다. 이어서, 44 mm의 직경을 갖는 폴리프로필렌 스크린 (1:2 능직, 500 마이크로미터 메쉬 개구)의 2개의 원형 섹션을 유동 분포 층 상에 배치하였다. 이어서, 30 mm 직경 및 대략 350 마이크로미터의 두께 (부피 0.25 mL)를 갖는 원형 멤브레인을, 이것이 칼럼 벽으로부터 동일한 거리에 있도록, 스크린 상에 배치하였다. 멤브레인은 에폭시드 기를 함유하는 표면을 가졌다. 폴리프로필렌 스크린의 또 다른 원형 섹션을, 이것이 멤브레인 상에 편평하게 놓이도록 하강시켰다. 멤브레인 층, 그 후 폴리프로필렌 스크린 층을 첨가하는 공정을, 칼럼이 도 4에 나타낸 추종 조성을 가질 때까지 9회 반복하였다.
상기에 기재된 바와 같은 칼럼 내의 층의 어셈블링 공정을, 칼럼이 100개의 멤브레인 층 (총 부피 25 mL), 120개의 스크린 층, 및 10개의 유동 분포 층을 함유할 때까지 9회 더 반복하였다. 이어서 추가의 유동 분포 층을 스택에 첨가하고, 다공성 프릿을 갖는 헤더를 칼럼의 상단에 첨가하였다. 멤브레인, 스크린, 및 유동 분포 층이 10.5 cm의 높이로 압축될 때까지 헤더를 하강시켰다.
다음으로 칼럼의 저부의 유입구에 튜빙을 첨가하고, 또한 칼럼의 상단의 유출구에 튜빙을 첨가하였다. 유입구 튜빙을 연동 펌프를 통과하여 연결하여 칼럼을 통과하는 용액의 제어된 유동을 가능하게 하였다.
칼럼 및 튜빙 내의 공기를 pH 7.4의 150 mM 염화나트륨과 20 mM 인산나트륨으로 구성된 PBS 완충제로 치환하였다. 유입구 튜빙을 400 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하고, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 이어서, 펌프를 가동시키고, 200 mL의 PBS 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다. 펌프를 멈추고, 칼럼을 뒤집었다. 이어서, 칼럼에 대한 유입구 튜빙 및 유출구 튜빙의 연결을 교환하여 유입구가 다시 칼럼의 저부에 있고 유출구가 칼럼의 상단에 있게 하였다. 펌프를 가동시키고, 추가의 200 mL의 PBS 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
펌프를 멈추고, 유입구 튜빙을 pH 9.0의 1.35 M 인산칼륨으로 구성된 500 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유리병 내로 이동시켰다. 유출구 튜빙은 폐기로 지향시켜 유지하였다. 펌프를 가동시키고, 200 mL의 커플링 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다. 펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 남아 있는 300 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유입구 튜빙과 동일한 유리병 내에 배치하였다. 유입구 튜빙 및 유출구 튜빙이 동일한 병 내에 있는 이 구성에서, 용액은 다수회 칼럼을 통과하여 재순환될 수 있다. 칼럼을 통과하는 용액의 재순환은 용액의 부피 증가를 필요로 하지 않으면서 연장된 반응 시간을 가능하게 한다.
남아 있는 300 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유리병에 물 중의 25.8 g/L의 농도를 갖는 82.4 mL의 PrA 리간드 모액을 첨가하였다. 펌프를 가동시키고, 이어서 PrA 용액을 50 mL/min의 유속으로 4시간 동안 칼럼을 통과하여 재순환시켰다. 칼럼을 통과하여 재순환되는 총 PrA 용액 부피는 422.4 mL인 것으로 계산되었고, 이는 유리병 내에 남아 있는 300 mL의 커플링 완충제, 칼럼/튜빙 내에 남아 있는 40 mL의 커플링 완충제, 및 첨가된 82.4 mL의 PrA 모액으로 구성되었다. 2.12 g의 PrA 리간드를 함유하는 82.4 mL의 PrA 리간드 모액이 422.4 mL의 부피로 희석된 것을 고려하면, 시스템 내에서 재순환된 PrA 용액은 5 g/L의 농도를 갖는 것으로 계산되었다. 멤브레인 상의 리간드 로딩은, 2.12 g의 PrA 리간드의 총 질량을 총 멤브레인 부피 25 mL로 나누어 85 g/L의 리간드 로딩을 얻음으로써 계산되었다.
펌프를 멈추고 4시간 후, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 유입구 튜빙을 200 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 펌프를 가동시키고, PBS 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
이어서, 펌프를 멈추고, 유입구 튜빙을 800 mL의 1 M 에탄올아민을 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 유출구 튜빙은 폐기로 지향시켜 유지하였다. 펌프를 가동시키고, 200 mL의 1 M 에탄올아민을 4 min 동안 50 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켜 폐기하였다. 펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 남아 있는 600 mL의 1 M 에탄올아민 용액을 함유하는 유리병 내로 지향시켰다. 이어서, 펌프를 가동시키고, 남아 있는 600 mL의 1 M 에탄올아민 용액을 50 mL/min의 유속으로 3시간 동안 칼럼을 통과하여 재순환시켰다.
펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 유입구 튜빙을 200 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 펌프를 가동시키고, PBS 완충제를 4 min 동안 50 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
펌프를 멈추고, 상단 칼럼 헤더를 제거하였다. 멤브레인을 제거하고 PBS 완충제 중에서 저장하였다. 스택 내의 상이한 위치에서의 여러 멤브레인의 플럭스 및 IgG 동적 결합능을 결정하였다. 위치 #1은 칼럼 유입구에 가장 근접한 것이며, 위치 #100은 칼럼 유출구에 가장 가까운 것이다. 위치가 달라짐에 따라 멤브레인 플럭스에서의 유의한 편차는 없는 것으로 나타났다 (표 2). 또한, IgG 동적 결합능에서의 유의한 편차가 없는 것으로 나타났고, 이는 칼럼 전반에 걸쳐 유동 분포가 비교적 균일하였음을 시사한다. 유동 분포 층의 첨가는 PrA 리간드와의 스택 내의 모든 에폭시드 멤브레인의 균일한 커플링을 제공하였다 (도 5a 및 5b).
표 2. 스택 내의 멤브레인의 위치를 기준으로 한 멤브레인 플럭스 및 IgG 동적 결합능.
실시예 6 - 멤브레인의 나선형 권취 롤을 통과하는 접선 유동에 의한 단백질 A 커플링
24.5 cm의 폭, 62.5 cm의 길이 및 0.035 cm의 두께 (53.6 mL의 총 멤브레인 부피)를 갖는 직사각형 멤브레인을, 1.6 cm의 직경 및 25.4 cm의 길이를 갖는 실린더형 코어 주위에 25.4 cm의 폭을 갖는 폴리프로필렌 스크린 (1:2 능직, 500 마이크로미터 메쉬 개구)의 플라스틱 직사각형 섹션과 권취하였다. 멤브레인을, 멤브레인의 연부와 스크린의 연부 사이에 0.45 cm가 존재하도록 중심에 두었다. 멤브레인 및 스크린을, 스크린을 코어에 접촉시키며 코어 주위에 랩핑하였다. 모든 멤브레인이 스크린 층에 의해 완전히 커버링될 때까지 멤브레인 및 스크린을 롤링하였다. 롤의 직경이 32 mm가 될 때까지 스크린 층을 롤 주위에 계속 권취하였다. 이어서, 스크린 층을 절단하였다. 이어서, 롤을, 롤의 연부가 칼럼의 양쪽 단부로부터 2.5 cm에 있도록, 32 mm의 내경을 갖는 유리 크로마토그래피 칼럼 (밴티지® L 실험실 칼럼 VL 32 x 250, 카탈로그 번호: 96320250) 내로 슬라이딩하였다. 이어서, 다공성 프릿을 함유하는 헤더를 칼럼의 저부 및 상단에 부착하였다.
다음으로 칼럼의 저부의 유입구에 튜빙을 첨가하고, 또한 칼럼의 상단의 유출구에 튜빙을 첨가하였다. 유입구 튜빙을 연동 펌프를 통과하여 연결하여 칼럼을 통과하는 용액의 제어된 유동을 가능하게 하였다.
칼럼 및 튜빙 내의 공기를 pH 7.4의 150 mM 염화나트륨과 20 mM 인산나트륨으로 구성된 PBS 완충제로 치환하였다. 유입구 튜빙을 400 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하고, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 이어서, 펌프를 가동시키고, 200 mL의 PBS 완충제를 5 min 동안 40 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다. 펌프를 멈추고, 칼럼을 뒤집었다. 이어서, 칼럼에 대한 유입구 튜빙 및 유출구 튜빙의 연결을 교환하여 유입구가 다시 칼럼의 저부에 있고 유출구가 칼럼의 상단에 있게 하였다. 펌프를 가동시키고, 추가의 200 mL의 PBS 완충제를 5 min 동안 40 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
펌프를 멈추고, 유입구 튜빙을 pH 9.0의 1.35 M 인산칼륨으로 구성된 1064 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유리병 내로 이동시켰다. 유출구 튜빙은 폐기로 지향시켜 유지하였다. 펌프를 가동시키고, 300 mL의 커플링 완충제를 7.5 min 동안 40 mL/min의 속도로 칼럼을 통과하여 유동시켰다. 펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 남아 있는 764 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유입구 튜빙과 동일한 유리병 내에 배치하였다. 유입구 튜빙 및 유출구 튜빙이 동일한 병 내에 있는 이 구성에서, 용액은 다수회 칼럼을 통과하여 재순환될 수 있다. 칼럼을 통과하는 용액의 재순환은 용액의 부피 증가를 필요로 하지 않으면서 연장된 반응 시간을 가능하게 한다.
남아 있는 764 mL의 커플링 완충제를 함유하는 유리병에 물 중의 25.8 g/L의 농도를 갖는 205.6 mL의 PrA 리간드 모액을 첨가하였다. 펌프를 가동시키고, 이어서 PrA 용액을 40 mL/min의 유속으로 4시간 동안 칼럼을 통과하여 재순환시켰다. 칼럼을 통과하여 재순환되는 총 PrA 용액 부피는 1062.6 mL인 것으로 계산되었고, 이는 유리병 내에 남아 있는 764 mL의 커플링 완충제, 칼럼/튜빙 내에 남아 있는 93 mL의 커플링 완충제, 및 첨가된 205.6 mL의 PrA 모액으로 구성되었다. 5.3 g의 PrA 리간드를 함유하는 205.6 mL의 PrA 리간드 모액이 1064 mL의 부피로 희석된 것을 고려하면, 시스템 내에서 재순환된 PrA 용액은 5 g/L의 농도를 갖는 것으로 계산되었다. 멤브레인 상의 리간드 로딩은, 5.3 g의 PrA 리간드의 총 질량을 총 멤브레인 부피 53.6 mL로 나누어 99 g/L의 리간드 로딩을 얻음으로써 계산되었다.
펌프를 멈추고 4시간 후, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 유입구 튜빙을 200 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 펌프를 가동시키고, PBS 완충제를 5 min 동안 40 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
이어서, 펌프를 멈추고, 유입구 튜빙을 600 mL의 1 M 에탄올아민을 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 유출구 튜빙은 폐기로 지향시켜 유지하였다. 펌프를 가동시키고, 200 mL의 1 M 에탄올아민을 10 min 동안 20 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켜 폐기하였다. 펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 남아 있는 400 mL의 1 M 에탄올아민 용액을 함유하는 유리병 내로 지향시켰다. 이어서, 펌프를 가동시키고, 남아 있는 400 mL의 1 M 에탄올아민 용액을 20 mL/min의 유속으로 170분 동안 칼럼을 통과하여 재순환시켰다.
펌프를 멈추고, 유출구 튜빙을 폐기로 지향시켰다. 유입구 튜빙을 400 mL의 PBS 완충제를 함유하는 유리병 내에 배치하였다. 펌프를 가동시키고, PBS 완충제를 10 min 동안 40 mL/min의 유속으로 칼럼을 통과하여 유동시켰다.
펌프를 멈추고, 상단 및 저부 칼럼 헤더를 제거하였다. 이어서, 멤브레인 및 스크린의 권취 롤을 칼럼으로부터 제거하였다. 멤브레인을 권출시키고 스크린으로부터 분리하였다. 이어서, 30 mm 직경을 갖는 멤브레인의 원형 섹션을 직사각형 멤브레인 시트로부터 제거하였다. 멤브레인의 5개의 원형 섹션을 하기 위치 각각으로부터 제거하였다 (도 6):
1. 중심: 직사각형 멤브레인 시트의 전체적 중심에 위치함.
2. 코어: 커플링 반응 동안 코어에 가장 가까운 직사각형 멤브레인 시트의 연부 중앙에 위치함.
3. 쉘: 커플링 반응 동안 칼럼 측면에 가장 가까운 직사각형 멤브레인 시트의 연부 중앙에 위치함.
4. 유입구: 커플링 반응 동안 칼럼 유입구에 가장 가까운 직사각형 멤브레인 시트의 연부 중앙에 위치함.
5. 유출구: 커플링 반응 동안 칼럼 유입구에 가장 가까운 직사각형 멤브레인 시트의 연부 중앙에 위치함.
6. 각각의 섹션으로부터 제거된 5개의 멤브레인을, 1.0 mL의 총 접근가능 멤브레인 부피를 갖는 5개의 5-층 멤브레인 크로마토그래피 장치로 어셈블링하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 5개의 크로마토그래피 장치의 압력 강하 및 IgG 동적 결합능을 10 멤브레인 부피/분 또는 10 mL/min의 유속에서 결정하였다. 1 mL 장치는 모두, 모든 5개의 상이한 위치에서 매우 유사한 압력 강하 및 IgG 동적 결합능을 갖는 것으로 나타났다. 이들 결과는, PrA 리간드와의 에폭시드 멤브레인의 접선 유동 커플링이, 멤브레인이 폴리프로필렌 스크린과 인터리핑될 때 이를 가로질러 균일하게 달성될 수 있음을 시사한다.
표 3. 나선형 권취 직사각형 시트 내의 멤브레인의 위치를 기준으로 한 압력 강하 및 IgG 동적 결합능.
참조로 포함
본원에서 인용된 모든 미국 특허 및 미국 특허 출원 공개는 본원에 참조로 포함된다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을, 단지 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있거나, 인식할 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.
Claims (79)
- a. i. 지지 부재를 통과하여 연장되는 복수의 세공을 포함하는 지지 부재; 및
ii. 하나 이상의 중합가능 단량체와 하나 이상의 가교제의 반응으로부터 형성된 중합체를 포함하고; 복수의 펜던트 반응성 관능기를 포함하고; 지지 부재의 세공 내에 위치하고; 그의 거대세공은 지지 부재의 세공보다 더 작은 것인 거대다공성 가교 겔
을 포함하는, 동연적(coextensive) 시트의 동일 평면상의 스택, 관형 구성, 또는 나선형 권취 구성으로 배열된 관능화된 복합재를 제공하는 단계; 및
b. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 용액을 제1 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제1 용액은 복수의 제1 리간드를 포함하고, 그에 따라 반응성 관능기와 제1 리간드 사이에 복수의 공유 결합이 형성되는 것인 단계
를 포함하는, 관능화된 복합재에 리간드를 커플링하는 방법. - 제1항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 알데히드, 아민, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 에폭시드, 히드록실, 티올, 무수물, 아지드, 반응성 할로겐, 산 염화물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 티올 관능기를 포함하는 분자 또는 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 분자로부터 유래되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 티올 관능기를 포함하는 분자로부터 유래되고; 티올 관능기를 포함하는 분자가 3-메르캅토프로피온산, 1-메르캅토숙신산, 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 시스테인 잔기를 포함하는 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 융합 단백질, 시스테아민, 1-티오헥시톨, 폴리(에틸렌 글리콜) 2-메르캅토에틸 에테르 아세트산, 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 티올, 1-티오글리세롤, 2-나프탈렌티올, 비페닐-4-티올, 3-아미노-1,2,4-트리아졸-5-티올, 5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-티올, 1-[2-(디메틸아미노)에틸]-1H-테트라졸-5-티올, 1-프로판티올, 1-부탄티올, 1-펜탄티올, 1-헥산티올, 1-옥탄티올, 8-아미노-1-옥탄티올 히드로클로라이드, 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-트리데카플루오로-1-옥탄티올, 8-메르캅토-1-옥탄올, 및 γ-Glu-Cys로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 티올 관능기를 포함하는 분자가 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 시스테인 잔기를 포함하는 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 단백질, 시스테인 잔기를 포함하는 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 및 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 융합 단백질인 방법.
- 제6항에 있어서, 티올 관능기를 포함하는 분자가 시스테인 잔기를 포함하는 단백질인 방법.
- 제4항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 분자로부터 유래되고; 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 분자가 1-옥텐, 1-헥신, 4-브로모-1-부텐, 알릴디페닐포스핀, 알릴아민, 알릴 알콜, 3,4-디히드록시-1-부텐, 7-옥텐-1,2-디올, 3-알릴옥시-1,2-프로판디올, 3-부텐산, 3,4-데히드로-L-프롤린, 비닐 라우레이트, 1-비닐-2-피롤리디논, 비닐 신나메이트, 아실아미드, 또는 아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 알데히드, 아민, 에폭시드, 히드록실, 무수물, 아지드, 반응성 할로겐, 및 산 염화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 하나 이상의 단량체가 글리시딜 메타크릴레이트, 아크릴아미독심, 아크릴산 무수물, 아젤라산 무수물, 말레산 무수물, 히드라지드, 아크릴로일 클로라이드, 2-브로모에틸 메타크릴레이트, 및 비닐 메틸 케톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 아민인 방법.
- 제9항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 에폭시드인 방법.
- 제9항에 있어서, 펜던트 반응성 관능기가 히드록실인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 리간드가 제1 관능기를 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 제1 리간드가 적어도 하나의 그래프팅 말단-기를 추가로 포함하고; 제1 관능기가 양이온성, 음이온성, 소수성, 친수성, 친황성(thiophilic), 수소 결합 공여, 수소 결합 수용, 파이-파이 결합 공여, 파이-파이 결합 수용, 금속 킬레이팅, 생물학적 분자, 및 생물학적 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 관능기가 양이온성, 음이온성, 소수성, 친수성, 친황성, 수소 결합 공여, 수소 결합 수용, 파이-파이 결합 공여, 및 파이-파이 결합 수용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 분자가 제1 관능기를 포함하고, 분자가 2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-아미노에틸 메타크릴레이트, 2-카르복시에틸 아크릴레이트, 2-(메틸티오)에틸 메타크릴레이트, 아크릴아미드, N-아크릴옥시숙신이미드, 부틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, N,N-디에틸아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, 2-(N,N-디메틸아미노)에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, N-[3-(N,N-디메틸아미노)프로필]메타크릴-아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, 에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 히드록시프로필 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 페닐 에테르 메타크릴레이트, 메타크릴아미드, 메타크릴산 무수물, 프로필 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, N-이소프로필아크릴아미드, 스티렌, 4-비닐피리딘, 비닐술폰산, N-비닐-2-피롤리디논 (VP), 아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰산, 스티렌술폰산, 알긴산, (3-아크릴아미도프로필)트리메틸암모늄 할라이드, 디알릴디메틸암모늄 할라이드, 4-비닐-N-메틸피리디늄 할라이드, 비닐벤질-N-트리메틸암모늄 할라이드, 메타크릴옥시에틸트리메틸암모늄 할라이드, 3-술포프로필 메타크릴레이트, 2-(2-메톡시)에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴아미드, N-(3-메톡시프로필 아크릴아미드), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]아크릴아미드, N-페닐 아크릴아미드, N-tert-부틸 아크릴아미드, 또는 디아세톤 아크릴아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 관능기가 금속 킬레이팅 관능기인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 관능기가 옥타덴테이트, 헥사덴테이트, 테트라덴테이트, 트리덴테이트, 비덴테이트, 이미노디카르복실산, 및 이미노디아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 금속 킬레이팅 관능기를 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 관능기가 생물학적 분자 또는 생물학적 이온인 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 관능기가 알부민, 리소자임, 바이러스, 세포, 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원 둘 다의 면역글로불린, 합성 또는 천연 기원의 폴리펩티드를 포함한 재조합 또는 천연 기원의 단백질, 인터류킨-2 및 그의 수용체, 효소, 모노클로날 항체, 항원, 렉틴, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 트립신 및 그의 억제제, 시토크롬 C, 미오글로불린, 재조합 인간 인터류킨, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 펩티드 H, 핵산 유래 생성물, 합성 또는 천연 기원의 DNA, 및 합성 또는 천연 기원의 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자 또는 생물학적 이온 관능기를 포함하는 것인 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기가 알데히드, 아민, 탄소-탄소 이중 결합, 탄소-탄소 삼중 결합, 에폭시드, 히드록실, 티올, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기가 알데히드인 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기가 아민인 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기가 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합인 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기가 에폭시드인 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기가 히드록실인 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 그래프팅 말단-기가 티올인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
c. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 세척 용액을 제2 유속으로 유동시킴으로써, 과량의 제1 리간드를 제거하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
d. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 켄칭 용액을 제3 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 켄칭 용액은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시키기 위한 반응성 화합물을 포함하는 것인 단계; 및
e. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 세척 용액을 제4 유속으로 유동시켜 임의의 잔류 반응성 화합물을 제거하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 복합재를 통과하여 또는 이를 가로질러 단계 b.의 제1 용액을 재순환시키는 것인 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 복합재를 통과하여 또는 이를 가로질러 단계 d.의 켄칭 용액을 재순환시키는 것인 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
c. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제1 세척 용액을 제2 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제1 리간드를 제거하는 단계;
d. 관능화된 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 용액을 제3 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 제2 용액은 적어도 3개의 반응성 기를 포함하는 복수의 제2 리간드, 및 임의로, 적어도 2개의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 중합가능 단량체를 포함하고, 여기서 제2 리간드는 가교제이고, 이로써 반응성 관능기와 제2 리간드 사이의 복수의 공유 결합을 형성하는 것인 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제33항에 있어서, 제2 리간드를 적어도 두 부분으로 첨가하는 것인 방법.
- 제33항에 있어서, 적어도 2개의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 중합가능 단량체를 적어도 두 부분으로 첨가하는 것인 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 리간드가 제2 관능기를 포함하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 제2 리간드가 적어도 하나의 그래프팅 말단-기를 추가로 포함하고; 제2 관능기가 양이온성, 음이온성, 소수성, 친수성, 친황성, 수소 결합 공여, 수소 결합 수용, 파이-파이 결합 공여, 파이-파이 결합 수용, 금속 킬레이팅, 생물학적 분자, 및 생물학적 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 제2 관능기가 양이온성, 음이온성, 소수성, 친수성, 친황성, 수소 결합 공여, 수소 결합 수용, 파이-파이 결합 공여, 및 파이-파이 결합 수용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 제2 리간드가 아민, 히드록실, 및 티올 관능기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 그래프팅 말단-기를 포함하는 생물학적 분자 또는 생물학적 이온을 포함하는 것인 방법.
- 제39항에 있어서, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온이 알부민, 리소자임, 바이러스, 세포, 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원 둘 다의 면역글로불린, 합성 또는 천연 기원의 폴리펩티드를 포함한 재조합 또는 천연 기원의 단백질, 인터류킨-2 및 그의 수용체, 효소, 모노클로날 항체, 항원, 렉틴, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 트립신 및 그의 억제제, 시토크롬 C, 미오글로불린, 재조합 인간 인터류킨, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 펩티드 H, 핵산 유래 생성물, 합성 또는 천연 기원의 DNA, 및 합성 또는 천연 기원의 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제39항에 있어서, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온이 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원 둘 다의 면역글로불린, 합성 또는 천연 기원의 폴리펩티드를 포함한 재조합 또는 천연 기원의 단백질, 모노클로날 항체, 항원, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 및 펩티드 H로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 리간드가 폴리펩티드, 단백질, 재조합 단백질, 박테리아 면역글로불린-결합 단백질, 재조합 융합 단백질, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 및 펩티드 H인 방법.
- 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 펜던트 반응성 관능기를 포함하는 중합가능 단량체가 폴리(에틸렌 글리콜) 디비닐 에테르인 방법.
- 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
e. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제2 세척 용액을 제4 유속으로 유동시켜 임의의 과량의 제2 리간드 및, 임의로, 임의의 과량의 중합가능 단량체를 제거하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
f. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 켄칭 용액을 제5 유속으로 유동시키는 단계이며, 여기서 켄칭 용액은 임의의 잔류 펜던트 반응성 관능기를 비-반응성 기로 전환시키기 위한 반응성 화합물을 포함하는 것인 단계; 및
g. 임의로, 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 제3 세척 용액을 제6 유속으로 유동시켜 임의의 잔류 반응성 화합물을 제거하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 복합재가 실질적으로 동연적 시트의 실질적으로 동일 평면상의 스택으로 배열되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 복합재가 2 내지 300개의 별도의 지지 부재를 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 복합재가 관형 구성으로 배열되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 복합재가 실질적으로 나선형 권취 구성으로 배열되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 지지 부재가 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리페닐렌옥시드, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 셀룰로스, 및 셀룰로스 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체 재료를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 복합재가 멤브레인인 방법.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 복합재가 하나 이상의 인터리프 층과 접촉되는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 하나 이상의 인터리프 층이 스크린, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 및 종이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 하나 이상의 인터리프 층이 하나 이상의 유동 분포 층과 접촉되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 가교 겔이 중성 히드로겔, 대전된 히드로겔, 다가전해질 겔, 소수성 겔, 중성 겔, 또는 관능기를 포함하는 겔인 방법.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 거대다공성 가교 겔이 10 nm 내지 3000 nm의 평균 크기를 갖는 거대세공을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 지지 부재의 세공이 약 0.1 μm 내지 약 50 μm의 평균 세공 직경을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 유동로가 복합재를 실질적으로 통과하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 유동로가 복합재를 실질적으로 가로지르는 것인 방법.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
h. 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 물질을 포함하는 제1 유체를 제7 유속으로 유동시킴으로써, 물질의 일부를 복합재 상에 흡착 또는 흡수시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제60항에 있어서, 제1 유체가 단편화된 항체, 응집된 항체, 숙주 세포 단백질, 폴리뉴클레오티드, 내독소, 또는 바이러스를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 제1 유체의 유체 유동로가 복합재를 실질적으로 통과하는 것인 방법.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 제1 유체의 유체 유동로가 복합재를 실질적으로 가로지르는 것인 방법.
- 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 유체가 복합재를 실질적으로 통과하여 또는 실질적으로 가로질러 유동한 후 실질적으로 모든 물질이 복합재 상으로 흡착 또는 흡수되는 것인 방법.
- 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
i. 복합재 상으로 흡착 또는 흡수된 물질과 제2 유체를 제8 유속으로 접촉시킴으로써, 복합재로부터 물질의 일부를 방출시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제65항에 있어서, 제2 유체의 유체 유동로가 복합재의 거대세공을 실질적으로 통과하는 것인 방법.
- 제65항에 있어서, 제2 유체의 유체 유동로가 복합재의 거대세공에 실질적으로 수직인 것인 방법.
- 제60항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 물질이 생물학적 분자, 생물학적 이온, 바이러스, 또는 바이러스 입자인 방법.
- 제68항에 있어서, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온이 알부민, 리소자임, 바이러스, 세포, 인간 및 동물 기원의 γ-글로불린, 인간 및 동물 기원의 면역글로불린, hIgG, 재조합 및 천연 기원의 단백질, 합성 및 천연 기원의 폴리펩티드, 인터류킨-2 및 그의 수용체, 효소, 모노클로날 항체, 트립신 및 그의 억제제, 시토크롬 C, 미오글로빈, 미오글로불린, α-키모트립시노겐, 재조합 인간 인터류킨, 재조합 융합 단백질, 핵산 유래 생성물, 합성 및 천연 기원의 DNA, 및 합성 및 천연 기원의 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 생물학적 분자 또는 생물학적 이온이 리소자임, hIgG, 미오글로빈, 인간 혈청 알부민, 대두 트립신 억제제, 트랜스퍼라제, 에놀라제, 오발부민, 리보뉴클레아제, 에그 트립신 억제제, 시토크롬 c, 아넥신 V, 또는 α-키모트립시노겐인 방법.
- 제60항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 유체 중의 물질의 농도가 약 0.2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL인 방법.
- 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 유속이 약 1 멤브레인 부피 (MV)/min 내지 약 75 MV/min인 방법.
- 제29항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유속이 약 1 MV/min 내지 약 75 MV/min인 방법.
- 제30항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유속이 약 1 MV/min 내지 약 75 MV/min인 방법.
- 제30항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 유속이 약 1 MV/min 내지 약 75 MV/min인 방법.
- 제45항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 제5 유속이 약 1 MV/min 내지 약 75 MV/min인 방법.
- 제45항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 제6 유속이 약 1 MV/min 내지 약 75 MV/min인 방법.
- 제60항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 제7 유속이 약 1 MV/min 내지 약 75 MV/min인 방법.
- 제65항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 제8 유속이 약 1 MV/min 내지 약 75 MV/min인 방법.
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