KR20220108398A

KR20220108398A - 에제티미브를 유효성분으로 포함하는 체내 콜레스테롤 흡수 저해에 의한골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20220108398A
Application number: KR1020210011368A
Authority: KR
Inventors: 류제황; 이규석; 김영권
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-08-03

Abstract

본 발명은 에제티미브를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 에제티미브의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료 방법, 및 에제티미브의 골관절염 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

에제티미브를 유효성분으로 포함하는 체내 콜레스테롤 흡수 저해에 의한골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 {Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoarthritis by inhibiting the absorption of cholesterol in the body containing ezetimibe as an active ingredient}

골관절염은 퇴행성관절염으로도 알려져 있는 질환이며, 노화 또는 외상성 염증에 의해 연골을 구성하는 연골세포의 본래 고유한 성질을 잃어버리는 퇴행성 변화가 발생하여 연골조직의 비가역적인 손실, 비정상적인 골조직의 생성, 연골하골의 두께증가 등이 나타나고 통증과 운동능력의 상실을 유발하는 질환이다. 골관절염은 면역세포에 의한 연골 및 골조직 침식이 일어나는 자가면역질환인 류마티스 관절염과는 전혀 다른 질환이며, 노화에 따라 골조직의 소실이 일어나는 골다공증과도 구별되는 질환이다.

최근 고령사회에 접어들면서 우리나라에서 골관절염 환자가 급증하고 있으나, 연골조직은 혈관과 신경조직이 없어 영양과 산소공급이 원활하지 않아 손상부위의 재생이 느린 조직이기에 골관절염은 치료가 어려운 질환이다.

현재까지 골관절염의 치료 약물은 염증 저해 및 통증 완화에 그치고 있으며, 인공관절 치환술 외에 근본적인 치료법이 확립되지 않은 상황임. 인공관절 역시 5년여의 수명을 가지고 있지만 재수술이 어려워 고령환자들 위주로 시술되고 있는 실정이다.

최근 줄기세포나 조직공학을 이용하여 연골재생을 유도하는 치료법이 연구되고 있으나, 골관절염 유발기전의 이해부족으로 인해 그 치료효율은 떨어지는 편이며, 보다 핵심적인 골관절염 조절기전 및 조절인자의 발굴이 필요한 상황이다.

최근 HIF-2a와 같은 연골기질 분해효소의 발현을 조절하는 조절인자나 아연-ZIP8-MTF1 axis와 같은 연골세포의 항상성을 조절하는 조절기전이 규명되고 있으며, 2019년에는 콜레스테롤 및 콜레스테롤 대사체와 결합하여 활성이 조절되는 핵수용체 Retinoid related orphan receptor alpha (RORα)가 골관절염을 유발하는 조절기전이 규명된 바 있다.

2019년에 발표된 해당 연구는 oxLDL 수용체 LOX-1에 의해 퇴행 연골세포 안으로 유입된 콜레스테롤이 CH25H, CYP7B1과 같은 콜레스테롤 수산화 효소에 의해 옥시스테롤로 변환되고, 연골세포 내 축적된 콜레스테롤과 옥시스테롤이 RORα에 결합, 활성을 증가시키며, 활성화된 RORα에 의해 연골기질 분해효소의 발현이 증가되어 골관절염이 유발됨을 보여주었다.

이 연구는 CH25H, CYP7B1, RORα와 같은 골관절염 치료표적을 제시하였으나, 연골세포는 연골세포가 분비한 두꺼운 연골기질에 둘러싸여 있으므로 CH25H, CYP7B1, RORα를 표적으로 하는 활성 및 발현 저해제가 효과적으로 전달되기는 어려울 것으로 여겨진다.

그러나 이 연구는 세포 내 콜레스테롤 농도가 증가하면서 연골세포의 퇴행이 유도됨을 보여주었으며, 이는 혈중 콜레스테롤 배출조절에 의해 연골조직으로 전달되는 콜레스테롤의 농도를 조절하여 골관절염을 예방 또는 억제할 수 있음을 암시한다.

에제티미브는 위장관 상피세포의 NPC1L1에 결합하여 소장에서 콜레스테롤 흡수를 감소시킴으로써 체내의 콜레스테롤 수준을 약 15 내지 30 % 낮추는 화합물이다. 에제티미브는 단독으로 또는 스타틴과 병용하여 고지혈증 및 고콜레스테롤혈증 환자에 대해 사용된다.

본 발명은 고콜레스테롤혈증을 비롯한 고지혈증 환자의 혈중 콜레스테롤 배출조절을 위해 임상적으로 사용되고 있는 약물인 에제티미브가 콜레스테롤의 체내 흡수 저해를 통해 골관절염을 제어할 가능성을 검증하고, 골관절염 예방 및 치료제로서의 신규한 용도를 제시하고자 한다.

이에, 본 발명의 목적은 에제티미브를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 에제티미브의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 에제티미브의 골관절염 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 에제티미브 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 에제티미브는 이의 라세미체, 이성질체 및 약제학적으로 허용 가능한 염을 모두 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 골관절염을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 골관절염이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 체내 콜레스테롤의 흡수 저해를 통해 골관절염의 진행을 억제하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 에제티미브에 의한 체내 콜레스테롤 흡수 저해를 통해 무릎 내 연골조직으로 전달되는 콜레스테롤의 양을 조절하여, 콜레스테롤에 의해 활성이 조절되는 RORα에 의해 골관절염을 예방 또는 치료하는 것이다.

본 발명에 있어서 골관절염은 퇴행성 관절염인 것일 수 있으며, 예를 들어, 노화에 의한 연골세포의 퇴행성 변화에 의해 나타나는 관절염 또는 외상 후에 나타나는 퇴행성 관절염인 것일 수 있으며, 면역세포의 연골조직 침식을 통해 발생하는 류마티스 관절염 또는 골조직의 소실이 나타나는 골다공증과 같은 다른 근골격계 질환은 포함되지 않는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 약학적 조성물의 투여 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 고콜레스테롤혈증 환자의 혈중 콜레스테롤 농도를 조절하기 위해 투여되는 범위이다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 포유동물에 투여되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 포유동물은 쥐, 가축 또는 인간인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있으며, 상기 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 혈중 콜레스테롤 농도조절을 위해 투여할 수 있는 방식으로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구 투여 방식으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제 (Plasters), 과립제 (Granule), 산제 (Powders), 시럽제 (Syrups), 액제 (solutions), 유동엑스제 (FluidextractsI), 유제 (Emulsions), 현탁제 (Suspensions), 침제 (Infusions), 정제 (Tablets), 캅셀제 (Capsules) 및 환제 (Pills)등으로 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 예는 에제티미브의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는 에제티미브의 골관절염 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 에제티미브를 복강 내 주입한 고콜레스테롤 식이 골관절염 동물모델의 무릎관절을 분석하여 에제티미브에 의한 골관절염 억제효과를 보여주는 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 무릎 내 주사 (intrra-articular injection, IA)를 통해 에제티미브를 투여한 고콜레스테롤 사료 식이 골관절염 동물모델의 무릎관절을 분석하여, 에제티미브가 연골세포에 직접 영향을 미쳐 골관절염을 억제하는 것이 아님을 보여주는 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 도 1과 도 2에서 진행된 실험군 사이의 총 사료섭취량에 큰 차이가 없음을 보여주고, 에제티미브 복강 내 주입에 의해 혈중 콜레스테롤 농도가 조절되었음을 보여주는 혈중 콜레스테롤 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 에제티미브를 퇴행연골세포에 직접 처리한 뒤 연골기질 분해효소의 발현변화를 확인하여, 에제티미브 복강 내 주입에 의한 골관절염 억제효과는 에제티미브가 연골세포에 직접 영향을 미쳐 나타나는 것이 아님을 보여주는 결과이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 고콜레스테롤 식이 골관절염 동물모델을 이용한 퇴행관절염 억제여부 확인실험 - 경구 섭취

콜레스테롤 체내 흡수 저해에 따른 골관절염 조절효과를 확인하기 위해 생후 5주령 생쥐에 고콜레스테롤 사료 식이 (high cholesterol diet, HCD)를 진행하였다. 고콜레스테롤 사료는 76A 기반 사료에 2% 콜레스테롤을 추가한 사료이며, 이에 대한 대조군 (regular diet, RD)으로 76A 기본 사료를 사용하였다. 매주 잔여사료 및 급여사료의 무게를 측정하여 총 사료섭취량을 계산하고 실험군 간 차이여부를 분석하였다.

에제티미브에 의한 콜레스테롤 체내 흡수 저해를 유도하기 위해 고콜레스테롤 사료 식이 4주 후에 에제티미브가 포함된 고콜레스테롤 사료로 교체하여 관절조직 채취 시까지 급여하였다. 사료에 포함된 에제티미브의 농도(150 mg/kg/day)는 유사한 실험을 진행한 타문헌을 참고하였다.

골관절염을 인위적으로 유도하기 위해 생후 12주째에 DMM (destabilization of medial meniscus)수술을 통해 골관절염을 유도하였다. DMM 수술은 생쥐의 관절조직에 존재하는 내측 반월상연골판 (medial meniscus)을 고정하고 있는 인대를 절개하여 관절조직의 기계적 불안정성을 유도하여 연골손상을 인위적으로 유도하는 방법이며, 수술 후 7주째에 관절조직을 채취하여 아래와 같은 분석과정을 거친다.

생쥐의 연골조직을 분석하기 위해 관절조직을 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 다음, 0.5 M EDTA 용액에 3일간 담가 탈회 (decalcification)를 수행하였다. 그 다음, 조직을 30%, 50%, 70%, 90%, 95% 100% 에탄올에 담가 탈수과정을 진행한 뒤, 자일렌 및 파라핀 침투과정을 거친다. 그 다음, 조직을 6 um 두께로 잘라 슬라이드 위에 올려 보관한다.

골관절염이 일어난 정도를 확인하기 위해서 자일렌, 100%, 95%, 90%, 70%, 50%, 30% 에탄올, 및 물의 순서로 재수화 (rehydration)과정을 거친 조직절편을 헤마톡실린, 0.1% 패스트 그린, 0.1% 사프라닌 O 용액에 담가 염색하고 70%, 90%, 95% 100% 에탄올, 자일렌에 담근 뒤, 고정액을 뿌려 고정하였다. 현미경을 통해 조직절편의 사프라닌 O 염색 정도를 확인하여 연골조직의 손상정도 (OARSI grade), 연골하골 (subchondral bone plate, SBP)의 두께를 분석하여, 그 결과를 도 1a 내지 도 1b 및 표 1 내지 표 2에 나타내었다.

OARSI	RD		HCD (2%)
OARSI	Sham Vehicle	DMM Vehicle	Sham HCD Diet	DMM HCD Diet	Sham Eze Diet	DMM Eze Diet
S1	0	2.5	1	2.5	0	2
S2	0	3	0	2.5	0	4
S3	0	2	0	3	0.5	2
S4	0	2	0.5		0	5
S5	0.5	4	0.5	4	0	3
S6	0	3	0	5	1	3
S7	0.5	4.5	0	2.5	1	2.5
S8	0	2	0	4	0	4
S9	0.5	4	0.5	6	0	3.5
S10	0	4	0.5	4.5	0.5	2.5
S11	0	3	0.5	4	0	4.5
S12	0	2.5	0.5		0.5	3
S13	0.5	2	0.5	3	0.5	2
S14	0	1	0	4	0	4
S15	0	5	0	3	0	3
S16	0	4	0.5	5	0	2
S17	0	3	1	4.5	0.5	3
S18	0.5	4	0.5	4	0.5	2.5
S19	0	3	0	5		5
S20	0	3	0	5
S21	0.5		0.5	3.5
S22			0	4
S23			0.5	5
S24			0	4.5
S25			0.5	3
S26			0	4
S27			0	3
S28			0.5	3.5
S29			0.5	5
S30			0	3
n수	21	20	30	28	18	19
Average	0.143	3.075	0.300	3.929	0.278	3.184
SEM	0.050508	0.227327	0.056731	0.177643	0.083061	0.226886
t-test	0.027553947	0.002184359			0.410284132	0.006142075
f test	0.174154309	0.694845430			0.535566028	0.792543225

SBP Depth	RD		HCD (2%)
SBP Depth	Sham Vehicle	DMM Vehicle	Sham HCD Diet	DMM HCD Diet	Sham Eze Diet	DMM Eze Diet
S1	137.77	171.02	162.37	182.56	88.52	97.11
S2	65.91	99.79	115.06	148.29	62.65	134.77
S3	168.35	101.11	112.23	121.37	59.87	121.13
S4	79.08	76.69	95.46	97.59	131.05	171.40
S5	78.02	135.00	154.23	142.84	129.95	189.04
S6	92.25	92.33	124.17	129.07	72.31	89.05
S7	95.84	117.99	86.08	87.61	66.22	148.27
S8	132.71	138.50	57.64	92.49	145.38	150.29
S9	162.84	133.85	95.34	122.56	61.37	113.61
S10	79.21	106.40	90.15	126.97	59.10	74.02
S11	125.81	127.83	117.97	223.88	71.73	90.50
S12	150.81	123.72	167.29	198.16	115.86	146.93
S13	115.37	135.26	128.64	127.55	73.46	69.50
S14	69.52	118.21	128.25	205.98	92.01	111.06
S15	89.30	165.37	64.11	124.92	71.07	125.29
S16	110.20	144.63	71.34	129.47	80.75	114.01
S17	69.38	113.45	76.02	117.54	125.20	126.27
S18	67.63	60.61	87.86	127.26	71.54	104.47
S19	120.30	129.68	126.04	129.31	119.03	152.36
S20	94.98	141.73	158.72	175.21
S21	125.13	149.42	95.29	123.17
S22	78.51	107.67	107.70	130.38
S23	80.94	109.94	122.24	208.78
S24	173.46	114.77	155.06	189.59
S25	72.67	115.76	137.50	117.12
S26	166.21	182.54
S27
S28
S29
S30
n수	26	26	25	25	19	19
Average	107.777	123.588	113.470	143.187	89.320	122.584
SEM	6.925498	5.379725	6.301265	7.610262	6.577668	7.349236
t-test	0.273434948	0.019713397			0.006142927	0.032044984
f test	0.578910641	0.110618972			0.689722360	0.457971334

도 1a 내지 도 1b 및 표 1 내지 표 2에서 확인할 수 있듯이, 고콜레스테롤 사료 식이 ＋ DMM 수술에 의해 증가한 연골조직의 손상이 에제티미브 혼입사료 섭취에 의해 감소함을 확인하였다. 또 에제티미브의 섭취가 고콜레스테롤 사료 식이로 인해 유도된 연골하골의 두께 증가도 억제함을 확인하여 에제티미브의 섭취가 골관절염의 예방 및 치료에 효과가 있음을 검증하였다.

실시예 2. 고콜레스테롤 사료 식이 골관절염 동물모델을 이용한 퇴행관절염 억제여부 확인실험 - 무릎 내 주입

에제티미브가 콜레스테롤의 체내 흡수 저해와 별개로 연골조직에 직접 영향을 미쳐 골관절염을 조절할 가능성을 확인하기 위해 상술한 것과 같은 방식으로 제작한 고콜레스테롤 식이 골관절염 동물모델에 에제티미브 혼입 사료를 급여하는 대신, 에제티미브를 DMSO에 녹인 수용액(0.7 mg/ml)을 DMM 수술 1주 전부터 관절조직 채취 시까지 1주일에 한번씩 무릎에 주사 (intra-articular injection, IA)하였다 (0.35 mg/kg/week).

그 다음, 상기 실시예 1과 같은 방식으로 무릎관절 조직을 분석하여, 그 결과를 도 2a 내지 도 2b 및 표 3 내지 표 4에 나타내었다.

OARSI	RD		HCD (2%)
OARSI	Sham Vehicle	DMM Vehicle	Sham HCD IA	DMM HCD IA	Sham Eze IA	DMM Eze IA
S1	0	2.5	0	3.5	0	3
S2	0	3		3	0	3
S3	0	2	0.5	5	0.5	3
S4	0	2	0.5	5	0.5	5.5
S5	0.5	4	0.5	4.5	0.5	3
S6	0	3	0	5.5	0	5
S7	0.5	4.5	0	4	0.5	4
S8	0	2	0	5	0	5
S9	0.5	4	0	4.5	0.5	5
S10	0	4	0	3	0.5	6
S11	0	3	0.5	3	0.5	3
S12	0	2.5	0.5	2.5	0.5	2.5
S13	0.5	2	0.5	4	0	2.5
S14	0	1	0	2	0	3
S15	0	5	0.5	2	0.5	4
S16	0	4	0	2	0.5	3
S17	0	3	0.5	3	0.5	2.5
S18	0.5	4	1	5	0	3
S19	0	3	0	5		3
S20	0	3	0.5	5	0.5	4
S21	0.5		0.5	3
S22			0	4
S23			0	4
S24				5
S25			0	5
S26			0.5	4.5
S27				3
S28			0.5	4


n수	21	20	25	28	19	20
Average	0.143	3.075	0.280	3.893	0.316	3.650
SEM	0.050508	0.227327	0.058310	0.203080	0.056849	0.243602
t-test	0.044222234	0.005389603			0.334802882	0.223341521
f test	0.297858876	0.815452618			0.483653587	0.929279921

SBP Depth	RD		HCD (2%)
SBP Depth	Sham Vehicle	DMM Vehicle	Sham HCD IA	DMM HCD IA	Sham Eze IA	DMM Eze IA
S1	137.77	171.02	142.49	174.90	56.81	142.51
S2	65.91	99.79	107.14	138.32	65.20	104.56
S3	168.35	101.11	87.81	186.15	181.11	176.62
S4	79.08	76.69	173.14	191.02	161.83	193.71
S5	78.02	135.00	138.94	136.07	98.60	105.31
S6	92.25	92.33	138.91	136.61	113.05	152.66
S7	95.84	117.99	145.19	152.16	181.99	181.73
S8	132.71	138.50	148.61	196.08	73.26	108.19
S9	162.84	133.85	59.87	140.25	148.80	154.55
S10	79.21	106.40	87.36	120.79	194.33	171.52
S11	125.81	127.83	87.42	99.56	111.84	166.54
S12	150.81	123.72	82.96	130.55	56.92	101.46
S13	115.37	135.26	104.79	115.10	87.12	128.88
S14	69.52	118.21	95.82	85.67	88.09	120.47
S15	89.30	165.37	162.85	158.32	112.69	134.58
S16	110.20	144.63	95.53	176.13	97.36	115.29
S17	69.38	113.45	102.07	124.22	88.44	132.01
S18	67.63	60.61	164.99	130.59	56.59	104.69
S19	120.30	129.68	98.12	83.89	93.11	138.46
S20	94.98	141.73	52.17	106.06	108.44	133.49
S21	125.13	149.42	120.70	165.78
S22	78.51	107.67	104.23	113.11
S23	80.94	109.94	103.65	128.85
S24	173.46	114.77	110.77	157.90
S25	72.67	115.76	128.98	145.47
S26	166.21	182.54	89.46	170.82
S27			64.43	87.91
S28			64.83	105.19


n수	26	26	28	28	20	20
Average	107.777	123.588	109.401	137.767	108.779	138.361
SEM	6.925498	5.379725	6.203266	6.065836	9.656474	6.375577
t-test	0.430830366	0.044016575			0.477510628	0.473746935
f test	0.708375912	0.432742254			0.187302987	0.600175670

도 2a 내지 도 2b 및 표 3 내지 표 4에서 확인할 수 있듯이, 고콜레스테롤 식이에 의해 증가한 연골손상을 에제티미브 무릎 주사가 억제하지 못하였으며, 연골하골의 두께 증가도 억제하지 못함을 확인하였다. 이는 도 1에서 나타난 에제티미브의 골관절염 억제효과가 에제티미브가 연골조직에 직접 영향을 미쳐 나타나는 효과는 아님을 의미한다.

실시예 3. 사료 섭취량 및 혈중 콜레스테롤 프로파일링

에제티미브에 의한 콜레스테롤 체내 흡수 저해 여부를 확인하기 위해 에제티미브를 섭취시킨 고콜레스테롤 식이 골관절염 동물모델과, 에제티미브를 무릎 내 주입한 고콜레스테롤 식이 골관절염 동물모델에서 혈액을 채취하여 2000 g에서 15분동안 원심분리하여 혈장을 확보하고, 여기서 총 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤의 양을 ELISA kit를 이용하여 측정하여, 그 결과를 도 3a 내지 도 3b 및 표 5 내지 표 14에 나타내었다.

Total Chol	RD	HCD (2%)	Sham Eze Diet
1	183.80	227.000	81.000
2	191.60	266.200	101.600
3	173.80	233.000	159.600
4	135.60	232.200	201.800
5	175.80	221.600	167.000
6	188.80	263.200	153.400
7	164.60	337.000	110.000
8	217.80	249.400	107.600
9	213.00	282.800	106.800
10	169.00	289.000	117.400
n수	10	10	10
Average	181.380	260.140	130.620
SEM	7.535719	11.311785	11.902584
t-test	0.000017211		0.000000300
f test	0.242003182		0.881929021

HDL-C (mg/dl)	RD	HCD D	Eze D
1	53.0	58.5	43.2
2	61.6	71.2	32.9
3	43.8	61.6	33.3
4	72.8	67.0	43.2
5	58.0	41.5	41.1
6	53.8	45.4	30.0
7	71.4	75.0	35.6
8	75.2	80.0
9	75.8	38.9
10	57.0	51.4
n수	10	10	7
Average	62.236	59.058	37.054
SEM	3.481700	4.561376	2.036920
Ttest	0.000000		0.000000
Ftest	0.001691		0.000171

LDL-C (mg/dl)	RD	HCD D	Eze D
1	21.4	20.6	2.5
2	17.4	36.7	3.4
3	19.9	24.3	2.2
4	18.8	38.1	1.7
5	9.9	15.6	5.2
6	9.3	43.4	3.3
7	11.3	35.9	4.5
8	15.4	24.3
9	10.9	28.6
10	11.5	31.1
n수	10	10	7
Average	14.562	29.858	3.241
SEM	1.433567	2.771134	0.478310
Ttest	0.000000		0.000000
Ftest	0.000001		0.000000

HDL/LDL	RD	HCD IP	Eze D
1	2.475	2.843	17.577
2	3.546	1.940	9.740
3	2.200	2.532	15.294
4	3.880	1.757	25.554
5	5.833	2.665	7.927
6	5.800	1.047	9.209
7	6.339	2.092	7.846
8	4.898	3.299
9	6.969	1.359
10	4.972	1.652
n수	10	10	7
Average	4.691	2.119	13.306
SEM	0.512553	0.223518	2.490263
Ttest	0.000000		0.000000
Ftest	0.000000		0.000547

Total Chol	RD	HCD (2%)	Sham Eze IA
1	183.80	227.000	299.400
2	191.60	266.200	206.000
3	173.80	233.000	280.400
4	135.60	232.200	261.800
5	175.80	221.600	217.200
6	188.80	263.200	255.600
7	164.60	337.000	292.600
8	217.80	249.400	233.400
9	213.00	282.800	230.800
10	169.00	289.000	247.400
n수	10	10	10
Average	181.380	260.140	252.460
SEM	7.535719	11.311785	9.973389
t-test	0.000017211		0.616754194
f test	0.242003182		0.713637116

HDL-C (mg/dl)	RD	HCD IA	Eze IA
1	53.0	58.7	71.3
2	61.6	72.2	71.6
3	43.8	62.1	67.3
4	72.8	49.0	47.5
5	58.0	65.3	49.3
6	53.8	51.8	44.5
7	71.4	37.2	35.9
8	75.2	50.2	42.0
9	75.8	48.7	66.8
10	57.0	55.4
n수	10	10	9
Average	62.236	55.068	55.118
SEM	3.481700	3.150128	4.663989
Ttest	0.144230		0.992918
Ftest	0.770449		0.331408

LDL-C (mg/dl)	RD	HCD IA	Eze IA
1	21.4	30.6	27.4
2	17.4	24.2	47.0
3	19.9	37.5	39.0
4	18.8	21.9	23.1
5	9.9	41.0	34.7
6	9.3	24.1	28.7
7	11.3	24.9	17.6
8	15.4	43.3	19.9
9	10.9	28.5	23.9
10	11.5	40.7
n수	10	10	9
Average	14.562	31.668	29.029
SEM	1.433567	2.588405	3.193981
Ttest	0.000000		0.000022
Ftest	0.028110		0.923489

HDL/LDL	RD	HCD IA	Eze IA
1	2.475	1.918	2.605
2	3.546	2.985	1.523
3	2.200	1.656	1.725
4	3.880	2.232	2.056
5	5.833	1.595	1.418
6	5.800	2.155	1.552
7	6.339	1.493	2.042
8	4.898	1.158	2.108
9	6.969	1.710	2.796
10	4.972	1.361
n수	10	10	9
Average	4.691	1.826	1.981
SEM	0.512553	0.166453	0.160560
Ttest	0.000000		0.000000
Ftest	0.000009		0.000000

마리당 사료 총 섭취량	Average	SEM	Cage 수
RD	267.174	25.442639	6
HCD-Diet	272.327	12.367272	6
HCD-Eze-Diet	252.980	19.408704	4

마리당 사료 총 섭취량	Average	SEM	Cage 수
RD	267.174	25.442639	6
HCD-IA	270.068	12.571373	6
HCD-Eze-IA	256.900	5.803131	4

도 3a 및 표 5 내지 표 8에서 확인할 수 있듯이, 고콜레스테롤 사료 식이에 의해 증가한 혈중 총 콜레스테롤 농도가 에제티미브 섭취에 의해 감소하였다. 혈중 HDL-콜레스테롤은 고콜레스테롤 사료 식이에 의해 두드러지게 변화하진 않았으나 에제티미브 섭취에 의해 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 혈중 LDL-콜레스테롤은 고콜레스테롤 사료 식이에 의해 유의미하게 증가하였고 에제티미브 섭취에 의해 크게 감소하였다. 이로 인해 고콜레스테롤 사료 식이군과 fenofibrate 섭취군 사이의 HDL/LDL ratio는 상당히 큰 차이를 보여주었다. HDL 및 LDL의 혈중 농도감소는 콜레스테롤의 체내 흡수 저해로 인한 것으로 여겨진다.

반면, 도 3b 및 표 9 내지 표 12에서 확인할 수 있듯이, 에제티미브의 무릎 내 주입은 혈중 총 콜레스테롤을 유의미하게 감소시키지 못하였고, 에제티미브 섭취군과 다르게 혈중 HDL 및 LDL의 농도가 변화하지 않는 것으로 나타났다.

결봐적으로, 각 실험군의 총 사료 섭취량을 계산한 결과, 모든 실험군 사이에 사료 섭취량의 유의미한 차이는 나타나지 않아, 혈중 콜레스테롤 프로파일링 결과는 에제티미브에 의한 것임을 확인하였다.

이상의 혈중 콜레스테롤 프로파일링 결과는 에제티미브 섭취에 의한 골관절염 억제효과가 콜레스테롤의 체내 흡수 저해에 의한 혈중 총 콜레스테롤의 농도감소 때문임을 보여준다.

실시예 4. 에제티미브를 처리한 생쥐의 연골세포 분석을 통한 에제티미브의 골관절염 조절능 확인실험

에제티미브가 콜레스테롤 체내 흡수 저해와 별개로 연골세포에 직접 영향을 미쳐 골관절염을 조절할 가능성을 확인하기 위해 생후 5일령 생쥐의 무릎조직을 채취하고, 0.2% type II collagenase 및 0.02% 트립신을 3시간 동안 처리하여 무릎조직의 피부, 근육을 제거하였다. 이후 PBS로 잘 씻은 뒤 연골조직을 분리하여 0.2% type II collagenase로 녹여 연골세포를 확보한 뒤, 3X10^5 개/1dish의 농도로 배양하였다. 배양 이틀째에 DMEM 배양액을 교체해 준 뒤, IL-1β (1 ng/ml) 또는 TNFα (50 ng/ml)를 처리하고 여기에 에제티미브 (5, 10 uM)를 처리한 뒤 36 시간 후에 세포를 PBS로 씻은 뒤 RNA를 분리하였다. 이를 위해 세포를 배양한 dish에 trizol을 처리하고 10분 후 클로로포름을 섞은 뒤 원심분리하여 조직 내 단백질을 분리하였다. 그 후 mRNA가 녹아있는 수용액에 isopropanol을 섞고 원심분리하여 수분을 제거하고, 수분이 제거된 침전물에 75% 에탄올을 첨가하고 원심분리하여 남아있는 유기용매를 제거한 뒤, 공기 중에서 말려 에탄올을 증발시키고 RNA를 확보하였다. 확보한 RNA에 역전사효소 (reverse transcriptase)를 첨가하고 반응시켜 cDNA를 확보하고 이후 연골기질 분해효소 Mmp3, 9, 12, 13, 및 Adamts4, 5에 대한 primer와 taq polymerase를 첨가하여 conventional PCR을 진행하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 에제티미브는 연골기질 분해효소의 발현을 조절하지 못함을 확인하였다. 결국 퇴행연골세포에서 증가한 연골기질 분해효소의 발현을 에제티미브가 억제하지 못함을 확인하여, 에제티미브 섭취에 의한 골관절염 억제효과는 연골세포에 직접 영향을 미쳐서 일어나는 것이 아님을 확인하였다.

[용어 정리]

RD: Regular diet, 정상 사료식이

HCD: High cholesterol diet, 고콜레스테롤 사료식이

Eze: Ezetimibe

DMM: destabilization of medial meniscus, 골관절염 유도수술

OARSI grade: 연골손상 정량화 기준

SBP thickness: 연골하골(subchondral bone plate) 두께

IA: intra-articular injection, 무릎 내 주입

HDL: high density lipoprotein, 고밀도 지질단백질

LDL: low density lipoprotein, 저밀도 지질단백질

Claims

에제티미브 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 체내 콜레스테롤의 흡수 저해를 통해 골관절염의 진행을 억제하는 것인, 골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 골관절염은 퇴행성 관절염인 것인, 골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 퇴행성 관절염은 노화에 의한 연골세포의 퇴행성 변화에 의해 나타나는 퇴행성 관절염 또는 외상 후에 나타나는 퇴행성 관절염인 것인, 골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구 투여용인 것인, 골관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.