KR20220105680A - 근친교배 형질전환 카놀라 계통 ns-b50027-4 및 이의 종자 - Google Patents

근친교배 형질전환 카놀라 계통 ns-b50027-4 및 이의 종자 Download PDF

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안토니오 레온포르테
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Abstract

본 실시양태는 근친교배 형질전환 카놀라 계통 NS-B50027-4; NS-B50027-4로부터 수득된 종자 및 오일; 및 NS-B50027-4로부터 유래한 자손에 관한 것이다. 구체적으로, NS-B50027-4는 그의 종자 오일에서 적어도 5% DHA를 생성할 수 있는 진정한 육종 카놀라 계통이다.

Description

근친교배 형질전환 카놀라 계통 NS-B50027-4 및 이의 종자{INBRED TRANSGENIC CANOLA LINE NS-B50027-4 AND SEEDS THEREOF}
관련 출원
본원은 모든 목적을 위해 본원에 전체적으로 참고로 도입된, 2017년 6월 16일에 출원된 미국 가특허출원 제62/351,250호의 우선권 이익을 주장한다.
서열목록
본원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출되었고 전체로서 본원에 전체적으로 참고로 도입된 서열목록을 함유한다.
분야
본 실시양태는 카놀라 육종 및 농작물의 분야, 구체적으로 NS-B50027-4로서 명명된 근친교배 형질전환 카놀라 계통(line)의 근친교배 종자 및 식물, 및 이러한 근친교배 식물의 유도체; 및 근친교배 형질전환 카놀라 계통 NS-B50027-4를 검출하는 방법에 관한 것이다.
카놀라는 세계 많은 지역들에서 중요한 오일 작물이다. 카놀라 오일의 지방산 조성은 단쇄 오메가-3을 비롯한 단일불포화 지방산 및 다중불포화 지방산 둘 다에서 풍부하나, 장쇄 오메가-3 지방산에서 결여되어 있다. 장쇄 오메가-3(LC-ω3) 지방산은 확립된 건강 이점을 갖지만, 현재 LC-ω3 지방산은 주로 조류로부터 직접적으로 또는 조류 포식 해양 어류로부터 수득된다. LC-ω3 지방산, 특히 도코사헥사엔산(22:6 n-3; DHA), 도코사펜타엔산(22:5 n-3; DPA) 및 에이코사펜타엔산(20:5 n-3; EPA)의 식이 중요성의 인식은 소비 가능한 어류 오일에 대한 수요의 현저한 증가에 기여하였다. 따라서, 인간 소비를 위한 LC-ω3 지방산의 대안적 직접적 공급원에 대한 필요성이 있다. 추가로, 양식된 어류, 예컨대, 대서양 연어가 식이 지방산에 비례하여 지방산을 축적하기 때문에, 어류 사료에서 LC 다중불포화 지방산(LC-PUFA)의 양을 유지하여, 양식된 어류에서 이 지방산의 존재를 보장할 필요성이 있다. 따라서, 수산양식에 사용될 수 있는 LC-PUFA 풍부 공급원에 대한 필요성이 있다. 예를 들면, 수산양식에서의 사용뿐만 아니라 직접적인 인간 소비를 위해서도 LC-PUFA, 특히 LC-ω3 지방산, 예컨대, DHA를 생성할 수 있는 카놀라에 대한 필요성이 있다. 그러나, 식물 육종 및 분자유전학에 의한 조작에 있어서의 성공에도 불구하고, 야생 어류에서 생성된 LC-PUFA의 함량에 근접하는 카놀라 오일의 상업적 공급원은 없다. 추가로, 카놀라 재배종(F1 하이브리드가 아님)은 상업적 작물의 신뢰 가능한 생산에 유용하기 위해 균질해야 하고, 동형접합적이어야 하고 재생산 가능해야 한다. 따라서, 상업적으로 실행 가능한 양의 ω3 지방산, LC-PUFA 및 LC-ω3 지방산, 예컨대, DHA를 제공하는 종자를 가진 지속 가능한 작물로서 생장될 수 있는 카놀라 계통에 대한 필요성이 남아 있다.
본원에 기재된 실시양태는 NS-B50027-4로 표기된 근친교배 재조합 카놀라 계통을 제공하는데, 이 계통의 종자는 유리한 수준의 ω3 및 LC-ω3 지방산을 포함함으로써, 이 귀중한 오일을 생성하는 재생 가능한 육상 시스템을 제공한다. 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 종자의 대표적인 샘플은 부다페스트 조약에 따라 2016년 6월 9일에 어메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC®)(버지니아주 마나사스 소재)에 기탁되었고 수탁번호 PTA-123186(부록 A 참조)을 배정받았다. 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 세포, 조직, 종자 및 오일도 본원에 기재되어 있다. 선택 및 육종과 형질전환 조작의 조합은 변이가 존재하지 않는 종에서 변이를 가능하게 한다. 예를 들면, 본원에 기재된 카놀라 계통 NS-B50027-4의 지방산 프로파일은 천연 식물, 예컨대, 브라시카 나푸스(B. napus)에 존재하지 않고; 본원에 기재된 형질, 특히 DHA를 생성한다는 유리한 형질은 사람에 의한 상당한 기술적 개입에 의해 개발되었다.
본 실시양태의 한 양태는 선택되고, 총 지방산 함량에 비해 높은 비율(중량 퍼센트)의 ω3 및 LC-ω3 지방산, 특히 LC-ω3 PUFA, 예컨대, DHA를 그의 종자에 축적하는 안정한 균일한 육종 계통으로 육종된 재배종 AV Jade의 유전적으로 변형된 카놀라인 카놀라(브라시카 나푸스 엘(Brassica napus L.)) 계통 NS-B50027-4의 종자를 제공한다. 근친교배 계통 NS-B50027-4는 일부 야생 어류 오일에서 발견된 수준에 육박하는 수준으로 LC-ω3 PUFA, 특히 DHA를 포함하는 종자를 생성하는 카놀라 식물을 제공하도록 개발되었다. NS-B50027-4로부터 유래한 식용 오일은 다른 브라시카 나푸스 식물보다 유의미하게 더 높은 DHA 함량을 가진다. 신규 균일한 육종 계통 NS-B50027-4는 초기 유전자 변형 후, 형태학적으로 맞춰진 안정한 다수확 카놀라 계통에서의 높은 DHA 형질에 대한 엄격한 선택 및 육종에 의해 개발되었다.
따라서, 본원에 기재된 적어도 하나의 실시양태는 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 종자; 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 종자로부터 재배된 식물 및 이의 부분, 예컨대, 화분, 밑씨 또는 종자; 및 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4를 재배함으로써, 또는 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4를 그 자신 또는 또 다른 카놀라 또는 브라시카 계통(예컨대, 브라시카 준세아(B. juncea))과 교배시키고 재배된 자손으로부터 종자를 수득함으로써 카놀라 식물로부터 종자를 생성하는 방법에 관한 것이다. 관련 실시양태는 NS-B50027-4의 적어도 하나의 형질전환 좌위의 유전자이입(introgression)에 의해 NS-B50027-4로부터 유래한 카놀라 또는 브라시카 계통으로부터의 종자를 제공한다.
적어도 하나의 실시양태는 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 카놀라 식물의 집단으로서, 그의 대립유전자의 평균 10% 내지 100%가 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터 유래한 집단으로부터의 종자를 제공한다. 유사하게, 본 실시양태는 종자, 오일, 가루 또는 단백질 생성용 식물을 육종하거나 재배하기 위한 카놀라 계통 NS-B50027-4, NS-B50027-4의 하위계통, NS-B50027-4의 자손 또는 하위계통, 또는 NS-B50027-4를 제2 카놀라 또는 브라시카 식물과 교배시킴으로써 생성된 식물의 용도를 제공한다.
적어도 하나의 실시양태는 근친교배 계통 NS-B50027-4의 게놈의 적어도 부분을 그의 게놈 내에 포함하는 오일종자 유채 식물, 예컨대, 브라시카 나푸스 식물의 종자를 제공한다. 적어도 하나의 실시양태는 근친교배 계통 NS-B50027-4의 게놈의 적어도 부분을 그의 게놈 내에 포함하는 식물, 예컨대, 브라시카 나푸스 또는 브라시카 준세아 식물을 제공한다. 적어도 하나의 실시양태는 근친교배 계통 NS-B50027-4의 게놈의 적어도 부분을 그의 게놈 내에 포함하는 오일종자 유채 식물, 예컨대, 브라시카 나푸스 또는 브라시카 준세아 식물의 세포를 제공한다. 또 다른 실시양태는 예를 들면, 적어도 하나의 형질전환 좌위에서 계통 NS-B50027-4의 게놈의 적어도 부분을 포함하는, 오일종자 유채 식물, 예컨대, 브라시카 나푸스 또는 브라시카 준세아 식물의 게놈 DNA를 제공한다. 적어도 하나의 실시양태는 수탁번호 PTA-123186을 가진, ATCC®에 기탁된 종자로부터 생장된 NS-B50027-4의 게놈의 적어도 부분을 포함하는 식물로부터의 종자, 세포, 조직, 조직 배양물, 자손 및 후손에 관한 것이기도 하다. 또 다른 실시양태는 NS-B50027-4의 게놈의 적어도 부분을 포함하는 카놀라 식물(예컨대, 수탁번호 PTA-123186을 가진, ATCC®에 기탁된 종자로부터 생장된 식물)로부터 (예컨대, 증식 또는 육종에 의해) 수득될 수 있는 식물도 제공한다.
본 실시양태의 근친교배 계통 NS-B50027-4의 기준 종자는 수탁번호 PTA-123186 하에 ATCC®에 기탁되었다. 적어도 하나의 실시양태는 보편적인 수확 시 종자의 총 지방산의 중량 퍼센트(중량%)로서, 언급된 값들 사이의 양 및 언급된 값의 양을 포함하는 적어도 약 5% DHA, 약 6% DHA, 약 7% DHA, 약 8% DHA, 약 9% DHA, 약 10% DHA, 약 11% DHA, 약 12% DHA, 약 13% DHA, 약 14% DHA, 약 15% DHA 또는 16% DHA 이상의 DHA를 포함하는 종자를 가진 카놀라 식물로 생장하는, 수탁번호 PTA-123186으로서 기탁된 NS-B50027-4의 종자를 제공한다.
적어도 하나의 실시양태에서, ATCC® 기탁 수탁번호 PTA-123186의 종자는 종자의 총 지방산의 중량%로서, 적어도 5% DHA, 약 6% DHA, 약 7% DHA, 약 8% DHA, 약 9% DHA, 약 10% DHA, 약 11% DHA, 약 12% DHA, 약 13% DHA, 약 14% DHA, 약 15% DHA 또는 약 16% DHA 이상의 DHA를 포함하는 종자를 가진 카놀라 식물로 생장하는, NS-B50027-4의 엘리트 이벤트의 전이유전자(transgene)를 가진 적어도 약 95% 근친교배 형질전환 종자로 구성된 종자 로트(lot)이다.
ATCC® 수탁번호 PTA-123186의 종자는 종자의 총 지방산의 EPA, DPA 및 DHA 중량%의 합계로서 적어도 약 5% 약 LC-PUFA, 약 6% LC-PUFA, 약 7% LC-PUFA, 약 8% LC-PUFA, 약 9% LC-PUFA, 약 10% LC-PUFA, 약 11% LC-PUFA, 약 12% LC-PUFA, 약 13% LC-PUFA, 약 14% LC-PUFA, 약 15% LC-UFA, 약 16% LC-PUFA, 약 17% LC-PUFA, 약 18% LC-PUFA, 약 19% LC-PUFA 또는 약 20% LC-PUFA 이상의 LC-PUFA를 포함하는 종자를 가진 카놀라 식물로 생장하는, NS-B50027-4의 엘리트 이벤트를 포함하는 전이유전자 DNA에 대한 동형접합성을 가진 약 95% 또는 95% 초과의 형질전환 종자로 구성된 종자 로트이다. 이 계통의 종자 또는 종자 오일은 약 20 중량% 내지 약 35 중량%의 LC-PUFA를 함유할 수 있다.
적어도 하나의 실시양태는 웅성 불임 카놀라 또는 브라시카 계통을 제2 카놀라 또는 브라시카 계통과 교배시킴으로써 수득된 하이브리드 종자의 종자 로트를 제공하는데, 이때 상기 두 계통들은 NS-B50027-4의 엘리트 이벤트에 대한 동형접합성을 갖고, 하이브리드 종자는 종자의 총 지방산의 중량%로서 적어도 약 5% DHA, 약 6% DHA, 약 7% DHA, 약 8% DHA, 약 9% DHA, 약 10% DHA, 약 11% DHA, 약 12% DHA, 약 13% DHA, 약 14% DHA, 약 15% DHA, 약 16% DHA, 약 17% DHA, 약 18% DHA, 약 19% DHA 또는 약 20% DHA 이상의 DHA를 포함한다.
본 실시양태의 한 양태는 재배되고 또 다른 카놀라 또는 브라시카와 적어도 한 번 교배된, 기탁된 종자로부터 수득될 수 있거나 수득된 종자 또는 자손 종자로서, 파종되고 재배될 수 있는 종자 또는 자손 종자를 제공하는데, 이때 이러한 자손으로부터 수득된 종자는 NS-B50027-4의 종자 오일 표현형(형질)과 실질적으로 동일한 종자 오일 표현형(형질)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 자손 종자의 종자 또는 종자 오일에서의 지방산 함량의 상대적 비율은 NS-B50027-4보다 더 높은 수확량에서 NS-B50027-4의 비율과 유사하다. 일부 실시양태에서, 이러한 자손 종자 또는 종자 오일은 NS-B50027-4 종자에서의 LC-PUFA의 비율보다 더 높은 비율의 LC-PUFA, 예컨대, EPA, DPA 또는 DHA를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 자손 종자는 NS-B50027-4 종자 또는 종자 오일에 함유된 비-LC-PUFA의 비율과 상이한 비율의 비-LC-PUFA, 예컨대, 올레산, 리놀레산, 팔미톨레산, 박센산 또는 리놀렌산을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보편적인 수확 시, NS-B50027-4 유래의 자손 종자의 지방산 함량은 종자의 총 지방산의 중량%로서 적어도 5% DHA, 약 6% DHA, 약 7% DHA, 약 8% DHA, 약 9% DHA, 약 10% DHA, 약 11% DHA, 약 12% DHA, 약 13% DHA, 약 14% DHA, 약 15% DHA, 약 16% DHA, 약 17% DHA, 약 18% DHA, 약 19% DHA, 약 20% DHA, 약 21% DHA, 약 22% DHA, 약 23% DHA, 약 24% DHA, 약 25% DHA, 약 26%, 약 27% DHA, 약 28% DHA, 약 29% DHA 또는 약 30% DHA 이상의 DHA를 포함한다. 예를 들면, 이러한 자손의 종자는 종자의 총 지방산의 중량%로서 20% 내지 35% DHA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보편적인 수확 시, 이러한 NS-B50027-4 유래의 자손 종자의 지방산 함량은 종자의 총 지방산의 EPA, DPA 및 DHA 중량%의 합계로서 적어도 약 5% LC-PUFA, 약 6% LC-PUFA, 약 7% LC-PUFA, 약 8% LC-PUFA, 약 9% LC-PUFA, 약 10% LC-PUFA, 약 11% LC-PUFA, 약 12% LC-PUFA, 약 13% LC-PUFA, 약 14% LC-PUFA, 약 15% LC-UFA, 약 16% LC-PUFA, 약 17% LC-PUFA, 약 18% LC-PUFA, 약 19% LC-PUFA, 약 20% LC-PUFA, 약 21% LC-PUFA, 약 22% LC-PUFA, 약 23% LC-PUFA, 약 24% LC-PUFA 또는 약 25% LC-PUFA 이상의 LC-PUFA를 포함한다. 예를 들면, 이러한 자손의 종자는 약 20% 내지 약 40% LC-PUFA(중량% 총 지방산)를 포함할 수 있다.
적어도 하나의 실시양태에서, NS-B50027-4의 종자는 보편적인 카놀라 품종보다 실질적으로 더 많은 ω3 ALA를 포함한다. 예를 들면, 보편적인 수확 시, NS-B50027-4 또는 이의 자손 종자의 지방산 함량은 종자의 총 지방산의 중량%로서 적어도 약 15% ALA, 약 15% ALA, 약 17% ALA, 약 18% ALA, 약 19% ALA, 약 20% ALA, 약 21% ALA, 약 22% ALA, 약 23% ALA, 약 24% ALA, 약 25% ALA 또는 약 26% ALA 이상의 ALA를 포함한다.
본 실시양태의 또 다른 양태는 유리한 ω3 지방산 및 LC-ω3 지방산 수준을 가진 오일을 제공하는데, 이때 지방산 함량은 통상의 상업적 카놀라 오일의 비보다 더 높은 비의 ω3:ω6 지방산을 함유한다. 예를 들면, 한 실시양태에서, NS-B50027-4로부터의 종자 오일은 약 1.25의 EPA/DPA/DHA(ω3):LA(ω6) 비를 가진다. 비교하건대, (EPA/DPA/DHA를 함유하지 않는) AV Jade로부터의 종자 오일은 약 0.5의 ω3:ω6 비를 가진다. 추가로, 모본(parent) 계통 AV Jade로부터의 오일은 DHA를 갖지 않으므로, DHA:LA 비를 갖지 않는 반면; NS-B50027-4로부터의 예시적 오일은 약 0.908의 DHA:LA 비를 가진 양식된 연어로부터의 오일에 비해 약 1.05의 DHA:LA 비를 가진다. NS-B50027-4로부터의 ω3 지방산의 비는 팔미트산의 경우 특히 유리하다. 보다 구체적으로, 모본 계통 AV Jade로부터의 오일은 DHA를 갖지 않으므로, DHA:팔미테이트 비를 갖지 않고; 대조적으로, NS-B50027-4로부터의 예시적 오일은 약 2.12의 DHA:팔미테이트 비를 갖고; 이에 비해, 양식된 연어로부터의 오일은 약 0.59의 DHA:팔미테이트 비를 갖고; 야생 연어로부터의 오일은 약 1.02의 DHA:팔미테이트 비를 가진다. 적어도 하나의 실시양태에서, NS-B50027-4의 종자 오일에서 ω3:ω6 지방산의 비는 약 3 내지 약 7, 예컨대, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5 또는 약 7의 ω3:ω6 지방산 비이다. 유전자이입 하이브리드화에 의해 유도된 자손 하이브리드 식물, 및 NS-B50027-4로부터 유래한 다른 이러한 식물은 유사하거나 유리한 ω3:ω6 비를 가진다.
본 실시양태의 또 다른 양태에서, 근친교배 계통 NS-B50027-4 또는 이로부터 유래한 자손의 종자로부터의 오일, 지질, ω3-FA, LC-PUFA 또는 DHA는 인간 또는 동물을 위한 식품(음료를 포함하는 음식 또는 식용 물질) 또는 영양 보충제(음식 첨가제)로서 사용되거나 이러한 식품 또는 영양 보충제에서 사용된다. 적어도 하나의 실시양태에서, 이벤트 NS-B50027-4 종자로부터의 오일, 지질, ω3-FA, LC-PUFA 또는 DHA는 수산양식에서 사용될 사료 또는 사료 첨가제를 보충하는 데 사용된다. 적어도 하나의 실시양태에서, 근친교배 계통 NS-B50027-4 종자로부터의 오일, 지질, ω3-FA, LC-PUFA 또는 DHA는 약학 조성물로서 사용되거나 약학 조성물에서 사용된다. 다른 실시양태에서, 이러한 오일, 지질, ω3-FA, LC-PUFA, ω3 LC-PUFA 또는 DHA는 NS-B50027-4로부터 육종된 계통으로부터 수득된다.
본 실시양태의 또 다른 양태에서, 근친교배 계통 NS-B50027-4 또는 이로부터 유래한 자손의 종자로부터 수득된 종자 가루(seed meal)로부터 유래한 가루 또는 단백질은 인간 또는 동물을 위한 식품(음식 또는 식용 물질)로서 사용되거나 이러한 식품에서 사용되거나, 영양 보충제(음식 첨가제)로서 사용된다. 적어도 하나의 실시양태에서, 근친교배 계통 NS-B50027-4 또는 이로부터 유래한 자손의 종자로부터 프로세싱된 가루는 수산양식에서 사용될 사료 또는 사료 첨가제를 보충하는 데 사용된다. 적어도 하나의 실시양태에서, NS-B50027-4 또는 이로부터 유래한 자손의 종자로부터 프로세싱된 단백질은 수산양식에서 사용될 사료 또는 사료 첨가제를 보충하는 데 사용된다.
본 실시양태의 한 양태는 LC-PUFA 생합성 경로의 일부 "전단부(front end)" 효소들을 발현하는 유전자 구축물의 다수의 카피를 가진 식물을 (예를 들면, 유전자 형질전환 또는 육종으로) 제공함으로써 식물에서 LC-PUFA를 증가시키는 방법을 제공한다. 예를 들면, 효소 Δ6-데사투라제(desaturase), Δ5-데사투라제, Δ5-일롱가제(elongase) 및 ω3/Δ15-데사투라제 모두가 전단부 데사투라제 또는 일롱가제로서 배타적으로 간주될 수 없을지라도, 특정 실시양태에서, 이 유전자들은 LC-PUFA의 합성에 필요한 다른 유전자를 발현하는 형질전환 식물에서 LC-PUFA, 예컨대, EPA, DPA 또는 DHA의 생성을 향상시키는 인공 좌위로 조립된다. 특정 실시양태에서, 일부 전단부 유전자들을 포함하는 인공 좌위는 마이크로모나스 푸실라(Micromonas pusilla) 유래의 Δ6-데사투라제, 피라미모나스 코르다타(Pyramimonas cordata) 유래의 Δ5-일롱가제, 파블로바 살리나(Pavlova salina) 유래의 Δ5-데사투라제 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 유래의 Δ15/ω3-데사투라제 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 실시양태에서, LC-PUFA 생합성 경로의 일부 전단부 유전자들을 포함하는 인공 좌위는 마이크로모나스 푸실라 유래의 Δ6-데사투라제, 피라미모나스 코르다타 유래의 Δ5-일롱가제, 파블로바 살리나 유래의 Δ5-데사투라제 및 피키아 파스토리스 유래의 Δ15/ω3-데사투라제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 4-유전자 형질전환 삽입체는 (예를 들면, A02 염색체의 이종교배에 의해) NS-B50027-4로부터 분리되고 표준 식물 육종 기법의 이용을 통해 수용자 식물 내로 도입된다.
기재된 실시양태의 한 양태는 그의 핵 게놈 내에 NS-B50027-4의 엘리트 이벤트를 포함하는, NS-B50027-4로서 표기된 신규 카놀라 육종 계통 및 오일종자 유채 식물, 예컨대, 브라시카 나푸스 엘 또는 브라시카 준세아를 제공한다. 계통 NS-B50027-4의 유전자 이벤트를 포함하는 카놀라 식물은 보편적인 카놀라 식물에서 생성된 지방산보다 더 많은 LC-PUFA를 함유하는 지방산을 종자 특이적으로 생성할 수 있다. 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4 식물은 비-형질전환 동질유전자 카놀라 식물 계통과 실질적으로 동등한 다른 작물학적 성능 형질을 나타내나; 이러한 형질은 NS-B50027-4로서 표기된 독립적인 계통 또는 재배종을 제공하도록 다른 계통과 상이하다. 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4 종자의 대표적인 샘플은 ATCC®에 기탁되었고 수탁번호 PTA-123186을 배정받았다.
적어도 하나의 실시양태는 16개의 이종 유전자들, 즉 식물 발현을 위해 코돈 최적화되어 있고 파블로바 살리나 유래의 Δ4-데사투라제, 파블로바 살리나 유래의 Δ5-데사투라제, 피라미모나스 코르다타 유래의 Δ5-일롱가제, 마이크로모나스 푸실라 유래의 Δ6-데사투라제, 피라미모나스 코르다타 유래의 Δ6-일롱가제, 라칸세아 클루이베리(Lachancea kluyveri) 유래의 Δ12-데사투라제, 피키아 파스토리스 유래의 Δ15/ω3-데사투라제를 코딩하는 전이유전자들, 및 적어도 하나의 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 매트릭스 부착 영역(MAR), 및 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 형질전환 삽입체; 및 4개의 이종 유전자들, 즉 식물 발현을 위해 코돈 최적화되어 있고 마이크로모나스 푸실라 유래의 Δ6-데사투라제, 피라미모나스 코르다타 유래의 Δ5-일롱가제, 파블로바 살리나 유래의 Δ5-데사투라제, 피키아 파스토리스 유래의 Δ15/ω3-데사투라제 전이유전자를 코딩하는 전이유전자들 및 적어도 하나의 니코티아나 타바쿰 유래의 MAR을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 형질전환 삽입체가 게놈 내에 안정하게 삽입되어 있는 형질전환 카놀라 종자, 식물 또는 식물 부분, 또는 이의 조직 또는 세포에 관한 것이다. 근친교배 형질전환 계통 NS-B50027-4는 이 실시양태를 예시하고, 이 이종 유전자들을 가진 종자의 대표적인 샘플은 수탁번호 PTA-123186으로서 ATCC®에 기탁되었다.
추가로, 본 실시양태의 한 양태는 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 형질전환 특징(엘리트 이벤트)을 포함하는 형질전환 식물, 또는 이의 세포 또는 조직을 확인하는 방법으로서, 특정 뉴클레오타이드 서열을 갖거나 특정 아미노산을 코딩하는 특징적인 DNA 분자의 존재를 확인하는 것에 기반을 둔 방법을 제공한다. 예를 들면, 이러한 특징적인 DNA 분자는 상기 이벤트의 삽입 부위 또는 연접부를 포함하는 적어도 15 bp, 적어도 20 bp, 적어도 30 bp의 서열, 즉 LC-ω3 지방산 합성 유전자를 포함하는 삽입된 외래 DNA의 부분 및 이것과 인접한 카놀라 게놈의 부분(각각의 삽입을 위한 5' 또는 3' 플랭킹 영역) 둘 다를 포함함으로써, NS-B50027-4의 구체적인 확인을 가능하게 한다. 이 양태의 또 다른 예로서, 다수의 전이유전자들 및 플랭킹 영역들의 확인을 위한 한 세트의 프라이머들이 NS-B50027-4를 확인하는 방법에서 사용될 수 있다. 상기 실시양태는 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 식물에 관한 것이기도 하다.
일부 실시양태는 경쟁 대립유전자 특이적 PCR(KASP) 어세이(2개의 대립유전자 특이적 정방향 프라이머들이 SNP를 인식함), 소적 디지털 PCR(ddPCR) 어세이, 정량적 PCR(qPCR) 어세이, 파랄로그(paralog) 특이적 어세이, 또는 우연한 존재(AP) 시험을 위한 어세이에 유용한 조성물을 제공한다. KASP 어세이를 수행하여 NS-B50027-4 유전 형질을 검출하는 데 유용한, 특히 유전자이입 연구 및 하이브리드 개발에 유용한 프라이머의 특정 실시양태는 서열번호 1 내지 서열번호 90으로 표시된 프라이머들, 또는 이들의 상보체들을 포함한다. 이 프라이머들 또는 이들의 상보체들의 적어도 일부는 NS-B50027-4, NS-B50027-4의 자손, 또는 NS-B50027-4의 적어도 부분 게놈을 포함하는 다른 식물 또는 식물 물질을 확인하는 키트에 포함될 수 있다.
관련된 양태는 계통 NS-B50027-4의 게놈 DNA의 적어도 부분, 특히 전이유전자들 또는 이들의 연접부를 포함하는 게놈의 영역을 포함하는, 식물로부터 수득되었거나 유래한 게놈 DNA를 제공한다. 이러한 게놈 DNA는 예를 들면, 본원에 기재된 확인 어세이에서 기준 대조군 물질로서 사용될 수 있다.
도 1은 DHA의 합성을 위한 생합성 경로를 제공하기 위해 형질전환 식물 내로 도입되는 효소를 보여주는 도식이다.
도 2는 8개의 재배 장소들 전체에 걸쳐 예측된 DHA에 대하여 작도된 곡물 수확량(kg/ha)의 그래프이다. ◆는 DHA Kg/ha이고; --는 선형 DHA Kg/ha이고; y = 29.296x + 2.8315이고; R2 = 0.8567이다.
도 3은 8개의 장소들 전체에 걸쳐 예측된 LC-PUFA(EPA, DPA 및 DHA)에 대하여 그래프로 작성된 곡물 수확량(kg/ha)을 묘사한다. ◆는 LC-PUFA Kg/ha이고; --는 선형 LC-PUFA Kg/ha이고; y = 34.043x + 3.4049이고; R2 = 0.8636이다.
도 4는 ω3 지방산을 함유하는 수확된 형질전환 카놀라 종자로부터의 가능한 프로세싱 및 생산 스트림을 보여주는 순서도이다. 둥근 가장자리 직사각형은 생성물 또는 과정 분획을 표시하고; 타원은 프로세싱 단계를 표시하고; 날카로운 모서리 직사각형은 가능한 생성물 사용을 표시한다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약 등으로 한정되지 않으므로, 변경될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고, 청구범위에 의해서만 정의되는, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
확인된 모든 특허들 및 다른 공개문헌들은 예를 들면, 본 발명과 관련하여 사용될, 이러한 공개문헌들에 기재된 방법을 기술하고 개시하기 위해 본원에 참고로 도입되나, 본원에서 제시된 용어들과 불일치하는 용어들의 정의를 제공하기 위한 것이 아니다. 이 공개문헌들은 본원의 출원일 전에 그들의 개시에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 어느 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시를 예상할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 날짜에 대한 모든 진술 또는 이 문헌들의 내용에 대한 표현은 본 출원인에 의해 이용될 수 있는 정보에 기반을 둔 것이고 이 문헌들의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 임의의 인정을 구성하지 않는다.
본원 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 용어는 복수 지시대상을 포함한다. 본 명세서 전체에서, 달리 표시되어 있지 않은 한, "포함한다", "포함하고" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군이 하나 이상의 다른 언급되지 않은 정수 또는 정수의 군을 포함할 수 있도록 배타적으로 사용되기 보다는 오히려 포괄적으로 사용된다. 용어 "또는"은 예를 들면, "어느 하나"에 의해 수식되지 않은 한 포괄적이다. 따라서, 문맥이 달리 표시하지 않은 한, 용어 "또는"은 특정 목록의 어느 한 구성원을 의미하고 그 목록의 구성원들의 임의의 조합도 포함한다.
환경적 조건으로 인해 지방산 조성에서의 약간의 변동이 있기 때문에, 모든 값들은 근사치이다. 값은 전형적으로 총 지방산의 중량 퍼센트, 또는 총 종자의 중량 퍼센트로서 표현된다. 따라서, 작동 예 또는 달리 표시되어 있는 경우를 제외하고, 반대로 언급되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자들은 모든 경우들에서 용어 "약"에 의해 수식된 것으로서 이해되어야 하고; "약"은 일반적으로 지정된 값의 ± 1%를 의미하나, 당분야에서 숙련된 자에 의해 관련 문맥에서 인정될 때 지정된 값의 ± 5% 또는 ± 10%를 허용할 수 있다.
재조합 DNA 기법은 당분야에서 공지되어 있는 표준 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (2nd Ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, NY (1989)); 문헌(Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS MOLEC. BIOL. (1994 and updates)); 문헌(DNA CLONING: PRACTICAL APPROACH, Vols. 1-4 (Glover & Hames, Eds., IRL Press 1995, 1996)); 문헌(Croy, PLANT MOLEC. BIOL. LABFAX (BIOS Sci. Pub. Ltd. & Blackwell Sci. Pub., UK, 1993)); 및 국제 특허출원 공보 제WO 2015089587호를 참조한다.
제목은 편의를 위해서만 제공되고 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고, 청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다. 본 개시가 보다 더 용이하게 이해될 수 있도록, 일부 용어들이 먼저 정의된다. 추가 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
정의
"계통"은 그 표기를 공유하는 개체들 사이에 매우 적은 전체 변이만을 표시하는 식물 군이다. 또한, "계통"은 적어도 하나의 형질에 대해 개체들 사이에 유전자 변이를 거의 또는 전혀 표시하지 않는 실질적으로 동일한 유전 물질을 보유하는 식물의 균일한 집단을 지칭한다. "품종" 또는 "재배종"은 "계통"과 상호교환 가능하게 사용될 수 있으나, 일반적으로 앞의 두 용어들은 상업적 생산에 적합한 계통을 지칭한다. 예를 들면, 어구 "모본 계통으로부터 유전적으로 유래한"에서 사용된 "유전적으로 유래한"은 해당 특징이 전체적으로 또는 부분적으로 해당 식물의 유전자 구성의 양태에 의해 좌우된다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "브라시카" 식물은 브라시카세아(Brassicaceae) 과의 식물을 지칭한다. 브라시카 식물은 브라시카 나푸스, 브라시카 라파(B. rapa)(또는 캄페스트리스(campestris)), 또는 브라시카 준세아 종 중 하나에 속할 수 있다. 대안적으로, 상기 식물은 이 브라시카 종들의 이종교배로부터 유래한 종, 예컨대, 브라시카 나포캄페스트리스(B. napocampestris), 또는 이 브라시카 종들 중 한 종과 크루시페라세아(Cruciferacea)의 또 다른 종의 인공 교배로부터 유래한 종에 속할 수 있다. 배수성(Ploidy)은 재배종에 의해 나타난 염색체의 수가 이배체인지 아니면 사배체인 지를 의미한다. 브라시카 나푸스가 브라시카 라파(이전에 브라시카 캄페스트리스) 및 브라시카 올레라세아(B. oleracea)의 두 게놈들의 교배 및 보유로부터 발생된 이질사배체(복이배체)이기 때문에, 본원에 기재된 바와 같이 NS-B50027-4 이벤트를 도입하여, LC-ω3 지방산 생성 또는 LC-ω3 지방산의 발현 증가라는 "형질"을 브라시카 속의 다른 구성원 내로 도입하기 위해 형질전환 이벤트 NS-B50027-4를 포함하는 브라시카 나푸스 식물을 다양한 또는 보편적인 육종 방법과 함께 사용할 수 있다. 따라서, 본 실시양태를 실시하는 데 유용한 브라시카 속의 구성원의 예는 브라시카 준세아, 브라시카 나포브라시카, 브라시카 올레라세아, 브라시카 카리나타, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파 및 브라시카 캄페스트리스뿐만 아니라, 브라시카 종들 사이의 육종을 허용하는 브라시카 속에 속하는 임의의 다른 식물도 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 일반적으로, "오일종자 식물"은 브라시카 나푸스, 브라시카 라파(또는 캄페스트리스) 또는 브라시카 준세아 종 중 어느 한 종을 지칭한다.
브라시카 나푸스는 평지씨 또는 오일종자 유채로서 통상적으로 공지되어 있고, 특정 재배종은 카놀라로서 지칭될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "카놀라" 또는 "카놀라 식물"은 카놀라 오일(즉, 2% 미만의 에룩산 함유라는 특정 품질 표기를 충족시키는 오일)을 생성하는 데 사용될 수 있는 브라시카 식물을 지칭하고, 브라시카 나푸스, 브라시카 나포브라시카, 브라시카 라파, 브라시카 준세아 및 브라시카 캄페스트리스의 품종을 포함한다. 카놀라 식물은 전형적으로 게놈 AACC로 표시된, 각각의 모본 형태로부터의 완전한 이배체 염색체 세트를 가진 종간 하이브리드를 지칭하는 복이배체(이질사배체로서도 지칭됨)이다.
"카놀라" 및 "카놀라 식물"은 전형적으로 브라시카 나푸스를 지칭하나, 카놀라와 교배될 수 있는 모든 식물 품종을 포함한다. "카놀라" 및 "카놀라 식물"은 식물 부분도 포함한다. "카놀라 오일"은 2% 미만의 에룩산(Δ13-22:1), 및 30 μmol 미만의 글루코시놀레이트/g 공기 건조 오일 무함유 고체 카놀라 종자(즉, 가루)를 함유해야 한다. 예를 들면, 문헌(CODEX ALIMENTARIUS: FATS, OILS & RELATED PRODUCTS, VOL. 8 (2nd ed., Food & Agriculture Org. United Nations, Rome, Italy, 2001))을 참조한다.
"식물 부분"은 식물 세포, 식물 기관, 식물 원형질체, 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 조직 배양물, 식물 유합조직, 식물 덤불, 및 식물 또는 식물의 부분에서 온전한 식물 세포, 예컨대, 배아, 화분, 밑씨, 종자, 꼬투리, 잎, 꽃, 가지, 과일, 줄기, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 떡잎, 배축, 어린뿌리, 단일 세포, 생식세포, 세포 배양물, 조직 배양물 등을 포함한다. 떡잎은 종자 잎의 일종; 즉, 식물 배아에 함유된 작은 잎이다. 떡잎은 종자의 식품 저장 조직을 함유한다. 배아는 성숙 종자 내에 함유된 작은 식물이다. "식물 세포"는 재생 불가능한 식물 세포도 포함한다. 재생된 식물의 자손, 유도체, 변이체 및 돌연변이체도, 이 부분들이 적어도 일부 이벤트 NS-B50027-4 핵산 분자, 전형적으로 NS-B50027-4의 엘리트 이벤트의 2개 좌위들 중 1개 또는 2개 좌위를 포함하는 한, 본 실시양태의 범위 내에 포함된다. 본 실시양태는 식물 세포 배양 및 조직 배양에서의 엘리트 이벤트 NS-B50027-4 전이유전자의 용도에 관한 것이기도 하다. 상기 실시양태는 엘리트 이벤트 NS-B50027-4 계통으로부터의 식물 및 식물 부분뿐만 아니라, NS-B50027-4, 또는 NS-B50027-4의 2개의 형질전환 좌위들 중 적어도 하나를 포함하는 자손의 유전자 구성을 증가시키는 기재된 방법에 의해 생성된 다른 식물도 포함한다.
"대립유전자"는 1개의 형질 또는 특징과 관련된, 한 유전자의 대안적 형태이다. 이배체 세포 또는 유기체에서, 소정의 유전자의 2개의 대립유전자들은 한 쌍의 상동성 염색체들 상의 상응하는 좌위를 점유한다.
"좌위"는 하나 이상의 형질, 예를 들면, 변형된 지방산 대사, 변형된 피트산 대사, 변형된 탄수화물 대사, 웅성 불임, 제초제 내성, 곤충 내성, 질환 내성 또는 변형된 단백질 대사를 부여한다. 형질은 예를 들면, 역교배, 천연 또는 도입된 돌연변이, 또는 유전자 변형 기법을 통해 도입된 전이유전자에 의해 계통의 게놈 내로 도입된 천연 생성 유전자에 의해 부여될 수 있다. 좌위는 단일 염색체 위치에서 삽입된 하나 이상의 대립유전자를 포함할 수 있다. "정량적 형질 좌위"(QTL)는 표현형(정량적 형질)의 변경과 상호관련되어 있는 DNA(좌위)의 한 구획을 지칭한다. QTL은 표현형을 조절하는 유전자와 종종 연관되어 있거나 이러한 유전자를 함유한다. QTL은 어느 마커 유전자(예컨대, SNP 또는 AFLP)가 관찰된 형질과 상호관련되어 있는 지를 확인함으로써 맵핑된다.
"퍼센트 동일성"은 2종의 카놀라 또는 브라시카 품종들의 동형접합성 대립유전자들의 비교를 의미한다. 퍼센트 동일성은 2종의 개발된 품종들의 통계학적으로 유의미한 수의 동형접합성 대립유전자들을 비교함으로써 측정된다. 예를 들면, NS-B50027-4와 제2 브라시카 사이의 90%의 퍼센트 동일성은 이들 2종의 브라시카들이 90%의 그들의 좌위에서 동일한 대립유전자를 가진다는 것을 의미한다. 정의된 DNA 분자 또는 단백질의 경우, 확인된 서열(서열번호)의 최소 % 동일성은 서열번호로 표시된 관련 지정된 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99,4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
소정의 단백질을 코딩할 수 있는 많은 수의 뉴클레오타이드 조합으로 인해, 유전자 코드의 축퇴성은 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 % 동일성의 범위가 단백질에 대해 전형적으로 허용될 수 있는 % 동일성의 범위보다 더 클 수 있게 한다. 더욱이, 아미노산 치환은 단백질의 일차 아미노산 구조의 많은 중요하지 않은 변화들, 예를 들면, 효소 기능을 파괴하지 않는 아미노산 치환을 허용한다. 추가로, 천연 생성 분자와 비교될 때, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 잔기의 결실, 삽입 또는 치환인 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 기준 서열에 비해 돌연변이를 가진 폴리뉴클레오타이드는 천연 생성될(즉, 천연 공급원으로부터 단리될) 수 있거나 (부위 지정 돌연변이유발 또는 DNA 셔플링을 수행함으로써) 합성될 수 있다.
일반적으로, "이벤트"는 유전자 조작의 결과로서 관심 있는 유전자 또는 유전자들(전이유전자(들))을 포함하는 외래 DNA를 가진 인공 유전자 좌위이다. 이벤트의 전형적 대립유전자 상태는 외래 DNA의 존재 또는 부재이다. 이벤트는 표현형적으로 하나 이상의 전이유전자의 발현을 특징으로 할 수 있다. 유전자 수준에서, 이벤트는 식물의 유전자 구성의 부분이다. 분자 수준에서, 이벤트는 제한 지도를 특징으로 할 수 있거나, 전이유전자(들)의 업스트림 또는 다운스트림 플랭킹 서열, 또는 전이유전자(들)의 분자 배열을 특징으로 할 수 있다. 통상적으로, 형질전환 DNA를 사용한 식물 세포 또는 식물 부분의 형질전환은 다수의 이벤트들을 유발하고, 이 이벤트들 각각은 독특하다.
용어 "유전자"는 전형적으로 여러 작동 가능하게 연결된 DNA 영역들, 예컨대, 함께 프로모터 영역을 형성하는 프로모터 및 5' 비번역 영역(5' UTR 또는 5' 비코딩 서열); (단백질을 코딩할 수 있거나 코딩할 수 없는) 코딩 영역; 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 비번역 3' 영역(3' UTR 또는 3' 비코딩 서열)을 포함하는 DNA 분자를 지칭한다. 전형적으로, 식물 세포에서, 5' UTR 영역, 코딩 영역 및 3' UTR 영역은 단백질 코딩 유전자의 경우 단백질로 번역되는 RNA 분자로 전사된다. 따라서, "코딩 서열"은 (메신저 RNA, 리보좀 및 관련 번역 기구를 통해) 특정 아미노산 서열을 번역하는 코돈을 제공하는, DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 유전자는 추가 DNA 영역, 예를 들면, 인트론을 포함할 수 있다. "유전형"은 세포 또는 유기체의 유전자 구성을 지칭한다. "유전자 좌위"는 일반적으로 식물의 게놈에서 소정의 유전자 또는 유전자 세트의 위치이다.
용어 "전이유전자"는 식물의 게놈 내에 도입된 관심 있는 유전자를 지칭한다. 따라서, "형질전환 식물"은 그의 모든 세포들의 게놈 내에 적어도 하나의 전이유전자를 포함한다. 본 실시양태의 전이유전자는 계통 NS-B50027-4에서의 LC-PUFA의 생합성에서 발현되는 하기 효소들의 적어도 하나의 카피를 포함한다: 해양 미세조류 파블로바 살리나로부터 유래한 Δ4-데사투라제, 파블로바 살리나로부터 유래한 Δ5-데사투라제, 미세조류 피라미모나스 코르다타로부터 유래한 Δ5-일롱가제, 미세조류 마이크로모나스 푸실라로부터 유래한 Δ6-데사투라제, 피라미모나스 코르다타로부터 유래한 Δ6-일롱가제, 효모 라칸세아 클루이베리로부터 유래한 Δ12-데사투라제, 및 효모 피키아 파스토리스로부터 유래한 Δ15/ω3-데사투라제. 대안적으로 또는 추가로, 본 실시양태의 전이유전자는 파블로바 살리나로부터 유래한 Δ5-데사투라제, 피라미모나스 코르다타로부터 유래한 Δ5-일롱가제, 마이크로모나스 푸실라로부터 유래한 Δ6-데사투라제, 및 피키아 파스토리스로부터 유래한 Δ15/ω3-데사투라제를 포함한다. NS-B50027-4의 전이유전자들은 적절한 조절 영역을 포함하는 발현 카세트에서 이원 방식으로 정렬된다. 전술된 NS-B50027-4의 전이유전자들은 이들이 코돈 최적화 전략의 이용을 통해 디자인됨으로써, 전이유전자들이 자연에 존재하지 않는다는 점에서 인공적이다. 형질전환 발현 카세트는 니코티아나 타바쿰으로부터의 적어도 하나의 매트릭스 부착 영역(MAR)을 포함하였다. 형질전환 카세트는 선택 가능한 마커 유전자도 포함하였다. 예를 들면, 미국 가출원 제62/351,246호의 우선권 이익을 주장하면서 2017년 6월 16일에 출원된, 국제 특허출원 공보 제WO 2013185184호; 미국 특허출원 공보 제2015/0166928호; 국제 특허출원 제PCT/US2017/_____호를 참조한다.
식물 종과 관련하여 유전자 또는 DNA 분자를 지칭할 때 "외래" 또는 "이종"은 유전자 또는 DNA 분자, 또는 이의 부분(예를 들면, 특정 영역)이 그 식물 종에서 천연적으로 발견되지 않거나, 그 식물 종 내의 그 유전자 좌위에서 천연적으로 발견되지 않는다는 것을 표시한다. 용어 "외래 DNA"는 형질전환의 결과로서 식물의 게놈 내로 도입되거나 도입되어 있는 DNA 분자도 지칭한다. 이 개시와 관련하여, 전이유전자, 형질전환 카세트 또는 형질전환 발현 카세트는 적어도 하나의 외래 또는 이종 DNA를 포함한다.
유전자 또는 DNA 분자를 지칭할 때 용어 "키메라"는 유전자 또는 DNA 분자가 서로 천연적으로 관련되어 있지 않은 적어도 2개의 기능적으로 관련된 DNA 영역들(예컨대, 프로모터, 5' UTR, 코딩 영역, 3' UTR, 인트론)을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 영역이 키메라 DNA 분자 내의 또 다른 DNA 영역에 대한 외래 물질이도록 상이한 공급원들로부터 유래한다는 것을 표시하기 위해 사용된다.
용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 종종 세포의 중추 대사의 부분이 아닌 유전자를 보유하고 통상적으로 환형 이중 가닥 DNA 분자의 형태로 존재하는 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래한, 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 환형 자율 복제 서열, 게놈 삽입 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있고, 이때 다수의 뉴클레오타이드들이 예를 들면, 발현 카세트를 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구축물로 연결되어 있거나 재조합되어 있다. 형질전환 식물과 관련하여, 이러한 플라스미드 또는 벡터는 식물 게놈 내로의 전이유전자(들)의 삽입을 용이하게 하는 T-DNA의 영역을 함유할 수 있다.
"발현 카세트"는 전이유전자를 함유하고 외래 유전자 이외에 외래 숙주에서 그 유전자의 발현을 가능하게 하는 요소(예를 들면, (임의적으로 인핸서를 가진) 5' 프로모터 비번역("UTR") DNA, 선택된 유전자 생성물을 코딩하는 DNA, 및 적절한 3' UTR DNA)를 가진 유전자 구축물을 지칭하고; 식물의 게놈 내로의 삽입 전 및 후 카세트를 지칭할 수 있다. 다시 말해, 형질전환 삽입체는 발현 카세트를 포함한다. 따라서, "삽입체 DNA"는 형질전환 과정을 통해 식물 물질에 도입되는 이종 DNA를 지칭하고, 본원에서 설명된 바와 같은 형질전환을 위해 사용된 DNA(원래의/야생형/천연 DNA와 상이함)를 포함한다. 삽입체 DNA는 전형적으로 형질전환 발현 카세트이다.
"형질전환 DNA"는 형질전환을 위해 사용되는 재조합 DNA 분자, 예를 들면, 발현 벡터를 지칭한다. 형질전환 DNA는 통상적으로 하나 이상의 특정 특징을 형질전환된 식물에 부여할 수 있는 적어도 하나의 "관심 있는 유전자"(예를 들면, 키메라 유전자)를 포함한다.
"형질전환"은 유전적으로 안정한 유전을 야기하는, 숙주 유기체 내로의 핵산 분자의 전달을 지칭한다. 핵산 분자는 예를 들면, 자율 복제하거나 숙주 유기체의 게놈 내로 삽입될 수 있는 플라스미드일 수 있다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "형질전환" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로서 지칭된다.
용어 "재조합 DNA 분자"는 예시하기 위해 사용되므로, DNA일 수 있고 재조합 또는 다른 절차, 예컨대, 합성 DNA 합성 또는 PCR을 통해 수득될 수 있는 단리된 핵산 분자를 포함할 수 있다. PCR(중합효소 연쇄 반응)은 "업스트림" 및 "다운스트림" 프라이머로 구성된 프라이머, 및 중합 촉매, 예컨대, DNA 중합효소 및 전형적으로 열안정성 중합효소를 사용함으로써 표적 폴리뉴클레오타이드의 복제 카피를 만드는 반응이다. PCR 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, PCR(McPherson & Moller, eds., BIOS Sci. Publ. Ltd., Oxford, 2000)을 참조한다. 게놈 DNA 또는 cDNA에 대한 PCR을 수행할 수 있다.
"적합한 조절 요소" 또는 "적절한 조절 서열"은 코딩 영역의 업스트림(예를 들면, 5' UTR), 내부 또는 다운스트림(3' UTR)에 위치하여, 관련된 코딩 영역의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 조절 요소는 프로모터, 인핸서 요소, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위 및 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다.
"프로모터"는 코딩 영역 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 요소를 지칭한다. 일반적으로, 코딩 영역은 프로모터 요소의 3'에 위치한다. 프로모터는 전체적으로 천연 유전자로부터 유래할 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터들로부터 유래한 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 분절을 포함할 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 상이한 프로모터가 상이한 유형의 조직 또는 세포에서, 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도할 수 있다는 것을 이해한다. 유전자가 대다수의 유향의 세포들에서 항상 발현되게 하는 프로모터는 통상적으로 "항시성 프로모터"로서 지칭된다. 대부분의 경우 조절 요소의 정확한 경계가 완전히 정의되어 있지 않기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것도 인식된다.
용어 "3' 비코딩 서열" 및 "전사 터미네이터" 또는 3' UTR은 DNA 분자의 코딩 영역의 다운스트림에 위치하는 DNA 요소를 지칭한다. 이것은 폴리아데닐화 인식 서열, 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 통상적으로 mRNA 전구체의 3' 말단에의 폴리아데닐산 트랙의 추가에 영향을 미치는 것을 특징으로 한다. 3' 영역은 관련된 코딩 영역의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"은 한 요소의 기능이 다른 핵산 서열에 의해 영향을 받도록 핵산 효소들이 단일 핵산 분자 또는 이의 부분 상에서 회합되어 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 영역의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때(즉, 코딩 영역이 프로모터의 전사 조절 하에 있을 때) 그 코딩 영역과 작동 가능하게 연결되어 있다. 코딩 영역은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
"돌연변이유발"은 유전 물질에서 돌연변이를 야기하는 것으로 공지되어 있는 물질, 예컨대, 에틸 메틸설포네이트가 종에서 새로운 유전자 변이를 야기할 목적으로 식물 물질에 적용되는 과정이고, 통상적으로 특정 형질을 유념하면서 수행된다. 문헌(Swanson et al., 7 Plant Cell Rep. 83 (1988))을 참조한다. 다른 기법은 특정 뉴클레오타이드에 대해 유도된 돌연변이체의 생성 또는 아미노산 변화(치환, 결실 또는 추가)를 포함한다. 핵산 서열 변화를 도입하는 이러한 방법은 용어 "돌연변이유발"에 포함된다. 돌연변이유발은 유전자 발현을 파괴하기 위한 "넉아웃" 실험에 유용할 수 있다.
"프라이머"는 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭될 폴리뉴클레오타이드의 부분에 상보적인 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드이다. 전형적으로, 프라이머는 길이가 50개 이하의 뉴클레오타이드, 예컨대, 약 30개 미만의 뉴클레오타이드 또는 약 24개 미만의 뉴클레오타이드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현"은 본 발명의 핵산으로부터 유래한 센스(mRNA)의 전사 및 안정한 축적을 지칭한다. 발현은 폴리펩타이드로의 mRNA의 번역을 지칭할 수도 있다.
문맥으로부터 달리 언급되어 있거나 명확하지 않은 한, 세포의 언급은 단리되어 있거나, 조직 배양물에 존재하거나 식물 또는 식물 부분 내로 도입된 식물 세포를 포함한다.
"재생"은 선택된 식물 또는 품종으로부터 재생할 수 있는 세포(예를 들면, 종자, 미세포자, 밑씨, 화분, 영양 부분)의 선택을 포함한다. 이 세포에 대해 임의적으로 유전자 형질전환 또는 돌연변이유발을 수행할 수 있고, 그 후 유전적으로 변형된 세포의 유형을 기반으로 재생, 수정 또는 생장 기법을 이용하여 세포로부터 식물을 발생시킨다. 적용 가능한 재생 기법은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Armstrong & Green, 165 Planta 322 (1985)); 문헌(Close & Ludeman, 52 Planta Sci. 81 (1987)) 참조).
"자손"은 식물 또는 식물들의 자손 및 유도체를 포함하는 모든 후손들을 의미하고, 제1 세대, 제2 세대, 제3 세대 및 후속 세대를 포함하고; 자가수분, 또는 동일하거나 상이한 유전형을 가진 식물과의 교배에 의해 생성될 수 있고, 다양한 적합한 유전공학 기법들에 의해 변형될 수 있다. 재배종은 일반적으로 인간에 의해 의도적으로 변경되고 선택된 식물을 의미한다. "T0"은 형질전환된 식물 물질의 제1 세대를 지칭하고, "T1"은 T0 식물에서 생성된 종자를 지칭하고, T1 종자는 후속 Tx 자손까지 T2 종자 등을 생성하는 식물을 발생시킨다.
"육종"은 식물을 발생시키거나 증식시키는 모든 방법들을 포함하고, 종내 및 종간 교배, 및 계통내 및 계통간 교배뿐만 아니라, 모든 적합한 보편적인 육종 및 인공 육종 기법들도 포함한다. 원하는 형질(예를 들면, NS-B50027-4 DHA 형질)은 보편적인 육종 방법을 통해 다른 카놀라 또는 브라시카 나푸스 계통, 재배종 또는 배양종으로 전달될 수 있고, 종간 교배를 통해 다른 브라시카 종, 예컨대, 브라시카 준세아 및 브라시카 라파로 전달될 수도 있다. 보편적인 육종 방법 및 종간 교배 방법 둘 다뿐만 아니라, 식물들 사이에 유전 물질을 전달하는 다른 방법도 당분야에서 잘 공지되어 있다.
"역교배"는 육종자가 하이브리드 자손을 모본 계통과 반복적으로 역교배시키는 과정이다. 예를 들면, 제1 세대 하이브리드 F1과 F1 하이브리드의 모본 유전형들 중 한 유전형의 교배는 역교배이다. 역교배를 이용하여 공여친(형질전환친)으로부터의 관심 있는 형질을 반복친(변형될 엘리트 계통) 내로 도입할 수 있다: 공여친을 반복친과 교배시키고; 그 다음, 이 교배의 자손을 반복친과 역교배시키고; 관심 있는 형질에 대해 이 교배들의 자손을 선택한 후, 반복친과 역교배시키고; 반복친이 공여친으로부터의 형질에 대해 동형접합성을 가진 계통을 생성하기 위해 많은 역교배가 필요하기 때문에 이 과정을 반복한다. 역교배는 자가수분과도 조합될 수 있고, 이것은 열성 유전자를 도입할 때 유리할 수 있다.
"유전자이입"은 유전자를 한 유전자 풀로부터 또 다른 유전자 풀 내로 안정하게 도입하는 것이다. "유전자이입 하이브리드화"는 (통상적으로 하이브리드화 및 역교배를 통해) 대립유전자를 한 물질로부터 제2 상이한 물질의 유전자 풀 내로 도입하는 것을 의미한다. 유전자이입 계통은 정량적 형질 좌위의 연구를 가능하게 하고, 신규 형질, 즉 NS-B50027-4 형질을 다른 카놀라 또는 브라시카, 예컨대, 브라시카 나푸스 또는 브라시카 준세아 내로 도입하는 수단도 제공한다. 관심 있는 수용자 계통은 개방 수분된(OP) 제초제 내성 계통, 예컨대, 트리아진 내성(TT); Roundup Ready®(RR); 적층된 TT 및 RR; 이미다졸리논(IMI) 내성 OP 계통; 또는 IMI 임성회복친(Rf) 계통; 높은 퍼센트 종자 오일 계통; DHA 계통에 대한 최적 배경; 또는 지역적 적응을 위해 선택된 계통을 포함한다. 이러한 계통은 하이브리드 또는 엘리트 이벤트로서 개발될 수 있다. 기존 동질유전자(isogenic) 카놀라 계통이 45%의 종자 오일 잠재력을 나타내기 때문에, NS-B50027-4 좌위의 유전자이입은 이러한 적층된 이벤트에서 대용량 수확량으로 20% DHA를 함유하는 종자 오일을 생성할 수 있다. EPA 또는 DPA의 생성을 위해 추가 육종 이벤트 적층물을 선택할 수 있다. 사실상, NS-B50027-4 유전자(한 좌위 또는 두 좌위)는 NS-B50027-4를 생성하는 데 사용되는 동일한 벡터 또는 유사한 벡터를 사용한 형질전환을 통해 적어도 하나의 7-유전자 또는 8-유전자 삽입체(즉, 7개의 효소들 및 임의적으로 1개의 마커)를 함유하는 다른 형질전환 브라시카와 적층되어, 예를 들면, LC-PUFA의 생성을 제공하는 3개의 좌위들을 가진 식물을 생성할 수 있다. 대안적으로, 본원에 더 기재된 바와 같이, A02 및 A05 좌위는 NS-B50027-4로부터 분리될 수 있고, A02 좌위는 다른 LC-PUFA 생성 계통(예를 들면, EPA, DPA 또는 DHA의 생성을 위한 단일 삽입체를 가진 계통)에서 적층되어, LC-PUFA 생성을 증가시킬 수 있다.
"질환 저항성"은 일반적으로 특정된 해충, 예컨대, 곤충, 진균, 바이러스 또는 세균의 활성을 제한하는 식물의 능력이다. "질환 내성"은 특정된 해충(예컨대, 곤충, 진균, 바이러스 또는 세균), 또는 불리한 환경적 조건에 의해 야기된 장애를 견디고 이러한 장애에도 불구하고 여전히 수행하고 생성하는 식물의 능력이다.
"지방산 조성" 또는 "지방산 함량"은 일반적으로 성숙 전체 부분적으로 건조된 종자의 내생적으로 형성된 오일에 존재하는 다양한 지방산들의 중량 퍼센트를 의미한다. 통상의 산업 관행은 지방산 조성을 절대적인 중량 퍼센트보다는 오히려 면적 퍼센트(표준화된 면적)로서 보고하는 것이나, 면적 퍼센트는 중량 퍼센트의 근사치이다. 절대적인 결과는 공지된 농도의 개별 기준 표준물 및 내부 표준물을 사용하여 mg/kg 기준으로 결과를 계산함으로써 계산될 수 있다. 내부 표준물이 여전히 필요할 수 있지만, 개별 지방산 표준물을 사용하지 않고 보정 계수를 사용하여 지방산의 질량을 계산할 수도 있다. 통상적으로, 지방산 함량은 종자를 분쇄하고, 데이터를 면적 퍼센트로서 생성하거나 이 면적 퍼센트로부터 유도될 수 있는 데이터를 생성하는 다양한 기법들에 의해 지방산 함량에 대해 분석될 수 있는 지방산 메틸 에스테르(FAME)로서 지방산을 추출함으로써 측정된다. 예시적 분석 방법은 기체 크로마토그래피(GC), GC-질량 분광측정(GC-MS), 액체 크로마토그래피-질량 분광측정(LC-MS), 핵 자기 공명(NMR) 또는 근적외선 반사 분광법을 포함한다. 총 지질은 분획, 예를 들면, TAG 분획을 정제하는, 당분야에서 공지된 기법에 의해 분리될 수 있다. 지방산 조성을 특징규명하는 다른 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(CANOLA: CHEM. PRODUCTION, PROCESSING & UTILIZATION (Daun et al., eds., AOCS Press, Urbana, IL, 2011) (Daun et al., 2011)); 미국 특허출원 공보 제2015/0166928호; 및 미국 특허출원 공보 제20160002566호를 참조한다.
유사하게, "오일 함량"은 성숙 전체 부분적으로 건조된 종자(전형적으로 약 6% 또는 7% 수분을 함유함)에 존재하는 오일의 전형적인 중량 퍼센트이다. 오일 함량으로서도 지칭되는 퍼센트 오일은 표준화된 수분 함량에서 종자의 중량에 의해 나누어진 오일의 중량으로서 계산된다. 오일 함량은 상이한 품종의 특징일 수 있다. 이것은 다양한 분석 기법들, 예컨대, 핵 자기 공명(NMR), 근적외선 반사(NIR) 및 Soxhlet 추출을 이용함으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 카놀라 오일 함량은 NMR 기법(Rossell & Pritchar, ANALYSIS OF OILSEEDS, FATS & FATTY FOODS 48-53 (Elsevier Sci. Pub. Ltd, London, 1991)), 또는 동시에 수분 함량을 측정하는 펄스 파장 NMS 100 미니스펙(Minispec)에 의해 측정될 수 있다. 종자 오일 함량은 NIR 분광법에 의해 측정될 수도 있다(Li et al. 67 Phytochem. 904 (2006)).
어구 "추출된 식물 지질", "단리된 식물 지질", "추출된 지질" 등은 예를 들면, 분쇄된 식물 또는 식물 부분, 예컨대, 종자로부터 추출된 지질을 포함하는 조성물을 지칭한다. 추출된 지질은 예를 들면, 식물 물질, 예컨대, 종자를 분쇄함으로써 수득된 상대적으로 미정제된 조성물; 또는 전부는 아니더라도 식물 물질로부터 유래한 대부분의 물, 핵산, 단백질 또는 탄수화물이 오일로부터 제거되어 있는 보다 더 정제된 조성물일 수 있다. 정제 방법의 예는 당분야에서 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 추출된 또는 단리된 식물 지질은 조성물의 중량을 기준으로 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%(중량/중량)의 지질을 포함한다. 추출된 지질은 실온에서 고체 또는 액체일 수 있고, 이때 액체는 본원에서 "오일"로서 간주된다. 일부 실시양태에서, 추출된 지질은 또 다른 공급원에 의해 생성된 또 다른 지질, 예컨대, DHA(예를 들면, 어류 오일로부터의 DHA)와 블렌딩되지 않는다. 일부 실시양태에서, 추출 후, 올레산 대 DHA, 팔미트산 대 DHA, 리놀레산 대 DHA, 또는 총 ω6 지방산 대 총 ω3 지방산의 비는 온전한 종자 또는 세포에서의 상기 비에 비해 유의미하게 변경되지 않았다(예를 들면, 10% 또는 5% 이하의 변경). 다시 말해, 추출된 오일은 특정 지방산, 예를 들면, DHA에 대해 농축되지 않았다. 다른 실시양태에서, 추출된 식물 지질은 올레산 대 DHA, 팔미트산 대 DHA, 리놀레산 대 DHA, 또는 총 ω6 지방산 대 총 ω3 지방산의 비를 온전한 종자 또는 세포에서의 상기 비에 비해 변경시키는 절차, 예컨대, 수소첨가 또는 분획화에 노출되지 않았다. 다시 말해, 추출된 오일은 특정 지방산, 예를 들면, DHA에 대해 농축되지 않았다. 본 실시양태의 추출된 식물 지질이 오일일 때, 오일은 비-지방산 분자, 예컨대, 스테롤을 추가로 포함할 수 있다.
상기 인지된 바와 같이, 어구 "추출된 식물 오일" 및 "단리된 식물 오일"은 실온에서 액체인 추출된 식물 지질 또는 단리된 식물 지질을 포함하는 조성물을 지칭한다. 상기 오일은 식물 또는 이의 부분, 예컨대, 종자로부터 수득된다. 추출된 또는 단리된 오일은 예를 들면, 식물 종자를 분쇄함으로써 수득된 상대적으로 미정제된 조성물; 또는 전부는 아니더라도 식물 물질로부터 유래한 대부분의 물, 핵산, 단백질 또는 탄수화물이 오일로부터 제거되어 있는 보다 더 정제된 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 지질 또는 비-지질일 수 있는 다른 성분을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 오일 조성물은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(w/w)의 추출된 식물 지질을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 추출된 오일은 또 다른 오일, 예컨대, 또 다른 공급원에 의해 생성되지 않는 DHA(예를 들면, 어류 오일로부터의 DHA)와 블렌딩되어 있지 않다. 한 실시양태에서, 추출 후, 올레산 대 DHA, 팔미트산 대 DHA, 리놀레산 대 DHA, 또는 총 ω6 지방산 대 총 ω3 지방산의 비는 온전한 종자 또는 세포에서의 상기 비에 비해 유의미하게 변경되어 있지 않다(예를 들면, 10% 또는 5% 이하의 변경). 또 다른 실시양태에서, 추출된 식물 오일은 올레산 대 DHA, 팔미트산 대 DHA, 리놀레산 대 DHA, 또는 총 ω6 지방산 대 총 ω3 지방산의 비를 온전한 종자 또는 세포에서의 상기 비에 비해 변경시키는 절차, 예컨대, 수소첨가 또는 분획화에 노출되지 않는다. 이 실시양태들의 추출된 식물 오일은 비-지방산 분자, 예컨대, 스테롤을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "오일"은 주로 지질을 포함하고 실온에서 액체인 조성물이다. 예를 들면, 본 발명의 오일은 바람직하게는 중량을 기준으로 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%의 지질을 포함한다. 전형적으로, 정제된 식물 오일은 오일 중의 지질의 중량을 기준으로 적어도 90%의 트리아실글리세롤(TAG)을 포함한다. 오일의 소수 성분, 예컨대, 디아실글리세롤(DAG), 유리 지방산(FFA), 인지질 또는 스테롤이 오일에 존재할 수 있다. NS-B50027-4로부터 유래한 식용 오일은 하기 특징들 중 하나 이상의 특징을 특징으로 할 수 있다: 적어도 약 7 중량%의 DHA 함량, 적어도 약 1 중량%의 DPA 함량, 적어도 약 0.4 중량%의 EPA 함량, 약 46 중량%의 올레산/시스-박센산 함량, 약 8.2 중량%의 리놀레산 함량, 적어도 약 19%의 ALA 함량, 약 21 중량%의 조합된 ALA/아라키드산/SDA 함량, 적어도 약 9%(% 중량 총 지방산)의 조합된 EPA/DPA/DHA 함량. 일부 실시양태에서, 조합된 EPA/DPA/DHA 함량은 약 16%이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방산"은 종종 긴 지방족 꼬리를 가진 포화 또는 불포화 카복실산을 지칭한다. 전형적으로, 지방산은 길이가 적어도 8개 탄소 원자, 예를 들면, 길이가 적어도 12개 탄소, 16개 탄소, 18개 탄소, 20개 탄소, 22개 탄소 또는 24개 탄소인 탄소-탄소 결합된 쇄를 가진다. 대부분의 천연 생성 지방산들은 그들의 생합성이 2개의 탄소 원자들을 가진 아세테이트를 사용하기 때문에 짝수의 탄소 원자를 가진다. 지방산은 유리 상태(에스테르화되지 않음); 에스테르화된 형태, 예컨대, 트리글리세라이드(TAG), 디아실글리세라이드(DAG), 모노아실글리세라이드의 부분; 아실-CoA(티오에스테르)-결합된 또는 또 다른 결합된 형태로 존재할 수 있다. 지방산은 인지질, 예컨대, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 또는 디포스파티딜글리세롤로서 에스테르화될 수 있다.
"포화 지방산"은 쇄를 따라 탄소-탄소 이중 결합(알켄) 또는 다른 기능성 기를 함유하지 않는다. 따라서, "포화"는 (카복실산[-COOH] 기와 별도로) 모든 가능한 탄소들에서 수소가 존재한다는 것을 의미한다. 다시 말해, 포화 지방산에서 지방산의 오메가(ω) 말단(n-말단으로서도 지칭됨)은 3개의 수소를 함유하고(-CH3), 쇄 내의 각각의 탄소는 2개의 수소를 함유한다(-CH2-). "총 포화물"은 전형적으로 조합된 퍼센트의 팔미트산(C16:0), 스테아르산(C18:0), 아라키드산(C20:0), 베헨산(C22:0) 및 테트라코산산(C24:0) 지방산을 지칭한다.
"불포화 지방산"은 탄소 쇄에서 적어도 하나의 알켄 기(-CH=CH-)를 포함한다는 점을 제외하고 포화 지방산과 유사한 골격을 공유한다. (알켄 기의 어느 한 측면에 결합된) 2개의 플랭킹 탄소 원자들은 시스 또는 트랜스 배열로 존재할 수 있다. "단일불포화 지방산"은 탄소 쇄에서 적어도 12개의 탄소 원자를 갖되 단지 1개의 알켄 기를 가진 지방산을 지칭한다. "다중불포화 지방산" 또는 "PUFA"는 탄소 쇄에서 적어도 12개의 탄소 원자들 및 적어도 2개의 알켄 기들을 가진 지방산을 지칭한다. "장쇄 다중불포화 지방산" 및 "LC-PUFA"는 탄소 쇄에서 적어도 20개의 탄소 원자들을 갖고 적어도 2개의 알켄 기를 가진 지방산을 지칭한다. "매우 긴 쇄 다중불포화 지방산" 및 "VLC-PUFA"는 탄소 쇄에서 적어도 22개의 탄소 원자들 및 적어도 3개의 알켄 기들을 가진 지방산을 지칭한다. LC-PUFA의 지칭은 VLC-PUFA를 포함한다. 통상적으로, 지방산의 탄소 쇄에서 탄소 원자의 수는 비분지된 탄소 쇄를 지칭한다. 탄소 쇄가 분지된 경우, 탄소 원자의 수는 측면 기에 존재하는 탄소 원자를 제외한다.
한 실시양태에서, LC-PUFA는 "ω3 지방산" 또는 "오메가-3 지방산"이다: 이것은 지방산의 메틸 말단으로부터 세 번째 탄소-탄소 결합에서 탈포화(알켄 기, 이중 결합 또는 C=C)를 가진다. 또 다른 실시양태에서, LC-PUFA는 ω6 지방산이다: 이것은 지방산의 메틸 말단으로부터 여섯 번째 탄소-탄소 결합에서 탈포화(알켄 기)를 가진다. Δ(또는 델타)를 사용하여 지방산 쇄에서 알켄의 위치에 주석을 달고, 이때 알켄의 위치는 지방산의 카복실산 말단에 대해 넘버링된다. 예를 들면, 리놀레산은 "시스-Δ9, 시스-Δ12 옥타데카디엔산" 또는 Δ9,12 옥타데카디엔산"으로서 표기될 수도 있다. 지방산은 "C:D" 지질 수에 대해 확인될 수도 있고, 이때 C는 탄소의 수이고, D는 탄소 골격에서 이중 결합의 수이다. 예를 들면, 아라키돈산은 지방산의 카복실산 말단으로부터 탄소 5, 8, 11 및 14에 위치하는 4개의 알켄 기들을 가진 20-탄소 쇄를 의미하는 20:4Δ5,8,11,14라는 주석이 달릴 수 있다. 20개의 탄소들이 존재하고 카복실산 말단으로부터 C14에서 알켄이 존재하는 경우, 메틸 말단으로부터 첫 번째 알켄이 C6에 있어야 하기 때문에, 이 명칭은 아라키돈산이 ω6 지방산이라는 것도 표시한다.
추가 실시양태에서, LC-PUFA는 아라키돈산(ARA, 20:4Δ5,8,11,14; ω6), 에이코사테트라엔산(ETA, 20:4Δ8,11,14,17; ω3), 에이코사펜타엔산(EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17; ω3), 도코사펜타엔산(DPA, 22:5Δ7,10,13,16,19; ω3) 또는 도코사헥사엔산(DHA, 22:6Δ4,7,10,13,16,19, ω3)으로 구성된 군으로부터 선택된다. LC-PUFA는 디호모-γ-리놀레산(DGLA) 또는 에이코사트리엔산(ETrA, 20:3Δ11,14,17; ω3)일 수도 있다. 본 실시양태에 따라 생성된 LC-PUFA는 전술된 LC-PUFA들 중 임의의 또는 모든 LC-PUFA의 혼합물일 수 있고, 다른 LC-PUFA, 또는 이 LC-PUFA들 중 임의의 LC-PUFA의 유도체를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 실시양태에서, ω3 지방산은 DHA; DPA 및 DHA; 또는 EPA, DPA 및 DHA 중 적어도 하나이다.
나아가, 상기 인지된 바와 같이, LC-PUFA 및 VLC-PUFA는 유리 지방산(에스테르화되지 않음), 에스테르화된 또는 또 다른 결합된 형태일 수 있다. 따라서, 본 실시양태의 LC-PUFA는 세포의 지질, 추출된 지질 또는 정제된 오일 중의 상기 형태들의 혼합물로서 존재할 수 있다. 적어도 하나의 실시양태에서, 오일은 적어도 75% 또는 적어도 85%의 트리아실글리세롤("TAG")을 포함하고, 이때 나머지는 다른 형태의 지질, 예컨대, 상기 언급된 형태의 지질로서 존재하고, TAG는 적어도 하나의 LC-PUFA를 포함한다. 그 후, 오일은 예를 들면, 유리 지방산을 방출시키기 위한 강염기를 사용한 가수분해, 또는 증류 등에 의해 더 정제될 수 있거나 처리될 수 있다.
따라서, "총 ω3 지방산", "총 ω3 지방산 함량" 등은 문맥에 따라 전형적으로 총 지방산 함량의 퍼센트로서 표현된, 추출된 지질, 오일, 재조합 세포, 식물 부분 또는 종자에 있는 모든 에스테르화된 ω3 지방산들 및 에스테르화되지 않은 ω3 지방산들의 합계를 지칭한다. 이 ω3 지방산은 ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 또는 DHA를 포함하고, 임의의 ω6 지방산 또는 단일불포화 지방산을 제외한다. "신규 ω3 지방산", "신규 ω3 지방산 함량" 등은 문맥에 따라 총 지방산 함량의 퍼센트로서 표현된, 추출된 지질, 오일, 재조합 세포, 식물 부분 또는 종자에 있는 모든 에스테르화된 ω3 지방산들 및 에스테르화되지 않은 ω3 지방산들(ALA를 제외함)의 합계를 지칭한다. 이 신규 ω3 지방산은 엘리트 이벤트 형질전환 구축물의 발현에 의해 본 실시양태의 세포, 식물, 식물 부분 및 종자에서 생성된 지방산이고, 존재하는 경우 SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 또는 DHA를 포함하나, ALA, 임의의 ω6 지방산 또는 단일불포화 지방산을 제외한다. 예시적 총 ω3 지방산 함량 및 신규 ω3 지방산 함량은 샘플 중의 지방산을 FAME로 전환시키고 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용하여 GC로 분석함으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 미국 오일종자 화학자 협회(AOCS) 방법 Celd-91을 참조한다.
유사하게, "총 ω6 지방산", "총 ω6 지방산 함량" 등은 문맥에 따라 총 지방산 함량의 퍼센트로서 표현된, 추출된 지질, 오일, 재조합 세포, 식물 부분 또는 종자에 있는 모든 에스테르화된 ω6 지방산들 및 에스테르화되지 않은 ω6 지방산들의 합계를 지칭한다. 존재하는 경우, "총 ω6 지방산"은 LA, GLA, DGLA, ARA, EDA 또는 ω6-DPA를 포함할 수 있고, 임의의 ω3 지방산 또는 단일불포화 지방산을 제외한다. "신규 ω6 지방산", "신규 ω6 지방산 함량" 등은 문맥에 따라 총 지방산 함량의 퍼센트로서 표현된, 추출된 지질, 오일, 재조합 세포, 식물 부분 또는 종자에 있는 모든 에스테르화된 ω6 지방산들 및 에스테르화되지 않은 ω6 지방산들(LA를 제외함)의 합계를 지칭한다. 이 신규 ω6 지방산은 엘리트 이벤트 전이유전자의 발현을 통해 본원에 기재된 세포, 식물, 식물 부분 또는 종자에서 생성된 지방산이고, GLA, DGLA, ARA, EDA 또는 ω6-DPA를 포함할 수 있으나, LA, 임의의 ω3 지방산 또는 단일불포화 지방산을 제외한다.
"절반-종자 분석"은 2개의 떡잎들 중 하나(절반-종자)에 대해 지방산 분석을 수행하는 절차이고, 분석 결과가 양성인 경우 제2 떡잎을 보유하는 남은 묘목은 식물을 형성하는 데 사용된다.
"단백질 함량"은 당분야에서 공지되어 있는 방법에 의해 측정될 때 성숙 전체 건조된 종자로부터의 오일 무함유 가루 또는, 예를 들면, 95% 또는 99%의 오일이 제거되어 있는 실질적으로 오일 무함유 가루 중의 단백질의 전형적인 중량 퍼센트이다. 예를 들면, 문헌(Daun et al., 2011; AOCS Official Meth. Ba 4e-93 Combustion Meth. Determination Crude Protein)을 참조한다.
종의 생장 또는 재생산 이외의 목적을 위해 상업적 재배자에 의해 생성된 성숙 종자는 종종 "곡물"로서 지칭된다.
숙련된 자가 인식할 바와 같이, 예를 들면, 본 실시양태의 과정에서 한 단계로서 용어 "식물 부분을 수득하는"은 이 과정에서 사용될 하나 이상의 식물 부분, 예컨대, 종자를 수득하는 것을 포함할 수 있다. 식물 부분을 수득하는 것은 예컨대, 기계 수확기로 식물로부터 식물 부분을 수확하거나, 식물 부분을 구입하거나, 공급자로부터 식물 부분을 제공받거나, 식물 부분을 수확한 다른 누군가로부터 식물 부분을 획득하여 식물 부분을 수득하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들면, NS-B50027-4 또는 NS-B50027-4의 자손으로부터 종자를 수득하는 것은 식물을 재배하는 것, 식물로부터 종자를 수확하는 것, 종자를 구입하는 것, 종자를 제공받는 것, 종자를 획득하는 것, 종자를 용기 내에 넣거나 종자를 저장하는 것, 또는 종자를 상이한 위치로 수송하는 것을 포함할 수 있다.
"모본의 본질적으로 모든 생리학적 및 형태학적 특징들"은 전환된 형질로부터 유래한 특징을 제외하고 반복친의 본질적으로 모든 생리학적 및 형태학적 특징들을 가진 식물을 지칭한다.
근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4
카놀라 계통 NS-B50027-4는 본원에 기재된 바와 같이 안정하고 균일한 육종 계통이다. 식물 유형의 균일성에 조심스럽게 주의를 기울이면서 NS-B50027-4를 육종하였고, 균일성에 대해 계속 관찰하면서 상기 계통을 증가시켰다. 호주 및 캐나다의 주요 카놀라 생장 지역 내의 10개 장소들에서 규제관청 허가 하에서 NS-B50027-4를 들판(field) 시험하였다. 작물학적 성능 평가를 다중 장소 들판 연구에서 수행하여, 특징, 예컨대, 출현, 묘목 생장력, 식물 높이, 도복 및 수확량을 측정하였다. 기회감염 질환 또는 곤충 스트레스요인뿐만 아니라 정상 표현형 특징에 대해서도 모든 들판 시험을 관찰하였다.
계통 NS-B50027-4는 잎, 꽃 및 장각과의 관점에서 호주 재배종 AV Jade(모본 동질유전자 계통)와 유사하고, 성숙 시 유사한 식물 높이 및 습성의 식물을 생성한다. 계통 NS-B50027-4는 흑갈병(렙토스패리아(Leptosphaeria))에 대한 허용 가능한 내성을 갖고, 전형적인 호주 카놀라 경작 환경에서 유사한 종자 수확 잠재력을 갖고, AV Jade와 비교될 때 성숙 시 종자 탈립 또는 식물 도복에 대한 증가된 성향을 보이지 않는다. 식물 해충 특징에 대한 DHA 카놀라와 AV Jade 사이에 관찰된 유의미한 차이는 없었고, NS-B50027-4 카놀라의 증가된 잡초 증식력을 야기할 수 있는 선택적 장점의 표시도 없었다.
LC-PUFA 형질 이외에, 계통 NS-B50027-4는 개화 단계에 도달하기 위한 약간 더 긴 시간에 의해 AV Jade와 구별될 수 있고, 이러한 면에서 호주 재배종 ATR Wahoo와 유사하다. NS-B50027-4는 특히 그의 종자에서 LC-PUFA, 구체적으로 LC-ω 지방산, 보다 구체적으로 DHA를 생성한다는 점에서 구별될 수 있다. 카놀라 계통 NS-B50027-4는 이 계통 NS-B50027-4에 대한 특허 출원 시 상업화된 임의의 다른 카놀라 재배종의 모본이 아니다.
근친교배 형질전환 카놀라 계통 NS-B50027-4는 (주로 2015년 동안 호주에서 8개의 상이한 위치들로부터 수집되고 평균 산출된 데이터에 기반을 둘 때) 하기 형태학적 및 생리학적 특징을 가진다:
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본 실시양태의 또 다른 양태는 NS-B50027-4 유래의 브라시카 또는 카놀라 식물, 또는 이들의 부분, 예컨대, 종자를 생성하는 방법으로서, 전술된 NS-B50027-4의 종자 또는 신규 브라시카 나푸스 계통의 종자를 수득하는 단계, 및 브라시카 또는 카놀라 생장 조건 하에서 상기 종자를 식물로 생장시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태는 전술된 NS-B50027-4의 종자 또는 브라시카 나푸스 계통의 종자를 수득하고 식물을 생장시키고 식물을 타가수분시키고 타가수분으로부터 성숙된 종자를 수득함으로써 하이브리드 종자를 수득하는 방법을 제공한다. 그 다음, 브라시카 식물 또는 카놀라 생장 조건 하에서 상기 종자를 재배하여 하이브리드 브라시카 또는 카놀라 식물, 또는 종자를 포함하는 이의 부분을 수득할 수 있다. 따라서, 또 다른 양태는 브라시카 나푸스 계통 NS-B50027-4(이 계통의 대표적인 종자는 ATCC® 수탁번호 PTA-123186 하에 기탁됨), NS-B50027-4의 하위계통, NS-B50027-4 또는 상기 하위계통의 자손, 또는 NS-B50027-4와 제2 브라시카 식물을 교배시킴으로써 생성된 식물을 생장시키는 방법으로서, 전술된 브라시카 NS-B50027-4 종자 또는 브라시카 나푸스 계통의 종자를 수득하는 단계, 및 브라시카 식물 생장 조건 하에서 상기 종자를 생장시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. NS-B50027-4를 생산하기 위한 자손, 하이브리드 및 유전자이입 하이브리드화에 대한 추가 양태는 본원에 기재되어 있다.
엘리트 이벤트
카놀라에서의 전이유전자의 표현형 발현은 전이유전자 카세트 그 자체의 구조 및 식물 게놈 내에서의 그의 삽입 위치 둘 다에 의해 결정된다: 식물 게놈 내의 특정 위치에서의 전이유전자의 존재는 전이유전자의 발현 및 식물의 전체 표현형에 영향을 미칠 수 있다. 식물 게놈 내로의 재조합 DNA 분자의 도입은 전형적으로 세포 또는 조직의 형질전환(또는 또 다른 유전자 조작)으로부터 비롯된다. 구체적인 도입 부위(들)는 우연히 생길 수 있거나 예정될 수 있다(표적화된 삽입 과정이 이용된 경우). 유전자 조작에 의한 식물 내로의 상업적으로 흥미로운 형질의 작물학적으로 또는 산업적으로 성공적인 도입은 상이한 요인들에 의존하는 긴 절차일 수 있다. 유전적으로 형질전환된 식물의 실제 형질전환 및 재생은 광범위한 유전자 특징규명, 육종 및 온실 또는 들판 시험에서의 평가를 포함하여, 궁극적으로 엘리트 이벤트의 선택을 이끌어내는 일련의 선택 단계들 중에서 첫 번째 단계일 뿐이다.
NS-B50027-4는 LC-PUFA, 구체적으로 LC-ω3 지방산, 보다 구체적으로 DHA를 생성하는 카놀라의 개발에 있어서 엘리트 이벤트로서 선택되었다. "엘리트 이벤트"는 전이유전자 구축물의 발현 및 안정성, 이러한 구축물을 포함하는 식물의 최적 작물학적 특징과의 적합성, 및 원하는 표현형 형질의 실현을 기반으로, 동일한 형질전환 DNA를 사용한 형질전환, 또는 이러한 형질전환에 의해 수득된 식물과의 역교배에 의해 수득된 이벤트 군으로부터 선택된 이벤트이다. 따라서, 엘리트 이벤트 선택에 대한 기준은 하기 내용들 중 적어도 하나, 유리하게는 전부이다:
(a) 전이유전자의 존재는 식물의 다른 원하는 특징, 예컨대, 작물학적 성능 또는 상업적 가치와 관련된 특징을 과도하게 손상시키지 않고;
(b) 이벤트는 안정하게 유전되는, 정의된 분자 배열을 특징으로 하고, 동일성 조절을 위해 상기 배열에 대한 적절한 진단 수단이 개발될 수 있고;
(c) 전이유전자 카세트 내의 관심 있는 유전자는 이벤트를 보유하는 식물이 정상 작물학적 사용에서 노출될 가능성이 높은 다양한 환경 조건들에서 상업적으로 허용 가능한 수준으로 정확하고 적절하고 안정한 공간적 및 시간적 표현형 발현을 보인다. 전이유전자는 더 원하는 상업적인 유전적 배경 내로의 유전자이입을 허용하는, 식물 게놈 내의 위치와 관련되어 있을 수도 있다.
엘리트 이벤트로서 이벤트의 상태는 엘리트 이벤트를 상이한 관련 유전적 배경 내로 유전자이입하고 기준, 예를 들면, 상기 (a), (b) 및 (c) 중 적어도 하나에 부합하는 지를 관찰함으로써 확인될 수 있다. 추가로, 자손이 두 이벤트들을 보유하도록 적합성, 보다 구체적으로 NS-B50027-4와 적어도 하나의 다른 이벤트를 보유하는 식물의 교배로부터 비롯된 자손을 기반으로 엘리트 이벤트의 선택을 결정할 수도 있다. 따라서, "엘리트 이벤트"는 상기 기준에 부합하는 형질전환 카세트(들)를 포함하는 유전자 좌위를 지칭한다. 식물, 종자, 식물 물질 또는 자손은 그의 게놈 내에 하나 이상의 엘리트 이벤트를 포함할 수 있다.
전이유전자의 발현은 (관심 있는 유전자들의 일부 또는 전부의 구조 및 기능에 기반을 둘 때) 형질전환 DNA의 도입으로 부여하고자 하는 하나 이상의 표현형 형질(예를 들면, LC-ω3 지방산의 생성)을 식물에 부여한다. 본 실시양태에서, 여러 전이유전자들이 형질전환된 식물에서 LC-ω3 지방산의 생성을 위한 생합성 경로를 제공한다.
본 실시양태의 한 양태는 NS-B50027-4 게놈 내의 발현 가능한 전이유전자의 놀라운 수의 카피에 관한 것이다. "발현 가능한"은 DNA 분자의 일차 구조, 즉 전이유전자의 코딩 서열이, 그 유전자가 활성 단백질을 코딩한다는 것을 표시한다는 것을 의미한다. 그러나, '유전자 침묵'이 생체 내에서 상동성 전이유전자 불활성화의 다양한 기작들을 통해 일어나기 때문에, 발현 가능한 코딩 서열은 발현되지 않을 수 있다. 상동성 전이유전자 불활성화는 유전자 및 전이유전자 둘 다가 하향조절되었다는 예상외의 결과와 함께, 전이유전자가 센스 배향으로 삽입되어 있는 식물에서 기재되었다(Napoli et al., 2 Plant Cell 279 (1990)). 상동성 유전자 서열의 불활성화에 대한 가능한 기작은 중복된 DNA 영역이 유전자 침묵을 위해 내생성 기작에 신호를 보내는 메틸화를 통한 전사 불활성화, 및 내생성 유전자 및 전이유전자 둘 다로부터의 mRNA의 조합된 수준이 메세지들 둘 다의 역치-유도된 분해를 유발하는 전사 후 침묵을 포함한다. 문헌(van Bokland et al., 6 Plant J. 861 (1994))을 참조한다. 그러나, 놀랍게도, NS-B50027-4에 여러 전이유전자들(이들 중 일부는 동일한 배향으로 배치되어 있음)의 적어도 3개 카피들이 존재할지라도, NS-B50027-4는 상승작용적 DHA 발현을 나타낸다.
브라시카 나푸스 엘(품종 AV Jade)로부터 재배된 초기 형질전환체들은 지방산 생성의 수준, 특히 EPA 및 DHA 수준에서의 넓은 변동을 나타내었다. 제2 세대 및 제3 세대의 경우, 선택은 주로 형질전환 종자의 DHA 및 EPA 함량을 기준으로 하였다. 일부 경우, 구체적으로 T2 또는 T3 세대의 경우, (1개의 식물로부터의 20개 내지 40개의 개별 종자들을 20개 내지 40개의 자손들로 생장시킨 후, 이 자손들의 개별 종자들의 DHA 및 EPA 함량을 측정함으로써 확인된) 분리 패턴도 흩어진 결과를 나타내었는데, 이것은 복잡한 또는 다중 카피 삽입이 일어났다는 것을 시사한다. 따라서, 식물의 초기 T2 또는 T3 세대들 중 대다수는 버렸다. 초기에, 형질전환 삽입체의 다중 카피들이 불안정한 형질전환체를 생산하였을 것이고, 상기 논의된 바와 같이 동형접합성 유전형에서 확인된 고전적인 유전자 침묵도 나타내었을 것이라는 결론을 내렸다. 따라서, 형질전환된 식물의 PCR 분석이 1 초과의 카피 수를 표시하는 경우, 형질전환체들은 종종 버려졌다.
놀랍게도, 엘리트 이벤트 NS-B50027-4는 안정한(그리고 기능적인) 다중 카피 이벤트, 즉 (거대한 팔린드롬(massive palindrome)과 유사한) 이원 (역위) 좌측 경계 대 우측 경계 방식으로 정렬된 2개의 8-유전자-T-DNA-접경 카세트들(7개의 효소들 및 마커를 코딩하는 각각 8-유전자 삽입체)을 포함하는 16-유전자 삽입; 및 별도의 보다 더 작은 4-유전자 카세트를 함유하는 것으로 발견되었고; 전이유전자 삽입체의 이 조합은 근친교배 계통 NS-B50027-4에서 DHA의 생성에 있어서 상승작용적으로 작용한다. 보다 구체적으로, 교배, 역교배 및 자가 교배의 조합은 16-유전자 삽입체를 염색체 A05로 분리하였고(NO5로서도 지칭됨), 4-유전자 삽입체를 염색체 A02로 분리하였다(N02로서도 지칭됨). 각각의 형질전환 염색체의 기여를 각각의 분리개체의 육종으로 확인하여, 각각의 이벤트의 순수한 동형접합성 계통을 수득하였다. 예를 들면, 한 실험에서, 16-유전자 삽입체를 포함하는 분리개체는 약 4% DHA를 생성하였고; 4-유전자 삽입체를 포함하는 분리개체는 DHA를 생성하지 않았으나; 분리개체들이 형질전환 염색체 A02 좌위와 형질전환 염색체 A05 좌위를 조합하도록 육종되었을 때, 상기 2개의 형질전환 삽입체들의 조합은 그의 종자에서 적어도 약 7% DHA 내지 적어도 약 14% DHA를 생성하는 식물을 제공하였다. 이 결과는 예상되지 않은 것이었다. 인지된 바와 같이, 엘리트 이벤트 NS-B50027-4의 희귀한 유전자 구성에도 불구하고, 계통은 지방산 생성에 있어서 안정하고 균일한 것으로 입증되었다.
본원에서 인지된 바와 같이, LC-PUFA에 대한 생합성 경로는 LC-PUFA의 발현 및 생성을 발생 종자로 한정하기 위한 종자 특이적 프로모터를 포함하였다. 종자 이외에, NS-B50027-4 전체 식물, 뿌리, 꽃 또는 다른 식물 조직(예를 들면, 꽃봉우리, 어린 장각과)에서 상기 7개의 전이유전자들 중 어느 전이유전자의 발현도 검출되지 않았다. 발생 종자에서, 형질전환 단백질은 가장 높은 함량부터 가장 낮은 함량까지 다음과 같이 존재하였고(ng/mg 총 단백질): Pavsa-Δ4D > Lack1-Δ12D > Picpa-ω3D > Micpu-Δ6D > Pavsa-Δ5D > Pyrco-Δ6E; Pyrco-Δ5E는 검출될 수 없었다. 성숙 종자에서, 형질전환 단백질은 가장 높은 함량부터 가장 낮은 함량까지 다음과 같이 존재한 반면(ng/mg 총 단백질): Pavsa-Δ4D > Lack1-Δ12D = Picpa-ω3D > Pavsa-Δ5D > Micpu-Δ6D > Pyrco-Δ5E; 반면, Pyrco-Δ6E는 검출될 수 없었다.
본 실시양태의 한 양태는 LC-PUFA 생합성 경로의 "전단부(front end)"의 일부 효소들을 발현하는 유전자 구축물의 다수의 카피를 가진 식물을 (예를 들면, 유전자 형질전환 또는 육종으로) 제공함으로써 식물에서 LC-PUFA를 증가시키는 방법을 제공한다. 문헌(Napier et al., 330 Biochem. J. 611 (1998))(N-말단 사이토크롬 b5 도메인, 및 3개의 고도로 보존된 히스티딘 상자를 가진 전형적인 지방산-데사투라제 도메인으로서 구조를 특징규명함)을 참조한다. 예를 들면, 효소 Δ6-데사투라제, Δ5-데사투라제, Δ5-일롱가제 및 ω3/Δ15-데사투라제(생합성 경로에서 2번, 3번, 5번 및 6번으로서 간주됨) 모두가 전단부 데사투라제로서 배타적으로 간주될 수 없을지라도, 특정 실시양태에서, 이 유전자들은 LC-PUFA, 예컨대, DHA의 생성을 향상시키는 인공 좌위로 조립된다. 특정 실시양태에서, 일부 전단부 유전자들을 포함하는 인공 좌위는 마이크로모나스 푸실라 유래의 Δ6-데사투라제, 피라미모나스 코르다타 유래의 Δ5-일롱가제, 파블로바 살리나 유래의 Δ5-데사투라제 및 피키아 파스토리스 유래의 Δ15/ω3-데사투라제를 포함한다. NS-B50027-4의 염색체 A02 상에서의 이 인공 좌위의 위치는 이 좌위를 식물 계통(분리개체)으로 분리시키는 수단을 제공하고, 보편적인 식물 육종 기법으로 이 좌위를 또 다른 식물 내로 유전자이입할 수 있게 한다.
오일 및 ω3 지방산
본 실시양태에 따라 카놀라 계통 NS-B50027-4 식물을 사용하여 NS-B50027-4 카놀라 종자로부터 상업적 양으로 ω3 및 LC-ω3 지방산을 생성할 수 있다. 따라서, 형질전환된 식물을 선택하고 증식시키는 기법은 NS-B50027-4의 유리한 형질, 즉 보편적인 방식으로 수확되고 관심 있는 조직, 예를 들면, 종자로부터 지방산이 추출된다는 점을 가진 복수의 식물들을 생산한다.
추가 실시양태에서, 추출된 식물 지질은 총 지방산 함량의 퍼센트로서 DHA의 수준을 증가시키도록 처리될 수 있다. 예를 들면, 처리는 유리 지방산을 생성하기 위한 에스테르화된 지방산의 가수분해, 또는 TAG 성분을 변형시키기 위한 트랜스에스테르화를 포함한다. 예를 들면, NS-B50027-4 또는 이의 자손의 종자로부터의 오일을 DHA 함량에 대해 농축할 수 있거나, 오일 중의 지방산을 알킬 에스테르, 예컨대, 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환시키도록 처리할 수 있고, 그 후 이 에스테르를 정제하거나 분획화하여 DHA에 대해 지질 또는 오일을 농축할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 처리 후 지질의 지방산 조성은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% DHA를 포함한다.
본 실시양태는 계통 NS-B50027-4로부터의 이 신규 브라시카 나푸스 계통의 자손 및 후손도 포함한다. 상기 자손 또는 후손은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 육종 또는 조직 배양 방법에 의해 발생될 수 있다. 예를 들면, 자손 또는 후손은 이 계통들에서 발생된 카놀라 지방산 프로파일을 함유할 수 있다. 따라서, 자손 또는 후손은 발생된 계통으로부터의 임의의 수의 유전자를 가질 수 있다. 상기 후손 또는 자손은 본원에서 제공된 카놀라 지방산 표현형을 제공하는 유전자만을 포함할 수 있거나 추가 유전자를 포함할 수 있다. 이것은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 분자 분석에 의해 확인될 수 있다.
한 양태는 NS-B50027-4의 표현형, 예를 들면, (총 지방산의 중량%로서) 적어도 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12% DHA, 약 13% DHA, 약 14% DHA, 약 15%, 약 16% DHA, 약 17% DHA, 약 18% DHA, 약 19% DHA, 약 20% DHA, 약 21% DHA, 약 22% DHA, 약 23% DHA, 약 24% DHA 또는 약 25% DHA 이상을 포함하는 DHA 종자 함량; 또는 예를 들면, 적어도 5% LC-PUFA, 약 6% LC-PUFA, 약 7% LC-PUFA, 약 8% LC-PUFA, 약 9% LC-PUFA, 약 10% LC-PUFA, 약 11% LC-PUFA, 약 12% LC-PUFA, 약 13%, 약 14% LC-PUFA, 약 15% LC-PUFA, 약 16% LC-PUFA, 약 17% LC-PUFA, 약 18% LC-PUFA, 약 19% LC-PUFA, 약 20% LC-PUFA, 약 21% LC-PUFA, 약 22% LC-PUFA, 약 23% LC-PUFA, 약 24% LC-PUFA 또는 약 25% LC-PUFA 이상의 LC-PUFA 지방산 함량(총 지방산의 중량%로서 EPA, DPA 및 DHA의 합계)을 가진 브라시카 종자, 예컨대, 브라시카 나푸스 또는 브라시카 준세아를 발생시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태는 본원에 기재된 식물로부터 생성된 분쇄된 브라시카 나푸스 종자(즉, NS-B50027-4로부터의 종자, 또는 NS-B50027-4의 적어도 하나의 좌위를 포함하는 자손으로부터의 종자)의 균질한 집단을 제공하는데, 이때 분쇄된 브라시카 나푸스 종자는 적어도 약 30 중량%, 약 35 중량%, 또는 약 36 중량% 내지 약 40 중량%의 총 지방산(%중량 종자)을 가진다. 특정 실시양태에서, 예를 들면, NS-B50027-4 종자, 또는 NS-B50027-4로부터의 적어도 하나의 좌위를 포함하는 자손으로부터 수득된 종자의 지방산 함량은 (총 지방산의 중량%로서) 적어도 5% DHA, 약 6% DHA, 약 7% DHA, 약 8% DHA, 약 9% DHA, 약 10% DHA, 약 11% DHA, 약 12% DHA, 약 13% DHA, 약 14% DHA, 약 15%, 약 16% DHA, 약 17% DHA, 약 18% DHA, 약 19% DHA, 약 20% DHA, 약 21% DHA, 약 22% DHA, 약 23% DHA, 약 24% DHA 또는 약 25% DHA 이상의 DHA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 예를 들면, NS-B50027-4 종자, 또는 NS-B50027-4로부터의 적어도 하나의 좌위를 함유하는 자손의 종자의 지방산 함량은 적어도 5% LC-PUFA, 약 6% LC-PUFA, 약 7% LC-PUFA, 약 8% LC-PUFA, 약 9% LC-PUFA, 약 10% LC-PUFA, 약 11% LC-PUFA, 약 12% LC-PUFA, 약 13%, 약 14% LC-PUFA, 약 15% LC-PUFA, 약 16% LC-PUFA, 약 17% LC-PUFA, 약 18% LC-PUFA, 약 19% LC-PUFA, 약 20% LC-PUFA, 약 21% LC-PUFA, 약 22% LC-PUFA, 약 23% LC-PUFA, 약 24% LC-PUFA, 약 25% LC-PUFA, 약 26% LC-PUFA, 약 27% LC-PUFA, 약 28% LC-PUFA, 약 29% LC-PUFA, 약 30% LC-PUFA, 약 31% LC-PUFA, 약 32% LC-PUFA 또는 약 33% 이상의 LC-PUFA(LC-PUFA는 총 지방산의 중량%로서 EPA, DPA 및 DHA의 합계임)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 예를 들면, NS-B50027-4 종자의 지방산 함량은 종자의 총 지방산의 중량%로서 적어도 약 18% ALA, 약 19% ALA, 약 20% ALA, 약 21% ALA, 약 22% ALA, 약 23% ALA, 약 24% ALA, 약 25% ALA 또는 약 26% ALA 이상의 ALA를 포함한다.
본원에 개시된 분쇄된 브라시카 나푸스 NS-B50027-4 종자의 균질한 집단, 또는 NS-B50027-4의 자손 또는 후손으로부터의 분쇄된 브라시카 나푸스 종자의 균질한 집단도 제공되고, 이때 상기 분쇄된 브라시카 나푸스 종자는 (총 지방산의 중량%로서) 적어도 5% DHA, 약 6% DHA, 약 7% DHA, 약 8% DHA, 약 9% DHA, 약 10% DHA, 약 11% DHA, 약 12% DHA, 약 13% DHA, 약 14% DHA, 약 15%, 약 16% DHA, 약 17% DHA, 약 18% DHA, 약 19% DHA, 약 20% DHA, 약 21% DHA, 약 22% DHA, 약 23% DHA, 약 24% DHA 또는 약 25% DHA 이상의 DHA 함량을 가진다. 이러한 분쇄된 종자로부터의 오일, 가루 및 단백질도 제공된다.
추가 실시양태에서, 추출된 식물 지질(예를 들면, 오일)은 총 지방산 함량의 퍼센트로서 DHA의 수준을 증가시키도록 처리될 수 있다. 예를 들면, 처리는 유리 지방산을 생성하기 위한 에스테르화된 지방산의 가수분해, 또는 트랜스에스테르화를 포함한다. 예를 들면, 오일 중의 지방산을 알킬 에스테르, 예컨대, 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환시키도록 카놀라 오일을 처리할 수 있고, 그 후 이 에스테르를 분획화하여, DHA에 대해 지질 또는 오일을 농축할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 농축 후 지질의 지방산 조성은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% DHA 또는 적어도 95% DHA를 포함한다.
또 다른 실시양태는 브라시카 나푸스 계통 NS-B50027-4(이 계통의 대표적인 종자는 ATCC® 수탁번호 PTA-123186 하에 기탁됨), NS-B50027-4의 하위계통, NS-B50027-4 또는 상기 하위계통의 자손, 또는 NS-B50027-4를 제2 브라시카 식물과 교배시킴으로써 생성된 식물로부터 오일 또는 가루를 생성하는 방법으로서, 브라시카 식물 생장 조건 하에서 전술된 브라시카 나푸스 식물을 생장시키는 단계; 종자를 수확하는 단계; 및 상기 종자로부터 오일, 가루 또는 단백질을 추출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 또 다른 실시양태는 브라시카 나푸스 계통 NS-B50027-4(이 계통의 대표적인 종자는 ATCC® 수탁번호 PTA-123186 하에 기탁됨), NS-B50027-4의 하위계통, NS-B50027-4 또는 상기 하위계통의 자손, 또는 NS-B50027-4를 제2 브라시카 식물과 교배시킴으로써 생성된 식물로부터 오일을 생성하는 방법으로서, 브라시카 나푸스 계통 NS-B50027-4(이 계통의 대표적인 종자는 ATCC® 수탁번호 PTA-123186 하에 기탁됨), NS-B50027-4의 하위계통, NS-B50027-4 또는 상기 하위계통의 자손, 또는 NS-B50027-4를 제2 브라시카 식물과 교배시킴으로써 생성된 식물의 종자를 분쇄하는 단계; 및 상기 종자로부터 오일을 추출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태는 NS-B50027-4 종자 또는 NS-B50027-4 유래의 자손 종자로부터의 오일뿐만 아니라 종자 가루 및 단백질도 제공한다. 식물 바이오매스로부터의 단백질 추출은 공지되어 있는 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Heney & Orr, 114 Anal. Biochem. 92 (1981))을 참조한다. NS-B50027-4 종자로부터의 가루는 적어도 일부 DHA 및 다른 ω3 지방산을 함유하기 때문에 특히 유리한 것으로 입증될 수 있다. 유사하게, NS-B50027-4 종자로부터의 단백질 분획은 적어도 일부 유리한 DHA 및 다른 ω3 지방산을 포함한다. 따라서, 또 다른 실시양태는 NS-B50027-4 종자 또는 NS-B50027-4 유래의 자손 종자의 종자로부터 수득된 종자 가루를 제공한다. 한 실시양태에서, 종자 가루는 NS-B50027-4 엘리트 이벤트를 포함한다. 유리하게는, 종자 가루는 종자에서 생성된 지질 또는 오일의 일부를 보유하고, 종자로부터 대부분의 지질 또는 오일을 추출한 후, 비록 더 낮은 수준일지라도 상기 종자로부터 종자 가루를 수득한다. 종자 가루는 식품, 예를 들면, 동물 사료의 성분 또는 식품 생산에서의 성분으로서 사용될 수 있다. 이 종자 가루 중의 ω3:ω6 지방산의 보다 더 높은 비를 고려해 볼 때, NS-B50027-4 종자의 가루는 다른 상업적으로 이용 가능한 종자 가루에 비해 더 우수한 영양을 제공할 수 있다.
상기 인지된 바와 같이, "지방산 함량" 또는 "지방산 조성"은 일반적으로 표준화된 면적으로서의 퍼센트 특정 지방산으로서; 공지된 표준물과 비교되어; 또는 종자의 그램당 지방산의 중량 비(예를 들면, mg DHA/g 종자)로서 계산된, 성숙 전체 부분적으로 건조된 종자(전형적으로 약 6% 또는 7% 수분을 함유함)의 내생적으로 형성된 오일에 존재하는 다양한 지방산들의 중량 퍼센트를 의미한다.
통상의 산업 관행은 절대적인 양보다는 오히려 면적 퍼센트(표준화된 면적)로서 지방산 조성을 보고한다. 예를 들면, 크로마토그래피는 종종 피크로서 데이터를 생성하고, 각각의 피크 하 면적은 적분되고 크로마토그램에서 지방산들에 대한 모든 피크 하 총 면적의 퍼센트로서 제시된다. 면적 퍼센트는 계산하기에 용이하고 마찬가지로 면적 퍼센트를 보고하는 다른 당업자에 의해 보고된 결과와 비교하기에 용이하다. 면적 퍼센트는 절대적인 값이 아니라, 허용 가능한 근사치를 제공한다. mg/kg 결과로서 절대적인 수확량은 예를 들면, 공지된 농도의 기준 표준물 및 내부 표준물을 포함시킴으로써 계산될 수 있다. 지방산의 질량 양을 계산하기 위해 보정 계수도 사용할 수 있다.
예를 들면, 지방산 함량을 측정하는 데 있어서, 종자를 분쇄하고, 오일 트리아실글리세라이드(TAG)를 추출한 후, 메탄올 및 나트륨 메톡사이드로 사포닌화 및 메틸화를 수행하거나 메탄올(Meth Prep II™, Fischer Scientific 카탈로그 #AT18007)에서 1.25% 3-(트리플루오로메틸)페닐-트리메틸-암모늄 하이드록사이드와 반응시켜 지방산 메틸 에스테르를 형성할 수 있다. 생성된 지방산 메틸 에스테르(FAME)는 불포화 정도 및 지방산 쇄 길이를 기준으로 FAME를 분리하는 모세관 컬럼을 이용하는 기체-액체 크로마토그래피(GLC)에 의해 분석될 수 있다. FAME는 예를 들면, GC, LC-MS, GC-MS, NMR 또는 근적외선 반사 분광법에 의해 분석될 수도 있다. 지방산 조성은 예를 들면, 종자 피막을 깨고 깨진 종자를 직접적으로 메틸화함으로써 전체 종자로부터 확인될 수도 있다. 총 지질은 분획, 예컨대, TAG 분획을 정제하기 위해 당분야에서 공지된 기법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들면, 구체적으로 TAG의 지방산 조성을 확인하기 위해 박층 크로마토그래피(TLC)를 분석 규모로 수행하여 다른 지질 분획, 예컨대, DAG, 아실-CoA 또는 인지질로부터 TAG를 분리할 수 있다. 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 다수의 다른 분석 기법들이 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Tinoco et al., 3 Anal. Biochem. 514 (1962); CANOLA: CHEMISTRY, PRODUCTION, PROCESSING & UTILIZATION (Daun et al., eds., AOCS Press, Urbana, IL, 2011) (Daun et al., 2011)); 미국 특허출원 공보 제2015/0166928호; 및 미국 특허출원 공보 제20160002566호를 참조한다.
NS-B50027-4 종자의 지질 또는 오일은 예를 들면, 유리 지방산 또는 인지질의 제거에 의해 TAG의 비율을 증가시키도록 정제될 수도 있거나 농축될 수도 있다. 적어도 하나의 실시양태에서, NS-B50027-4 종자의 지질은 오일의 형태로 존재하고, 이때 적어도 75 중량%, 적어도 80 중량%, 적어도 85 중량%, 적어도 90 중량%, 적어도 95 중량%, 적어도 98% 중량, 또는 약 95 중량% 내지 98 중량%의 지질이 TAG의 형태로 존재한다.
추가 실시양태에서, NS-B50027-4 종자(또는 이의 자손)으로부터의 지질은 총 지방산 함량의 퍼센트로서 DHA의 양을 증가시키도록 프로세싱된다. 예를 들면, 처리는 트랜스에스테르화를 포함할 수 있다. 예를 들면, 오일 중의 지방산을 알킬 에스테르, 예컨대, 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환시키도록 지질을 처리할 수 있고, 그 후 상기 에스테르를 분획화하여 DHA에 대해 지질 또는 오일을 농축할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 농축 후 지질의 지방산 조성은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% DHA를 포함한다. 유사하게, NS-B50027-4 종자로부터의 지질이 전형적인 카놀라보다 더 큰 비율의 ALA를 포함하기 때문에, NS-B50027-4 종자로부터의 지질은 ALA 함량에 대해 지질을 농축하도록 프로세싱될 수 있다. 추가로, 지방산은 본원에 기재된 지방산 조성을 가진 지방산들의 혼합물로 존재할 수 있거나, 지방산이 상기 혼합물의 적어도 40% 또는 적어도 90%의 지방산 함량을 포함하도록 농축될 수 있다. 한 실시양태에서, 지방산은 에스테르화되지 않는다. 대안적으로, 지방산은 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 기로 에스테르화된다.
NS-B50027-4의 종자로부터의 LC-PUFA ω3 지방산 오일은 높은 올레산 함량을 통해 안정성을 DHA 및 다른 LC-PUFA에 부여하는 것으로 주장된 오일보다 더 낮은 올레산 함량을 가짐에도 불구하고 놀라운 안정성을 나타낸다. 보다 구체적으로, LC-PUFA ω3 지방산은 악명높게 불안정하고 산화에 특히 민감하다. LC-PUFA 및 LC-PUFA를 함유하는 식품의 저장 수명을 연장하기 위해 캡슐화, 다른 오일, 특히 올레산 함량이 높은 오일과의 블렌딩, 또는 항산화제의 첨가가 요구된다는 것은 당분야에서 이해된다. 그러나, 이러한 처리의 결여에도 불구하고, 증거는 분쇄된 NS-B50027-4 종자로부터 추출된 오일이 실온에서 수개월 동안 신선도를 유지한다는 것을 암시한다. 추가로, NS-B50027-4 오일의 영양소, 예컨대, 파이토스테롤, 비타민 E, 비타민 K1, β-카로텐 및 미네랄의 수준은 다른 상업적 카놀라 오일의 천연 범위 내에 속한다. NS-B50027-4로부터 수득된 오일에서 발견된 검출 가능한 수준의 바람직하지 않은 물질, 예컨대, 살충제, 마이코톡신 또는 다중방향족 탄화수소는 없었다. 추가로, 식물 DNA는 NS-B50027-4로부터 수득된 오일에서 검출되지 않았다.
본 실시양태의 또 다른 양태는 인간 및 비-인간 동물을 위한 영양 보충제 및 식품에서 사용하기 위한 DHA 및 LC-PUFA의 공급원을 제공한다. 구체적으로, NS-B50027-4 종자로부터의 오일은 수산양식에서 사용하기 위한 DHA 및 LC-PUFA의 지속 가능한 공급원을 제공한다. 어류에 대한 높은 전세계적 수요 및 이로 인한 바다의 남획으로 인해, 해양 및 담수 수산양식의 중요성은 증가하고 있다. 예를 들면, 문헌(Betancor et al., 4 Sci. Rep. 8104 (2014))을 참조한다. 예를 들면, 연어과 어류의 양식 및 소비는 지난 20년 동안 현저히 증가하였다. 그러나, 야생 어류의 식습관은 수산양식되는 그들의 동료 종들의 식습관과 매우 상이하다. 실제로, 수산양식은 핵심 식이 영양소, 예컨대, 어류 가루 및 어류 오일을 제공하기 위해 해양 포획 어장에 여전히 많이 의존한다. 사실상, 어류 오일은 수산양식에서 ω3 LC-PUFA의 주요 공급원이다. 해양 어류 오일이 급격히 성장하는 어류 양식 산업(해마다 5% 내지 10%)에 대한 제한 인자를 포함하기 때문에, 수산양식 상용사료는 동물 유래의 오일 이외에 매우 다양한 대안적 식물 기제 성분들, 예컨대, 콩류 종자, 오일종자 케이크, 잎 가루, 및 식물성 오일의 증가하는 부분을 함유한다. 전통적으로 LC-PUFA에서 낮은 식물성 오일로 어류 오일을 대체한다는 것은, 일부 오일, 예컨대, 아마씨 오일이 어류에서 제한된 정도로만 LC 대사물질로 전환될 수 있는 양의 ALA를 함유할지라도, 보다 더 적은 LC-PUFA가 어류 상용사료에서 이용될 수 있다는 것을 의미한다. 일반적으로, 현재 어류 사료 중의 식물성 오일은 어류에서의 FA 분포에 유해한 효과를 가질 수 있고, ω3/ω6 비를 변경시킬 수 있고 어류 살코기에서 총 LC-PUFA를 감소시킬 수 있다.
예를 들면, 전형적인 식물성 오일은 주로 리놀레산(C18:2 ω6; LA)으로서 다량의 ω6 PUFA를 함유한다. 모본 계통 AV Jade로부터의 오일은 0.016의 DHA:LA 비를 갖고; NS-B50027-4로부터의 오일은 0.908의 DHA:LA 비를 가진 양식된 연어로부터의 오일에 비해 1.048의 DHA:LA 비를 가진다(Strobel et al., 11 Lipids Health Dis. 144 (2012)). 흥미롭게도, NS-B50027-4로부터의 ω3 FA의 비는 심혈관 질환 및 이상지혈증과 관련된 포화 지방산인 팔미트산의 경우 특히 유리하다(Diet, Nutrition & Prevention of Chronic Dis., WHO Tech. Rep. Series 916, Report of a Joint WHO/FAO Expert Consultation, 88 (World Health Organization, Geneva, 2003)). 모본 계통 AV Jade로부터의 오일은 DHA를 갖지 않고; NS-B50027-4로부터의 예시적 오일은 약 2.12의 DHA:팔미테이트 비를 갖고; 양식된 연어로부터의 오일에 비해, 약 0.59의 DHA:팔미테이트 비를 갖고; 야생 연어로부터의 오일은 약 1.028의 DHA:팔미테이트 비를 가진다(Strobel et al., 2012). LC-PUFA를 포함하는, 수산양식에서 사용할 식품의 제조는 당분야에서 공지되어 있다. 문헌(Betancor et al., 2014; Petrie et al., 9 PLOS ONE 1, 2014; Tocher, 449 Aquaculture 94 (2015))을 참조한다.
따라서, 본 실시양태의 범위는 수산양식 사료를 위한 ω3 지방산의 공급원으로서 NS-B50027-4로부터의 오일의 사용, 및 NS-B50027-4 및 이의 자손으로부터 수득된 오일을 포함하는 수산양식 사료를 포괄한다. NS-B50027-4로부터 수득된 오일을 사용한 연구는 이 오일이 담수 연어(2 그램 내지 25 그램의 연어새끼)에게 제공된 사료에 포함되기에 안전하고 NS-B50027-4 오일 함유 사료로부터의 EPA 및 DHA가 연어 살코기 내로 도입되었다는 것을 보여주었다.
또 다른 양태에서, 본 실시양태는 NS-B50027-4의 지질, 오일, 지방산, 종자, 종자 가루, 단백질, 세포, 오일종자 식물 또는 식물 부분 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약학, 식품 또는 농업 용도에 적합한 담체, 종자 처리 화합물, 비료, 또 다른 식품 또는 식품 성분, 또는 첨가된 단백질 또는 비타민을 추가로 포함한다. 도 4는 가능한 프로세싱 단계, 다양한 과정 단계들로부터의 생성물 또는 분획, 및 이러한 분획 또는 생성물에 대한 제안된 용도의 도표를 제공한다.
NS-B50027-4로부터 수득된 지질 또는 오일, NS-B50027-4로부터 수득된 지방산, NS-B50027-4로부터 수득된 세포, 오일종자 식물, 종자 가루, 또는 NS-B50027-4로부터 수득되거나 유래한 다른 조성물 중 하나 이상을 포함하는 식품, 화장품 또는 화학물질도 제공된다. 또 다른 양태는 식품을 생성하는 방법으로서, NS-B50027-4 또는 이의 자손의 지질 또는 오일, NS-B50027-4 또는 이의 자손의 지방산, NS-B50027-4 또는 이의 자손의 세포, 식물 부분, 종자, 종자 가루, 오일종자 식물, 또는 NS-B50027-4 또는 이의 자손으로부터 수득되거나 유래한 이 조성물들 중 임의의 조성물을 포함하는 또 다른 조성물 중 하나 이상을 적어도 하나의 다른 식품 성분과 혼합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 식품을 블렌딩하거나, 요리하거나, 굽거나, 압출하거나, 유화시키거나 다른 방식으로 제형화하거나, 식품을 포장하거나, 식품 중의 지질 또는 오일의 양을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 예상된 식품은 본원에 개시된 방법, 세포, 식물 또는 종자의 이용에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 생성된 오일, 지질, 지방산 에스테르 또는 지방산, 즉 NS-B50027-4 종자로부터의 오일, 또는 NS-B50027-4로부터의 적어도 하나의 좌위를 포함하는, NS-B50027-4로부터 유래한 자손으로부터 수득된 종자로부터의 오일을 포함한다. 식품은 체내로 흡수될 때 조직에 영양소를 공급하거나 조직을 구축하거나, 에너지를 공급하거나; 대사 작용에 적합한 영양 상태를 유지하거나, 회복시키거나 뒷받침하는, 인간 또는 동물 소비용 식품 또는 제제를 포함한다. 식품은 유아 또는 소아용 영양 조성물, 예를 들면, 유아식 및 종자 가루를 포함한다. 식품은 식품 첨가제, 예컨대, 영양 보충제도 포함한다. 추가로, 식품은 특정 용도에 적합한 양으로 식용 다량영양소, 단백질, 탄수화물, 비타민 또는 미네랄을 포함할 수 있다. 이 성분들의 양은 조성물이 정상 개체에게 사용되기 위한 것인지 아니면 특별한 필요성을 가진 개체, 예컨대, 대사 장애 등을 앓고 있는 개체에게 사용되기 위한 것인지에 따라 달라진다. 식품은 고체, 액체, 겔 또는 에멀전 형태로 존재할 수 있다. 식품은 임의의 적합한 목적을 위한 임의의 유형의 식품에 첨가될 수 있다. 즉, 식품이 영양 목적을 위해서만 첨가될 필요는 없다.
본원에서 예상된 식품은 NS-B50027-4의 종자, 또는 NS-B50027-4로부터의 적어도 하나의 좌위를 포함하는, NS-B50027-4로부터 유래한 자손의 종자로부터의 분쇄된 카놀라, 카놀라 종자 가루, 또는 이들로부터 프로세싱된 단백질(즉, 가루, 케이크 또는 가루 단백질)도 포함한다. 특정 고가치 제조 사료에서의 카놀라 가루의 현재 사용은 항-영양 인자, 고섬유 함량, 한정된 소화율, 및 ω3-FA 또는 LC-PUFA의 부재, 또는 단백질의 저밀도 공급원을 포함하는 다양한 문제점들로 인해 종종 제한된다. 카놀라 단백질을 농축하기 위해 카놀라 종자의 가루 케이크 분획을 프로세싱하는 것은 NS-B50027-4 또는 이의 자손의 종자로부터 수득된 카놀라 단백질이 어류가루, 카놀라 가루, 대두 가루 또는 대두 단백질 농축물, 및 다양한 다른 널리 사용되는 사료 성분들에 적합한 대체물을 제공한다. 예를 들면, 새우는 10개의 필수 아미노산을 요구한다. 카놀라는 새우에 적합한 아미노산 균형을 가진다. 4개의 지방산들은 새우를 위해 필수적이다: LA, ALA, 및 보다 중요하게는 EPA 및 DHA. ω3 지방산 대 ω6 지방산의 비는 새우 사료에서도 중요하고, 이때 최적 ω3:ω6 비는 약 2.5이다. 4.5% 내지 4.5%의 총 지질 사료 포함이 최적인 것으로 간주된다. 일부 오일을 본원에 기재된 카놀라 계통으로부터의 가루 유래 단백질에 포함시키는 것은 유리한 것으로 입증될 것이다. 더욱이, 새우를 위한 겉보기 미정제 단백질 소화율은 80% 이상으로 높고; 역사적으로, 연구는 식물로부터의 단백질은 어류 가루로부터 유래한 단백질보다 더 낮은 소화율을 가진다는 것을 시사하였다. 본원에 기재된 카놀라로부터의 케이크 가루로부터 프로세싱된 단백질의 단백질 분획화 및 농축을 통해, 소화율은 어류 가루와 거의 일치할 것으로 예상되고 현재의 카놀라 가루보다 더 우수할 수 있다. 이러한 단백질 생성물은 수산양식 및 육상 동물용 사료에서 어류 가루에 대한 중요한 대체물도 제공할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 NS-B50027-4는 PUFA, 예컨대, ω3 지방산 또는 DHA로부터 이익을 얻을 상태를 치료하거나 예방하는 방법으로서, NS-B50027-4로부터 수득된 지질 또는 오일, NS-B50027-4로부터 수득된 지방산, NS-B50027-4로부터 수득된 세포, NS-B50027-4로부터 수득되거나 유래한 오일종자 식물, 종자 가루 또는 다른 조성물 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태는 PUFA의 에틸 에스테르를 포함하는 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있는 약물을 제조하는 방법으로서, NS-B50027-4의 지질 또는 오일, NS-B50027-4의 지방산, NS-B50027-4에 따른 세포, NS-B50027-4의 오일종자 식물, NS-B50027-4의 식물 부분, NS-B50027-4의 종자, NS-B50027-4의 종자 가루, 또는 NS-B50027-4 또는 이의 자손으로부터 수득되거나 유래한 이 조성물들 중 임의의 조성물을 포함하는 또 다른 조성물 중 하나 이상을 혼합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 대상체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다.
ω3 지방산으로부터 이익을 얻을 수 있는 상태의 예로는 상승된 혈청 트리글리세라이드 수준, 상승된 혈청 콜레스테롤 수준, 예컨대, 상승된 LDL 콜레스테롤, 심장 부정맥, 고혈압, 관상 심장 질환, 혈관성형술 후 재협착증, 염증, 천식, 류마티스성 관절염, 궤양성 결장염, 크론병, 건선, 습진 혈소판 응집, 위장 출혈, 자궁내막증, 월경전 증후군, 신장 결석, 치명적 알코올 증후군, 주의력 결핍 과다행동 장애, 단극성 우울증, 양극성 우울증, 공격적 적대감, 조현병, 부신백질이영양증, 고혈압, 당뇨병, 비만, 골다공증, 알츠하이머병, 만성 폐쇄성 폐 질환, 다발성 경화증, 낭성 섬유증, 페닐케톤뇨증, 근통성 뇌척수염, 후천성 면역결핍 장애, 바이러스 감염 후 만성 피로, 암 또는 안 질환이 있다.
약물의 제조는 본원에 예시된 상태의 치료를 위해 NS-B50027-4로부터 수득된 오일을 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 오일을 정제하거나, 오일을 트랜스에스테르화하거나 분획화하여 DHA의 수준을 증가시키는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 오일 중의 지방산을 알킬 에스테르, 예컨대, 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환시키도록 지질 또는 오일을 처리하는 단계를 포함한다. 추가 처리, 예컨대, 분획화 또는 증류를 적용하여 DHA에 대해 지질 또는 오일을 농축할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 약물은 DHA의 에틸 에스테르를 포함한다. 약물 중의 DHA의 에틸 에스테르의 수준은 약물, 또는 약물의 지방산 성분의 약 30% 내지 약 50%, 또는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%일 수 있다. 약물은 예컨대, 약물 중의 총 지방산 함량의 약 30% 내지 50%, 또는 적어도 90%의 수준으로 EPA 또는 DPA의 에틸 에스테르를 추가로 포함할 수 있다. 약물은 ω3 지방산 함량이 약물 중의 총 지방산 함량의 약 30% 내지 약 50%, 또는 적어도 90%이도록 ALA, EPA 또는 DPA의 에틸 에스테르를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약물은 건강관리 전문가에 의해 확인된 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기에 적합하다. 지방산을 포함하는 약학 조성물의 제형화는 당분야에서 공지되어 있다. 추가로, 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이, ω3 지방산, 특히 ω3 LC-PUFA, 예컨대, EPA, DPA 또는 DHA의 최소량인 일당 약 300 mg이 바람직하나, 건강관리 전문가에 의해 권장될 때 일당 0.1 mg 내지 20 g 또는 더 많은 용량의 특정 지방산이 적절할 수 있다.
추가로, NS-B50027-4로부터 수득된 오일은 미용 목적을 위해 사용될 수 있다: 상기 오일은 혼합물이 형성되도록 기존 미용 조성물에 첨가될 수 있거나, 본원에 기재된 바와 같이 생성된 지방산은 미용 조성물 중의 "활성" 성분으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허출원 공보 제2008/0241082호를 참조한다.
추가로, 당분야에서 관례적으로 실시되는 기법을 이용하여, 주로 NS-B50027-4의 종자에서 생성된 오일을 추출하고 프로세싱하고 분석할 수 있다. 오일은 냉압착, 수성 처리 또는 보다 더 전형적인 프로세싱에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Mansour et al., 6 Nutrients 776 (2014)); 및 미국 특허 제6,599,513호를 참조한다. 예를 들면, (예를 들면, 나사 프레스를 통해) NS-B50027-4 종자를 냉압착시킬 수 있고 오일을 여과할 수 있고; 남은 가루 케이크를 헥산으로 추출하여 분쇄된/압착된 카놀라 종자로부터 추가 오일을 수득할 수 있다.
프로세싱된 식품 제조에서, 예를 들면, 카놀라 종자를 굽고 압착시키고 추출하여 미정제 오일을 생성한 후, 이 오일을 탈검하고 정련하고 표백하고 탈취시킨다. 질소 대기 하에서 다양한 단계들을 수행할 수 있다. 일반적으로, 종자를 분쇄하는 기법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, (필요한 경우) 물을 분무하거나 물에 담금으로써 종자 수분 함량을 예를 들면, 7% 내지 8.5%까지 증가시킴으로써 오일종자를 불릴 수 있다. 예를 들면, 0.23 내지 0.27 mm의 갭 설정을 가진 매끄러운 롤러를 이용하여 불린 종자를 박편으로 만든다. 가열을 적용하여 효소를 불활성화시키고 세포를 파괴하고 오일 소적을 유착시키고 단백질 입자를 응집시킬 수 있다. 프로세싱된 종자 가루("케이크") 및 압착된 미정제 오일을 생산하는 나사 프레스에 통과시켜 압착시킴으로써 종자 오일의 대부분을 방출한다. 압착 작업에 의해 생성된 미정제 오일을, 홈붙이 와이어 배수 상부를 가진 침전 탱크에 통과시켜 정화함으로써, 압착 작업 동안 오일과 함께 짜진 고체를 제거할 수 있다. 이 정화된 오일을, 플레이트 및 프레임 필터를 통해 유동시켜, 임의의 남아 있는 미세한 고체 입자를 제거할 수 있다. 나사 프레스로부터 배출된 케이크는 상당한 오일을 종종 함유하고, 예를 들면, 열 추적 컬럼을 이용하여, 예를 들면, 헥산으로 상기 오일을 용매 추출하여 종자 가루로부터 추가 오일을 수득할 수 있다. 일단 용매가 케이크로부터 수득된 미정제 오일로부터 분리되면, 압착되고 추출된 오일을 조합하고 추가 오일 프로세싱 절차로 처리할 수 있다. 예를 들면, 추출된 지질 또는 오일을 하나 이상의 프로세싱 단계로 처리하여, 지질/오일 성분의 순도를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 정제 단계는 추출된 미정제 오일을 탈검, 탈취, 탈색, 건조, 분획화, 또는 항산화제(예를 들면, 혼합된 토코페롤)를 사용한 강화 중 적어도 하나로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
탈검은 오일을 정련하는 데 있어서 초기 단계이고, 총 추출된 지질의 약 1% 내지 2%로서 존재할 수 있는 대부분의 인지질을 오일로부터 제거하는 데 주로 기여한다. 전형적으로 2% 인산을 함유하는 물을 70℃ 내지 80℃의 미정제 오일에 첨가하여 대부분의 인지질, 미량 금속, 안료 및 불용성 레시틴을 분리한다. 탈검은 농축된 인산을 미정제 종자오일에 첨가하여 수화 불가능한 포스파타이드를 수화 가능한 형태로 전환시키고 존재하는 소량의 금속을 킬레이팅함으로써 수행될 수도 있다. 고무는 원심분리에 의해 종자오일로부터 분리된다.
종종 중화로서도 지칭되는 알칼리 정련은 통상적으로 탈검 후, 및 탈취 및 표백 전에 수행된다. 보다 구체적으로, 탈검 후, 종자오일을 충분한 양의 알칼리 용액으로 적정하여 유리 지방산 및 인산을 중화시키고, 트리글리세라이드 분획을 분리한다. 적합한 알칼리성 물질은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 수산화리튬, 수산화칼슘, 탄산칼슘 및 수산화암모늄을 포함한다. 비누를 원심분리로 제거하거나 비누용 용매 내로의 추출로 제거하고, 중화된 오일을 물로 세척한다. 요구된 경우, 오일 중의 임의의 과량의 알칼리를 적합한 산, 예컨대, 염산 또는 황산으로 중화할 수 있다.
일부 식물 오일, 예컨대, 대두유는 탈검과 중화의 조합에 의해 프로세싱된다. 수화 불가능한 포스파타이드의 컨디셔닝을 위해, 소량의 인산 또는 구연산을 미정제 비-탈검 오일에 첨가한다. 집중적인 혼합 후, 희석된 가성 소다(7% 및 12%)를 첨가하여 유리 지방산을 중화시킨다. 적절한 물은 가성 소다의 존재 하에서 포스파타이드를 수화시킨다. 보유 혼합기에서의 반응 시간 후, 오일을 가열하고 분리기로 직접 보내어 솝스톡(soapstock)을 분리한다. 중성 오일을 약 3% 내지 10%의 물로 세척하여 잔류 비누 함량을 감소시키고, 혼합물을 세척수와 오일로 분리한다. 오일의 잔류 습도를 진공 건조기 내에서 감소시킨다.
탈취는 전형적으로 종자오일 100 ㎖당 약 0.1 ㎖/분의 속도로 증기를 종자오일 내로 도입함으로써 달성되는, 고온(200℃ 내지 260℃) 및 저압(0.1 내지 1 mmHg)에서의 오일 및 지방의 처리이다. 약 30분의 이러한 스파징(sparging) 후, 종자오일을 진공 하에서 냉각시킨다. 종자오일을 전형적으로 유리 용기로 옮기고, 냉장 하에서 저장하기 전에 아르곤으로 씻어낸다. 이 처리는 종자오일의 색상을 개선하고, 임의의 남은 유리 지방산, 모노아실글리세롤 또는 산화 생성물을 비롯한 대부분의 휘발성 또는 방향성 화합물을 제거한다.
표백은 표백토(예를 들면, TRISYL® Silicas, W.R. Grace & Co., 미국 메릴랜드주 콜롬비아 소재)의 존재(예를 들면, 0.2% 내지 2.0%) 하에서 및 (질소 하에서 또는 진공 하에서 작동시킴으로써) 산소의 부재 하에서 10분 내지 30분 동안 90℃ 내지 120℃에서 오일을 가열하는 정련 과정이다. 이 단계는 원치 않는 안료(카로테노이드, 클로로필, 고시폴 등)뿐만 아니라 산화 생성물, 미량 금속, 황 화합물 및 비누의 미량물질도 제거한다. "RDB 오일"은 정련되고 탈취되고 표백된 오일을 지칭한다.
동결방지처리는 주위 온도 미만의 온도에서 결정화함으로써 오일 및 지방을 고체(스테아린) 및 액체(올레인) 분획으로 분리하기 위해 오일의 상업적 생산에서 종종 사용되는 과정이다. 일부 식물성 오일, 예컨대, 해바라기유 또는 옥수수유는 저온에서 결정화하고 오일에서 혼탁도를 야기하는 왁스(장쇄 지방 알코올의 에스테르 및 지방산 에스테르)를 함유한다. 중화와 조합된 습식 동결방지처리는 이 왁스를 제거하는 데 적합하다. 이 과정은 처음에 고체 무함유 생성물을 생성하기 위해 면실유에 적용되었고, 오일의 포화 지방산 함량을 감소시키는 데에도 이용될 수 있다.
트랜스에스테르화는 TAG 내에서 및 사이에서 지방산을 교환하거나 지방산을 또 다른 알코올에게 전달하여 에스테르를 형성하는 과정이다. 이것은 처음에 지방산을 유리 지방산으로서 TAG로부터 방출시키는 단계를 포함할 수 있거나, 지방산 에스테르, 예컨대, 지방산 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르를 직접적으로 생성할 수 있다. 알코올, 예컨대, 메탄올 또는 에탄올을 사용한 TAG의 트랜스에스테르화 반응에서, 알코올의 알킬 기는 TAG의 아실 기(DHA를 포함함)와 에스테르 결합을 형성한다. 분획화 과정과 조합될 때, 트랜스에스테르화를 이용하여 지질의 지방산 조성을 변형시킬 수 있다(Marangom et al., 6 Trends Food Sci. Technol. 329 (1995)). 트랜스에스테르화는 화학적 수단(예를 들면, 강산 또는 강염기에 의한 촉진), 또는 효소적 수단을 이용할 수 있고, 효소적 수단은 TAG의 지방산에 위치 특이적(sn-1/3 또는 sn-2 특이적)일 수 있거나 다른 지방산들에 비해 일부 지방산들을 선호하는 리파제를 사용한다(Adamczak, 13 Pol. J. Food Nutr. Sci. 3 (2004); Ferreira-Dias Elec. 16 J. Biotechnol. (2013)).
대안적으로, 정제 단계는 총 지방산 함량의 퍼센트로서 DHA 함량을 증가시키도록 지질 또는 오일의 지방산 함량을 변경시키는 트랜스에스테르화 과정 또는 다른 과정을 피할 수 있다. 즉, NS-B50027-4 또는 이의 자손의 종자로부터 수득된 정제된 지질 또는 오일의 지방산 함량/프로파일은 정제되지 않은 지질 또는 오일의 지방산 함량/프로파일과 본질적으로 동일할 수 있다.
임의적으로, 오일에서 LC-PUFA의 농도를 증가시키기 위한 지방산 분획화는 당분야에서 공지되어 있는 방법들 중 임의의 방법, 예를 들면, 동결 결정화, 우레아를 사용한 복합체 형성, 분자 증류, 초임계 유체 추출, 반대 전류 크로마토그래피 및 은 이온 복합체형성에 의해 달성될 수 있다. 우레아를 사용한 복합체 형성은 오일에서 포화 지방산 및 단일불포화 지방산의 수준을 감소시키는 데 있어서 그의 단순성 및 효율 때문에 바람직한 방법이다(Gamez et al., 36 Food Res. Int'l 721 (2003)). 처음에, 리파제, 또는 산 또는 염기 촉진 반응 조건 하에서의 가수분해로 오일의 TAG들을 종종 지방산 에스테르의 형태로 그들의 성분 지방산으로 분할하고, 이때 과량의 알코올을 사용하여 1 몰의 TAG를 적어도 3 몰의 알코올(예를 들면, 에틸 에스테르의 경우 에탄올 또는 메틸 에스테르의 경우 메탄올)과 반응시켜, 형성된 알킬 에스테르 및 형성된 글리세롤의 분리를 가능하게 한다. 유리 지방산 또는 지방산 에스테르는 통상적으로 상기 처리에 의해 지방산 조성에서 변경되지 않고, 나중에 복합체 형성을 위해 우레아의 에탄올성 용액과 혼합될 수 있다. 포화 지방산 및 단일불포화 지방산은 우레아와 용이하게 복합체를 형성하고 냉각 시 결정화하고, 나중에 여과에 의해 제거될 수 있다. 이로써, 완성된 비-우레아 분획에는 LC-PUFA가 풍부하다.
상기 인지된 바와 같이, 다양한 또는 다수의 단계들을 질소, 다른 불활성 대기 또는 진공 하에서 실시할 수 있고, NS-B50027-4 또는 이의 자손의 종자로부터 수득된 원하는 오일 또는 지질을 질소, 불활성 기체 또는 진공 하에서 포장하여 산화를 피할 수 있다.
마찬가지로 본원에서 인지된 바와 같이, NS-B50027-4 또는 이의 자손으로부터 수득된 종자로부터의 분쇄된 카놀라, 종자 가루, 또는 이들로부터 프로세싱된 단백질(즉, 가루, 케이크 또는 가루 단백질)은 식품 또는 사료용으로 사용될 수 있다. DHA 함량이 높은 압착된 케이크는 오일 함량이 높은 케이크로서 사용될 수 있거나, 가루를 제조하기 위해 헥산에 의해 탈지될 수 있다. 헥산으로 처리된 가루는 전형적으로 탈용매화되고 노르스름하게 구워진다(DT-가루).
NS-B50027-4 및 이의 자손의 확인
엘리트 유전자 이벤트는 식물 게놈 내로의 재조합 DNA 분자(들)의 도입 부위(들)에서의 위치(들) 및 배열을 특징으로 할 수 있다. 재조합 DNA 카세트가 삽입되는 식물 게놈 내의 부위는 "삽입 부위" 또는 "표적 부위"로서도 지칭된다. "플랭킹 영역" 또는 "플랭킹 서열"은 형질전환 카세트의 바로 업스트림에서 인접하여 위치하거나, 형질전환 카세트의 바로 다운스트림에서 인접하여 위치하는 식물 게놈의 DNA 영역, 예를 들면, 적어도 20개 염기쌍, 적어도 50개 염기쌍 또는 최대 5,000개 염기쌍이다. 외래 DNA의 무작위 삽입을 유발하는 형질전환은 각각의 형질전환체(엘리트 이벤트)에 대해 특징적이고 독특한 상이한 플랭킹 영역들을 가진 형질전환체를 야기한다.
또 다른 양태는 NS-B50027-4 유래의 브라시카 나푸스 식물 또는 이의 부분을 생성하는 방법으로서, 전술된 브라시카 나푸스 식물 또는 이의 부분을 제2 식물과 교배시켜 제1 세대 자손 종자를 생성하는 단계; 상기 제1 세대 자손 종자를 생장시켜 F2 세대 식물을 생성하는 단계; 임의적으로, 교배시키는 단계 및 생장시키는 단계를 반복하여 상기 종자의 연속적인 자식 세대를 수득함으로써, 육종 계통 NS-B50027-4 유래의 브라시카 나푸스 종자, 식물 또는 이의 부분을 수득하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이 방법에 의해 생성된 식물 또는 식물 부분(임의의 하이브리드를 포함함)도 제공된다. 한 실시양태에서, 특정 카놀라 식물의 게놈 내로 조작된 유전 형질은 식물 육종 분야에서 잘 공지되어 있는 전통적인 육종 기법을 이용함으로써 또 다른 재배종의 게놈 내로 이동될 수 있다. 예를 들면, 역교배 방법을 이용하여 전이유전자를 형질전환된 카놀라 재배종으로부터 이미 개발된 카놀라 재배종 내로 이동시킬 수 있고, 그 후 생성된 역교배 전환 식물은 전이유전자(들)를 포함할 것이다.
따라서, 본 실시양태의 또 다른 양태는 NS-B50027-4를 검출하는 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 유성 교배의 자손이 관심 있는 전이유전자를 함유하는 지를 확인하기 위해 특정 이벤트의 존재를 검출할 수 있는 것이 유리할 것이다. 또한, 특정 이벤트를 검출하는 방법은 예를 들면, 재조합 작물 식물로부터 유래한 식품의 시판 전 승인 및 표지부착을 요구하는 규정을 따르는 데 도움이 될 것이다. 임의의 잘 공지되어 있는 핵산 검출 방법, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 핵산 프로브를 사용한 DNA 하이브리드화로 전이유전자의 존재를 검출할 수 있다. 이 검출 방법들은 일반적으로 빈번히 사용되는 유전자 요소, 예컨대, 프로모터, 터미네이터, 마커 유전자 등에 초점을 맞춘다. 그 결과, 삽입된 DNA에 인접한 염색체 DNA("플랭킹 DNA")의 서열이 공지되어 있지 않은 한, 이러한 방법들은 상이한 이벤트들, 특히 동일한 DNA 구축물을 사용함으로써 생성된 이벤트들을 구별하는 데 유용하지 않을 수 있다. 이벤트 특이적 PCR 어세이는 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌(Windels et al., Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b: 459 (1999))(연접부에 걸쳐 있는 프라이머 세트를 사용한 PCR로 글리포세이트 내성 대두 이벤트를 확인함: 제1 프라이머는 삽입체로부터의 서열을 포함하였고, 제2 프라이머는 플랭킹 DNA로부터의 서열을 포함하였음)을 참조한다. 추가로, NS-B50027-4의 16-유전자 삽입체는 염색체 A05에 위치하는, 과민성 반응 매개 신호전달에 관여하는 세린-쓰레오닌 키나제인 Pto 상호작용 단백질(PTI)을 코딩하는 브라시카 유전자의 발현을 파괴하였다. 표현형 변화가 관찰되지 않았을지라도, 이것은 NS-B50027-4 또는 NS-B50027-4 유래의 자손의 확인을 위한 또 다른 마커를 제공한다.
본원의 방법 및 키트는 구체적으로 NS-B50027-4에서 전이유전자를 포함하는 식물 물질의 존재뿐만 아니라, 이러한 이벤트를 함유하는 형질전환 카놀라 식물, 식물 물질 및 종자의 존재도 생물학적 샘플에서 확인하는 데 유용하다. 본원에 기재된 엘리트 이벤트 NS-B50027-4는 동일한 재배종 또는 관련된 재배종의 식물을 확인할 수 있거나 혈통을 확인하거나 검증하는 데 사용될 수 있는 유전자 마커 프로파일을 통해 특징규명될 수 있는 유전형에 의해 확인될 수 있다. 유전자 마커 프로파일은 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 무작위적으로 증폭된 다형성 DNA(RAPD), 임의로 프라이밍된 중합효소 연쇄 반응(AP-PCR), DNA 증폭 핑거프린팅(DAF), 서열 특징규명된 증폭된 영역(SCAR), 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP), 단순한 서열 반복부(SSR)(마이크로세틀라이트(Microsatellite)로서도 지칭됨), 및 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)과 같은 기법에 의해 수득될 수 있다.
예를 들면, 본원에 기재된 엘리트 이벤트 NS-B50027-4는 식물 물질의 샘플로부터 유전자 지도를 생성함으로써 확인될 수 있다. 유전자 지도는 외래 단백질을 코딩하는 삽입된 DNA 분자의 대략적인 염색체 위치를 확인하는 보편적인 RFLP, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석 또는 SSR에 의해 생성될 수 있다. 문헌(Glick & Thompson, METHODS IN PLANT MOLEC. BIOL. & BIOTECHNOL. 269 (CRC Press, Boca Raton, FL, 1993))을 참조한다. 염색체 위치에 대한 지도 정보는 대상체 형질전환 식물의 독점 보호에 유용하다. 예를 들면, 삽입 영역의 지도를 의심되는 식물에 대한 유사한 지도와 비교하여, 의심되는 식물이 대상체 식물과 공통된 혈통을 갖는 지를 확인할 수 있다. 지도 비교는 하이브리드화, RFLP, PCR, SSR 및 시퀀싱(이들 모두 보편적인 기법임)을 포함할 수 있다.
본 실시양태의 또 다른 양태는 카놀라 식물이 근친교배 계통 NS-B50027-4, 또는 계통 NS-B50027-4의 유전자 엘리트 이벤트의 적어도 부분을 포함하는 카놀라 식물이거나 이와 관련되어 있는 지를 확인하는 키트 및 방법을 제공한다. 생물학적 샘플에서 엘리트 이벤트 NS-B50027-4를 확인하는, 단순하고 분명한 기법을 위한 조성물 및 방법이 본원에 기재되어 있다.
예를 들면, 키트는 NS-B50027-4의 하나 이상의 유전자 마커의 확인을 위한 적어도 한 세트의 프라이머, 예컨대, 한 세트의 센스(정방향) 및 안티센스(역방향) 프라이머를 포함할 수 있다. 프라이머의 구체적인 실시양태는 KASP 어세이를 수행하여 NS-B50027-4 유전 형질을 검출하는 키트에서 유용한, 특히 유전자이입 연구 및 하이브리드 개발에 유용한 하기 프라이머들을 포함한다. 실시예 2를 참조한다. 이 프라이머들은 서열번호 1 내지 서열번호 90(표 14, 실시예 3 참조)에 표시된 서열 또는 이의 상보체의 적어도 10개의 연속 핵산을 포함하는 핵산 분자로 구성될 수 있다.
본 발명은 엘리트 이벤트 NS-B50027-4 카놀라 식물을 확인하는 방법으로서, (a) 카놀라 식물 DNA를 함유하는 생물학적 샘플, 및 이벤트 NS-B50027-4 특이적 핵산 분자를 증폭할 수 있는 제1 핵산 프라이머 및 제2 핵산 프라이머를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 제1 핵산 프라이머 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 NS-B50027-4 특이적 핵산 분자를 증폭할 수 있게 하는 조건 하에서 상기 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) 증폭된 단편 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법도 제공하는데, 이때 카놀라 엘리트 이벤트 NS-B50027-4 특이적 핵산 분자의 존재는 상기 카놀라 식물이 NS-B50027-4 카놀라 식물이라는 것을 표시한다.
또 다른 실시양태는 생물학적 샘플에서 엘리트 이벤트 NS-B50027-4 핵산 분자를 검출하는 방법으로서, (a) DNA를 함유하는 생물학적 샘플, 및 이벤트 NS-B50027-4 특이적 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 상기 프로브가 이벤트 NS-B50027-4 특이적 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있게 하는 조건 하에서 상기 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) 하이브리드화된 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는데, 이때 이벤트 NS-B50027-4 특이적 핵산 분자의 존재는 상기 샘플이 이벤트 NS-B50027-4 핵산 분자를 함유한다는 것을 표시한다.
또 다른 실시양태는 생물학적 샘플에서 이벤트 NS-B50027-4 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법으로서, (a) DNA를 함유하는 생물학적 샘플, 및 이벤트 NS-B50027-4 삽입체 핵산 분자의 영역에 어닐링할 수 있는 제1 프라이머 및 숙주 세포 게놈 내의 플랭킹 핵산 분자에 어닐링할 수 있는 제2 프라이머를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; (b) 제1 핵산 프라이머 및 제2 핵산 프라이머가 이벤트 NS-B50027-4 삽입체 핵산 분자의 단편을 포함하는 증폭된 핵산 분자를 생성할 수 있게 하는 조건 하에서 상기 혼합물을 반응시키는 단계; 및 (c) 증폭된 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는데, 이때 이벤트 NS-B50027-4 삽입체 핵산 분자의 단편의 존재는 상기 샘플이 이벤트 NS-B50027-4 삽입체 DNA를 함유한다는 것을 표시한다.
적절한 시험은 임의의 주요 결함을 검출할 것이고 현재의 상업적 카놀라 재배종에 비해 우수성 또는 개선의 수준을 확립할 것이다. 보다 더 우수한 성능을 보여주는 것 이외에, 산업 표준에 적합하거나 신규 시장을 생성하는 신규 재배종에 대한 수요가 있어야 한다. 신규 재배종의 도입은 특별한 광고 및 마켓팅, 변경된 종자 및 상업적 생산 관행, 및 신제품 이용을 위해 종자 생산자, 재배자, 가공자 및 소비자에게 추가 비용을 발생시킬 것이다. 신규 재배종의 공개에 앞선 시험은 연구 및 개발 비용뿐만 아니라, 최종 재배종의 기술적 우수성도 고려해야 한다. 종자-증식된 재배종의 경우, 종자를 용이하게 경제적으로 생성하는 것이 실현 가능해야 한다.
자손
본원에 기재된 계통 NS-B50027-4는 다른 계통을 육종하는 데 모본으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 바와 같이, 이것은 공급원으로서 자가수분될 수 있고, 교배될 수 있고, 역교배될 수 있고, 2배 반수체를 생성하는 데 사용될 수 있고, 유전자 형질전환용 공급원 물질로서 사용될 수 있거나 유전자 형질전환될 수 있고, 더 돌연변이될 수 있고, 다른 형태의 육종을 위해 사용될 수 있다. 공급원 물질을 사용하여 다른 계통을 육종하는 방법 및 결과도 이 실시양태의 범위 내에 있다.
특정 단백질 생성물을 코딩하는 유전자의 단리 및 특징규명을 가능하게 하는 분자 생물학적 기법의 출현으로 인해, 식물 생물학 분야의 과학자들은 특정 방식으로 식물의 형질을 변경시키기 위해 (아마도 상이한 프로모터에 의해 유도되는) 외래 유전자, 또는 천연 또는 내생성 유전자의 추가 또는 변형된 버전을 함유하고 발현하도록 식물의 게놈을 조작하는 데 강한 관심을 가졌다. 형질전환 또는 다양한 육종 방법들의 이용을 통해 게놈 내로 도입되는, 상이한 종 또는 동일한 종으로부터 유래한 임의의 DNA 서열은 본원에서 총체적으로 "전이유전자"로서 지칭된다. 최근 15년 내지 20년에 걸쳐, 형질전환 식물을 생성하는 여러 방법들이 개발되었고, 특정 실시양태에서, 본 발명은 청구된 계통의 형질전환된 버전에 관한 것이기도 하다.
핵산, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 선형 또는 분지된 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA 분자, 또는 RNA/DNA 하이브리드를 비롯한 이들의 하이브리드를 지칭한다. 이 용어들은 3' UTR 및 5' UTR, 전형적으로 코딩 영역의 5' 말단으로부터 업스트림에 있는 적어도 약 1000개 뉴클레오타이드의 서열, 및 유전자의 코딩 영역의 3' 말단으로부터 다운스트림에 있는 적어도 약 200개 뉴클레오타이드의 서열도 포괄한다. 덜 흔한 염기, 예컨대, 이노신, 5-메틸사이토신, 6-메틸아데닌, 하이포잔틴 등도 안티센스, dsRNA 및 리보자임 페어링을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 유리딘 및 사이티딘의 C-5 프로핀 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 고친화성으로 RNA에 결합하고 유전자 발현의 강력한 안티센스 억제제인 것으로 밝혀졌다. 다른 변형, 예컨대, 포스포디에스테르 골격, 또는 RNA의 리보스 당 기의 2'-하이드록시의 변형도 만들 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 리보자임은 전체적으로 리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있거나, 혼합된 리보뉴클레오타이드 및 데옥시리보뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 게놈 준비, cDNA 준비, 시험관내 합성, RT-PCR 및 시험관내 또는 생체내 전사를 포함하는 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다.
식물 형질전환은 식물 세포에서 작용할 발현 벡터의 구축을 포함한다. 이러한 벡터는 조절 요소(예를 들면, 프로모터)의 조절 하에 있거나 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 유전자를 포함하는 DNA를 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 이러한 작동 가능하게 연결된 유전자/조절 요소 조합을 함유할 수 있다. 벡터(들)는 플라스미드의 형태로 존재할 수 있고, 당분야에서 공지되어 있는 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 카놀라 식물을 제공함으로써, NS-B50027-4 카놀라 식물을 포함하는 카놀라 식물(들)의 유전 물질 내로 전이유전자를 도입하는 데 단독으로 또는 다른 플라스미드와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GPAT), 리소파티드산 아실트랜스퍼라제(LPAAT) 또는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT)를 코딩하는 유전자(들)를 포함하는 전이유전자 카세트를 NS-B50027-4 내로 형질전환시켜 지방산 또는 TAG 합성을 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌(Shrestha et al., 7 Front. Plant Sci. 1402 (2016))을 참조한다.
형질전환 기법의 이용을 통해 특정 카놀라 식물 내로 조작된 유전 형질은 식물 육종 분야에서 잘 공지되어 있는 전통적인 육종 기법의 이용을 통해 또 다른 계통 내로 이동될 수 있었다. 예를 들면, 엘리트 이벤트 NS-B50027-4를 보유하는 식물은 예를 들면, ATCC®에 기탁된 종자로부터 수득될 수 있다. 이러한 식물을 보편적인 육종법으로 더 증식시키거나 사용하여, 이벤트 NS-B50027-4(즉, LC-PUFA 생합성)를 동일한 또는 관련된 식물 종의 다른 재배종 내로 도입할 수 있다. 기탁된 종자는 브라시카 나푸스 종에 속한다. 그럼에도 불구하고, 브라시카 나푸스로부터의 A 게놈 또는 C 게놈에 위치하는 대립유전자 또는 전이유전자를 브라시카 준세아 내로 도입하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 반복된 역교배를 포함한다. 역교배 방법을 이용하여 전이유전자를 형질전환된 카놀라 식물로부터 엘리트 근친교배 계통으로 이동시킬 수 있고, 생성된 자손은 전이유전자를 포함한다. 또한, 근친교배 계통이 형질전환을 위해 사용된 경우, 형질전환 하이브리드 카놀라 식물을 생성하기 위해 형질전환 식물을 상이한 계통과 교배시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "교배"는 문맥에 따라 X와 Y의 단순한 교배 또는 역교배 과정을 의미할 수 있다.
형질전환을 이용하여 다양한 유전자 요소들을 식물 게놈 내로 더 도입할 수 있다. 이 요소들은 유전자; 코딩 서열; 유도성 프로모터, 항시성 프로모터 및 조직 특이적 프로모터; 증강 서열; 및 신호 및 표적화 서열을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 신규 분자 생물학적 기법의 출현은 특정 기능을 가진, 예컨대, 특정 단백질 생성물을 코딩하는 유전자 요소의 단리 및 특징규명을 가능하게 하였다. 식물 생물학 분야의 과학자들은 특정 방식으로 식물의 형질을 변경시키기 위해 외래 유전자 요소, 또는 천연 또는 내생성 유전자 요소의 추가 또는 변형된 버전을 함유하고 발현하도록 식물의 게놈을 조작하는 데 강한 관심을 가졌다. 형질전환의 이용을 통해 게놈 내로 삽입된, 상이한 종 또는 동일한 종으로부터 유래한 임의의 DNA 서열은 본원에서 총체적으로 "전이유전자"로서 지칭된다. "형질전환" 과정은 게놈 내로의 DNA의 삽입이다. 형질전환 식물을 생성하는 여러 방법들이 개발되었고, 특정 실시양태에서, 본 발명은 청구된 카놀라 계통 NS-B50027-4의 형질전환된 버전에 관한 것이기도 하다.
생물학적 및 물리적 식물 형질전환 프로토콜을 포함하는 여러 식물 형질전환 방법들이 개발되었다. 추가로, 식물 세포 또는 조직 형질전환 및 식물의 재생을 위한 발현 벡터 및 시험관내 배양 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Miki et al., Procedures for introducing foreign DNA into plants, in METH. PLANT MOLEC. BIOL. & BIOTECHNOL. at 63 (Glick & Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, 1993); Gruber et al., Vectors for plant transformation, id. at R 89; Genetic transformation for the improvement of Canola, PROC. WORLD CONF. BIOTECHNOL. FATS & OILS INDUS. at 43-46 (Am. Oil. Chem. Soc., Champaign, IL, 1988))을 참조한다.
가장 우세한 유형의 식물 형질전환은 발현 벡터의 구축을 포함한다. 이러한 벡터는 조절 영역, 예를 들면, 프로모터의 조절 하에 있거나 이러한 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역을 함유하는 DNA 분자를 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 유전자 및 하나 이상의 조절 요소를 함유할 수 있다. 코딩 영역들 및 이들 각각의 조절 요소들 중 적어도 하나는 벡터 내에서 반대 배향으로 정렬되어, 이원 벡터를 제공할 수 있다. 이론적으로, 이원 방식으로 유전자 침묵에 민감한 유전자들을 정렬하는 것은 유전자 침묵을 최소화할 수 있다. 벡터(들)는 플라스미드의 형태로 존재할 수 있고, 당분야에서 공지되어 있는 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 카놀라 식물을 제공함으로써, NS-B50027-4 식물 또는 NS-B50027-4 유래의 식물의 유전 물질 내로 전이유전자를 도입하는 데 단독으로 또는 다른 플라스미드와 함께 사용될 수 있다.
예를 들면, 초기 형질전환 카세트인 pJP3416_GA7-modB는 카놀라 종자에서 오메가-3 지방산의 축적을 촉진할 수 있는 7개의 유전자들, 및 시험관 내에서의 잠정적 형질전환 식물의 선택을 용이하게 하기 위한 1개의 선택 가능한 마커 유전자를 포함하였다. 국제 특허출원 공보 제WO 2013185184호; 미국 특허 공보 제20150374654호; 및 문헌(Petrie et al., 6 Plant Meth. 8 (2010))을 참조한다. 발현된 유전자들은 모두 합성 -- 코돈 최적화되고 합성된 -- 유전자들이므로, 형질전환 DNA 분자는 임의의 천연 유기체에서 발견되지 않는다. 코돈 최적화를 위한 주형으로서 사용된 원래의 DNA 서열이 기재되어 있다. 문헌(Petrie et al., 12 Metab. Eng'g 233 (2010a); Petrie et al., 11 Plant Methods 6 (2010b); Petrie et al., 21 Transgenic Res. 139 (2012))을 참조한다.
당분야에서 잘 공지되어 있는 바와 같이, 기능성 유전자 프로모터는 유전자 전사에 중요하나 기능성 생성물, 예컨대, 펩타이드를 코딩하지 않는 DNA 영역이다. 예를 들면, 항시적 발현을 위한 통상의 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스로부터 유래한다(Kay et al., 236 Science 1299 (1987); Coutu et al., 16 Transgenic Res. 771 (2007)). 발생 조절 하에 있는 프로모터는 일부 조직들, 예컨대, 종자, 잎, 뿌리, 섬유, 물관, 헛물관 또는 후막조직에서 전사를 우선적으로 시작하는 프로모터를 포함한다. 특히 적절한 프로모터는 주로 또는 오로지 종자에서 전사를 시작하는 "종자 선호" 프로모터이다. "종자 선호" 프로모터는 "종자 특이적" 프로모터(종자 발생 동안 활성을 가진 프로모터, 예컨대, 종자 저장 단백질의 프로모터) 및 "종자 발아" 프로모터(종자 발아 동안 활성을 가진 프로모터) 둘 다를 포함한다. 문헌(Thompson et al., 10 BioEssays 108 (1989))을 참조한다. 이러한 종자 선호 프로모터는 Cim1(사이토키닌-유도된 메세지); cZ19B1(옥수수 19 kDa 제인(zein)); milps(미요-이노시톨-1-포스페이트 합성효소)(국제 특허출원 공보 제WO 2000/11177호 및 미국 특허 제6,225,529호 참조)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 쌍떡잎식물의 경우, 종자 특이적 프로모터는 콩 β-파세올린(phaseolin), 나핀(napin), β-콘글리시닌(conglycinin), 대두 렉틴(lectin), 크루시페린(cruciferin), 콘리닌(conlinin) 등을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. GA7-modB에서 사용되는 종자 특이적 프로모터는 이전에 기재되었다: 아라비돕시스 탈리아나 FAE1(Rossack et al., 46 Plant Molec. Biol. 717 (2001)); 리눔 우시타티시뭄 Cnl1 및 Cnl2(Chaudhary et al., 국제 특허출원 공보 제WO 2001016340호); 및 절두된 브라시카 나푸스 나핀 프로모터(Stalberg et al., 23 Plant Molec. Biol. 671 (1993)). 국제 특허출원 공보 제WO 2013185184호도 참조한다.
"유도성" 프로모터는 환경 조절 하에 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터에 영향을 미칠 수 있는 환경 조건의 예로는 혐기성 조건, 또는 광의 존재가 있다. 조직 특이적 프로모터, 조직 선호(예를 들면, 종자 특이적) 프로모터 및 유도성 프로모터는 "비-항시성" 프로모터의 부류를 구성한다. 문헌(Ward et al., 22 Plant Mol. Biol. 361 (1993)); 문헌(Meft et al., 90 PNAS 4567 (1993))(구리 유도성); 문헌(Gatz et al., 243 Mol. Gen. Genet. 32 (1994))(제초제 완화제에 의해 유도됨); 문헌(Gatz, et al., 227 Mol. Gen. Genet. 229 (1991))(테트라사이클린 유도성); 문헌(Schena et al., 88 PNAS 10421 (1991))(글루코코르티코스테로이드 유도성)을 참조한다. 국제 특허출원 공보 제WO 2001016340호 및 여기서 논의된 프로모터를 참조한다.
"항시성" 프로모터는 대부분의 환경 조건들 하에서 활성을 나타내는 프로모터이다. 예시적 항시성 프로모터는 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CMV)로부터의 35S 프로모터(Odell et al., 313 Nature 810 (1985)), 및 쌀 액틴(McElroy et al., 2 Plant Cell 163 (1990)); 유비퀴틴(Christensen et al., 12 Plant Mol. Biol. 619 (1989); Christensen et al., 18 Plant Mol. Biol. 6759 (1992)); pEMU(Last et al., 81 Theor. Appl. Genet. 581 (1991)); MAS(Velten et al., 3 EMBO J. 2723 (1984)) 및 옥수수 H3 히스톤(Lepetit et al., 231 Mol. Gen. Genet. 276 (1992); Atanassova et al., 2 Plant J. 291 (1992))과 같은 유전자로부터의 프로모터를 포함한다. 브라시카 나푸스 ALS3 구조 유전자의 5' 쪽에 위치하는 Xbal/Ncol 단편인 ALS 프로모터(또는 상기 Xbal/Ncol 단편과 유사한 뉴클레오타이드 서열)는 또 다른 항시성 프로모터를 제공한다. 국제 특허출원 공보 제WO 1996/30530호 및 여기서 논의된 프로모터를 참조한다. CMV 프로모터도 유용한 인핸서 영역과 관련되어 있다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 1996/30530호 및 제WO 2013185184호, 및 여기서 논의된 프로모터를 참조한다.
폴리아데닐화 신호를 포함하는 터미네이터 영역은 완전하고 안정한 mRNA 분자의 생성을 위해 요구된다. 예를 들면, 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성효소(NOS) 터미네이터는 유용한 터미네이터를 제공한다(Bevan, 12 Nucl. Acid Res. 8711 (1984); Rogers et al., in BIOTECHNOL. PLANT SCI. at 219 (Acad. Press, Inc., New York, NY, 1985); Sanders et al., 15 Nucl. Acids Res. 1543 (1987)). 다양한 조절 서열들이 다양한 발현 카세트들의 전사를 유도하고 종결시키기 위해 함께 사용되었다.
전이유전자에 의해 생성된 단백질이 하위세포 구획, 예컨대, 엽록체, 액포, 퍼록시좀, 글리옥시좀, 세포벽 또는 미토콘드리온으로 수송되거나, 아포플라스트(apoplast) 내로 분비되기 위해 수송되는 것은 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을, 관심 있는 단백질을 코딩하는 유전자의 5' 또는 3' 영역에 작동 가능하게 연결함으로써 달성된다. 구조 유전자의 5' 또는 3' 말단에 있는 표적화 서열은 코딩된 단백질이 궁극적으로 어느 구획으로 수송될 지를 단백질 합성 및 프로세싱 동안 결정할 수 있다.
신호 서열의 존재는 폴리펩타이드가 세포내 세포소기관 또는 하위세포 구획으로 향하게 하거나 아포플라스트로 분비되게 한다. 많은 신호 서열들이 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Becker et al., 20 Plant Mol. Biol. 49 (1992); Knox et al., 9 Plant Mol. Biol. 3 (1987); Lerner et al., 91 Plant Physiol. 124 (1989); Fontes et al., 3 Plant Cell 483 (1991); Matsuoka et al., 88 PNAS 834 (1991); Creissen et al., 2 Plant J. 129 (1991); Kalderon et al., 39 Cell 499 (1984); Steifel et al., 2 Plant Cell 785 (1990))을 참조한다.
발현 벡터는 전형적으로 마커를 함유하는 형질전환된 세포가 음성 선택, 즉 선택 가능한 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 생장 억제, 또는 양성 선택, 즉 유전자 마커에 의해 코딩된 생성물에 대한 스크리닝에 의해 회수될 수 있게 하는, 조절 요소(예를 들면, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 유전자 마커를 포함한다. 식물 형질전환을 위해 통상적으로 사용되는 많은 선택 가능한 마커 유전자들은 형질전환 분야에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선택 화학 물질을 대사적으로 해독하는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 억제제에 민감하지 않은 변경된 표적을 코딩하는 유전자를 포함한다. 양성 선택 방법도 당분야에서 공지되어 있다.
식물 형질전환을 위해 통상적으로 사용되는 하나의 선택 가능한 마커 유전자는 식물 조절 신호의 조절 하에 놓일 때 카나마이신에 대한 내성을 부여하는, 트랜스포존 Tn5로부터 단리된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase) II(nptII) 유전자이다(Fraley et al., 80 PNAS 4803 (1983)). 또 다른 통상적으로 사용되는 선택 가능한 마커 유전자는 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자이다(Vanden Elzen et al., 5 Plant Mol. Biol. 299 (1985)). 항생제에 대한 내성을 부여하는 세균 유래의 추가 선택 가능한 마커 유전자는 젠타마이신 아세틸 트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제, 아미노글리코사이드-3'-아데닐 트랜스퍼라제, 블레오마이신 내성 결정인자를 포함한다(Hayford et al., 86 Plant Physiol. 1216 (1988); Jones et al., 210 Mol. Gen. Genet., 86 (1987); Svab et al., 14 Plant Mol. Biol. 197 (1990); Hille et al., 7 Plant Mol. Biol. 171 (1986)). 다른 선택 가능한 마커 유전자는 제초제, 예컨대, 글리포세이트, 글루포시네이트 또는 브로목시닐에 대한 내성을 부여한다(Comai et al., 317 Nature 741 (1985); Gordon-Kamm et al., 2 Plant Cell 603 (1990); Stalker et al., 242 Sci. 419 (1988)). 세균으로부터 유래하지 않는, 식물 형질전환을 위한 선택 가능한 마커 유전자는 예를 들면, 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제, 식물 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 및 식물 아세토락테이트 합성효소를 포함한다(Eichholtz et al., 13 Somatic Cell Mol. Genet. 67 (1987); Shah et al., 233 Sci. 478 (1986); Charest et al., 8 Plant Cell Rep. 643 (1990)).
식물 형질전환을 위한 또 다른 부류의 마커 유전자는 독성 물질, 예컨대, 항생제에 대한 내성에 대한 형질전환된 세포의 직접적인 유전자 선택보다는 오히려 잠정적으로 형질전환된 식물 세포의 스크리닝을 요구한다. 이 유전자는 특정 조직에서 유전자의 발현의 공간적 패턴을 정량하거나 가시화하는 데 특히 유용하고, 유전자 발현의 조사를 위해 유전자 또는 유전자 조절 서열에 융합될 수 있기 때문에 종종 레포터 유전자로서 지칭된다. 잠정적으로 형질전환된 세포를 스크리닝하기 위해 통상적으로 사용되는 유전자는 α-글루쿠로니다제(glucuronidase)(GUS), α-갈락토시다제(galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 및 클로람페니콜(chloramphenicol), 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase)를 포함한다(Jefferson, 5 Plant Mol. Biol., 387 (1987); Teeri, et al., 8 EMBO J., 343 (1989); Koncz, et al., 84 PNAS, 131 (1987); and DeBlock, et al., 3 EMBO J., 1681 (1984)). GUS 활성을 가시화하는 일부 생체내 방법들은 식물 조직의 파괴를 요구하지 않는다(Molecular Probes, Publication 2908, IMAGENE GREEN, 1-4 (1993); Naleway et al., 115 J. Cell Biol. 151a (1991)). 그러나, GUS 활성을 가시화하는 생체내 방법은 낮은 민감성, 높은 형광 배경, 및 선택 가능한 마커로서의 루시퍼라제 유전자의 사용과 관련된 한계를 나타낸다는 문제점을 가진다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 원핵 세포 및 진핵 세포에서의 유전자 발현에 대한 마커로서 사용될 수 있다(Chalfie et al., 263 Sci. 802 (1994)). GFP 및 GFP의 돌연변이체는 스크리닝 가능한 마커로서 사용될 수 있다.
NS-B50027-4 및 NS-B50027-4 자손은 질환 또는 해충 내성을 부여하도록 더 형질전환될 수 있다. 예를 들면, 식물 계통은 특정 병원체 균주에 대한 내성을 가진 식물을 조작하기 위해 클로닝된 내성 유전자로 형질전환될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Jones et al., 266 Sci. 789 (1994))(클라도스포륨 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 내성을 위한 토마토 Cf-9 유전자의 클로닝); 문헌(Martin, et al., 262 Sci. 1432 (1993))(슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syringae) 병원형 토마토에 대한 내성을 위한 토마토 Pto 유전자, 단백질 키나제); 문헌(Mindrinos et al., 78 Cell 1089 (1994))(슈도모나스 시링가에에 대한 내성을 위한 아라비돕시스 RSP2 유전자); 문헌(Geiser et al. 48 Gene 109 (1986))(바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis) δ-내독소 유전자); 문헌(Van Damme et al., 24 Plant Mol. Biol. 25 (1994))(클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스 결합 렉틴); 문헌(Sumitani et al., 57 Biosci. Biotech. Biochem. 1243 (1993))(아밀라제 억제제); 문헌(Abe et al., 262 J. Biol. Chem. 16793 (1987))(시스테인 프로테이나제 억제제); 문헌(Huub et al., 21 Plant Mol. Biol. 985 (1993))(담배 프로테이나제 억제제 I); 문헌(Regan, 269 J. Biol. Chem. 9 (1994))(곤충 이뇨제 호르몬 수용체); 문헌(Pratt et al., 163 Biochem. Biophys. Res. Comm. 1243 (1989))(알로스타틴(allostatin)); 미국 특허 제5,266,317호(Tomalski et al.)(곤충 특이적 마비성 신경독소); 국제 특허출원 공보 제WO 1993/02197호(Scott et al.)(칼라제(callase) 유전자); 문헌(Kramer et al., 23 Insect Biochem. Mol. Biol. 691 (1993))(담배 박각시벌레 키티나제(chitinase)); 문헌(Kawalleck et al., 21 Plant Mol. Biol. 673 (1993))(파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자); 국제 특허출원 공보 제WO 1995/16776호(타키플레신(tachyplesin)의 유도체는 진균을 억제함); 국제 특허출원 공보 제WO 199518855호(합성 항미생물 펩타이드); 문헌(Jaynes et al., 89 Plant Sci. 43 (1993))(세크로핀(cecropin)-β, 용해성 펩타이드는 형질전환 담배 식물이 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대한 내성을 갖게 만듬); 문헌(Botella et al., 24 Plant Mol. Biol., 24:757 (1994))(녹두 칼모둘린); 문헌(Griess, et al., 104 Plant Physiol. 1467 (1994))(옥수수 칼모둘린); 문헌(Taylor, et al., Abstract #497, 7th Int'l Symp. Molec. Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland (1994))(형질전환 단쇄 항체를 통한 담배에서의 효소 불활성화); 문헌(Tavladorakiet al., 366 Nature 469 (1993))(형질전환 항체를 통한 바이러스 내성); 문헌(Lamb et al., 10 Bio technol. 1436 (1992))(진균 엔도-α-1,4-D-폴리갈락투로나제(polygalacturonase) 단편은 식물 세포벽 동종-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화시킴으로써 진균 콜로니화를 용이하게 하고 식물 영양소가 방출되게 함); 문헌(Toubart et al., 2 Plant J. 367 (1992))(콩 엔도폴리갈락투로나제 억제 단백질); 문헌(Logemann et al., 10 Bio/technology 305 (1992))(보리 리보좀 불활성화 유전자를 발현하는 형질전환 식물은 진균 질환에 대한 증가된 내성을 가짐)을 참조한다.
상기 인지된 바와 같이, 제초제 내성은 유전자 변형에 의해 도입될 수 있는 또 다른 유용한 형질이다. 예를 들면, 생장 점 또는 분열조직을 억제하는 제초제, 예컨대, 이미다졸리논 또는 설포닐우레아에 대한 내성은 돌연변이체 ALS 및 AHAS 효소에 의해 부여될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Lee et al., 7 EMBO J. 1241 (1988)); 및 문헌(Miki et al., 80 Theor. Appl. Genet. 449 (1990))을 참조하고; 글리포세이트 내성은 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS) 및 aroA 유전자에 의해 부여되고; 글루포시네이트 내성은 포스피노쓰리신아세틸 트랜스퍼라제 유전자에 의해 부여되고; ACCase 억제제 코딩 유전자는 피리디녹시 또는 페녹시 프로피온산 및 사이클로헥손에 대한 내성을 부여한다. 예를 들면, 미국 특허 제4,940,835호(EPSPS는 글리포세이트 내성을 부여함)를 참조하고; 돌연변이체 aroA 유전자(ATCC® 수탁번호 39256)에 대해서는 미국 특허 제4,769,061호(Comai)를 참조하고; 문헌(Umaballava-Mobapathie, 8 Transgen. Res. 33 (1999))(글루포시네이트에 대한 내성을 가진 락투카 사티바(Lactuca sativa)); 유럽 특허 제0 333 033호(Kumada et al.); 미국 특허 제4,975,374호(Goodman et al.)(글루타민 합성효소 유전자는 제초제, 예컨대, L-포스피노쓰리신에 대한 내성을 부여함); 유럽 특허 제0242246호(Leemans et al.)(포스피노쓰리신 아세틸 트랜스퍼라제); 문헌(DeGreef et al., 7 Bio/technol. 61 (1989))(포스피노쓰리신 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 키메라 bar 유전자); 문헌(Marshall et al., 83 Theor. Appl. Genet. 435 (1992))(Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자는 페녹시 프로피온산 및 사이클로헥손, 예컨대, 세톡시딤(sethoxydim) 및 할록시폽(haloxyfop)에 대한 내성을 부여함); 문헌(Przibilla et al., 3 Plant Cell 169 (1991))(PsbA 및 gs+ 유전자는 트리아진 내성을 부여함); 미국 특허 제4,810,648호(Stalker)(니트릴라제(nitrilase) 유전자는 벤조니트릴 내성을 부여함); 문헌(Hayes et al., 285 Biochem. J. 173 (1992))(글루타티온 S-트랜스퍼라제); 문헌(Hattori et al., 246 Mol. Gen. Genet. 419 (1995))(아세토하이드록시산 합성효소는 다수의 제초제들에 대한 내성을 부여함); 문헌(Shiota et al., 106 Plant Physiol. 17 (1994))(효모 NADPH-사이토크롬 P450 옥시도리덕타제); 문헌(Aono et al., 36 Plant Cell Physiol. 1687 (1995))(글루타티온 리덕타제 및 수퍼록사이드 디스뮤타제); 문헌(Datta, et al., 20 Plant Mol. Biol. 619 (1992))(다양한 포스포트랜스퍼라제); 국제 특허출원 공보 제WO 01/12825호; 및 미국 특허 제6,288,306호, 제6,282,837호 및 제5,767,373호(변경된 프로톡스 활성을 가진 식물은 프로톡스 표적화 제초제에 대한 내성을 가짐)도 참조한다.
NS-B50027-4 및 NS-B50027-4 유래의 자손은 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 임의의 수의 부가 가치 형질을 부여하도록 더 변형될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Goto, et al., 521 Acta Horticul. 101 (2000))(대두 페리틴 유전자); 문헌(Curtis et al., 18 Plant Cell Rep. 889 (1999))(니트레이트 리덕타제); 문헌(Knultzon et al., 89 PNAS 2625 (1992))(스테아릴-ACP 데사투라제); 문헌(Shiroza et al., 170 J. Bacteriol. 810 (1988))(스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 프럭토실트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오타이드 서열); 문헌(Steinmetz et al., 20 Mol. Gen. Genet. 220 (1985))(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제(levansucrase) 유전자); 문헌(Pen et al., 10 Bio/technol. 292 (1992))(형질전환 식물은 바실러스 리체니포니스(Bacillus lichenifonnis) α-아밀라제를 발현함); 문헌(Elliot et al., 21 Plant Mol. Biol. 515 (1993))(토마토 인버타제(invertase) 유전자); 문헌(Sφgaard et al., 268 J. Biol. Chem. 22480 (1993))(보리 α-아밀라제 유전자의 부위 지정 돌연변이유발); 및 문헌(Fisher et al., 102 Plant Physiol. 1045 (1993))(옥수수 배젖 전분 분지화 효소 II)을 참조한다.
카놀라 계통 NS-B50027-4는 기계적 방법, 화학적 방법, 자가-부적합성(SI), 세포질 웅성 불임(CMS, 오구라(ogura) 또는 또 다른 시스템) 또는 핵 웅성 불임(NMS)의 이용을 포함하는, 당분야에서 공지되어 있는 다수의 방법들 중 임의의 방법에 의해 웅성 불임이 되도록 조작될 수도 있다. 용어 "웅성 불임이 되도록 조작된"은 카놀라 계통 NS-B50027-4의 웅성 불임 버전을 생성하도록 임의의 이용 가능한 기법을 이용하는 것을 의미한다. 웅성 불임은 부분적 또는 완전한 웅성 불임일 수 있다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 2001/29237호(융단층 특이적 프로모터의 조절 하에 있는 데아세틸라제(deacetylase) 유전자의 도입 및 화학물질 N-Ac-PPT의 적용); 국제 특허출원 공보 제WO 199213956호, 국제 특허출원 공보 제WO 199213957호(수술 특이적 프로모터); 및 문헌(Paul et al., 19 Plant Mol. Biol. 611 (1992))(바르나제(barnase) 및 바르스타(barstar) 유전자의 도입)을 참조하고, 미국 특허 제5,859,341호, 제6,297,426호, 제5,478,369호, 제5,824,524호, 제5,850,014호 및 제6,265,640호; 및 문헌(Hanson et. al., 16 Plant Cell S154 (2004))도 참조한다.
생물학적 및 물리적 식물 형질전환 프로토콜을 포함하는 다수의 식물 형질전환 방법들이 개발되었다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 2013185184호; 및 문헌(Miki et al., in METHS. PLANT MOLEC. BIOL. BIOTECHNOL. at 67-88 (Glick & Thompson, Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1993))을 참조한다. 추가로, 식물 세포 또는 조직 형질전환 및 식물의 재생을 위한 발현 벡터 및 시험관내 배양 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 2013185184호; 및 문헌(Gruber et al., METHS. PLANT MOLEC. BIOL. BIOTECHNOL. at 89-119 (Glick & Thompson, Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1993))을 참조한다. 발현 벡터를 식물 내로 도입하는 한 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 사용한다. 문헌(Horsch et al., 227 Sci. 1229 (1985)); 문헌(Curtis et al., 45 J. Exper. Botany 1441 (1994)); 문헌(Torres et al., 34 Plant Cell Tissue Organ Culture 279 (1993)); 문헌(Dinant et al., 3 Molec. Breeding 75 (1997)); 문헌(Kado, 10 Crit. Rev. Plant Sci. 1 (1991) (Ti and Ri plasmids of A. tumefaciens and A. rhizogenes, respectively, carry genes responsible for genetic transformation of plant)); 문헌(Gruber et al.); 문헌(Miki et al.); 문헌(Moloney et al., 8 Plant Cell Rep. 238 (1989) (Agrobacterium vector systems, methods for Agrobacterium-mediated gene transfer)); 및 미국 특허 제5,591,616호를 참조한다.
직접적인 유전자 전달로서 총칭되는 여러 식물 형질전환 방법들이 아그로박테리움 매개 형질전환에 대한 대안으로서 개발되었다. 일반적으로 적용될 수 있는 식물 형질전환 방법은 미립자가속장치(microprojectile) 매개 형질전환이고, 이때 DNA는 1 ㎛ 내지 4 ㎛를 측정하는 미립자가속장치의 표면 상에서 운반된다. 발현 벡터는 식물 세포벽 및 막을 침투하기에 충분한 300 m/s 내지 600 m/s의 속도까지 미립자가속장치를 가속화하는 바이올리스틱 디바이스(biolistic device)에 의해 식물 조직 내로 도입된다(Russell et al., 12 Plant Cell Rep. 165 (1993); Aragao et al., 20 Plant Mol. Biol. 357 (1992); Aragao et al., 12 Plant Cell Rep. 483 (1993); Aragao, 93 Theor. Appl. Genet. 142 (1996); Kim & Minamikawa 117 Plant Sci. 131 (1996); Sanford et al., 5 Part. Sci. Technol. 27 (1987); Sanford 6 Trends Biotech. 299 (1988); Klein et al., 6 Bio/technol. 559 (1988); Sanford, 7 Physiol. Plant 206 (1990); Klein et al., 10 Bio/technol. 268 (1992)).
DNA를 식물에게 물리적으로 전달하는 방법도 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Zhang et al., 9 Bio/technol. 996 (1991))(초음파처리); 문헌(Deshayes et al., 4 EMBO J., 2731 (1985))(리포좀); 문헌(Christou et al., 84 PNAS 3962 (1987))(스페로플라스트 NHW11915); 문헌(Hain et al., 199 Mol. Gen. Genet. 161 (1985))(CaC12 침전); 문헌(Draper et al., 23 Plant Cell Physiol. 451 (1982))(폴리비닐 알코올 또는 폴리-L-오르니틴); 문헌(Saker et al., 40 Biologia Plantarum, 507 (1997/98))(원형질체의 전기천공)을 참조한다. 추가 방법은 직접적인 유전자 전달 방법, 예컨대, 바이올리스틱 디바이스를 사용한 미립자가속장치 매개 전달, DNA 주입, 전기천공 등을 이용하여 발현 벡터를 식물 조직 내로 도입하는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 형질전환 후, 전술된 선택 가능한 마커 유전자의 발현은 당분야에서 잘 공지되어 있는 재생 및 선택 방법을 이용하여 형질전환된 세포, 조직 또는 식물을 우선적으로 선택할 수 있게 한다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 2013185184호를 참조한다.
상기 형질전환 방법들은 전형적으로 형질전환 계통을 생성하는 데 사용될 것이다. 그 다음, 신규 형질전환 카놀라 계통을 생성하기 위해 형질전환 계통을 또 다른 (형질전환되지 않았거나, 돌연변이되었거나 형질전환된) 계통과 교배시킬 수 있다. 대안적으로, 잘 공지되어 있는 형질전환 기법의 이용을 통해 특정 하이브리드 브라시카, 예컨대, 브라시카 나푸스 또는 브라시카 준세아 내로 조작된 유전 형질은 마찬가지로 식물 육종 분야에서 잘 공지되어 있는 전통적인 교배, 역교배 및 자가수분 기법의 이용을 통해 또 다른 계통 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 역교배 방법을 이용하여, 조작된 형질을 공개된 비-엘리트 근친교배 계통으로부터 엘리트 근친교배 계통 내로 이동시킬 수 있거나, 그의 게놈 내에 외래 유전자를 함유하는 근친교배 계통으로부터 그 유전자를 함유하지 않는 근친교배 계통 또는 계통들 내로 이동시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "교배"는 문맥에 따라 X와 Y의 단순한 교배 또는 역교배 과정을 의미할 수 있다.
용어 "NS-B50027-4 식물"이 본 실시양태의 문맥에서 사용될 때, 이것은 그 계통의 임의의 유전자 전환도 포함한다. 용어 "유전자 전환된 식물"은 역교배, 유전자 조작 또는 돌연변이에 의해 발생된 NS-B50027-4 식물을 지칭하고, 이때 역교배 기법, 유전자 조작 또는 돌연변이를 통해 NS-B50027-4 유래의 계통 내로 전달된 하나 이상의 유전자 이외에 품종의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 및 생리학적 특징들이 회복된다. 역교배 방법은 특징을 개선하거나 식물 품종 내로 도입하기 위해 본 실시양태와 함께 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "역교배"는 하이브리드 자손을 반복친과 역으로 반복하여 교배시키는 것, 즉 반복친과의 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회 또는 9회 이상의 역교배를 의미한다. 원하는 특징을 위해 유전자(들)를 기여하는 모본 식물은 "비반복친" 또는 "공여친"으로서 지칭된다. 이 용어는 비반복친이 역교배 프로토콜에서 1회 사용되므로, 반복되지 않는다는 사실을 의미한다. 비반복친으로부터 유전자 또는 유전자들을 전달받는 모본 브라시카 또는 카놀라 식물은 역교배 프로토콜에서 여러 라운드 동안 사용되기 때문에 반복친으로서 공지되어 있다(Poehlman & Sleper, 1994; Fehr, 1993). 전형적인 역교배 프로토콜에서, 관심 있는 원래의 품종(반복친)을, 전달될 관심 있는 유전자를 보유하는 제2 품종(비반복친)과 교배시킨다. 그 다음, 이 교배로부터 생성된 자손을 다시 반복친과 교배시키고, 비반복친으로부터 전달된 유전자(들) 이외에 반복친의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 및 생리학적 특징들이 전환된 식물에서 회복되어 있는 카놀라 또는 브라시카 식물이 수득될 때까지 이 과정을 반복한다. 따라서, NS-B50027-4로부터의 1개 또는 2개의 좌위가 또 다른 카놀라 또는 브라시카 계통 내로 전달될 수 있다.
적합한 반복친의 선택은 성공적인 역교배 절차를 위한 중요한 단계이다. 역교배 프로토콜의 목적은 원래의 계통에서 형질 또는 특징을 변경시키거나 치환하는 것이다. 이를 달성하기 위해, 본질적으로 모든 나머지 원하는 유전을 유지함으로써, 원래의 모본 계통의 원하는 생리학적 및 형태학적 특징을 유지하면서 반복친의 유전자를 비반복친으로부터의 원하는 유전자로 변형시키거나 치환한다. 특정 비반복친의 선택은 역교배의 목적에 의존할 것이다. 유전자이입의 일차 목적은 일부 상업적으로 바람직하고 작물학적으로 중요한 형질을 식물에 추가하는 것이다. 정확한 역교배 프로토콜은 적절한 시험 프로토콜을 결정하기 위해 변경될 특징 또는 형질에 의존할 것이다. 전달되는 특징이 우성 대립유전자일 때 역교배 방법이 단순화될지라도, 열성 대립유전자도 전달될 수 있다. 이 경우, 원하는 특징이 성공적으로 전달되는 지를 확인하기 위해 자손의 시험을 도입하는 것이 필요할 수 있다.
신규 계통의 개발에 있어서 통상적으로 선택되지 않으나, 역교배 기법에 의해 개선될 수 있는 유전 형질을 확인할 수 있다. 이러한 형질은 형질전환 형질일 수 있거나 형질전환 형질이 아닐 수 있다. 이 형질의 예로는 웅성 불임, 변형된 탄수화물 대사, 제초제 내성, 세균, 진균 또는 바이러스 질환에 대한 내성, 곤충 내성, 향상된 영양 품질, 산업적 사용, 수확량 안정성, 및 수확량 향상이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이 유전자들은 일반적으로 핵을 통해 유전된다. 미국 특허 제5,969,217호 및 제7,164,059호를 참조한다.
추가로, 근친교배 계통 NS-B50027-4의 재생산은 조직 배양 및 재생에 의해 일어날 수 있다. 용어 "조직 배양"은 동일하거나 상이한 유형의 단리된 세포, 또는 식물의 부분으로 조직화된 이러한 세포의 집단을 포함하는 조성물을 표시한다. 예시적 유형의 조직 배양물은 식물 또는 식물의 부분, 예컨대, 잎, 화분, 배아, 뿌리, 뿌리끝, 꽃밥, 암술, 꽃, 종자, 잎꼭지, 흡지 등에서 온전한 조직 배양물을 생성할 수 있는 원형질체, 유합조직, 분열조직 세포 및 식물 세포이다. 식물 조직 배양을 준비하고 유지하는 수단은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 카놀라의 다양한 조직들의 조직 배양 및 이로부터의 식물의 재생은 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Teng et al., 27 HortSci. 1030 (1992)); 문헌(Teng et al., 28 HortSci. 669 (1993)); 문헌(Zhang et al., 46 J. Genet. Breeding 287 (1992)); 문헌(Webb et al., 38 Plant Cell Tissue Organ Cult. 77 (1994)); 문헌(Curtis et al., 45 J. Exp. Bot. 1441 (1994)); 문헌(Nagata et al., 125 J. Am. Soc'y Hort. Sci. 669 (2000)); 문헌(Ibrahim, et al., 28 Plant Cell Tissue Organ Cult. 139 (1992)); 및 미국 특허 제5,959,185호, 제5,973,234호, 제5,977,445호 및 제8,816,111호를 참조한다. 카놀라 식물의 재생을 위한 조직 배양 및 소포자 배양은 성공적으로 달성될 수 있다. 문헌(Chuong et al., 4 Plant Cell Rep. 4 (1985)); 문헌(Barsby et al., 5 Plant Cell Rep. 101 (1986)); 문헌(Kartha et al., 31 Physiol. Plant 217 (1974)); 문헌(Narasimhulu et al., 7 Plant Cell Rep. 104 (1988)); 문헌(Swanson, 6 Meth. Molec. Biol. 159 (1990)); 및 문헌(Cell Culture Tech. & Canola Improvement, 66 J. Am. Oil Chem. Soc. 455 (1989))을 참조한다. 최신 기술 수준은 식물을 수득하는 이 방법들이 높은 성공률로 관례적으로 이용되는 정도라는 것이 문헌으로부터 분명하다. 따라서, 본 실시양태의 또 다른 양태는 생장 및 분화 시 근친교배 형질전환 계통 NS-B50027-4의 생리학적 및 형태학적 특징을 가진 카놀라 식물을 생성하는 세포를 제공한다.
일반적으로, 전이유전자를 전통적인 교배를 통해 식물 내로 도입할 때, 식물 게놈 내의 그의 삽입 부위 및 그의 플랭킹 영역은 변하지 않는다. "삽입 영역"은 (형질전환되지 않은) 식물 게놈에서 전이유전자의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 영역에 포함되는, 적어도 40개 염기쌍, 예컨대, 적어도 100개 염기쌍 또는 최대 10,000개 초과의 염기쌍의 영역에 상응하고 삽입 부위(및 가능한 표적 부위 결실)를 포함하는 영역을 지칭한다. 종 내에서의 돌연변이로 인한 경미한 차이를 고려할 때, 삽입 영역은 그 종의 소정의 식물 내의 외래 DNA의 업스트림 플랭킹 영역 및 다운스트림 플랭킹 영역과 적어도 85%, 예컨대, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 그러나, 식물 게놈 내로의 형질전환 카세트의 삽입은 종종 "표적 부위 결실"로서 지칭되는 식물 DNA의 결실과 관련되어 있을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 과도한 실험 없이 NS-B50027-4에서 추가 전이유전자 또는 다른 유전자 조작을 수행할 수 있고; NS-B50027-4 유래의 식물을 본원에 기재된 바와 같이 확인할 수 있다.
NS-B50027-4의 공급원 물질은 예를 들면, 세포질 웅성 불임 공급원, 또는 자성으로서 근친교배 계통을 불임시키기 위한 일부 다른 공급원과 역교배되는 경우 하이브리드 종자 생성을 위한 계통을 생성하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 계통은 직접적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 브라시카 나푸스 계통 NS-B50027-4를 또 다른 카놀라 식물과 교배시켜 제1 세대 F1 식물 집단을 형성할 수 있다. 이 방법에 의해 생성된 제1 세대 F1 식물 집단도 한 실시양태이다. 이 제1 세대 F1 식물 집단은 카놀라 계통 NS-B50027-4의 본질적으로 완전한 세트의 대립유전자들을 포함한다. 전형적으로, F1 하이브리드는 각각의 모본의 모든 대립유전자들을 가진 것으로 간주된다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 육종 교재 또는 분자 방법을 이용하여, 카놀라 계통 NS-B50027-4를 사용함으로써 생성된 특정 F1 식물을 확인할 수 있고, 임의의 이러한 개별 식물도 본 발명에 포함된다. 이 실시양태들은 계통 NS-B50027-4의 형질전환 또는 단일 유전자 전환과 함께 이 방법들의 이용도 커버한다.
또 다른 실시양태는 임의의 횟수로 반복친과 역교배시키는 데 있어서 카놀라 계통 NS-B50027-4를 사용하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 형질전환 방법, 역교배 방법, 또는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 다른 육종 방법을 이용하여, 카놀라 계통 NS-B50027-4의 유전자 프로파일의 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%를 보유하는 개별 식물 및 식물의 집단을 발생시킬 수 있다. 자손에 보유된 유전의 퍼센트는 혈통 분석에 의해, 또는 유전자 기법, 예컨대, 분자 마커 또는 전기영동의 이용을 통해 측정될 수 있다. 혈통 분석에서, 또 다른 계통과의 1회 교배 후 평균 50%의 출발 생식질이 자손 계통에게 전달될 것이고, 상이한 계통과의 또 다른 교배 후 평균 25%의 출발 생식질이 자손 계통에게 전달될 것이다. 분자 마커는 자손 계통의 혈통을 확인하고/하거나 결정하는 데 사용될 수도 있다.
카놀라 계통 NS-B50027-4로부터 유래한 계통을 생성하는 구체적인 방법은 다음과 같다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 카놀라 계통 NS-B50027-4를 또 다른 카놀라 식물, 예컨대, 엘리트/동질유전자 계통과 교배시킨다. 이 교배로부터 유래한 F1 종자는 생장되어 균질한 집단을 형성한다. F1 종자는 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터의 50%의 대립유전자 및 다른 식물의 50%의 대립유전자를 함유한다. F1 종자를 생장시키고 자가수분시켜, F2 종자를 형성한다. 평균적으로, F2 종자는 계통 NS-B50027-4로부터 유래한 50%의 그의 대립유전자 및 다른 카놀라 식물로부터 유래한 50%의 대립유전자를 갖지만, 집단으로부터의 다양한 개별 식물들은 이벤트 NS-B50027-4로부터 유래한 그들의 대립유전자를 훨씬 더 큰 퍼센트로 가진다(Wang et al., 40 Crop Sci. 659 (2000); Bernardo et al., 102 Theor. Appl. Genet. 986 (2001)). 이 문맥에서 사용된 바와 같이, 용어 집단은 통계학적으로 대표적인 샘플을 지칭한다. F2 종자를 생장시키고, 형질의 시각적 관찰 또는 측정을 기반으로 식물을 선택한다. 선택을 위해 사용된 형질은 카놀라 종자에서의 높은 DHA 생성이라는 카놀라 계통 NS-B50027-4 형질일 수 있다. 원하는 NS-B50027-4 유래의 형질을 나타내는 이벤트 NS-B50027-4 유래의 자손을 선택하고, 각각의 식물을 따로 수확한다. 각각의 식물로부터의 이 F3 종자를 개별 이랑에서 생장시키고 자가수분시킨다. 그 다음, 선택된 이랑 또는 이랑으로부터의 식물을 개별적으로 수확하고 탈곡한다. 선택은 마찬가지로 식물 표현형의 시각적 관찰, 또는 식물의 바람직한 형질, 예컨대, 바람직한 NS-B50027-4 유래의 형질의 측정에 기반을 둔다. 근친교배 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물이 수득될 때까지 생장 및 선택의 과정을 임의의 횟수로 반복한다.
NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물은 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터 유래한 바람직한 형질들을 함유하고, 이들 중 일부는 카놀라 계통 NS-B50027-4와 교배된 다른 카놀라 식물에 의해 발현되지 않을 수 있고, 이들 중 일부는 두 카놀라 계통들에 의해 발현될 수 있으나 비로소 NS-B50027-4에서 발현되는 수준 이상의 수준으로 발현된다.
NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물은 평균적으로 NS-B50027-4로부터 유래한 50%의 그의 유전자를 갖지만, 집단으로부터의 다양한 개별 식물들은 NS-B50027-4로부터 유래한 그들의 대립유전자를 훨씬 더 큰 퍼센트로 가진다. 교배, 자가수분 및 선택의 육종 과정을 반복하여, 평균적으로 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터 유래한 25%의 그의 유전자를 가진 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물의 또 다른 집단을 생성하나, 집단으로부터의 다양한 개별 식물들은 NS-B50027-4로부터 유래한 그들의 대립유전자를 훨씬 더 큰 퍼센트로 가진다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 높은 DHA라는 바람직한 NS-B50027-4 유래의 형질을 제공받은 근친교배 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물이다.
앞의 예는 다수의 방식들로 변형될 수 있고, 예를 들면, 선택은 모든 자가수분된 세대에서 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있고, 선택은 실제 자가수분 과정이 일어나기 전 또는 후에 일어날 수 있거나, 개별 선택은 기재된 육종 과정 동안 임의의 시점에서 개별 꼬투리, 식물, 이랑 또는 대지를 수확함으로써 수행될 수 있다. 추가로, 2배 반수체 육종 방법을 상기 과정의 임의의 단계에서 이용할 수 있다. 자가수분의 각각의 임의의 세대에서 생성된 식물의 집단도 본 실시양태들 중 한 실시양태이고, 각각의 이러한 집단은 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터의 대략 50%의 그의 유전자를 함유하는 식물로 구성될 것이고, 교배, 자가수분 및 선택의 제2 주기에서 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터의 25%의 그의 유전자를 함유하는 식물로 구성될 것이고, 교배, 자가수분 및 선택의 제3 주기에서 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터의 12.5%의 그의 유전자를 함유하는 식물로 구성될 것이다.
또 다른 실시양태는 카놀라 계통 NS-B50027-4를 또 다른 카놀라 식물과 교배시키고 2배 반수체 방법을 F1 종자 또는 F1 식물, 또는 이 교배의 자가수분에 의해 수득된 임의의 세대의 카놀라 계통 NS-B50027-4에 적용함으로써 동형접합성 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물을 수득하는 방법이다. 혈통 육종은 자가수분 작물, 또는 타가수분 작물의 근친교배 계통의 개선을 위해 통상적으로 이용된다. 유리한 상보적 형질을 가진 2개의 모본들을 교배시켜 F1을 생성한다. 1개 또는 여러 F1을 자가수분시키거나 2개의 F1을 이종교배(형매교배)시킴으로써 F2 집단을 생성한다. 가장 우수한 개체의 선택을 통상적으로 F2 집단에서 시작한다. 그 다음, F3에서 시작하여, 가장 우수한 가계에서 가장 우수한 개체를 선택한다. 낮은 유전성을 가진 형질에 대한 선택의 효과를 개선하기 위해 종종 F4 세대에서 가계, 또는 이 가계의 개체들을 포함하는 하이브리드 조합의 반복된 시험이 뒤따른다. 근친교배의 진행된 단계(즉, F6 및 F7)에서, 가장 우수한 계통, 또는 표현형적으로 유사한 계통들의 혼합물을 신규 재배종으로서의 공개 가능성에 대해 시험한다.
추가로, 본 실시양태는 카놀라 계통 NS-B50027-4를 카놀라 식물과 교배시키고 자손 종자를 생장시키고, NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물을 사용한 생장 단계로 교배를 1회 또는 2회, 1회 내지 3회, 1회 내지 4회, 또는 1회 내지 5회 반복하고, 제1 교배, 제2 교배, 제3 교배, 제4 교배 또는 제5 교배 후 임의의 횟수로 자가수분시킴으로써 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 대량 및 반복 선택을 이용하여 자가수분 또는 타가수분 작물의 집단을 개선할 수 있다. 이형접합성 개체의 유전적으로 변이 가능한 집단은 여러 상이한 모본들의 이종교배에 의해 확인되거나 생성된다. 개체 우수성, 뛰어난 자손 또는 현저한 조합 능력을 기준으로 가장 우수한 식물을 선택한다. 선택된 식물을 이종교배시켜 신규 집단을 생성하고, 이 집단에서 추가 선택 주기를 계속한다. 이 과정을 이용하여 NS-B50027-4를 다른 LC-PUFA 형질전환 계통과 조합하여, 동형접합성 계통에서 카피 수를 효과적으로 증가시킴으로써 종자에서 LC-PUFA 생성을 증가시킬 수 있다. 이 기법은 전이유전자를 형질전환되기 어려운, 생장력이 강한 계통 내로 도입하는 데 유리하고, 형질전환 좌위가 NS-B50027-4의 염색체와 상이한 염색체에 존재하는 것으로 공지되어 있는 경우, 예를 들면, A06 내의 형질전환 좌위는 NS-B50027-4 좌위 A02 및 A05와 조합될 수 있다. 이러한 교배로부터의 동형접합성 계통은 형질전환 삽입체의 6개 카피를 포함한다. 유전자 침묵이 발현을 관리 불가능한 효과까지 억제하지 않는 경우, LC-PUFA 생성은 실질적으로 증가될 수 있다. 실제로, 6개의 형질전환 좌위(전체 단일 x NS-B50027-4)를 포함하는 동형접합성 F4 실험 계통(전체 단일 x NS-B50027-4)은 약 25% DHA(종자 내의 총 지방산의 중량%)를 생성하였다.
역교배 육종은 단순히 유전되는 고유전성 형질에 대한 유전자를 반복친인 바람직한 동형접합성 재배종 또는 계통 내로 전달하는 데 사용되고 있다. 전달될 형질의 공급원은 공여친으로서 지칭된다. 생성된 식물은 반복친(예를 들면, 재배종)의 속성 및 공여친으로부터 전달된 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다. 초기 교배 후, 공여친의 표현형을 가진 개체를 선택하고 반복친과 반복적으로 교배(역교배)시킨다. 생성된 식물은 반복친(예를 들면, 재배종)의 속성 및 공여친으로부터 전달된 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다.
엄격한 의미로 단일 종자 계보(descent) 절차는 분리 집단을 심고, 식물당 1개의 종자 샘플을 수확하고 하나의 종자 샘플을 사용하여 다음 세대를 심는 것을 의미한다. 집단이 F2부터 원하는 수준의 근친교배까지 진행되었을 때, 계통의 기원이 되는 식물을 상이한 F2 개체까지 각각 추적할 것이다. 일부 종자들이 발아하지 못하거나 일부 식물들이 적어도 하나의 종자를 생성하지 못하기 때문에, 집단에서의 식물의 수는 각각의 세대와 함께 감소한다. 그 결과, 집단에서 최초로 샘플링된 모든 F2 식물들이 세대 진행의 완결 시 자손으로 나타나지는 않을 것이다.
추가 실시양태는 NS-B50027-4의 단일 유전자 전환을 제공한다. DNA 서열이 전통적인(비-형질전환) 육종 기법, 예컨대, 역교배를 통해 도입될 때 유전자 전환이 일어난다. DNA 서열은 천연 생성 DNA 서열이든 아니면 전이유전자이든 관계없이 이 전통적인 육종 기법의 이용을 통해 도입될 수 있다. 이 과정을 통해 전달되는 원하는 형질은 생식력 변형, 지방산 프로파일 변형, 다른 영양 향상, 산업적 향상, 질환 내성, 곤충 내성, 제초제 내성 및 수확량 향상을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 관심 있는 형질은 공여친으로부터 반복친(이 경우 본원에 개시된 카놀라 식물)으로 전달된다. 단일 유전자 형질은 우성 대립유전자 또는 열성 대립유전자의 전달로부터 비롯될 수 있다. 관심 있는 형질을 함유하는 자손의 선택은 우성 대립유전자와 관련된 형질에 대한 직접적인 선택에 의해 수행된다. 열성 대립유전자를 통해 전달되는 형질에 대한 자손의 선택은 어느 식물이 열성 대립유전자를 보유하는 지를 확인하기 위해 제1 역교배를 생장시키고 자가교배(자가수분)시킬 것을 요구한다. 열성 형질은 관심 있는 유전자의 존재를 확인하기 위해 연속 역교배 세대들에서 추가 자손 시험을 요구할 수 있다. 관심 있는 형질에 대한 선택과 함께, 반복친의 표현형에 대해 자손을 선택한다. 때때로 추가 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 유전자가 관심 있는 단일 유전자 전환 형질과 함께 전달된다는 것이 이해될 것이다. 반복친(본원에 개시된 카놀라 식물)으로부터의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 유전자를 함유하고 유전자 전환 형질을 함유하는 자손은 NS-B50027-4의 유전자 전환인 것으로 간주된다. 형질이 2개의 유전자들(예를 들면, 일부 질환 내성)에 의해 조절될 때, 2개의 유전자들에 대한 선택이 수행된다. 본원에 기재된 실시양태의 특정 양태는 또 다른 형질전환 식물에서 LC-PUFA 생성을 증가시키기 위한 NS-B50027-4의 4-유전자 분리개체(염색체 A02에 삽입된 4-유전자 좌위)의 용도를 제공한다.
돌연변이 육종은 신규 형질을 카놀라 품종 내로 도입하는 또 다른 방법이다. 자연발생적으로 일어나거나 인공적으로 도입된 돌연변이는 식물 육종자에게 변이 가능성의 유용한 공급원일 수 있다. 인공 돌연변이유발의 목적은 원하는 특징에 대한 돌연변이율을 증가시키는 것이다. 돌연변이율은 온도, 장기간 종자 저장, 조직 배양 조건, 방사선(예컨대, X-선, 감마 선, 중성자, 베타 방사선 또는 자외선), 화학적 돌연변이유발제(예컨대, 염기 유사체, 예컨대, 5-브로모-우라실), 항생제, 알킬화제(예컨대, 황 머스타드, 질소 머스타드, 에폭사이드, 에틸렌아민, 설페이트, 설포네이트, 설폰 또는 락톤), 아자이드, 하이드록실아민, 아질산 또는 아크리딘을 포함하는 많은 상이한 수단들에 의해 증가될 수 있다. 일단 원하는 형질이 돌연변이유발을 통해 관찰되면, 전통적인 육종 기법으로 상기 형질을 기존 생식질 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Fehr, PRINCIPLES CULTIVAR DEVEL. (Macmillan Pub'l Co., 1993))을 참조한다. 예를 들면, 돌연변이는 Δ4-데사투라제 전이유전자의 발현을 파괴함으로써 NS-B50027-4에서의 DPA의 생성을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
본 실시양태의 카놀라 계통은 앞서 논의된 참고문헌에 기재된 바와 같이 세포질 유전자, 핵 유전자 또는 다른 인자의 관례적인 조작을 통해 웅성 불임 형태로 생성될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이러한 실시양태도 본 청구범위 내에 있다. 따라서, 본 실시양태는 카놀라 계통 NS-B50027-4의 사용에 의해 생성된 F1 하이브리드 종자 및 식물을 제공한다. 따라서, 또 다른 실시양태는 NS-B50027-4의 DHA 형질을 웅성 불임 엘리트 브라시카 계통 내로 유전자이입하고; NS-B50027-4의 DHA 형질을 가임 제2 엘리트 브라시카 계통 내로 유전자이입하고; 상기 2개의 계통들을 교배시켜 하이브리드 자손을 수득하고; 상기 하이브리드 자손의 종자를 재배하고; 재배된 하이브리드 자손에 의해 생성된 곡물을 수확함으로써 DHA 함유 카놀라 종자를 생성하는 방법을 제공한다. 하이브리드 종자의 자손으로부터 오일을 추출하는 추가 단계는 DHA 함유 카놀라 오일을 제공한다.
식물 유전형의 분석, 비교 및 특징규명을 위해 이용될 수 있는 많은 실험 기반 기법들이 존재하고; 이들 중에는 이소자임 전기영동, 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 무작위적으로 증폭된 다형성 DNA(RAPD), 임의로 프라이밍된 중합효소 연쇄 반응(AP-PCR), DNA 증폭 핑거프린팅(DAF), 서열 특징규명된 증폭된 영역(SCAR), 증폭된 단편 길이 다형성(AFLP), 단순한 서열 반복부(SSR)(마이크로세틀라이트로서도 지칭됨) 및 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)이 있다. 본원의 실시예 3은 NS-B50027-4 및 이로부터 유래한 자손의 분석을 위한 KASP 어세이를 제공한다. 서열번호 1 내지 서열번호 90으로 제공된 프라이머들로부터 선택된 프라이머는 다른 서열 기반 기법에 적합하게 맞추어질 수도 있다.
이소자임 전기영동 및 RFLP는 유전자 조성을 확인하는 데 널리 이용되고 있다. 문헌(Shoemaker & Olsen, in GENETIC MAPS: LOCUS MAPS OF COMPLEX GENOMES, at 6.131 (O'Brien, Ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1993))(약 365개의 RFLP, 11개의 RAPD, 3개의 고전적인 마커 및 4개의 이소자임 좌위를 사용한 25개의 연관 군들로 구성된 분자 유전자 연관 지도)을 참조하고; 문헌(Shoemaker, in DNA-BASED MARKERS IN PLANTS, 299 (Phillips &Vasil, Eds., Kluwer Acad. Press, Dordrecht, Netherlands, 1994))도 참조한다.
SSR 기술은 현재 효율적이고 실용적인 마커 기술이고; 보다 더 많은 마커 좌위들이 관례적으로 사용될 수 있고, RFLP에 비해 SSR을 사용할 때 마커 좌위당 더 많은 대립유전자들을 발견할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Diwan & Cregan, 95 Theor. Appl. Genet. 22 (1997))을 참조한다. SNP는 본 발명의 독특한 유전자 조성, 및 그 독특한 유전자 조성을 보유하는 자손 품종을 확인하는 데 이용될 수도 있다. 다양한 분자 마커 기법들이 전체 해상도를 향상시키기 위해 함께 이용될 수도 있다. 이소자임 전기영동, RFLP, RAPD, AP-PCR, DAF, SCAR, AFLP, SSR 및 SNP와 같은 기법의 이용을 통해 확인된 마커를 포함하는 분자 마커가 식물 육종에서 사용될 수 있다. 분자 마커의 한 사용은 정량적 형질 좌위(QTL) 맵핑이다. QTL 맵핑은 정량적 형질에 대한 측정 가능한 효과를 가진 대립유전자와 밀접하게 연관되어 있는 것으로 공지되어 있는 마커의 사용이다. 육종 과정에서의 선택은 긍정적 영향 대립유전자와 연관된 마커의 축적, 또는 식물의 게놈으로부터의 부정적 영향 대립유전자와 연관된 마커의 제거에 기반을 둔다.
분자 마커는 정성적 형질의 선택을 위해 육종 과정 동안 사용될 수도 있다. 예를 들면, 대립유전자와 밀접하게 연관된 마커 또는 관심 있는 실제 대립유전자 내의 서열을 함유하는 마커는 역교배 육종 프로그램 동안 관심 있는 대립유전자를 함유하는 식물을 선택하는 데 사용될 수 있다. 상기 마커는 반복친의 게놈 및 공여친의 마커에 대해 선택하는 데 사용될 수도 있다. 이 절차는 선택된 식물에 남아 있는 공여친으로부터의 게놈의 양을 최소화하고자 한다. 이 절차는 역교배 프로그램에 필요한 반복친과의 역교배 수를 감소시키는 데 이용될 수도 있다. 선택 과정에서 분자 마커의 사용은 종종 유전자 마커에 의해 향상된 선택 또는 마커에 의해 보조된 선택으로서 지칭된다. 분자 마커는 교배를 통해 유전자 프로파일을 추적하는 수단을 제공함으로써 식물의 모본 품종 또는 원형종(ancestor)으로서 생식질의 일부 공급원을 확인하고 배제하는 데 사용될 수도 있다.
따라서, 최신 기술 수준에서 식물을 수득하는 이 방법들이 관례적으로 이용되고 높은 성공률을 가진다는 점에서 "보편적"이라는 것은 분명하다. 카놀라 계통 NS-B50027-4의 유용성은 다른 종과의 교배까지 확장된다. 통상적으로, 적합한 종은 브라시카세아(Brassicacea) 과의 종이다. 따라서, 자가수분, 혈통 육종, 역교배, 하이브리드 생성 및 집단과의 교배를 포함하는, 육종에서 카놀라 엘리트 이벤트 NS-B50027-4를 사용하는 임의의 모든 방법들이 본 실시양태에 포함된다. 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터 유래한 품종으로부터 발생된 모든 식물들 및 식물 집단들을 포함하는, 카놀라 계통 엘리트 이벤트 NS-B50027-4를 모본으로서 사용함으로써 생성된 모든 식물들 및 식물 집단들이 이 실시양태의 범위 내에 있다. 독특한 분자 마커 프로파일 또는 육종 기록은 카놀라 계통 NS-B50027-4로부터 유래한 자손 계통 또는 자손 집단을 확인하기 위해 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 사용될 수 있다. 본 실시양태의 특정 양태는 NS-B50027-4로부터 분리된 A02 좌위가 보편적인 육종 기법에 의해 도입되어 있는 형질전환 식물에서의 LC-PUFA 생성에 있어서 예상외의 장점을 제공한다.
실시예
실시예 1. 실험 들판 시험에서 계통 NS-B50027-4의 특징규명 및 선택
대부분의 형질들의 경우 진정한 유전형 가치가 다른 교락 식물 형질 또는 환경적 요인에 의해 가려질 수 있기 때문에, 식물 육종에서의 어려운 과제는 유전적으로 우수한 개별 식물의 확인이다. 우수한 식물을 확인하는 한 방법은 그의 성능을 다른 실험적 식물 및 하나 이상의 널리 생장되는 표준 재배종과 비교하여 관찰하는 것이다. 단회 관찰로 결론에 이르지 못하는 경우, 반복된 관찰은 유전적 가치의 보다 더 우수한 평가를 제공한다.
식물당 하나의 종자의 샘플을 수확하고 하나의 종자 샘플을 사용하여 다음 세대를 심음으로써 단일 종자 계보 절차를 기반으로, B0050-027-18로서 최초로 확인된 식물을 선택하였다. 일반적으로, 일부 종자들이 발아하지 못하거나 일부 식물들이 적어도 하나의 종자를 생성하지 못하기 때문에, 집단 내의 식물의 수는 세대를 거치면서 감소한다. 그 결과, 집단에서 최초로 샘플링된 모든 식물들이 세대 진행의 완결 시 자손으로 표시되지는 않는다. 더욱이, 원래의 형질전환 이벤트는 자손의 유전형 또는 표현형에 대한 예측이 종종 부정확할 정도로 유전의 복잡성을 악화시킨다. 따라서, 특정 계통이 동형접합성을 갖게 되고 뛰어난 작물학적 성질을 가진 선택된 형질을 나타내고 진정한 육종 자손의 균질한 집단을 생성할 때까지, 실험 식물을 자가수분시키고 연속 세대에 대한 유형에 대해 선택하였다. 보다 구체적으로, 누시드 이노베이션 센터(Nuseed Innovation Centre; NIC)(호주 빅토리아 호샴 소재)에서 육종 재선택 프로그램 후 실험적 계통을 선택하였다. 후보 계통의 선택 및 진행은
(a) T-DNA 삽입체의 카피 수;
(b) DHA 발현의 분리 패턴;
(c) (지방산 표현형 및 유전형에 기반을 둔) 동형접합성;
(d) LC-ω3-DHA의 생성; 및
(e) 겨울 및 여름에 걸쳐 위치에서의 자손 시험에 기반을 둔, 작물 생성에 적합한 작물학적 형질
에 기반을 두었다.
호주에서, 카놀라는 남쪽 육지 경작 구역에 걸쳐 주로 겨울이 우세한 강우 환경 내에서 생장한다. 호주 생산은 주로 춘화처리 요구가 낮은 춘계형 카놀라 재배종으로부터의 생산이다. 일반적으로, 호주 재배종은 전형적으로 개화의 시작에 있어서 약간의 지연을 유지하고 겨울에 비해 상대적으로 높은 식물 생장력 또는 바이오매스 생성을 가진다. 호주에서 카놀라 작물은 전형적으로 첫 주요 강우가 발생한 후 4월부터 5월까지 파종되고, 10월부터 12월까지 수확된다. 수확량은 주로 생장 시기 동안 이용 가능한 물 및 재배종의 물 사용 효율에 의해 영향을 받는다. 렙토스패리아 마쿨란스(Leptosphaeria maculans)에 의해 야기된 흑갈병(blackleg disease)에 대한 주요 병원형 유전자 내성은 묘목 생존 및 줄기 동고병의 관점에서 재배종을 구별할 수 있으나, 호주 재배종은 권장된 작물학적 관행 하에서 생장될 때 일반적으로 높은 내성을 가진 것으로 간주된다. 종자 발생은 5개월 내지 7개월의 생장 시기 후에 일어나고, 늦은 봄 또는 초여름에 일어난다. 물 이용률과 별도로, 수확량은 종자 및 종자 꼬투리의 발육정지를 야기할 수 있는 큰 온도 극치(<0℃ 내지 >35℃)에 의해 유의미하게 영향을 받을 수 있다.
본원에서 인지된 바와 같이, LC-ω3 지방산, 특히 DHA의 종자 특이적 축적을 야기하는 8-유전자 구축물(DHA 생합성 경로를 위한 7개의 효소들 및 마커)을 사용하여 카놀라 생식질의 형질전환을 착수하였다. 일반적으로, 식물이 마커 유전자(MG)를 보유하였을지라도, 표현형은 생성물 품질(PQ)(생성된 오메가-3 지방산)을 특징으로 하였다. 형질전환된 물질을 좌위 동형접합성, 종자에서의 DHA의 발현, 및 상업적 생산에 적합한 작물학적 형질 및 수확 잠재력에 대해 재선택하였다. 시험 계통은 형질전환된 묘목(품종 AV Jade)으로부터 유래하였다. 식물이 격리된 상태(즉, 방충 텐트)에서 자가수분하게 함으로써 실험 종자의 부피를 증가시켰다.
형질전환 이벤트로부터의 3개의 T2 세대 유래의 형매들을 호주에서 8개의 실험 들판 위치들(장소들) 전체에 걸쳐 다양한 중요한 작물학적 및 종자 형질들에 대해 8개의 다른 상업적 카놀라 재배종들(계통들)과 비교하였다(호주 및 캐나다에서의 후속 들판 시험은 이하에 기재되어 있다). 8개의 호주 장소들은 장소 평균 장소 수확량의 범위로 표시된 광범위한 환경적 수확 잠재력(즉, AV Garnet: 0.7 내지 2.4 t/ha)을 대표하였다. 형질전환 형매들은 하기 시험 계통들로 대표되었다: NS-B50027-4(T3), B0050-027-18-36-13(T4) 및 B0050-027-18-105-13(T4). 추가로, NS-B50027-4를 캐나다의 실험 대지에서 생장시켰고, 작물학적 및 종자 형질을 비-형질전환 카놀라 계통과 비교하였다. 추가 NS-B50027-4 T3 및 T5 세대들도 비-형질전환 계통, 및 상이한 형질전환 좌위(즉, 분리된 A05 및 A02)를 각각 보유하는, NS-B50027-4로부터 이종교배된 2개의 형질전환 분리개체들과 비교하였다(실시예 2 참조). 시험 계통의 작물학적 형질 변이는 시험된 모든 환경 전체에 걸쳐 평가된 상업적 재배종의 작물학적 형질 변이에 필적할만하였다. 이 결론은 장소 전체에 걸쳐 수행된 분석(MET-REML)에 기반을 둘 때, 최고 수확량을 제공하는 시험 계통의 곡물 수확량이 최고 수확량을 제공하는 상업적 재배종에 통계학적으로 필적할만하였다는 발견에 의해 뒷받침되었다. 나아가, 유의미한 차이가 없는 한 장소를 제외하고 각각의 장소에 대해, 최고 수확량을 제공하는 시험 계통은 적어도 하나의 재배종보다 유의미하게 더 높은 수확량을 제공하였다. 상기 시험 계통은 약간 더 낮은 퍼센트 종자 오일 및 변경된 지방산 조성을 가진 종자를 생성하였으나, 이것은 수확량 또는 작물학적 성능에 영향을 미치지 않았다. LC-ω3 DHA 지방산의 발현은 시험된 환경 전체에 걸쳐 매우 안정하였다.
비교를 위해 사용된 대조군 재배종(상업적 육종 계통)은 경작 구역에서 넓게 생장된, 작물학적으로 다양한(예를 들면, 식물 습성, 생물계절학) 범위의 잘 적응된(즉, 높으나 상이한 수확 잠재력 및 오일 함량) 재배종들을 제공하였다. 이 재배종들은 모두 방임수분되고, 예를 들면, 문헌(Australian National Variety Testing Program and Regional annual crop reports)에 기재되어 있고 광범위하게 평가되어 있다. "nvtonline" 웹사이트를 참조한다. 추가로, 식물 질환 내성에 대한 변이는 호주에서 흑갈병에 대해 잘 기재되어 있다(Van De Wouw et al., 67 Crop & Pasture Sci. 273 (2015)). 호주에서, 흑갈병은 최대 90%의 수확량 손실을 야기할 수 있다( Marcroft & Bluett, Agricul. Notes, AG1352, Victoria, Dept. Primary Indus. (2008)). 특정 종자 지방산 조성 및 종자 오일 함량에 대한 상업적 재배종들 사이의 유전자 변이는 시간에 따라 기록되어 있다. 문헌(Seberry et al., Quality of Australian Canola 2011 (Australian Oilseeds Fed., 2012))을 참조한다. 재배종 AV Jade로부터의 식물은 형질전환 T0를 생성하도록 형질전환되었으므로, AV Jade는 본원에 기재된 형질전환 이벤트의 형질전환되지 않은 이소계통(isoline)인 것으로서 간주될 수 있다.
시험 계통에 대한 표현형 변이는 식물 출현, 식물 생장력, 개화 시기, 개화 지속시간, 식물 높이, 종자 탈립, 도복 내성, 흑갈병 중증도, 식물 수확 카운트, 곡물 수확량, 곡물 수분, 퍼센트 종자 오일, 및 지방산 함량, 특히 구체적으로 EPA, DPA 및 DHA의 수율에 관한 종자 LC-ω3 다중불포화 지방산(LC-PUFA)을 특징으로 하였다. 통계학적 소프트웨어 GenStat에서 ASREML을 이용하여, 측정된 모든 형질들에 대한 제한 추정 확률 분석을 착수하였다(Gilmour et al., ASREML user guide, release 3.0, Biometric Bulletin (3) (VSV Int'l, Waterhouse Stm Hemel Hempstead, UK, 2009)). 들판 식물 육종 및 유전학 연구를 위해 광범위하게 기재되고 이용된 바와 같이, 선형 혼합 모델 통계학적 방법을 이용하여 들판 공간적 변동을 설명하였다(Cullis & Gleeson, 47 Biometrics 1449 (1991); Smith et al., 57 Biometrics 1138 (2001); Welham et al., Analysis of linear mixed models by ASReml-R with Applications in Plant Breeding: Course Notes (VSV Int'l, Waterhouse Stm Hemel Hempstead, UK, 2013). 곡물 수확량(t/ha)에 대한 메타-REML 분석도 장소 전체에 걸쳐 착수하여, 시험된 계통에 대한 최적 선형 비편향 예측(BLUP)을 장소 전체에 걸쳐 확인하였다.
보다 더 빈번하고 상세한 측정치를 모든 환경들로부터 얻었다. 파종한 지 14일 후, 각각의 대지에서 2개의 무작위 1 평방 미터 사분원에 대한 식물 출현 확립 카운트를 수행하였다. 평방 미터당 출현한 식물의 수를 형질 변량으로서 분석하였다. 대지당 평균 식물 밀도의 가시적 추정치에 기반을 둔 식물 출현 점수도 모든 장소들 전체에 걸쳐 각각의 대지에 대해 기록하였고 형질 변량으로서 분석하였다(1: 낮음 = 0개 내지 5개 식물/m2; 5: 중간 = 25개 내지 30개 식물/m2; 9: 높음 = 45개 내지 50개 식물/m2). 평방 미터당 수에 기반을 둔 식물 출현 및 식물 출현 점수는 모든 8개의 장소들에 대해 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 형질전환 계통의 식물 출현에 대한 통계학적 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게(P <0.05) 있었다. 식물 생장력은 바이오매스에 기반을 두었고, 1(낮음: 대지 지면의 <10% 잎 면적 커버율) 내지 9(높음: 대지 지면 커버의 >90% 잎 커버율) 등급으로 점수화되었고 분석되었다. 식물 생장력은 7개의 장소들 중 6개의 장소들에 대해 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 장소 식물 평균 생장력 점수는 모든 8개의 장소들에서 6(대지 바닥의 60% 내지 70% 잎 커버율)이었고; 변동은 상대적으로 일정하였는데, 이것은 이 형질에 대한 낮은 환경 효과를 시사한다. 통계학적으로, 시험 계통들에 대한 식물 생장력에 대한 변동은 모든 위치들 전체에 걸쳐 재배종들에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게 있었다.
개화 시기는 파종부터 실험 대지 내의 50%의 식물이 적어도 하나의 핀 꽃을 가졌을 때까지 일수로서 기록되었다. 이것은 모든 시험들 전체에 걸쳐 각각의 대지에 대해 기록되었고 형질 변량으로서 분석되었다. 개화는 모든 장소들에 대해 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 장소 평균 개화 시기는 99일 내지 110일이었고, 실험 장소들 전체에 걸쳐 이 형질에 대한 환경적 차이의 표시이다. 통계학적으로, 형질전환 계통의 개화 시기에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게 있었다.
개화 지속시간은 개화 시기와 개화 시기의 말기 사이의 계산된 차이(일수로서 표현됨)이었다. 이것은 모든 시험들 전체에 걸쳐 각각의 대지에 대해 계산되었고 형질 변량으로서 분석되었다: 개화 지속시간 = 개화 말일 - 개화 시기(50%). 장소 평균 개화 시기는 평균보다 더 짧은 24일 내지 30일이었고 적당한 등숙을 우세하게 하는 조건을 반영하였다. 통계학적으로, 형질전환 계통의 개화 지속시간에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게 있었다.
평방 미터당 식물에 기반을 둔, 수확 시 식물은 모든 8개의 장소들에 대해 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다. 형질전환 계통에 대한 수확 시 식물 수에 대한 변동은 모든 식재 및 위치 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게(P <0.05) 있었다. 출현 시 식물의 수는 수확 시 기록된 식물의 수와 유의미한 상관관계를 가졌다. 계산된 생존 퍼센트의 일부는 100%를 초과하였는데, 이것은 2개의 재배종들(ATR Wahoo 및 AV Jade)에서 느린 묘목 출현을 반영하였다: 모든 묘목들이 식물 출현 카운트가 기록된 때에 출현한 것은 아니다.
생리학적 성숙 시 식물 높이는 대지의 중심에서 기부부터 생장 정점까지 측정되었다. 대지의 중심을 사용하여, 대지간 공간적 면적과 관련되어 있을 가능성 있는 교락 효과(가장자리 효과)를 피하였다. 모든 시험들 전체에 걸쳐 각각의 대지에 대해 이 형질을 기록하였고 형질 변량으로서 분석하였다. 성숙 시 식물 높이(cm)는 모든 장소들에 대해 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 장소 평균 식물 높이는 63 cm 내지 105 cm이었고, 실험 장소들 전체에 걸쳐 이 형질에 대한 환경적 차이를 표시하였다. 형질전환 계통에 대한 성숙 시 높이에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게(P <0.05) 있었다.
2주 기간에 걸쳐 기록된, 평방 미터의 8분의 1당 종자 탈립 카운트를 이용하여 성숙 시 종자 탈립(종종 꼬투리 탈립으로서 지칭됨)을 분석하였다. 모든 위치들에서 각각의 대지에 대해 파종된 이랑들 사이 및 차양 아래에 2개의 트레이들을 배치함으로써 이것을 착수하였고, 형질 변량으로서 분석하였다. 수확 직전에 지면에서 관찰된 종자의 수를 기반으로, 한 장소에서 (1[영점] 내지 9[높음: +40]의 등급에 기반을 둔) 종자 탈립 점수도 기록하였고 형질 변량으로서 분석하였다. 수확 시 지면에 있는 종자의 수에 기반을 둔 종자 탈립은 8개의 장소들 중 4개의 장소들에 대해 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 장소 평균 종자 탈립 수는 (평방 미터의 8분의 1당) 3 내지 15이었고, 모든 장소들 전체에 걸쳐 낮은 수준의 탈립을 표시하였다. 장소들 중 한 장소에서 종자 탈립 점수도 계통들 사이에 유의미하게 상이하였고, 장소 전체에 걸쳐 평균 종자 탈립 카운트와 밀접한 상관관계를 가졌다. 이것은 점수로서 기록된 탈립이 종자 탈립의 우수한 예측자이었다는 것을 표시한다. 통계학적으로, 형질전환 계통에 대한 종자 카운트 및 점수에 기반을 둔 종자 탈립에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게 있었다.
성숙 시 식물의 기부로부터 식물이 기울어진 각도를 기반으로 점수화된 도복 저항성을 1(저항성) 내지 9(민감성)로서 기록하였다. 식물 도복에 대한 통계학적으로 유의미한 변동은 없었다. 이 형질에 대한 변동의 결여는 후기 꼬투리 충전 단계에서 평균 미만의 강우와 관련되어 있을 가능성이 있다.
렙토스패리아 마쿨란스 및 렙토스패리아 비글로보사(Leptosphaeria biglobosa)를 대표하는 흑갈병 잎 중증도 증상을 5개의 장소들 전체에 걸쳐 1개의 복제물에 대한 1(낮음: <5%) 내지 9(높음: >40%) 점수로서 기록하였다. 관찰 가능한 변동의 결여로 인해, 모든 대지들이 점수화되지는 않았다. 동고병과 관련된 증상 및 줄기 부러짐은 관찰되지 않았다. 관찰된 흑갈병 잎 증상은 모든 8개의 장소들에서 매우 낮은 수준으로 존재하였다. 텅 빈 종자(살진균제로 처리되지 않은 종자)를 사용하여 한 장소를 파종하였다. 이 장소와 종자 살진균제로 처리된 다른 장소 사이에 시험된 계통들 중에서 식물 출현의 상대적 차이는 없었다. 잎 증상이 렙토스패리아 마쿨란스에 의해 야기된 줄기 동고병의 정도(수확량 손실의 주원인 및 호주에서의 내성 평가에 대한 기준, 문헌(Sosnowski et al., 33 Australian Plant Pathol. 401 (2004)) 참조)를 항상 예측하지는 않는다. 여러 연구들은 들판 조건 하에서 떡잎, 잎, 줄기(동고병) 및 식물 생존에 대한 병원체 감염을 기반으로 흑갈병 내성을 평가하였다. 동고병 및 줄기 부러짐의 결여를 고려할 때, 카놀라 계통은 본원에 기재된 목적을 위한 본 질환 압력에 대한 내성을 가진 것으로서 간주될 수 있다.
모든 8개의 장소들에서 각각의 대지 내의 2개의 1 평방 미터 사분원들에서 식물을 카운팅함으로써 식물 수확 카운트를 평가하였다. 그 다음, 두 사분원들의 평균을 사용하여 평방 미터당 식물의 수를 평가하였고 형질 변량으로서 분석하였다. 식물 출현 카운트에 대한 장소 평균의 %로서 식물 카운트에 대한 장소 평균을 표현함으로써 식물 생존 퍼센트(%)를 계산하였다: 식물 생존율 % = (식물 수확 카운트 x 100)/식물 출현 카운트.
실험 종자가 생리학적으로 성숙하였을 때 대지 수확기를 이용하여 곡물을 수확하였다. 수확 방향 오류를 피하기 위해 각각의 시험에 대해 수확 방향을 일정하게(즉, 각각의 이랑에 대해 앞면부터 뒷면 범위까지) 유지하였다. 각각의 대지에 대한 건조된 곡물 중량을 측정하였고 대지 면적을 기반으로 t/ha 단위로 전환하였고 형질 변량으로서 분석하였다.
수확 시 및 실험실 샘플에서 곡물 수분을 기록하였고 형질 변량으로서 분석하였다. 휴대용 수분 측정기를 이용하여 실험 들판에서 수확 시점에서 직접적으로 대용량 샘플을 분석하였다. 호주 오일종자 협회(AOF) 방법 4-1.5에 기반을 둔 오븐 건조 방법을 이용하여 퍼센트 수분도 측정하였다. 이 방법은 1시간 동안 130℃의 개방된 주석관 내에서 5 g 샘플을 오븐 건조하는 단계를 포함하였다. 샘플을 40분 동안 건조기 내에서 냉각시키고 계량하였고, 퍼센트 수분을 질량의 퍼센트 손실로서 측정하였다. 수확 시 (퍼센트로서) 곡물 수분은 모든 8개의 장소들에 대해 계통 처리들 사이에 유의미하게 상이하였다. 수확 시 장소 평균 곡물 수분은 9% 내지 12%이었고, 이것은 종자가 유사한 곡물 단계에서 수확되었다는 것을 시사하였다. 통계학적으로, 형질전환 계통에 대한 수확 시 곡물 수분에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게 있었다. 수확 시 곡물 수분 퍼센트는 늦은 개화 계통의 종자(즉, ATR Wahoo 및 Monola515TT)가 모든 장소들 전체에 걸쳐 수확 시 유의미하게 더 높은 곡물 수분 %를 가졌을 정도로 개화 시기와도 상관관계를 가졌다. 실험실 종자 수분은 모든 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다. 그러나, 계통들 사이의 차이 및 장소 전체에 걸친 차이는 매우 낮았고, 평균 약 7%이었다. 이것은 종자 저장의 교락 효과가 없음을 시사한다. 형질전환 계통에 대한 실험실에서의 종자 수분에 대한 변동은 비-형질전환 계통에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게(P <0.05) 있었다.
스핀락(Spinlock) NMR 분광측정을 이용하여 6% 수분으로 조절된 종자에 대한 종자 오일 함량(%)을 분석하였다. 요약하건대, 5 g 내지 10 g의 종자의 샘플을 NMR 튜브 내로 계량하고 NMR 분광계로 분석하였다. 중량측정 오일 추출에 의해 측정된, 공지된 퍼센트 오일 함량의 20개 기준 샘플들을 사용함으로써 최초로 생성된 소프트웨어 보정으로 종자 오일 결과를 확인하였다. 종자 오일 함량은 모든 8개의 실험 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다(P <0.05). 장소 평균 종자 오일 퍼센트는 37.0% 내지 41.5%이었고, 이 결과는 일반적으로 파종된 환경에 대한 전형적인 평균 미만이었고, 등숙 기간 동안 경험된 평균 미만의 강우 및 평균보다 더 높은 온도의 결과일 가능성이 있었다. 상대적 계통 차이는 장소들 전체에 걸쳐 매우 일정하였다. 형질전환 계통에 대한 종자 오일 함량에 대한 변동은 모든 장소들 전체에 걸쳐 비-형질전환 계통에 비해 평균 약 2%까지 약간 더 낮았는데, 이것은 유전자 개선을 위한 표적을 제공할 수 있다. 보다 더 낮은 오일 함량은 형질전환 이벤트와 유전학적으로 연관되어 있는 것이 아니라, 보다 더 낮은 오일 함량을 가진 재배종, 즉 AV Jade를 형질전환시킨 결과일 수 있다.
실험 재배 동안 모아진, 비-형질전환 재배종의 작물학적 형질과 비교된 이벤트 NS-B50027-4의 작물학적 형질의 특징규명의 요약은 표 2에 제시되어 있다(분석 REML; 모든 형질들에 대한 F pr <0.001 Sig).
Figure pat00002
용매 추출에 이은 동시적 사포닌화 및 메틸화, 및 GC-FID에 의한 분석을 이용하여 지방산을 측정하였다. 요약하건대, 이것은 종자 샘플을 분쇄하는 단계 및 분쇄된 종자 하위샘플로부터 오일을 용매 내로 추출하는 단계를 포함하였다. 용매를 질소 하에서 증발시켰고, 오일 하위샘플을 신규 용매로 희석하였다. 분취액을 Meth Prep II(사포닌화/메틸화 시약)와 반응시켰다. 샘플을 40℃에서 가열하여 반응을 가속화한 후, 지방산 측정을 위해 BPX-70 컬럼을 사용하여 GC-FID에 주입하였다. 지방산은 오일의 퍼센트 조성으로서 계산되었는데, 이때 각각의 지방산 피크의 면적은 크로마토그램에서 모든 지방산 피크들의 합계의 퍼센트로서 측정되었다. 이 추정치들을 형질 변량으로서 개별적으로 분석하였다. 하기 산들에 대한 특정 지방의 퍼센트를 추정하였다: 팔미트산; 스테아르산; 올레산 및 시스-박센산; 리놀레산; 알파 리놀렌산(ALA); 아라키드산(에이코산으로서도 공지되어 있음) 및 스테아리돈산(SDA); 파울린산, 곤도산 및 가돌레산; 에룩산 및 에이코사테트라엔산(ETA); 에이코사펜타엔산(EPA); 도코사파펜타엔산(DPA); 및 도코사헥사엔산(DHA).
표 3은 장소 전체에 걸쳐 종자 지방산 함량을 분석한 결과를 제공한다(모든 값 퍼센트; 분석 REML; 모든 형질들에 대한 Fpr <0.001 Sig).
Figure pat00003
GC-FID로 분석하였을 때, 스테아르산으로서 종자에 존재하는 지방산의 퍼센트는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다. 장소 평균 퍼센트 스테아르산은 매우 작은 변동을 보였고, 1.6% 내지 2.4%이었다. 통계학적으로, 형질전환 계통에 대한 퍼센트 스테아르산에 대한 변동은 모든 장소들 전체에 걸쳐 비-형질전환 계통들에 의해 표시된 범위 내에 유의미하게 있었다.
GC-FID로 분석하였을 때, 올레산 및 시스-박센산으로서 종자에 존재하는 지방산의 퍼센트는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다. 장소 평균 퍼센트 올레산 및 시스-박센산은 60% 내지 73%이었다. 형질전환 계통에 대한 퍼센트 올레산 및 시스-박센산에 대한 변동은 모든 장소들 전체에 걸쳐 비-형질전환 계통들에 의해 표시된 범위보다 유의미하게(P <0.05) 더 낮았다. 이 결과는 형질전환 삽입체와 연관되어 있고, 상업적 농업경제 또는 곡물 생산에 영향을 미치지 않는다. 추가로, 올레산 오일 함량이 특별히 높은 재배종인 Monola515 TT는 Fad 유전자 내의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)으로 인해 다른 재배종들에 비해 유의미하게 더 높은 올레산 및 시스-박센산을 생성하였다.
GC-FID로 분석하였을 때, 리놀레산으로서 종자에 존재하는 지방산의 퍼센트는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 모든 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다. 장소당 평균 퍼센트 리놀레산은 12% 내지 21%이었다. 하나의 T2 이벤트(식물 NS-B50027-4)로부터 유래한 형질전환 형매 계통에 대한 퍼센트 리놀레산에 대한 변동은 모든 장소들 및 다른 이벤트 형매로부터 유래한 형매들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 범위보다 유의미하게(P <0.05) 더 낮았다. 리놀레산 %의 유의미한 차이는 전이유전자의 발현과 관련되어 있을 가능성이 있다. % 리놀레산의 감소는 형질전환 삽입체와 연관되어 있을 가능성이 있고, 상업적 규모의 농업경제 또는 곡물 생산에 영향을 미치지 않는다.
ALA, 아라키드산 및 SDA로서 존재하는 지방산의 퍼센트는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 모든 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다. 퍼센트 ALA, 아라키드산 및 SDA에 대한 장소 평균은 5% 내지 11%이었다. 형질전환 계통에 대한 % ALA, 아라키드산 및 SDA에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 비-형질전환 재배종에 의해 표시된 변동보다 유의미하게(P <0.05) 더 높았다. 일부 장소들에서 이 형질에 대해 관찰된 유의미한 차이는 전이유전자의 발현과 관련되어 있었다. 이 결과는 형질전환 삽입체와 관련되어 있고, 상업적 농업경제 또는 곡물 생산에 영향을 미치지 않는다. 올레산 오일이 특별히 높은 재배종(Monola515 TT)은 Fad 유전자 내의 SNP로 인해 다른 재배종에 비해 유의미하게(P <0.05) 더 낮은 % ALA를 생성하였다.
파울린산, 곤도산 및 가돌레산으로서 존재하는 지방산의 퍼센트는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다. 퍼센트 파울린산, 곤도산 및 가돌레산에 대한 장소 평균은 1.0% 내지 1.5%이었다. 형질전환 계통에 대한 퍼센트 파울린산, 곤도산 및 가돌레산에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 비-형질전환 재배종에 의해 표시된 변동보다 유의미하게(P <0.05) 더 높았다. 이 결과는 형질전환 삽입체와 관련되어 있고, 상업적 농업경제 또는 곡물 생산에 영향을 미치지 않는다.
에룩산 및 ETA로서 존재하는 지방산의 퍼센트는 5개의 장소들에서 기록되었고, 일반적으로 0%에 가까웠다. 형질전환 삽입체와 관련된 결과는 농업경제 또는 곡물 생산에 상업적으로 영향을 미치지 않는다.
종자 LC-ω3 다중불포화 지방산(LC-PUFA), 구체적으로 EPA, DPA 및 DHA를 각각의 대지 샘플에 대한 퍼센트로서 계산하였고, 형질 변량으로서 분석하였는데, 이때 LC-PUFA = EPA% + DPA% + DHA%이었다. 각각의 대지에 대해 예측된 DHA를 Kg/ha의 단위로서 계산하였고 형질 변량으로서 분석하였다: DHA kg/ha = (오일% x 0.01) x (DHA% x 0.01) x 곡물 수확량(t/ha) x 1000. 각각의 대지에 대해 예측된 LC-PUFA를 Kg/ha의 단위로서 계산하였고 형질 변량으로서 분석하였다: DHA kg/ha = (오일% x 0.01) x (LC-PUFA% x 0.01) x 곡물 수확량(t/ha) x 1000.
EPA로서의 지방산의 퍼센트는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 형질전환 계통에 대한 퍼센트에 대한 변동은 비-형질전환 재배종에 의해 표시된 변동보다 유의미하게(P <0.05) 더 높았다. 형질전환 삽입체와 관련된 이 결과는 농업경제 또는 곡물 생산에 영향을 미치지 않으나, 실제로 종자를 더 가치 있게 만들 수 있다.
DPA로서의 지방산의 퍼센트는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게 상이하였다. 형질전환 계통에 대한 퍼센트에 대한 변동은 모든 장소들 전체에 걸쳐 비-형질전환 재배종에 의해 표시된 변동보다 유의미하게(P <0.05) 더 높았다. 이 결과는 형질전환 삽입체와 관련되어 있고, 농업경제 또는 곡물 생산에 상업적으로 영향을 미치지 않을 것이다.
DHA로서의 지방산의 퍼센트는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 형질전환 계통에 대한 퍼센트에 대한 변동은 모든 위치들에서 비-형질전환 재배종에 의해 표시된 변동보다 유의미하게(P <0.05) 더 높았다. 이 결과는 형질전환 삽입체와 관련되어 있고, 상업적 농업경제 또는 곡물 생산에 영향을 미치지 않는다. 형질전환 형매 계통들 사이의 편차는 선택을 위한 기준으로서 사용되었다.
장소들 전체에 걸쳐 (GC-FID에 의해 측정된) DHA 퍼센트 및 엘리트 이벤트 NS-B50027-4와 비-형질전환 재배종의 비교는 표 4에 제시되어 있다(분석 REML; 모든 위치들에 대한 F pr <0.001 Sig).
Figure pat00004
지방산 프로파일, 종자 오일 퍼센트 및 곡물 수확량을 기반으로 계산된, Kg/ha로서 표현된 예측된 DHA는 모든 장소들 전체에 걸쳐 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 형질전환 계통에 대한 %에 대한 변동은 모든 위치들 전체에 걸쳐 비-형질전환 계통에 의해 표시된 변동보다 유의미하게(P <0.05) 더 높았다. 이 결과는 형질전환 삽입체와 관련되어 있고, 상업적 농업경제 또는 곡물 생산에 영향을 미치지 않는다. 형질전환 형매 계통들 사이의 편차는 선택을 위한 기준으로서 사용되었다. 종자에서 생성된 종자 오일 및 퍼센트 DHA에 대한 변동이 장소 전체에 걸쳐 낮기 때문에, 면적당 생성의 단위(Kg/ha)의 관점에서 DHA의 높은 안정성이 있었다.
장소들 전체에 걸쳐 예측된 DHA의 수확량(Kg/ha) 및 엘리트 이벤트 NS-B50027-4와 비-형질전환 재배종의 비교는 표 5에 제시되어 있다(분석 REML, 모든 위치들에 대한 F pr <0.001 Sig).
Figure pat00005
종자 LC-PUFA 오메가 3(HPLC에 의해 측정된 퍼센트 EPA, DPA 및 DHA)의 경우, 퍼센트 LC-PUFA는 모든 8개의 장소들 전체에 걸쳐 계통 처리들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 형질전환 계통에 대한 %에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 변동보다 유의미하게(P <0.05) 더 높았다. 이 결과는 형질전환 삽입체와 관련되어 있고, 농업경제 또는 상업적 곡물 생산에 영향을 미치지 않는다. 형질전환 형매 계통들 사이의 편차는 선택을 위한 기준으로서 사용되었다. 비-형질전환 계통에서 관찰된 미량의 수준의 LC-PUFA는 화분 유동, 종자 이동 또는 GC-FID 오류와 관련되어 있을 가능성이 높았다.
표 6은 GC-FID에 의해 측정된 퍼센트 값을 보여준다(분석 REML; 모든 위치들에 대한 F pr <0.001 Sig).
Figure pat00006
지방산 프로파일, 종자 오일 % 및 곡물 수확량을 기반으로 계산된, Kg/ha로서 표현된 예측된 LC-PUFA는 모든 장소들 전체에 걸쳐 처리 계통들 사이에 유의미하게(P <0.05) 상이하였다. 형질전환 계통에 대한 %에 대한 변동은 모든 실험들 전체에 걸쳐 재배종에 의해 표시된 변동보다 유의미하게(P <0.05) 더 높았다. 이 결과는 형질전환 삽입체와 관련되어 있고, 농업경제 또는 곡물 생산에 상업적으로 영향을 미치지 않는다. 형질전환 형매 계통들 사이의 편차는 선택을 위한 기준으로서 사용되었다. 재배종 종자에서의 미량 수준은 화분 유동, 종자 이동 또는 HPLC 오류와 관련되어 있을 가능성이 높다. 종자에서 생성된 종자 오일 및 퍼센트 DHA에 대한 변동이 장소 전체에 걸쳐 낮기 때문에, 면적당 생성의 단위(Kg/ha)의 관점에서 LC-PUFA의 높은 안정성이 있다. 도 2 및 도 3도 참조한다.
표 7은 예측된 Kg/ha LC-PUFU를 보여준다(모든 장소들에 대한 F pr <0.001).
Figure pat00007
NMR을 이용하여 각각의 재배 장소에 대해 측정한 종자 오일 함량도 표로 작성하였고, 표 8에 제시되어 있다(단위는 퍼센트임; 분석 REML; 모든 장소들에 대한 F pr <0.001 Sig).
Figure pat00008
NS-B50027-4 종자의 지방산 함량의 추가 분석은 표 9에 제시되어 있다.
Figure pat00009
Figure pat00010
표 9의 데이터는 LC-ω3 지방산 이외에 NS-B50027-4의 종자가 보편적인 카놀라 품종보다 실질적으로 더 많은 ALA도 함유한다는 것을 확인시켜준다. 표 3도 참조한다. ALA는 LC-PUFA가 아닐지라도, ω3 지방산이다. 표 9에서 NS-B50027-4의 종자 오일에서의 ω3:ω6 지방산의 비는 약 3.59 내지 약 6.12이고, 보편적인 카놀라 오일에서의 ω3:ω6 지방산의 비는 약 0.5이다. 문헌(Patterson et al., J. Nutr. Metab. 2012:539426 (2012))을 참조한다.
표 10은 호주에서의 실험적 재배 시 생장된 엘리트 이벤트 NS-B50027-4의 16 세대들로부터의 종자에서 퍼센트 DHA 및 LC-PUFA와 관련된 데이터를 제공한다. 호주에서의 추가 들판 시험은 9.6% DHA 및 10.1% LC-PUFA를 가진 대용량 종자를 생성하였다.
Figure pat00011
추가로, 캐나다에서 생장하는 NS-B50027-4의 능력을 2016년에 2개의 상이한 장소들에서 조절된 실험 조건 하에서 시험하였다. 표 11은 NS-B50027-4를 여러 비-형질전환 카놀라 계통들과 비교하는 작물학적 데이터 및 수확량 데이터를 제공한다.
Figure pat00012
카놀라 계통 NS-B50027-4는 실질적으로 균질하기 때문에 이러한 계통의 종자를 심고, 생성된 카놀라 식물을 적절하게 격리한 상태로 자가수분 또는 형매수분 조건 하에서 생장시키고, 보편적인 작물학적 관행을 이용하여 생성된 종자를 수확함으로써 재생산될 수 있다.
실시예 2. NS-B50027-4 분리개체
상기 인지된 바와 같이, NS-B50027-4는 16-유전자 삽입체(2개의 역위된 8-유전자 카세트들) 및 4-유전자 삽입체 둘 다를 함유하고; 각각의 삽입체는 식물 게놈 내의 상이한 좌위를 대표한다. 교배, 역교배 및 자가교배의 조합은 16-유전자 삽입체를 염색체 A05("분리개체 A05 좌위")로 분리하였고, 4-유전자 삽입체를 염색체 A02("분리개체 A02 좌위")로 분리하였다. 이들 분리개체들에 대한 작물학적 데이터를 호주의 4개 상이한 실험 장소들에서 생장된 NS-B50027-4 및 비-형질전환 재배종과 비교하였다. 4개의 실험 장소들 전체에 걸친 평균 값을 제공하는 데이터의 요약은 표 12에 제시되어 있다(분석 REML; 모든 형질들에 대한 F pr < 0.001 Sig).
Figure pat00013
식물 생장력 및 다른 작물학적 특징 이외에, 곡물 수확량(t/ha)도 표 13에 제시된 바와 같이 특징규명되었고, 이때 퍼센트 오일은 NMR에 의해 측정되었고, AV Garnet는 종자 오일%에 대한 100% 비교대상으로서 설정되었다.
Figure pat00014
장소 전체에 걸쳐 NS-B50027-4 T3에 대한 평균 DHA 및 LC-PUFA 함량은 약 6.2% DHA 및 약 7.1% LC-PUFA이었고, 장소 전체에 걸쳐 NS-B50027-4 T5에 대한 평균 DHA 및 LC-PUFA 함량은 약 7.4% DHA 및 약 8.6% LC-PUFA이었는데, 이것은 T3 세대부터 T5 세대까지 유전자 획득을 입증하였다.
또한, 분리개체 A02 좌위의 경우, NS-B50027-4로부터 유래한 이 형질전환 계통은 하기 4개의 전이유전자들을 포함한다: (마이크로모나스 푸실라로부터 유래한) Δ6-데사투라제, (피라미모나스 코르다타로부터 유래한) Δ5-일롱가제, (파블로바 살리나로부터 유래한) Δ5-데사투라제, 및 (피키아 파스토리스로부터 유래한 Δ15/ω3-데사투라제). 이 계통이 종자 오일을 발현하였을지라도, 분리개체 A02 좌위는 LC-PUFA 및 DHA의 생성을 위해 요구된 효소를 결여한다(도 1 참조). 특히, 상기 좌위는 초기 기질인 LA를 제공하는 Δ12-데사투라제, SDA를 ETA로 전환시키는 Δ6-일롱가제, 및 DPA를 DHA로 전환시키는 Δ4-데사투라제를 결여한다. 예상된 바와 같이, 조절 들판 시험은 분리개체 A02 좌위가 1% 미만의 LC-PUFA(EPA + DPA + DHA)를 생성하였다는 것을 보여주었다. 비교하건대, 분리개체 A05 좌위는 DHA 생합성 효소의 완전한 스위트(suite)를 함유하고, 조절 들편 시험은 이것이 약 4.5% LC-PUFA 중 약 4% DHA를 생성하였다는 것을 보여주었다. 놀랍게도, 동일한 조절 들판 시험에서, NS-B50027-4는 약 8.4% LC-PUFA 중 약 7.4% DHA를 생성하였다(이 시험은 비-최적 수확을 경험하였다). 예를 들면, 분리개체 A02 좌위가 DPA를 DHA로 전환시키는 추가 Δ4-데사투라제를 제공하지 않기 때문에, NS-B50027-4가 분리개체 A05 좌위보다 유의미하게 더 많은 DHA를 생성하였다는 것은 놀라운 결과이다. 분리개체 A02 좌위는 수확량을 개선할 잠재력을 제공한다.
A02 및 A05 좌위가 NS-B50027-4로부터 분리될 수 있기 때문에, NS-B50027-4 유래의 자손의 추가 생성을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 분리된 A02 좌위는 다른 LC-PUFA 생성 계통, 예컨대, 그 계통에서의 LC-PUFA 생성을 증가시키기 위해 DHA의 생합성을 위한 단일 7-전이유전자 삽입체를 포함하는 "전체 단일" 계통에서 적층될 수 있다. 사실상, 전체 단일 수용자에서 A02 좌위의 유전자이입에 의해 적층된 F4 동형접합성 자손으로부터의 종자는 수용자인 전체 단일 계통에 비해 DHA의 6% 증가를 나타내었다. 흥미롭게도, 이 A02 좌위 함유 동형접합성 자손은 분리된 A05 좌위와 적층된 F4 동형접합성 전체 단일보다 더 많은 DHA를 생성하였다. NS-B50027-4는 전체 단일보다 더 많은 DHA를 생성하였고, NS-B50027-4(두 좌위들)와 적층된 전체 단일은 전체 단일에 비해 DHA 생성의 증가도 나타내었다는 것을 주목한다.
NS-B50027-4 A02 좌위도 다른 LC-PUFA, 예컨대, EPA 또는 DPA를 생성하는 반복 브라시카 또는 카놀라 내로 유전자이입되어, 그 브라시카 또는 카놀라에서 LC-PUFA의 생성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 종자에서 상당한 양의 DPA를 생성하는 형질전환 브라시카 준세아가 기재되어 있다(국제 특허출원 공보 제WO 2015089587호). 이 브라시카 준세아 내로의 분리된 NS-B50027-4 A02 좌위의 유전자이입은 종자에서 생성된 DPA의 양을 증가시켰다. 유사하게, EPA 생성을 위한 생합성 경로(예를 들면, Δ5-일롱가제 및 Δ4-데사투라제 둘 다를 포함하지 않는 형질전환 삽입체(들))로 형질전환된 브라시카는 종자에서 상당한 양의 EPA를 생성하고; EPA의 생성은 NS-B50027-4의 A02 좌위와의 유전자이입 하이브리드화에 의해 증가된다.
실시예 3. 경쟁적 대립유전자 특이적 PCR(KASP) 어세이
카놀라에서의 전이유전자의 표현형 발현은 전이유전자 카세트 그 자체의 구조 및 식물 게놈 내에서의 그의 삽입 위치 둘 다에 의해 결정된다: 식물 게놈 내의 특정 위치에서의 전이유전자의 존재는 전이유전자의 발현 및 식물의 전체 표현형에 영향을 미칠 수 있다. 식물 게놈 내로의 재조합 DNA 분자의 도입은 전형적으로 세포 또는 조직의 형질전환(또는 또 다른 유전자 조작)으로부터 비롯된다. 구체적인 도입 부위(들)는 우연히 생길 수 있거나 예정될 수 있다(표적화된 삽입 과정이 이용된 경우). 유전자 조작에 의한 식물 내로의 상업적으로 흥미로운 형질의 작물학적으로 또는 산업적으로 성공적인 도입은 상이한 요인들에 의존하는 긴 절차일 수 있다. 유전적으로 형질전환된 식물의 실제 형질전환 및 재생은 광범위한 유전자 특징규명, 육종 및 들판 시험에서의 평가를 포함하여, 궁극적으로 엘리트 이벤트의 선택으로 이어지는 일련의 선택 단계들 중에서 첫 번째 단계일 뿐이다.
NS-B50027-4는 광범위한 선택 육종 및 들판 시험 후 개발되었고, 종자 오일에서 약 7% 내지 15% DHA(총 지방산의 중량%)를 생성하는 카놀라 재배종을 제공한다. 유전자 분석은 NS-B50027-4가 염색체 A02 상에서 형질전환 삽입체를 갖고 염색체 A05 상에서 또 다른 형질전환 삽입체를 가졌다는 것을 시사하였다. A05 상의 삽입체는 헤드-대-헤드(RB-LB:LB-RB)로 정렬된 8개의 유전자들(Micpu-Δ6D, Pyrco-Δ5E, Pavsa-Δ5D, Picpa-ω3D, Pavsa-Δ4D, Lack1-Δ12D, Pyrco-Δ6E 및 PAT 마커)의 2개의 완전한 T-DNA-접경 카세트들을 포함한다. 염색체 A02 상의 삽입체는 한 세트의 4개 유전자들 Micpu-Δ6D, Pyrco-Δ5E, Pavsa-Δ5D 및 Picpa-ω3D를 포함한다. 놀랍게도, 분리 교배는 염색체 A02 및 염색체 A05 상의 삽입체들이 약 11%의 DHA 생성을 달성하기 위해 요구된다는 것을 보여주었다.
우드랜드의 누시드 분자 실험실(Nuseed Molecular Lab)에서 개발된 LGC 옥토퓨어(Octopure) SOP에 기반을 둔 DNA 추출을 위해 DHA 카놀라 유전자이입 육종의 8개 상이한 BC 및 F2 집단들로부터의 약 1200개 자손들을 사용하였다. 요약하건대, 0.25 인치의 직경을 가진 2개의 동결건조된 잎 원반들을, 제노그린더(GenoGrinder)로 8분 동안 1,400 rpm에서 300 ㎕의 DNA 추출 완충제(100 mM Tris-HCl, PH 8.0; 25 mM EDTA, PH 8.0; 0.5% SDS, 1.5 M NaCl)에서 분쇄하였다. 45분 동안 55℃ 수조에서 항온처리하고 30분 동안 4,500 rpm에서 원심분리한 후, 50 ㎕의 상청액을, 자기 sbeadex 비드를 가진 100 ㎕의 LGC 결합 완충제로 옮겼다. 결합 및 세척 후, DNA를 80 ㎕의 LGC DNA 용출 완충제로 용출하였다.
DNA 농도는 나노드롭(NanoDrop) 8000(Thermo Scientific)에 의해 측정되었고, 10.0 ng/㎕의 평균을 가지면서 5.0 내지 20.0 ng/㎕의 범위 내에 있었다. DNA 샘플을 1배 희석하였다. 각각의 반응을 위해, 2.0 ㎕(약 5.0 ng/㎕)의 게놈 DNA 샘플, 및 프라이머를 가진 2 ㎕의 마스터 혼합물을, KASP 유전형분석을 위해 384웰 플레이트에 분배하였다.
DHA 카놀라 유전자이입 집단으로부터의 자손 이외에, 8개의 대조군들을 유전형분석에 포함시켰다. 이들은 2개의 비-GMO 대조군들(Dwarf 및 AV Jade), 2개의 반접합성 대조군들(2.5 ng Av Jade 또는 2.5 ng Dwarf + 2.5 ng B0050-027-18-20-12-19), 2개의 이벤트 양성 대조군들(B0050-027-18-20-12-19) 및 4개의 비-주형 대조군(NTC)들을 포함하였다. 양성 대조군(T5 식물 B0050-027-18-20-12-19)은 시퀀싱을 통한 DHA 카놀라 이벤트의 특징규명을 위해 이전에 사용되었다.
8개의 전이유전자들 및 4개의 NS-B50027-4 특이적 연접부들을 검출하고 모니터링하는, 단순하고 비용 효과적이고 고효율적이고 유연한 방식을 제공하고 육종 프로그램에서 NS-B50027-4 유전자이입을 더 용이하게 하기 위해 KASP 어세이를 개발하였다. 변형된 제조자(LGC Ltd., 영국 미들섹스 소재)의 표준 프로토콜에 따라 KASP™ 유전형분석 화학, 어세이 디자인, 유전형분석 및 점수화를 수행하였다.
서열 정보를 LGC 크라켄 워크플로우 매니저(Kraken Workflow Manager)에 업로딩하였고, 그의 어세이 디자인 프로그램 프라이머 픽커(Primer Picker)를 이용하여 KASP 어세이를 디자인하였다. 전형적인 KASP 어세이는 2개의 대립유전자 특이적 프라이머들(형질전환 대립유전자에 대한 프라이머_대립유전자 X 및 비-형질전환 야생형 대립유전자에 대한 프라이머_대립유전자 Y) 및 1개의 공통된 좌위 특이적 프라이머(프라이머_공통)를 포함한다. 프라이머_대립유전자 X는 형광 FAM과 관련되어 있고, 프라이머_대립유전자 Y는 형광 HEX와 관련되어 있다.
연접부를 표적화하는 대다수의 어세이들은 이 유형의 3-프라이머 어세이이었다(표 14). DHA 카놀라를 검출하기 위해, 상기 언급된 보편적인 3-프라이머 어세이 이외에 4-프라이머 어세이도 개발하였다. 4-프라이머 어세이는 반응에서 형질전환 대립유전자 특이적 프라이머_대립유전자 X, 야생형 대립유전자 특이적 프라이머_대립유전자 Y, 오메가 3 유전자 특이적 프라이머_공통 및 야생형 특이적 프라이머_공통 2를 가졌다. 오메가 3 카세트에서 8개의 유전자들을 검출하기 위해, 단지 2개의 프라이머들, 즉 프라이머_대립유전자 X 및 프라이머_공통을 각각의 어세이에서 사용하였고(2-프라이머 어세이); 두 프라이머들은 오메가 3 유전자 특이적이었다(표 14).
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
KASP 유전형분석 시스템은 2개의 성분들을 요구한다: 어세이 혼합물 및 마스터 혼합물. 어세이 혼합물은 요구된 프라이머들의 혼합물이고, 마스터 혼합물은 PCR 완충제, 보편적인 형광 보고 시스템 및 Taq 중합효소를 비롯한 모든 다른 요구된 성분들을 함유한다.
KASP 반응을 2.0 ㎕(10.0 ng)의 게놈 DNA, 2.0 ㎕의 2배 KASP 마스터 혼합물 및 0.06 ㎕의 어세이(프라이머) 혼합물로 구성된 4.0 ㎕의 부피로 실시하였다. 어세이 (프라이머) 혼합물은 2-프라이머 어세이의 경우 12 μM의 대립유전자 특이적 프라이머_대립유전자 X 및 12 μM의 프라이머_공통의 조합이고, 3-프라이머 어세이의 경우 12 μM의 대립유전자 특이적 프라이머_대립유전자 X, 12 μM의 대립유전자 특이적 프라이머_대립유전자 Y 및 30 μM의 프라이머_공통의 조합이고, 4-프라이머 어세이의 경우 12 μM의 대립유전자 특이적 프라이머_대립유전자 X, 12 μM의 대립유전자 특이적 프라이머_대립유전자 Y, 12 μM의 프라이머_공통 및 12 μM의 프라이머_공통2의 조합이다.
하기 순환 파라미터를 이용하여 LGC 하이드로사이클러(Hydrocycler) 16 내의 384웰 플레이트에서 반응을 실시하였다: 15분 동안 94℃의 1 주기에 이은, 30초 동안 94℃ 및 60초 동안 64℃ 내지 57℃(주기당 1.0℃ 하락)의 8 주기에 이은, 30초 동안 94℃ 및 60초 동안 57℃의 30 주기. 명확한 유전형분석 클러스터가 수득되지 않은 경우, 30초 동안 94℃ 및 60초 동안 57℃의 추가 3 주기로 플레이트를 더 열순환시켰다.
KASP 반응의 완결 후, 프라이머_대립유전자 X를 통해 형질전환 대립유전자를 FAM으로 표지하였고, 프라이머_대립유전자 Y를 통해 야생형 대립유전자를 HEX로 표지하였다. FAM에 대해 485 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장을 이용하고 HEX에 대해 535 nm의 여기 파장 및 556 nm의 방출 파장을 이용하여 페라스타(PheraStar) 마이크로플레이트 판독기에서 형광 신호를 판독하였다. LGC 크라켄 데이터베이스를 이용하여 데이터를 분석하였다.
구축물 카세트에서 8개 유전자들을 검출하기 위해 8-유전자 특이적 우성(NBN01-NBN08; 1개 어세이/유전자)을 개발하였다. A02 상의 삽입체의 업스트림(NBN57, NBN68, NBN58, NBN85 및 NBN14) 및 다운스트림(NBN16, NBN62 및 NBN64) 연접부, 및 A05 상의 삽입체의 업스트림(NBN52, NBN51, NBN09, NBN50, NBN48 및 NBN10) 및 다운스트림(NBN83, NBN82, NBN84, NBN66, NBN41 및 NBN43) 연접부를 표적화하는 총 20개의 삽입체 특이적 공-우성 KASP 어세이들을 개발하였고, 이들을 NS-B50027-4 유전자이입 집단으로부터의 1200개 자손으로 검증하였다(표 14). 10,000개 이상의 샘플들을 이 마커들로 유전형분석하였다.
DHA 카놀라 이벤트 NS-B50027-4의 2개 삽입체들의 상기 8개 유전자들 및 4개 연접부를 표적화하는 30개의 경쟁적 대립유전자 특이적 PCR(KASP) 어세이들을 개발하고 검증하였다. 이 어세이들은 육종 프로그램에서 NS-B50027-4를 검출하고 모니터링하는, 단순하고 비용 효과적이고 고효율적이고 유연한 방식을 제공하였다.
실시예 4. NS-B50027-4 및 비-형질전환 카놀라의 상세한 비교
2014년부터 2016년까지 실험 들판 대지에서의 카놀라 종자 생산으로부터의 데이터를 표로 작성하였다. DHA 및 총 EPA + DPA + DHA의 범위는 여러 시험 들판 관찰에 기반을 둔 것이었다. NS-B50027-4 및 비-형질전환 "대조군" 카놀라 둘 다에서의 주요 지방산들의 함량은 생장 조건에 따라 여러 퍼센트 포인트만큼 상이할 수 있다. 하기 표 15에서, "0.0"은 성분의 양을 정확히 측정하기 위해 필요한 양 미만으로서 확인된 미량을 의미할 수 있다.
Figure pat00018
NS-B50027-4의 실험 재배로부터 수확된 종자를 분쇄하였고 냉압착을 통해 오일을 수득하였다. 모본 동질유전자 계통인 AV Jade로부터 수확된 종자를 유사하게 프로세싱하였고, 각각의 오일의 함량을 표 16에 표시된 바와 같이 비교하였다.
Figure pat00019
Figure pat00020
특허 절차를 위한 미생물의 기탁의 국제적 승인(1977)에 대한 부다페스트 조약에 따라, 본 출원인은 2016년 6월 9일에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 소재의 어메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC®)에 카놀라 NS-B50027-4의 적어도 2500개 종자들을 기탁하였고 수탁번호 PTA-123186을 배정받았다. 본원의 계류 동안, 본 발명에의 접근은 요청에 의해 미국 특허상표청의 특허청장에게 제공될 수 있고; 일반대중의 이용 가능성에 대한 모든 제한은 특허 허가 시 번복불가능하게 철회되고; 계통 NS-B50027-4의 기탁은 30년의 기간, 가장 최근의 종자 요청 후 5년 또는 특허의 유효 기간(이들 중 더 긴 기간) 동안 공공 기탁기관인 ATCC® 기탁기관에서 유지될 것이고; 기탁된 종자가 그 기간 동안 생존불가능해진 경우 종자는 대체될 것이다. 종자의 생존율은 기탁 시 시험되었다. 본 명세서와 함께 제출된 부록 A는 기탁일, 수탁번호 및 생존 가능성의 인정을 제공한다. 본 출원인은 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809의 모든 요건들을 충족시켰다. 본 출원인은 ATCC®로부터의 기탁된 물질의 이용 가능성에 대한 제한을 두지 않으나; 본 출원인은 생물학적 물질의 전달 또는 그의 상업적 수송에 대한 법률에 의해 부과된 임의의 제한을 포기할 권한을 갖지 않는다. 본 출원인은 이 출원으로부터 발행된 특허 하에서 또는 식물 품종 보호법(7 U.S.C. § 2321 et seq.) 하에서 허가된 그의 권리의 임의의 침해를 관망하지 않는다.
상기 실시양태들은 명료성 및 이해를 목적으로 예시 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 일부 변화 및 변형, 예컨대, 단일 유전자 변형 및 돌연변이, 소모클로날(somoclonal) 변이체, 본 근친교배 계통의 큰 식물 집단으로부터 선택된 변이체 개체 등이 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위 내에서 실시될 수 있다는 것은 당분야에서 숙련된 자에게 명확할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Nuseed Pty Ltd. <120> INBRED TRANSGENIC CANOLA LINE NS-B50027-4 AND SEEDS THEREOF <130> 87376.3\PCT <150> 62/351,250 <151> 2016-06-16 <160> 90 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KASP primer <400> 1 gaaggtgacc aagttcatgc tccaagcacc gtagtaagag agca 44 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KASP primer <400> 2 gctaagaagt ggggactcaa ctacaa 26 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KASP primer <400> 3 gaaggtgacc aagttcatgc tgctcttgct ggaactcttg g 41 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KASP primer <400> 4 gggttagcca cattgtaggt aacgta 26 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KASP primer <400> 5 gaaggtgacc aagttcatgc ttaagagaca ccctggtgga aaga 44 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KASP primer <400> 6 tagcatcagt tccaacttgg taagcaat 28 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial 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Claims (77)

  1. 근친교배 카놀라 계통(line) NS-B50027-4의 종자로서, 상기 근친교배 카놀라 계통의 대표적인 종자가 ATCC 수탁번호 PTA-123186 하에 기탁된 것인 종자.
  2. 제1항의 종자를 생장시킴으로써 생성된 카놀라 식물 또는 이의 부분.
  3. 제2항의 식물의 화분.
  4. 제2항의 식물의 밑씨.
  5. 제2항의 식물의 모든 생리학적 및 형태학적 특징들을 가진 카놀라 식물 또는 이의 부분.
  6. 제2항의 카놀라 식물로부터 생성된 재생 가능한 세포의 조직 배양물.
  7. 제6항에 있어서, 세포 또는 원형질체가 잎, 화분, 배아, 뿌리, 뿌리끝, 꼬투리, 꽃, 밑씨 및 줄기로 구성된 군으로부터 선택된 조직의 세포 또는 원형질체인 조직 배양물.
  8. 제2항에 따른 카놀라 식물의 재생 가능한 세포의 조직 배양물로서, 조직이 제2항에 따른 식물의 모든 형태학적 및 생리학적 특징들을 발현할 수 있는 식물을 재생시키는 것인 조직 배양물.
  9. 제2항의 식물을 생장시켜 종자를 생성하는 단계 및 상기 종자를 수확하는 단계를 포함하는, 카놀라 종자를 생성하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생장을 온실에서 수행하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 생장을 텐트에서 수행하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 생장을 노지(open field)에서 수행하는 것인 방법.
  13. 제2항의 식물의 종자를 수득하는 단계 및 상기 종자를 프로세싱하여 오일을 수득하는 단계를 포함하는, 오일을 생성하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제2항의 식물을 수확하여 상기 종자를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제5항에 있어서, 그 유전 물질이 카놀라 계통 NS-B50027-4에 존재하는 전이유전자 이외에 하나 이상의 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 전이유전자를 함유하도록 형질전환된 카놀라 식물 또는 이의 부분.
  16. 교배로부터 비롯된 자손의 유전 물질이 추가 전이유전자(들)를 발현하도록 제15항의 카놀라 식물을 또 다른 카놀라 계통의 제2 식물 또는 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 카놀라 식물과 교배시키는 단계를 포함하는, 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 전이유전자 이외에 하나 이상의 전이유전자를 그의 유전 물질 내에 함유하는 카놀라 식물을 생성하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 추가 전이유전자가 제초제 내성, 곤충 내성, 세균 질환 내성, 진균 질환 내성, 바이러스 질환 내성 또는 불임을 부여하는 것인 방법.
  18. 제5항에 있어서, 전통적인 육종 기법의 생성물이고 NS-B50027-4와 관련된 엘리트 이벤트(elite event) 이외의 재조합, 돌연변이유발 또는 다른 유전자 변형에 의해 변형되지 않은 카놀라 식물 또는 이의 부분.
  19. 교배로부터 비롯된 자손의 유전 물질이 원하는 추가 형질을 발현하도록 제18항의 카놀라 식물을 또 다른 카놀라 계통의 식물 또는 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 식물과 교배시키는 단계를 포함하는, 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 형질 이외에 적어도 하나의 원하는 형질을 갖는 카놀라 식물을 생성하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 추가 전이유전자가 제초제 내성, 곤충 내성, 세균 질환 내성, 진균 질환 내성, 바이러스 질환 내성 또는 불임을 부여하는 것인 방법.
  21. (a) 카놀라 계통 NS-B50027-4를 제2 카놀라 식물과 교배시켜, 자손 카놀라 종자를 생산하는 단계; 및
    (b) 식물 생장 조건 하에서 상기 자손 카놀라 종자를 생장시켜, 카놀라 계통 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물을 생산하는 단계
    를 포함하는, 카놀라 계통 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물을 생성하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (a) 상기 카놀라 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물을 그 자체 또는 또 다른 카놀라 식물과 교배시켜, 추가 카놀라 NS-B50027-4 유래의 자손 카놀라 종자를 생산하는 단계;
    (b) 식물 생장 조건 하에서 단계 (a)의 상기 자손 카놀라 종자를 생장시켜, 추가 카놀라 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물을 생산하는 단계; 및
    (c) (a) 및 (b)의 교배 및 생장 단계를 0회 내지 7회 반복하여, DHA 생성으로부터 선택된 적어도 2개의 NS-B50027-4 형질들 및 적어도 하나의 추가 작물학적으로 바람직한 형질을 발현하는 추가 카놀라 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물을 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제21항의 방법에 의해 생성된 카놀라 계통 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물 또는 이의 부분.
  24. 제22항의 방법에 의해 생성된 카놀라 NS-B50027-4 유래의 카놀라 식물 또는 이의 부분.
  25. 제1 모본(parent) 카놀라 식물을 제2 모본 카놀라 식물과 교배시키는 단계, 및 생성된 제1 세대 카놀라 종자를 수확하는 단계를 포함하고, 상기 제1 또는 제2 모본 카놀라 식물이 제2항의 카놀라 식물인 카놀라 종자를 생성하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제1 모본 카놀라 식물이 상기 제2 모본 카놀라 식물과 상이하고, 상기 생성된 종자가 제1 세대(F1) 하이브리드 카놀라 종자인 방법.
  27. 카놀라 근친교배 계통을 수득하는 방법으로서,
    (a) 하이브리드의 종자를 포함하고 상기 근친교배 계통의 종자도 포함하는 종자 집단을 심는 단계로서, 이의 모본 중 하나가 제2항에 따른 식물이거나, 제2항에 따른 카놀라 식물의 모든 생리학적 및 형태학적 특징들을 가진 카놀라 식물인 단계;
    (b) 상기 종자 집단으로부터 카놀라 식물을 생장시키는 단계;
    (c) 상기 근친교배 계통으로부터 근친교배 식물을 확인하는 단계;
    (d) 상기 근친교배 식물을 선택하는 단계; 및
    (e) 상기 근친교배 식물의 동형접합성을 보존하는 방식으로 수분(pollination)을 조절하는 단계
    를 포함하는, 카놀라 근친교배 계통을 수득하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 한 모본이 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 모든 생리학적 및 형태학적 특징들을 갖고, 상기 계통의 종자가 ATCC 수탁번호 PTA-123186 하에 기탁된 것인 방법.
  29. 카놀라 계통 NS-B50027-4의 세포로서, 이의 종자의 대표적인 샘플이 ATCC 수탁번호 PTA-123186 하에 기탁된 것인 세포.
  30. 식물 DNA를 포함하는 샘플에서 이벤트 NS-B50027-4의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 샘플을
    (a) 서열번호 42 내지 서열번호 82, 서열번호 87 내지 서열번호 90, 서열번호 17 내지 서열번호 41, 또는 서열번호 83 내지 서열번호 86에 표시된 프라이머들, 상기 프라이머들 중 임의의 프라이머의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드들, 또는 이들의 상보체로 구성된 프라이머 군으로부터 선택된, 브라시카(Brassica) 게놈의 전이유전자 플랭킹 연접 영역에 결합하는 제1 프라이머; 및
    (b) 서열번호 1 내지 서열번호 16에 표시된 프라이머들, 상기 프라이머들 중 임의의 프라이머의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드들, 또는 이들의 상보체로 구성된 프라이머 군으로부터 선택된, 삽입체 서열에 결합하는 제2 프라이머
    와 접촉시키는 단계;
    상기 샘플에 대해 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계; 및
    상기 프라이머들 사이에 생성된 앰플리콘(amplicon)에 대해 어세이하는 단계
    를 포함하는, 식물 DNA를 포함하는 샘플에서 이벤트 NS-B50027-4의 존재를 검출하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 어세이가 KASP™ 유전형분석 어세이인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항의 방법에 의해 확인된 식물, 식물 물질 또는 식물 유래의 물질.
  33. 제30항 또는 제31항의 방법을 수행하기 위한 성분을 포함하는 키트.
  34. 근친교배 카놀라 계통 NS-B50027-4의 게놈 DNA로서, 상기 근친교배 카놀라 계통의 대표적인 종자가 ATCC 수탁번호 PTA-123186 하에 기탁된 것인 게놈 DNA.
  35. 식물의 종자에서 DHA를 생성하는 방법으로서, 상기 식물의 종자에서 발현될 수 있는 Δ6-데사투라제(desaturase), Δ5-일롱가제(elongase), Δ5-데사투라제 및 Δ15/ω3-데사투라제 전이유전자들 중 적어도 한 전이유전자의 적어도 2개의 카피를 그의 게놈 내에 가진 식물을 재배하는 단계를 포함하는, 식물의 종자에서 DHA를 생성하는 방법.
  36. 제35항에서와 같이 재배된 식물의 종자.
  37. 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19% 또는 약 20%의 DHA(오일 중의 총 지방산의 중량%로서)를 포함하는 NS-B50027-4의 종자.
  38. 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34% 또는 약 35%의 장쇄 다중불포화 지방산(오일 중의 총 지방산의 중량%로서 EPA, DPA 및 DHA의 합계)을 포함하는 NS-B50027-4의 종자.
  39. NS-B50027-4의 적어도 95% 종자를 포함하는 종자 집단으로서, 상기 종자가 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19% 또는 약 20%의 DHA(오일 중의 총 지방산의 중량%)를 포함하는 것인 종자 집단.
  40. NS-B50027-4의 적어도 95% 종자를 포함하는 종자 집단으로서, 상기 종자가 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34% 또는 약 35%의 장쇄 다중불포화 지방산(오일 중의 총 지방산의 중량%로서 EPA, DPA 및 DHA의 합계)을 포함하는 것인 종자 집단.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항의 종자를 포함하는 조성물로서, 상기 종자가 분쇄되어 종자 오일 및 종자 가루(meal)를 제공하는 것인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 종자 오일이 식용 종자 오일인 조성물.
  43. 계통 NS-B50027-4의 종자로부터 추출된 종자 오일로서, 상기 종자 오일의 지방산 함량이 적어도 약 3의 오메가-3:오메가-6 지방산의 비를 갖는 것인 종자 오일.
  44. 제41항에 있어서, 오메가-3:오메가-6 지방산의 비가 약 3 내지 약 20의 범위 내에 있는 것인 종자 오일.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 미정제 오일인 종자 오일.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 정련된 오일인 종자 오일.
  47. 제43항 또는 제44항에 있어서, 농축된 오일인 종자 오일.
  48. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 식용인 종자 오일.
  49. 제48항의 종자 오일을 포함하는 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 식품인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 식품이 인간 소비를 위한 것인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 조리용 오일 또는 샐러드 오일인 조성물.
  53. 제49항에 있어서, 에멀전인 조성물.
  54. 제49항에 있어서, 건조 성분인 조성물.
  55. 제50항에 있어서, 식품이 수산양식 영양의 공급원인 조성물.
  56. 제45항에 있어서, 식품이 고체 어류 사료인 조성물.
  57. 제45항에 있어서, 식품이 액체 어류 사료인 조성물.
  58. 제41항에 있어서, 상기 종자 가루가 식품 중의 성분인 조성물.
  59. 제49항에 있어서, 약학 조성물인 조성물.
  60. 제41항의 종자 가루를 포함하는 조성물.
  61. 제60항의 종자 가루로부터 수득되거나 농축된 단백질을 포함하는 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 식품인 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 식품이 인간 소비를 위한 것인 조성물.
  64. 제61항에 있어서, 건조 성분인 조성물.
  65. 제61항에 있어서, 단백질이 수산양식 영양의 공급원인 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 단백질이 고체 어류 사료에서 사용되는 것인 조성물.
  67. 제65항에 있어서, 단백질이 액체 어류 사료에서 사용되는 것인 조성물.
  68. 제61항에 있어서, 단백질이 동물 사료에서 사용되는 것인 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 동물이 가금류 또는 돼지인 조성물.
  70. NS-B50027-4 또는 이의 자손의 종자로부터 수득된 오일로서, 이 오일의 지질이 DHA에 대해 농축되었고, 농축된 지질이 상기 오일의 총 지방산의 중량%로서 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% DHA를 포함하는 것인 오일.
  71. DHA 함유 카놀라 오일을 제조하는 방법으로서,
    (a) NS-B50027-4의 DHA 형질을 웅성 불임 엘리트 브라시카 계통 내로 유전자이입시키는 단계;
    (b) NS-B50027-4의 DHA 형질을 가임 제2 엘리트 브라시카 계통 내로 유전자이입시키는 단계;
    (c) (a) 및 (b)의 상기 두 계통들을 교배시켜 하이브리드 자손을 수득하는 단계;
    (d) 하이브리드 자손의 종자를 재배하는 단계;
    (e) 재배된 하이브리드 자손에 의해 생성된 곡물을 수확하는 단계; 및
    (f) 하이브리드 종자의 자손으로부터 오일을 추출하는 단계
    를 포함하는, DHA 함유 카놀라 오일을 제조하는 방법.
  72. 식물 DNA를 포함하는 샘플에서 이벤트 NS-B50027-4의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 샘플을
    (a) NS-B50027-4의 브라시카 게놈의 플랭킹 연접 영역에 결합하는 제1 프라이머, 및
    (b) NS-B50027-4의 전이유전자에 결합하는 제2 프라이머
    와 접촉시키는 단계;
    상기 샘플에 대해 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계; 및
    상기 프라이머들 사이에서 생성된 앰플리콘을 특징규명하는 단계
    를 포함하는, 식물 DNA를 포함하는 샘플에서 이벤트 NS-B50027-4의 존재를 검출하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 1 내지 서열번호 90에 표시된 프라이머인 방법.
  74. NS-B50027-4 A02 형질전환 좌위 또는 NS-B50027-4 A05 형질전환 좌위를 함유하는, NS-B50027-4로부터 수득된 분리개체.
  75. 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)을 생성하는 브라시카에서 LC-PUFA의 생성을 증가시키는 방법으로서, NS-B50027-4의 게놈을 분리하여 NS-B50027-4 A02 좌위를 포함하는 분리개체를 수득하는 단계, 및 상기 분리개체를, LC-PUFA 생합성 유전자를 포함하는 수용자 브라시카로 유전자이입시켜, 수용자 LC-PUFA 생합성 유전자 및 NS-B50027-4 A02 좌위 둘 다를 함유하는 유전자이입된 자손 브라시카를 수득하는 단계를 포함하고, 상기 유전자이입된 브라시카 자손이 증가된 LC-PUFA를 생성하는 것인 LC-PUFA를 생성하는 브라시카에서 LC-PUFA의 생성을 증가시키는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 브라시카가 브라시카 준세아(B. juncea) 또는 브라시카 나푸스(B. napus)인 방법.
  77. 제75항에 있어서, LC-PUFA가 DHA보다 더 많은 DPA를 포함하는 것인 방법.
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