KR20220095680A - Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella abortus and primer set for detection - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a single nucleotide polymorphism marker for discriminating Brucella abortus and a primer set for detecting the same. The single nucleotide polymorphism marker for discriminating Brucella abortus and the primer set for detecting the same according to the present invention can quickly and accurately discriminate the sequence type of Brucella abortus, and thus can be used in various fields of identifying and diagnosing Brucella abortus.

Description

브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트{Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella abortus and primer set for detection}Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella abortus and primer set for detection

본 발명은 브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.The present invention relates to a single nucleotide polymorphism marker for the differentiation of Brucella abotus and a primer set for detecting the same.

브루셀라병은 브루셀라균(Brucella)에 의해 소, 돼지, 산양, 면양, 개 등 대부분의 동물에 감염되어 유산, 불임 등 주로 생식기 장애를 일으키는 전염병으로 전세계적으로 발생하면서 축산업에 막대한 경제적 손실을 초래한다. 이 질병은 사람에게도 감염되는 인수공통 전염병으로 주로 축주, 수의사, 도축장 종사자 등 가축과 관련된 직업 종사자들에게 많이 발생하는 직업병으로 알려져 있으며, 주기적인 발열, 두통, 식욕부진 등 감기와 같은 증상을 보이다가 만성으로 지속될수록 심내막염, 뇌척수염, 관절염 등 중증 질병으로 진행하게 되며 1-3% 미만의 치사율을 보이고 있다. 현재 국내에서도 동물뿐만 아니라 사람에서도 브루셀라병이 발생하고 있으며 감염된 동물으로부터 사람으로 브루셀라균이 전파되는 것을 막기 위한 대책이 시급한 실정이다. 감염된 동물은 뚜렷한 증상없이 균을 장기간 보균하면서 지속적으로 브루셀라균을 외부로 배출하면서 주변환경을 오염시킨다. 브루셀라병 치료를 위해서는 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하며, 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 때문에 치료방법에 대한 개선이 시급한 실정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되고 있다. Brucella disease is an infectious disease that infects most animals such as cattle, pigs, goats, sheep, and dogs by Brucella bacteria and causes mainly reproductive disorders such as miscarriage and infertility. . This disease is a zoonotic infectious disease that infects humans and is known as an occupational disease that occurs frequently in livestock-related occupations, such as livestock owners, veterinarians, and slaughterhouse workers. As it continues chronically, it progresses to serious diseases such as endocarditis, encephalomyelitis, and arthritis, with a mortality rate of less than 1-3%. Currently, brucellosis is occurring not only in animals but also in humans in Korea, and measures to prevent the spread of brucellosis from infected animals to humans are urgently needed. Infected animals contaminate the surrounding environment by continuously excreting Brucella bacteria while retaining the bacteria for a long time without any obvious symptoms. For the treatment of brucellosis, antibiotic treatment is required for a short period of several weeks to a long time, and there is an urgent need to improve the treatment method because of the sequelae caused by taking a large amount of antibiotics. this is being requested

브루셀라균(Brucella)은 숙주특이성, 배양성, 생물·생화학적, 혈청학적 성상 차이에 따라 B. melitensis (sheep and goats), B. abortus (cattle and other Bovidae), B. canis (dogs), B. ovis (rams), B. suis (pigs, reindeer, hare, wild rodents), B. neotomae (desert wood rats), B. pinnipedialis (common seal), B. ceti (common dolphin), B. microti (soil), B. inopinata (human) 등 10종과 함께 2014년 개코원숭이(baboon)에서 분리된 B. papionis와 2016년 빨간여우(redfox)에서 분리된 B. velpis가 새롭게 추가되어 현재까지 총 12종이 알려져 있다. 이들 중 사람에게 감염되어 병원성을 일으키는 균종은 B. melitensis, B. suis, B. abortus, B.canis이며, 국내에서는 B. abortus와 B. canis만 분리 보고되고 있다. 브루셀라균의 분류는 생물학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 집락의 형태, oxidase 및 urease에 대한 반응성, phages에 대한 용해능에 따라 종(species)을 구분하고 더 나아가 CO2 요구도, H2S 산생능, 색소(thionin, basic fuchsin)에서의 배양성, 특이혈청과의 응집 여부에 따라 생물형(biovar)을 구분하고 있어 최종 야외에서 분리된 브루셀라균에 대하여 생물형까지 동정하기 위해서는 많은 시간이 소요되며 각 시험결과를 판독하기 위해서는 숙련된 전문가가 필요하며 살아 있는 균을 다루기 때문에 매우 위험하다. 최근 이와 같은 한계점을 극복하기 위해 유전자를 이용한 분자생물학적 기법으로 균을 보다 쉽게 감별 및 동정하려는 시도가 계속되고 있다. 하지만 브루셀라균은 유전학적 상동성(DNA homology)이 매우 높기 때문에 이들을 감별하는 연구가 90년대 중반부터 계속되었으며, 그 결과 AMOS PCR법, Bruce-ladder PCR법, differential multiplex PCR법 등이 개발되어 많은 브루셀라균을 감별동정할 수 있었다. 특히, 2012년에 개발된 differential multiplex PCR법은 10종의 브루셀라균에 대하여 단일튜브 내 동시에 감별할 수 있는 유전자 진단법이다. 그러나 이들은 균종 감별은 가능하지만 생물·생화학적 특성분석은 할 수 없기 때문에 이러한 특성 분석도 동시에 할 수 있는 진단법이 필요한 실정이다.Depending on the host specificity, culture, bio-biochemical, and serological characteristics of Brucella , B. melitensis (sheep and goats), B. abortus (cattle and other Bovidae), B. canis (dogs), B ovis (rams), B. suis (pigs, reindeer, hare, wild rodents), B. neotomae (desert wood rats), B. pinnipedialis (common seal), B. ceti (common dolphin), B. microti (soil) ) and B. inopinata (human), as well as B. papionis isolated from baboon in 2014 and B. velpis isolated from redfox in 2016, and a total of 12 species are known so far. have. Among these, bacterial species that infect humans and cause pathogenicity are B. melitensis, B. suis, B. abortus, and B. canis, and only B. abortus and B. canis have been reported separately in Korea. Classification of Brucella bacteria is based on biological and biochemical characteristics, and classifies species according to colony shape, reactivity to oxidase and urease, and solubility in phages, and furthermore, CO 2 requirement, H 2 S production ability Biovars are classified according to cultivability in thionin, basic fuchsin, and aggregation with specific serum. It requires a skilled professional to read each test result, and it is very dangerous because it deals with live bacteria. Recently, in order to overcome this limitation, attempts to more easily identify and identify bacteria by molecular biological techniques using genes are continuing. However, since Brucella bacteria have very high DNA homology, research to differentiate them has been continued since the mid-1990s, and as a result, AMOS PCR, Bruce-ladder PCR, differential multiplex PCR, etc. fungus could be identified. In particular, the differential multiplex PCR method developed in 2012 is a genetic diagnostic method capable of simultaneously discriminating 10 types of Brucella bacteria in a single tube. However, since these species can be differentiated but cannot be analyzed for bio-biochemical characteristics, a diagnostic method capable of analyzing these characteristics is needed at the same time.

이에 본 발명자들은 브루셀라균 유전체를 분석하여 유전자형(sequence type, ST)을 감별하기 위한 특이 단일염기다형성을 확인하고, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have completed the present invention by analyzing the Brucella genome to identify a specific single nucleotide polymorphism for discriminating a sequence type (ST), and designing a primer set for detecting it.

따라서 본 발명의 목적은, 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트 및 마이크로어레이를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for differentiating Brucella abotus comprising a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases including a single nucleotide polymorphism marker or a complementary polynucleotide thereof, and for differentiating Brucella abotus comprising the composition To provide kits and microarrays.

본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 감별용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a primer set for differentiation of Brucella abotus comprising at least one selected from the group consisting of primers represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 28, and a kit for differentiation comprising the same.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention, (a) obtaining DNA from a sample isolated from a subject; (b) amplifying a single nucleotide polymorphism marker from the DNA obtained in step (a); And (c) confirming the genotype of the single nucleotide polymorphism marker amplified in step (b); to provide a Brucella abotus differentiation method comprising a.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for differentiating Brucella abotus comprising a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases including a single nucleotide polymorphism marker or a complementary polynucleotide thereof.

또한 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a Brucella abortus differentiation kit comprising the composition for the Brucella abortus differentiation.

또한 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 마이크로어레이를 제공한다.In addition, the present invention provides a Brucella abortus differentiation microarray comprising the composition for differentiation of Brucella abortus.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a primer set for differentiating Brucella abotus comprising at least one selected from the group consisting of primers represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 28.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for differentiation of Brucella abotus comprising the primer set.

또한 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 아보투스 감별 방법을 제공한다.The present invention also comprises the steps of (a) obtaining DNA from a sample isolated from an individual; (b) amplifying a single nucleotide polymorphism marker from the DNA obtained in step (a); and (c) confirming the genotype of the single nucleotide polymorphism marker amplified in step (b);

본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트는 브루셀라 아보투스의 유전자형(sequence type)을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라 아보투스의 동정 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.The single nucleotide polymorphism marker for the differentiation of Brucella abotus according to the present invention and the primer set for detecting the same can quickly and accurately discriminate the genotype of Brucella abotus, and are used in the field of identification and diagnosis of Brucella abotus. It can be used in various ways.

도 1은 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 draft WGS를 통해 브루셀라 아보투스 225주를 감별한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석을 통해 브루셀라 아보투스의 지역적 역학 특성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the results of discriminating Brucella abotus 225 strains through draft WGS using a Brucella abortus specific SNP according to the present invention.
2 is a diagram showing the results of multi-locus base analysis using Brucella abotus-specific SNP according to the present invention.
3 is a diagram showing the results of analyzing regional epidemiologic characteristics of Brucella abotus through multi-locus base analysis using Brucella abotus-specific SNP according to the present invention.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention provides a composition for differentiation of Brucella abotus comprising a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases containing a single nucleotide polymorphism (SNP) marker or a complementary polynucleotide thereof to provide.

상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물의 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이다:The single nucleotide polymorphism marker of the Brucella abotus differentiation composition is at least one selected from the group consisting of:

브루셀라 아보투스 1번 염색체(NC_007618)의 817476번째 뉴클레오티드;nucleotide 817476 of Brucella abotus chromosome 1 (NC_007618);

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;nucleotide 817479 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 2번 염색체(NC_007624)의 360501번째 뉴클레오티드;nucleotide 360501 of Brucella abotus chromosome 2 (NC_007624);

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 브루셀라 아보투스 1번 염색체 1099314번째 뉴클레오티드;1099314 nucleotide of Brucella abotus chromosome 1 of Brucella abotus chromosome 1;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 641898번째 뉴클레오티드;nucleotide 641898 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1219989번째 뉴클레오티드;nucleotide 1219989 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1212540번째 뉴클레오티드;nucleotide 1212540 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1138131번째 뉴클레오티드;nucleotide 1138131 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1185177번째 뉴클레오티드;nucleotide 1185177 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304711번째 뉴클레오티드;nucleotide 304711 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304792번째 뉴클레오티드;nucleotide 304792 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 2번 염색체의 665349번째 뉴클레오티드;nucleotide 665349 of chromosome 2 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 2번 염색체의 371261번째 뉴클레오티드;nucleotide 371261 of chromosome 2 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1083739번째 뉴클레오티드;1083739 nucleotide of Brucella abotus chromosome 1;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472410번째 뉴클레오티드;nucleotide 472410 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472392번째 뉴클레오티드;nucleotide 472392 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472386번째 뉴클레오티드; 및472386th nucleotide of Brucella abotus chromosome 1; and

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 360543번째 뉴클레오티드.Nucleotide 360543 of chromosome 1 of Brucella abotus.

본 발명에 있어서, 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.In the present invention, single nucleotide polymorphism (SNP) refers to a genetic change or mutation showing a difference in one nucleotide sequence (A, T, G, C) from a DNA nucleotide sequence, and DNA sequence polymorphism ( polymorphism) is the most common form.

본 발명에 있어서, 다형성(polymorphism)은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.In the present invention, polymorphism refers to a case in which two or more alleles exist at one locus, and among polymorphic sites, only a single base differs from person to person. It is called nucleotide polymorphism (SNP). Preferred polymorphic markers have two or more alleles that exhibit an incidence of at least 1%, more preferably at least 10% or 20% in a selected population.

본 발명에 있어서, 대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.In the present invention, an allele refers to several types of a gene present on the same locus of a homologous chromosome. Alleles are also used to indicate polymorphism, for example, SNPs have two types of alleles.

본 발명에 있어서, 마커(marker)는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌(genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 마커의 유전자 지도 상의 위치는 유전자 좌로 표시할 수 있다.In the present invention, a marker refers to a nucleotide sequence used as a reference point when identifying a genetically unspecifically related genetic locus, and the location of the marker on a genetic map may be indicated as a genetic locus.

본 발명에 있어서, 감별은 유전학적·생물학적 성질의 차이를 이용하여 특정한 세균을 가려내는 것을 의미한다.In the present invention, differentiation means screening specific bacteria using differences in genetic and biological properties.

본 발명의 구체예에서, 상기 감별은 유전자형(sequence type, ST)을 감별하는 것일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the discrimination may be to discriminate a genotype (sequence type, ST).

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 이용하여 브루셀라 아보투스의 유전자형을 도 1과 같이 감별할 수 있다. 예를 들어, 감별 대상 균을 분석한 결과, 브루셀라 아보투스 2번 염색체의 360501번째 염기가 G이고, 1번 염색체의 1212540번째 염기가 T인 경우 브루셀라 아보투스 ST13으로 감별할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the genotype of Brucella abotus can be differentiated as shown in FIG. 1 by using the composition for differentiation of Brucella abotus of the present invention. For example, as a result of analyzing the bacteria to be differentiated, when the 360501th base of the Brucella abotus chromosome 2 is G and the 1212540th base of the 1st chromosome is T, it can be differentiated as Brucella abotus ST13.

본 발명에 따른 단일염기다형성 마커는 브루셀라 아보투스의 유전자형(sequence type, ST)을 감별할 수 있는바, 브루셀라 아보투스의 동정 및 감염병 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다. The single nucleotide polymorphism marker according to the present invention can discriminate the genotype (sequence type, ST) of Brucella abotus, and thus can be variously used in the fields of identification of Brucella abotus and diagnosis of infectious diseases.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트를 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a Brucella abortus differentiation kit comprising the composition for the Brucella abortus differentiation.

본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 감별용 키트는 단일염기다형성 마커를 검출하여 브루셀라 아보투스의 유전자형을 감별할 수 있다. 상기 키트에는 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 및 프로브 등을 포함할 수 있으며, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.The Brucella abortus differentiation kit according to the present invention can detect a single nucleotide polymorphism marker to discriminate the Brucella abotus genotype. The kit may include polynucleotides, primers and probes for detecting a single nucleotide polymorphism marker, and may include one or more other components, solutions or devices suitable for the analysis method.

본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA) 키트인 것이 바람직하나, 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 분석법이라면 제한없이 적용 가능하다.In an embodiment of the present invention, the kit is preferably a multilocus sequence analysis (MLSA) kit, but any assay capable of detecting a single nucleotide polymorphism marker is applicable without limitation.

본 발명에 있어서, 다좌위 염기 분석은 필수 유전자들의 서열을 연결한 후 연결된 염기서열을 바탕으로 계통학적 분석을 수행하는 방법으로, 분석하고자 하는 종의 분절유전자(segmentation gene)의 염기서열 증폭으로 계통분석을 수행하므로 종에 대한 보다 광범위한 정보를 제공한다는 장점이 있다.In the present invention, polylocus nucleotide analysis is a method of performing phylogenetic analysis based on the linked nucleotide sequence after linking the sequences of essential genes. It has the advantage of providing more extensive information about the species as it performs the analysis.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 마이크로어레이를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a Brucella abortus differentiation microarray comprising the composition for differentiation of Brucella abortus.

본 발명에 있어서, 마이크로어레이는 유전자 칩(gene chip)이라고도 불리며, 유전자, DNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 일정한 패턴으로 고정시킨 작은 고형물을 의미한다.In the present invention, a microarray is also called a gene chip, and refers to a small solid in which genes, DNA fragments, or oligonucleotides are immobilized in a predetermined pattern.

본 발명의 브루셀라 아보투스 감별용 마이크로어레이는 상기 브루셀라 아보투스 감별용 조성물, 즉, 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는바, 브루셀라 아보투스의 감별 및 감염병의 진단에 유용하게 활용될 수 있다. The Brucella abortus differentiation microarray of the present invention includes the Brucella abotus differentiation composition, that is, a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases including a single nucleotide polymorphism marker or a complementary polynucleotide thereof. It can be usefully used for the differentiation of avotus and the diagnosis of infectious diseases.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a primer set for the differentiation of Brucella abotus comprising at least one selected from the group consisting of primers represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 28.

본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.In the present invention, the primer is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group and can form a base pair with a template of a complementary nucleic acid, and is used for strand copying of the nucleic acid template. It refers to a short nucleic acid sequence that serves as a starting point. Primers are capable of initiating DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in appropriate buffers and temperatures.

상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.When designing the primer, there are various restrictions such as the A, G, C, T content ratio of the primer, prevention of primer dimer formation, and prohibition of repeating the same nucleotide sequence more than 3 times. (template) Conditions such as DNA amount, primer concentration, dNTP concentration, Mg 2+ concentration, reaction temperature, and reaction time must be appropriate.

상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.The above primers may incorporate additional features that do not change the basic properties. That is, the nucleic acid sequence can be modified using a number of means known in the art. Examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of a nucleotide with one or more homologues and uncharged linkages such as phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates or carbamates or phosphorothioates or phosphorodithioates. Modification of nucleotides into charged linkages such as In addition, the nucleic acid may include one or more of nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, proteins such as poly L lysine, intercalating agents such as acridine or psoralen, chelating agents such as metals, radioactive metals, iron oxidizing metals, and alkylating agents. It may have additional covalently attached residues.

또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.In addition, the primer sequence of the present invention can be modified using a label capable of directly or indirectly providing a detectable signal. The primer may include a label that can be detected using spectroscopy, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Useful labels include proteins for which 32 P, fluorescent dyes, electron-dense reagents, enzymes (commonly used in ELISAs), biotin or haptens and antisera or monoclonal antibodies are available.

본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.The primers of the present invention are suitable for cloning and restriction enzyme digestion, Narang et al.'s phosphotriester method (1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), and Beaucage's diethyl phosphoramidi Chemical synthesis may be accomplished using any other well known method, including direct chemical synthesis methods such as the method of the present invention (1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), and the solids support method of US 4458066.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a Brucella abotus differentiation kit comprising the primer set.

본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 대립유전자 특이 PCR 키트, RT-PCR 키트, 디지털 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.In an embodiment of the present invention, the kit is preferably an allele-specific PCR kit, an RT-PCR kit, a digital PCR kit or a DNA chip kit, but is not limited thereto.

본 발명의 구체예에서, 본 발명의 브루셀라 아보투스 감별용 키트는 PCR을 수행하기 위한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 필수 요소는 단일염기다형성 마커에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the Brucella abortus differentiation kit of the present invention may further include essential elements for performing PCR. For example, the essential elements may include, in addition to polynucleotides, primers or probes specific for a mononucleotide polymorphic marker, a test tube or other suitable container, reaction buffer (with varying pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), Taq- enzymes such as polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water and sterile water, and the like.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 아보투스 감별 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) obtaining DNA from a sample isolated from an individual; (b) amplifying a single nucleotide polymorphism marker from the DNA obtained in step (a); and (c) confirming the genotype of the single nucleotide polymorphism marker amplified in step (b);

상기 (b) 단계의 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다:The single nucleotide polymorphism marker in step (b) is at least one selected from the group consisting of:

브루셀라 아보투스 1번 염색체(NC_007618)의 817476번째 뉴클레오티드;nucleotide 817476 of Brucella abotus chromosome 1 (NC_007618);

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;nucleotide 817479 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 2번 염색체(NC_007624)의 360501번째 뉴클레오티드;nucleotide 360501 of Brucella abotus chromosome 2 (NC_007624);

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 브루셀라 아보투스 1번 염색체 1099314번째 뉴클레오티드;1099314 nucleotide of Brucella abotus chromosome 1 of Brucella abotus chromosome 1;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 641898번째 뉴클레오티드;nucleotide 641898 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1219989번째 뉴클레오티드;nucleotide 1219989 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1212540번째 뉴클레오티드;nucleotide 1212540 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1138131번째 뉴클레오티드;nucleotide 1138131 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1185177번째 뉴클레오티드;nucleotide 1185177 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304711번째 뉴클레오티드;nucleotide 304711 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304792번째 뉴클레오티드;nucleotide 304792 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 2번 염색체의 665349번째 뉴클레오티드;nucleotide 665349 of chromosome 2 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 2번 염색체의 371261번째 뉴클레오티드;nucleotide 371261 of chromosome 2 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1083739번째 뉴클레오티드;1083739 nucleotide of Brucella abotus chromosome 1;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472410번째 뉴클레오티드;nucleotide 472410 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472392번째 뉴클레오티드;nucleotide 472392 of chromosome 1 of Brucella abotus;

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472386번째 뉴클레오티드; 및472386th nucleotide of Brucella abotus chromosome 1; and

브루셀라 아보투스 1번 염색체의 360543번째 뉴클레오티드.Nucleotide 360543 of chromosome 1 of Brucella abotus.

본 발명의 구체예에서, 상기 (b) 단계는 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트를 이용하여, (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 것이 바람직하다.In an embodiment of the present invention, step (b) is performed using a primer set for differentiation of Brucella abotus comprising at least one selected from the group consisting of primers represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 28, step (a) It is preferable to amplify a single nucleotide polymorphism marker from the DNA obtained from

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 (c) 단계는 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a preferred embodiment of the present invention, step (c) may be to confirm the genotype of the amplified single nucleotide polymorphism marker, but is not limited thereto.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Redundant content is omitted in consideration of the complexity of the present specification, and terms not defined otherwise in the present specification have the meanings commonly used in the technical field to which the present invention pertains.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1. 브루셀라 아보투스(Example 1. Brucella abotus ( Brucella abortusBrucella abortus ) 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작) Selection of specific SNPs for differentiation and production of primers

브루셀라 아보투스 감별용 SNP를 선발하기 위하여, 표 1의 브루셀라　아보투스 43주를 활용하였다.In order to select SNPs for differentiation of Brucella abotus, 43 strains of Brucella abotus in Table 1 were used.

No.No. SpeciesSpecies BiovarBiovar Strainstrain Year Year SourceSource AnalysisAnalysis CommentComment 1One B. abortusB. abortus 1One 544544 19421942 EnglandEngland draft WGSdraft WGS ReferenceReference 22 B. abortusB. abortus 1One 23082308 19591959 USAUSA draft WGSdraft WGS ReferenceReference 33 B. abortusB. abortus 22 86/8/5986/8/59 19591959 EnglandEngland draft WGSdraft WGS ReferenceReference 44 B. abortusB. abortus 33 TulyaTulya 19581958 UgandaUganda draft WGSdraft WGS ReferenceReference 55 B. abortusB. abortus 44 292292 19611961 EnglandEngland draft WGSdraft WGS ReferenceReference 66 B. abortusB. abortus 55 B3196B3196 19861986 EnglandEngland draft WGSdraft WGS ReferenceReference 77 B. abortusB. abortus 66 870870 19591959 AfricaAfrica draft WGSdraft WGS ReferenceReference 88 B. abortusB. abortus 99 C68C68 19581958 EnglandEngland draft WGSdraft WGS ReferenceReference 99 B. abortusB. abortus 1One RB51RB51 USAUSA draft WGSdraft WGS ReferenceReference 1010 B. abortusB. abortus 1One S19S19 USAUSA draft WGSdraft WGS ReferenceReference 1111 B. abortusB. abortus 1One A13315A13315 20082008 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 1212 B. abortusB. abortus 1One A13405A13405 20092009 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 1313 B. abortusB. abortus 1One A14234(S19)A14234(S19) 20142014 MongolMongol draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 1414 B. abortusB. abortus 1One A14251A14251 20142014 ThailandThailand draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 1515 B. abortusB. abortus 33 A14270A14270 20152015 ThailandThailand draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 1616 B. abortusB. abortus 1One A13334A13334 20082008 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 1717 B. abortusB. abortus 22 A13352A13352 20082008 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 1818 B. abortusB. abortus 33 A13476A13476 20122012 MongolMongol draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 1919 B. abortusB. abortus 33 A14164A14164 20152015 MongolMongol draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2020 B. abortusB. abortus 33 A14230A14230 20152015 MongolMongol draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2121 B. abortusB. abortus 1One A14305A14305 20162016 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2222 B. abortusB. abortus 1One A14307A14307 20162016 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2323 B. abortusB. abortus 77 A13452A13452 20122012 MongolMongol draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2424 B. abortusB. abortus 77 A13470A13470 20122012 MongolMongol draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2525 B. abortusB. abortus 77 A14141A14141 20132013 MongolMongol draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2626 B. abortusB. abortus 1One A14228(S19) A14228(S19) 20142014 ThailandThailand draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2727 B. abortusB. abortus 1One A14227(S19)A14227(S19) 20142014 ThailandThailand draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2828 B. abortusB. abortus 1One A11253A11253 20042004 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 2929 B. abortusB. abortus 1One A11302A11302 19961996 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3030 B. abortusB. abortus 1One A11344A11344 20022002 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3131 B. abortusB. abortus 1One A11365A11365 20002000 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3232 B. abortusB. abortus 1One A12453A12453 19981998 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3333 B. abortusB. abortus 1One A13238A13238 20072007 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3434 B. abortusB. abortus 1One A13259A13259 20072007 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3535 B. abortusB. abortus 1One A13311A13311 20072007 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3636 B. abortusB. abortus 1One A13341A13341 20082008 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3737 B. abortusB. abortus 1One A12346A12346 20052005 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3838 B. abortusB. abortus 1One A11447A11447 20052005 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 3939 B. abortusB. abortus 1One A12260A12260 20052005 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 4040 B. abortusB. abortus 1One A11414A11414 20052005 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 4141 B. abortusB. abortus 1One A14341A14341 20172017 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 4242 B. abortusB. abortus 1One A14344A14344 20172017 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate 4343 B. abortusB. abortus 1One A14262A14262 20152015 KoreaKorea draft WGSdraft WGS IsolateIsolate

표 1의 브루셀라 아보투스 43주를 차세대염기서열분석법(Next generation sequencing, NGS)를 통해 draft WGS(whole genome sequence) 분석을 실시하였다. Illumina TruseqNano DNA HT Kit를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 라이브러리를 준비하였으며, Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 사용하여 생성된 DNA 라이브러리를 대상으로 quality control을 추가로 수행하였다. Miseq reagent kit v2를 사용하여 Illumina Miseq system으로 pairend sequencing을 수행하여 각 균주별 3GB정도의 데이터를 생성하였다. B. melitensis bv.1 16M reference genome(GCF_000740415.1) 기준으로 Bowtie2를 사용하여 맵핑하여 sequence alignment를 수행하였다.A draft whole genome sequence (WGS) analysis was performed on the 43 strains of Brucella abotus in Table 1 through next generation sequencing (NGS). A DNA library was prepared according to the manufacturer's protocol using Illumina TruseqNano DNA HT Kit, and quality control was additionally performed on the DNA library generated using an Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Pairend sequencing was performed with the Illumina Miseq system using Miseq reagent kit v2 to generate about 3GB of data for each strain. B. melitensis bv.1 16M reference genome (GCF_000740415.1) was mapped using Bowtie2 as a reference, and sequence alignment was performed.

총 43주 draft WGS를 대상으로 특이 SNP를 분석한 결과, B. abortus 특이 SNP 대상부위가 약 870개가 분석되었으며, 동일 유전자 내에서 약 500bp 크기 이내에서 2∼3개 이상의 SNP를 갖는 부위를 중심으로 선발하여 분자역학적 특성분석에 활용하였다. 특이 SNP가 포함된 유전자 부위를 중심으로 annealing temperature는 54℃로, 증폭산물의 크기는 180bp±60 범위로 프라이머를 합성하였으며, 특이 SNP가 포함된 감별부위에 대하여 수집된 표준균주와 분리균주들의 유전자정보와 이 부위를 직접 assemble sequencing한 염기서열정보와의 일치여부를 재차 확인하여 선발된 부위의 신뢰도를 확보하였다.As a result of analyzing specific SNPs for a total of 43-week draft WGS, about 870 B. abortus specific SNP target sites were analyzed, Within the same gene, sites having 2 to 3 or more SNPs within a size of about 500 bp were selected and utilized for molecular dynamics characterization. The primers were synthesized at an annealing temperature of 54°C and the size of the amplification product in the range of 180bp±60 around the gene site containing the specific SNP. Reliability of the selected site was secured by reconfirming the correspondence between the information and the nucleotide sequence information directly assembled sequencing of this site.

SNP 분석 결과, 브루셀라 아보투스에 대한 특이 SNP는 총 14개 유전자 부위에서 선발하였다. 보다 상세하게는, 선발된 6개의 유전자(BCSP31, fbaA, BAbRB51, clpxS9, rpsL, rpIV)의 SNP7개는 브루셀라균 특이 SNP를 활용하였고, 브루셀라 아보투스의 특성 분석을 위한 8개 유전자(DK63_RS15435, DK63_RS14910, DK63_RS08465, DK63_RS08685, DK63_RS14655, DK63_RS02320, DK63_RS03625, DK63_RS08240)의 특이 SNP 11개는 새롭게 선발하였다.As a result of SNP analysis, specific SNPs for Brucella abotus were selected from a total of 14 gene sites. More specifically, 7 SNPs of the selected 6 genes (BCSP31, fba A, BAbRB51, clpx S9, rps L, rp IV) utilized Brucella-specific SNPs, and 8 genes for characterization of Brucella abotus 11 specific SNPs of (DK63_RS15435, DK63_RS14910, DK63_RS08465, DK63_RS08685, DK63_RS14655, DK63_RS02320, DK63_RS03625, DK63_RS08240) were newly selected.

선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP에 대한 정보는 표 2에 나타내었다.Information on the selected Brucella abotus-specific SNPs is shown in Table 2.

Gene nameGene name Amplified size(bp)Amplified size (bp) PositionPosition SNP
(Ref*/Alt)SNP
(Ref*/Alt) CommentsComments BCSP31BCSP31 224224 121121 G/GG/G Gene and SNP for differential identification of B. abortus Gene and SNP for differential identification of B. abortus 124124 A/AA/A fbaA fba A 195195 3939 A/GA/G BAbRB51BAbRB51 210210 143143 A/CA/C clpxS9 clpx S9 208208 130130 G/CG/C rpsL rps L 231231 176176 C/AC/A rpIV rp IV 390390 4848 G/TG/T DK63_RS15435DK63_RS15435 173173 7878 G/AG/A Gene and SNP for molecular genetic and epidemiologic characteristics of B. abortus Gene and SNP for molecular genetic and epidemiologic characteristics of B. abortus 9696 G/TG/T 102102 T/CT/C DK63_RS14910DK63_RS14910 161161 9999 G/AG/A DK63_RS08465DK63_RS08465 213213 4747 C/TC/T DK63_RS08685DK63_RS08685 219219 7474 T/CT/C DK63_RS14655DK63_RS14655 316316 9292 G/AG/A 176176 C/TC/T DK63_RS02320DK63_RS02320 248248 166166 C/TC/T DK63_RS03625DK63_RS03625 160160 6868 C/TC/T DK63_RS08240DK63_RS08240 195195 9090 C/TC/T * B. melitensis 16M(NZ_CP007763, NZ_CP007762)* B. melitensis 16M (NZ_CP007763, NZ_CP007762)

브루셀라 아보투스 특이 SNP를 선발하기 위해 사용한 유전자 및 프라이머 정보는 표 3에 정리하였다.The gene and primer information used to select Brucella abotus-specific SNPs are summarized in Table 3.

GeneGene Primer sequence(5` → 3`)Primer sequence(5` → 3`) 서열번호SEQ ID NO: Size
(bp)Size
(bp) 타겟 부위를 기준으로 한 SNP의 위치Position of the SNP relative to the target site 브루셀라 아보투스의 whole genome을 기준으로 한 SNP의 위치Location of SNPs based on the whole genome of Brucella abotus CommentsComments BCSP31BCSP31 FF TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAATGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA 1One 224224 121
124121
124 Ch. 1, 817476
Ch. 1, 817479Ch. 1, 817476
Ch. 1, 817479 Genus Brucella Genus Brucella RR CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTGCGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG 22 fbaA fba A FF CCA ATG ACA TCA TGC TCCCCA ATG ACA TCA TGC TCC 33 195195 3939 Ch. 2, 360501Ch. 2, 360501 B. abortusB. abortus RR CGT TAT AGT CCC AGT CGGCGT TAT AGT CCC AGT CGG 44 clpxS9 clpx S9 FF GAT ATC GAA CTG GCG AAGGAT ATC GAA CTG GCG AAG 55 208208 130130 Ch. 1, 1099314Ch. 1, 1099314 B. abortusB. abortus RR CGC GCT CCA CAT TAT AAT CCGC GCT CCA CAT TAT AAT C 66 BabRB51BabRB51 FF GCC TAC AAG AAT TAC GAA CAGCC TAC AAG AAT TAC GAA CA 77 210210 143143 Ch. 1, 641898Ch. 1, 641898 B. abortusB. abortus RR CCG CCC TTT TGA TAC CAT ATACCG CCC TTT TGA TAC CAT ATA 88 rpsL rps L FF TTG CCA AGG TTC GTC TGATTG CCA AGG TTC GTC TGA 99 231231 176176 Ch. 1, 1219989Ch. 1, 1219989 B. abortusB. abortus RR TCC CCG GAA AAT CTT ACT TCTCC CCG GAA AAT CTT ACT TC 1010 rpNrpN FF AAT CTT CTG ACC CAT TAT GCAAT CTT CTG ACC CAT TAT GC 1111 202202 6262 Ch. 1, 1212540Ch. 1, 1212540 B. abortusB. abortus RR CAA ACG CTG AAA ACA ATC ACCAA ACG CTG AAA ACA ATC AC 1212 DK63_RS08465DK63_RS08465 FF TCG ATG GTG AAT TTT GAA GGTCG ATG GTG AAT TTT GAA GG 1313 213213 4747 Ch. 1, 1138131Ch. 1, 1138131 B. abortus point variation B. abortus point variation RR TGT TTT GTG GAC AAT GGCTGT TTT GTG GAC AAT GGC 1414 DK63_RS08685DK63_RS08685 FF ATG TCA CCC TTC AAT TCGATG TCA CCC TTC AAT TCG 1515 219219 7474 Ch. 1, 1185177Ch. 1, 1185177 B. abortus point variation B. abortus point variation RR CAT CTA TAA CAT CAC CAA GGCAT CTA TAA CAT CAC CAA GG 1616 DK63_RS14655DK63_RS14655 FF CTC CGG ATC CCA TAT AAC ACTC CGG ATC CCA TAT AAC A 1717 316316 92
17692
176 Ch. 1, 304711
Ch. 1, 304792Ch. 1, 304711
Ch. 1, 304792 B. abortus point variation B. abortus point variation RR CAA GCT CAA TCA GGA CAGCAA GCT CAA TCA GGA CAG 1818 DK63_RS02320DK63_RS02320 FF CAA TTT GGT TTA AGT GCG GCAA TTT GGT TTA AGT GCG G 1919 248248 166166 Ch. 2, 665349Ch. 2, 665349 B. abortus point variation B. abortus point variation RR GTC GGT CTT GTC GGT TTCGTC GGT CTT GTC GGT TTC 2020 DK63_RS03625DK63_RS03625 FF CTT CCG AGG TGG TGT AGACTT CCG AGG TGG TGT AGA 2121 160160 6868 Ch. 2, 371261Ch. 2, 371261 B. abortus point variation B. abortus point variation RR CAG AAA GTC GTA ATT GGC ACAG AAA GTC GTA ATT GGC A 2222 DK63_RS08240DK63_RS08240 FF GAA TTT GGT GTT CAA GGCGAA TTT GGT GTT CAA GGC 2323 195195 9090 Ch. 1, 1083739Ch. 1, 1083739 B. abortus point variation B. abortus point variation RR ACC GAC CTT GAT TAC GAAACC GAC CTT GAT TAC GAA 2424 DK63_RS15435DK63_RS15435 FF CTT TTG ATG GTG GCG TTGCTT TTG ATG GTG GCG TTG 2525 173173 78
96
10278
96
102 Ch. 1, 472410
Ch. 1, 472392
Ch. 1, 472386Ch. 1, 472410
Ch. 1, 472392
Ch. 1, 472386 B. abortus point variation B. abortus point variation RR ATG GCA AAA ACC AGA AGT GATG GCA AAA ACC AGA AGT G 2626 DK63_RS14910DK63_RS14910 FF GAT GCG ATT GAA TAG GCGGAT GCG ATT GAA TAG GCG 2727 161161 9999 Ch. 1, 360543Ch. 1, 360543 B. abortus point variation B. abortus point variation RR TTT AAT CAG GAA ACC GTC ACTTT AAT CAG GAA ACC GTC AC 2828 14 genes14 genes 28 pairs28 pairs 18 SNPs18 SNPs

상기 표 2의 브루셀라 아보투스 염색체 1 및 2번의 accession No.는 각각 NC_007618 및 NC_007624이다.The accession numbers of Brucella abotus chromosomes 1 and 2 of Table 2 are NC_007618 and NC_007624, respectively.

실시예 2. 선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 브루셀라 아보투스 감별법Example 2. Brucella abotus differentiation method using the selected Brucella abotus specific SNP

상기 표 2의 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 활용하여, 브루셀라 아보투스 225주를 감별할 수 있는지 확인하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.Using the Brucella abotus-specific SNP of Table 2, it was confirmed whether 225 strains of Brucella abotus could be discriminated, and the results are shown in FIG. 1 .

도 1에 나타낸 바와 같이, 선발된 13종의 유전자(gene)에 위치한 브루셀라 아보투스 특이 SNP 16개를 이용할 경우 브루셀라 아보투스의 유전자형(Sequence type, ST)을 모두 감별할 수 있음을 확인하였다.As shown in FIG. 1 , it was confirmed that all of the Brucella abotus genotypes (Sequence type, ST) could be discriminated using 16 Brucella abotus-specific SNPs located in 13 selected genes.

실시예 3. 선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA)Example 3. Multilocus sequence analysis (MLSA) using selected Brucella abotus-specific SNPs

국내 분리주(187주)를 대상으로, 브루셀라균을 감별할 수 있는 6개 유전자(BCSP31, fbaA, BAbRB51, clpxS9, rpsL, rpIV)의 SNP 7개; 및 유전자형 분석을 위해 선발된 8개 유전자(DK63_RS15435, DK63_RS14910, DK63_RS08465, DK63_RS08685, DK63_RS14655, DK63_RS02320, DK63_RS03625, DK63_RS08240)의 브루셀라 아보투스 특이 SNP 11개;를 이용한 다좌위 염기 분석을 수행하였다. 다좌위 염기 분석 결과는 도 2에 나타내었다. 7 SNPs of 6 genes (BCSP31, fba A, BAbRB51, clpx S9, rps L, rp IV) capable of differentiating Brucella bacteria in domestic isolates (187 strains); and 11 Brucella abotus-specific SNPs of 8 genes (DK63_RS15435, DK63_RS14910, DK63_RS08465, DK63_RS08685, DK63_RS14655, DK63_RS02320, DK63_RS03625, DK63_RS08240) selected for genotyping; was performed. The polylocus base analysis results are shown in FIG. 2 .

도 2에 나타낸 바와 같이, 선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용하는 경우 유전자형(sequence type, ST)을 감별할 수 있음을 확인하였다. 또한 국내 분리주(187주)만을 대상으로 적용하여 분석한 결과, 브루셀라 아보투스의 유전자형은 총 8개(즉, ST1 내지 8)임을 확인하였다.As shown in FIG. 2 , it was confirmed that the genotype (sequence type, ST) could be discriminated when the selected Brucella abotus-specific SNP was used. In addition, as a result of applying and analyzing only domestic isolates (187 strains), it was confirmed that there were a total of 8 genotypes of Brucella abotus (ie, ST1 to 8).

실시예 4. 선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 브루셀라 아보투스의 지역적 역학 특성 분석Example 4. Analysis of regional epidemiologic characteristics of Brucella abotus using selected Brucella abotus-specific SNPs

선발된 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용하여 브루셀라 아보투스의 지역적 역학 특성을 분석하였다. 상기 지역적 역학 특성 분석은 국내 분리주(187주)를 대상으로 선발된 14개 유전자의 브루셀라 아보투스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석을 통해 수행하였다. 지역적 역학 특성 분석 결과는 도 3에 나타내었다.The regional epidemiologic characteristics of Brucella abotus were analyzed using the selected Brucella abotus-specific SNPs. The regional epidemiologic characteristics analysis was performed through polylocus nucleotide analysis using Brucella abotus-specific SNPs of 14 genes selected for domestic isolates (187 strains). The regional epidemiologic characteristics analysis results are shown in FIG. 3 .

도 3에 나타낸 바와 같이, 지역적으로 강원(Kangwon), 경기(Gyeonggi) 및 충남(Chungnam) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 2 및 4;As shown in FIG. 3, regionally, Gangwon, Gyeonggi, and Chungnam regions include Brucella abotus ST 1, 2 and 4;

경북(Gyeongbuk) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 2, 3, 5, 7 및 8;Gyeongbuk region includes Brucella abotus ST 1, 2, 3, 5, 7 and 8;

경남(Gyeongnam) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 2 및 3;Gyeongnam region includes Brucella abotus ST 1, 2 and 3;

전북(Jeonbuk) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 2, 3, 4 및 6;Jeonbuk region includes Brucella abotus ST 1, 2, 3, 4 and 6;

전남(Jeonnam) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 3 및 5;Jeonnam region includes Brucella abotus ST 1, 3 and 5;

충북(Chungbuk) 지역은 브루셀라 아보투스 ST 1, 3, 4, 6 및 7;Chungbuk region includes Brucella abotus ST 1, 3, 4, 6 and 7;

제주(Jeju)지역은 브루셀라 아보투스 ST 1 및 4;가 분포해있는 것을 확인하였다.It was confirmed that Brucella abotus ST 1 and 4; were distributed in Jeju.

특히, 대구(Daegu) 지역은 경북지역에서 다양한 유전자형의 브루셀라 아보투스가 분포된 것을 알 수 있다. 또한 브루셀라 아보투스 ST 1은 경기, 충남 등 9개 지역(49.2%)에 다양하게 분포해 있는 것을 확인하였다. 상기 결과는 브루셀라 아보투스의 숙주인 소의 이동 이력 및 인근 전파 등의 사유로 지역별 역학적 연관성이 나타나는 것으로 보인다.In particular, it can be seen that in the Daegu (Daegu) area, various genotypes of Brucella abotus were distributed in the Gyeongbuk area. In addition, it was confirmed that Brucella abotus ST 1 was diversely distributed in 9 regions (49.2%) including Gyeonggi and Chungnam. The above results seem to show a regional epidemiologic relationship due to reasons such as the migration history of cattle, the host of Brucella abotus, and nearby transmission.

종합적으로 본 발명자들은 브루셀라 아보투스의 sequencing 및 alignment를 통해 유전자형(sequence type, ST)을 감별하기 위한 특이 SNP를 확인하였고, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계하였다. 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스 감별용 특이 SNP 및 프라이머 세트는 브루셀라 아보투스의 유전자형을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라 아보투스의 동정 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.Overall, the present inventors identified a specific SNP for discriminating a genotype (sequence type, ST) through sequencing and alignment of Brucella abotus, and designed a primer set for detecting it. The specific SNP and primer set for differentiation of Brucella abotus according to the present invention can rapidly and accurately discriminate the genotype of Brucella abotus, and thus can be used in various ways in the field of identification and diagnosis of Brucella abotus.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다. Above, a specific part of the present invention has been described in detail, for those of ordinary skill in the art, it is clear that this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, it is intended that the substantial scope of the present invention be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella abortus and primer set for detection <130> 114 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCSP31_forward primer <400> 1 tggctcggtt gccaatatca a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCSP31_reverse primer <400> 2 cgcgcttgcc tttcaggtct g 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbaA_forward primer <400> 3 ccaatgacat catgctcc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbaA_reverse primer <400> 4 cgttatagtc ccagtcgg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clpxS9_forward primer <400> 5 gatatcgaac tggcgaag 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clpxS9_reverse primer <400> 6 cgcgctccac attataatc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BabRB51_forward primer <400> 7 gcctacaaga attacgaaca 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BabRB51_reverse primer <400> 8 ccgccctttt gataccatat a 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_forward primer <400> 9 ttgccaaggt tcgtctga 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_reverse primer <400> 10 tccccggaaa atcttacttc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpN_forward primer <400> 11 aatcttctga cccattatgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpN_reverse primer <400> 12 caaacgctga aaacaatcac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08465_forward primer <400> 13 tcgatggtga attttgaagg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08465_reverse primer <400> 14 tgttttgtgg acaatggc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08685_forward primer <400> 15 atgtcaccct tcaattcg 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08685_reverse primer <400> 16 catctataac atcaccaagg 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14655_forward primer <400> 17 ctccggatcc catataaca 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14655_reverse primer <400> 18 caagctcaat caggacag 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS02320_forward primer <400> 19 caatttggtt taagtgcgg 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS02320_reverse primer <400> 20 gtcggtcttg tcggtttc 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS03625_forward primer <400> 21 cttccgaggt ggtgtaga 18 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS03625_reverse primer <400> 22 cagaaagtcg taattggca 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08240_forward primer <400> 23 gaatttggtg ttcaaggc 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08240_reverse primer <400> 24 accgaccttg attacgaa 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS15435_forward primer <400> 25 cttttgatgg tggcgttg 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS15435_reverse primer <400> 26 atggcaaaaa ccagaagtg 19 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14910_forward primer <400> 27 gatgcgattg aataggcg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14910_reverse primer <400> 28 tttaatcagg aaaccgtcac 20 <110> REPUBLIC OF KOREA (Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Single nucleotide polymorphism marker for identification of Brucella abortus and primer set for detection <130> 114 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCSP31_forward primer <400> 1 tggctcggtt gccaatatca a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCSP31_reverse primer <400> 2 cgcgcttgcc tttcaggtct g 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbaA_forward primer <400> 3 ccaatgacat catgctcc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fbaA_reverse primer <400> 4 cgttatagtc ccagtcgg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clpxS9_forward primer <400> 5 gatatcgaac tggcgaag 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clpxS9_reverse primer <400> 6 cgcgctccac attataatc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BabRB51_forward primer <400> 7 gcctacaaga attacgaaca 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BabRB51_reverse primer <400> 8 ccgccctttt gataccatat a 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_forward primer <400> 9 ttgccaaggt tcgtctga 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_reverse primer <400> 10 tccccggaaa atcttacttc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpN_forward primer <400> 11 aatcttctga cccattatgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpN_reverse primer <400> 12 caaacgctga aaacaatcac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08465_forward primer <400> 13 tcgatggtga attttgaagg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08465_reverse primer <400> 14 tgttttgtgg acaatggc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08685_forward primer <400> 15 atgtcaccct tcaattcg 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08685_reverse primer <400> 16 catctataac atcaccaagg 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14655_forward primer <400> 17 ctccggatcc catataaca 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14655_reverse primer <400> 18 caagctcaat caggacag 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS02320_forward primer <400> 19 caatttggtt taagtgcgg 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS02320_reverse primer <400> 20 gtcggtcttg tcggtttc 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS03625_forward primer <400> 21 cttccgaggt ggtgtaga 18 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS03625_reverse primer <400> 22 cagaaagtcg taattggca 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08240_forward primer <400> 23 gaatttggtg ttcaaggc 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS08240_reverse primer <400> 24 accgaccttg attacgaa 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS15435_forward primer <400> 25 cttttgatgg tggcgttg 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS15435_reverse primer <400> 26 atggcaaaaa ccagaagtg 19 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14910_forward primer <400> 27 gatgcgattg aataggcg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DK63_RS14910_reverse primer <400> 28 tttaatcagg aaaccgtcac 20

Claims (10)

단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 브루셀라 아보투스 감별용 조성물로서,
상기 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 조성물 :
브루셀라 아보투스 1번 염색체(NC_007618)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체(NC_007624)의 360501번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 브루셀라 아보투스 1번 염색체 1099314번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 641898번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1219989번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1212540번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1138131번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1185177번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304711번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304792번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체의 665349번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체의 371261번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1083739번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472410번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472392번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472386번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 360543번째 뉴클레오티드.A single nucleotide polymorphism (SNP) composition comprising a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases including a marker or a complementary polynucleotide thereof, for the differentiation of Brucella abotus,
The single nucleotide polymorphic marker is at least one composition selected from the group consisting of:
nucleotide 817476 of Brucella abotus chromosome 1 (NC_007618);
nucleotide 817479 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 360501 of Brucella abotus chromosome 2 (NC_007624);
1099314 nucleotide of Brucella abotus chromosome 1 of Brucella abotus chromosome 1;
nucleotide 641898 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 1219989 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 1212540 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 1138131 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 1185177 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 304711 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 304792 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 665349 of chromosome 2 of Brucella abotus;
nucleotide 371261 of chromosome 2 of Brucella abotus;
1083739 nucleotide of Brucella abotus chromosome 1;
nucleotide 472410 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 472392 of chromosome 1 of Brucella abotus;
472386th nucleotide of Brucella abotus chromosome 1; and
Nucleotide 360543 of chromosome 1 of Brucella abotus. 제1항에 있어서,
상기 감별은 유전자형(sequence type, ST)을 감별하는 것인, 브루셀라 아보투스 감별용 조성물.According to claim 1,
The discrimination is to discriminate the genotype (sequence type, ST), Brucella abotus discrimination composition. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트.A kit for differentiation of Brucella abotus comprising the composition of claim 1 or 2. 제3항에 있어서,
상기 키트는 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA) 키트인, 브루셀라 아보투스 감별용 키트.4. The method of claim 3,
The kit is a multilocus sequence analysis (MLSA) kit, Brucella abotus differentiation kit. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 마이크로어레이.A microarray for differentiation of Brucella abortus comprising the composition of claim 1 or 2. 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는, 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트.A primer set for differentiation of Brucella abotus, comprising at least one selected from the group consisting of primers represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 28. 제6항의 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 키트.A kit for the differentiation of Brucella abotus comprising the primer set of claim 6. 제7항에 있어서,
상기 키트는 대립유전자 특이 PCR 키트, RT-PCR 키트, 디지털 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인, 브루셀라 아보투스 감별용 키트.8. The method of claim 7,
The kit is an allele-specific PCR kit, RT-PCR kit, digital PCR kit or DNA chip kit, Brucella abotus differentiation kit. (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 아보투스 감별 방법으로서,
상기 (b) 단계의 단일염기다형성 마커는, 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 브루셀라 아보투스 감별 방법:
브루셀라 아보투스 1번 염색체(NC_007618)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체(NC_007624)의 360501번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 브루셀라 아보투스 1번 염색체 1099314번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스의 1번 염색체의 641898번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1219989번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스의 1번 염색체의 1212540번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1138131번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1185177번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304711번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 304792번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체의 665349번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 2번 염색체의 371261번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 1083739번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472410번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472392번째 뉴클레오티드;
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 472386번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라 아보투스 1번 염색체의 360543번째 뉴클레오티드.(a) obtaining DNA from a sample isolated from a subject;
(b) amplifying a single nucleotide polymorphism marker from the DNA obtained in step (a); and
(c) confirming the genotype of the single nucleotide polymorphism marker amplified in step (b);
The single nucleotide polymorphism marker in step (b) is a Brucella abotus differentiation method, characterized in that at least one selected from the group consisting of:
nucleotide 817476 of Brucella abotus chromosome 1 (NC_007618);
nucleotide 817479 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 360501 of Brucella abotus chromosome 2 (NC_007624);
1099314 nucleotide of Brucella abotus chromosome 1 of Brucella abotus chromosome 1;
nucleotide 641898 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 1219989 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 1212540 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 1138131 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 1185177 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 304711 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 304792 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 665349 of chromosome 2 of Brucella abotus;
nucleotide 371261 of chromosome 2 of Brucella abotus;
1083739 nucleotide of Brucella abotus chromosome 1;
nucleotide 472410 of chromosome 1 of Brucella abotus;
nucleotide 472392 of chromosome 1 of Brucella abotus;
472386th nucleotide of Brucella abotus chromosome 1; and
Nucleotide 360543 of chromosome 1 of Brucella abotus. 제9항에 있어서,
상기 (b) 단계는 서열번호 1 내지 28의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 아보투스 감별용 프라이머 세트를 이용하여, (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 것인, 브루셀라 아보투스 감별 방법.10. The method of claim 9,
In step (b), a single base from the DNA obtained in step (a) using a primer set for differentiation of Brucella abotus comprising at least one selected from the group consisting of primers represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 28 A method for differentiating Brucella abotus, comprising amplifying polymorphic markers.
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차세대염기서열분석법을 이용한 브루셀라균 신속 감별동정 및 분자유전학적 특성분석, 세균질병과 브루셀라병 OIE 표준실험실, 농림축산검역본부, 연구과제 최종보고, 2016.* *

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