KR20220095388A

KR20220095388A - 개질된 하이드로겔

Info

Publication number: KR20220095388A
Application number: KR1020200186701A
Authority: KR
Inventors: 권태혁; 김정수
Original assignee: (주)오투메디; 울산과학기술원
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2022-07-07
Also published as: KR102564911B1

Abstract

본 발명은 개질된 하이드로겔에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면인 하이드로겔은 다중 작용기가 도입된 알긴산 폴리머 및 키토산 폴리머를 포함하여, 응집력, 수중 접착력을 포함한 접착력이 우수하다. 그 결과, 상기 하이드로겔은 수중 환경에서도 피부 접착력이 우수하고, 혈액 응고 효과와 피부 상처 효과가 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 겔화 시간이 빨라 신속한 지혈 효과를 기대할 수 있으며, 세포 독성이 없어 생체 적합성이 우수하다.

Description

개질된 하이드로겔{MODIFIED HYDROGEL}

본 발명은 개질된 하이드로겔에 관한 것이다.

과다 출혈은 일반적으로 인간이 생존할 수 있는 한계 이상으로 출혈이 발생하는 것을 의미한다. 과다 출혈은 전쟁터, 수술, 등 기타 응급 상황에서 사망의 주요 원인 중 하나로, 즉각적인 치료가 필요하다. 출혈을 멈추기 위해서는 수분 흡수와 혈소판 활성화가 필수 전제이다. 구체적으로, 수분 흡수를 통해 혈소판 및 피브린과 같은 혈액 응고 인자의 농도를 향상시켜서 지혈 작용을 촉진시킬 수 있다. 또한, 혈소판은 인체가 부상을 입었을 때 체내에서 가장 먼저 반응하는 혈액 구성 요소로, 가장 중요한 혈액응고 인자로 알려져 있으며, 혈소판의 지혈 기전은 다음과 같다. 먼저 손상된 혈관벽에 혈소판의 접착이 발생하고 혈소판들끼리 뭉쳐서 혈소판 플러그를 만들어 1차 지혈이 완성되며 이를 혈소판 활성화라고 한다. 활성화된 혈소판들은 피브린과 적혈구들을 끌어들여 빈 공간을 메우며 2차 지혈을 완성하게 되는데, 추가적으로 혈소판유도 성장 인자들을 방출하게 된다. 지혈 과정 후 상처 표면을 덮은 혈소판들은 혈소판 유도 성장 인자(Platelet-derived growth factors, PDGF)들의 방출을 통하여 염증, 증식, 리모델링과 같은 상처 치유 과정을 컨트롤한다.

이러한 수분 흡수 및 혈소판 활성화 원리를 이용하여, 제올라이트, 키토산, 피브린과 같은 많은 천연 지혈제들이 개발 및 상품화되었다. 이들 대부분의 천연 지혈제들은 긴급 지혈 효과는 어느정도 있으나, 다음과 같은 심각한 문제점들을 안고 있다. 예를 들어 제올라이트 광물은 화상을 일으키기 쉬우며, 생체 적합성이 부족하고, 키토산은 물에 대한 용해도가 낮아 생체표면과의 수중접착 능력이 떨어진다. 또한, 피브린은 생체 적합성은 높은 반면, 생체 유래 추출물이기에 비용이 높으며 단백질 구조 및 트롬빈과 같은 효소를 필요로 하기 때문에 동결 보관 및 해동 사용이 제한적이다.

상기 문제점을 해소할 수 있는 이상적인 지혈 소재로 하이드로겔이 주목을 받고 있다. 하이드로겔은 수많은 3차원 다공성 구조와, 수분 흡수 능력이 높아 세포 증식 및 상처 치유에 강점을 지닌 것으로 알려져 있다. 하이드로겔은 작용기를 도입함으로써, 스스로 뭉치는 응집(cohension) 및 다른 물질에 들러붙는 접착(adhesion)과 같은 주요 물성들을 조절할 수 있다. 특히 응집은 젤화 속도 및 젤의 기계적 안정성에 큰 영향을 미치고, 접착은 주변 바이오 분자들과의 상호 작용과 밀접한 관련성이 있다.

최근 하이드로겔의 응집과 접착력을 조절하여 지혈용 하이드로겔을 개발하려는 다양한 시도가 있었으며 그 예는 다음과 같다. 다당류 기반에 소수성 알킬 체인을 기능화한 하이드로겔은 세포막의 인지질 이중막과의 상호 작용을 통하여 크로스링킹이 가능하였으며 더 나아가 혈액 세포와의 접착 및 응집으로 지혈제의 가능성을 보여주었다. 그러나, 이러한 하이드로겔은 혈액 속의 수많은 물분자들의 반데르발스 힘의 방해로 인한 수중 접착 능력이 저하되는 한계점을 보였다. 또한, 지혈용 하이드로겔의 수중 접착 능력을 향상시키기 위해 홍합 유래의 수중 접착 능력이 뛰어난 카테콜 작용기를 생체 적합성이 높은 히알루론산에 접목한 연구가 진행되었다. 그러나, 카테콜 단일 작용기만을 도입하였을 시 응집과 접착 사이의 효율성이 떨어지는 문제점을 보였고, 크로스링킹 시 세포독성 위험을 지닌 NaIO₄의 사용을 필요로 하는 문제점이 발견되었다.

이에, 우수한 생체 적합성 보유를 전제로, 응집력과 접착력이 우수하면서, 이들이 적절히 조화된 하이드로겔의 개발이 필요한 상황이다.

KR 10-2020-0101818 A

일 측면에서, 본 발명의 목적은 생체 적합성이 우수한 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 피부 접착성이 우수한 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 수중 접착력이 우수한 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 하이드로겔의 수분 흡수 능력을 개선하기 위한 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 하이드로겔 조성물의 겔화 속도를 개선하기 위한 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 즉각적인 지혈 효과가 있는 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 지혈 및 피부 재생 효과가 우수한 하이드로겔을 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 보관성이 우수하고 사용이 편리한 지혈·상처 치료제를 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 생체 유래 물질인 피브린과 비교하여 경제적인 상처 치유제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에서, 하이드로겔로서, 상기 하이드로겔은, 키토산 유도체; 및 알긴산 유도체를 포함하고, 상기 키토산 유도체는, 키토산의 관능기가 갈릭산(gallic acid), 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하고, 상기 알긴산 유도체는, 알긴산의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔을 제공한다.

본 발명의 일 측면인 하이드로겔은 다중 작용기가 도입된 알긴산 폴리머 및 키토산 폴리머를 포함하여, 응집력, 수중 접착력을 포함한 접착력이 우수하다. 그 결과, 상기 하이드로겔은 수중 환경에서도 피부 접착력이 우수하고, 혈액 응고 효과와 피부 상처 효과가 우수하다. 또한, 본 발명의 하이드로겔은 겔화 시간이 빨라 신속한 지혈 효과를 기대할 수 있으며, 세포 독성이 없어 생체 적합성이 우수하다.

도 1 내지 도 8에서 AC는 알긴산 유도체 및 키토산 유도체 함유 하이드로겔를 의미하고, ACa는 알긴산 유도체 및 칼슘 함유 하이드로겔을 의미하며, ACCa는 본 발명의 알긴산 유도체, 키토산 유도체 및 Ca 함유 하이드로겔을 의미한다.
도 1은 본 발명의 하이드로겔의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 하이드로겔의 응집력과 부착력의 메커니즘을 보이는 도이다.
도 3a는 본 발명의 키토산 유도체의 NMR(nuclear magnetic resonance) 결과를 보이는 도이다.
도 3b는 본 발명의 알긴산 유도체의 NMR 결과를 보이는 도이다.
도 4a는 본 발명의 하이드로겔의 겔화 시간을 측정한 도이다.
도 4b는 AC 하이드로겔, ACa 하이드로겔, 및 ACCa 하이드로겔의 점도를 측정한 결과이다.
도 4c는 AC 하이드로겔의 SEM(scanning electron microscope) 이미지이다.
도 4d는 ACa 하이드로겔의 SEM 이미지이다.
도 4e는 ACCa 하이드로겔의 SEM 이미지이다.
도 4f는 AC 하이드로겔, ACa 하이드로겔, 및 ACCa 하이드로겔의 팽윤비(swelling ratio)를 관찰한 결과이다.
도 5a는 혈소판과 하이드로겔의 반응성을 확인한 결과로, 혈액과 하이드로겔을 반응시킨 후 혈액 내 존재하는 혈소판의 수 측정 결과이다(Alginate-Chitosan_Ca Hydrogel은 개질되지 않은 알긴산과 키토산 및 Ca를 포함하는 하이드로겔을 의미함).
도 5b는 혈액과 하이드로겔을 반응시킨 후 혈액 내 혈소판 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF-BB)의 발현양을 측정한 결과이다(N: 음성 대조군, P: 양성 대조군).
도 5c는 혈소판과 하이드로겔의 반응성을 확인한 결과로, 혈소판과 하이드로겔 반응 시간 경과에 따른 하이드로겔 표면 상의 혈소판 결합 정도를 SEM 을 통해 확인한 결과이다.
도 5d는 본 발명의 하이드로겔이 세포 증식에 적합한 환경인지 여부를 확인하기 위해 Hela 세포를 하이드로겔에서 배양한 결과를 보이는 도이다.
도 6는 본 발명의 하이드로겔의 지혈 효과를 확인한 in vivo 실험의 결과로, 도 6a는 하이드로겔 처리 후 출혈 시간을 측정한 결과, 도 6b는 하이드로겔 처리 후 출혈량을 측정한 결과이다.
도 7은 하이드로겔의 상처 치유 효과를 in vivo 실험한 결과로, 도 7a와 도 7b는 하이드로겔 처리후 상처 단면 회복 두께를 확인한 것이고, 도 7c는 하이드로겔을 처리한 후 상처 단면을 보이는 도이고, 도 7d은 하이드로겔을 처리한 후 상처 단면의 두께를 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이하에서, 각 구성을 보다 상세히 설명하나, 이는 하나의 예시에 불과할 뿐, 본 발명의 권리 범위가 다음 내용에 의해 제한되지 아니한다.

본 발명은 일 측면에서, 키토산 유도체; 및 알긴산 유도체를 포함하고, 상기 키토산 유도체는, 키토산의 관능기가 갈릭산(gallic acid), 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하고, 상기 알긴산 유도체는, 알긴산의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔이다.

본 명세서에서 상기 개질은, 축합 중합·첨가 중합과 같은 중합, 치환 및 첨가 등 화학적 반응을 포함하는 개념으로 사용되며, '작용기화'와 동의어로 사용될 수 있다.

상기 관능기(functional group)는 기능 원자단, 또는 작용기라고도 불리우며, 예컨대, 수산기(-OH), 알데히드기(-CHO), 카보닐기(-CO), 카복실기(-COOH), 아민기(-NH₂), 니트로기(-NO₂) 등을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 상기 키토산 유도체는, 하기 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함할 수 있다.

<화학식 1>

또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 알긴산 유도체는, 하기 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함할 수 있다.

<화학식 2>

또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 키토산 유도체는 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 및 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함할 수 있으며, 추가적으로 상기 화학식 1의 단위체를 더 포함할 수 있다.

상기 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함할 수 있으며, 및 상기 화학식 1의 단위체는 중합되어 연결된 것으로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 키토산 유도체는, 화학식 1의 단위체, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것이 중합된 폴리머일 수 있다.

상기와 같은 측면에서. 상기 알긴산 유도체는, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 및 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함할 수 있으며, 추가적으로 상기 화학식 2의 단위체를 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함할 수 있으며, 및 상기 화학식 2의 단위체는 중합되어 연결된 것으로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 알긴산 유도체는, 화학식 2의 단위체, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것, 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것이 중합된 폴리머일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 키토산의 관능기 중 갈릭산 등으로 개질된 부위는, 아미노기를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 알긴산의 관능기 중 갈릭산 등으로 개질된 부위는, 카복실기를 포함할 수 있다.

상기와 같은 측면에서, 본 발명의 키토산 유도체는, 하기 화학식 3의 물질을 포함할 수 있다:

<화학식 3>

일 측면에서, 상기 화학식 3의 키토산 유도체는 아래와 같은 방법에 의하여 제조할 수 있다.

<키토산 유도체의 합성공정>

구체적으로, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 카르보디이미드 커플링 반응을 이용하여, 상기 화학식 1의 단위체의 아미노 잔기를 개질하였으며, 개질은 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜 순으로 수행하였다. 상기 합성 방법은 논문(Journal of Polymer Science, Chitosan conjugated with deoxycholic acid and gallic acid: A novel biopolymer-based additive antioxidant for polyethylene, Wanvimol Pasanphan 외2인, 2008, https://doi.org/10.1002/app.27953)을 참고하였다. 그 결과, 갈릭산, 케노디옥시콜산 및 카테콜은 아민기 대비 25%(몰/몰)씩 작용기화 되었다.

또한, 상기와 같은 측면에서, 상기 알긴산 유도체는, 하기 화학식 4의 물질을 포함할 수 있다.

<화학식 4>

일 측면에서, 상기 화학식 4의 알긴산 유도체는 아래와 같은 방법에 의하여 제조할 수 있다.

<알긴산 유도체의 합성공정>

구체적으로, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 카르보디이미드 커플링 반응을 이용하였고, 아디픽산 디하이드라자이드(Adipic acid dihydrazide)를 폴리머와 단분자 사이의 브릿지로 사용하였다. 상기 화학식 1의 단위체의 아미노 잔기를 개질하였으며, 개질은 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜 순으로 수행하였다. 상기 합성 방법은 논문(J.App.Pol.Sci.2008, 27953)을 참고하였다. 그 결과, 갈릭산, 케노디옥시콜산 및 카테콜은 아민기 대비 25%(mol/mol)씩 작용기화되었다.

본 발명의 하이드로겔은 상기와 같은 키토산 유도체, 알긴산 유도체를 포함하여 우수한 응집력과 접착력을 나타낼 수 있다. 또한, 금속 이온을 더 포함하여 응집력과 접착력을 더욱 개선할 수 있다.

구체적으로, 알긴산의 카복실기와 키토산의 아민기의 인력, 알긴산의 카복실기와 금속 이온간의 인력을 통해 강한 응집력을 나타낼 수 있다. 또한, 유도체 내의 갈릭산은 친수성으로, 하이드로겔의 수분 흡수력을 향상시켜 혈액 응고 인자의 농도를 높일 수 있고, 케노디옥시콜산은 콜레스테롤에서 유래한 물질로서 세포 인지질 막과의 접착력이 우수하여, 하이드로겔 표면과 혈소판의 직접적인 접착을 유도할 수 있다. 또한, 카테콜은 수중 접착력이 우수한 물질로, 마이클 첨가와 수소 결합을 통하여 하이드로겔과 피부 등의 생체 조직의 섬유성 물질 간의 접착력과, 세포 간의 접착력을 향상시킬 수 있다(도 2 참조).

또한, 본 발명의 하이드로겔의 응집 물성은 점도를 통해서도 확인할 수 있다. 본 발명의 하이드로겔의 점도는 약 250Pa·s 이상일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 하이드로겔의 점도는 약 250~330 Pa·s, 더욱 구체적으로는 약 270~300 Pa·s로, 높은 점도를 나타낸다.

또한, 본 발명의 하이드로겔은 두터운 벽 두께를 나타내며, 우수한 기계적 안정성을 나타낸다. 구체적으로, 본 발명의 하이드로겔의 벽 두께는, 약 6μm 이상이며, 더욱 구체적으로는 약 6~9μm, 더욱 구체적으로는 약 6.5~8.5μm일 수 있다. 개질되지 않은 일반 알긴산과 키토산을 포함하는 하이드로겔의 벽 두께가 약 1μm임을 고려할 때, 최소 약 6배 이상 우수한 기계적 물성을 나타내는 것이라고 볼 수 있다.

또한, 본 발명의 하이드로겔의 평균 기공 사이즈는 약 10~25μm, 구체적으로는 약 10~21μm, 더욱 구체적으로는 약 16μm일 수 있다. 한편, 개질되지 않은 일반 알긴산과 키토산을 포함하는 하이드로겔의 경우 기공 사이즈가 약 19μm을 고려할 때, 본 발명의 하이드로겔은 동일 면적대비 더 우수한 다공성과 이로 인한 우수한 기계적 안정성을 나타낸다고 볼 수 있다.

또한, 상기와 같은 이유로 본원 발명의 하이드로겔은 수분 흡수 능력이 우수하며, 수중 환경에서도 우수한 접착성을 나타낼 수 있다.

또한, 일 측면에서 상기 하이드로겔은 금속 이온을 더 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 하이드로겔 또는 하이드로겔 조성물이 금속 이온을 포함 할 경우, 이에 포함되는 알긴산 유도체, 키토산 유도체 및 금속 이온은 각각 순서대로 1~10%, 1~8%, 0.1~1%로 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 알긴산 유도체는 3~10%, 또는 5~10%, 또는 6~10%로 포함될 수 있고, 상기 키토산 유도체는 1~6%, 또는 2~6%, 또는 3~5%로 포함될 수 있고, 상기 금속 이온은 0.1~0.8%, 또는 0.2~0.8%, 또는 0.3~0.8%, 또는 0.4~0.6%로 포함될 수 있다.

키토산 유도체, 알긴산 유도체 및 금속 이온이 상기와 같은 농도로 포함될 때, 신속한 겔화(gelation) 속도를 보일 수 있다. 겔화 속도가 빠를수록 응급 상황 시 지혈에 용이하다.

또한, 일 측면에서 본 발명의 하이드로겔에 포함되는 금속 이온은 2 가 금속 이온을 포함할 수 있다. 2가 금속 이온은 제한되지 않고, 칼슘(Ca), 베릴륨(Be), 마그네슘(Mg), 스트론튬(Sr), 바륨(Ba) 등을 포함할 수 있으며, 2종 이상의 금속 이온을 포함할 수 있다.

상기와 같은 측면에서, 본 발명의 일 구현예에서 상기 금속 이온은 칼슘 이온을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 하이드로겔은 상처 치유용 또는 지혈용을 포함할 수 있다.

또한, 일 측면에서, 본 발명의 하이드로겔은 약학적 조성물을 포함할 수 있다.

또한, 상기 하이드로겔은 시트화할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예와 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[제조예] 키토산 유도체, 알긴산 유도체 및 칼슘 함유 하이드로겔의 제조

[제조예 1] 키토산 유도체의 제조

키토산 유도체는 Chitosan conjugated with deoxycholic acid and gallic acid: A novel biopolymer-based additive antioxidant for polyethylene(Wanvimol Pasanphan 외2인, Journal of Polymer Science, 2008, https://doi.org/10.1002/app.27953)을 참고하여 제조하였다.

키토산 유도체 합성은 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 카르보디이미드 커플링 반응을 이용하였고, 갈릭산, 케노디옥시콜산 및 카테콜을 아민기 대비 각각 25%(몰/몰)씩 순서대로 작용기화 하였다.

키토산의 작용기화(개질)은 프로톤 NMR을 통하여 확인하였다. 그 결과 키토산의 갈릭산과 카테콜의 프로톤 피크는 7ppm과 8.5ppm 사이에서 나타났고, 케노디옥시콜산의 프로톤 피크는 1ppm 근처에서 나타남을 확인하여, 작용기화가 되었음을 확인할 수 있었다(도 3a).

[제조예 2] 알긴산 유도체의 제조

알긴산 유도체의 합성 방법 역시 상기 논문을 참고하여 제조하였다.

구체적으로, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)와 N-hydroxysuccinimide(NHS)의 카르보디이미드 커플링 반응을 이용하였고, 아디픽산 디하이드라자이드(Adipic acid dihydrazide)를 폴리머와 단분자 사이의 브릿지로 사용하였다. 갈릭산, 케노디옥시콜산 및 카테콜을 각각 아민기 대비 25%(mol/mol)씩 순서대로 작용기화 하였다.

알긴산의 작용기화(개질) 역시 프로톤 NMR을 통하여 확인하였다. 그 결과 알긴산의 갈릭산과 카테콜의 프로톤 피크는 6.5ppm~7ppm 사이에서 나타났고, 케노디옥시콜산의 프로톤 피크는 1ppm 근처에서 나타났으며, 아디픽산 디하이드라자이드의 프로톤 피크는 1.5~2.2ppm에서 확인되어, 작용기화가 되었음을 확인할 수 있었다(도 3a).

[제조예 3] 하이드로겔의 제조

본 하이드로겔은 4%의 키토산 유도체와 1%의 칼슘클로라이드를 녹인 수용액과, 8%의 알긴산 유도체를 녹인 수용액을 1:1 비율로 듀얼시린지를 이용하여 실온에서 혼합하였다. 그 결과 제조된 하이드로겔 내 알긴산 유도체, 키토산 유도체 및 칼슘 이온의 농도는 각각 순서대로 4%, 2%, 0.5%이다(ACCa 하이드로겔).

또한, AC 하이드로겔은 4% 키토산유도체를 물에 녹인 수용액과 8% 알긴산 유도체를 물에 녹인 수용액을 각각 1:1 부피비로 혼합하여 AC하이드로젤을 제조하였고, ACa 하이드로겔은 1% 칼슘이온을 물에 녹인 수용액과 8% 알긴산 유도체를 물에 녹인 수용액을 각각 1:1 부피비로 혼합하여 제조하였다. 또한, 개질되지 않은 알긴산과 키토산을 사용한 하이드로겔은 작용기를 달지 않은 8% 알긴산(alinate)을 녹인 수용액과 작용기를 달지 않은 4% 키토산과 1% 칼슘이온을 혼합하여 물에 녹인 수용액을 각각 1:1 부피비로 혼합하여 제조하였다.

[실험예]

[실험예 1] 겔화 시간 측정 및 최적의 농도 도출

제조예 1의 키토산 유도체 용액, 제조예 2의 알긴산 유도체 용액과 칼슘 이온 수용액을 이중 주사기를 통해 혼합하여 겔화되는 시간을 바이알 틸팅(vial tilting)법을 활용하여 측정하였다.

실험에 사용된 각 성분의 조성은 아래 표 1과 같았다.

Ratio Concentration	A : CCa = 2 : 1	A : CCa = 1 : 1	A : CCa = 1 : 2
A 2% & C 2% & Ca 0%	No	No	No
A 4% & C 2% & Ca 0%	1.2 ± 0.2 h	1.2 ± 0.1 h	No
A 8% & C 2% & Ca 0%	1.2 ± 0.1 h	1.2 ± 0.2 h	1.2 ± 0.2 h
A 2% & C 4% & Ca 0%	No	No	No
A 4% & C 4% & Ca 0%	40 ± 7 s	45 ± 10 s	62 ± 11 s
A 8% & C 4% & Ca 0%	32 ± 9 s	18 ± 4 s	41 ± 8 s
A 8% & C 4% & Ca 1%	1s	1 s	1 s

(A: 알긴산 유도체, C: 키토산 유도체, Ca: 칼슘이온, h:시간, s: 초)

상기 표의 해석 예시는 다음과 같다. 예컨대, 2% 농도의 알긴산 유도체 용액과, 2%농도의 키토산 유도체 용액 및 0% 농도의 칼슘 용액의 혼합액을 2:1의 부피비로 혼합하였을 때, 겔화 현상이 나타나지 않았다. 또한, 8%의 알긴산 유도체 용액과, 2%의 키토산 유도체 용액 및 0%의 칼슘 용액의 혼합액을 1:1의 부피비로 혼합할 경우의 겔화시간은 1.2 ± 0.2 h였다.

그 결과, 8%의 알긴산 유도체 용액, 4%의 키토산 유도체 용액 및 1%의 칼슘이온 용액을 혼합하였을 때, 겔화 시간이 1초로, 즉각적인 겔화가 나타남을 알 수 있었다. 이러한 빠른 겔화 시간은 응급 상황 시 지혈을 위한 응급제제로서 활용성에 강점을 나타낼 수 있다.

하기 실험에서 사용되는 하이드로겔은 4%의 키토산 유도체(또는 0%의 키토산 유도체를 녹인 수용액)와 1%의 칼슘클로라이드를 녹인 수용액(또는 0%의 칼슘클로라이드를 녹인 수용액)과, 8%의 알긴산 유도체를 녹인 수용액을 1:1 비율로 듀얼시린지를 이용하여 실온에서 혼합한 것을 사용하였다.

[실험예 2] 하이드로겔의 응집 물성 확인

레오미터를 활용하여 하이드로겔의 G'와 G''값을 비교 분석하고, 점도 특성을 확인하였다.

일반적으로 G'이 G"을 앞서는 cross-point를 겔화 시점(gelation time)으로 추정하며, 그림 4a와 같이 제조예 3의 ACCa 하이드로겔은 G'이 G"을 앞서는 즉각적인 gelation time을 나타냈다.

비교군인 알기닌 유도체와 키토산 유도체를 포함하는 AC 하이드로겔과, ACa 하이드로겔 또한 즉각적인 겔화 현상을 나타내며 이는 이온 상호 작용(ionic interaction)과 조화(coordination)가 빠른 속도로 일어나는 것을 말해준다. 또한 이러한 특성은 바이알 틸팅으로 관찰한 빠른 겔화 현상과도 일치한다.

제조예 3의 하이드로겔(ACCa 하이드로겔)은 ionic interaction과 coordination 두가지 응집력 모두를 사용하여 향상된 기계적 안정성을 구현하였으며, 이는 점도가 향상됨을 통해 확인할 수 있었다

점도는 rheometer(Haake MARS III-ORM Package) 을 이용하여 측정하였으며, 그 결과 ACCa 하이드로겔의 점도는 283 ± 13 Pa·s, ACCa 하이드로겔은 110 ± 12 Pa·s, 마지막으로 AC 하이드로겔은 9 ± 1 Pa·s의 점도를 나타내어, 본 발명의 하이드로겔의 점도가 높음을 확인할 수 있었다(도 4b).

또한, SEM 이미지 측정을 통하여 하이드로겔의 벽 두께(wall thickness)와 기공 사이즈를 측정하였다.

그 결과, ACCa 하이드로겔의 벽 두께는 7.6 ± 0.9 μm, AC 하이드로겔의 벽 두께는 1.0 ± 0.3 μm, ACa 하이드로겔의 벽 두께는 7.4 ± 1.4 μm임을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 하이드로겔은 두터운 벽 두께를 가지므로, 우수한 기계적 안정성을 나타낼 수 있다.

기공 크기의 경우 본 발명의 ACCa 하이드로겔은15.9 ± 5.1 μm, AC 하이드로겔이 18.8 ± 6.2 μm, ACa 하이드로겔은 7.4 ± 1.4 μm인 것으로 나타났다(도 4c~도 4e 참조).

즉, 본 발명의 하이드로겔은 높은 다공성과 두터운 두께로 안정성이 향상된 결과를 보여주었다.

또한, 상기와 같은 다공성의 경향으로 인해 본원 발명의 하이드로겔은 수분 흡수율이 높음을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 본원 발명의 ACCa 하이드로겔의 팽창률은 1189 ± 108 %이고, AC하이드로겔의 팽창률은 1483 ± 132 %이며, ACa 하이드로겔은1042 ± 119 % 이었다.

[실험예 3] 하이드로겔과 혈소판의 접착력 확인

혈소판과 본 발명의 ACCa 하이드로겔의 상호작용을 확인하기 위해, 혈액과 ACCa 하이드로겔을 섞고 10분간 침강 시킨 뒤 남아있는 혈소판의 개수를 XE-2100 혈구 분석기를 사용하여 측정하였다.

대조군인 혈액 샘플의 혈소판 개수는 272 ± 33×10³개이며, 작용기를 도입하지 않은 알기네이트, 작용기를 도입하지 않은 키토산 및 칼슘 함유 하이드로겔 샘플의 혈소판 개수는 233 ± 32×10³개였다. 하지만, 본원 발명의 ACCa 하이드로겔 샘플의 혈액 샘플의 혈소판 개수는 44 ± 19×10³개로 극적인 혈소판 개수의 감소를 나타냈다.

이러한 혈소판 감소는 혈액 중 혈소판이 하이드로겔의 표면에 들러붙어 침강된 결과로 본 연구의 다중 작용기가 혈소판의 접착에 성공적이었음을 입증한다(도 5a).

접착된 혈소판은 활성화를 통해 혈소판 성장 인자(Platelet-derived growth factor, PDGF-BB)를 방출하고, 방출된 혈소판 성장 인자는 세포 증식 및 혈관 생성을 유도하여 상처 치유에 중요한 역할을 하게 된다. 따라서, 본 발명의 ACCa 하이드로겔에 접착된 혈소판이 활성화되었음을 증명하기 위해, 혈액과 ACCa 하이드로겔을 섞어 18시간 후 PDGF-BB가 방출됨을 웨스턴 블롯을 이용하여 검증하였다). 그 결과 음성 대조군(N) 인 혈액속의 PDGF-BB signal intensity는 25.6 ± 9이고, 양성 대조군(P)인 혈액과 물을 섞은 PDGF-BB signal intensity는 20.4 ± 3.3이었으며, 본원 발명의 ACCa 하이드로겔 혈액 샘플의 PDGF-BB signal intensity는 67.2 ± 3.6이었다. 즉, 본원 발명의 하이드로겔은 대조군 대비 2배 이상의 PDGF-BB 증가를 보였으며, 이는 본원 발명의 하이드로겔에 접착된 혈소판이 대조군들에 비하여 활성화도가 높고, 이로 인해 혈소판 유도 성장 인자를 더욱 다량 방출 하였음을 의미한다(도 5b).

하이드로겔 표면에의 혈소판 접착은 SEM 이미지를 통해서도 확인하였다. 혈액과 ACCa하이드로겔을 섞은 혼합물을 1분 및 5분 뒤에 세척하여, NBS 고정 용액에 담근 후 에탄올 드라잉을 시켜 표면을 관찰하였다. 음성 대조군과 비교 시, 1분간 혈액에 노출된 ACCa 하이드로겔의 표면에는 1~2 μm 크기의 혈소판이 접착되기 시작하였고, 5분 뒤 ACCa 하이드로겔 표면 위에는 다량의 혈소판들이 빽빽하게 위치하고 있음을 확인하였다(도 5c).

[실험예 4] 하이드로겔의 생체 적합성 확인

본 발명의 ACCa 하이드로겔이 세포 증식에 적합한 환경을 제공할 수 있는지를 확인하기 위해, Hela 세포를 ACCa 하이드로겔 속에 넣어 7일간 배양한 후 dead or live staining을 진행하였다. 그 결과, 배양 후 1일차에 Hela 세포들이 균일하게 하이드로겔의 3D 구조에 분포되었으며 독성이 없음을 확인하였다. 배양 후 7일차에 Hela 세포들은 증식 과정을 거치면서 덩어리로 뭉쳐 자라났고 세포독성이 없음을 확인하여, ACCa 하이드로겔의 세포 적합성이 우수하다는 것을 입증하였다(도 5d).

[실험예 5] 하이드로겔의 지혈 효과 확인 -in vivo 실험

본 발명의 ACCa 하이드로겔의 지혈 성능을 테스트하기 위해, 마우스의 꼬리를 4cm로 절단한 후 출혈 시간과 출혈량을 음성 대조군과 비교하였다. 자연 출혈(음성 대조군)의 경우, 13분 동안 366 ± 28 mg의 출혈이 발생하였으며 13분 이후 자연적으로 출혈이 멈췄다. 반면, 본 발명의 ACCa 하이드로겔을 사용하였을 시 출혈 시간은 1분 동안 28 ± 6 mg 의 출혈량이 발생하여, 음성 대조군 대비 출혈 시간과 출혈량 모두 10배 이상 단축시킨 결과를 보였다(도 6a 및 도 6b).

이는 본 발명의 ACCa 하이드로겔이 응급 지혈제로 응용 가능함을 충분히 시사해주는 것이다.

[실험예 6] 하이드로겔의 상처 치유 효과 확인 -in vivo 실험

지혈 후에는, 상처 회복 과정이 자연적으로 뒤따르며 본 발명 ACCa 하이드로겔은 혈소판의 활성으로 방출된 혈소판 성장인자를 방출하여 상처 회복을 촉진시킬 것으로 예상하였다.이에, 본 발명의 ACCa 하이드로겔의 in vivo 상처치유 성능을 테스트 하기 위하여, 도 7a와 같이 Rat 모델에 직경 5 mm 둥근 상처를 낸 후, 0, 5, 10, 및 15일 동안 상처 회복률(수축률)과 상처 단면 회복 두께를 측정하였다. Rat의 자연적 회복을 음성 대조군으로, 병원에서 흔히 사용되는 surgicel 과 fibrin(tisseel) 지혈제를 양성 대조군으로 비교하였다. 5일차에 모든 샘플은 25% 이하의 유사한 상처 회복률을 보였다. 그러나 10일차 경과 시 surgicel(48 ± 6.2%)과 자연회복(52 ± 4.1%)과 비교하여, 하이드로겔(71 ± 3.8%)과 피브린(73 ± 5.3%)에서 눈에 띄는 상처 회복이 나타났다. 15일차 경과 시 하이드로겔(92 ± 2.4%)과 피브린 (94 ± 2.2%)의 상처 회복률은 90%으로 회복 속도가 빠른 반면, surgicel (73 ± 2.3%)과 자연회복(70 ± 1.8%) 그룹은 상대적으로 더딘 상처 회복률을 보였다. 본 발명의 ACCa 하이드로겔이 피브린과 유사한 상처 회복률을 보이는 것은 동물 지혈 추출물인 피브린 또한 혈소판 접착과 활성을 이용한 동일한 메커니즘을 가지기 때문이라고 짐작된다. 그러나, 본 발명의 하이드로겔은 피브린 보다 저렴한 가격으로 대량 생산 및 공급이 가능하며, 보관과 사용에 있어서도 사용자의 편의성을 높여 더욱 경쟁력이 있다고 판단된다.

또한, 상처 회복 정도를 심층적으로 파악하기 위해, Hematoxylin and Eosin staining을 통하여 10일차와 15일차의 상처 회복 단면들을 비교하여 두께를 측정하였다. 그 결과, 눈에 띄는 상처 회복을 보이는 10일차의 상처 단면 두께는 하이드로겔과(719 ± 23 μm), 피브린(728 ± 28 μm)이 surgicel(508 ± 21 μm)과 자연회복(517 ± 32 μm)보다 두꺼우며 앞선 상처 회복률과 일치하는 결과를 보여주었다 (도 7c및 도7d).

Claims

하이드로겔로서,
상기 하이드로겔은,
키토산 유도체; 및 알긴산 유도체를 포함하고,
상기 키토산 유도체는,
키토산의 관능기가 갈릭산(gallic acid), 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 및 카테콜(catechol)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하고,
상기 알긴산 유도체는,
알긴산의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 키토산 유도체는,
하기 화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔:
<화학식 1>

.
제1항에 있어서,
상기 알긴산 유도체는,
하기 화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산, 케노디옥시콜산, 및 카테콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔:
<화학식 2>

.
제1항에 있어서,
상기 키토산 유도체는,
화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것;
화학식 1의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것; 및
화학식 1의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 알긴산 유도체는,
화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것;
화학식 2의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것; 및
화학식 2의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것을 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 키토산 유도체는,
화학식 1의 단위체;
화학식 1의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것;
화학식 1의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것; 및
화학식 1의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것이 중합된 것을 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 알긴산 유도체는,
화학식 2의 단위체;
화학식 2의 단위체 상의 관능기가 갈릭산으로 개질된 것;
화학식 2의 단위체 상의 관능기가 케노디옥시콜산으로 개질된 것; 및
화학식 2의 단위체 상의 관능기가 카테콜로 개질된 것이 중합된 것을 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 키토산의 관능기는, 아미노기를 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 알긴산의 관능기는 카복실기를 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 키토산 유도체는, 하기 화학식 3의 물질을 포함하는, 하이드로겔:
<화학식 3>

.
제1항에 있어서,
상기 알긴산 유도체는, 하기 화학식 4의 물질을 포함하는, 하이드로겔:
<화학식 4>

.
제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 금속 이온을 더 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은, 알긴산 유도체, 키토산 유도체 및 금속 이온을 포함하고,
상기 알긴산 유도체, 키토산 유도체 및 금속 이온은, 각각 순서대로,
1~10%, 1~8%, 0.1~1%로 포함되는, 하이드로겔.
제12항에 있어서,
상기 금속 이온은, 2가 금속 이온을 포함하는, 하이드로겔.
제12항에 있어서,
상기 금속은, 칼슘을 포함하는, 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은,
상처 치유용, 또는 지혈용인, 하이드로겔.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 하이드로겔은, 약학적 조성물을 포함하는, 하이드로겔.