KR20220092583A - 인자 viii 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상응하는 야생형 인자 VIII과 비교하여 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 하나 이상의 치환 돌연변이는 인자 VIII 폴리펩타이드의 2개 도메인 사이의 도메인 간(inter-domain) 계면(interface)에 위치한다. 또한, 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 AAV 작제물, 이러한 재조합 AAV 작제물을 포함하는 AAV 바이러스 입자, 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, 또는 AAV 바이러스 입자를 포함하는 조성물, 및 요법에서 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 및 조성물의 용도가 제공된다.

Description

인자 VIII 폴리펩타이드
본 발명은 인자 VIII(FVIII) 폴리펩타이드, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 재조합 AAV 작제물에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 본 발명의 재조합 AAV 작제물을 포함하는 AAV 바이러스 입자, 및 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 또는 AAV 바이러스 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 및/또는 조성물을 사용하는 방법, 및 용도에 관한 것이다.
A형 혈우병(haemophilia A)은 혈액 응고 인자 VIII의 결핍에 의해 야기되는 출혈 장애이다. 이는 세계적으로 1 : 4,000 내지 1 : 5,000의 남자 신생아에게 영향을 미친다. 대부분의 사례는 X-연관 열성 특성(X-linked recessive trait)으로서 유전된다. 현재의 치료는 인자 VIII 단백질의 빈번한 정맥내 주사(주당 2 내지 3회)를 수반한다. 이러한 치료는 출혈을 억제시키는 데 고도로 효과적이지만, 이는 치유적이지는 않고 비용이 매우 많이 들어서(￡150,000/환자/년), 세계에서 대부분의 A형 혈우병 환자에 의해 선호되지 않게 된다. A형 혈우병에 대한 유전자 요법은 인자 VIII 유전자의 기능적 복사체를 유병(affected) 환자에게 이전시킨 후 인자 VIII의 지속적인 내인성 생성을 통해 치유에 대한 잠재성을 제공한다.
인자 VIII은 6개의 도메인, 즉, A1-A2-B-A3-C1-C2로 구성된다. 인자 VIII은 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자에 결합된 채로 혈류에서 비활성 형태로 순환된다. 손상에 반응하여, 인자 VIII은 활성화되고(그 후에 종종 인자 VIIIa로 지칭됨), 폰 빌레브란트 인자로부터 분리된다. 인자 VIIIa는 응고 캐스케이드에서 인자 IXa와 상호작용한다. 특히, 인자 FVIIIa는 인자 X의 활성화에서 인자 IXa에 대한 보조인자이다.
본 발명은 특정 아미노산 치환(치환 돌연변이)을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드에 관한 것이다. 인자 VIII은 A1-A2-B 도메인, 및 A3-C1-C2 도메인으로 구성된 헤테로이량체성 복합체로서 비활성 형태로 발현되고 순환된다. 인자 VIII은 트롬빈에 의한 단백분해성 절단에 의해 활성화된다. 트롬빈 절단 후, 인자 VIII은 A1 도메인, A2 도메인, 및 A3-C1-C2 도메인으로 구성된 헤테로삼량체성 복합체를 형성하고 입체배좌(conformational) 변화를 겪으며, 이는 인자 IXa에의 결합 및 인자 X의 활성화를 가능하게 한다. 활성화 후, 인자 VIIIa는 추가의 단백분해를 겪을 수 있고/있거나 헤테로삼량체성 복합체의 각각의 성분은 서로로부터 해리되어, 인자 VIIIa를 비활성화시킬 수 있다. 본 발명자들은, 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도(specific activity)를 증가시키는, 인자 VIII의 도메인의 계면(interface)에 위치한 소정의 아미노산의 치환을 식별하였다. 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도를 증가시키는 것은, 응고가 발생하기 위해 더 적은 양의 인자 VIII 폴리펩타이드가 필요할 수 있음을 의미한다.
제1 양태에서, 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 FVIII 아미노산 서열은
a. A1/A3 도메인 계면;
b. A2/A3 도메인 계면; 또는
c. A1/C2 도메인 계면
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 도메인간(inter-domain) 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
(i) 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하거나;
(ii) 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고;
인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 고유 활성도를 갖는다.
제2 양태에서, 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 인자 VIII 아미노산 서열은
a. A1/A3 도메인 계면;
b. A2/A3 도메인 계면; 또는
c. A1/C2 도메인 계면
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 도메인간 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
(i) 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하거나;
(ii) 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고;
인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 갖는다.
제3 양태에서, 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 인자 VIII 아미노산 서열은
a. A1/A3 도메인 계면;
b. A2/A3 도메인 계면; 또는
c. A1/C2 도메인 계면
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 도메인간 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
(i) 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하거나;
(ii) 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고;
인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현된다.
제4 양태에서, 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 인자 VIII 아미노산 서열은
a. SEQ ID NO: 1의 M662 또는 H693에 상응하는 아미노산의 치환; 또는
b. 시스테인 잔기로의 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 포함하는 아미노산의 쌍의 치환
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
1. 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 M147, S149 또는 S289에 상응하고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 E1969, E1970 또는 N1977에 상응하거나;
2. 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 T667, T669, N684, L687, I689, S695 또는 F697에 상응하고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 S1791, G1799, A1800, R1803, E1844, S1949, G1981, V1982, 또는 Y1979에 상응하거나;
3. 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 A108, T118 또는 V137에 상응하고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 N2172, Q2329 또는 Y2332에 상응한다.
제5 양태에서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 여기서 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩한다.
제6 양태에서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 AAV 작제물이 제공되며, 여기서 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩한다.
제7 양태에서, 본 발명의 재조합 AAV 작제물을 포함하는 AAV 바이러스 입자가 제공된다.
제8 양태에서, 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 또는 AAV 바이러스 입자 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
제9 양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물이 제공된다.
제10 양태에서, 유효량의 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공된다.
제11 양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물의 용도가 제공된다.
도 1은 수성상으로부터 비-수성상(옥타놀)으로의 아미노산의 자유 에너지(△G) 전이에 대한 윔리-화이트(Wimley-White) 소수성 스케일을 도시한다. 더 음성의 △G 값은 수성상으로부터 비-수성상으로의 더 선호할 만한 전이와 관련이 있고, 더 소수성 아미노산을 의미한다.
도 2는 임의의 치환 돌연변이가 결여된 FVIII-SQ('95') 대조군과 비교하여, 각각의 변이체에 대한 많은 대안적인 치환된 잔기를 포함하여, 몇몇 상이한 아미노산 치환 돌연변이 변이체에 대한 SA(고유 활성도)의 배수-변화(fold-change)를 도시한다. 변이체 65(H693W)는 95와 비교하여 SA의 상승을 나타낸다.
도 3은 임의의 치환 돌연변이가 결여된 FVIII-SQ('95') 대조군과 비교하여, 몇몇 상이한 이중 시스테인 치환 돌연변이 변이체에 대한 SA의 배수-변화를 도시한다. 많은 변이체는 95와 비교하여 SA의 상승을 나타낸다.
도 4는 치환 돌연변이를 포함하는 일련의 인자 VIII 폴리펩타이드의 인자 VIII 고유 활성도를 도시한다. 고유 활성도에 미치는 치환 돌연변이의 효과는 임의의 치환 돌연변이를 포함하지 않은 인자 VIII-SQ 대조군과 비교하여, 'SQ' 및 '96-106' 인자 VIII 폴리펩타이드에서 평가되었다. 오차 막대는 ELISA 및 활성 검정에서 시료 2벌(duplicate)로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 2 × 1012 vg/kg의, 작제물 FRE72-SP5-FVIIICo19(26-96-106)-SpA(SEQ ID NO: 27); FRE72-SP5-FVIIICo19-SQ-SpA(SEQ ID NO: 32); 또는 네이티브(native) FVIII 신호 펩타이드, SpA 및 간-특이적 프로모터와 함께 코돈-최적화된 FVIII-SQ-인코딩 서열을 포함하는 비교인자(comparator) 작제물(SEQ ID NO: 34)로부터 제조된 AAV8 바이러스 입자가 정맥내로 주사된 C7BL/6 FVIII 넉아웃 마우스의 혈장에서 주사-후 6주째에 인자 VIII 고유 활성도를 도시한다. **P = 0.0038. 좌측 패널은 미접촉(naive) 대조군과 비교하여, FRE72-SP5-FVIIICo19(26-96-106)-SpA(좌측 컬럼) 및 비교인자 작제물(중간 컬럼)의 고유 활성도를 도시하고; 우측 패널은 FRE72-SP5-FVIIICo19-SQ-SpA(좌측 컬럼) 및 비교인자 작제물(우측 컬럼)의 고유 활성도를 도시한다.
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일반적인 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업계의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
일반적으로, 용어 "포함하는(comprising)"은 포함하지만 이로 제한되지 않는 것으로 의미되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 어구 "인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드"는, 인자 VIII 폴리펩타이드가 인자 VIII 아미노산 서열을 갖지만 인자 VIII 폴리펩타이드가 추가 아미노산을 함유할 수 있음을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게는, 어구 "인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드"는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하지만, 폴리뉴클레오타이드는 추가의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단어 "포함하는"은 어구 "본질적으로 ~로 구성되는"으로 대체된다. 용어 "본질적으로 ~로 구성되는"은, 특정한 추가 성분, 즉, 주제의 본질적인 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분이 존재할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단어 "포함하는"은 어구 "~로 구성되는"으로 대체된다. 용어 "~로 구성되는"은 제한적인 것으로 의도된다. 예를 들어, 어구 "인자 VIII 아미노산 서열로 구성되는 인자 VIII 폴리펩타이드"는, 인자 VIII 폴리펩타이드가 인자 VIII 아미노산 서열을 갖고 어떠한 추가의 아미노산을 갖지 않음을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게는, 어구 "인자 VIII 뉴클레오타이드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오타이드"는, 폴리뉴클레오타이드가 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 갖고 어떠한 추가의 뉴클레오타이드를 갖지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단어 "갖는다"는 단어 "포함하다" 또는 어구 "~로 구성되다"로 대체될 수 있다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체성 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "핵산 분자", "핵산 서열", "폴리뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "치환 돌연변이" 및 "아미노산 치환"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 상이한 아미노산으로의 아미노산 서열 내 하나의 아미노산의 치환을 의미하는 것으로 의도된다. 어구 아미노산 X"의 치환", 또는 "치환되는(될) 아미노산 X"에서, 아미노산 X는 아미노산 서열 내에 존재하고 대체될 원래의 또는 네이티브 아미노산이다. 예를 들어, 메티오닌의 치환은, 네이티브 메티오닌 아미노산이 다른 아미노산에 의해 대체됨을 의미한다. 어구 아미노산 Y"로의 치환"에서, 아미노산 Y는 아미노산 서열 내 원래의 또는 네이티브 아미노산을 대체하는 상이한 아미노산이다. 예를 들어, 메티오닌으로의 치환은 메티오닌으로의 네이티브(비-메티오닌) 아미노산의 대체를 지칭한다. 치환 돌연변이를 정의하는 데 사용되는 표준 약칭 명명법은 치환될 아미노산 서열 내 위치에서의 원래의 또는 네이티브 아미노산, 및 원래의 또는 네이티브 아미노산을 대체하는 아미노산을 나열한다. 예를 들어, 치환 돌연변이 M662W를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열은, 위치 662에 상응하는 위치에서 트립토판 잔기로의 메티오닌 잔기의 치환을 포함하는(즉, 위치 662에 트립토판 잔기를 포함함) 인자 VIII 아미노산 서열을 지칭한다.
용어 "보존적 치환"은, 아미노산이 유사한 생화학적 특성, 예컨대 크기, 전하 또는 소수성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 치환 돌연변이를 지칭한다. 아미노산은 이의 측쇄의 구조에 기초하여 군(group)으로 범주화될 수 있다: 지방족(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신); 하이드록실/황-함유(세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌); 환식(프롤린); 방향족(페닐알라닌, 티로신, 트립토판); 염기성(히스티딘, 리신, 아르기닌); 산성(아스파르트산, 글루탐산); 및 산 아민(아스파라긴, 글루타민). 그러므로, "보존적 치환"은, 아미노산이 동일한 군의 다른 아미노산으로 치환되는 치환 돌연변이를 지칭한다. 대조적으로, 용어 "비-보존적 치환"은, 아미노산이 상이한 생화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 치환, 즉, 아미노산이 다른 군 내의 아미노산으로 치환되는 치환 돌연변이를 지칭한다. 예를 들어, 글루탐산으로의 아스파르트산의 치환은 "보존적 치환"인 것으로 여겨질 수 있는 한편, 발린으로의 아스파르트산의 치환은 "비-보존적" 치환인 것으로 여겨질 수 있다.
용어 "야생형" 및 "네이티브"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 천연 발생하는 것을 기재하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "야생형 인자 VIII 아미노산 서열"은 자연상에서 발생하는 아미노산 인자 VIII 서열이다.
용어 "B 도메인" 및 "베타 도메인"은 인자 VIII의 B 도메인과 관련하여 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 야생형 인자 VIII의 B 도메인은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 741-1648에 상응하는 영역으로 구성된다.
용어 "AAV 바이러스 입자" 및 "AAV 벡터"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 길이를 기재하는 맥락에서 사용되는 용어 "대략"은, 서열이 정의된 수 +(플러스) 또는 -(마이너스) 10%, 더 특히 + 또는 - 5%, 또는 더 특히 + 또는 - 단일 정수(single integer)의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함하거나 구성될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, "대략" 45개 아미노산 길이의 아미노산 서열에 대한 지칭은 41개 내지 49개 아미노산, 더 특히 43개 내지 47개 아미노산, 및 더 특히 44개 내지 46개 아미노산 길이의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 2개 서열(예컨대 2개 폴리뉴클레오타이드 또는 2개 폴리펩타이드 서열)의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭(gap)은 제2 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 서열에 도입될 수 있음). 그 후에, 각각의 위치에서의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 비교된다. 제1 서열 내 위치가 제2 서열 내 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 해당 위치에서 동일하다. 2개 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 갯수 / 기준 서열 내 위치의 총 갯수 × 100).
전형적으로 서열 비교는 기준 서열의 길이에 걸쳐 수행된다. 예를 들어, 사용자가 주어진("시험") 서열이 SEQ ID NO: 3과 95% 동일한지의 여부를 결정하기 원한다면, SEQ ID NO: 3이 기준 서열일 것이다. 서열이 SEQ ID NO: 3(기준 서열의 일례)과 적어도 95% 동일한지의 여부를 평가하기 위해, 당업자는 SEQ ID NO: 3의 길이에 걸쳐 정렬을 수행하고, 시험 서열 내 얼마나 많은 위치가 SEQ ID NO: 3과 동일한지 식별할 것이다. 위치 중 적어도 95%가 동일하다면, 시험 서열은 SEQ ID NO: 3과 적어도 95% 동일하다. 서열이 SEQ ID NO: 3보다 더 짧다면, 갭 또는 결측(missing) 위치는 동일하지 않은 위치인 것으로 여겨져야 한다.
당업자는 2개 서열 사이의 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해 이용 가능한 상이한 컴퓨터 프로그램을 알고 있다. 예를 들어, 2개 서열 사이에서 서열의 비교 및 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 얻어질 수 있다. 일 구현예에서, 2개 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 동일성 백분율은 Needleman 및 Wunsch(1970) 알고리즘을 사용하여 결정되며, 이는 Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 사용하여 Accelrys GCG 소프트웨어 패키지(http://www.accelrys.com/products/gcg/에서 입수 가능함) 내 GAP 프로그램 내로 혼입되었다.
단수형(a", "an", 및 "the")은 문맥상 분명하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "아미노산"에 대한 지칭은 이러한 아미노산의 2개 이상의 경우 또는 버전을 포함한다.
위에서 또는 아래에서 본원에서 인용되는 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 그 전체 내용이본원에 인용되어 포함된다.
기능 돌연변이의 획득
활성화된 인자 VIII 헤테로삼량체성 복합체의 각각의 성분의 해리(특히, A1 도메인 및 A3-C1-C2 도메인으로부터 A2 도메인의 해리)는 응고 캐스케이드의 활성화 후 인자 VIII 활성의 소실에 대한 주요한 기전 중 하나인 것으로 여겨진다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 즉각적인 아미노산 치환 돌연변이는 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성화 후 인자 VIII 헤테로삼량체성 복합체의 각각의 성분의 해리를 방지하거나 지연시켜, FVIIIa가 무손상(intact)이어서 활성인 시간을 연장시키는 역할을 할 수 있는 것으로 여겨진다.
본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 인자 VIII 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함한다. 더 특히, 하나 이상의 치환 돌연변이는 인자 VIII 폴리펩타이드의 2개 도메인 사이의 도메인간 계면에 위치한다. 특히, 하나 이상의 치환 돌연변이는 A1/A3 도메인 계면, A2/A3 도메인 계면, 또는 A1/C2 도메인 계면으로부터 선택되는 도메인간 계면에 위치한다. 따라서, 인자 VIII 아미노산 서열은 A1, A2, A3 또는 C2 도메인에 치환 돌연변이를 포함한다. 인자 VIII의 3-차원 결정 구조가 이용 가능하고(예를 들어, PDB 기탁 번호 2RZE 또는 4BDV); 따라서, 이들 도메인 내에서 치환될 수 있는 아미노산, 더 특히 명시된 도메인간 계면에 놓인 아미노산을 식별하는 것이 일상적일 것이다. 야생형 인자 VIII과 관련하여, A1 도메인은 SEQ ID NO: 1의 위치 1-329에 상응하는 아미노산으로 구성되며; A2 도메인은 SEQ ID NO: 1의 위치 380-711에 상응하는 아미노산으로 구성되고; A3 도메인은 SEQ ID NO: 1의 위치 1694-2021에 상응하는 아미노산으로 구성되며; C1 도메인은 SEQ ID NO: 1의 위치 2021-2169에 상응하는 아미노산으로 구성되고; C2 도메인은 SEQ ID NO: 1의 위치 2174-2332에 상응하는 아미노산으로 구성된다. 마지막 6개 아미노산(SEQ ID NO: 1의 위치 2327 내지 2332에 상응함)은 C2 도메인의 부분인 것으로 여겨지지 않을 수 있다. 그러므로, 선택적으로, C2 도메인은 SEQ ID NO: 1의 위치 2174-2326에 상응하는 아미노산으로 구성된다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 A1/A3 도메인 계면, A2/A3 도메인 계면 또는 A1/C2 도메인 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 고유 활성도를 가질 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도를 증가시키는 예시적인 치환 돌연변이는 본원에 개시되어 있다.
인자 VIII은 응고 캐스케이드에서 인자 X에 대한 보조인자이고, 일단 활성화되면 활성화된 인자 IX와 조합되어 작용하여 인자 X를 활성화시킨다. 인자 VIII은 그 자체로는 독립적으로 효소 활성을 소유하지 않는다. 그러므로, 본원에서 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성 또는 고유 활성도라는 지칭은 인자 X의 활성을 결정하기 위한 기능적 검정에서 관찰된 활성 또는 고유 활성도를 지칭하며, 여기서 인자 VIII은 인자 IX와 조합되어 인자 X에 대한 보조인자로서 역할을 할 수 있다(즉, 인자 VIII 보조인자 활성(FVIII:C)). 유사하게는, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드(예컨대 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드)보다 더 높은 활성 또는 고유 활성도를 갖는 인자 VIII 폴리펩타이드라는 지칭은 기능적 검정에서 기준 인자 VIII 폴리펩타이드에 대한 인자 X의 관찰된 활성 또는 고유 활성도와 비교하여 상기 검정에서 상기 인자 VIII 폴리펩타이드에 대해 증가되는 인자 X의 관찰된 활성 또는 고유 활성도를 지칭한다.
인자 VIII 폴리펩타이드가 기준 인자 VIII 폴리펩타이드, 예컨대 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 고유 활성도를 증가시켰는지의 여부를 결정하기 위해, 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성은 2 단계 발색 인자 Xa 검정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 적합한 발색 검정은 하기와 같다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 인간 인자 X 폴리펩타이드 및 인자 IXa 폴리펩타이드, 트롬빈, 인지질 및 칼슘과 혼합된다. 트롬빈은 인자 VIII 폴리펩타이드를 활성화시켜, 인자 VIIIa 폴리펩타이드를 형성한다. 트롬빈-활성화된 인자 VIII 폴리펩타이드는 인자 IXa 폴리펩타이드, 인지질 및 칼슘과 효소 복합체를 형성하며, 이러한 효소 복합체는 인자 X 폴리펩타이드로부터 인자 Xa 폴리펩타이드로의 전환을 촉매화할 수 있다. 인자 Xa 폴리펩타이드의 활성은 발색 기질(예를 들어 SXa-11)의 절단을 촉매화하여, pNA를 생성할 수 있다. 생산된 pNA의 수준은 405 nm에서 발색을 결정함으로써 측정(예를 들어 흡광도에 의해 측정)될 수 있다. 인자 X 폴리펩타이드, 그리고 따라서 인자 Xa 폴리펩타이드는 과량으로 제공된다. 따라서, 제한 인자는 인자 VIIIa 폴리펩타이드이다. 그러므로, 생산된 pNA의 수준은 시료 내 인자 FVIIIa 폴리펩타이드에 의해 생산되는 인자 Xa 폴리펩타이드의 양에 비례하며, 이는 시료 내 인자 FVIIIa 폴리펩타이드의 활성에 비례한다. 시료 내 인자 FVIIIa 폴리펩타이드의 활성은 시료 내 인자 FVIII 폴리펩타이드의 보조인자 활성의 측정치(measure)이다.
예를 들어, 적합한 발색 검정은 실시예에 사용된 바와 같이 HYPHEN BioMed에 의해 제작된 BIOPHEN FVIII:C 검정(Ref: 221406)이다. 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성은 BIOPHEN FVIII:C 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 더 특히, 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성은 실시예에서 아래 기재된 프로토콜에 따라 BIOPHEN FVIII:C 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
본 출원의 목적을 위해, 용어 "고유 활성도"는, 활성이 시료 내 인자 VIII 폴리펩타이드의 양 또는 농도를 고려하도록 '정규화(normalised)'되게 하는 인자 VIII 폴리펩타이드의 단위당(예를 들어 정상 인간 혈장에서 μg당, IU당, 또는 수준의 %로서의 항원 수준당) 활성(예를 들어 응고 활성 또는 내재적인(intrinsic) 효소 활성)을 지칭한다(전형적으로, 풀링된(pooled) 건강한 인간 혈장은 0.2 μg/ml의 인자 VIII 농도를 가짐을 주목함). 이는, 시료 내 인자 VIII 폴리펩타이드의 농도를 예를 들어 표준 ELISA 검정, 예컨대 실시예 1에 기재된 검정을 사용하여 측정하고, 활성을 인자 VIII 농도로 나눔으로써 수행될 수 있다. 발색 검정은 "고유 활성도"를 측정하는 데 사용될 수 있다. 발색 검정은 시료 내 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성을 계산하고 농도로 나눔으로써 "고유 활성도"를 측정하는 데 사용될 수 있다. 발색 검정은 본원에 기재된 발색 검정 중 임의의 하나일 수 있다.
ELISA 검정의 일례에서, 인자 VIII 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 플레이트에 결합될 수 있을 것이다. 미지의 농도의 인자 VIII 폴리펩타이드를 포함하는 시료는 플레이트에 걸쳐 통과될 수 있을 것이다. 인자 VIII 폴리펩타이드에 결합하는 제2 검출 항체가 플레이트에 적용되고, 임의의 과량은 씻겨 나갈 수 있을 것이다. 잔존하는(즉, 씻겨 나가지 않는) 검출 항체는 인자 VIII 폴리펩타이드에 결합될 것이다. 검출 항체는 효소, 예컨대 겨자무 퍼옥사다제(horse radish peroxidase)에 연결될 수 있을 것이다. 플레이트 상의 인자 VIII 폴리펩타이드에 결합하는 검출 항체의 수준은 검출 항체의 양을 측정함으로써 측정될 수 있을 것이다. 예를 들어, 검출 항체가 겨자무 퍼옥시다제에 연결된다면, 겨자무 퍼옥시다제는 기질, 예컨대 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)로부터 청색 반응 생성물의 생성을 촉매화할 수 있고, 청색 생성물의 수준은 450 nm에서 흡광도에 의해 검출될 수 있다. 청색 생성물의 수준은 세척 단계 후에 잔존한 검출 항체의 양에 비례하며, 이는 시료 내 인자 VIII 폴리펩타이드의 양에 비례한다. 대안적으로, 예를 들어 정제된 단백질을 사용할 때, 인자 VIII 폴리펩타이드의 양 또는 농도는 분광광도적으로 결정될 수 있다.
소정의 구현예에서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 정제되고, 고유 활성도는 정제된 인자 VIII 폴리펩타이드 상에서 수행된 발색 검정에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도는, 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 입자를 생산하고, 마우스에게 상기 AAV 입자를 주사하고, 상기 마우스로부터의 혈장 내 고유 활성도를 발색 검정을 사용하여 검출함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도는, 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 발현하는 세포를 제공하고, 상기 세포로부터 인자 VIII 폴리펩타이드를 수확하고/하거나 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도를 발색 검정을 사용하여 측정함으로써 측정된다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드(예컨대 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드)의 고유 활성도보다 더 높은 고유 활성도를 가질 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 또는 적어도 5.5배 더 높은 고유 활성도를 가질 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도보다 1.2배 내지 5.5배, 또는 1.5배 내지 5배의 더 높은 고유 활성도를 가질 수 있다. 활성의 배수 변화를 지칭할 때, 용어 "~내지~"는 명시된 값을 포함한다. 그러므로, 예를 들어 "1.2배 내지 5.5배"는 1.2의 값 및 5.5의 값을 포함한다.
추가 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 A1/A3 도메인 계면, A2/A3 도메인 계면 또는 A1/C2 도메인 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 가질 수 있다.
기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 갖는 인자 VIII 폴리펩타이드는 시간 경과에 따라 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 비율의 이의 인자 VIII 활성을 보유한다. 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화되기 전 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 가질 수 있으며, 즉, 인자 VIII 폴리펩타이드는 이의 비활성 형태에서, 비활성 형태의 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 가질 수 있다. 다시 말해, 본 발명의 비활성 인자 VIII 폴리펩타이드는 비활성 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 가질 수 있다. 다시 말해, 본 발명의 활성 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 가질 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화 전 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 가질 수 있다. 활성화 전 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 갖는, 더 높은 비율의 인자 VIII 폴리펩타이드는 시간 경과에 따라 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 활성화될 수 있도록 유지될 수 있다. 활성화 전 인자 VIII 폴리펩타이드의 안정성은 시료 내 잔여 인자 VIII 활성을 시간 경과에 따라 측정함으로써 결정될 수 있다. 비활성화된 인자 VIII 폴리펩타이드를 함유하는 시료의 분취물은 적합한 시점에서 제거될 수 있고, 인자 VIII 폴리펩타이드 활성은 분취물에서 인자 VIII 폴리펩타이드를 활성화시키고, 본원에 기재된 바와 같은 2 단계 인자 X 발색 검정을 수행함으로써 결정될 수 있다. 그 후에, 주어진 시점에서의 활성은 시료의 초기 인자 VIII 활성과(즉, 초기 시점에서 인자 VIII 활성을 결정함으로써) 비교될 수 있고, 잔여 인자 VIII 활성은 초기 인자 VIII 활성의 백분율로서 계산될 수 있다. 그러므로, 일단 활성화되면, 활성화 전 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 갖는 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 잔여 활성을(즉, 초기 인자 VIII 폴리펩타이드 활성의 백분율로서) 가질 것이다.
선택적으로, 시료 내 비활성 인자 VIII 폴리펩타이드의 잔여 활성은 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 45분 또는 60분의 경과에 걸쳐, 또는 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간 또는 24시간의 경과에 걸쳐, 또는 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일의 경과에 걸쳐 측정될 수 있다. 시료의 분취물은 초기 시점에서 시료의 분취물을 얻는 것에 더하여 일련의 시점, 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 시점에서 얻어질 수 있고, 각각의 분취물 내 인자 VIII 활성이 결정될 수 있다. 각각의 시점에서의 인자 VIII 활성을 초기 시점에서의 인자 VIII 활성과 비교하는 것은 잔여 인자 VIII 활성이 결정되게 한다. 선택적으로, 고유 활성도는 각각의 시점에서 결정될 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 가질 수 있다. 활성화될 때의 기준 FVIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 갖는 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화 후 시간 경과에 걸쳐 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 비율의 이의 인자 VIII 활성을 보유할 수 있다. 활성화 후 인자 VIII 폴리펩타이드의 안정성은 즉, FVIIIa 활성 붕괴(decay) 검정에서 시료 내 인자 VIII 폴리펩타이드 활성을 시간 경과에 걸쳐 측정함으로써 결정될 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 23℃에서 1분 동안 트롬빈을 사용하여 활성화되고, 히루딘(hirudin)을 사용하여 즉시 켄칭되어, 트롬빈을 비활성화시킬 수 있다. 분취물은 적합한 시점에서 제거될 수 있고, 활성은 인자 X 발색 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
선택적으로, 시료 내 활성 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성은 활성화 후 5분, 10분, 15분, 20분, 25분 또는 30분의 경과에 걸쳐 측정될 수 있다. 활성은 활성화 후(예를 들어 활성화 직후) 시료 내 인자 VIII의 활성을 결정하는 것에 더하여, 활성화 후 일련의 시점, 예를 들어 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 시점에서 결정될 수 있다. 대표적인 예로서, 시료 내 인자 VIII의 활성은 활성화 직후 결정될 수 있고, 추가 측정은 20분의 활성화 이내에 일련의 최대 6개 시점에서 수행될 수 있다. 선택적으로, 고유 활성도는 각각의 시점에서 결정될 수 있다.
기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 갖는 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 긴 반감기를 가질 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화 전 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 긴 반감기를 갖는다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 기준 인자 VIII보다 더 긴 반감기를 갖는다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드의 반감기의 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배 또는 적어도 3배인 반감기를 갖는다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 기준 인자 VIII 폴리펩타이드의 반감기의 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배 또는 적어도 3배인, 활성화될 때의 반감기를 갖는다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 기준 인자 VIII 폴리펩타이드의 반감기의 1.1배 내지 3배, 1.2배 내지 3배, 1.5배 내지 3배, 1.7 내지 3배, 1.8배 내지 3배, 2배 내지 3배, 2.2배 내지 3배, 2.5배 내지 3배, 또는 2.8배 내지 3배의 활성화될 때의 반감기를 갖는다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 액체에서(즉, 용액으로 있을 때) 더 높은 안정성을 가질 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 액체에서 더 긴 반감기를 갖는다. 선택적으로, 액체는 조건화된 배지, 예컨대 인자 VIII 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포가 배양되는 조건화된 배지이다. 선택적으로, 액체는 생물학적 시료이다. 생물학적 시료는 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 혈장에서 더 높은 안정성을 가질 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 혈장에서 더 긴 반감기를 가질 수 있다.
더 추가의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 A1/A3 도메인 계면, A2/A3 도메인 계면 또는 A1/C2 도메인 계면에 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 치환을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배 또는 적어도 5배 더 높게 발현될 수 있다. 선택적으로, 치환을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 1.1배 내지 5배, 1.2배 내지 5배, 1.5배 내지 5배, 1.8배 내지 5배, 2배 내지 5배, 2.5배 내지 5배, 3배 내지 5배, 3.5배 내지 5배, 4배 내지 5배 또는 4.5배 내지 5배 더 높게 발현될 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에 의해 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 분비된다.
인자 VIII 폴리펩타이드의 발현 수준(따라서 인자 VIII 폴리펩타이드가 숙주 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현되는지의 여부)은 전형적으로, 시료 내 인자 VIII 폴리펩타이드의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 숙주 세포에서의 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드의 발현 수준은 숙주 세포에서의 기준 인자 VIII 폴리펩타이드의 발현 수준과 비교될 수 있다. 이는 정량적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 인자 VIII 폴리펩타이드의 발현 수준은 상기 기재된 바와 같은 ELISA 검정에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드의 발현 수준은 반전량적으로(semi-quantitatively), 예를 들어, SDS-PAGE 전기영동에 의해 또는 웨스턴 블롯에 의해 결정될 수 있다. 소정의 구현예에서, 혈장에서의 발현은 실시예에 기재된 바와 같이 아쎄라크롬(Asserachrom) 검정에 의해 결정될 수 있다.
숙주 세포에 의해 분비되는 인자 VIII 폴리펩타이드의 발현 수준은 전형적으로, 즉, 숙주 세포에 의해 세포내에서 보유되는 인자 VIII 폴리펩타이드의 수준과 대조적으로 결정된다. 이는 예를 들어, 세포(예를 들어 숙주 세포)를 인자 VIII 폴리펩타이드를 함유하는 액체(예를 들어 생물학적 시료, 예컨대 혈액, 혈청 또는 혈장, 또는 인자 VIII 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포가 배양되는 배양 배지, 예컨대 조건화된 배지)로부터 분리하고, 상기 액체 내 인자 VIII 폴리펩타이드의 발현 수준을 결정함으로써 결정될 수 있다. 세포는 예를 들어, 원심분리 또는 여과에 의해 분리될 수 있고/있거나 액체는 세포로부터 경사분리(decant)(예를 들어 피펫팅에 의해)될 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드의 발현 수준은 생물학적 시료, 예컨대 혈액, 혈청 또는 혈장에서 결정될 수 있거나, 인자 VIII 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포가 배양되는 배양 배지, 예컨대 조건화된 배지에서 결정될 수 있다.
숙주 세포는 인자 VIII 폴리펩타이드(또는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드)를 발현하는 진핵생물 숙주 세포일 수 있다. 선택적으로, 숙주 세포는 인자 VIII 폴리펩타이드를 발현하는 곤충 세포일 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 인자 VIII 폴리펩타이드를 발현하는 포유류 숙주 세포일 수 있다. 포유류 숙주 세포는 인간, 개, 돼지, 마우스, 햄스터, 또는 기니피그 세포를 포함한다. 더 특히, 숙주 세포는 포유류 간 세포일 수 있고, 더 특히 인간 간 세포일 수 있다. 선택적으로, 숙주 세포는 Huh7 세포일 수 있다. 선택적으로, 숙주 세포는 유기체 내의 숙주 세포일 수 있다. 선택적으로, 발현은 생체 내 발현일 수 있다. 선택적으로, 발현은 생체 내 발현일 수 있고, 혈장 내 발현이 결정될 수 있다.
본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 고유 활성도 및/또는 안정성을 가질 수 있고/있거나 숙주 세포에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 선택적으로, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드는 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드일 수 있으며, 즉, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드일 수 있다. "기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드"는 임의의 야생형 인자 FVIII 폴리펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 인자 VIII 폴리펩타이드일 수 있다. 선택적으로, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드는 베타 도메인 결실(deleted) 인자 VIII 폴리펩타이드이다. 선택적으로, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5로 표시된 아미노산 서열을 갖는다. 선택적으로, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드는 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드의 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하지만, 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하지 않는다.
하나 이상의 치환 돌연변이는 도메인간 계면에서 더 소수성 아미노산으로의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 생물물리학적 연구는 20개의 천연 발생 아미노산의 소수성, 또는 더 특히 아미노산의 상대 소수성을 확립하기 위해 수행되어 왔고, 소수성 스케일은 각각의 아미노산의 소수성(hydropathy)을 나열한다. 하나의 이러한 예는 윔리-화이트 전체-잔기 소수성 스케일이며, 이는 수성상으로부터 비-수성상(옥타놀)으로의 아미노산 이전의 자유 에너지를 계산한다. 용어 "더 소수성 아미노산"은, 윔리-화이트 소수성 스케일에 따라 수성상으로부터 옥타놀로의 전이에 대해 더 선호할 만한(더 음성의 △G) 자유 에너지 값을 갖는 아미노산을 지칭한다. 수성상으로부터 옥타놀로의 전이에 대한 자유 에너지는 아래 표 2에 제시되어 있고, 도 1에 그래프로 도시되어 있다. 가장 소수성인 아미노산으로 출발하여, 윔리-화이트 소수성 스케일은 아미노산의 소수성을 하기 순서대로 나열한다: 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 티로신, 메티오닌, 발린, 시스테인, 글루탐산(비하전됨), 히스티딘(비하전됨), 프롤린, 트레오닌, 아스파르트산(비하전됨), 세린, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 글리신, 아르기닌(양으로 하전됨), 히스티딘(양으로 하전됨), 리신(양으로 하전됨), 글루탐산(음으로 하전됨), 아스파르트산(음으로 하전됨).
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본 발명의 치환 돌연변이는 인자 VIII 폴리펩타이드의 2개 이상의 도메인 사이의 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, 도메인간 계면에서의 하나 이상의 치환 돌연변이는 인자 VIII 폴리펩타이드의 각각의 도메인 사이의 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 특히, A1/A3 도메인간 계면에서의 하나 이상의 치환 돌연변이는 A1 도메인과 A3 도메인의 상호작용을 안정화시킬 수 있으며, A2/A3 도메인간 계면에서의 하나 이상의 치환 돌연변이는 A2 도메인과 A3 도메인의 상호작용을 안정화시킬 수 있고, A1/C2 도메인간 계면에서의 하나 이상의 치환 돌연변이는 A1 도메인과 C2 도메인의 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 하나 이상의 치환 돌연변이는 활성화될 때 인자 VIII 폴리펩타이드의 각각의 도메인의 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 하나 이상의 치환 돌연변이는 활성화될 때 인자 VIII 폴리펩타이드의 A1 도메인과 A3 도메인, A2 도메인과 A3 도메인, 및/또는 A1 도메인과 C2 도메인(즉, 각각의 도메인)의 상호작용을 안정화시킬 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 하나 이상의 치환 돌연변이는 활성화된 인자 VIII 헤테로삼량체성 복합체의 A1 도메인, A2 도메인, 및 A3-C1-C2 도메인의 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 활성화된 인자 VIII 헤테로삼량체성 복합체의 A2 도메인과 A1 도메인 및 A3-C1-C2 도메인의 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 활성화된 인자 VIII 헤테로삼량체성 복합체의 A1 도메인 및 A3-C1-C2 도메인으로부터 A2 도메인의 해리를 방지하거나 지연시킬 수 있다.
인자 VIII의 A1 도메인, A2 도메인, 및 A3-C1-C2 도메인의 상호작용은 표면 플라즈몬 공명(SPR, 또는 Biacore)에 의해 결정될 수 있다. 상이한 성분은 별개로 단리될 수 있고, 도메인 중 하나는 SPR 칩의 표면 상에 고정될 수 있으며; 고정 후, 다른 도메인이 유동 세포 내로 주입될 수 있고, 도메인의 상호작용에 대한 결합 및 해리 동역학(kon 및 koff)이 시간 경과에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 대안적으로, 비활성 인자 VIII이 SPR 칩 상에 고정될 수 있고, 트롬빈이 유동 세포 내로 주입되어, 인자 VIII을 활성화시킬 수 있으며; 인자 VIII 헤테로삼량체성 복합체의 각각의 성분의 해리(질량 소실)(koff)를 나타내는 신호 하락이 시간 경과에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 어떤 수단에 의해서든, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드(예를 들어 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드)와의 비교는 도메인의 상호작용의 안정성이 결정되게 한다. FVIIIa의 안정성을 결정하기 위한 표면 플라즈몬 공명의 사용은 문헌[Gale et al. 2006. Journal of Thrombosis and Haemostasis 4, 1315-1322]에 기재되어 있다.
폴리펩타이드 내의 도메인간 상호작용은 전형적으로, 각각의 도메인 각각에서 아미노산 측쇄 사이의 상호작용에 의해 매개된다. 각각의 도메인에서 아미노산 측쇄 사이의 상호작용은 비-공유 상호작용일 수 있다. 대안적으로, 각각의 도메인 내 아미노산 측쇄는 공유 결합(예를 들어 이황화 결합)을 형성할 수 있다. 따라서, 인자 VIII 폴리펩타이드의 도메인 사이의 상호작용은, 인자 VIII 폴리펩타이드의 각각의 도메인(예를 들어 A1 및 A3, A2 및 A3 또는 A1 및 C2 도메인)의 상호작용을 안정화시키는 아미노산 치환(들)(치환 돌연변이)에 의해(즉, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여) 안정화될 수 있다.
방향족 아미노산 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘 및 트립토판의 측쇄는 파이-적층(pi-stacking) 상호작용에 의해 서로 상호작용할 수 있다. 파이-적층 상호작용에서, 방향족 측쇄 쌍은 전형적으로, 이들의 각각의 방향족 고리를 중심밖(off-centred) 평행 배향으로 정렬시킬 수 있다. 대안적으로, 방향족 측쇄 쌍은 이들의 각각의 방향족 고리를 서로에 대해 T-형상의 수직인 배향으로 정렬시킬 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는, 각각의 도메인의 아미노산 측쇄 사이의 파이-적층 상호작용을 증가시키는 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
소수성 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신 및 메티오닌의 측쇄는 전형적으로, 단백질의 소수성 코어 내에서 함께 클러스터(cluster)한다. 물에 노출되는 소수성 측쇄의 수를 최소화하는 것은 단백질 접힘(folding)의 배후에 있는 근본적인 구동력이고, 소수성 패킹(packing)은 단백질 구조를 안정화시키는 데 기여한다. 대조적으로, 하전된 그리고 극성 아미노산의 측쇄는 단백질의 물-노출 표면 상에 놓여서, 이들은 주변의 물 분자와 상호작용한다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는, 각각의 도메인의 아미노산 측쇄 사이의 소수성 패킹을 증가시키는(즉, 지방족/소수성 아미노산의 측쇄가 서로 상호작용하고 물을 더 효율적으로 배제하는 더 소수성 환경을 제공하는) 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 소수성 아미노산으로의 극성 아미노산 또는 하전된 아미노산의 치환을 도메인간 계면에 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신 또는 메티오닌으로의 극성 아미노산 또는 하전된 아미노산의 치환을 도메인간 계면에 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 소수성 아미노산의 치환을 도메인간 계면에 포함한다.
각각의 도메인 내 아미노산 측쇄는 서로에 대한 각각의 도메인의 배향으로 인해 선호하지 않는 방식으로 서로 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 측쇄는 서로에 대한 각각의 도메인의 배향으로 인해 에너지적으로 선호하지 않는 입체배좌를 채택하도록 강제될 수 있다(입체 충돌(steric clashing)). 대안적으로, 아미노산 측쇄는 다른 도메인 내의 유사하게 하전된 아미노산 측쇄에 근접하게 위치할 수 있다(선호하지 않는 정전기 상호작용).
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 각각의 도메인의 아미노산 측쇄 사이의 선호하지 않는 상호작용을 무력화할 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 각각의 도메인의 아미노산 측쇄 사이의 입체 충돌을 감소시킬 수 있다. 선택적으로, 입체 충돌을 감소시키기 위한 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 작은 아미노산으로의 큰 소수성 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 이소류신, 류신, 발린, 알라닌 또는 글리신으로의 큰 소수성 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 선택적으로, 큰 소수성 아미노산은 방향족 아미노산이다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 각각의 도메인의 아미노산 측쇄 사이의 선호하지 않는 정전기 상호작용을 감소시킬 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 양으로 하전된 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 음으로 하전된 아미노산으로의 양으로 하전된 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 선택적으로, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 또는 글루탐산이다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 음으로 하전된 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 양으로 하전된 아미노산으로의 음으로 하전된 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 선택적으로, 양으로 하전된 아미노산은 아르기닌 또는 리신이다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 비하전된 아미노산으로의 하전된 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 선택적으로, 비하전된 아미노산은 극성 아미노산일 수 있다. 선택적으로, 비하전된 아미노산은 아스파라긴 또는 글루타민일 수 있다. 선택적으로, 비하전된 아미노산은 세린 또는 트레오닌일 수 있다. 선택적으로, 비하전된 아미노산은 발린, 이소류신, 류신, 알라닌 또는 글리신일 수 있다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 도메인간 계면에 하나 이상의 표면-접근 불능(surface-inaccessible) 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 인자 VIII의 3-차원 결정 구조는 이용 가능하고(예를 들어, PDB 기탁 번호 2RZE 또는 4BDV); 따라서, 표면-접근 불능인 도메인간 계면에서 아미노산을 식별하는 것이 일상적일 것이다. 선택적으로, 표면-접근 불능 아미노산은 활성화될 때 인자 VIII 폴리펩타이드에서 표면-접근 불능이다.
본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드는 A1/A3 계면, A2/A3 계면, 또는 A1/C2 계면으로부터 선택되는 도메인간 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 치환되는 아미노산은 메티오닌 또는 히스티딘이다. 이들 도메인간 계면에서의 메티오닌 또는 히스티딘 잔기는 예를 들어, 인자 VIII의 3-차원 결정 구조로부터 식별될 수 있다. 선택적으로, 메티오닌 또는 히스티딘은 더 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 선택적으로, 메티오닌 잔기는 티로신, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환될 수 있다. 선택적으로, 히스티딘 잔기는 글루탐산, 시스테인, 발린, 메티오닌, 티로신, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환될 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열은 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함할 수 있으며, 여기서 치환되는 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 위치 662의 아미노산에 상응하는 메티오닌 잔기(M662), 또는 SEQ ID NO: 1의 위치 693의 아미노산에 상응하는 히스티딘 잔기(H693)이다. 선택적으로, M662는 알라닌, 시스테인, 글루탐산, 글리신 또는 세린으로 치환될 수 있다. 선택적으로, H693은 아르기닌으로 치환될 수 있다. 선택적으로, M662 또는 H693은 더 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 선택적으로, M662는 티로신, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환될 수 있다. 선택적으로, H693은 글루탐산, 시스테인, 발린, 메티오닌, 티로신, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환될 수 있다.
SEQ ID NO: 1의 특정 아미노산"에 상응하는" 잔기를 결정하는 것은 당업자의 역량 내에 있다. 예를 들어, 당업자는 단지, 적합한 정렬 알고리즘, 예컨대 상기 기재된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘을 사용하여 야생형 인자 VIII 아미노산 서열과 SEQ ID NO: 1의 서열 정렬을 수행하고, 어떤 잔기가 SEQ ID NO: 1의 아미노산과 정렬되는지 결정하는 것을 필요로 할 뿐이다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 도메인간 계면에서의 아미노산을 방향족 아미노산으로 치환시키는 것을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 페닐알라닌, 티로신, 히스티딘 또는 트립토판으로의 도메인간 계면에서의 아미노산의 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로의 도메인간 계면에서의 메티오닌 잔기의 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로의 도메인간 계면에서의 히스티딘 잔기의 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662F, M662W 또는 M662Y 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 H693F, H693W 또는 H693Y 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662W 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 H693W 또는 H693Y 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 H693W 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662W 및 H693W 치환을 포함한다.
그러므로, 특정 구현예에서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662W 치환을 포함한다. 추가 구현예에서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 치환 돌연변이는 H693W 치환을 포함한다. 더 추가의 구현예에서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662W 및 H693W 치환을 포함한다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28, 30, 35, 36, 40 또는 41 중 임의의 하나로 표시된 바와 같은 인자 VIII 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 28, 30, 35, 36, 40 또는 41 중 임의의 하나로 표시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 덜 소수성 아미노산으로의 M662의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662I를 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662C를 포함하지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662K를 포함하지 않는다. 선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1의 위치 1828에 상응하는 위치에 아스파르트산 잔기(D1828)를 포함한다면, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662K를 포함하지 않는다. 선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1의 위치 1823-1834에 상응하는 위치에 서열 MAPTKDEFDCKA를 포함한다면, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662K를 포함하지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 A108의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 A108의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환은 A108I를 포함하지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 음으로 하전된 아미노산의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 비하전된 아미노산으로의 음으로 하전된 아미노산의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 D27, E272, E287, D302, D519, E540, E665, D666, E683, D696, D1795, E1829, E1984의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 비하전된 아미노산으로의 D27, E272, E287, D302, D519, E540, E665, D666, E683, D696, D1795, E1829, E1984의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 알라닌 또는 발린으로의 D27, E272, E287, D302, D519, E540, E665, D666, E683, D696, D1795, E1829, E1984의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 D519L, D519Q, D519T 또는 D519V를 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 D519, E665 및 E1984 중 2개 이상의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 알라닌 또는 발린으로의 D519, E665 및 E1984 중 2개 이상의 치환을 포함하지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 양으로-하전된 아미노산의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 비하전된 아미노산으로의 양으로-하전된 아미노산의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 K380, R490, K512, K523, R527, K556, R562, K570 또는 R571의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 비하전된 아미노산으로의 K380, R490, K512, K523, R527, K556, R562, K570 또는 R571의 치환을 포함하지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 S313, H317, T522, S524, R531, N538, S650, S654, N684, S695, S1791, Q1820, S1949, N1950 또는 R1966의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 알라닌으로의 S313, H317, T522, S524, R531, N538, S650, S654, N684, S695, S1791, Q1820, S1949, N1950 또는 R1966의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 Y476, Y664, Y1786 또는 Y1792의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 페닐알라닌으로의 Y476, Y664, Y1786 또는 Y1792의 치환을 포함하지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 K659의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 K659의 비-보존적 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 K659D, K659E, K659Y, K659N, K659Q, K659T, K659S, K659C, K659W, K659F, K659P, K659M, K659V, K659L, K659I, K659Y, K659G 또는 K659A를 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 E665의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 E665의 비-보존적 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 E665V, E665I, E665M, E665N 또는 E665Y를 포함하지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 K659의 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 K659Q, K659G, K659I 또는 K659F를 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 E665의 치환을 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 E665R, E665Q, E665H, E665K, E665M, E665F, E665W 또는 E665Y를 포함한다.
소정의 구현예에서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 A1/A3 도메인 계면, A2/A3 도메인 계면 또는 A1/C2 도메인 계면으로부터 선택되는 도메인간 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 치환 돌연변이 중 적어도 하나는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함한다. 다시 말해, 적어도 하나 이상의 치환 돌연변이는 제1 도메인(예를 들어 A1 또는 A2 도메인) 내 시스테인 잔기의 치환, 및 제2 도메인(예를 들어 A3 또는 C2 도메인) 내 시스테인 잔기의 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 아미노산의 쌍은 제1 아미노산(제1 도메인 내) 및 제2 아미노산(제2 도메인 내)을 포함할 수 있다. 다시 말해, 적어도 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 제1 아미노산(제1 도메인 내), 및 제2 아미노산(제2 도메인 내)의 치환을 포함할 수 있다. 그러므로, 인자 VIII 폴리펩타이드는, 시스테인 잔기로의 인자 VIII 폴리펩타이드의 2개의 각각의 도메인 내 코그니트(cognate) 아미노산의 쌍의 치환을 포함하는 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로, 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환은 시스테인 잔기가 각각의 도메인 사이에 이황화 결합을 형성하게 한다. 이황화 결합의 형성은 질량 분광법에 의해, 특히 예를 들어 문헌[Gorman et al. 2002. Mass Spectrometry Reviews 21, 183-216]에 상술된 바와 같이 선택적으로 제한된 단백분해 후에, 이황화 결합을 함유하는 것으로 의심되는 폴리펩타이드의 단편화 패턴의 분석에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 이황화 결합의 형성은 폴리펩타이드 상에서 제한된 단백분해를 수행하고, 생성된 단백질 단편을 환원 조건과 비-환원 조건 둘 다 하에, 선택적으로 N-말단 시퀀싱과 조합하여 SDS-PAGE에 의해 분석함으로써 결정될 수 있다.
선택적으로, 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산의 쌍은 A1 및 A3 도메인에 존재할 수 있다. 선택적으로, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 M147, S149 또는 S289에 상응할 수 있고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 E1969, E1970 또는 N1977에 상응할 수 있다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 (i) S289C와 N1977C, (ii) M147C와 E1970C, 및 (iii) S149C와 E1969C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함한다.
선택적으로, 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산의 쌍은 A2 및 A3 도메인에 존재할 수 있다. 선택적으로, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 T667, T669, N684, L687, I689, S695 또는 F697에 상응하고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 S1791, G1799, A1800, R1803, E1844, S1949, G1981, V1982, 또는 Y1979에 상응한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 (i) T669C와 V1982C, (ii) L687C와 A1800C, (iii) I689C와 G1799C, (iv) F697C와 S1949C, (v) T667C와 G1981C, (vi) T669C와 Y1979C, (vii) N684C와 S1791C, (viii) L687C와 R1803C, 및 (ix) S695C와 E1844C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함한다.
선택적으로, 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산의 쌍은 A1 및 C2 도메인에 존재할 수 있다. 선택적으로, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 A108, T118 또는 V137에 상응하고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 N2172, Q2329 또는 Y2332에 상응한다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 (i) A108C와 Q2329C, (ii) T118C와 N2172C, 및 (iii) V137C와 Y2332C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함한다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 SEQ ID NO: 1의 위치 656-667에 상응하는 아미노산(YTFKHKMVYEDT) 중 임의의 하나의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 SEQ ID NO: 1의 위치 1823-1834에 상응하는 아미노산(MAPTKDEFDCKA) 중 임의의 하나의 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 SEQ ID NO: 1의 위치 656-667에 상응하는 아미노산(YTFKHKMVYEDT) 중 임의의 하나의 치환을 포함하는 제1 치환 돌연변이 및 시스테인 잔기로의 SEQ ID NO: 1의 위치 1823-1834에 상응하는 아미노산(MAPTKDEFDCKA) 중 임의의 하나의 치환을 포함하는 제2 치환 돌연변이를 포함하지 않는다.
선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 Y656C와 A1834C, T657C와 K1833C, K659C와 D1831C, H660C와 F1830C, K662C와 E1829C, M662C와 D1828C, V663C와 K1827C, Y664C와 T1826C, E665C와 P1825C, D666C와 A1824C, 및 T667C와 M1823C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662C와 D1828C, 및 Y664C와 T1826C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 R121C 및 L2302C 치환을 포함하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662C와 D1828C, S268C와 F673C, I312C와 P672C, S313C와 A644C, M662C와 K1827C, Y664C와 T1826C, P264C와 Q645C, R282C와 T522C, S285C와 F673C, H311C와 F673C, S314C와 A644C, S314C와 Q645C, V663C와 E1829C, N694C와 P1980C, 및 S695C와 E1844C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 치환은 (i) L687C와 A1800C; (ii) N684C와 S1791C; 및 (iii) S695C와 E1844C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 37, 38, 39, 42, 43 또는 44 중 임의의 하나로 표시된 바와 같은 인자 VIII 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 37, 38, 39, 42, 43 또는 44 중 임의의 하나로 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상술된 바와 같이, 인자 VIII의 활성화는 트롬빈에 의한 단백분해성 절단을 필요로 한다. 트롬빈 절단 후, 인자 VIII은 A1 도메인, A2 도메인, 및 A3-C1-C2 도메인으로 구성된 헤테로삼량체성 복합체를 형성한다. 활성화의 과정에서, 인자 VIII은 입체배좌 변화를 겪는다. 더 구체적으로, 활성화의 과정에서, A1 도메인 및 A3-C1-C2 도메인과 비교하여 A2 도메인의 배향은 변경된다. 그러므로, 활성화된 인자 VIII의 A2 도메인은 A1, A3, C1 및 C2 도메인에 관하여 비활성 인자 VIII과 상이한 배향에 존재한다. 따라서, A2 도메인은 활성화 과정 동안 인자 VIII의 다른 도메인에 관하여 중심축(pivot)인 것으로 나타날 수 있다. 야생형 인자 VIII의 최대 활성은 전형적으로 활성화 후 대략 2분째에 나타난다.
이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, A2 도메인에 의해 겪는 입체배좌 변화는 인자 VIII 활성화에 필요할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 비활성 인자 VIII의 배향에서 입체배좌 A2 도메인을 안정화시키는 치환 돌연변이는 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성화를 저해할 수 있다. 소정의 구현예에서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성화를 저해하지 않는다. 선택적으로, 하나 이상의 치환 돌연변이는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성화와 비교하여 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성화를 저해하지 않는다. 선택적으로, A1/A3, A2/A3 또는 A1/C2 도메인 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 느리게 활성화되지 않는다.
인자 VIII 활성화의 저해는 활성화 후 최대 인자 VIII 활성을 달성하는 데 소요된 시간을 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교함으로써 결정될 수 있다. 트롬빈은 인자 VIII 폴리펩타이드를 함유하는 시료에 첨가될 수 있고, 인자 VIII 활성화는 적합한 시점에서 시료의 분취물을 얻고 각각의 분취물에 대해 FVIII 활성을 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 선택적으로 FVIII 활성은 활성화 후 5분, 10분, 15분 또는 20분의 경과에 걸쳐 측정될 수 있다. 활성은 일련의 시점에서, 예를 들어 활성화 후 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 시점에서 결정될 수 있다. 선택적으로 인자 VIII 활성은 활성화 직전에 결정될 수 있다. 대표적인 예로서, 인자 VIII 활성은 활성화 직후 결정될 수 있고, 추가 측정은 활성화 후 30초마다 수행될 수 있다. 선택적으로, 상대 인자 VIII 활성은 활성화 직후 인자 VIII 활성과 비교하여, 주어진 시점에서 인자 VIII 활성의 배수-증가를 계산함으로써 결정될 수 있다. 선택적으로, 고유 활성도는 각각의 시점에서 결정될 수 있다.
하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드
인자 VIII 아미노산 서열은 신호 펩타이드, 예컨대 본원에 기재된 것들 중 임의의 것의 모두 또는 부분을 포함할 수 있다. 선택적으로, 신호 펩타이드는 야생형 인자 VIII 신호 펩타이드일 수 있다. 선택적으로, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 15를 포함할 수 있다. 선택적으로, 신호 펩타이드는 야생형 인자 VIII 신호 펩타이드 이외의 신호 펩타이드일 수 있다. 선택적으로, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 18 또는 20을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 성숙(mature) 인자 VIII 폴리펩타이드일 수 있다. "성숙 인자 VIII 폴리펩타이드"는 신호 펩타이드를 포함하지 않는 인자 VIII 폴리펩타이드이다. 신호 펩타이드는 합성 후 절단되었을 수 있다. 신호 펩타이드는 결코 존재하지 않았을 수 있다. 예를 들어, 인자 VIII 아미노산 서열은 신호 펩타이드를 결코 포함하지 않았을 수 있다.
야생형 인자 VIII 폴리펩타이드는 A1 도메인, A2 도메인, B 도메인, A3 도메인, C1 도메인 및 C2 도메인을 포함한다. 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드는 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, B 도메인, C1 도메인 및/또는 C2 도메인 각각의 모두 또는 부분을 포함할 수 있다. 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드의 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되어 있다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 개(canine), 돼지(porcine) 또는 인간 인자 VIII이다. 특정 구현예에서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 인간 인자 VIII이다. 인간 인자 VIII의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다시 말해, 인자 VIII 폴리펩타이드는 선택적으로, SEQ ID NO: 1 내의 상응하는 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 단지 하나 이상의 치환 돌연변이만큼 SEQ ID NO: 1로 표시된 아미노산 서열과 상이한 인자 VIII 아미노산을 포함할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드의 인자 VIII 아미노산 서열에 상응하는 SEQ ID NO: 1 내의 서열을 결정하는 것은 당업자의 역량 내에 있다. 예를 들어, 당업자는 단지, 적합한 정렬 알고리즘, 예컨대 상기 기재된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘을 사용하여 인자 VIII 아미노산 서열과 SEQ ID NO: 1의 서열 정렬을 수행하고, SEQ ID NO: 1의 어떤 영역이 인자 VIII 아미노산에 상응하는지(즉, SEQ ID NO: 1의 어떤 서열이 인자 VIII 아미노산 서열과 정렬되는지) 결정하는 것을 필요로 할 뿐이다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 적어도 1349개, 적어도 1357개, 적어도 1368개, 적어도 1376개, 적어도 1377개, 적어도 1385개, 적어도 1386개, 적어도 1391개, 적어도 1394개, 적어도 1418개 또는 적어도 1421개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 적어도 1349, 적어도 1357, 적어도 1368, 적어도 1376, 적어도 1377, 적어도 1385, 적어도 1386, 적어도 1391, 적어도 1394, 적어도 1418 또는 적어도 1421 인접(contiguous) 아미노산과 적어도 90% 동일할 수 있다. 대안적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 또는 최대 2개 영역으로부터 적어도 1349개, 적어도 1357개, 적어도 1368개, 적어도 1376개, 적어도 1377개, 적어도 1385개, 적어도 1386개, 적어도 1391개, 적어도 1394개, 적어도 1418개 또는 적어도 1421개 아미노산과 적어도 90% 동일할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 적어도 1349개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 치환 돌연변이만큼 상이한 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 적어도 1349개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 단지 하나 이상의 치환 돌연변이만큼 상이한 인자 VIII 아미노산을 포함할 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1로 표시된 아미노산 서열과 20개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 치환 돌연변이만큼 상이한 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1로 표시된 아미노산 서열과 단지 하나 이상의 치환 돌연변이만큼 상이한 인자 VIII 아미노산을 포함할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 B 도메인의 일부를 포함할 수 있거나, 인자 VIII 폴리펩타이드는 B 도메인을 포함하지 않을 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 인자 VIII 폴리펩타이드는 B 도메인을 포함하지 않는다. 따라서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 베타 도메인 결실(BDD: beta domain deleted) 인자 VIII 폴리펩타이드일 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5의 적어도 1349개, 적어도 1357개, 적어도 1368개, 적어도 1376개, 적어도 1377개, 적어도 1385개, 적어도 1386개, 적어도 1391개, 적어도 1394개, 적어도 1418개 또는 적어도 1421개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5의 적어도 1349개, 적어도 1357개, 적어도 1368개, 적어도 1376개, 적어도 1377개, 적어도 1385개, 적어도 1386개, 적어도 1391개, 적어도 1394개, 적어도 1418개 또는 적어도 1421개의 인접 아미노산과 적어도 90% 동일할 수 있다. 대안적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5의 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 또는 최대 2개 영역으로부터의 적어도 1349개, 적어도 1357개, 적어도 1368개, 적어도 1376개, 적어도 1377개, 적어도 1385개, 적어도 1386개, 적어도 1391개, 적어도 1394개, 적어도 1418개 또는 적어도 1421개 아미노산과 적어도 90% 동일할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5의 적어도 1349개, 적어도 1357개, 적어도 1368개, 적어도 1376개, 적어도 1377개, 적어도 1385개, 적어도 1386개, 적어도 1391개, 적어도 1394개, 적어도 1418개 또는 적어도 1421개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 치환 돌연변이만큼 상이한 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5의 적어도 1349개, 적어도 1357개, 적어도 1368개, 적어도 1376개, 적어도 1377개, 적어도 1385개, 적어도 1386개, 적어도 1391개, 적어도 1394개, 적어도 1418개 또는 적어도 1421개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 단지 하나 이상의 치환 돌연변이만큼 상이한 인자 VIII 아미노산을 포함할 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5로 표시된 아미노산 서열과 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 치환 돌연변이만큼 상이한 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 또는 5로 표시된 아미노산 서열과 단지 하나 이상의 치환 돌연변이만큼 상이한 인자 VIII 아미노산을 포함할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드의 도메인 중 임의의 또는 모든 도메인은, 도메인의 인자 VIII 아미노산 서열이 야생형 인자 VIII 아미노산 서열과 비교될 때, 본원에 정의된 하나 이상의 치환 돌연변이에 더하여 하나 이상의 변형, 예컨대 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 A1 도메인의 적어도 300개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A1 도메인의 적어도 300개 아미노산(선택적으로 적어도 300개의 인접 아미노산)과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A1 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A1 도메인과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 329에 상응하는 아미노산 중 적어도 300개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 329에 상응하는 아미노산 중 적어도 300개 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 329에 상응하는 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 329에 상응하는 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 A2 도메인의 적어도 300개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A2 도메인의 적어도 300개 아미노산(선택적으로 적어도 300개의 인접 아미노산)과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A2 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A2 도메인과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 380 내지 711에 상응하는 아미노산 중 적어도 300개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 380 내지 711에 상응하는 아미노산 중 적어도 300개 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 380 내지 711에 상응하는 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 380 내지 711에 상응하는 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 A3 도메인의 적어도 300개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A3 도메인의 적어도 300개 아미노산(선택적으로 적어도 300개의 인접 아미노산)과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A3 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 A3 도메인과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1694 내지 2021에 상응하는 아미노산 중 적어도 300개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1694 내지 2021에 상응하는 아미노산 중 적어도 300개 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1694 내지 2021에 상응하는 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1694 내지 2021에 상응하는 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 C1 도메인의 적어도 130개, 적어도 135개 또는 적어도 140개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 C1 도메인의 적어도 130개, 적어도 135개 또는 적어도 140개 아미노산(선택적으로 적어도 130개의 인접 아미노산)과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 C1 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 C1 도메인과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 2021 내지 2169에 상응하는 아미노산 중 적어도 130개, 적어도 135개 또는 적어도 140개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 2021 내지 2169에 상응하는 아미노산 중 적어도 130개, 적어도 135개 또는 적어도 140개 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 2021 내지 2169에 상응하는 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 2021 내지 2169에 상응하는 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드는 C2 도메인의 적어도 130개, 적어도 135개 또는 적어도 140개 아미노산(선택적으로 적어도 130개의 인접 아미노산)과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 C2 도메인의 적어도 130개, 적어도 135개 또는 적어도 140개 아미노산과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 C2 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 C2 도메인과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 2174 내지 2326에 상응하는 아미노산 중 적어도 130개, 적어도 135개 또는 적어도 140개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 2174 내지 2326에 상응하는 아미노산 중 적어도 130개, 적어도 135개 또는 적어도 140개 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 2174 내지 2326에 상응하는 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 2174 내지 2326에 상응하는 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 완전(full) 또는 부분(partial) B 도메인을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 B 도메인의 적어도 820개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 B 도메인의 적어도 820개 아미노산(선택적으로 적어도 820개의 인접 아미노산)과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 B 도메인과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 B 도메인과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 741 내지 1648에 상응하는 아미노산 중 적어도 800개 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 741 내지 1648에 상응하는 아미노산 중 적어도 800개 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 741 내지 1648에 상응하는 아미노산과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 741 내지 1648에 상응하는 아미노산과 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 변형된 베타 도메인 관련(BDR) 영역을 포함할 수 있다. 야생형 BDR 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 713과 1697 사이의 영역에 상응한다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 최대 88개의 아미노산을 포함하는 변형된 BDR 영역을 포함할 수 있다.
야생형 BDR 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 713과 1697 사이의 영역에 상응한다. 아미노산 위치를 지칭할 때, 용어 "~과 ~사이"는 명시된 위치를 포함하지 않는다. 그러므로, 야생형 BDR 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 714에 상응하는 위치에서 시작하고 SEQ ID NO: 1의 위치 1696에 상응하는 위치에서 끝난다. 야생형 BDR 영역은 인자 VIII의 베타 도메인을 포함한다. 야생형 BDR 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 713과 1697 사이의 영역일 수 있다. 야생형 BDR 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 714에서 시작할 수 있고 SEQ ID NO: 1의 위치 1696에서 끝날 수 있다. 야생형 BDR 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 713과 1697 사이의 영역에 상응하는 다른 야생형 인자 VIII 아미노산 서열로부터의 영역일 수 있다. 야생형 BDR 영역은 SEQ ID NO: 1의 위치 714에서 시작하고 SEQ ID NO: 1의 위치 1696에서 끝나는 영역에 상응하는 다른 야생형 인자 VIII 아미노산 서열로부터의 영역일 수 있다.
SEQ ID NO: 1의 위치 713과 1697 사이의 영역"에 상응하는" 야생형 인자 VIII 아미노산 서열의 영역을 결정하는 것은 당업자의 역량 내에 있다. 예를 들어, 당업자는 단지, 적합한 정렬 알고리즘, 예컨대 상기 기재된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘을 사용하여 야생형 인자 VIII 아미노산 서열과 SEQ ID NO: 1의 서열 정렬을 수행하고, 야생형 인자 VIII 아미노산 서열의 어떤 영역이 SEQ ID NO: 1의 위치 713과 1697 사이의 영역과 정렬되는지 결정하는 것을 필요로 할 뿐이다. 예를 들어, 당업자는 야생형 인자 VIII 아미노산 서열의 어떤 영역이 SEQ ID NO: 1의 위치 714 내지 1696과 정렬되는지 결정할 수 있다.
"변형된 BDR 영역"은 야생형 BDR 영역과 동일하지 않다. 변형된 BDR 영역은 야생형 BDR 영역보다 더 짧다. 당업자는, 인자 VIII 폴리펩타이드의 변형된 BDR 영역이 "야생형 BDR 영역과 비교하여 변형되는지"의 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 단지, 적합한 정렬 알고리즘, 예컨대 상기 기재된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘을 사용하여 인자 VIII 아미노산 서열과 인자 VIII 폴리펩타이드의 야생형 인자 VIII 아미노산 서열의 서열 정렬을 수행하고, SEQ ID NO: 1의 위치 713과 1697 사이의 영역에 상응하는 야생형 인자 VIII 아미노산 서열의 영역(야생형 BDR 영역)과 정렬되는 인자 VIII 아미노산 서열의 영역(변형된 BDR 영역)을 결정하고, 인자 VIII 아미노산 서열 내 영역(변형된 BDR 영역)과 야생형 인자 VIII 아미노산 서열 내 영역(야생형 BDR 영역) 사이의 아미노산 서열을 비교하는 것을 필요로 할 뿐이다. 임의의 차이가 존재한다면, 해당 영역은 변형된 BDR 영역이다.
본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드의 변형된 BDR 영역이 최대 88개의 아미노산을 포함하기 때문에, 인자 VIII 아미노산 서열이 야생형 인자 VIII 아미노산 서열과 정렬될 때 야생형 BDR 영역과 비교하여 변형된 BDR 영역 내 인자 VIII 아미노산 서열에 하나 이상의 갭(들)이 존재할 것이다. 그러므로, 변형된 BDR 영역이 야생형 BDR 영역과 비교될 때, 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드의 변형된 BDR 영역은 하나 이상의 결실(들)을 포함한다. 변형된 BDR 영역이 야생형 BDR 영역과 비교될 때, 변형된 BDR 영역은 또한, 하나 이상의 변형, 예컨대 치환 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 변형된 BDR 영역은 야생형 BDR 영역에서 발견되는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 BDR 영역은 야생형 BDR 영역에서 발견되는 아미노산의 하나 이상의 스트레치(stretch)를 포함할 수 있다.
변형된 BDR 영역은 "최대" 명시된 수의 아미노산을 "포함한다". 이는, 변형된 BDR 영역이 명시된 수 이하의 아미노산을 포함함을 의미한다. 인자 VIII 아미노산 서열은 추가 아미노산을 포함할 수 있지만, 변형된 BDR 영역에서는 아니다. 예를 들어, 변형된 BDR 영역이 "최대 88개의 아미노산을 포함한다"면, 변형된 BDR 영역은 88개 이하의 아미노산을 포함한다. 추가 예로서, 변형된 BDR 영역이 "최대 74개의 아미노산을 포함한다"면, 변형된 BDR 영역은 74개 이하의 아미노산을 포함한다.
"인자 VIII 폴리펩타이드"는 기능적이다. 기능적 인자 VIII 폴리펩타이드는, 트롬빈에 의해 활성화될 때, 인자 IXa, 인지질 및 칼슘과 효소 복합체를 형성하는 것이고, 상기 효소 복합체는 인자 X로부터 인자 Xa로의 전환을 촉매화할 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드가 기능적인지의 여부를 결정하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 당업자는 단지 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도를 결정하는 것을 필요로 한다. 폴리펩타이드의 고유 활성도가 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도의 적어도 20%라면, 이는 기능적이다. 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성은 발색 검정, 예컨대 보조인자 활성을 측정하는 발색 검정을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 적합한 발색 검정은 하기와 같다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 (인간 인자 X 폴리펩타이드 및 인자 IXa 폴리펩타이드, 트롬빈, 인지질 및 칼슘과 혼합된다). 트롬빈은 인자 VIII 폴리펩타이드를 활성화시켜, 인자 VIIIa 폴리펩타이드를 형성한다. 트롬빈-활성화된 인자 VIII 폴리펩타이드는 인자 IXa 폴리펩타이드, 인지질 및 칼슘과 효소 복합체를 형성하고, 이러한 효소 복합체는 인자 X 폴리펩타이드로부터 인자 Xa 폴리펩타이드로의 전환을 촉매화할 수 있다. 인자 Xa 폴리펩타이드의 활성은 발색 기질(예를 들어 SXa-11)의 절단을 촉매화하여, pNA를 생성할 수 있다. 생산된 pNA의 수준은 405 nm에서 발색을 결정함으로써 측정(예를 들어 흡광도에 의해 측정)될 수 있다. 인자 X 폴리펩타이드, 그리고 따라서 인자 Xa 폴리펩타이드는 과량으로 제공된다. 따라서, 제한 인자는 인자 VIIIa 폴리펩타이드이다. 그러므로, 생산된 pNA의 수준은 시료 내 인자 FVIIIa 폴리펩타이드에 의해 생산되는 인자 Xa 폴리펩타이드의 양에 비례하며, 이는 시료 내 인자 FVIIIa 폴리펩타이드의 활성에 비례한다. 시료 내 인자 FVIIIa 폴리펩타이드의 활성은 시료 내 인자 FVIII 폴리펩타이드의 보조인자 활성의 측정치이다.
예를 들어, 적합한 발색 검정은 실시예에 사용된 바와 같이 HYPHEN BioMed에 의해 제작된 BIOPHEN FVIII:C 검정(Ref: 221406)이다. 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성은 BIOPHEN FVIII:C 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드의 활성은 응고 검정을 사용하여 분석될 수 있다. 이러한 검정은 1-단계 응고 검정일 수 있다. 예를 들어, 적합한 응고 검정(1-단계 응고 검정)은 하기와 같다.
인자 VIII이 응고 캐스케이드의 일부이기 때문에, 활성을 증가시킨 인자 VIII 폴리펩타이드는 더 낮은 활성을 갖는 인자 VIII 폴리펩타이드보다 혈액 응고를 더 신속하게 촉매화할 것이다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 혈소판 부족(poor) 혈장과 혼합되고, 37℃에서 인큐베이션된다. 그 후에, 인지질 및 접촉 활성화 경로 활성자, 예컨대 카올린 또는 SynthaSIL APTT 시약이 첨가된다. 그 후에, 칼슘이 첨가되고, 사용자는 응고가 발생하는 데 소요된 시간을 측정한다. 혈전 형성은 자기 강철 볼(magnetic steel ball) 방법에 의해 직접 평가될 수 있다. 혈전 형성은 회전형 큐벳 검정을 사용하여 측정될 수 있는데, 이 검정에서 볼 주변의 피브린 가닥의 형성이 움직임을 생성하고 자기장에서의 변화가 검출될 수 있을 때까지 강철 볼은 자기장에서 정적인 상태로 유지된다. 대안적으로, 혈전 형성은 회전형 강철 볼 검정을 사용하여 측정될 수 있는데, 이 검정에서 볼 주변의 피브린 가닥의 형성이 이 볼의 회전을 중단시킬 때까지 강철 볼이 자석의 영향 하에 회전하며, 이는 센서에 의해 검출될 수 있다. 어느 경우이든, 응고 시간이 기록될 수 있다.
환자, 예컨대 인간 환자에서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 환자로부터 혈액 시료를 얻음으로써, 또는 환자로부터 얻은 혈액 시료 상에서 검정을 수행함으로써 측정될 수 있다.
인자 VIII 폴리펩타이드의 활성은 꼬리 클립(tail clip) 검정을 사용하여 분석될 수 있다. 적합한 꼬리 클립 검정은 유전자 요법의 맥락에서 인자 VIII 폴리펩타이드, 또는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 마우스, 예컨대 인자 VIII가 결핍된 넉아웃 마우스에게 투여하는 단계를 수반할 수 있다. 그 후에, 마우스의 꼬리를 클립으로 고정하고, 꼬리에서의 절단부(cut)가 응고하는 데 소요된 시간을 측정한다. 출혈 기간은 투여된 인자 VIII, 예를 들어 변형된 BDR 영역을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드 대(vs) 야생형 인자 VIII, 또는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 일부가 야생형이 아닌 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 인자 VIII 폴리펩타이드 대 야생형 인자 VIII의 활성의 상대 측정치를 제공한다.
변형된 BDR 영역은 최대 88개의 아미노산을 포함한다. 변형된 BDR 영역은 최대 87, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 또는 45개의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 변형된 BDR 영역은 최대 74개의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 BDR 영역은 최대 54개의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 BDR 영역은 최대 47개의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 BDR 영역은 최대 45개의 아미노산을 포함할 수 있다.
변형된 BDR 영역은 적어도 20, 적어도 25, 적어도 28, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 60, 또는 적어도 65개의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 BDR 영역은 적어도 28개의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 BDR 영역은 적어도 30개의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 BDR 영역은 적어도 54개의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 BDR 영역은 적어도 57개의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 BDR 영역은 적어도 58개의 아미노산을 포함할 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 722 및 위치 1670 내지 2332에 상응하는 아미노산을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 722 및 위치 1670 내지 2332에 상응하는 아미노산으로 구성된 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 731 및 위치 1670 내지 2332에 상응하는 아미노산을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 731 및 위치 1670 내지 2332에 상응하는 아미노산으로 구성된 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 743 및 위치 1638 내지 2332에 상응하는 아미노산을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다('SQ' 인자 VIII 폴리펩타이드). 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 743 및 위치 1638 내지 2332에 상응하는 아미노산으로 구성될 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열은 SQ 링커 서열 SFSQNPPVLKRHQR을 포함할 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28 또는 30으로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28 또는 30으로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 구성된 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28 또는 30으로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 28 또는 30으로 표시된 아미노산 서열로 구성된 인자 VIII 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체의 중합체성 사슬을 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 DNA(데옥시리보뉴클레오타이드) 또는 RNA(리보뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 mRNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있기 때문에, T(티민) 뉴클레오타이드에 대한 모든 지칭은 U(우라실)로 대체될 수 있다.
인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩한다. "인코딩하는" "서열"은 인코딩되는 아미노산 서열을 인코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈을 포함한다. 야생형 인자 VIII을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2로 제공된다. 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 비-코딩 뉴클레오타이드, 예컨대 인트론의 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 비-코딩 뉴클레오타이드의 영역은, 인코딩되는 아미노산 서열을 인코딩하는 코돈의 서열을 개재할 수 있다. 그러므로, 인코딩되는 아미노산 서열을 인코딩하는 코돈의 서열은 서열에서 인접해 있거나 비-코딩 뉴클레오타이드의 하나 이상의 영역에 의해 분리될 수 있다. 바람직하게는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 임의의 비-코딩 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 본원에서, 정지 코돈은 비-코딩 뉴클레오타이드인 것으로 여겨지지 않을 것이다.
하기 표는 각각의 아미노산을 인코딩하는 코돈을 기재한다:
Figure pct00004
상응하는 RNA 코돈은 상기 표에서 T의 자리에 U를 함유할 것이다.
인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 성숙 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드의 모두 또는 일부를 인코딩하지 않는다. 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드의 모두 또는 일부, 예컨대 본원에 기재된 임의의 신호 펩타이드의 임의의 것 또는 일부를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 코돈-최적화될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 유전자 코드는 축퇴성(degenerate)이고, 많은 아미노산은 하나 초과의 대안적인 코돈에 의해 인코딩될 수 있다. 그러나, 상이한 유기체, 조직 또는 세포의 유전자 코드는 특정 아미노산을 인코딩하는 하나의 특정 코돈을 사용하는 쪽으로 편향될 수 있다. "코돈-최적화된" 뉴클레오타이드 서열은 특정 숙주 세포 또는 유기체에서의 발현, 예를 들어 인간 간 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 바람직하게는, 코돈-최적화된 핵산 서열은 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 변형되는 한편, 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열은 변형되지 않는다.
코돈 최적화된 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드는 인간 간 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 더 높은 수준으로 발현될 수 있다.
그러므로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 인자 VIII 폴리펩타이드는 서열이 인간 간 세포에서 발현될 때, 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 코돈-최적화된 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드는 인간 간 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 높게 발현될 수 있다. "기준 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열"은 인자 VIII 폴리펩타이드(그 자체가 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드일 수 있거나 변형된 인자 VIII 폴리펩타이드, 예컨대 변형된 BDR을 포함하는 본 발명의 인자 VIII 폴리펩타이드일 수 있음)를 인코딩하는 야생형 코돈을 사용하는 임의의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 2의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 선택적으로, 기준 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드는 "등가의(equivalent)" 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열이며, 즉, 기준 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드는 이것이 비교되는 인자 VIII 폴리뉴클레오타이드와 동일한 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩한다.
뉴클레오타이드 서열을 "코돈-최적화되는" 것으로 기재함으로써, 모든 코돈이 최적화될 필요는 없다. 그러므로, 코돈-최적화되는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열의 부분은, 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열의 상응하는 부분과 비교될 때, 야생형 코돈(들) 대신에 하나 이상의 대안적인 코돈(들)을 포함할 수 있다. 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열이 코돈-최적화되는 부분을 포함한다면, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드는 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 코돈-최적화되는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열의 부분은 인간 간 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 그러므로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드는, 서열이 인간 간 세포에서 발현될 때, 등가의 비-코돈-최적화된(예를 들어 야생형) 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. "등가의" 비-코돈 최적화된 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은, 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하는 데 사용되는 코돈이 야생형 인자 VIII 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 2의 상응하는 코돈에 상응할 것이라는 점을 제외하고는, 동일하다(즉, 동일한 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하고 동일한 전사 조절 요소 등을 포함함). 전형적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열의 코돈-최적화된 부분은 정지 코돈을 포함하지 않는다.
본 발명의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 야생형 코돈(들) 대신에 하나 이상의 대안적인 코돈(들)을 포함할 수 있으며, 여기서 "대안적인" 코돈은 야생형 코돈과 상이한 서열을 갖지만 야생형 코돈과 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈(즉, 축퇴성 코돈)이다. 표 3은 각각의 아미노산을 인코딩하는 코돈을 기재한다.
코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은, 코돈-최적화되지 않는 상응하는 뉴클레오타이드 서열보다 적어도 하나 더 많은 "바람직한" 코돈을 포함할 수 있다. 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은, 코돈-최적화되지 않는 상응하는 뉴클레오타이드 서열보다 더 높은 백분율의 "바람직한" 코돈을 포함할 수 있다. 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은, 코돈-최적화되지 않는 상응하는 뉴클레오타이드 서열보다 적어도 하나 더 적은 "바람직하지 않은" 코돈을 포함할 수 있다. 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은 코돈-최적화되지 않는 상응하는 뉴클레오타이드 서열보다 더 낮은 백분율의 "바람직하지 않은" 코돈을 포함할 수 있다. 인간 간 세포에서 인자 VIII의 발현에 바람직한 코돈은 표 3에 밑줄표시되어 있다.
선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4의 적어도 4047개, 적어도 4071개, 적어도 4104개, 적어도 4128개, 적어도 4131개, 적어도 4155개, 적어도 4158개, 적어도 4173개, 적어도 4182개, 적어도 4254개 또는 적어도 4263개의 뉴클레오타이드(선택적으로 SEQ ID NO: 4의 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개 또는 최대 2개 영역으로부터의 적어도 4047개, 적어도 4071개, 적어도 4104개, 적어도 4128개, 적어도 4131개, 적어도 4155개, 적어도 4158개, 적어도 4173개, 적어도 4182개, 적어도 4254개 또는 적어도 4263개의 인접 뉴클레오타이드, 또는 적어도 4047개, 적어도 4071개, 적어도 4104개, 적어도 4128개, 적어도 4131개, 적어도 4155개, 적어도 4158개, 적어도 4173개, 적어도 4182개, 적어도 4254개 또는 적어도 4263개의 뉴클레오타이드)를 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4의 적어도 4047개, 적어도 4071개, 적어도 4104개, 적어도 4128개, 적어도 4131개, 적어도 4155개, 적어도 4158개, 적어도 4173개, 적어도 4182개, 적어도 4254개 또는 적어도 4263개의 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4의 적어도 4047개, 적어도 4071개, 적어도 4104개, 적어도 4128개, 적어도 4131개, 적어도 4155개, 적어도 4158개, 적어도 4173개, 적어도 4182개, 적어도 4254개 또는 적어도 4263개의 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 단지 하나 이상의 치환 돌연변이를 인코딩하는 대안적인 코돈만큼 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시된 뉴클레오타이드와 43개 이하, 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 단지 하나 이상의 치환 돌연변이를 인코딩하는 대안적인 코돈만큼 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 29로 표시된 뉴클레오타이드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 29로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성될 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 29로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 29로 표시된 뉴클레오타이드 서열로 구성될 수 있다.
선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 31로 표시된 뉴클레오타이드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 31의 적어도 4047개 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 31로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성될 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 31로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 31로 표시된 뉴클레오타이드 서열로 구성될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 AAV 작제물
본 발명은 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 AAV 작제물을 제공하며, 여기서 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩한다. 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 임의의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 인자 VIII 폴리펩타이드는 본 발명의 임의의 인자 VIII 폴리펩타이드일 수 있다.
재조합 AAV 작제물은 4900개 미만, 4850개 미만, 4800개 미만, 또는 4750개 미만의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 재조합 AAV 작제물은 4700 내지 4900개, 4700 내지 4850개, 4700 내지 4800개, 4700 내지 4750개, 또는 대략 4713개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 재조합 AAV 작제물은 대략 4845개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
재조합 AAV 작제물은 4850 내지 4900개, 또는 대략 4845개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 선택적으로 4318개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 4318 내지 4046개, 4318 내지 4070개, 4264 내지 4127개, 4210 내지 4151개, 또는 대략 4182개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
재조합 AAV 작제물은 4700 내지 4850개, 4700 내지 4800개, 4700 내지 4750개 또는 대략 4713개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 선택적으로 4318개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 4318 내지 4046개, 4264 내지 4070개, 4264 내지 4103개, 4255 내지 4127개, 4246 내지 4130개, 4237 내지 4154개, 4228 내지 4157개, 4219 내지 4166개, 4210 내지 4169개, 4201 내지 4172개, 4192 내지 4175개 또는 대략 4182개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 선택적으로, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 대략 4182개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
선택적으로, 재조합 AAV 작제물은 대략 4713개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 4228 내지 4157개, 4219 내지 4166개, 4210 내지 4169개, 4201 내지 4172개, 4192 내지 4175개 또는 대략 4131개, 대략 4134개, 대략 4155개, 대략 4158개, 대략 4161개, 대략 4167개, 대략 4173개 또는 대략 4182개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 선택적으로, 재조합 AAV 작제물은 대략 4713개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 4131개, 4134개, 4155개, 4158개, 4161개, 4167개, 4173개 또는 4182개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 선택적으로 재조합 AAV 작제물은 4713개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 27일 수 있다.
일부 경우, 재조합 AAV 작제물의 맥락에서 상기 단락에서의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열의 길이에 대한 지칭은 '정지' 코돈을 포함하지 않는다 - 정지 코돈을 포함하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열보다 3개 뉴클레오타이드 더 길 것이다. 일부 구현예에서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 정지 코돈을 포함할 수 있다.
재조합 AAV 작제물은 전사 조절 요소(TRE) 및/또는 polyA 서열에 작동 가능하게 연결된 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
재조합 AAV 작제물은 전사 조절 요소(TRE)를 추가로 포함할 수 있다. 전사 조절 요소는 간-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 전사 조절 요소는 270개 미만의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. TRE는 선택적으로 SEQ ID NO: 13으로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도, 기지의 HLP2 TRE로부터의 실질적인 수의 뉴클레오타이드가 TRE의 효능에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 결실되거나 변형될 수 있음을 결정하였다. 특히, 본 발명자들은 놀랍게도, 짧은 전사 조절 요소 FRE 72가 상당히 더 짧은 길이임에도 불구하고 HLP2 TRE에 필적하는 효능(즉, 비교에 의해 적어도 50% 또는 더 양호한 활성)을 가짐을 발견하였다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 200개 뉴클레오타이드 더 짧으며, 선택적으로 150개 뉴클레오타이드 더 짧고, 선택적으로 125개 뉴클레오타이드 더 짧다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 적어도 85개 뉴클레오타이드 길이, 선택적으로 적어도 100개 뉴클레오타이드 길이, 선택적으로 적어도 110개 뉴클레오타이드 길이이다. 선택적으로, 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 14로 표시된 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
재조합 AAV 작제물은 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 야생형 인자 VIII 신호 펩타이드일 수 있다. 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 15로 표시된 야생형 FVIII 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16 또는 17과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 선택적으로, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16 또는 17을 포함한다.
선택적으로, 신호 펩타이드는 야생형 인자 VIII 신호 펩타이드가 아니다. 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 18 또는 20의 서열과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 18과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 18을 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 20을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 57개 미만의 뉴클레오타이드 길이이다. 더 바람직하게는, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 대략 54개 뉴클레오타이드 길이이다. 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 대략 54개 뉴클레오타이드 길이이고 SEQ ID NO: 18의 서열을 인코딩할 수 있다. 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 대략 54개 뉴클레오타이드 길이이고 SEQ ID NO: 20의 서열을 인코딩할 수 있다. 선택적으로, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화될 수 있다. SEQ ID NO: 18로 표시된 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 19의 서열을 갖는다. SEQ ID NO: 20으로 표시된 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 21의 서열을 갖는다. 선택적으로, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 19 또는 21과 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 선택적으로, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 19 또는 21을 포함한다.
재조합 AAV 작제물은 polyA 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. polyA 뉴클레오타이드 서열은 합성일 수 있다. polyA 뉴클레오타이드 서열은 50개 미만의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. polyA 뉴클레오타이드 서열은 16 내지 50개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. polyA 뉴클레오타이드 서열은 대략 49개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. polyA 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
재조합 AAV 작제물은 1 또는 2개의 ITR(들)을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 또는 각각의 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 선택적으로, 재조합 AAV 작제물은 AAV1, AAV2, AAV4 및/또는 AAV6으로부터 유래되는 ITR 서열을 포함한다. 이러한 또는 각각의 ITR은 AAV2 ITR일 수 있다. 이러한 또는 각각의 ITR의 뉴클레오타이드 서열은 157개 미만, 또는 154개 미만의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 이러한 또는 각각의 ITR의 뉴클레오타이드 서열은 대략 145개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 5' ITR의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 23의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 3' ITR의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
재조합 AAV 작제물은 단일-가닥일 수 있다. 재조합 AAV 작제물은 AAV 게놈일 수 있다.
인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 27의 서열을 포함할 수 있고, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 19를 포함할 수 있다. 재조합 AAV 작제물은 간-특이적 프로모터인 전사 조절 요소를 포함할 수 있고, 간-특이적 프로모터는 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 재조합 AAV 작제물은 2개의 ITR 및 polyA 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 5' ITR의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 23이며, 3' ITR의 서열은 SEQ ID NO: 24이고, polyA 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. AAV 작제물은 서열 SEQ ID NO: 27을 가질 수 있다.
작제물을 포함하는 바이러스 입자
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 AAV 작제물을 포함하는 AAV 바이러스 입자를 제공한다.
나아가, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "바이러스 입자"는 비리온의 모두 또는 일부를 지칭한다. 예를 들어, 바이러스 입자는 재조합 게놈을 포함하고, 캡시드를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 입자는 유전자 요법 벡터일 수 있다. 본원에서, 용어 "바이러스 입자" 및 "벡터"는 상호 교환적으로 사용된다. 본 출원의 목적을 위해, "유전자 요법" 벡터는 유전자 요법에 사용될 수 있는 바이러스 입자, 즉, 투여 후 숙주 세포에서 이식유전자, 예컨대 인자 IX 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위해 모든 필요한 기능적 요소를 포함하는 바이러스 입자이다.
적합한 바이러스 입자는 파보바이러스(parvovirus), 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 단순 포진 바이러스를 포함한다. 파보바이러스는 아데노-관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus)일 수 있다. 바이러스 입자는 바람직하게는 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 더 바람직하게는, 바이러스 입자는 AAV 바이러스 입자이다. 용어 AAV 및 rAAV는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
모든 기지의 AAV 혈청형의 게놈 구조화는 매우 유사하다. AAV의 게놈은 약 5,000개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 선형, 단일-가닥 DNA 분자이다. 역 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat)는 비-구조적 복제(Rep) 단백질 및 구조적(VP) 단백질에 대한 독특한 코딩 뉴클레오타이드 서열을 플랭킹(flank)한다. VP 단백질(VP1, VP2 및 VP3)은 캡시드를 형성한다. 말단 145개 nt는 자가-상보적이고, T-형상의 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 이중체(duplex)가 형성될 수 있도록 구조화된다. 이들 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제를 위한 기원(origin)으로서 작용하여, 세포성 DNA 폴리머라제(polymerase) 복합체에 대한 프라이머로서 역할을 한다. 포유류 세포에서 야생형(wt) AAV 감염 후, Rep 유전자(즉, Rep78 단백질 및 Rep52 단백질을 인코딩함)는 P5 프로모터 및 P19 프로모터로부터 각각 발현되고, Rep 단백질은 둘 다 바이러스 게놈의 복제에서 기능을 갖는다. Rep ORF에서의 스플라이싱 사건은 실제 4개의 Rep 단백질(즉, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)의 발현을 이끈다. 그러나, 포유류 세포에서 Rep78 단백질 및 Rep52 단백질을 인코딩하는 스플라이싱되지 않은(unspliced) mRNA는 AAV 벡터 생성에 충분한 것으로 나타났다. 또한 곤충 세포에서, Rep78 단백질 및 Rep52 단백질은 AAV 벡터 생성에 충분하다.
AAV 벡터의 생성을 위해 본 발명에 사용될 수 있는 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 유의한 상동성의 게놈 서열을 가지며, 유전적 기능의 동일한 세트를 제공하고, 본질적으로 물리적으로 그리고 기능적으로 등가인 비리온을 생성하며, 실제로 동일한 기전에 의해 복제 및 조립한다. 다양한 AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성의 개요에 대해, 예를 들어 GenBank 기탁 번호 U89790; GenBank 기탁 번호 J01901; GenBank 기탁 번호 AF043303; GenBank 기탁 번호 AF085716; Chiorini et al., 1997; Srivastava et al., 1983; Chiorini et al., 1999; Rutledge et al., 1998; 및 Wu et al., 2000을 참조한다. AAV 혈청형 1, 2, 3, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12는 본 발명에 사용될 수 있다. AAV 혈청형으로부터의 서열은 유전자 요법 벡터의 생성에 사용되고 있을 때 돌연변이화되거나 조작될 수 있다.
선택적으로, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4 및/또는 AAV6으로부터 유래되는 ITR 서열을 포함한다. 바람직하게는 ITR 서열은 AAV2 ITR 서열이다. 본원에서, 용어 AAVx/y는 AAVx(여기서 x는 AAV 혈청형 수임)로부터의 일부 성분 및 AAVy(여기서 y는 동일한 또는 상이한 혈청형의 수임)로부터의 일부 성분을 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 예를 들어, AAV2/8 벡터는 AAV2 균주로부터의 ITR 및 AAV8 균주로부터의 캡시드를 포함하는 바이러스 게놈의 일부를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 바이러스 입자는 캡시드를 포함하는 AAV 바이러스 입자이다. AAV 캡시드는 일반적으로, 3개의 단백질인 VP1, VP2 및 VP3으로부터 형성된다. VP1의 아미노산 서열은 VP2의 서열을 포함한다. VP2의 부분을 형성하지 않는 VP1의 일부는 VP1독특 또는 VP1U로 지칭된다. VP2의 아미노산 서열은 VP3의 서열을 포함한다. VP3의 부분을 형성하지 않는 VP2의 일부는 VP2독특 또는 VP2U로 지칭된다. 바이러스 입자는 캡시드를 포함할 수 있다. 캡시드는
(i) SEQ ID NO: 25와 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 캡시드;
(ii) SEQ ID NO: 26과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 캡시드;
(iii) 간-회귀성(liver-tropic) 캡시드; 및
(iv) AAV5 캡시드
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
캡시드는
(i) SEQ ID NO: 47과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 캡시드;
(ii) SEQ ID NO: 48과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 캡시드; 및
(iii) AAV6 캡시드
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바이러스 입자는, 바이러스 ITR 및 바이러스 캡시드가 상이한 파보바이러스, 예컨대 상이한 AAV 혈청형으로부터의 것인 "하이브리드" 입자일 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 ITR 및 캡시드는 AAV의 상이한 혈청형으로부터의 것이며, 이러한 경우 이러한 바이러스 입자는 트랜스캡시드화(transcapsidated) 또는 위형화(pseudotyped)라고 알려져 있다. 마찬가지로, 파보바이러스는 "키메라" 캡시드(예를 들어, 상이한 파보바이러스, 바람직하게는 상이한 AAV 혈청형으로부터의 서열을 함유함) 또는 "표적화된" 캡시드(예를 들어, 직접 회귀성(directed tropism))를 가질 수 있다.
조성물, 방법 및 용도
본 발명의 추가 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 작제물/바이러스 입자 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
약학적으로 허용 가능한 부형제는 담체, 희석제 및/또는 다른 의학적 제제, 약학적 제제 또는 아쥬반트(adjuvant) 등을 포함할 수 있다. 선택적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 식염수를 포함한다. 선택적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 인간 혈청 알부민을 포함한다.
나아가, 본 발명은 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 작제물/바이러스 입자 또는 조성물을 제공한다. 선택적으로 치료 방법은 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 작제물/바이러스 입자를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
나아가, 본 발명은 치료 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 작제물/바이러스 입자 또는 조성물의 용도를 제공한다. 선택적으로 치료 방법은 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 작제물/바이러스 입자를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
선택적으로 치료 방법은 유전자 요법이다. "유전자 요법"은, 본 발명의 작제물/바이러스 입자가 투여되는 숙주에서 이식유전자(예컨대 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열)를 발현할 수 있는 본 발명의 작제물/바이러스 입자를 투여하는 단계를 수반한다.
선택적으로, 치료 방법은 응고병증(coagulopathy), 예컨대 혈우병(예를 들어 A형 혈우병 또는 B형 혈우병) 또는 폰 빌레브란트 질환을 치료하는 방법이다. 바람직하게는, 응고병증은 증가된 출혈 및/또는 감소된 응고를 특징으로 한다. 선택적으로, 치료 방법은 혈우병, 예를 들어 A형 혈우병을 치료하는 방법이다. 일부 구현예에서, 환자는 A형 혈우병을 앓고 있는 환자이다. 선택적으로 환자는 인자 VIII에 대한 항체 또는 저해제를 갖는다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 작제물/바이러스 입자는 정맥내로 투여된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 작제물/바이러스 입자는 환자에게 단지 1회 투여(즉, 단회 용량)되기 위한 것이다.
선택적으로, 본 발명의 방법은 환자가 유전자 요법 벡터의 투여에 의해 부분적으로 또는 완전히 치료되었는지의 여부를 결정하는(예를 들어 환자가 A형 혈우병의 증상에 대해 부분적으로 또는 완전히 치료되었는지 결정하는) 단계를 추가로 포함할 수 있다. A형 혈우병을 부분적으로 또는 완전히 치료한다는 것은 A형 혈우병을 앓고 있는 환자의 응고를 개선하고, 비제어된 출혈 사건의 위험을 감소시키는 것을 지칭할 수 있다. A형 혈우병을 부분적으로 또는 완전히 치료한다는 것은 예를 들어 관절에서 비제어된 출혈 사건 또는 내출혈(internal bleeding)의 횟수 및/또는 빈도를 감소시키는 것을 지칭할 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 치료되는 환자는 매해 더 적은 수의 비제어된 출혈 사건을 경험할 수 있다. A형 혈우병이 상기 방법으로 "치료될" 때, 이는, 혈우병의 하나 이상의 증상이 개선됨을 의미한다. 이는, 혈우병의 증상이 완전히 치유되어 이들 증상이 환자에 더 이상 존재하지 않음을 의미하는 것은 아니지만, 일부 방법에서 이러한 경우가 있을 수 있다. 치료 방법은 A형 혈우병의 증상 중 하나 이상이 치료 전보다 덜 심각해지는 것을 이끌 수 있다. A형 혈우병을 부분적으로 또는 완전히 치료하는 것은 환자의 혈장에 존재하는 FVIII의 양 또는 활성을 증가시키는 것을 지칭할 수 있다. 선택적으로, 투여-전 상황과 비교하여, 치료 방법은 환자의 혈액 중 순환형 인자 VIII의 양/농도의 증가, 및/또는 환자의 주어진 부피의 혈액 내에서 검출 가능한 인자 VIII 활성의 전체 수준, 및/또는 환자의 혈액 중 인자 VIII의 고유 활성도(인자 VIII 단백질의 양(amount)당 활성)의 증가를 이끈다. 혈우병을 부분적으로 치료하는 것은 중증(< 1%의 정상적인 혈액 응고 인자 활성) 또는 중등도(< 2%의 정상적인 혈액 응고 인자 활성) 혈우병 환자를 경증(5% ~ 40%의 정상적인 혈액 응고 인자 활성) 혈우병 환자로 전환시키는 것을 지칭할 수 있다. 혈우병을 완전히 치료하는 것은 중증, 중등도 또는 경증 혈우병 환자의 혈액 응고 인자 활성을 정상적인 범위(50% ~ 150%의 정상적인 혈액 응고 인자 활성) 내로 증가시키는 것을 지칭할 수 있다.
부분적으로 또는 완전히 치료되는 환자는 더 낮은 용량의 인자 VIII가 투여되는 것을 필요로 할 수 있다. 선택적으로, 부분적으로 또는 완전히 치료되는 환자는 FVIII의 지속(on-going) 투여를 필요로 하지 않을 수 있다. 선택적으로, 방법은, 혈우병에 대해 부분적으로 또는 완전히 치료된 적이 있는 환자가 인자 VIII을 이용한 지속 치료를 더 이상 필요로 하지 않거나 지속 치료를 감소된 수준으로 필요하는지의 여부를 평가하고, 예를 들어 투여될 인자 VIII의 용량 또는 용량 빈도를 감소시키거나 인자 VIII의 투여를 중단시키기 위해 환자의 치료 계획을 적절하게 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
"치료적 유효량"은 대상체에서 요망되는 치료 결과를 달성하기에, 예컨대 기능적 인자 VIII의 수준을 상승시키기 위해(따라서 A형 혈우병의 증상을 개선하기에 충분한 수준에서 기능적 인자 VIII 생성을 이끌기 위해) 필요한 투약량에서 그리고 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
선택적으로, 작제물/바이러스 입자는 환자 체중 kg당 1 × 1011개 미만, 1 × 1012개 미만, 5 × 1012개 미만, 2 × 1012개 미만, 1.5 × 1012개 미만, 3 × 1012개 미만, 1 × 1013개 미만, 2 × 1013개 미만, 또는 3 × 1013개 미만의 작제물 게놈의 용량으로 투여된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드, 바이러스 입자 또는 조성물은 환자 체중 kg당 적어도 4.5 × 1011개, 또는 4.5 × 1011개 내지 1 × 1012개의 작제물 게놈의 용량(vg/kg)으로 투여된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드, 바이러스 입자 또는 조성물은 5 × 1011 vg/kg 미만의 용량으로 투여된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드, 바이러스 입자 또는 조성물은 4.5 × 1011 vg/kg 내지 5 × 1011 vg/kg, 또는 4.5 × 1011 vg/kg 내지 4.9 × 1011 vg/kg의 용량으로 투여된다. 선택적으로, 투여되는 폴리뉴클레오타이드 또는 바이러스 입자는 포유류 세포로부터 생성되고/되거나, 포유류 바이러스 작제물 생성 세포의 사용으로부터 비롯되고 곤충 바이러스 작제물 생성 세포(예를 들어 바큘로바이러스(baculovirus) 시스템)에서 생성되는 작제물과 구별되는 특징을 소유한다.
선택적으로, 주어진 용량의 작제물/바이러스 입자의 투여 - 작제물 게놈의 수의 측면에서 정량화됨 - 는 작제물 게놈을 적정하기 위해 qPCR을 사용하여 달성된다.
qPCR을 수행하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 실시간 PCR 사이클러 및 DNA-결합 염료, 예컨대 SYBR 그린(ThermoFisher Scientific)을 사용하여, 초기(nascent) 이중-가닥 앰플리콘의 증폭은 실시간으로 검출될 수 있다. 그 후에, 기지의 양의 qPCR 주형 유전 물질(예를 들어 프로모터 영역)은 일련으로 희석되어, 표준 곡선을 생성하고, 시료 작제물 게놈 역가는 표준 곡선으로부터 내삽될 수 있다.
실시예
실시예 1 - 일반적인 방법 및 재료
FVIII 작제물
FVIII-SQ 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-743 및 1638-2332에 상응하는 아미노산을 포함한다(문헌[Lind et al. 1995. Eur J Biochem 232, 19-27](SEQ ID NO: 3).
내부-절단된(internally-truncated) 인간 FVIII 폴리펩타이드(FVIII-96-106)는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 732-1669에 상응하는 아미노산의 결실을 포함하고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-731 및 1670-2332에 상응하는 아미노산(SEQ ID NO: 7)을 포함한다.
AAV 벡터의 생산
AAV Rep 및 Cap 기능; 아데노바이러스 헬퍼 기능; 및 AAV2 ITR에 의해 플랭킹된 FVIII 발현 카세트를 함유하는 재조합 게놈을 인코딩하는 플라스미드로 HEK293T 세포를 삼중(triple) 플라스미드 형질주입함으로써 AAV 입자를 생성하였다. 형질주입-후 72시간째에 세포 펠렛 및 현탁액을 수확하고, 수지, 예컨대 POROS Capture Select 및 AVB Sepharose를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 AAV 입자를 정제하였다. 그 후에, AAV를 PBS 내로 밤새 투석시키고, 4℃에서 저장하고, qPCR에 의해 적정하였다.
FVIII 발색 활성 검정
Biophen FVIII:C 발색 검정(Hyphen BioMed, ref 221406)은 FVIII의 보조인자 활성(FVIII:C)을 측정한다.
트롬빈 활성화를 통해, FVIII:C 폴리펩타이드는 인간 인자 IXa, 인지질 및 칼슘과 복합체를 형성한다. 이들 조건 하에, 이 검정에서 특정 농도에서 그리고 과량으로 제공되는 인자 X는 인자 Xa(활성화됨)로 전환된다. 생성된 이러한 인자 Xa는 제한 인자인 FVIII:C에 정비례한다. 인자 Xa는 발색 기질인 Sxa-11에 의해 직접 측정된다. 인자 Xa는 발색 기질을 절단하고 pNA를 방출시킨다. pNA의 생성은, FVIII:C 활성과 직접적으로 관련이 있는 인자 Xa 활성에 비례한다. 방출되는 pNA의 수준은 405 nm에서 발색을 측정함으로써 결정될 수 있으며, 이는 시료 내 인자 VIII:C에 의해 생산되는 인자 Xa 폴리펩타이드의 양에 비례하며, 이는 시료 내 FVIII:C의 활성에 비례한다.
검정은 제조업체의 설명에 따라 수행된다. 간략하게는, 37℃에서 예비인큐베이션된 마이크로플레이트 웰에, 50 μl의 보정자(calibrator) 혈장, 희석된(시약 R4에서) 시험 혈장 또는 세포 상층액/용해물 또는 대조군을 첨가하고, 50 μl의 각각의 시약 R1 및 R2를 첨가하고, 이를 6 mL의 증류수로 재구성하고 37℃까지 예열시킨다. 혼합 후, 이들 성분은 150 μl 반응물을 형성하며, 이 반응물을 37℃에서 5분 동안 인큐베이션되게 한다. 후속적으로, 반응물에 시약 R3을 보충하고, 이 자체를 6 mL의 증류수에 재현탁시키고 37℃까지 예열시키고, 200 μL 믹스(mix)를 37℃에서 추가 5분 동안 인큐베이션되게 한다. 50 μl의 20% 아세트산 또는 시트르산(20 g/l)을 첨가함으로써 반응을 중단시킨 후, 생성된 250 μl 혼합물의 흡광도를 405 nm에서 측정한다.
시약:
R1 - 인간 인자 X, 피브린 중합 저해제의 존재 하에 동결건조됨.
R2 - 활성화 시약 - 동결건조된, 인간 트롬빈, 칼슘 및 합성 인지질을 함유하는 일정하고 최적화된 농도에서의 인자 IXa(인간).
R3 - SXa-11 - 트롬빈 저해제와 함께 동결건조된, 인자 Xa에 특이적인 발색 기질.
R4 - Tris-BSA 완충액. 1% BSA, PEG, FVIII:C 안정화제 및 소듐 아자이드(0.9 g/L)를 함유함.
발색 활성 검정으로부터의 판독물에 관하여, "%FVIII 활성"("%FVIII:C"로도 지칭됨)은 "정상 %"이며, 이는 예를 들어, HuH-7 세포에서 FVIII 발현 카세트를 발현하는 맥락에서 100% FVIII 활성을 갖는 인간 혈장 시료와 비교하여, HuH-7 세포에서 FVIII 발현 카세트의 발현 후 상층액에서 검출되는 FVIII 활성이, 100% FVIII 활성을 갖는 상기 인간 혈장 시료에서 검출되는 명시된 %의 FVIII 활성임을 의미한다.
FVIII 샌드위치 ELISA 항원 검정
Asserachrom VIII:Ag 키트(Stago Diagnostica, ref 00280)는 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)에 의한 혈장 중 FVIII의 정량화를 위한 항원성 검정이다. 검정된 시료에서 FVIII은, 플라스틱 마이크로플레이트 웰의 벽을 예비-코팅시키는 마우스-단일클론 항-인간 VIII:Ag 항체에 의해 포획된다. 충분한 인큐베이션 및 비-특이적 결합을 감소시키기 위한 세척 후, 퍼옥시다제에 커플링된 마우스 항-인간 FVIII 항체는 포획된 FVIII의 잔여 유리(free) 항원 결정기에 결합한다. 그 후에, 결합된 퍼옥시다제는 TMB 기질에 의해 드러난다. TMB에 의해 유도되는 발색은 강산의 첨가에 의해 중단된다. 발색의 강도는, 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정되는, 검정된 시료 내 FVIII 농도에 정비례한다.
이러한 검정으로부터의 판독물은 "정상 %"로서 표현될 수 있으며, 이는 예를 들어, 마우스에서 FVIII 작제물을 발현하는 맥락에서 100% FVIII 활성을 갖는 인간 혈장 시료와 비교하여, 마우스 혈장 시료에서 검출되는 FVIII 분자(엄격하게는 에피토프)의 수가, 100% FVIII 활성을 갖는 상기 인간 혈장 시료에서 검출되는 명시된 %의 FVIII 분자/에피토프의 수임을 의미한다.
상기 기재된 활성 검정과 항원 검정 둘 다에서, FVIII(활성 수준 또는 항원 수준)은, WHO 국제 표준(NIBSC 코드 07/316)에 대해 보정된, 기지의 FVIII 활성 또는 항원(적절하다면)의 동결건조된 인간 혈장 시료를 포함하거나 제조업체에 의해 권고대로 사용하여 마우스, 또는 인간 세포 상층액, 시료에서 정량화된다.
실시예 2 - FVIII 치환 돌연변이 변이체의 상대 고유 활성도의 시험관 내 평가
인 실리코(in silico) 모델링을 사용하여, 비-표면-노출된 도메인간 표면 상에서 단일 아미노산 치환, 및 시스테인 치환의 쌍을 예측하였고, 이는 FVIII의 안정성을 증가시킬 것이다. 그러나, 안정성에 미치는 임의의 영향은 활성에 대한 유익한 효과와 본질적으로 동등하지 않고, 일부 경우 증가된 안정성은 유해 효과, 예를 들어 안정성을 증가시키지만 필요한 FVIII 도메인 재배열을 활성 형태로 가능하게 하지 않는 치환을 가질 것이다. 수많은 이러한 치환 변이체를 아래 기재된 바와 같이 시험관 내에서 시험하였다.
하나 이상의 이러한 치환을 포함하는 FVIII-SQ 변이체를 인코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 유전자-합성하고, 상업적으로 입수 가능한 발현 벡터 pcDNA5-FRT(Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 96 Deepwell 플레이트에 제조업체의 프로토콜에 따라 expi293 현탁 세포 내로 형질주입하고, 습윤화된 8% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 400 rpm에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양물을 100 × g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 발색 검정에서의 즉시 시험 및 항원 정량화를 위해 0.2 μl 필터를 통해 여과하였다.
블랭크 차감 후, 발색 검정으로부터의 FVIII 활성 판독물을 FVIII 항원 정량화(ELISA) 판독물로 나누어서, 고유 활성도(SA) 값을 수득하였다.
도 2a는, 임의의 치환 돌연변이가 결여된 FVIII-SQ('95') 대조군과 비교하여, 각각의 변이체에 대한 많은 대안적인 치환된 잔기를 포함한 몇몇 상이한 단일 아미노산 치환 변이체에 대한 SA의 배수-변화를 도시한다. 하기 표는 각각의 번호매겨진 작제물에 상응하는 치환의 정체성(identity)을 보여준다. 변이체 65(H693W)는 95와 비교하여 SA의 상승을 나타낸다.
Figure pct00005
Figure pct00006
다른 실험에서, 치환 M662W('26'이라고 함)는 '95'와 비교하여 SA의 두드러진 증가를 실증하였다. 위치 M662에 대해, 모든 대안적인 치환의 SA를 스크리닝하기로 결정되었다. 그 결과를 도 2b에 도시하고, 이는 또한 M662W를 H693W와 조합하는 이중 치환을 포함한다(도 2a로부터 65). 또한, 치환의 정체성에 대해 아래 표를 참조한다. 위치 M662에서 C 및 E로의 치환은 95와 비교하여 SA에서 어느 정도의 증가를 제공하는 것으로 보인다. SA의 가장 큰 증가는 M662W+H693W 조합에 대해 관찰되었다.
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 3 - 이황화 브릿지를 형성하는 것으로 예측되는 추가의 FVIII 치환 돌연변이 변이체의 상대 고유 활성도의 시험관 내 평가
실시예 2에서의 인 실리코(in silico) 예측 작업에 기초하여, 많은 시스테인 치환 쌍을 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 시험하였다.
결과 - 마찬가지로 FVIII-SQ('95')(SEQ ID NO: 3)와 비교하여 고유 활성도의 배수-변화로서 표현됨 - 를 도 3에 도시한다. 아래 표는 도 3에 도시된 작제물 번호에 상응하는 치환쌍을 나타낸다. 몇몇 C-C 치환 변이체는 대조군과 비교하여 고유 활성도의 몇배 증가를 보여준다.
Figure pct00009
실시예 4 - 특정 유망한 치환 변이체의 확인용 시험관 내 시험
도 4는, 실시예 2 및 3의 시험된 치환 변이체의 하위세트에 대해, FVIII-SQ('95') 대조군과 비교하여 SA에서의 배수-증가를 확인시켜 준다. 치환을 2개의 FVIII '백그라운드'에서 평가하였고, 제1 치환은 상기 실시예에서와 같이 FVIII-SQ였다:
· FVIII-SQ-M662W('26')
· FVIII-SQ-H693W('65')
· FVIII-SQ-M662W-H693W('26-65')
· FVIII-SQ-L687C-A1800C('12SS').
제2 FVIII 백그라운드는, 이것이 B 도메인을 포괄하고 이의 어느 한쪽 측면(side) 상에서 연장되는 더 광범위한 내부 결실을 함유한다는 점에서 FVIII-SQ와 상이하다. 결실된 영역은 아미노산 위치 732-1669에 상응하고, 변이체 단백질은 FVIII-(96-106)으로 지칭된다.
· FVIII-(96-106)-M662W('26-96-106')
· FVIII-(96-106)-H693W('65-96-106')
· FVIII-(96-106)-M662W-H693W('26-65-96-106')
· FVIII-(96-106)-L687C-A1800C('12SS-96-106')
도 4가 도시하는 바와 같이, 시험된 작제물의 각각의 상기 하위세트는 FVIII-SQ 대조군(95)과 비교하여 고유 활성도에서 대략 2배 이상의 증가를 보여주었다.
실시예 5 - 안정화 치환 돌연변이를 함유하는 내부적으로-결실된 FVIII 이식유전자 작제물의 생체 내 평가
이 연구에서, AAV8 벡터를 하기 작제물로부터 만들었다:
· FRE72-SP5-FVIIICo19(26-96-106)-SpA(SEQ ID NO: 27)
· FRE72-SP5- FVIIICo19-SQ-SpA(SEQ ID NO: 32)
상기 작제물은 FRE72 프로모터, 신호 펩타이드 5, 및 합성 polyA를 함유한다. 이들은, 하나는 FVIII-SQ를 인코딩하는 한편 다른 것은 "96-106" 내부 결실, 뿐만 아니라 치환 돌연변이 "26"(= M662W)을 갖는 더 짧은 변이체를 인코딩한다는 점에서 상이하다.
· 비교인자 FVIIIco-SQ
상기 작제물은 네이티브 FVIII 신호 펩타이드, SpA, 및 간-특이적 프로모터와 함께 코돈-최적화된 FVIII-SQ-인코딩 서열을 포함한다. 작제물은 SEQ ID NO: 34의 서열을 갖는다.
AAV8-비교인자 FVIIIco-SQ을 별개의 실험에서 AAV8-FRE72-SP5-FVIIICo19(26-96-106)-SpA 및 AAV8-FRE72-SP5-FVIIICo19-SQ-SpA와 각각 비교하였다.
6주령 내지 8주령 C7BL/6 인자 VIII-넉아웃(FVIII-KO) 마우스에게 2 × 1012 vg/kg의 각각의 상기 벡터 중 하나를 정맥내로 주사하였다. 이 연구를 위한 모든 AAV8 벡터를 동시에 qPCR 방법에 의해 적정하였다.
주사 후 6주째에, 100 μl 내지 200 μl의 혈액을, 시트레이트 상에서 비-헤파린처리된 청색 모세관을 이용한 안와 천공(retro-orbital puncture)에 의해 각각의 마우스로부터 수집하였다(1 : 10 희석). 혈장을 4000 rpm에서 20분 동안 원심분리에 의해 제조하였다.
주사된 동물 및 미접촉 동물로부터의 혈장을 FVIII 활성 및 인간 FVIII 항원 수준(실시예 1에 기재된 바와 같은 검정)에 대해 분석하고, 항원 수준에 대한 FVIII 활성의 비(즉, 고유 활성도)를 계산하였다(도 5).
본 발명의 번호매겨진 양태
1. 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드로서, 여기서 FVIII 아미노산 서열은
a. A1/A3 도메인 계면;
b. A2/A3 도메인 계면; 또는
c. A1/C2 도메인 계면
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 도메인간 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
(i) 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하거나;
(ii) 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고;
인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 고유 활성도를 갖는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
2. 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드로서, 여기서 인자 VIII 아미노산 서열은
a. A1/A3 도메인 계면;
b. A2/A3 도메인 계면; 또는
c. A1/C2 도메인 계면
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 도메인간 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
(i) 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하거나;
(ii) 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고;
인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 갖는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
3. 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드로서, 여기서 인자 VIII 아미노산 서열은
a. A1/A3 도메인 계면;
b. A2/A3 도메인 계면; 또는
c. A1/C2 도메인 계면
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 도메인간 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
(i) 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하거나;
(ii) 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고;
인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현되는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
4. 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드로서, 여기서 인자 VIII 아미노산 서열은
a. SEQ ID NO: 1의 M662 또는 H693에 상응하는 아미노산의 치환; 또는
b. 시스테인 잔기로의 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 포함하는 아미노산의 쌍의 치환
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
1. 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 M147, S149 또는 S289에 상응하고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 E1969, E1970 또는 N1977에 상응하거나;
2. 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 T667, T669, N684, L687, I689, S695 또는 F697에 상응하고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 S1791, G1799, A1800, R1803, E1844, S1949, G1981, V1982, 또는 Y1979에 상응하거나;
3. 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 A108, T118 또는 V137에 상응하고 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 N2172, Q2329 또는 Y2332에 상응하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
5. 양태 2 내지 4 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 높은 고유 활성도를 갖는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
6. 양태 1 또는 5에 있어서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 또는 적어도 5.5배 더 높은 고유 활성도를 갖는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
7. 양태 1 또는 3 내지 5 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 높은 안정성을 갖는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
8. 양태 2 또는 7에 있어서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 긴 반감기를 갖고, 선택적으로 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 긴 반감기를 갖는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
9. 양태 8에 있어서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드의 반감기의 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배 또는 적어도 3배의 더 긴 반감기를 갖고/갖거나 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드의 반감기의 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배 또는 적어도 3배의 활성화될 때의 반감기를 갖는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
10. 양태 8 또는 9에 있어서, 더 긴 반감기는 혈장에서의 더 긴 반감기인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
11. 양태 1, 2 또는 4 내지 6 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현되는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
12. 양태 11에 있어서, 발현되는 인자 VIII 폴리펩타이드의 수준은 숙주 세포에 의해 분비되는 FVIII 폴리펩타이드의 수준인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
13. 양태 11 또는 12에 있어서, 숙주 세포는 인간 간 세포인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
14. 양태 13에 있어서, 인간 간 세포는 Huh7 세포인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
15. 양태 11에 있어서, 발현되는 인자 VIII 폴리펩타이드의 수준은 생체 내 발현인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
16. 양태 1 내지 15 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에서, 인자 VIII 폴리펩타이드의 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하지만 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하지 않는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 고유 활성도 및/또는 더 높은 안정성을 갖고/갖거나 더 높은 수준으로 발현되는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
17. 양태 16에 있어서, 기준 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1, 3 또는 5의 인자 VIII 폴리펩타이드인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
18. 양태 1 내지 17 중 어느 한 양태에 있어서, 도메인간 계면에서의 하나 이상의 치환 돌연변이는 활성화될 때 인자 VIII 폴리펩타이드의 각각의 도메인의 상호작용을 안정화시키는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
19. 양태 18에 있어서, 하나 이상의 산 치환 돌연변이 중 적어도 하나는 각각의 도메인의 아미노산 측쇄 사이에서 파이-적층 상호작용을 증가시키는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
20. 양태 18 또는 19에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이 중 적어도 하나는 각각의 도메인의 아미노산 측쇄 사이에서 소수성 패킹을 증가시키는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
21. 양태 18 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이 중 적어도 하나는 각각의 도메인의 아미노산 측쇄 사이에서 입체 충돌(steric clashing) 및/또는 선호하지 않는 정전기 상호작용을 감소시키는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
22. 양태 1 내지 3 또는 5 내지 21 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 도메인간 계면에 하나 이상의 표면-접근 불능 아미노산의 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
23. 양태 1 내지 3 또는 5 내지 22 중 어느 한 양태에 있어서, 더 소수성 아미노산으로 치환되는 아미노산은 메티오닌 또는 히스티딘인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
24. 양태 1 내지 3 또는 5 내지 23 중 어느 한 양태에 있어서, 더 소수성 아미노산으로 치환되는 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 위치 662의 아미노산에 상응하는 메티오닌 또는 SEQ ID NO: 1의 위치 693의 아미노산에 상응하는 히스티딘인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
25. 양태 1 내지 24 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662C 치환을 포함하지 않는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
26. 양태 1 내지 25 중 어느 한 양태에 있어서,
a. 하나 이상의 치환 돌연변이는 티로신, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판으로의 메티오닌의 치환을 포함하고/하거나;
b. 하나 이상의 치환 돌연변이는 글루타메이트, 시스테인, 발린, 메티오닌, 티로신, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 또는 트립토판으로의 히스티딘의 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
27. 양태 1 내지 26 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 방향족 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
28. 양태 1 내지 27 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662W 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
29. 양태 1 내지 28 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 H693W 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
30. 양태 1 내지 29 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662W 및 H693W 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
31. 양태 1 내지 30 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고, 시스테인 잔기는 각각의 도메인 사이에 이황화 결합을 형성하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
32. 양태 1 내지 31 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고, 아미노산의 쌍은 A1 및 A3 도메인에 존재하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
33. 양태 1 내지 32 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하며, 아미노산의 쌍은 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 포함하고, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 M147, S149 또는 S289에 상응하며 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 E1969, E1970 또는 N1977에 상응하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
34. 양태 1 내지 33 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고, 하나 이상의 치환 돌연변이는 (i) S289C와 N1977C, (ii) M147C와 E1970C, 및 (iii) S149C와 E1969C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
35. 양태 1 내지 31 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고, 아미노산의 쌍은 A2 및 A3 도메인에 존재하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
36. 양태 1 내지 31 또는 35 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하며, 아미노산의 쌍은 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 포함하고, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 T667, T669, N684, L687, I689, S695 또는 F697에 상응하며 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 S1791, G1799, A1800, R1803, E1844, S1949, G1981, V1982, 또는 Y1979에 상응하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
37. 양태 1 내지 31, 35 또는 36 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고, 하나 이상의 치환 돌연변이는 (i) T669C와 V1982C, (ii) L687C와 A1800C, (iii) I689C와 G1799C, (iv) F697C와 S1949C, (v) T667C와 G1981C, (vi) T669C와 Y1979C, (vii) N684C와 S1791C, (viii) L687C와 R1803C, 및 (ix) S695C와 E1844C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
38. 양태 1 내지 31 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고, 아미노산의 쌍은 A1 및 C2 도메인에 존재하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
39. 양태 1 내지 31 또는 38 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하며, 아미노산의 쌍은 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 포함하고, 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 A108, T118 또는 V137에 상응하며 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 N2172, Q2329 또는 Y2332에 상응하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
40. 양태 1 내지 31, 38 또는 39 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고, 하나 이상의 치환 돌연변이는 (i) A108C와 Q2329C, (ii) T118C와 N2172C, 및 (iii) V137C와 Y2332C로 이루어진 목록으로부터 선택되는 치환 돌연변이의 쌍을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
41. 양태 1 내지 40 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 치환 돌연변이는 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성화를 저해하지 않는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
42. 양태 1 내지 41 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1, 3 또는 5로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, 3 또는 5의 적어도 1349개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
43. 양태 1 내지 42 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 폴리펩타이드는 베타 도메인 결실(BDD) 인자 VIII 폴리펩타이드인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
44. 양태 1 내지 43 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 722 및 1670 내지 2332에 상응하는 아미노산을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
45. 양태 44에 있어서, 인자 VIII 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 731 및 1670 내지 2332에 상응하는 아미노산을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
46. 양태 1 내지 43 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한, 인자 VIII 폴리펩타이드.
47. 양태 1 내지 46 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 28로 표시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 28로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
48. 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 양태 1 내지 47 중 어느 한 양태에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
49. 양태 48에 있어서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 코돈-최적화되는, 폴리뉴클레오타이드.
50. 양태 48 또는 49에 있어서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 인간 간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는, 폴리뉴클레오타이드.
51. 양태 50에 있어서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 인자 VIII 폴리펩타이드는 인간 간 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 더 높은 수준으로 발현되는, 폴리뉴클레오타이드.
52. 양태 50 또는 51에 있어서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 인자 VIII 폴리펩타이드는 인간 간 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 높게 발현되는, 폴리뉴클레오타이드.
53. 양태 51 또는 52에 있어서, 기준 야생형 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 2의 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열인, 폴리뉴클레오타이드.
54. 양태 49 내지 53 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 31로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열, 또는 SEQ ID NO: 31의 적어도 4047개 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
55. 양태 49 내지 54 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 29로 표시된 뉴클레오타이드 서열 또는 SEQ ID NO: 29로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
56. 양태 49 내지 55 중 어느 한 양태에 따른 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 AAV 작제물.
57. 양태 56에 있어서, 4900개 미만의 뉴클레오타이드 길이인, 재조합 AAV 작제물.
58. 양태 57에 있어서, 4700 내지 4900개, 4700 내지 4850개, 4700 내지 4800개, 4700 내지 4750개 또는 대략 4713개 뉴클레오타이드 길이인, 재조합 AAV 작제물.
59. 양태 56 내지 58 중 어느 한 양태에 있어서, 재조합 AAV 작제물은 단일-가닥인, 재조합 AAV 작제물.
60. 양태 56 내지 59 중 어느 한 양태에 있어서, 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 전사 조절 요소 및/또는 polyA 서열에 작동 가능하게 연결되는, 재조합 AAV 작제물.
61. 양태 60에 있어서, 전사 조절 요소는 SEQ ID NO: 13 또는 14로 표시된 서열을 갖는, 재조합 AAV 작제물.
62. 양태 60 또는 61에 있어서, polyA 서열은 SEQ ID NO: 22로 표시된 서열을 갖는, 재조합 AAV 작제물.
63. 양태 56 내지 62 중 어느 한 양태에 있어서, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 재조합 AAV 작제물.
64. 양태 63에 있어서, 신호 펩타이드는 야생형 인자 VIII 신호 펩타이드인, 재조합 AAV 작제물.
65. 양태 64에 있어서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 15를 포함하거나, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17을 포함하는, 재조합 AAV 작제물.
66. 양태 63에 있어서, 신호 펩타이드는 야생형 인자 VIII 신호 펩타이드가 아닌, 재조합 AAV 작제물.
67. 양태 66에 있어서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 18 또는 20을 포함하거나, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 19 또는 21을 포함하는, 재조합 AAV 작제물.
68. 양태 56 내지 67 중 어느 한 양태에 있어서, 1 또는 2개의 ITR(들)을 추가로 포함하는, 재조합 AAV 작제물.
69. 양태 68에 있어서, 이러한 또는 각각의 ITR의 뉴클레오타이드 서열은 157개 미만, 154개 미만, 또는 대략 145개 뉴클레오타이드 길이인, 재조합 AAV 작제물.
70. 양태 68 또는 69에 있어서, 이러한 또는 각각의 ITR은 야생형 ITR이고/이거나 이러한 또는 각각의 ITR은 AAV2 ITR인, 재조합 AAV 작제물.
71. 양태 68 내지 70 중 어느 한 양태에 있어서, 이러한 또는 각각의 ITR의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 23 또는 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 작제물.
72. 양태 56 내지 71 중 어느 한 양태에 있어서, AAV 작제물은 AAV 게놈인, 재조합 AAV 작제물.
73. 양태 56 내지 72 중 어느 한 양태에 있어서, AAV 작제물은 SEQ ID NO: 27로 표시된 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 재조합 AAV 작제물.
74. 양태 56 내지 73 중 어느 한 양태에 따른 재조합 AAV 작제물을 포함하는 AAV 바이러스 입자.
75. 양태 74에 있어서, 바이러스 입자는 캡시드를 포함하는, AAV 바이러스 입자.
76. 양태 75에 있어서, 캡시드는
(i) SEQ ID NO: 25와 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 캡시드;
(ii) SEQ ID NO: 26과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 캡시드;
(iii) 간-회귀성 캡시드; 및
(iv) AAV5 캡시드
로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV 바이러스 입자.
77. 양태 75에 있어서, 캡시드는
(i) SEQ ID NO: 47과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 캡시드;
(ii) SEQ ID NO: 48과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 캡시드; 및
(iii) AAV6 캡시드
로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV 바이러스 캡시드.
77. 양태 1 내지 76 중 어느 한 양태에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, 또는 AAV 바이러스 입자, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
78. 치료 방법에 사용하기 위한, 양태 1 내지 77 중 어느 한 양태에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물.
79. 양태 78에 있어서, 치료 방법은 유효량의 양태 1 내지 77 중 어느 한 양태에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 또는 AAV 바이러스 입자를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물.
80. 유효량의 양태 1 내지 77 중 어느 한 양태에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 또는 AAV 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
81. 치료 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 양태 1 내지 77 중 어느 한 양태에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 또는 AAV 바이러스 입자 또는 조성물의 용도.
82. 양태 80에 있어서, 치료 방법은 유효량의 양태 1 내지 77 중 어느 한 양태에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 또는 AAV 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
83. 양태 78 내지 82 중 어느 한 양태에 있어서, 치료 방법은 혈우병을 치료하는 방법인, 사용하기 위한 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 AAV 바이러스 입자 또는 조성물, 방법 또는 용도.
84. 양태 78 내지 83 중 어느 한 양태에 있어서, 치료 방법은 A형 혈우병을 치료하는 방법인, 사용하기 위한 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 AAV 바이러스 입자 또는 조성물, 방법 또는 용도.
SEQUENCE LISTING <110> Freeline Therapeutics Limited <120> Factor VIII polypeptide <130> N416596WO <150> 1915955.7 <151> 2019-11-01 <150> 1915956.5 <151> 2019-11-01 <150> 1917925.8 <151> 2019-12-06 <150> 2006250.1 <151> 2020-04-28 <150> 1915953.2 <151> 2019-11-01 <150> 1917926.6 <151> 2019-12-06 <150> 1917927.4 <151> 2019-12-06 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys 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Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 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Codon-optimised nucleotide sequence encoding native FVIII signal peptide <400> 17 atgcagattg agctctccac ctgcttcttc ctctgcctct tgagattctg tttctct 57 <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of SP5 <400> 18 Met Lys Leu Leu Ala Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Ile Cys Ser Leu 1 5 10 15 Glu Gly <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding SP5 <400> 19 atgaagctgc tcgcagcaac tgtgctactc ctcaccatct gcagccttga agga 54 <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of SP10 <400> 20 Met Lys Trp Val Trp Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Gly Ser Gly 1 5 10 15 Arg Ala <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding SP10 <400> 21 atgaagtggg tgtgggcgct cttgctgttg gcggcgctgg gcagcggccg cgcg 54 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PolyA sequence (SpA; 49 bp) <400> 22 aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49 <210> 23 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV2 5' ITR sequence <400> 23 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145 <210> 24 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV2 3' ITR sequence <400> 24 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 25 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of AAV capsid <400> 25 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu 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agggcaacca 4380 ggattccttc acccctgtgg tgaatagcct ggatccccca ctgctgacca gatacctgag 4440 aatccacccc cagtcctggg ttcaccagat tgccctgaga atggaggtgc tgggctgtga 4500 ggcccaggac ctgtactgaa ataaaagatc tttattttca ttagatctgt gtgttggttt 4560 tttgtgtgag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 4620 cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 4680 gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caa 4713 <210> 28 <211> 1394 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> FVIII 26-96-106 amino acid sequence <400> 28 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser 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gccacaccaa tacactgaac cctgctcatg ggagacaggt cacagtgcag 2940 gagtttgcac tcttctttac catctttgat gagaccaagt cctggtattt cactgagaac 3000 atggagagga actgcagggc cccttgtaac atccagatgg aggatcccac cttcaaggaa 3060 aactacagat tccatgccat caatggctac atcatggaca ccctgccagg cctggtgatg 3120 gcccaggacc agaggatcag gtggtacctc ctgtctatgg gcagcaatga aaatatccac 3180 agcattcact tctctggaca tgtgtttact gtgaggaaga aggaggaata caagatggct 3240 ctgtacaacc tctaccctgg ggtgtttgaa acagtggaga tgctgccctc caaggctggc 3300 atctggagag tggaatgtct gattggggag catctgcatg ctggcatgag cacactgttc 3360 ctggtgtatt ccaacaagtg ccagacccca ctgggcatgg cctcaggaca tatcagggac 3420 ttccagatca ctgctagtgg acaatatgga cagtgggcac ccaagctggc cagactgcac 3480 tactcaggct ccatcaatgc ctggagtacc aaggagccct tcagctggat caaggtggac 3540 ctgctggccc ccatgattat acatggcatc aagacccagg gagctagaca gaagttcagc 3600 tccctgtaca tctcccaatt catcatcatg tactctctgg atggcaagaa atggcagacc 3660 tacagaggca atagcactgg caccctgatg gtgttttttg gaaatgttga ctcttctggc 3720 atcaagcaca acatcttcaa cccccccatc attgccagat atatcaggct ccaccccacc 3780 cactactcca taaggagcac cctgagaatg gagctgatgg gctgtgacct gaattcctgc 3840 tccatgcccc tgggcatgga atccaaggca atctctgatg cacagatcac agcctcctcc 3900 tacttcacca acatgtttgc aacctggagc ccctccaagg ccagactgca cctgcagggc 3960 aggtccaatg cttggagacc acaagtgaac aacccaaagg agtggctgca ggtggacttc 4020 cagaagacca tgaaagtgac tggagtgacc acccagggag tgaaatccct gctcactagc 4080 atgtatgtga aggaattcct gatcagtagc tctcaagatg gccaccagtg gaccctgttc 4140 ttccagaatg gcaaggtgaa ggtgtttcag ggcaaccagg attccttcac ccctgtggtg 4200 aatagcctgg atcccccact gctgaccaga tacctgagaa tccaccccca gtcctgggtt 4260 caccagattg ccctgagaat ggaggtgctg ggctgtgagg cccaggacct gtac 4314 <210> 32 <211> 4845 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> FVIII AAV construct SQ <400> 32 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctttaat taacccagcc agtggactta gcccctgttt 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actgtgaatg gctatgtgaa tagaagcctg cctgggctga taggctgtca 1080 cagaaaatct gtgtactggc atgtgattgg catgggcacc acacctgagg tgcactccat 1140 tttcctggag ggccacacct tccttgtgag aaaccacaga caagcttccc tggagatcag 1200 cccaatcacc tttctgactg ctcaaaccct cctgatggat ctgggccagt tcctgctgtt 1260 ctgtcatatc tcctcacacc agcatgatgg aatggaagct tatgtcaagg tggactcctg 1320 cccagaggaa ccacagctca gaatgaagaa caatgaggag gctgaggact atgatgatga 1380 cctgacagac tctgaaatgg atgtggtcag atttgatgat gacaacagcc cttcattcat 1440 ccaaatcaga tctgtggcca agaagcatcc caagacctgg gtgcactaca tagctgctga 1500 ggaggaggac tgggactatg cccctctggt cctggcccct gatgacagaa gctataaaag 1560 ccagtacctg aataatggcc cccagagaat tggcagaaag tacaagaaag tcagattcat 1620 ggcttacact gatgagacct tcaaaaccag ggaagccatc cagcatgagt caggcatcct 1680 gggccccctg ctgtatgggg aggttggaga taccctgctg attatcttca aaaaccaggc 1740 aagcaggccc tacaatatct accctcatgg catcactgat gtcaggccac tgtattccag 1800 aagactgcct aagggggtga agcacctgaa ggacttccca atcctgccag gggagatttt 1860 caaatacaag tggacagtga ctgtggagga tggaccaacc aagtcagatc ctagatgtct 1920 gaccagatac tactccagct ttgtgaacat ggagagagac ctggcctctg gcctgattgg 1980 ccctctgctg atctgctata aagagtcagt ggaccagaga ggcaaccaga tcatgagtga 2040 caaaagaaat gtgatcttgt tctcagtgtt tgatgagaat agatcttggt acctcacaga 2100 aaacatccag aggttcctgc ccaatccagc tggggtgcag ctggaagatc cagaattcca 2160 ggccagcaac atcatgcata gcatcaatgg ttatgtcttt gacagcctgc agctgtcagt 2220 gtgtctgcat gaagttgctt actggtatat tctgtccatt ggagcccaga cagacttcct 2280 gtctgtcttc ttctctggct acacctttaa acacaagatg gtgtatgagg acaccctgac 2340 cctgttccct ttctctgggg aaacagtgtt catgtccatg gaaaaccctg gactgtggat 2400 cctgggctgc cataacagtg acttcagaaa cagaggcatg acagccctgc tcaaggtgtc 2460 cagctgtgat aagaacacag gagactacta tgaggatagc tatgaggaca tcagtgctta 2520 cctgctgagc aagaataatg ccattgaacc caggtcattt tcccaaaatc cccctgtgct 2580 gaaaaggcac cagagggaga tcacgcgtac caccctgcag agtgaccagg aggaaattga 2640 ttatgatgac accatctctg tggaaatgaa aaaggaggat tttgacatct atgatgagga 2700 tgagaaccag agccctagaa gcttccagaa aaagactaga cactacttca ttgctgcagt 2760 ggagagactc tgggattatg gcatgagctc cagcccccat gtgctgagaa atagagctca 2820 gagtggcagt gtgccacagt tcaagaaggt ggtgtttcag gagttcactg atggctcctt 2880 cacacaacca ctttacagag gagaactgaa tgagcacctg ggcctcctgg gcccctacat 2940 cagggctgaa gtggaggata acattatggt cacatttagg aatcaggctt ccagacccta 3000 ctccttttat tcctcactca tttcctatga ggaggaccag aggcagggag ctgagcccag 3060 aaaaaatttt gtgaaaccca atgaaaccaa gacctacttc tggaaggtgc agcaccatat 3120 ggcccctacc aaggatgaat ttgactgcaa ggcttgggct tacttttctg atgtggacct 3180 tgagaaagat gtgcattcag gcctcattgg gccactgctg gtgtgccaca ccaatacact 3240 gaaccctgct catgggagac aggtcacagt gcaggagttt gcactcttct ttaccatctt 3300 tgatgagacc aagtcctggt atttcactga gaacatggag aggaactgca gggccccttg 3360 taacatccag atggaggatc ccaccttcaa ggaaaactac agattccatg ccatcaatgg 3420 ctacatcatg gacaccctgc caggcctggt gatggcccag gaccagagga tcaggtggta 3480 cctcctgtct atgggcagca atgaaaatat ccacagcatt cacttctctg gacatgtgtt 3540 tactgtgagg 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Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu 1415 1420 1425 Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1430 1435 <210> 44 <211> 1438 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> FVIII 31SS-SQ amino acid sequence <400> 44 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Cys Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His 740 745 750 Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile 755 760 765 Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp 770 775 780 Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys 785 790 795 800 Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly 805 810 815 Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser 820 825 830 Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser 835 840 845 Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 850 855 860 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr 865 870 875 880 Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile 885 890 895 Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe 900 905 910 Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His 915 920 925 Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe 930 935 940 Ser Asp Val Asp Leu Cys Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro 945 950 955 960 Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln 965 970 975 Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr 980 985 990 Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro 995 1000 1005 Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg 1010 1015 1020 Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu 1025 1030 1035 Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met 1040 1045 1050 Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val 1055 1060 1065 Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 1070 1075 1080 Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys 1085 1090 1095 Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His 1100 1105 1110 Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln 1115 1120 1125 Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile 1130 1135 1140 Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg 1145 1150 1155 Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro 1160 1165 1170 Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His 1175 1180 1185 Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr 1190 1195 1200 Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 1205 1210 1215 Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe 1220 1225 1230 Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro 1235 1240 1245 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1250 1255 1260 Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn 1265 1270 1275 Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp 1280 1285 1290 Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr 1295 1300 1305 Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn 1310 1315 1320 Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val 1325 1330 1335 Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly 1340 1345 1350 Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile 1355 1360 1365 Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn 1370 1375 1380 Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro 1385 1390 1395 Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg 1400 1405 1410 Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu 1415 1420 1425 Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1430 1435 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acids 656-667 of SEQ ID NO:1 <400> 45 Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acids 1823-1834 of SEQ ID NO:1 <400> 46 Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of LK03 capsid <400> 47 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735 <210> 48 <211> 736 <212> PRT <213> adeno-associated virus 6 <400> 48 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His 260 265 270 Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe 275 280 285 His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn 290 295 300 Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln 305 310 315 320 Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn 325 330 335 Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro 340 345 350 Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala 355 360 365 Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly 370 375 380 Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro 385 390 395 400 Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe 405 410 415 Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp 420 425 430 Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg 435 440 445 Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg 565 570 575 Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala 580 585 590 Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu 705 710 715 720 Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735

Claims (25)

  1. 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드로서,
    상기 인자 FVIII 아미노산 서열은 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하며, 상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 SEQ ID NO: 1의 M662에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하고, 상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662C 치환을 포함하지 않는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 높은 고유 활성도(specific activity)를 갖고/갖거나;
    (ii) 상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 높은 안정성을 갖고/갖거나;
    (iii) 상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 긴 반감기를 가지며, 선택적으로 상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드와 비교하여 더 긴 반감기를 갖고/갖거나;
    (iv) 상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현되는,
    인자 VIII 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 상기 기준 인자 VIII 폴리펩타이드의 고유 활성도보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 또는 적어도 5.5배 더 높은 고유 활성도를 갖는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드의 반감기의 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배 또는 적어도 3배의 더 긴 반감기를 갖고/갖거나 인자 VIII 폴리펩타이드는 활성화될 때의 상기 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드의 반감기의 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 2배, 적어도 2.2배, 적어도 2.5배, 적어도 2.8배 또는 적어도 3배의 활성화될 때의 반감기를 갖고, 선택적으로, 상기 더 긴 반감기는 혈장에서의 더 긴 반감기인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 발현되는 인자 VIII 폴리펩타이드의 수준은 숙주 세포에 의해 분비되는 FVIII 폴리펩타이드의 수준이며, 선택적으로 상기 숙주 세포는 인간 간 세포이고, 선택적으로 상기 인간 간 세포는 Huh7 세포이고/이거나;
    (ii) 발현되는 인자 VIII 폴리펩타이드의 수준은 생체 내 발현인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에서, 상기 인자 VIII 폴리펩타이드의 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하지만 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하지 않는 기준 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 고유 활성도 및/또는 더 높은 안정성을 갖고/갖거나 더 높은 수준으로 발현되고, 선택적으로 상기 기준 인자 VIII 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1, 3 또는 5의 인자 VIII 폴리펩타이드인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 트립토판, 티로신, 이소류신, 류신 또는 페닐알라닌으로의 메티오닌의 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 방향족 아미노산으로의 SEQ ID NO: 1의 M662에 상응하는 아미노산의 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662W 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 M662W 및 H693W 치환을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 상기 인자 VIII 폴리펩타이드의 활성화를 저해하지 않는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인자 VIII 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1, 3 또는 5로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, 3 또는 5의 적어도 1349개 아미노산을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 베타 도메인 결실(BDD: beta domain deleted) 인자 VIII 폴리펩타이드인, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인자 VIII 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 731 및 1670 내지 2332에 상응하는 아미노산을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인자 VIII 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 28로 표시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 28로 표시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  16. 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드로서,
    상기 인자 VIII 아미노산 서열은
    a. A1/A3 도메인 계면(interface);
    b. A2/A3 도메인 계면; 또는
    c. A1/C2 도메인 계면
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 도메인 간(inter-domain) 계면에 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
    (i) 상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 더 소수성 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하거나;
    (ii) 상기 하나 이상의 치환 돌연변이는 시스테인 잔기로의 각각의 도메인 내 아미노산 쌍의 치환을 포함하고;
    (A) 상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 고유 활성도를 갖고/갖거나;
    (B) 상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 안정성을 갖고/갖거나;
    (C) 상기 인자 VIII 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 기준 야생형 인자 VIII 폴리펩타이드보다 더 높은 수준으로 발현되는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  17. 인자 VIII 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩타이드로서,
    상기 인자 VIII 아미노산 서열은
    a. SEQ ID NO: 1의 M662 또는 H693에 상응하는 아미노산의 치환; 또는
    b. 시스테인 잔기로의 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 포함하는 아미노산의 쌍의 치환
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환 돌연변이를 포함하고,
    i. 상기 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 M147, S149 또는 S289에 상응하고 상기 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 E1969, E1970 또는 N1977에 상응하거나;
    ii. 상기 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 T667, T669, N684, L687, I689, S695 또는 F697에 상응하고 상기 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 S1791, G1799, A1800, R1803, E1844, S1949, G1981, V1982, 또는 Y1979에 상응하거나;
    iii. 상기 제1 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 A108, T118 또는 V137에 상응하고 상기 제2 아미노산은 SEQ ID NO: 1의 N2172, Q2329 또는 Y2332에 상응하는, 인자 VIII 폴리펩타이드.
  18. 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서,
    상기 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 인자 VIII 아미노산 서열을 인코딩하는 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 31로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열, 또는 SEQ ID NO: 31 또는 SEQ ID NO: 29의 적어도 4047개 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제18항 또는 제19항에 따른 인자 VIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 재조합 AAV 작제물.
  21. 제20항에 따른 재조합 AAV 작제물을 포함하는, AAV 바이러스 입자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 또는 AAV 바이러스 입자, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 조성물.
  23. 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 인자 FVIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물.
  24. A형 혈우병의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 인자 FVIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물로서, 상기 방법은 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 인자 FVIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 인자 FVIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물, AAV 바이러스 입자 또는 조성물.
  25. A형 혈우병의 치료 방법으로서,
    상기 방법은 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 인자 VIII 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 재조합 AAV 작제물 AAV, AAV 바이러스 입자 또는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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