KR20220086609A - 반응성 친화도 탐침-상호작용 발견 플랫폼 - Google Patents

Abstract

단백질, 지질, 탄수화물, 또는 핵산과 같은 생물학적 분자에 대한 리간드를 확인하기 위한 방법, 검정, 및 키트가 개시된다. 개시된 방법은 표적 정제의 난제를 회피하고 알로스테릭 결합 부위를 발견하고 표적화하기 위한 체계적인 접근법을 제공할 수 있는, 표적에 대한 정량적 결합 검정일 수 있다.

Description

반응성 친화도 탐침-상호작용 발견 플랫폼

관련 출원

본 출원은 2019년 10월 15일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제62/915,310호의 우선권의 이익을 주장한다.

약물 발견 연구에서 "약물 가능한" 표적 및 이의 상응하는 치료제를 확인하는 것은 약물 발견 연구에서 두 가지 기본적인 난제이다. 단백질과 같은 많은 생물학적 분자의 약리학은 이들의 내인성 또는 외인성 조절제가 발견되지 않았기 때문에 접근할 수 없다. 따라서, 이들이 내인성 및/또는 대리 리간드인지 여부에 관계 없이 이들 생물학적 분자의 생리학적 기능 및 약리학적 잠재력을 탐구하는 도구가 가장 중요하다.

관심있는 생물학적 거대분자에 대한 약리학적 조절제의 발견은 종종 분자의 라이브러리가 정제된 거대분자를 결합하거나 기능적으로 조절하는 이의 능력을 스크리닝함으로써 달성된다. 그러나, 다중-통과 막횡단 단백질을 포함하는 많은 부류의 생물학적 거대분자는 세포로부터의 정제에 대해 난해하며, 이들의 본래의 세포 환경에서 스크리닝되어야 한다. 이러한 세포-기반 스크리닝은 세포 생존력, 신호 전달, 또는 유전자 발현과 같은 대리 판독의 선택을 필요로 한다. 대리 세포-기반 판독을 사용하는 화합물 스크리닝에는 다음 두 가지 난제가 초래된다: (i) 다수의 히트(hit)가 표적 외 효과를 통해 간접적으로 약리학을 발휘할 것이고, (ii) 거대분자 기능의 다른 측면을 변경하는 다수의 실제 리간드를 누락할 것이다. 온전한 세포에서 관심있는 생물학적 거대분자에 대한 소분자 결합제의 직접 확인을 가능하게 하는 기술은 이러한 뛰어난 과제를 해결하고 이러한 분야에 대한 상당한 발전을 나타낼 것이다.

발명의 개요

본 발명은 생물학적 분자에 대한 리간드 후보의 스크리닝을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 반응성 친화도 탐침 상호작용 발견(reactive affinity probe interaction discovery; RAPID) 기술은 표적 정제의 난제를 회피하고 알로스테릭(allosteric) 결합 부위를 발견하고 표적화하기 위한 체계적인 접근법을 제공할 수 있는 동일 반응계에서 표적에 대한 정량적 결합 검정이다.

특정 구현예에서, 리간드를 확인하는 방법으로서, (a) 생물학적 분자와 탐침 분자를 접촉시키는 단계로서, 탐침 분자가 결합 요소, 리포터 그룹 및 반응성 모이어티를 포함하고, 탐침 분자가 결합 요소를 통해 생물학적 분자에 결합하고, 반응성 모이어티가 생물학적 분자와 공유 결합을 형성하여 접합체를 형성시키는 단계; (b) 접합체 및 리포터 그룹과 반응하는 기능성 모이어티를 포함하는 검출 가능 분자를 접촉시켜 검출 가능 접합체를 형성시키는 단계; (c) 검출 가능 접합체와 고체 지지체를 접촉시키는 단계로서, 고체 지지체가 인식 모이어티를 포함하고, 인식 모이어티가 검출 가능 접합체에 결합되어 결합된 검출 가능 접합체를 형성시키는 단계; 및 (d) 결합된 검출 가능 접합체를 검출하여 생물학적 분자에 대한 리간드로서 탐침 분자를 확인하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 개시된다.

본원에 기재된 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있는 다수의 구현예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합 요소는 소분자, 펩티드, 또는 핵산(예컨대, RNA 또는 DNA)이다. 일부 구현예에서, 결합 요소는 복수의 결합 요소를 포함하는 라이브러리의 구성요소이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 3 대 규칙을 만족하는 것으로 규정될 수 있는 소분자 단편의 라이브러리를 포함한다: 분자량 ≤ 300Da, cLogP ≤ 3, 수소 결합 공여체 ≤ 3, 및 수소 결합 수용체 ≤ 3. 예시적인 라이브러리는 다음을 포함한다: ChemBridge 단편 라이브러리, Pyramid 플랫폼 단편-기반 약물 발견, Maybridge 단편 라이브러리, AnalytiCon로부터의 FRGx, AnCoreX로부터의 TCI-Frag, ASINEX로부터의 Bio Building Blocks, Charles River로부터의 BioFocus 3D, Emerald Bio로부터의 Fragments of Life (FOL), Enamine 단편 라이브러리, IOTA Diverse 1500, BIONET 단편 라이브러리, Life Chemicals Fragments Collection, OTAVA 단편 라이브러리, Prestwick 단편 라이브러리, Selcia 단편 라이브러리, TimTec 단편-기반 라이브러리, Vitas-M Laboratory로부터의 Allium, 또는 Zenobia 단편 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 단백질이다. 일부 구현예에서, 반응성 모이어티는 단백질의 아미노산과 공유 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 지질, 탄수화물, 또는 핵산(예컨대, RNA 또는 DNA)이다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 에피토프 태그, 예를 들어, FLAG, 6xHis, HA, c-myc, 글루타티온-S-트랜스페라제, Strep-태그, 말토스-결합 단백질, 키틴-결합 단백질, S-태그, V5 태그, 또는 AviTag를 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 그룹은 아자디벤조사이클로옥틴, 티올, 알켄, 알킨, 아자이드, 테트라진, 트랜스-사이클로옥텐, (디페닐포스피노)아릴, (디페닐포스피노)알킬, 또는 활성화 에스테르(예를 들어, 하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 에스테르)를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응성 모이어티는 광가교제 기, 설포닐 플루오라이드, 플루오로설페이트, 마이클 수용체 모이어티, 이탈기 모이어티, 또는 천연 알파 아미노산의 측쇄에서 친핵성 모이어티(예를 들어, 시스테인의 티올기, 리신의 아미노기, 세린 또는 트레오닌의 하이드록실기, 또는 티로신의 페놀기)와 공유 결합을 형성하는 모이어티이다. 일부 구현예에서, 검출 가능 분자는 디곡시게닌, 니켈 NTA(니트릴로트리아세트산), 발색단, 또는 발광단을 포함한다. 일부 구현예에서, 발색단은 비-형광색소 발색단, 소광제, 흡수 발색단, 형광단, 유기 염료, 무기 염료, 금속 킬레이트, 또는 형광 효소 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 가능 분자는 비오틴이다. 비오틴은 HRP, 설포태그(SulfoTag), 형광단, 또는 금속 킬레이트와 같은 스트렙타비딘 접합체에 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 기능성 모이어티는 아자디벤조사이클로옥틴, 티올, 알켄, 알킨, 아자이드, 테트라진, 트랜스-사이클로옥텐, (디페닐포스피노)아릴, (디페닐포스피노)알킬, 또는 활성화 에스테르(예를 들어, 하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 에스테르)를 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 멤브레인, 유리, 플라스틱, 합성 제조된 폴리머, 에펜도르프 튜브, 다중-웰 플레이트의 웰, 또는 표면 플라즈몬 공명 칩이다. 일부 구현예에서, 인식 모이어티는 항체, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 탄수화물 결합 단백질, 또는 지질 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항체는 생물학적 분자, 및/또는 에피토프 태그에 대항하는 항체이다.

일부 구현예에서, 단계 (d)는 ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광 검정, 형광 분석, 형광 마이크로부피 검정 기술(FMAT), 또는 세포 하 염색을 통해 결합된 검출 가능 접합체를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 분자를 포함하는 미정제 세포 추출물에서 수행되거나, 생물학적 분자를 포함하는 단백질의 리포좀 제제에서 수행되거나, 생물학적 분자를 포함하는 단리된 세포기관에서 수행되거나, 생물학적 분자를 포함하는 정제된 단백질 제제에서 수행되거나, 동일 반응계에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포-기반 검정이다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 세포는 생물학적 분자를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 단계 (b) 전에 용해된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 결합된 검출 가능 접합체의 양을 정량화하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)는 생물학적 분자에 대한 기질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자에 대한 기질의 존재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양은 기질의 부재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양보다 적다(즉, 탐침 분자는 기질-경쟁적 탐침임). 다른 구현예에서, 생물학적 분자에 대한 기질의 존재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양은 기질의 부재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양보다 많다(즉, 탐침 분자는 기질-협동적 탐침임).

도 1은 리간드 발견 및 표적 관여를 위한 세포 결합 검정에서 고처리량 스크리닝인 RAPID에 대한 일반적인 프로토콜을 예시한다.
도 2a 내지 2c는 RAPID가 표적 점유에 대한 출발점 또는 탐침으로서 오르토스테릭 및 알로스테릭 리간드를 확인함을 보여준다. 도 2a는 RAP 라이브러리의 서브세트에 의한 크레아틴 수송체의 공유 변형 정도가 매우 재현 가능함을 보여준다. 도 2b는 크레아틴 수송체 SLC6A8 ± 기질 유사체 β-구아니디노프로피온산(β-GPA)에 대한 2000 개의 RAP의 스크린을 보여준다. 대각선으로 떨어지는 점은 기질-경쟁적 또는 기질-협동적이다. 도 2c는 스크린으로부터 확인된 2 개의 RAP가 GPA 농도의 함수로서 표적의 용량-의존적 억제 또는 공유 변형 증가를 나타낸다는 것을 보여준다. IC50/EC50은 β-GPA의 확인된 억제 상수(~30 μM)에 해당한다.
도 3은 반응성 친화도 탐침 JN-1724에 의한 크레아틴 수송체 SLC6A8의 공유 불활성화 및 경쟁자 β-GPA와의 공동-투입에 의한 보호를 보여준다. 세포에 1 mM β-GPA의 존재 또는 부재에서 100 μM JN-1724를 30 분 동안 투입한 다음 365 nm 광으로 6 분 동안 조사하였다. 세포를 세척하고, SLC6A8의 잔류 수송 활성을 크레아틴 흡수 검정을 통해 측정하였다.
도 4는 β-GPA와 공동-투입함으로써 경쟁되는 반응성 친화도 탐침 JN-1724에 의한 SLC6A8의 공유 변형을 입증하는 질량 분석 데이터를 보여준다. 세포에 1 mM β-GPA의 존재 또는 부재에서 20 μM JN-1724를 30 분 동안 투입한 다음 365 nm 광으로 6 분 동안 조사하였다. 세포를 용해시키고; 비오틴을 클릭하고; 비오티닐화된 단백질을 스트렙타비딘으로 친화도-정제하고, 트립신으로 분해하고, TMT 정량화와 함께 탠덤 질량 분석법에 의해 확인하였다. SLC6A8(화살표로 가리키는 점)은 확인된 단백질 중 하나였으며, 1 mM β-GPA와의 공동-투입은 농축 수준을 80%까지 감소시켰다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 생물학적 분자에 대한 리간드 후보의 스크리닝을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 반응성 친화도 탐침 상호작용 발견(RAPID)은 표적 정제의 난제를 회피하고 알로스테릭 결합 부위를 발견하고 표적화하기 위한 체계적인 접근법을 제공할 수 있는 동일 반응계에서 표적에 대한 정량적 결합 분석이다. 본원에 기재된 RAPID 기술은 온전한 세포에서 관심있는 생물학적 거대분자에 대한 소분자 결합제의 직접 확인을 가능하게 한다.

소분자는 단백질 기능을 조사하기 위한 강력한 도구이며, 새로운 치료법의 선두로서 역할을 할 수 있다. 그러나, 대부분의 인간 단백질에는 소분자 리간드가 부족하며, 전체 단백질 부류는 약물성이 없는 것으로 간주된다. 본원에 개시된 방법은 복잡한 화합물 라이브러리의 고처리량 스크리닝을 사용하여 표적화하기 어려운 것으로 판명된 단백질과 같은 생물학적 분자에 대한 소분자 탐침을 확인할 수 있다. 가역적으로 결합하는 리간드가 일반적으로 추구되지만, 공유 단편은 결합 친화도만을 통해 표적화하기 어려운 단백질의 영역에 접근할 수 있는 것들을 포함하여 소분자 탐침에 대한 대안적인 경로를 제공한다.

특정 구현예에서, 리간드를 확인하는 방법으로서, (a) 생물학적 분자와 탐침 분자를 접촉시키는 단계로서, 탐침 분자가 결합 요소, 리포터 그룹 및 반응성 모이어티를 포함하고, 탐침 분자가 결합 요소를 통해 생물학적 분자에 결합하고, 반응성 모이어티가 생물학적 분자와 공유 결합을 형성하여 접합체를 형성시키는 단계; (b) 접합체 및 리포터 그룹과 반응하는 기능성 모이어티를 포함하는 검출 가능 분자를 접촉시켜 검출 가능 접합체를 형성시키는 단계; (c) 검출 가능 접합체와 고체 지지체를 접촉시키는 단계로서, 고체 지지체가 인식 모이어티를 포함하고, 인식 모이어티가 검출 가능 접합체에 결합되어 결합된 검출 가능 접합체를 형성시키는 단계; 및 (d) 결합된 검출 가능 접합체를 검출하여 생물학적 분자에 대한 리간드로서 탐침 분자를 확인하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 개시된다.

일부 구현예에서, 탐침 분자는 단백질 잔기와의 본유의 화학적 반응성에 의존한다. 탐침 분자는 UV 조사 시 가역적 소분자-단백질 상호작용을 안정한 공유 부가물로 전환시키는 광반응성 요소와 같은 반응성 모이어티를 가질 수 있다. 탐침 분자는 또한 알킨과 같은 리포터 그룹을 가질 수 있으며, 이는 구리-촉매작용 아자이드-알킨 고리화첨가(CuAAK 또는 "클릭") 화학에 의해 아자이드 태그에 대한 후기 접합을 허용하는 입체적으로 최소화된 대리 리포터로서 작용한다. 탐침 분자는 또한 탐침이 특정 구조적 특징을 인식하는 단백질로 향하도록 유도하는 결합 요소를 지닐 수 있다.

미국 공개 특허 출원 2017/0115303 및 2016/0252509에는 탐침 분자의 예가 기재되어 있고; 이들 간행물 각각은 그 전체가 특히 본원에 기재된 보체 경로의 억제제에 대하여 인용에 의해 본원에 포함된다.

정의

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 화학, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 세포 및 암 생물학, 신경생물학, 신경화학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 약리학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 이의 기술에 사용되는 명명법은 당분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다.

용어 "배양하는"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 배지 중에서 세포 또는 유기체의 시험관내 증식을 지칭한다. 배양물에서 성장한 세포의 후손은 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있음이 이해된다(즉, 형태학적, 유전학적 또는 표현형적). "확장된"은 세포의 임의의 증식 또는 분열을 의미한다.

용어 "감소", "저하된", "저하"또는 "억제하다"는 모두 본원에서 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, "저하시키다", "저하" 또는 "감소" 또는 "억제하다"는 전형적으로 참조 수준(예를 들어, 주어진 리간드의 부재)와 비교하여 적어도 10%까지의 감소를 의미하고, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 이상까지의 감소를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 "저하" 또는 "억제"는 참조 수준과 비교하여 완전한 억제 또는 저하를 포괄하지 않는다. "완전한 억제"는 참조 수준과 비교하여 100% 억제이다.

용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "향상시키다" 또는 "활성화시키다"는 모두 본원에서 일반적으로 통계적으로 유의한 양까지의 증가를 의미하기 위해 사용되며; 어떠한 의심의 여지를 없애기 위해, 용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "향상시키다" 또는 "활성화시키다"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 이하 증가 또는 10 내지 100%의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 적어도 약 2-배, 또는 적어도 약 3-배, 또는 적어도 약 4-배, 또는 적어도 약 5-배 또는 적어도 약 10-배 증가, 적어도 약 20-배 증가, 적어도 약 50-배 증가, 적어도 약 100-배 증가, 적어도 약 1000-배 증가 이상을 의미한다.

관사("a" 및 "an")는 관사의 문법상 대상이 1 개 또는 1 개 초과(즉, 적어도 1 개)인 것을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 1 개 초과의 요소를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "상호작용"은 두 분자 간의 상호작용을 지칭할 때 분자가 서로 물리적 접촉(예를 들어, 결합)하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 상호작용은 상기 분자 중 하나 또는 둘 모두의 활성(생물학적 효과를 생성함)을 일으킨다. 활성은 분자 중 하나 또는 둘 모두의 직접적인 활성일 수 있다(예를 들어, 신호 전달).

본원에서 사용되는 "단리된 단백질"은 세포로부터 단리되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 때 다른 단백질, 세포 물질, 분리 배지, 및 배양 배지가 실질적으로 함유하지 않는 단백질, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 지칭한다. "단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 항체, 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질을 실질적으로 함유하지 않거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 용어 "세포 물질을 실질적으로 함유하지 않는"은 표적 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린) 또는 이의 단편의 제제를 포함하며, 여기서 단백질은 단백질이 단리되거나 재조합으로 생산되는 세포의 세포 구성요소로부터 분리된다. 일 구현예에서, 용어 "세포 물질을 실질적으로 함유하지 않는"은 약 30%(건조 중량 기준) 미만의 비표적 단백질(본원에서 "오염 단백질"로도 지칭됨), 더욱 바람직하게는 약 20% 미만의 비표적 단백질, 더욱 더 바람직하게는 약 10% 미만의 비표적 단백질, 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 비표적 단백질을 갖는 표적 단백질 또는 이의 단편의 제제를 포함한다. 항체, 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 이의 생물학적 활성 단편이 재조합으로 생산될 때, 이는 또한 바람직하게는 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않고, 즉, 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만을 차지한다.

본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 전사 조절 서열과 관련하여, 작동 가능하게 연결된은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 필요한 경우 2 개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 인접하고 판독 프레임에 있음을 의미한다. 스위치 서열의 경우, 작동 가능하게 연결된은 서열이 스위치 재조합에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.

스크리닝 검정

본 발명은 생물학적 분자에 대한 리간드 후보의 스크리닝을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 반응성 친화도 탐침 상호작용 발견(RAPID)은 표적 정제의 난제를 회피하고 알로스테릭 결합 부위를 발견하고 표적화하기 위한 체계적인 접근법을 제공할 수 있는 동일 반응계에서 표적에 대한 정량적 결합 검정이다.

특정 구현예에서, 리간드를 확인하는 방법으로서, (a) 생물학적 분자와 탐침 분자를 접촉시키는 단계로서, 탐침 분자가 결합 요소, 리포터 그룹 및 반응성 모이어티를 포함하고, 탐침 분자가 결합 요소를 통해 생물학적 분자에 결합하고, 반응성 모이어티가 생물학적 분자와 공유 결합을 형성하여 접합체를 형성시키는 단계; (b) 접합체 및 리포터 그룹과 반응하는 기능성 모이어티를 포함하는 검출 가능 분자를 접촉시켜 검출 가능 접합체를 형성시키는 단계; (c) 검출 가능 접합체와 고체 지지체를 접촉시키는 단계로서, 고체 지지체가 인식 모이어티를 포함하고, 인식 모이어티가 검출 가능 접합체에 결합되어 결합된 검출 가능 접합체를 형성시키는 단계; 및 (d) 결합된 검출 가능 접합체를 검출하여 생물학적 분자에 대한 리간드로서 탐침 분자를 확인하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 개시된다.

본원에 기재된 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있는 다수의 구현예가 추가로 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합 요소는 소분자, 펩티드, 또는 핵산(예컨대, RNA 또는 DNA)이다. 일부 구현예에서, 결합 요소는 복수의 결합 요소를 포함하는 라이브러리의 구성요소이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 ChemBridge 단편 라이브러리, Pyramid 플랫폼 단편-기반 약물 발견, Maybridge 단편 라이브러리, AnalytiCon로부터의 FRGx, AnCoreX로부터의 TCI-Frag, ASINEX로부터의 Bio Building Blocks, Charles River로부터의 BioFocus 3D, Emerald Bio로부터의 Fragments of Life (FOL), Enamine 단편 라이브러리, IOTA Diverse 1500, BIONET 단편 라이브러리, Life Chemicals Fragments Collection, OTAVA 단편 라이브러리, Prestwick 단편 라이브러리, Selcia 단편 라이브러리, TimTec 단편-기반 라이브러리, Vitas-M Laboratory로부터의 Allium, 또는 Zenobia 단편 라이브러리를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 단백질이다. 일부 구현예에서, 반응성 모이어티는 단백질의 아미노산과 공유 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 지질, 탄수화물, 또는 핵산(예컨대, RNA 또는 DNA)이다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 에피토프 태그, 예를 들어, FLAG, 6xHis, HA, c-myc, 글루타티온-S-트랜스페라제, Strep-태그, 말토스-결합 단백질, 키틴-결합 단백질, S-태그, V5 태그, 또는 AviTag를 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 그룹은 아자디벤조사이클로옥틴, 티올, 알켄, 알킨, 아자이드, 테트라진, 트랜스-사이클로옥텐, (디페닐포스피노)아릴, (디페닐포스피노)알킬, 또는 활성화 에스테르(예를 들어, 하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 에스테르)를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응성 모이어티는 광가교제 기, 설포닐 플루오라이드, 플루오로설페이트, 마이클 수용체 모이어티, 이탈기 모이어티, 또는 천연 알파 아미노산의 측쇄에서 친핵성 모이어티(예를 들어, 시스테인의 티올기, 리신의 아미노기, 세린 또는 트레오닌의 하이드록실기, 또는 티로신의 페놀기)와 공유 결합을 형성하는 모이어티이다. 일부 구현예에서, 검출 가능 분자는 디곡시게닌, 니켈 NTA(니트릴로트리아세트산), 발색단, 또는 발광단을 포함한다. 일부 구현예에서, 발색단은 비-형광색소 발색단, 소광제, 흡수 발색단, 형광단, 유기 염료, 무기 염료, 금속 킬레이트, 또는 형광 효소 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 가능 분자는 비오틴이다. 비오틴은 HRP, 설포태그, 형광단, 또는 금속 킬레이트와 같은 스트렙타비딘 접합체에 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 기능성 모이어티는 아자디벤조사이클로옥틴, 티올, 알켄, 알킨, 아자이드, 테트라진, 트랜스-사이클로옥텐, (디페닐포스피노)아릴, (디페닐포스피노)알킬, 또는 활성화 에스테르(예를 들어, 하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 에스테르)를 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 멤브레인, 유리, 플라스틱, 합성 제조된 폴리머, 에펜도르프 튜브, 다중-웰 플레이트의 웰, 또는 표면 플라즈몬 공명 칩이다. 일부 구현예에서, 인식 모이어티는 항체, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 탄수화물 결합 단백질, 또는 지질 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항체는 생물학적 분자, 및/또는 에피토프 태그에 대항하는 항체이다.

일부 구현예에서, 단계 (d)는 ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광 검정, 형광 분석, 형광 마이크로부피 검정 기술(FMAT), 또는 세포 하 염색을 통해 결합된 검출 가능 접합체를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 분자를 포함하는 미정제 세포 추출물에서 수행되거나, 생물학적 분자를 포함하는 단백질의 리포좀 제제에서 수행되거나, 생물학적 분자를 포함하는 단리된 세포기관에서 수행되거나, 생물학적 분자를 포함하는 정제된 단백질 제제에서 수행되거나, 동일 반응계에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포-기반 검정이다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 세포는 생물학적 분자를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 단계 (b) 전에 용해된다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 결합된 검출 가능 접합체의 양을 정량화하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (a)는 생물학적 분자에 대한 기질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자에 대한 기질의 존재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양은 기질의 부재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양보다 적다(즉, 탐침 분자는 기질-경쟁적 탐침임). 다른 구현예에서, 생물학적 분자에 대한 기질의 존재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양은 기질의 부재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양보다 많다(즉, 탐침 분자는 기질-협동적 탐침임).

본원에서 사용되는 용어 "탐침" 또는 "시험 화합물" 또는 "후보 작용제"는 세포에 대한 효과를 갖는 이들의 능력에 대해 스크리닝될 작용제 또는 작용제의 집합체(예를 들어, 화합물)을 지칭한다. 시험 화합물은 화합물, 화합물들의 혼합물, 예를 들어, 다당류, 유기 또는 무기 소분자(예를 들어, 2000 달톤 미만, 1000 달톤 미만, 1500 달톤 미만, 1000 달톤 미만, 또는 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자), 생물학적 거대분자, 예를 들어, 펩티드, 단백질, 펩티드 유사체, 및 이의 유사체 및 유도체, 펩티도미메틱, 핵산, 핵산 유사체 및 유도체, 생물학적 물질, 예컨대, 세균, 식물, 진균류, 또는 동물 세포 또는 조직으로부터 제조된 추출물, 천연 또는 합성 조성물을 포함하는 매우 다양한 여러 화합물을 포함할 수 있다.

실행되는 특정 구현예에 따라, 탐침은 용액 중에 자유롭게 제공될 수 있거나, 담체, 또는 고체 지지체, 예를 들어, 비드에 부착될 수 있다. 탐침의 고정화를 위해 다수의 적합한 고체 지지체가 사용될 수 있다. 적합한 고체 지지체의 예는 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란(즉, 세파덱스(Sephadex), 세파로스(Sepharose)로서 상업적으로 입수 가능), 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 여과지, 니트로셀룰로스, 이온 교환 수지, 플라스틱 필름, 폴리아민메틸비닐에테르 말레산 코폴리머, 유리 비드, 아미노산 코폴리머, 에틸렌-말레산 코폴리머, 나일론, 실크 등을 포함한다. 추가로, 본원에 기재된 방법을 위해, 탐침은 개별적으로 또는 그룹으로 스크리닝될 수 있다. 그룹 스크리닝은 유효 탐침에 대한 적중률이 낮은 것으로 예상되어 주어진 그룹에 대해 하나 초과의 양성 결과가 예상되지 않을 경우에 특히 유용하다.

우수한 리드 화합물과 상관 관계가 있는 소분자의 성질은 당업계에 널리 공지되어 있다. Lipinski의 5대 규칙은 경구로 생체이용 가능한 약물 후보의 개발을 위한 기본 틀을 제공하였다. 이러한 규칙은 회전 가능한 결합 수(NROT)가 중요한 매개변수이며, 최대 7 개가 경구 생체 이용률에 최적인 것으로 보인다는 발견으로 강화되었다. 극성 표면적(PSA)은 또 다른 주요 성질일 수 있고; PSA가 110 내지 140 Å2인 수동 흡수 분자는 경구 생체이용률이 낮은 것으로 사료된다. 최근, 최적화에 적합하고 Lipinski 값과 비교하여 상대적으로 '축소된' 성질을 갖는 HTS 캠페인에서 확인된 분자에 대해 용어 '리드-유사(lead-like)'가 도입되었다. 문헌의 본문은 약물-크기 화합물 라이브러리를 스크리닝하여 발견된 화합물이 직면한 문제를 다루고 있다. 최근에 신규한 대안적 접근법이 등장했으며, 이는 '단편-기반' 발견으로 지칭된다(Carr, R. and Jhoti, H. (2002) Structure-based screening of low-affinity compounds. Drug Discov. Today 7, 522-527; Erlanson, D.A. et al. (2000) Site-directed ligand discovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 9367-72; Vetter, D. (2002) Chemical microarrays, fragment diversity, label-free imaging by plasmon resonance-a chemical genomics approach. J. Cell. Biochem. 39, 79-84). 이러한 접근법을 이용하여, 확인된 히트는 일반적으로 '3 대 규칙'을 따르며, 이는 리드 생성을 위한 단편 라이브러리 구성에 유용한 규칙일 수 있다.

이러한 접근법은 고처리량 X-선 결정학을 사용하여 스크리닝된 단편 라이브러리(MW 100 내지 250 Da)로 시작된다. 이들 단편은 단백질에서 주요 결합 상호작용을 탐침하지만, 이들이 효율적으로 결합하는 것을 막을 바람직하지 않은 상호작용(전자 또는 입체)의 가능성을 최소화하기에 충분히 작다(Hann, M. et al. (2001) Molecular complexity and its impact on the probability of finding leads for drug discovery. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41, 856-864). 단백질에서 이들 소리간드의 결합 모드는 이후 전자 밀도 맵의 해석에 의해 규정된다. X-선 결정학은 약한 상호 작용(μM-mM)을 확인하는 데 매우 효과적이므로 생물학적 검정에서 측정 가능한 활성이 없는 단편 히트가 확인될 수 있다. 단편 라이브러리는 화학적 다양성을 샘플링하거나 단백질에 대한 특정 상호작용을 표적화도록 구성될 수 있다. 키나제 및 프로테아제에 대한 두 유형 모두의 단편 라이브러리의 스크리닝, 및 강력한 리드 화합물로의 히트의 후속 최적화는 성공적인 히트가 특정 물리화학적 성질을 나타낸다는 것을 지시한다.

다양한 단편 히트 세트의 분석은 이러한 히트가 평균적으로 '3 대 규칙'을 따르는 것을 나타냈으며, 여기서 분자량은 < 300이고, 수소 결합 도너의의 수는 ≤ 3이고, 수소 결합 억셉터의 수는 ≤ 3이고, ClogP는 ≤ 3였다. 또한, 결과는 NROT(≤3) 및 PSA(≤60)가 또한 단편 선택을 위한 유용한 기준일 수 있음을 시사했다. 이러한 데이터는 효율적인 리드 발견을 위해 단편 라이브러리를 구성할 때 '3 대 규칙'이 유용할 수 있음을 암시한다.

다수의 소분자 라이브러리가 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 입수 가능하다. 이러한 소분자 라이브러리는 본원에 기재된 스크리닝 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 화학 라이브러리 또는 화합물 라이브러리는 특정 효과에 대해 후보 물질을 스크리닝하기 위해 본원에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있는 저장된 화학 물질의 집합체이다. 화학적 라이브러리는 각 화합물의 화학 구조, 순도, 양, 및 물리화학적 특징에 관한 정보를 포함한다. 화합물 라이브러리는 특히, 예를 들어, Enzo Life Sciences, Aurora Fine Chemicals, Exclusive Chemistry Ltd., ChemDiv, ChemBridge, TimTec Inc., AsisChem, 및 Princeton Biomolecular Research로부터 상업적으로 입수될 수 있다.

제한 없이, 화합물은 적절한 기간에 걸쳐 대조군에 비해 세포에 영향을 미칠 수 있는 임의의 농도에서 시험될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 약 0.01 nM 내지 약 100 mM, 약 0.1 nM 내지 약 500 microM, 약 0.1 microM 내지 약 20 microM, 약 0.1 microM 내지 약 10 microM, 또는 약 0.1 microM 내지 약 5 microM 범위의 농도에서 시험된다.

화합물 스크리닝 검정은 고처리량 스크린에서 사용될 수 있다. 고처리량 스크리닝은 주어진 활성에 대해 화합물 라이브러리를 시험하는 절차이다. 고처리량 스크리닝은 다수의 화합물을 빠르고 동시에 스크리닝하는 것을 추구한다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트와 자동화된 분석 장비를 사용하여 실험실은 1 일 100,000 회 이상만큼 많이 검정을 동시에 수행할 수 있다.

스크리닝 검정에 이어 확인된 시험 화합물이 의도된 용도에 바람직한 성질을 갖는지의 여부를 추가로 확인하기 위해 후속 검정이 이어질 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 검정에 이어 생체 이용률, 독성 또는 약동학 중 어느 하나의 측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 검정이 수행될 수 있지만, 이들 방법으로 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 리간드를 확인하기 위한 키트를 포괄한다. 본 발명의 키트는 또한 본원에 제공된 바와 같은 개시된 발명의 방법에서 개시된 발명의 키트 또는 탐침의 용도를 개시하거나 기술하는 지침 자료를 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하는 추가 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 추가로 표지를 검출하는 수단(예를 들어, 효소 표지를 위한 효소 기질, 형광 표지를 검출하기 위한 필터 세트, 양 항-마우스-HRP 등과 같은 적절한 2차 표지 등) 및 대조에 필요한 시약(예를 들어, 대조 생물학적 샘플 또는 표준)을 함유할 수 있다. 키트는 추가로 개시된 발명의 방법에 사용하기 위해 인식되는 완충제 및 다른 시약을 포함할 수 있다. 비-제한적인 예는 담체 단백질 또는 세제와 같은 비특이적 결합을 감소시키는 작용제를 포함한다.

"키트"는 본 발명의 마커의 발현을 특이적으로 검출 및/또는 영향을 주기 위한 적어도 하나의 시약, 예를 들어, 탐침 또는 소분자를 포함하는 임의의 제조물(예를 들어, 패키지 또는 용기)이다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 촉진, 유통, 또는 판매될 수 있다. 키트는 본 발명의 방법에 유용한 조성물을 발현시키는 데 필요한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 키트는 참조 표준을 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 공통 분자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다수의 이러한 대조를 구상할 수 있다. 키트의 시약은 개별 용기에 제공되거나 단일 용기에 둘 이상의 시약의 혼합물로 제공될 수 있다. 또한, 키트 내의 조성물의 사용을 설명하는 지침 자료가 포함될 수 있다.

실시예

실시예 1: 친화도 태그 표적에 대한 RAP 라이브러리를 스크리닝하기 위한 RAPID 프로토콜

포획 플레이트 제조:

Greiner HiBind 플레이트(Sigma Aldrich Cat. No. M4561-40EA)를 포획 항체로 코팅하였다. 단백질A(Thermo, Cat. No. 101100)를 50% 글리세롤/PBS에 의해 5 mg/mL로 이를 제구성하고, 이를 코팅 완충액(Thermo, BupH™ 카보네이트-바이카보네이트 완충액 팩)에 1:500 희석함으로써 제조하였다. 플레이트를 100 uL의 코팅 완충액으로 1 회 세척하고 6 개 세트로 측면에 배치하였다. 50 μL의 단백질A를 모든 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 스탬핑된 플레이트를 4℃ 델리 냉장고에 밤새 두었다. 다음날 아침, 단백질A 코팅 플레이트를 100 μL의 코팅 완충액으로 2 회 세척하였다. 200 μL의 Superblock(Thermo Fisher Cat. No. 37515)을 모든 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 포획 플레이트를 2 시간 동안 차단한 후, 모든 플레이트를 PBS/T로 3 회 세척하였다. SuperBlock 완충액 중 1 μg/mL의 포획 항체 135 mL를 제조하였다. 50 μL의 제조된 항체를 모든 포획 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다.

용해물 플레이트 제조:

HEK293T 세포주의 경우, 96-웰 플레이트 당 7.5 M 세포를 사용하였다. 24 개의 96-웰 플레이트를 폴리-D-리신(Sigma Aldrich Cat. No. P7280-5MG)으로 코팅하고, 세척하였다. 그 후에, 웰 당 75 K 세포를 플레이팅하고, 세포가 부착되도록 밤새 인큐베이션하였다. RAP 투입 플레이트를 요망되는 최종 농도의 4x로 세포 영상화 배지로 재구성하였다. 한 번에 하나씩 각 세포 플레이트에서 배지를 제거하고 200 μL의 세포 영상화 배지(CIM)(Thermo, cat. no. A14291DJ)를 분배하였다. 다음으로, 각 플레이트에 대해 200 μL의 CIM을 제거하고, 즉시 75μL의 CIM을 첨가하였다. 일단 세포를 세척하고 75 μL의 CIM을 각 플레이트에 분배한 후, 25 μL의 재구성된 RAP를 첨가하고, 세포를 37℃ 세포 인큐베이터에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 세포가 배양되는 동안, 용해 완충액(~10 mL/플레이트)을 12.5 mL의 20% DDM(Anatrace Cat. No. D310 25 GM), 250 mL의 Hepes 완충 식염수 및 5 개의 완전한 프로테아제 정제(Sigma Aldrich Cat. No. 4693132001)를 첨가함으로써 제조하였다. 플레이트를 UV 가교제(Spectrolinker Cat. No. 1195T76)에서 조사하였다. 3 분 동안 조사한 후, 배지를 제거하고, 세포를 200 μL의 CIM으로 세척하여 과량의 RAP를 제거하였다. 그 후에, CIM을 각 플레이트에서 제거하고, 100 μL의 용해 완충액을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 용해를 완료하였다.

리포터 비오틴을 총 140 mL의 클릭 믹스에 대해 각 시약을 30 mL로 제조하여 구리 촉매작용된 아자이드 알킨 고리화첨가를 사용하여 RAP의 알킨에 부착하였다. 이는 600 mg의 THPTA (Click Chemistry Tools Cat. No. 1010-5G), 600 mg의 아스코르베이트 (Sigma Aldrich Cat. No. 11140-50G), 및 120 mg의 구리 설페이트 (Sigma Aldrich Cat. No. 451657-10G), 및 750 μL의 10 mM 피콜릴-비오틴-아자이드 (Click Chemistry Tools Cat. No. 1167-100)에 해당하였다. 각 시약을 30 mL의 물에 개별적으로 용해시킨 다음, 클릭 반응을 시작하기 직전에 시약을 다음 순서로 함께 혼합하였다: Ting -> THPTA -> 구리(청색으로 변함) -> 아스코르베이트(투명하게 변함). 40 μL의 클릭 혼합물을 모든 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 1 시간의 인큐베이션 후, 포획 항체를 300 μL의 PBS-T(Boston BioProducts Cat. No. IBB-171)의 3 회 세척으로 포획 플레이트에서 세척하였다. 클릭 반응을 웰 당 10 μL의 0.5 M EDTA(Sigma Aldrich Cat. No. 324506-100ML)를 첨가함으로써 켄칭하였다. 100 μL의 용해물을 각각의 상응하는 포획 플레이트로 옮기고, 실온에서 적어도 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 1 시간 포획 인큐베이션 후, 플레이트를 300 μL의 PBS/T로 5 회 세척하였다.

스트렙타비딘-HRP(Cell Signaling Technologies Cat. No. 3999S)을 Cell Signaling Technologies (P/N) 물질을 1:1000 희석함으로써 PBS/T에서 제조하였다. 50 μL의 제조된 스트렙타비딘-HRP를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 30 분의 스트렙타비딘 인큐베이션 후, 플레이트를 300 μL의 PBS/T로 5 회 세척하였다. 마지막 세척을 플레이트에서 유지하여 건조를 방지하였다.

Tecan을 200 uL 팁 및 TMB로 설정하였다. Tecan의 트로프를 적어도 135 uL의 TMB(Thermo Fisher Cat. No. N301)로 충전하고, Stamp 50 uL 방법을 개시하였다. 플레이트를 비우고, 적절한 순서로 Tecan에 배치하고, 방법을 수행하였다. 이 과정을 모든 플레이트가 TMB를 수용할 때까지 반복하였다. 각 플레이트를 50 μL의 0.2 N 황산으로 켄칭시켰다. 플레이트를 450 nm에서 흡광도를 정량화하는 플레이트 판독기에서 순차적으로 판독하였다.

크레아틴 수송체 SLC6A8의 기질-민감성 결합제의 확인:

태그 크레아틴 수송체 SLC6A8을 발현하는 세포를 사용하여 기질-민감성 결합제를 스크리닝하였다. 리간드 발견 및 표적 관여를 위한 세포 결합 검정에서 고처리량 스크리닝인 RAPID에 대한 일반적인 프로토콜은 도 1에 예시되어 있다.

RAPID는 표적 점유에 대한 출발점 또는 탐침으로서 오르토스테릭 및 알로스테릭 리간드를 확인하였다. RAP 라이브러리의 서브세트에 의한 크레아틴 수송체의 공유 변형 정도는 매우 재현 가능했다(도 2a). 크레아틴 수송체 SLC6A8 ± 기질 유사체 구아니디노프로피온산(GPA)에 대한 2000 개의 RAP의 스크린은 기질-민감성 결합제를 확인하였다(도 2b). 대각선으로 떨어지는 점은 기질-경쟁적 또는 기질-협동적이다. 스크린으로부터 확인된 2 개의 RAP는 GPA 농도의 함수로서 표적의 용량-의존적 억제 또는 공유 변형 증가를 나타냈다(도 2c). IC50/EC50은 GPA의 확인된 억제 상수(~30 μM)에 해당한다. 세포에 1 mM β-GPA의 존재 또는 부재에서 100 μM JN-1724를 30 분 동안 투입한 다음 365 nm 광으로 6 분 동안 조사하였다. 세포를 세척하고, SLC6A8의 잔류 수송 활성을 크레아틴 흡수 검정을 통해 측정하였다. 반응성 친화도 탐침 JN-1724에 의한 크레아틴 수송체 SLC6A8의 공유 불활성화 및 경쟁자 β-GPA와의 공동-투입에 의한 보호는 도 3에 나타나 있다.

기질-경쟁적인 RAP로 세포를 처리하는 것은 크레아틴 수송체를 정량적으로 억제하였다. 30 분의 100 μM 용량의 JN-1724에 이어서 365 nm에서 6 분의 가교는 정상 수송체의 5.7%로 크레아틴의 SLC6A8 수송체를 억제하기에 충분했다. 부가물의 비편향 질량 분석법에 의한 표적 관여를 확인하기 위해, 세포에 1 mM β-GPA의 존재 또는 부재에서 20 μM JN-1724를 30 분 동안 투입한 다음 365 nm 광으로 6 분 동안 조사하였다. 세포를 용해시키고; 비오틴을 클릭하고; 비오티닐화된 단백질을 스트렙타비딘으로 친화도-정제하고, 트립신으로 분해하고, TMT 정량화와 함께 탠덤 질량 분석법에 의해 확인하였다. SLC6A8(화살표로 가리키는 점)은 확인된 단백질 중 하나였으며, 1 mM β-GPA와의 공동-투입은 농축 수준을 80%까지 감소시켰다(도 4).

인용에 의한 포함

본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 인용에 의해 포함되어 있는 것처럼 전체가 인용에 의해 본원에 포함된다. 충돌하는 경우, 본 명세서의 임의의 정의를 포함하여, 본 출원이 우선할 것이다.

균등물

본 발명의 특정 구현예가 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적이며 제한적이지 않다. 본 발명의 다수 변형은 본 명세서 및 하기 청구범위를 검토할 때 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 균등물의 이들의 전체 범위와 함께 청구범위, 및 명세서를 참조하여 그러한 변형과 함께 결정되어야 한다.

Claims (52)

1. 리간드를 확인하는 방법으로서,
   (a) 생물학적 분자와 탐침 분자를 접촉시키는 단계로서, 상기 탐침 분자가 결합 요소, 리포터 그룹 및 반응성 모이어티를 포함하고, 상기 탐침 분자가 상기 결합 요소를 통해 상기 생물학적 분자에 결합하고, 상기 반응성 모이어티가 상기 생물학적 분자와 공유 결합을 형성하여 접합체를 형성시키는 단계;
   (b) 상기 접합체 및 상기 리포터 그룹과 반응하는 기능성 모이어티를 포함하는 검출 가능 분자를 접촉시켜 검출 가능 접합체를 형성시키는 단계;
   (c) 상기 검출 가능 접합체와 고체 지지체를 접촉시키는 단계로서, 상기 고체 지지체가 인식 모이어티를 포함하고, 상기 인식 모이어티가 상기 검출 가능 접합체에 결합되어 결합된 검출 가능 접합체를 형성시키는 단계; 및
   (d) 상기 결합된 검출 가능 접합체를 검출하여 생물학적 분자에 대한 리간드로서 탐침 분자를 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 결합 요소가 소분자인, 방법.
3. 제1항에 있어서, 결합 요소가 펩티드인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 결합 요소가 핵산인, 방법.
5. 제4항에 있어서, 핵산이 RNA 또는 DNA인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 요소가 복수의 결합 요소를 포함하는 라이브러리의 구성요소인, 방법.
7. 제6항에 있어서, 결합 요소가 소분자 단편이고; 각각의 소분자 단편이 다음 특징: 분자량 ≤ 300Da, cLogP ≤ 3, 수소 결합 공여체 ≤ 3, 및 수소 결합 수용체 ≤ 3 중 적어도 하나를 갖는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 분자가 단백질인, 방법.
9. 제8항에 있어서, 반응성 모이어티가 단백질의 아미노산과 공유 결합을 형성하는, 방법.
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 분자가 지질인, 방법.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 분자가 탄수화물인, 방법.
12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 분자가 핵산인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 핵산이 RNA인, 방법.
14. 제12항에 있어서, 핵산이 DNA인, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 분자가 에피토프 태그를 포함하는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 에피토프 태그가 FLAG, 6xHis, HA, c-myc, 글루타티온-S-트랜스페라제, Strep-태그, 말토스-결합 단백질, 키틴-결합 단백질, S-태그, V5 태그, 또는 AviTag인, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 그룹이 아자디벤조사이클로옥틴, 티올, 알켄, 알킨, 아자이드, 테트라진, 트랜스-사이클로옥텐, (디페닐포스피노)아릴, (디페닐포스피노)알킬, 또는 활성화 에스테르(예를 들어, 하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 에스테르)를 포함하는, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 모이어티가 광가교제 기, 설포닐 플루오라이드, 플루오로설페이트, 마이클(Michael) 수용체 모이어티, 이탈기 모이어티, 또는 천연 알파 아미노산의 측쇄에서 친핵성 모이어티(예를 들어, 시스테인의 티올기, 리신의 아미노기, 세린 또는 트레오닌의 하이드록실기, 또는 티로신의 페놀기)와 공유 결합을 형성하는 모이어티인, 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능 분자가 디곡시게닌, 니켈 NTA(니트릴로트리아세트산), 발색단, 또는 발광단을 포함하는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 검출 가능 분자가 디곡시게닌을 포함하는, 방법.
21. 제19항에 있어서, 검출 가능 분자가 니켈 NTA(니트릴로트리아세트산)를 포함하는, 방법.
22. 제19항에 있어서, 검출 가능 분자가 발색단을 포함하는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 발색단이 비-형광색소 발색단, 소광제, 흡수 발색단, 형광단, 유기 염료, 무기 염료, 금속 킬레이트, 또는 형광 효소 기질을 포함하는, 방법.
24. 제19항에 있어서, 검출 가능 분자가 발광단을 포함하는, 방법.
25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능 분자가 비오틴인, 방법.
26. 제25항에 있어서, 비오틴이 스트렙타비딘 접합체에 결합되는, 방법.
27. 제26항에 있어서, 스트렙타비딘 접합체가 HRP, 설포태그(SulfoTag), 형광단, 또는 금속 킬레이트를 포함하는, 방법.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 모이어티가 아자디벤조사이클로옥틴, 티올, 알켄, 알킨, 아자이드, 테트라진, 트랜스-사이클로옥텐, (디페닐포스피노)아릴, (디페닐포스피노)알킬, 또는 활성화 에스테르(예를 들어, 하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 에스테르)를 포함하는, 방법.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 멤브레인, 유리, 플라스틱, 합성 제조된 폴리머, 에펜도르프 튜브, 다중-웰 플레이트의 웰, 또는 표면 플라즈몬 공명 칩인, 방법.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 인식 모이어티가 항체, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 탄수화물 결합 단백질, 또는 지질 결합 단백질인, 방법.
31. 제30항에 있어서, 인식 모이어티가 항체인, 방법.
32. 제31항에 있어서, 항체가 생물학적 분자에 대한 항체인, 방법.
33. 제31항에 있어서, 항체가 에피토프 태그에 대한 항체인, 방법.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 ELISA를 통해 결합된 검출 가능 접합체를 검출함을 포함하는, 방법.
35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 웨스턴 블롯을 통해 결합된 검출 가능 접합체를 검출함을 포함하는, 방법.
36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 면역형광 검정을 통해 결합된 검출 가능 접합체를 검출함을 포함하는, 방법.
37. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 형광 검정을 통해 결합된 검출 가능 접합체를 검출함을 포함하는, 방법.
38. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 마이크로부피 검정 기술(FMAT)을 통해 결합된 검출 가능 접합체를 검출함을 포함하는, 방법.
39. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 세포 하 염색을 통해 결합된 검출 가능 접합체를 검출함을 포함하는, 방법.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 생물학적 분자를 포함하는 미가공 세포 추출물에서 수행되는, 방법.
41. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 생물학적 분자를 포함하는 단백질의 리포좀 제제에서 수행되는, 방법.
42. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 생물학적 분자를 포함하는 단리된 세포기관에서 수행되는, 방법.
43. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 생물학적 분자를 포함하는 정제된 단백질 제제에서 수행되는, 방법.
44. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 동일 반응계에서 수행되는, 방법.
45. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 세포-기반 검정인, 방법.
46. 제45항에 있어서, 생물학적 분자가 세포에서 발현되는, 방법.
47. 제46항에 있어서, 세포가 생물학적 분자를 발현하도록 조작되는, 방법.
48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 단계 (b) 전에 용해되는, 방법.
49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 결합된 검출 가능 접합체의 양을 정량화함을 추가로 포함하는, 방법.
50. 제49항에 있어서, 단계 (a)가 생물학적 분자에 대한 기질을 추가로 포함하는, 방법.
51. 제50항에 있어서, 생물학적 분자에 대한 기질의 존재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양이 상기 기질의 부재 하에 형성된 상기 결합된 검출 가능 접합체의 양보다 적은(즉, 탐침 분자는 기질-경쟁적 탐침임), 방법.
52. 제50항에 있어서, 생물학적 분자에 대한 기질의 존재 하에 형성된 결합된 검출 가능 접합체의 양이 상기 기질의 부재 하에 형성된 상기 결합된 검출 가능 접합체의 양보다 큰(즉, 탐침 분자는 기질-협동적 탐침임), 방법.

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