JP2022552256A - 反応性アフィニティプローブ相互作用探索プラットフォーム - Google Patents
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Abstract
タンパク質、脂質、炭水化物、または核酸などの生体分子に対するリガンドを同定するための方法、アッセイ、およびキットが開示される。開示された方法は、標的に対する定量的結合アッセイであってよく、それは、標的精製の課題を回避し、アロステリック結合部位を発見および標的化するための系統的アプローチを提供することができる。
Description
本出願は、2019年10月15日に出願された米国仮特許出願第62/915,310号に対する優先権の利益を主張する。
創薬研究において、「ドラッガブル(druggable)」標的とそれに対応する治療薬の同定は、2つの基本的な課題である。タンパク質など多くの生体分子は、それらの内因性または外因性の調節物質が発見されていないため、その薬理作用にアクセスできないままである。したがって、これらの生体分子の生理機能や薬理学的可能性を探索するツールは、内因性リガンドであれ代理リガンドであれ、最も重要なものである。
目的の生体高分子に対する薬理学的調節物質の発見は、多くの場合、精製された高分子に結合する能力またはその機能を調節する能能を有する分子のライブラリをスクリーニングすることにより達成される。しかしながら、複数回膜貫通型タンパク質を含む多くのクラスの生体高分子は、細胞からの精製が困難であり、そのネイティブな細胞環境下でスクリーニングする必要がある。このような細胞ベースのスクリーニングには、細胞バイアビリティ、シグナル伝達、遺伝子発現などの、代理の読み出し(surrogate readout)を選択することが必要である。細胞ベースの代理の読み出しを用いた化合物スクリーニングには2つの課題がある:(i)多くのヒットがオフターゲット効果によって間接的にそれらの薬理作用を発揮すること;および(ii)高分子の機能の他の側面を変化させる真のリガンドの多くが見落とされることである。インタクトな細胞において目的の生体高分子に対する小分子バインダーを直接同定することを可能にする技術は、これら未解決の課題に対処し、この分野での飛躍的な進歩となるあろう。
本発明は、生体分子に対するリガンド候補のスクリーニングのための方法およびシステムを提供する。反応性アフィニティプローブ相互作用探索(RAPID)技術は、in situでの標的に対する定量的結合アッセイであり、標的精製の課題を回避し、アロステリック結合部位の発見および標的化のための系統的アプローチを提供することができる
本明細書において開示されるのは、特定の実施形態では、リガンドを同定する方法であって、(a)生体分子とプローブ分子を接触させるステップであって;プローブ分子は、結合要素、レポーター基、および反応性部分を含み;プローブ分子は、結合要素を介して生体分子に結合し;反応性部分が、生体分子と共有結合を形成し、それによってコンジュゲートを形成する、ステップ;(b)コンジュゲートと、レポーター基と反応する官能基部分を含む検出可能分子を接触させ、それによって検出可能コンジュゲートを形成するステップ;(c)検出可能コンジュゲートと固体支持体を接触させるステップであって;固体支持体は認識部分を含み;認識部分が検出可能コンジュゲートに結合し、それによって結合した検出可能コンジュゲートを形成するステップ;および(d)結合した検出可能コンジュゲートを検出し、それによってプローブ分子を生体分子のリガンドとして同定するステップ;を含む。
本明細書に記載される本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、結合要素は、小分子、ペプチド、または核酸(RNAまたはDNAなど)である。いくつかの実施形態では、結合要素は、複数の結合要素を含むライブラリの構成要素である。いくつかの実施形態では、ライブラリは、分子量≦300Da、cLogP≦3、水素結合ドナー≦3、および水素結合アクセプター≦3の3の法則を満たすとして定義され得る小分子フラグメントのライブラリを含む。例示的なライブラリには以下のものが含まれる:ChemBridgeフラグメントライブラリ、Pyramid Platform Fragment-Based Drug Discovery、Maybridgeフラグメントライブラリ、AnalytiCon社のFRGx、AnCoreX社のTCI-Frag、ASINEX社のBio Building Blocks、Charles River社のBioFocus 3D、Emerald Bio社のFragments of Life(FOL)、Enamine Fragment Library、IOTA Diverse 1500、BIONETフラグメントライブラリ、Life Chemicals Fragments Collection、OTAVAフラグメントライブラリ、Prestwickフラグメントライブラリ、Selciaフラグメントライブラリ、TimTec fragment-based library、Vitas-M Laboratory社のAllium、またはZenobiaフラグメントライブラリ。いくつかの実施形態では、生体分子はタンパク質である。いくつかの実施形態では、反応性部分は、タンパク質のアミノ酸と共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、生体分子は、脂質、炭水化物、または核酸(RNAまたはDNAなど)である。いくつかの実施形態では、生体分子は、エピトープタグ、例えば、FLAG、6xHis、HA、c-myc、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、Strep-tag、マルトース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、Sタグ、V5タグ、またはAviTagを含む。いくつかの実施形態では、レポーター基は、アザジベンゾシクロオクチン、チオール、アルケン、アルキン、アジド、テトラジン、trans-シクロオクテン、(ジフェニルホスフィノ)アリール、(ジフェニルホスフィノ)アルキル、または活性化エステル(例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステル)を含む。いくつかの実施形態では、反応性部分は、光架橋性基(photocrosslinker group)、フッ化スルホニル(またはスルホニルフルオリド)、フルオロスルフェート、マイケルアクセプター部分、脱離基部分、または天然に存在するαアミノ酸の側鎖中の求核性部分(例えば、システインのチオール基、リジンのアミノ基、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基、またはチロシンのフェノール基)と共有結合を形成する部分である。いくつかの実施形態では、検出可能分子は、ジゴキシゲニン、ニッケルNTA(ニトリロ三酢酸)、発色団(chromophore;クロモフォア)、または発光団(luminophore;ルミノフォア)を含む。いくつかの実施形態において、発色団は、非蛍光色素(non-fluorochrome)発色団、クエンチャー、吸収発色団、蛍光体(fluorophore;フルオロフォア)、有機色素、無機色素、金属キレート、または蛍光酵素基質を含む。いくつかの実施形態では、検出可能分子はビオチンである。ビオチンを、ストレプトアビジンコンジュゲート、例えば、HRP、SulfoTag、蛍光体、または金属キレートなどのコンジュゲートに結合させることができる。いくつかの実施形態では、官能基部分は、アザジベンゾシクロオクチン、チオール、アルケン、アルキン、アジド、テトラジン、trans-シクロオクテン、(ジフェニルホスフィノ)アリール、(ジフェニルホスフィノ)アルキル、または活性化エステル(例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステル)を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、膜、ガラス、プラスチック、合成的に調製されたポリマー、エッペンドルフチューブ、マルチウェルプレートのウェル、または表面プラズモン共鳴チップである。いくつかの実施形態では、認識部分は、抗体、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、炭水化物結合タンパク質、または脂質結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体は、生体分子および/またはエピトープタグに対する抗体である。
いくつかの実施形態では、ステップ(d)は、ELISA、ウェスタンブロット、免疫蛍光アッセイ、蛍光測定アッセイ(fluorometric assay)、蛍光測定マイクロボリュームアッセイ技術(fluorometric microvolume assay technology)(FMAT)、または細胞サブセルラー染色(cell subcellular dying)を介して、結合した検出可能コンジュゲートを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体分子を含む粗細胞抽出物で行われるか、生体分子を含むタンパク質のリポソーム調製物で行われるか、生体分子を含む単離オルガネラで行われるか、生体分子を含む精製タンパク質調製物で行われるか、またはin situで行われる。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞ベースアッセイ(またはセルベースアッセイ)である。いくつかの実施形態では、生体分子は細胞において発現される。いくつかの実施形態では、細胞は、生体分子を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、ステップ(b)の前に溶解される。いくつかの実施形態では、ステップ(d)は、結合した検出可能コンジュゲートの量を定量化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ(a)は、生体分子に対する基質をさらに含む。いくつかの実施形態では、生体分子に対する基質の存在下で形成される結合した検出可能コンジュゲートの量は、基質の非存在下で形成される結合した検出可能コンジュゲートの量より少ない(すなわち、プローブ分子は基質競合的(substrate-competitive)プローブである)。他の実施形態では、生体分子に対する基質の存在下で形成される結合した検出可能コンジュゲートの量は、基質の非存在下で形成される結合した検出可能コンジュゲートの量より多い(すなわち、プローブ分子は基質協同的(substrate-cooperative)プローブである)。
本発明は、生体分子に対するリガンド候補をスクリーニングするための方法およびシステムを提供する。反応性アフィニティプローブ相互作用探索(RAPID)は、in situでの標的に対する定量的結合アッセイであり、標的精製の課題を回避し、アロステリック結合部位の発見および標的化のための系統的アプローチを提供することができる。RAPID技術は、インタクトな細胞において目的の生体高分子に対する小分子バインダーを直接同定することを可能にする。
小分子は、タンパク質機能を調べるための強力なツールであり、新規治療薬のリードとしての役割を果たすことができる。しかしながら、ほとんどのヒトタンパク質は小分子リガンドを欠いており、タンパク質クラス全体がアンドラッガブルと考えられている。本明細書で開示する方法は、複雑な化合物ライブラリのハイスループットスクリーニングを用いて、標的化が困難であることが判明しているタンパク質などの生体分子に対する小分子プローブを同定することができる。可逆的結合リガンドが一般的に追求されているが、共有結合フラグメントは、結合親和性によるだけでは標的化が困難なタンパク質の領域にアクセスできるものを含む、小分子プローブへの代替ルートを提供する。
本明細書において開示されるのは、特定の実施形態では、リガンドを同定する方法であって、(a)生体分子とプローブ分子を接触させるステップであって;プローブ分子は、結合要素、レポーター基、および反応性部分を含み;プローブ分子は、結合要素を介して生体分子に結合し;反応性部分が、生体分子と共有結合を形成し、それによってコンジュゲートを形成する、ステップ;(b)コンジュゲートと、レポーター基と反応する官能基部分を含む検出可能分子を接触させ、それによって検出可能コンジュゲートを形成するステップ;(c)検出可能コンジュゲートと固体支持体を接触させるステップであって;固体支持体は認識部分を含み;認識部分が検出可能コンジュゲートに結合し、それによって結合した検出可能コンジュゲートを形成するステップ;および(d)結合した検出可能コンジュゲートを検出し、それによってそのプローブ分子を生体分子のリガンドとして同定するステップ;を含む。
いくつかの実施形態では、プローブ分子は、タンパク質残基との生来の化学反応性に依存する。プローブ分子は、紫外線(UV)照射により可逆的な小分子-タンパク質相互作用を安定な共有結合性付加物に変換させる、光反応性要素などの反応性部分を有していてもよい。プローブ分子はまた、アルキンのようなレポーター基を有していてもよく、これは、銅触媒アジド-アルキン環化付加(CuAAKまたは「クリック」)化学によるアジドタグへの後期段階でのコンジュゲーションを可能にする立体的に最小限の代理レポーター(surrogate reporter)として機能する。また、プローブ分子は、特定の構造的特徴を認識するタンパク質へとプローブを向かわせる結合要素を有していてもよい。
公開された米国特許出願第2017/0115303号および同第2016/0252509号は、プローブ分子の例を記載する:これらの刊行物の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、特に、そこに記載された補体経路の阻害剤について、参照により本明細書に組み込まれる。
定義
本願で使用する科学技術用語は、特に定義しない限り、当業者に一般的に理解されている意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される、化学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞およびがん生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、薬学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学に関連して用いられる命名法および技術は、当該技術分野においてよく知られ一般的に用いられているものである。
本願で使用する科学技術用語は、特に定義しない限り、当業者に一般的に理解されている意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される、化学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞およびがん生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、薬学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学に関連して用いられる命名法および技術は、当該技術分野においてよく知られ一般的に用いられているものである。
「培養」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での細胞または生物のin vitroでの増殖を指す。培養で増殖した細胞の子孫は、親細胞と完全に同一(すなわち、形態学的、遺伝学的、または表現型的に)でない場合があることが理解される。「拡大」とは、細胞のあらゆる増殖または分裂を意味する。
用語「減少」、「低減された」、「低減」、または「阻害する」はすべて、本明細書において、統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。いくつかの実施形態では、「減少」、「低減」、または「阻害」は、典型的には、基準レベル(例えば、所定のリガンドの不在)と比較して、少なくとも10%の減少を意味し、例えば、少なくとも10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%またはそれ以上の減少が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「減少」または「阻害」は、基準レベルと比較して完全な阻害または減少を包含しない。「完全な阻害」は、基準レベルと比較して100%の阻害である。
用語「増加した」、「増加」または「増強する」または「活性化する」は全て、本明細書でにおいて、一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために使用される;疑義を避けるために、用語「増加した」、「増加」または「増強する」または「活性化する」は、基準レベルと比較して、少なくとも10%の増加を意味し、例えば、基準レベルと比較して、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または100%の増加を含む最大100%の増加、または10~100%の間の任意の増加を意味し、あるいは、基準レベルと比較して、少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍の増加、少なくとも約20倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、または少なくとも約1000倍の増加、またはそれ以上の増加を意味する。
本明細書では、冠詞「a」および「an」は、冠詞の文法的対象の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために使用される。例として、「要素」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
本明細書において、「相互作用」という用語は、2つの分子間の相互作用に言及する場合、分子同士の物理的接触(例えば、結合)を指す。一般に、このような相互作用は、前記分子の一方または両方の(生物学的効果を生じる)活性をもたらす。この活性は、分子の一方または両方の直接的な活性(例えば、シグナル伝達)であり得る。
本明細書において、「単離されたタンパク質」とは、細胞から単離された場合または組換えDNA技術により製造された場合には、他のタンパク質、細胞物質、分離媒体、および培地を実質的に含まない、あるいは、化学的に合成された場合には、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を意味する。「単離」または「精製」されたタンパク質またはその生物学的活性部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の汚染タンパク質を実質的に含まない、あるいは、化学的に合成された場合には、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という文言は、そこからタンパク質が単離または組換え生産される細胞の細胞成分から分離されている、標的ポリペプチド(例えば、免疫グロブリン)またはそのフラグメントの調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という文言は、約30%未満(乾燥重量で)の非標的タンパク質(本明細書では「汚染タンパク質」とも呼ばれる)、より好ましくは約20%未満の非標的タンパク質、さらに好ましくは約10%未満の非標的タンパク質、そして最も好ましくは約5%未満の非標的タンパク質を有する、標的タンパク質またはそのフラグメントの調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質またはそれらのフラグメント、例えば生物学的に活性なフラグメント、が組換え生産される場合、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、すなわち、培地はタンパク質調製物の体積の約20%未満、より好ましくは約10%未満、および最も好ましくは約5%未満を示す。
本明細書で使用する場合、「核酸分子」という用語は、DNA分子およびRNA分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列に関して、作動可能に連結されているとは、連結されるDNA配列が隣接し、2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、隣接しかつリーディングフレーム内にあることを意味する。スイッチ配列に関して、作動可能に連結されていることは、その配列がスイッチ組換えを起こすことができることを表す。
スクリーニングアッセイ
本発明は、生体分子に対するリガンド候補をスクリーニングする方法およびシステムを提供する。反応性アフィニティプローブ相互作用探索(RAPID)は、in situでの標的に対する定量的な結合アッセイであり、標的精製の課題を回避し、アロステリック結合部位の発見および標的化のための系統的アプローチを提供し得る。
本発明は、生体分子に対するリガンド候補をスクリーニングする方法およびシステムを提供する。反応性アフィニティプローブ相互作用探索(RAPID)は、in situでの標的に対する定量的な結合アッセイであり、標的精製の課題を回避し、アロステリック結合部位の発見および標的化のための系統的アプローチを提供し得る。
本明細書において開示されるのは、特定の実施形態では、リガンドを同定する方法であって、(a)生体分子とプローブ分子を接触させるステップであって;プローブ分子は、結合要素、レポーター基、および反応性部分を含み;プローブ分子は、結合要素を介して生体分子に結合し;反応性部分が、生体分子と共有結合を形成し、それによってコンジュゲートを形成する、ステップ;(b)コンジュゲートと、レポーター基と反応する官能基部分を含む検出可能分子を接触させ、それによって検出可能コンジュゲートを形成するステップ;(c)検出可能コンジュゲートと固体支持体を接触させるステップであって;固体支持体は認識部分を含み;認識部分が検出可能コンジュゲートに結合し、それによって結合した検出可能コンジュゲートを形成するステップ;および(d)結合した検出可能コンジュゲートを検出し、それによってそのプローブ分子を生体分子のリガンドとして同定するステップ;を含む。
本明細書に記載される本発明の任意の態様に適用することができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、いくつかの実施形態では、結合要素は、小分子、ペプチド、または核酸(RNAまたはDNAなど)である。いくつかの実施形態では、結合要素は、複数の結合要素を含むライブラリの構成要素である。いくつかの実施形態では、ライブラリは、ChemBridgeフラグメントライブラリ、Pyramid Platform Fragment-Based Drug Discovery、Maybridgeフラグメントライブラリ、AnalytiCon社のFRGx、AnCoreX社のTCI-Frag、ASINEX社のBio Building Blocks、Charles River社のBioFocus 3D 、Emerald Bio社のFolgments of Life(FOL)、Enamine Fragment Library、IOTA Diverse 1500、BIONETフラグメントライブラリ、Life Chemicals Fragments Collection、OTAVAフラグメントライブラリ、Prestwickフラグメントライブラリ、Selciaフラグメントライブラリ、TimTec fragment-based library、Vitas-M Laboratory社のAllium、またはZenobiaフラグメントライブラリを含む。いくつかの実施形態では、生体分子はタンパク質である。いくつかの実施形態では、反応性部分は、タンパク質のアミノ酸と共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、生体分子は、脂質、炭水化物、または核酸(RNAまたはDNAなど)である。いくつかの実施形態では、生体分子は、エピトープタグ、例えば、FLAG、6xHis、HA、c-myc、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、Strep-tag、マルトース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、S-タグ、V5タグ、またはAviTagを含む。いくつかの実施形態では、レポーター基は、アザジベンゾシクロオクチン、チオール、アルケン、アルキン、アジド、テトラジン、trans-シクロオクテン、(ジフェニルホスフィノ)アリール、(ジフェニルホスフィノ)アルキル、または活性化エステル(例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステル)を含む。いくつかの実施形態では、反応性部分は、光架橋性基、フッ化スルホニル、フルオロスルフェート、マイケルアクセプター部分、脱離基部分、または天然に存在するαアミノ酸の側鎖中の求核性部分(例えば、システインのチオール基、リジンのアミノ基、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基、またはチロシンのフェノール基)と共有結合を形成する部分である。いくつかの実施形態では、検出可能分子は、ジゴキシゲニン、ニッケルNTA(ニトリロ三酢酸)、発色団、または発光団を含む。いくつかの実施形態において、発色団は、非蛍光色素発色団、クエンチャー、吸収発色団、蛍光体、有機色素、無機色素、金属キレート、または蛍光酵素基質を含む。いくつかの実施形態では、検出可能分子はビオチンである。ビオチンを、ストレプトアビジンコンジュゲート、例えば、HRP、SulfoTag、蛍光体、または金属キレートなどのコンジュゲートに結合させることができる。いくつかの実施形態では、官能基部分は、アザジベンゾシクロオクチン、チオール、アルケン、アルキン、アジド、テトラジン、trans-シクロオクテン、(ジフェニルホスフィノ)アリール、(ジフェニルホスフィノ)アルキル、または活性化エステル(例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステル)を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、膜、ガラス、プラスチック、合成的に調製されたポリマー、エッペンドルフチューブ、マルチウェルプレートのウェル、または表面プラズモン共鳴チップである。いくつかの実施形態では、認識部分は、抗体、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、炭水化物結合タンパク質、または脂質結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体は、生体分子および/またはエピトープタグに対する抗体である。
いくつかの実施形態では、ステップ(d)は、ELISA、ウェスタンブロット、免疫蛍光アッセイ、蛍光測定アッセイ、蛍光測定マイクロボリュームアッセイ技術(FMAT)、または細胞サブセルラー染色を介して、結合した検出可能コンジュゲートを検出することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生体分子を含む粗細胞抽出物で行われるか、生体分子を含むタンパク質のリポソーム調製物で行われるか、生体分子を含む単離オルガネラで行われるか、生体分子を含む精製タンパク質調製物で行われるか、またはin situで行われる。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞ベース(セルベース)アッセイである。いくつかの実施形態では、生体分子は、細胞において発現される。いくつかの実施形態では、細胞は、生体分子を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞は、ステップ(b)の前に溶解される。いくつかの実施形態では、ステップ(d)は、結合した検出可能コンジュゲートの量を定量化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ(a)は、生体分子に対する基質をさらに含む。いくつかの実施形態では、生体分子に対する基質の存在下で形成される結合した検出可能結合体の量は、基質の非存在下で形成される結合した検出可能結合体の量より少ない(すなわち、プローブ分子は基質競合的プローブである)。他の実施形態では、生体分子に対する基質の存在下で形成される結合した検出可能結合体の量は、基質の非存在下で形成される結合した検出可能結合体の量より多い(すなわち、プローブ分子は基質協同的プローブである)。
本明細書で使用する場合、「プローブ」または「試験化合物」または「候補薬剤」という用語は、細胞に影響を与える能力についてスクリーニングされる薬剤または薬剤のコレクション(例えば、化合物)を意味する。試験化合物は、広範囲の様々な化合物を含むことができ、化学化合物、化学化合物の混合物、例えば、多糖類、有機もしくは無機の小分子(例えば、2000ダルトン未満、1000ダルトン未満、1500ダルトン未満、1000ダルトン未満、または500ダルトン未満の分子量を有する分子)、生体高分子、例えば.ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体、およびそれらの類似体および誘導体、ペプチド模倣物、核酸、核酸類似体および誘導体;細菌、植物、真菌または動物の細胞もしくは組織などの生体材料から作られた抽出物;天然のまたは合成の組成物が挙げられる。
実施される特定の実施形態に応じて、プローブは溶液中に遊離した状態で提供することができ、あるいは、担体、または固体支持体(例えば、ビーズ)に付着させてもよい。プローブの固定化には、多くの適切な固体支持体を使用することができる。適切な固体支持体の例には、アガロース、セルロース、デキストラン(すなわち、セファデックス、セファロースとして市販されている)、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール(PEG)、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、ガラスビーズ、アミノ酸コポリマー、エチレン-マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹(シルク)などが挙げられる。さらに、本明細書に記載の方法に関して、プローブを個別に、またはグループでスクリーニングすることができる。グループスクリーニングは、有効なプローブのヒット率が、所与のグループに対して2つ以上の陽性結果を期待しない程度に低いと予想される場合に、特に有用である。
優れたリード化合物と相関する小分子の特性は、当技術分野で知られている。リピンスキーのルールオブファイブ(Lipinski’s Rule of Five)は、経口バイオアベイラビリティ薬物候補を開発するための最初の枠組みを提供した。これらの法則は、回転可能な結合の数(NROT)が重要なパラメータであり、経口バイオアベイラビリティには最大7が最適と思われることが発見されたことにより強化された。極性表面積(PSA)も別の鍵となる特性であり得る;PSAが110~140Å2である受動的に吸収される分子は、経口バイオアベイラビリティが低いと考えられる。最近、「リードライク(lead-like)」という用語が、最適化に適し、かつリピンスキーの値と比較して相対的に「スケールダウン」した特性を有するHTSキャンペーンから同定された分子のために導入された。文献は、薬物サイズの化合物ライブラリのスクリーニングによって発見される化合物が直面する問題に対処している。最近、新規の代替アプローチが登場し、「フラグメント」創薬(“fragment-based”discovery)と呼ばれている(Carr, R. and Jhoti, H. (2002) Structure-based screening of low-affinity compounds. Drug Discov. Today 7, 522-527; Erlanson, D.A. et al. (2000) Site-directed ligand discovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 9367-72; Vetter, D. (2002) Chemical microarrays, fragment diversity, label-free imaging by plasmon resonance-a chemical genomics approach. J. Cell. Biochem. 39, 79-84)。この方法を用いると、同定されたヒットは一般に「3の法則(Rule of Three)」に従っており、これはリード作製のためのフラグメントライブラリの構築に有用な法則となり得る。
このアプローチは、フラグメントライブラリ(分子量100~250Da)を用いて始まり、それらはハイスループットX線結晶構造解析でスクリーニングされる。これらのフラグメントは、タンパク質における鍵となる結合相互作用を調べるが、効率的な結合を妨げる好ましくない相互作用(電子的または立体的)の可能性を最小限に抑えるのに十分に小さい(Hann, M. et al. (2001) Molecular complexity and its impact on the probability of finding leads for drug discovery. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41, 856-864)。次に、タンパク質におけるこれらの小さなリガンドの結合様式が、電子密度マップの解釈によって定義される。X線結晶解析は弱い相互作用(μM~mM)の同定に非常に有効であるため、生物学的アッセイで測定可能な活性を持たないフラグメントヒットを同定することができる。フラグメントライブラリは、化学的多様性をサンプリングし、あるいはタンパク質での特異的相互作用を標的とするように構築することができる。キナーゼおよびプロテアーゼに対する両方のタイプのフラグメントライブラリのスクリーニング、およびそれに続く、強力なリード化合物へのヒットの最適化は、成功したヒットが特定の物理化学的特性を示すことを表す。
多様なフラグメントヒットのセットの分析は、そのようなヒットが、平均して、分子量<300、水素結合ドナー数≦3、水素結合アクセプター数≦3、ClogP≦3という「3の法則」に従うようであることを示した。さらに、NROT(≦3)およびPSA(≦60)もフラグメント選択の有用な基準となり得ることが示唆された。これらのデータは、効率的なリード探索のためにフラグメントライブラリを構築する際に、「3の法則」が有用であり得ることを示唆する。
多くの小分子ライブラリが当技術分野で知られており、商業的に入手可能である。これらの小分子ライブラリを、本明細書に記載されるスクリーニング方法を用いてスクリーニングすることができる。化学ライブラリまたは化合物ライブラリは、特定の効果について候補薬剤をスクリーニングするために本明細書に記載の方法と組み合わせて使用することができる、保管された化学物質のコレクションである。化学ライブラリは、各化合物の化学構造、純度、量、および物理化学的特性に関する情報を含む。化合物ライブラリは、例えば、Enzo Life Sciences、Aurora Fine Chemicals、Exclusive Chemistry Ltd.、ChemDiv、ChemBridge、TimTec Inc.、AsisChem、およびPrinceton Biomolecular Research等から市販で入手することが可能である。
制限されることなく、化合物は、適切な期間にわたり対照と対比して細胞に影響を及ぼし得る任意の濃度で試験することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、約0.01nM~約100mM、約0.1nM~約500μM、約0.1μM~約20μM、約0.1μM~約10μM、または約0.1μM~約5μMの範囲の濃度で試験される。
化合物スクリーニングアッセイは、ハイスループットスクリーニングで使用することができる。ハイスループットスクリーニングは、化合物のライブラリを所定の活性について試験するプロセスである。ハイスループットスクリーニングは、多数の化合物を迅速かつ並行してスクリーニングすることを追求する。例えば、マイクロタイタープレートおよび自動アッセイ装置を使用して、研究室では1日あたり10万回、あるいはそれ以上のアッセイを並行して行うことができる。
スクリーニングアッセイに続いて、同定された試験化合物が意図した用途に望ましい特性を有するか否かをさらに同定するために次のアッセイを実施することができる。例えば、スクリーニングアッセイに続いて、バイオアベイラビリティ、毒性、または薬物動態のいずれかの測定からなる群より選択される第2のアッセイを行うことができるが、これらの方法に限定されない。
本発明は、本明細書に記載されるリガンドを同定するためのキットも包含する。本発明のキットは、本明細書で提供される開示された発明の方法における開示されたキットまたはプローブの使用を開示または説明する説明書(instructional material)も含んでいてよい。キットはまた、キットが設計される特定の適用を容易にするために、追加の構成要素を含んでいてもよい。例えば、キットは、標識を検出する手段(例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、ヒツジ抗マウス-HRPなどの適切な二次標識など)、および対照に必要な試薬(例えば、対照生物学的試料または標準物質)を追加的に含んでいてもよい。キットはさらに、開示された発明の方法での使用が認められる緩衝液および他の試薬を含むことができる。非限定的な例としては、担体タンパク質またはデタージェントなどの、非特異的結合を低減するための薬剤が挙げられる。
「キット」は、本発明のマーカーの発現を特異的に検出するおよび/またはそれに影響を及ぼすための、少なくとも1つの試薬、例えばプローブまたは小分子を含む、任意の製品(例えば、パッケージまたは容器)である。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして、宣伝、配布、または販売され得る。キットは、本発明の方法において有用な組成物を発現させるために必要な1つまたは複数の試薬を含んでいてもよい。特定の実施形態では、キットは、参照標準をさらに含んでいてもよい。当業者は、一般的な分子を含むがこれらに限定されない、多くのそのような対照を想定することができる。キット中の試薬は、個々の容器で提供されてもよいし、単一容器内の2つ以上の試薬の混合物として提供されてもよい。さらに、キット内に組成物の使用方法を説明する説明書を含めることができる。
実施例1:アフィニティタグ付け標的に対するRAPライブラリのスクリーニングのためのRAPIDプロトコル
捕捉プレートの調製
Greiner HiBindプレート(Sigma Aldrichカタログ番号:M4561-40EA)に捕捉抗体をコーティングした。プロテインA(Thermo,カタログ番号:101100)は、50%グリセロール/PBSで5mg/mLに再構成し、それをコーティングバッファー(Thermo,BupH(商標)Carbonate-Bicarbonate Buffer Packs)で1:500に希釈して調製した。プレートを100μLのコーティングバッファーで1回洗浄し、6枚1組で横に置いた。50μLのプロテインAを各プレートの各ウェルに添加した。スタンプされたプレートを4℃のデリ冷蔵庫(deli fridge)に一晩おいた。翌朝、プロテインAをコーティングしたプレートを100μLのコーティングバッファーで2回洗浄した。200μLのSuperblock(Thermo Fisher、カタログ番号37515)を各プレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。捕捉プレートを2時間ブロッキングした後、すべてのプレートをPBS/Tで3回洗浄した。SuperBlock バッファー中の1μg/mLの捕捉抗体135mLを調製した。捕捉プレートの各ウェルに、調製した抗体を50μLずつ添加し、室温で1時間インキュベートした。
捕捉プレートの調製
Greiner HiBindプレート(Sigma Aldrichカタログ番号:M4561-40EA)に捕捉抗体をコーティングした。プロテインA(Thermo,カタログ番号:101100)は、50%グリセロール/PBSで5mg/mLに再構成し、それをコーティングバッファー(Thermo,BupH(商標)Carbonate-Bicarbonate Buffer Packs)で1:500に希釈して調製した。プレートを100μLのコーティングバッファーで1回洗浄し、6枚1組で横に置いた。50μLのプロテインAを各プレートの各ウェルに添加した。スタンプされたプレートを4℃のデリ冷蔵庫(deli fridge)に一晩おいた。翌朝、プロテインAをコーティングしたプレートを100μLのコーティングバッファーで2回洗浄した。200μLのSuperblock(Thermo Fisher、カタログ番号37515)を各プレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。捕捉プレートを2時間ブロッキングした後、すべてのプレートをPBS/Tで3回洗浄した。SuperBlock バッファー中の1μg/mLの捕捉抗体135mLを調製した。捕捉プレートの各ウェルに、調製した抗体を50μLずつ添加し、室温で1時間インキュベートした。
ライセートプレートの調製
HEK293T細胞株の場合、96ウェルプレートあたり7.5M細胞を使用した。96ウェルプレート24枚にポリ-D-リジン(Sigma Aldrich、カタログ番号P7280-5MG)をコーティングし、洗浄した。その後、1ウェルあたり75K細胞をプレーティングし、一晩インキュベートして細胞を付着させた。RAP投薬プレートを細胞イメージング培地で所望の最終濃度の4xに再構成した。各細胞プレートに1枚ずつ、培地を除去して200μLの細胞イメージング培地(CIM)(Thermo、カタログ番号A14291DJ)を分注する。次に、各プレートについて、200μLのCIMを除去し、すぐに75μLのCIMを添加する。細胞を洗浄し、各プレートに75μLのCIMを分注した後、25μLの再構成されたRAPを添加し、37℃の細胞インキュベータで30分間インキュベートした。細胞をインキュベートしている間に、12.5mLの20%DDM(Anatrace、カタログ番号D31025GM)、250mLのHepes緩衝食塩水、および5つの完全プロテアーゼ錠(Sigma Aldrich、カタログ番号4693132001)を添加することにより、溶解バッファ(~10mL/プレート)を調製する。プレートを、UVクロスリンカー(Spectrolinker、カタログ番号1195T76)で照射する。3分間照射した後、培地を除去し、細胞を200μLのCIMで洗浄し、過剰なRAPを除去する。その後、各プレートからCIMを除去し、100μLの溶解バッファーを添加する。プレートを室温で1時間インキュベートし、溶解を完了させる。
HEK293T細胞株の場合、96ウェルプレートあたり7.5M細胞を使用した。96ウェルプレート24枚にポリ-D-リジン(Sigma Aldrich、カタログ番号P7280-5MG)をコーティングし、洗浄した。その後、1ウェルあたり75K細胞をプレーティングし、一晩インキュベートして細胞を付着させた。RAP投薬プレートを細胞イメージング培地で所望の最終濃度の4xに再構成した。各細胞プレートに1枚ずつ、培地を除去して200μLの細胞イメージング培地(CIM)(Thermo、カタログ番号A14291DJ)を分注する。次に、各プレートについて、200μLのCIMを除去し、すぐに75μLのCIMを添加する。細胞を洗浄し、各プレートに75μLのCIMを分注した後、25μLの再構成されたRAPを添加し、37℃の細胞インキュベータで30分間インキュベートした。細胞をインキュベートしている間に、12.5mLの20%DDM(Anatrace、カタログ番号D31025GM)、250mLのHepes緩衝食塩水、および5つの完全プロテアーゼ錠(Sigma Aldrich、カタログ番号4693132001)を添加することにより、溶解バッファ(~10mL/プレート)を調製する。プレートを、UVクロスリンカー(Spectrolinker、カタログ番号1195T76)で照射する。3分間照射した後、培地を除去し、細胞を200μLのCIMで洗浄し、過剰なRAPを除去する。その後、各プレートからCIMを除去し、100μLの溶解バッファーを添加する。プレートを室温で1時間インキュベートし、溶解を完了させる。
合計140mLのクリックミックスのために各試薬を30mLずつ作製して、銅触媒によるアジドアルキン環化付加反応を利用してレポーターのビオチンをRAPのアルキンに結合させる。これは、600mgのTHPTA(Click Chemistry Tools、カタログ番号1010-5G)、600mgのアスコルビン酸塩(Sigma Aldrich、カタログ番号11140-50G)、および120mgの硫酸銅(Sigma Aldrich、カタログ番号451657-10G)、ならびに750μLの10mM ピコリル-ビオチン-アジド(picolyl-Biotin-Azide)(Click Chemistry Tools、カタログ番号1167-100)に相当する。各試薬を個別に30mLの水に溶解させ、クリック反応を開始する直前に、以下の順序で試薬を混合する:Ting -> THPTA -> 銅(青色になる) -> アスコルビン酸塩(透明になる)。40μLのクリックミックスをすべてのプレートの各ウェルに添加する。1時間のインキュベーション後、300μLのPBS-T(Boston BioProducts、カタログ番号 IBB-171)で3回洗浄して、捕捉プレートから捕捉抗体を除去する。各ウェルに10μLの0.5M EDTA(Sigma Aldrich、カタログ番号324506-100ML)を添加することにより、クリック反応をクエンチする。100μLの溶解物を対応する捕捉プレートに移し、室温で少なくとも1時間インキュベートする。1時間の捕捉インキュベーション後、300μLのPBS/Tで5回プレートを洗浄する。
ストレプトアビジン-HRP(Cell Signaling Technologies、カタログ番号3999S)は、Cell Signaling Technologies(P/N)の材料を1:1000に希釈して、PBS/T中に調製する。調製したストレプトアビジン-HRPを各ウェルに50μLずつ添加し、室温で30分間インキュベートする。30分間のストレプトアビジンとのインキュベーションの後、プレートを300μLのPBS/Tで5回洗浄する。最後の洗浄液は、乾燥を防ぐためにプレートに入れたままにする。
テカン(Tecan)に200μLのチップとTMBをセットする。Tecanのトラフに少なくとも135μLのTMB(Thermo Fisher、カタログ番号N301)を入れ、スタンプ50uLメソッド(Stamp 50uL method)を開く。プレートを空にし、適切な順番でTecanに入れ、メソッドを実行する。このプロセスを、すべてのプレートがTMBを受け取るまで繰り返す。各プレートを50μLの0.2N硫酸でクエンチする。プレートをプレートリーダーで順次読み取り、450nmでの吸光度を定量する。
クレアチントランスポーターSLC6A8の基質感受性バインダーの同定
タグ付けされたクレアチントランスポーターSLC6A8を発現する細胞を用いて、基質感受性バインダーをスクリーニングした。図1に、リガンド探索およびターゲットエンゲージメントのための細胞結合アッセイにおける、ハイスループットスクリーニングであるRAPIDの一般的なプロトコルを示す。
タグ付けされたクレアチントランスポーターSLC6A8を発現する細胞を用いて、基質感受性バインダーをスクリーニングした。図1に、リガンド探索およびターゲットエンゲージメントのための細胞結合アッセイにおける、ハイスループットスクリーニングであるRAPIDの一般的なプロトコルを示す。
RAPIDは、オルソステリックおよびアロステリックリガンドを、標的占有率のための出発点またはプローブとして同定する。RAPライブラリのサブセットによるクレアチントランスポーターの共有結合修飾の程度は、非常に再現性が高い(図2A)。クレアチントランスポーターSLC6A8±基質アナログであるグアニジノプロピオン酸(GPA)に対する2000個のRAPのスクリーニングにより、基質感受性バインダーが同定された(図2B)。対角線から外れるドットは、基質競合的であるかまたは基質協同的であるかのいずれかである。スクリーニングから同定された2つのRAPは、GPAの濃度の関数として、用量依存的な標的の共有結合修飾の阻害または増強を示す(図2C)。IC50/EC50は、GPAの既知の阻害定数(~30μM)に合致する。細胞に、1mMのβ-GPAと共にまたは無しで、100μMのJN-1724を30分間投薬し、その後、365nmの光を6分間照射した。細胞を洗浄し、SLC6A8の残存輸送活性をクレアチン取り込みアッセイにより測定した。反応性アフィニティプローブJN-1724によるクレアチントランスポーターSLC6A8の共有結合による不活性化と競合物質β-GPAとの共投与による保護を図3に示す。
基質競合的RAPでの細胞の処理により、クレアチントランスポーターが定量的に阻害される。100μMのJN-1724で30分間の投薬、続いて365nmでの6分間の架橋は、SLC6A8のクレアチン輸送を正常な輸送の5.7%まで阻害するのに十分であった。アダクトームの不偏質量分析によってターゲットエンゲージメントを確認するために、細胞に、1mMのβ-GPAと共にまたは無しで、20μMのJN-1724を30分間投薬し、その後、365nmの光を6分間照射した。細胞を溶解させ:ビオチンをクリック反応により結合させ;ビオチン化タンパク質をストレプトアビジンでアフィニティ精製し、トリプシンで消化し、TMT定量を伴うタンデム質量分析で同定した。SLC6A8(矢印で示した点)は同定されたタンパク質の1つであり、1mMのβ-GPAとの共投与により、エンリッチメントレベルが80%減少した(図4)。
参照による組込み
本明細書に記載されたすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合には、本明細書における定義を含む本出願が制御する。
本明細書に記載されたすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合には、本明細書における定義を含む本出願が制御する。
等価物
対象発明の具体的な実施形態について説明したが、上記明細書は例示であり、限定的なものではない。本発明の多くの変形が、本明細書および以下の特許請求の範囲を検討することにより、当業者には明らかになるであろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲、ならびに等価物の全範囲、および明細書ならびにそのような変形を参照することによって決定されるべきである。
対象発明の具体的な実施形態について説明したが、上記明細書は例示であり、限定的なものではない。本発明の多くの変形が、本明細書および以下の特許請求の範囲を検討することにより、当業者には明らかになるであろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲、ならびに等価物の全範囲、および明細書ならびにそのような変形を参照することによって決定されるべきである。
Claims (52)
- リガンドを同定する方法であって、
(a)生体分子とプローブ分子を接触させるステップであって、前記プローブ分子は、結合要素、レポーター基、および反応性部分を含み、プローブ分子は、前記結合要素を介して生体分子に結合し、前記反応性部分が生体分子と共有結合を形成し、それによってコンジュゲートを形成するステップ;
(b)前記コンジュゲートと、前記レポーター基と反応する官能基部分を含む検出可能分子を接触させ、それによって検出可能コンジュゲートを形成するステップ;
(c)前記検出可能コンジュゲートと固体支持体を接触させるステップであって、前記固体支持体は認識部分を含み、該認識部分が検出可能コンジュゲートに結合し、それによって結合した検出可能コンジュゲートを形成するステップ;および
(d)前記結合した検出可能コンジュゲートを検出することにより、プローブ分子を前記生体分子のリガンドとして同定するステップ;
を含む、方法。 - 前記結合素子が小分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記結合要素がペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記結合要素が核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸がRNAまたはDNAである、請求項4に記載の方法。
- 前記結合要素が、複数の結合要素を含むライブラリの構成要素である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合要素が小分子フラグメントであり、各小分子フラグメントが、以下の特徴:分子量≦300Da、cLogP≦3、水素結合ドナー≦3、および水素結合アクセプター≦3のうちの少なくとも1つを有する、請求項6に記載の方法。
- 前記生体分子がタンパク質である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応性部分が、タンパク質のアミノ酸と共有結合を形成する、請求項8に記載の方法。
- 前記生体分子が脂質である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体分子が炭水化物である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体分子が核酸である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸がRNAである、請求項12に記載の方法。
- 前記核酸がDNAである、請求項12に記載の方法。
- 前記生体分子がエピトープタグを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エピトープタグが、FLAG、6xHis、HA、c-myc、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、Strep-tag、マルトース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、Sタグ、V5タグ、またはAviTagである、請求項15に記載の方法。
- 前記レポーター基が、アザジベンゾシクロオクチン、チオール、アルケン、アルキン、アジド、テトラジン、trans-シクロオクテン、(ジフェニルホスフィノ)アリール、(ジフェニルホスフィノ)アルキル、または活性化エステル(例えばヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステル)を含む、請求項1~16いずれか一項に記載の方法。
- 前記反応性部分が、光架橋性基、フッ化スルホニル、フルオロスルフェート、マイケルアクセプター部分、脱離基部分、または天然に存在するαアミノ酸の側鎖中の求核性部分(例えば、システインのチオール基、リジンのアミノ基、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基、またはチロシンのフェノール基)と共有結合を形成する部分である、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 検出可能分子が、ジゴキシゲニン、ニッケルNTA(ニトリロ三酢酸)、発色団、または発光団を含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能分子がジゴキシゲニンを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記検出可能分子がニッケルNTA(ニトリロ三酢酸)を含む、請求項19に記載の方法。
- 検出可能分子が発色団を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記発色団が、非蛍光発色団、クエンチャー、吸収発色団、蛍光体、有機色素、無機色素、金属キレート、または蛍光酵素基質を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記検出可能分子が発光団を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記検出可能分子がビオチンである、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- ビオチンがストレプトアビジンコンジュゲートに結合する、請求項25に記載の方法。
- ストレプトアビジンコンジュゲートが、HRP、SulfoTag、蛍光体、または金属キレートを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記官能基部分が、アザジベンゾシクロオクチン、チオール、アルケン、アルキン、アジド、テトラジン、trans-シクロオクテン、(ジフェニルホスフィノ)アリール、(ジフェニルホスフィノ)アルキル、または活性化エステル(例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステル)を含む、請求項1~27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体が、膜、ガラス、プラスチック、合成的に調製されたポリマー、エッペンドルフチューブ、マルチウェルプレートのウェル、または表面プラズモン共鳴チップである、請求項1~28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識部分が、抗体、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、炭水化物結合タンパク質、または脂質結合タンパク質である、請求項1~29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識部分が抗体である、請求項30に記載の方法。
- 前記抗体が、生体分子に対する抗体である、請求項31に記載の方法。
- 前記抗体がエピトープタグに対する抗体である、請求項31に記載の方法。
- ステップ(d)が、ELISAによって、結合した検出可能コンジュゲートを検出することを含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)が、ウェスタンブロットによって、結合した検出可能コンジュゲートを検出することを含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)が、免疫蛍光アッセイによって、結合した検出可能コンジュゲートを検出することを含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)が、蛍光測定アッセイによって、結合した検出可能コンジュゲートを検出することを含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)が、蛍光測定マイクロボリュームアッセイ技術(FMAT)によって、結合した検出可能コンジュゲートを検出することを含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)が、細胞サブセルラー染色によって、結合した検出可能コンジュゲートを検出することを含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- 生体分子を含む粗細胞抽出物で実施される、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- 生体分子を含むタンパク質のリポソーム調製物で実施される、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- 生体分子を含む単離オルガネラで実施される、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- 生体分子を含む精製タンパク質調製物で実施される、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- in situで実施される、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞ベースアッセイである、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体分子が細胞において発現される、請求項45に記載の方法。
- 前記細胞が、生体分子を発現するように操作されている、請求項46に記載の方法。
- ステップ(b)の前に細胞を溶解させる、請求項45~47のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)が、結合した検出可能コンジュゲートの量を定量することをさらに含む、請求項1~48のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、生体分子に対する基質をさらに含む、請求項49に記載の方法。
- 生体分子に対する基質の存在下で形成される結合した検出可能コンジュゲートの量が、前記基質の非存在下で形成される結合した検出可能コンジュゲートの量より少ない(すなわち、プローブ分子が基質競合的プローブである)、請求項50に記載の方法。
- 生体分子に対する基質の存在下で形成される結合した検出可能コンジュゲートの量が、前記基質の非存在下で形成される結合した検出可能コンジュゲートの量より多い(すなわち、プローブ分子が基質協同的プローブである)、請求項50に記載の方法。
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