KR20220085926A - 체세포로부터 공통골수계전구세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

체세포로부터 공통골수계전구세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

화합물 칵테일을 포함하는 체세포로부터 공통골수계전구세포로의 직접교차분화 유도용 조성물, 상기 조성물을 이용하여 체세포를 공통골수계전구세포 및 대식세포로 직접교차분화하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포 또는 대식세포, 이들을 이용한 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 세포 치료제, 약물 스크리닝용 조성물, 인공조직 제작을 위한 3D 프린팅 생체소재 조성물을 제공한다.

Description

체세포로부터 공통골수계전구세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도{Composition for inducing direct conversion of somatic cell into common myeloid progenitor and use thereof}
체세포로부터 공통골수계전구세포로의 직접교차분화 유도용 조성물, 상기 조성물을 이용한 체세포를 공통골수계전구세포 및 대식세포로 직접교차분화하는 방법, 및 이의 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
기존의 배야줄기세포 또는 역분화줄기세포를 이용한 대식세포 분화 방법은 배아를 파괴하여 배아줄기세포를 확립하거나, 체세포에서 역분화줄기세포 단계로 역분화 과정을 거쳐 다시 대식세포로 분화시켜야 했다. 이처럼 배아줄기세포를 이용할 경우 윤리적 문제가 발생할 수 있다. 또한, 역분화줄기세포를 이용할 경우 분화를 수행하는 단계에 있어서 시간적, 금전적 비용과 노력이 소요되나 수율이 낮고, 인위적인 분화능의 조절이 용이하지 않아 비효율적이라는 문제가 있었다. 더욱이, 미분화세포로부터 유래한 기형종(teratoma)이 형성될 가능성이 높아 상기 세포를 사용하는 데 안전성의 문제가 있었다.
이에 대하여, 섬유아세포를 혈액세포로 직접교차분화 유도하기 위하여, 섬유아세포에 Oct4를 형질도입하여 단핵구, 호중구, 수지상세포, 또는 대식세포로의 분화가 증가한 것을 확인한 연구가 있었다(Szabo, E., et al. (2010). "Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors." Nature, 468(7323), 521-526. doi:10.1038/nature09591). 그러나, 이와 같이 유전자 과발현을 이용한 방법은 유전자 조작에 의한 안전성 문제가 있다.
따라서, 유전자 조작 없이 체세포로부터 대식세포로의 직접교차분화 유도가 가능한 기술 개발이 필요하다.
화합물 칵테일을 포함하는, 체세포로부터 공통골수계전구세포(CMP)로의 직접교차분화 유도용 조성물을 제공한다.
체세포를 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 직접교차분화하는 방법을 제공한다.
상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 또는 대식세포를 제공한다.
상기 직접교차분화 유도용 조성물, 또는 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
유효량의 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 또는 흉터를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.
상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.
상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터 치료용 인공조직 제작을 위한 3D 프린팅 생체소재 조성물을 제공한다.
일 양상은 화합물 칵테일을 포함하는, 체세포로부터 공통골수계전구세포(Common myeloid progenitor, CMP)로의 직접교차분화 유도용 조성물을 제공한다.
용어 "직접교차분화(Direct Conversion, Direct reprogramming, Transdifferentiation)"는 고등생물에서 전혀 다른 세포 타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난) 세포간의 전환을 유도하는 과정을 말한다(Kim, J. et al, Neurobiol. 22, 778-784, 2012). 이는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍 하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 종래 기술과 달리, 유도만능줄기세포단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이를 가진다. 현재 직접교차분화는 질병모델링과 신약 개발 등에 이용될 가능성을 인정받고 있어 유전자 치료 및 재생의학 등에도 응용될 수 있는 기술로 알려져 있다.
용어 "화합물 칵테일(chemical cocktail)"은 "화합물 조성"과 상호교환적으로 사용되며, 2종 이상의 화합물을 조합한 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 상기 화합물 칵테일은 소분자(small molecule) 화합물 칵테일일 수 있다.
상기 화합물 칵테일은 SOX2 (SRY(sex determining region Y)-box 2)의 발현을 강화시킬 수 있다. 화합물 칵테일 기반의 직접교차분화 방법은 SOX2를 형질도입하는 유전자 기반의 직접교차분화 방법에 비해 안전할 뿐만 아니라, 직접교차분화 시간을 단축시킬 수 있다.
상기 화합물 칵테일은 시판되는 약물들의 조합일 수 있고, 그에 따라 우수한 안정성 및 안전성이 확보될 수 있다.
상기 화합물 칵테일은 TGF-β 수용체 억제제, HDAC(histone deacetylase) 억제제, 및 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제 중 2종 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 화합물 칵테일은 TGF-β 수용체 억제제 및 HDAC 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 화합물 칵테일은 TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, 및 GSK-3 억제제를 모두 포함할 수 있다.
상기 TGF-β 수용체(Trnasforming growth factor β (TGF-β) receptor)는 TGF-β 수용체 타입 I(TGF-β receptor type I, TGF-β RI, TGFβRI, TGFBR1, ALK5)일 수 있다.
상기 TGF-β 수용체 억제제는 TGF-β 수용체 타입 I 억제제(TGF-β RI Kinase Inhibitor, ALK5 Inhibitor)일 수 있다. 상기 TGF-β 수용체 억제제는 TGF-β 수용체 타입 I 억제제 II(TGF-β RI Kinase Inhibitor II, ALK5 Inhibitor II)일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 TGF-β 수용체 억제제는 2-[3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-1,5-나프티리딘 (616452), SB431542, 갈루니서팁 (LY2157299), LY3200882, 백토서팁 (TEW-7197), PF-06952229, 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 TGF-β 수용체 억제제는 616452일 수 있다.
상기 HDAC(histone deacetylase) 억제제는 발프로에이트(Valproate), 트리코스타틴 A, 페닐부틸레이트, 소듐 부틸레이트, 수베로일아닐리드 하이드록삼산(Suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA), 수베로하이드록삼산(Suberohydroxamic acid, SBHA), 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 HDAC 억제제는 발프로에이트일 수 있다.
상기 발프로에이트는 발프로산(Valproic acid, VPA), 발프로에이트 나트륨(sodium valproate), 디발프로엑스 나트륨(divalproex sodium), 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 발프로에이트는 발프로산일 수 있다.
상기 "발프로산(Valproic acid, VPA)"은 "2-프로필펜탄산(2-propylpentanoic acid)"이라고도 하며, WHO 필수 의약품 목록에 등재되어 있다.
상기 "GSK-3(Glycogen synthase kinase 3)"는 진핵 생물에서 보존되어 있는 인산화효소 중 하나로 세린/트레오닌 아미노산 잔기에 인산기를 전달한다. GSK-3은 GSK-3α와 GSK-3β 형태가 존재한다.
상기 "GSK-3 억제제"는 GSK-3의 활성을 저해하는 물질을 의미할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 GSK-3 억제제는 GSK-3β 억제제일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 GSK-3 억제제는 6-((2-((4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일)아미노)에틸)아미노)니코티노니트릴 (CHIR99021), TD114-2, SB216763, SB415286, 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화합물 칵테일은 항산화제를 더 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 화합물 칵테일은 TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, 및 항산화제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 화합물 칵테일은 TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, GSK-3 억제제, 및 항산화제를 모두 포함할 수 있다. 상기 화합물 칵테일에 항산화제를 더 포함하는 경우, 분화 효율이 증가할 수 있다.
상기 "항산화제(antioxidant)"는 활성산소를 제거하여 산화적 스트레스로부터 신체를 방어하도록 돕는 물질을 의미한다. 상기 항산화제는 자연계에 존재하는 물질 및 인공적으로 합성된 물질을 모두 포함할 수 있다. 상기 항산화제는 카테킨을 포함하는 폴리페놀류, 비타민(예: 비타민A, 비타민E, 비타민C), 셀레늄, 코엔자임큐10 등이 있으나, 그 종류를 제한하지 않는다.
일부 구체예에서, 상기 항산화제는 아스코르브산(Ascorbic acid), 레스베라트롤(resveratrol), 아세틸시스테인(N-acetylcysteine), 에틸비스이미노메틸구아이아콜망가니즈클로라이드 (EUK-134), NADPH 산화효소 억제제, 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 항산화제는 아스코르브산일 수 있다.
상기 "아스코르브산(Ascorbic acid)"은 "비타민C(Vitamin C)"라고도 하며, 수용성 비타민 중 하나이다.
상기 "레스베라트롤(resveratrol)"은 폴리페놀의 일종으로, 베리류 등을 포함한 많은 식물에서 발견된다.
용어 "체세포"는 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미한다. 상기 체세포는, 예컨대, 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 것 또는 포유 동물로부터 분리된 것일 수 있다.
용어, "세포의 분리"는 처리하지 않은 조직 속에서 분리하고자 하는 세포와 정상적으로 결부되어있는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 제거하는 것을 의미할 수 있다. 한 조직에서 얻은 세포를 포함하는 세포군은 처리하지 않은 상태의 그 조직 속에서 그 세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50% 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다. 본 명세서에서 "분리된"은 자연적으로 발생하는 조직, 또는 세포 내의 환경과는 다른 환경에 존재하는 조직, 또는 세포를 의미할 수 있다. 예를 들면, 세포는 자연적으로 다세포 기관에서 발생하고, 상기 세포가 다세포 기관으로부터 제거되었다면 세포는 "분리된" 것이다.
일부 구체예에서, 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 지방간질세포(adipose stromal cell), 상피세포, 근육세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 혈액세포, 모낭 줄기세포, 신경줄기세포, 조혈모세포, 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 상기 체세포는 섬유아세포일 수 있다. 용어 "섬유아세포(fibroblast)"는 섬유성 결합조직의 성분을 이루는 세포로 포유류의 결합조직의 세포를 의미할 수 있다.
용어 "공통골수계전구세포(Common myeloid progenitor, CMP)"는 "공통골수선조세포"라고도 하며, 다양한 골수계 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 모든 종류의 혈액세포를 생성할 수 있는 줄기세포이다. 조혈모세포로부터 모든 혈액세포의 형성과정을 조혈작용(hematopoiesis)이라고 한다. 상기 조혈모세포는 공통골수계전구세포(CMP) 또는 공통림프계전구세포(Common lymphoid progenitor, CLP)로 분화할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 공통골수계전구세포(CMP)는 체세포로부터 직접교차분화 유도된 것이다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물을 이용하면 조혈모세포를 거치지 않고 체세포로부터 공통골수계전구세포(CMP)로 직접교차분화가 유도될 수 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)는 다양한 골수계 세포로 분화할 수 있으며, 예컨대, 골수아세포(Myeloblast), 호염기구(Basophil), 호중구(Neutrophil), 호산구(Eosinophil), 단핵구(Monocyte), 과립구(Granulocyte), 수지상세포(Dendritic cell), 또는 대식세포(Macrophage)로 분화할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 공통골수계전구세포(CMP)는 대식세포로 분화할 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 체세포로부터 대식세포로의 직접교차분화 유도용 조성물일 수 있다.
용어 "대식세포(Macrophage)"는 백혈구의 한 유형으로, 대식작용(phagocytosis) 기능을 갖는다. 대식세포는 대식작용에 의해 세포 찌꺼기, 이물질, 미생물, 암세포, 비정상적인 단백질 등을 분해할 수 있다. 또한, 대식세포는 사이토카인 분비, 손상된 조직의 제거 등을 통해 조직 재생, 세포 재생, 또는 상처 회복에 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 섬유아세포를 대식세포로 직접교차분화 유도하여 섬유아세포의 재생 불량으로 인한 섬유증, 켈로이드, 비후성반흔 등을 치료할 수 있다.
다른 양상은 체세포를 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 직접교차분화하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, 및 GSK-3 억제제를 포함하는 배지에서 체세포를 배양하여 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 in vitro에서 또는 in vivo에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화 방법은 SOX2 형질도입에 의한 직접교차분화 방법에 비해 짧은 기간 내에 높은 수득률로 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포를 제조할 수 있다. 또한, 유전자 조작 없이 실제 임상에 적용되는 약물을 사용함으로써, 보다 안전하게 직접교차분화가 가능하다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에서, 상기 배지에 항산화제를 더 포함할 수 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계는 두 단계로 세분화될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 TGF-β 수용체 억제제 및 HDAC 억제제를 포함하는 배지에서 체세포를 제1 배양하는 단계; 및 상기 배양된 체세포를 TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, 및 GSK-3 억제제를 포함하는 배지에서 제2 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제1 배양의 배지 및 제2 배양의 배지 중 하나 이상에 항산화제를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 제1 배양의 배지는 TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, 및 항산화제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 제2 배양의 배지는 TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, GSK-3 억제제, 및 항산화제를 포함할 수 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에서, 상기 배지 중 TGF-β 수용체 억제제의 농도는 TGF-β 수용체 억제제의 구체적인 종류에 따라 직접교차분화를 유도하기에 충분한 적절한 농도를 선택할 수 있다. 상기 배지 중 TGF-β 수용체 억제제의 농도는 약 0.01 내지 약 1000 μM 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, TGF-β 수용체 억제제가 616452인 경우, 상기 배지 중 616452의 농도는 약 1 내지 약 20 μM, 약 3 내지 약 20 μM, 약 3 내지 약 18 μM, 약 3 내지 약 15 μM, 약 3 내지 약 12 μM, 약 5 내지 약 20 μM, 약 5 내지 약 18 μM, 약 5 내지 약 15 μM, 약 5 내지 약 12 μM, 또는 약 10 μM일 수 있다. TGF-β 수용체 억제제의 농도가 지나치게 높을 경우 세포가 죽을 수 있다. TGF-β 수용체 억제제의 농도가 지나치게 낮을 경우 분화 효율이 떨어질 수 있다. 예를 들어, 616452의 농도가 3 μM 미만인 경우 직접교차분화가 정상적으로 이루어지지 않을 수 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에서, 상기 배지 중 HDAC 억제제의 농도는 HDAC 억제제의 구체적인 종류에 따라 직접교차분화를 유도하기에 충분한 적절한 농도를 선택할 수 있다. 상기 배지 중 HDAC 억제제의 농도는 약 0.01 내지 약 100.0 mM 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, HDAC 억제제가 발프로산인 경우, 상기 배지 중 발프로산의 농도는 약 0.01 내지 약 10.0 mM, 약 0.01 내지 약 5.0 mM, 약 0.01 내지 약 1.0 mM, 약 0.1 내지 약 10.0 mM, 약 0.1 내지 약 5.0 mM, 약 0.1 내지 약 1.0 mM, 또는 약 0.5 mM일 수 있다. HDAC 억제제의 농도가 상기 범위를 벗어날 경우 직접교차분화가 정상적으로 이루어지지 않거나 분화 효율이 감소할 수 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에서, 상기 배지 중 GSK-3 억제제의 농도는 GSK-3 억제제의 구체적인 종류에 따라 직접교차분화를 유도하기에 충분한 적절한 농도를 선택할 수 있다. 상기 배지 중 GSK-3 억제제의 농도는 약 0.01 내지 약 1000 μM 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, GSK-3 억제제가 CHIR99021인 경우, 상기 배지 중 CHIR99021의 농도는 약 0.1 내지 약 10 μM, 약 0.1 내지 약 5 μM, 약 0.5 내지 약 10 μM, 약 0.5 내지 약 5 μM, 약 1 내지 약 10 μM, 약 1 내지 약 5 μM, 또는 약 3 μM일 수 있다. GSK-3 억제제의 농도가 지나치게 높을 경우 세포가 죽을 수 있다. GSK-3 억제제의 농도가 지나치게 낮을 경우 분화 효율이 떨어질 수 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에서, 상기 배지 중 항산화제의 농도는 항산화제의 구체적인 종류에 따라 직접교차분화의 분화 효율을 증가시키에 충분한 적절한 농도를 선택할 수 있다. 상기 배지 중 항산화제의 농도는 약 0.001 내지 약 1000 μg/ml 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 항산화제가 아스코르브산인 경우, 상기 배지 중 아스코르브산의 농도는 약 10 내지 약 1000 μg/ml, 약 10 내지 약 500 μg/ml, 약 10 내지 약 300 μg/ml, 약 10 내지 약 200 μg/ml, 약 50 내지 약 1000 μg/ml, 약 50 내지 약 500 μg/ml, 약 50 내지 약 300 μg/ml, 약 50 내지 약 200 μg/ml, 약 50 μg/ml, 또는 약 100 μg/ml 일 수 있다. 일부 구체예에서, 항산화제가 레스베라트롤인 경우, 상기 배지 중 레스베라트롤의 농도는 약 0.01 내지 약 50 μM, 또는 약 0.01 내지 약 20 μM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항산화제의 농도가 지나치게 높거나 낮은 경우 분화 효율이 감소할 수 있고, 세포 사멸을 유도할 수도 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에서, 상기 배지는 당해 분야에서 체세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원, 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배지는 체세포로부터 공통골수계전구세포(CMP)로의 직접교차분화 유도에 도움이 되는 성분을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 배지는 리프로그래밍(reprogramming) 배지일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 배지는 KSR (Knockout Serum Replacement), 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민, 비필수아미노산, IGFII, bFGF2, β-메르캅토에탄올, 또는 이들의 2 이상의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에서, 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 체세포는 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 지방간질세포(adipose stromal cell), 상피세포, 근육세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 혈액세포, 모낭 줄기세포, 신경줄기세포, 조혈모세포, 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 체세포의 직접교차분화를 유도할 수 있는 배양 조건은 당해 분야에서 체세포의 직접교차분화를 유도하기 위한 통상적인 배양 조건을 선택할 수 있다.
상기 배양은 계대 배양(subculture)일 수 있다. 상기 제1 배양 및 제2 배양은 계대 배양일 수 있다. 용어 "계대 배양(subculture)"은 원래 배양물에서 일부 세포를 새로운 배양 배지로 옮겨서 새로운 세포를 배양하는 것을 의미한다.
상기 배양은 부착 배양일 수 있다. 상기 제1 배양 및 제2 배양은 부착 배양일 수 있다. 부착 배양 시, 상기 세포는 geltrex 또는 matrigel이 코팅된 세포 지지체, 예를 들면 플레이트에서 부착 배양되는 것일 수 있다.
상기 배양 시간은 체세포를 공통골수계전구세포(CMP)로 직접교차분화시키기에 충분한 시간일 수 있고, 예컨대, 약 20일 내지 약 36일, 약 20일 내지 약 32일, 약 24일 내지 약 36일, 약 24일 내지 약 32일, 또는 약 28일일 수 있다.
상기 제1 배양 시간은 약 10 내지 약 20일, 약 10일 내지 약 18일, 약 10일 내지 약 16일, 약 12일 내지 약 20일, 약 12일 내지 약 18일, 약 12일 내지 약 16일, 도는 약 14일일 수 있다.
상기 제2 배양 시간은 약 10 내지 약 20일, 약 10일 내지 약 18일, 약 10일 내지 약 16일, 약 12일 내지 약 20일, 약 12일 내지 약 18일, 약 12일 내지 약 16일, 도는 약 14일일 수 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에 의해 제조된 세포는 CD45 및 CD14 중 어느 하나 이상의 마커를 발현하는 것일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계에 의해 제조된 세포는 CD34를 발현하지 않았으므로 조혈모세포가 아니며, CD45 및 CD14의 발현이 확인되었으므로 공통골수계전구세포(CMP)임을 확인하였다. 또한, 상기 방법은 SOX2 형질도입에 의한 직접교차분화 방법에 비해 분화 효율이 우수하다.
상기 방법은 상기 제조된 공통골수계전구세포(CMP)를 골수계 세포로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 골수계 세포는 골수아세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 과립구, 수지상세포, 또는 대식세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 골수계 세포로 분화시키는 단계에서, 공통골수계전구세포(CMP)를 목적하는 세포로 분화시키기 위한 배지에서 배양할 수 있다. 기존 문헌(Szabo, E., et al. (2010). Nature, 468(7323), 521-526.; 및 J. Pulecio et al., Stem Cells. 2014 Nov. 32(11):2923-2938)에서는 CD45 발현이 확인된 CMP를 각각 목적하는 세포로 분화시키기 위한 배지에서 배양하여 호중구, 단핵구, 과립구, 수지상세포, 대식세포 등으로 분화시킨 예시를 제시하고 있다. 예를 들어, 상기 목적하는 세포가 대식세포인 경우, 상기 배지는 대식세포 분화 배지일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 제조된 공통골수계전구세포(CMP)를 대식세포로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 대식세포로 분화시키는 단계에서, 공통골수계전구세포(CMP)를 대식세포 분화 배지에서 배양할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 대식세포로 분화시키는 단계에서, 공통골수계전구세포(CMP)를 대식세포콜로니자극인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), IL-4, 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
상기 대식세포로 분화시키는 단계에서, 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 대식세포로 분화시키는 단계에서, 상기 배양 시간은 약 2 내지 약 14일, 약 2 내지 약 10일, 약 2 내지 약 8일, 약 4 내지 약 14일, 약 4 내지 약 10일, 약 4 내지 약 8일, 약 6 내지 약 14일, 약 6 내지 약 10일, 약 6 내지 약 8일, 또는 약 7일일 수 있다.
상기 대식세포로 분화시키는 단계에 의해 제조된 대식세포는 대식작용 기능을 갖는 것일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 대식세포로 분화시키는 단계에 의해 제조된 대식세포는 대식작용 기능을 갖는 것을 확인하였다.
상기 방법은 상기 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계 이전에, 체세포를 전처리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 전처리하는 단계는, (1) 항산화제를 포함하는 배지에서 체세포를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 배지에 HDAC 억제제를 첨가하여 체세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 전처리하는 단계에서, 상기 배지는 FBS, 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 글루타민, 비필수아미노산, β-메르캅토에탄올, 또는 이들의 2 이상의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 전처리하는 단계에서, 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 단계 (1)에서, 상기 배양 시간은 세포 전처리에 충분한 시간일 수 있고, 예컨대, 약 12 내지 약 36시간, 약 12 내지 약 32시간, 약 12 내지 약 28시간, 약 16 내지 약 36시간, 약 16 내지 약 32시간, 약 16 내지 약 28시간, 약 20 내지 약 36시간, 약 20 내지 약 32시간, 약 20 내지 약 28시간, 또는 약 24시간일 수 있다.
상기 단계 (2)에서, 상기 배양 시간은 세포 전처리에 충분한 시간일 수 있고, 예컨대, 약 12 내지 약 36시간, 약 12 내지 약 32시간, 약 12 내지 약 28시간, 약 16 내지 약 36시간, 약 16 내지 약 32시간, 약 16 내지 약 28시간, 약 20 내지 약 36시간, 약 20 내지 약 32시간, 약 20 내지 약 28시간, 또는 약 24시간일 수 있다.
상기 전처리하는 단계를 포함하면, 체세포의 직접교차분화 효율을 증가시킬 수 있다.
다른 양상은 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP), 골수계 세포, 또는 대식세포를 제공한다.
상기 공통골수계전구세포(CMP), 골수계 세포, 및 대식세포에 관한 상세는 상술한 바와 같다.
상기 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포는 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료 용도로 다양하게 활용될 수 있다.
상기 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포는 역분화줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 체세포로부터 직접교차분화 유도된 것이기 때문에, 미분화세포로부터 유래한 기형종이 형성될 가능성이 낮아 안전할 수 있다.
다른 양상은 상기 직접교차분화 유도용 조성물, 또는 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
용어 "섬유증(fibrosis)"은 재생이나 반응 과정에서 기관이나 조직에 과도한 섬유성 결합조직이 형성되는 것을 의미한다. 상기 섬유증의 예는 폐부종, 간경변, 심내막심근섬유증, 종격동섬유증, 골수섬유증, 후복막섬유증, 괴상섬유화, 신원성전신섬유증, 크론병, 흉터종, 심근경색, 전신성경피증 등을 포함한다.
용어 "흉터(scar)"는 질병이나 손상에 의해 손상되었던 피부가 치유된 흔적을 의미한다. 상기 흉터는 위축성흉터(atrophic scar), 켈로이드(keloid), 비후성흉터(hypertrophic scar) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 흉터의 원인은 특별히 제한되지 않는다.
용어 "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다.
용어 "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 상기 직접교차분화 유도용 조성물, 또는 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함할 수 있다.
용어 "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 활성성분이 첨가되는 것을 의미한다. 또한, 이는 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션(formulation)되는 것을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 실제 임상투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 예컨대 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
다른 양상은 유효량의 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 또는 흉터를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위하여 일 구체예에 따른 직접교차분화 유도된 대식세포는 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
상기 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육 또는 피하 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 피부에 도포되는 방식이라는 어떤 경로로든지 투여될 수 있다.
용어 "개체"란 섬유증 또는 흉터의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 포함한다.
상기 조성물은 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료, 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
다른 양상은 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.
용어 "세포치료제"는 조직의 기능을 복원하기 위하여 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 이용한 치료제를 의미한다. 상기 직접교차분화 유도된 대식세포를 유효성분으로 포함하면 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료를 위한 세포 치료제로 활용할 수 있다.
상기 세포치료제는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 예컨대 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, HSA(Human serum albumin) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 세포치료제는 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다.
다른 양상은 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.
상기 약물 스크리닝용 조성물은 섬유증 또는 흉터 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 반응성을 확인하는 방법으로 섬유증 또는 흉터 치료제를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 대식세포는 섬유증 또는 흉터의 회복 또는 치료에 중요한 세포로서 후보 물질에 대한 독성 또는 약효를 평가하는데 사용할 수 있다.
상기 독성의 평가는 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 상기 직접교차분화 유도된 대식세포의 IC50 등 당업계에서 통상적으로 독성을 판단하는 방법에 따라 평가할 수 있다. 또한, 상기 약효의 평가는 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 상기 직접교차분화 유도된 대식세포가 섬유증 또는 흉터의 회복 또는 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있는 통상적인 방법에 따라 평가할 수 있다.
다른 양상은 상기 직접교차분화 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터 치료용 인공조직 제작을 위한 3D 프린팅 생체소재 조성물을 제공한다.
상기 3D 프린팅 기술은 3차원(3D)의 입체적 고체 물질을 프린트하는 출력 기술이다. 상기 3D 프린팅 생체소재 조성물은 생체모방, 소형조직 및 자율성 자가조립의 특징을 가지는 생체적합성 고분자, 천연고분자, 바이오분자, 생체활성물질, 세포를 의미한다.
상기 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 3D 프린팅 생체소재 조성물을 원하는 형상 또는 패턴으로 적층 조형함으로써 섬유증 또는 흉터 치료용 인공조직 제작이 가능하므로, 이는 재생치료분야에서 널리 활용될 수 있다.
본 명세서에서, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 화합물 칵테일을 포함하는 체세포로부터 공통골수계전구세포로의 직접교차분화 유도용 조성물에 의하면, 기존의 유전자 형질도입에 의한 방법에 비해 짧은 기간 내에 높은 수득률로 공통골수계전구세포 및 대식세포를 제조할 수 있다. 또한, 유전자의 조작이나 변이 없이 실제 임상에 적용되는 약물을 이용함으로써 보다 안전하고 안정적으로 체세포로부터 공통골수계전구세포 및 대식세포로 직접교차분화가 가능하다. 따라서, 상기 조성물 및 이를 이용하여 제조된 공통골수계전구세포 및 대식세포는 섬유아세포에 의한 질환, 예를 들어, 섬유증, 흉터 등의 만성-난치성 질환의 예방 또는 치료 용도로 응용될 수 있다.
도 1은 섬유아세포에서 SOX2 과발현을 이용하여 대식세포를 제조하기 위한 모식도이다.
도 2A는 신생아 섬유아세포에 mCitrine-SOX2 도입 후 21일 배양 후, mCitrine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 2B는 신생아 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 21일 배양 후, 혈액세포 마커인 CD45와 mCitirine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 2C는 신생아 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 혈구세포 성숙(maturation) 배양 후, 혈액세포 마커인 CD45와 mCitirine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 2D는 신생아 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 CD45 발현하는 세포를 대식세포로 분화시켜 이의 대식작용을 평가한 결과이다.
도 3은 신생아 섬유아세포에 mCitrine-SOX2를 형질도입하여 21일 배양 후, 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 4A는 성인 섬유아세포에 mCitrine-SOX2 도입 후 21일 배양 후, mCitrine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 4B는 성인 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 21일 배양 후, 혈액세포 마커인 CD45와 mCitirine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 4C는 성인 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 혈구세포 성숙(maturation) 배양 후, 혈액세포 마커인 CD45와 mCitirine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 4D는 성인 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 CD45 발현하는 세포를 대식세포로 분화시켜 이의 대식작용을 평가한 결과이다.
도 5는 성인 섬유아세포에 mCitrine-SOX2를 형질도입하여 21일 배양 후, 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 6은 섬유아세포에서 화합물 칵테일을 이용하여 SOX2의 발현을 강화시켜 대식세포를 제조하기 위한 모식도이다.
도 7A는 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 조혈모세포 마커 CD34와 혈액세포 마커 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 7B는 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 혈액세포 마커 CD45와 CMP 마커 CD14의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 7C는 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포를 대식세포로 분화시켜 이의 대식작용을 평가한 결과이다.
도 8은 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 9A는 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 조혈모세포 마커 CD34와 혈액세포 마커 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 9B는 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 혈액세포 마커 CD45와 CMP 마커 CD14의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 9C는 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포를 대식세포로 분화시켜 이의 대식작용을 평가한 결과이다.
도 10는 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 11은 신생아 섬유아세포(HDF-N)에 SOX2를 형질도입하여 획득한 세포(SOX2 OE)와 화합물 칵테일을 첨가하여 획득한 세포(TβRIin)에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, Brachy; 그리고 혈구 생성에 필수 마커인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR 분석하여 비교한 결과이다.
도 12는 성인 섬유아세포(HDF-A)에 SOX2를 형질도입하여 획득한 세포(SOX2 OE)와 화합물 칵테일을 첨가하여 획득한 세포(TβRIin)에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, Brachy; 그리고 혈구 생성에 필수 마커인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR 분석하여 비교한 결과이다.
도 13A은 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, SOX2의 발현 정도를 qRT-PCR로 확인한 결과이다. C (Control): Tet-shSOX2를 도입하지 않은 섬유아세포; Tet-shSOX2 I 및 Tet-shSOX2 II: Tet-shSOX2를 도입하여 SOX2 발현을 저해한 섬유아세포.
도 13B은 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 혈액세포 마커 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다. Control: Tet-shSOX2를 도입하지 않은 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하지 않고 28일간 배양한 세포; HDF+TβRIin: Tet-shSOX2를 도입하지 않은 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도한 세포; Tet shSOX2-I+TβRIin 및 Tet shSOX2-II+ TβRIin: Tet-shSOX2를 도입하여 SOX2 발현을 저해한 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도한 세포.
도 14는 정상 신생아 섬유아세포(HDF-N)와 WT(wild type), CA(constitutively active), 또는 KD(kinase dead)를 과발현시킨 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 획득한 세포에서 혈액세포 마커 CD45와 CMP 마커 CD14의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 15는 정상 신생아 섬유아세포(HDF-N)와 WT, CA, 또는 KD를 과발현시킨 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 16은 정상 성인 섬유아세포(HDF-A)와 WT, CA, 또는 KD를 과발현시킨 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 획득한 세포에서 혈액세포 마커 CD45와 CMP 마커 CD14의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 17는 정상 성인 섬유아세포(HDF-A)와 WT, CA, 또는 KD를 과발현시킨 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 실험 방법>
1. 세포주 및 벡터의 준비
인간의 피부에서 유래한 섬유아세포 (human dermal fibroblast)를 ThermoFisher (USA)에서 구입하였다. 구체적으로, 신생아 섬유아세포 (HDF-N; neonatal-C0045C)와 성인 섬유아세포 (HDF-A; adult-C0135C)를 각각 구입하였다.
섬유아세포에 형질도입할 분화인자는 SOX2이고, 렌티바이러스 벡터(pLM-mCitrin-SOX2)는 Addgene에서 구입하였다. 선택적으로 SOX2의 발현을 억제할 수 있는 SOX2의 Tet (tetracycline) 유도성 넉다운 벡터(Tet-shSOX2)는 Addgene에서 구입하였다. TGF-β 수용체 타입 I (TGFBR1, ALK5)의 발현 및 활성을 조절할 수 있는 벡터(pcDNA3-ALK5 WT, pcDNA3-ALK5 T204D, pcDNA3-ALK5 K232R)는 Addgene에서 구입하였다. 구체적으로, pcDNA3-ALK5 WT는 TGFBR1 야생형(wild type, WT) 발현 벡터이고, pcDNA3-ALK5 T204D는 항상 활성을 유지(constitutively active, CA) 하는 형태인 TGFBR1 T204D 변이체 발현 벡터이고, pcDNA3-ALK5 K232R는 키나아제 활성이 없는(kinase dead, KD) TGFBR1 K232R 변이체 발현 벡터이다.
2. 분화된 대식세포의 기능성 평가
SOX2 과발현 방법 또는 화합물 칵테일을 이용한 방법에 의해 일주일간 대식세포 분화를 유도한 후 획득된 대식세포가 기능성을 갖는지 확인하기 위해, 대식작용 평가를 수행하였다. 구체적으로, 1 μm 크기의 라텍스 비드(sigma)를 세포 배양액에 첨가하여 60-90분간 반응시켰다. 차가운 PBS (phosphate-buffered saline)로 세척 후, 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 액으로 고정하여 세포 모양 및 대식 과정을 현미경으로 관찰하였다.
3. 리프로그래밍 관련 유전자 분석을 위한 qRT-PCR
섬유아세포의 리프로그래밍 특성을 확인하기 위해, 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽(mesodermal) 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인하였다.
상기 전분화능 마커는 리프로그래밍이나 직접교차분화시 줄기세포의 줄기능(stemness)을 평가하기 위해 사용하였다. 세포에서 전분화능 마커가 발현될 경우, 다분화성(totipotency)을 획득했다고 볼 수 있다.
MXIL1과 BRACHY는 중배엽 계열 및 혈구/단핵세포 분화 유도에 기여하는 인자이다. 이 유전자들은 조혈모세포-줄기세포 특성을 가진 세포보다 분화되면서 혈액세포의 특성을 결정하고 이의 기능을 발달시키는 역할을 하는 것으로 보고되었다. 혈액세포는 중배엽에서부터 분화가 되는 세포 중 하나이다.
C/EBPα는 혈액세포 분화/발달에서 핵심 인자 중 하나이고, PU.1은 단핵세포/대식세포 분화 및 발달 유도인자로 알려져 있다.
구체적으로, 트리졸(Trizol)을 이용하여 세포 내 RNA를 분리하고, 1 μg의 RNA를 기반으로 cDNA를 합성한 후, 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 정상 섬유아세포 (HDF-N 또는 HDF-A)에서 상기 마커의 양을 1로 하여 상대적으로 분석하였다.
유전자 명칭 방향 서열(5'-> 3') 서열번호
SOX2 정방향 GGGGGAAAGTAGTTTGCTGCCTCT 서열번호 1
역방향 CCTCCTCTGGCCGATCCTGC 서열번호 2
NANOG 정방향 CAGCCTCCAGCAGATGCAAGAACT 서열번호 3
역방향 TGAGGCCTTCTGCGTCACACC 서열번호 4
Oct4 정방향 AGCAAAACCCGGAGGAGTCCC 서열번호 5
역방향 GCAGATGGTCGTTTGGCTGAATACC 서열번호 6
MIXL1 정방향 AAACTGAGAAGTATCCTCTGCTAA 서열번호 7
역방향 TCTTCTGCAAGCCTCCCTAACACA 서열번호 8
BRACHY 정방향 ATGAGCCTCGAATCCACATAGT 서열번호 9
역방향 TCCTCGTTCTGATAAGCAGTCA 서열번호 10
C/EBPα 정방향 GAGGGACCGGAGTTATGACA 서열번호 11
역방향 TTCACATTGCACAAGGCACT 서열번호 12
PU.1 정방향 GACAGGCAGCAAGAAGAAG 서열번호 13
역방향 TTGGACGAGAACTGGAAGG 서열번호 14
SCL 정방향 CAAAGTTGTGCGGCGTATCTT 서열번호 15
역방향 TCATTCTTGCTGAGCTTCTTGTC 서열번호 16
GAPDH 정방향 GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 서열번호 17
역방향 GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 서열번호 18
4. 특정 단백질 발현 여부를 확인하기 위한 FACS 분석
섬유아세포로부터 CMP로의 직접교차분화능을 확인하기 위해서 유세포분석법 (FACS, flow cytometry)을 시행하였다. 아래와 같은 항체를 이용하여 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC) 세포막 마커인 CD34, 혈액세포(blood cell) 세포막 마커인 CD45, CMP (Common myeloid progenitor) 세포막 마커인 CD14 단백질 발현 정도를 확인하였다. 사용한 항체는 다음과 같다:
- FITC 접합된 마우스 항-인간 CD34 단일클론항체, eBioscience
- APC 접합된 마우스 항-인간 CD45 단일클론항체, eBioscience
- APC-eFluor780 접합된 마우스 항-인간 CD14 단일클론항체, eBioscience
세포를 아큐테이즈(Accutase) 처리하여 단일 세포로 분리한 후, 1% FBS/PBS 용액을 이용하여 세척하였다. Fc blocker (bioscience)를 10분간 처리하여 비특이적(non-specific) 항원 반응을 억제한 후, 1% FBS/PBS 용액을 이용하여 15분간 블로킹(blocking) 하였다. 특정 항체로 항원-항체 반응을 상온에서 1시간 시켰다. 대조군으로 정상 섬유아세포에 APC 마우스 IgG1 이소타입을 반응시켜 사용하였다. 반응 후, 차가운 PBS 용액으로 2번 세척 후, Beckman사의 CytoFLEX로 유세포 분석을 시행하였으며, 데이터는 CytExpert 프로그램을 이용하여 분석하였다.
실시예 1. SOX2 과발현을 이용한 섬유아세포로부터 대식세포의 제조
섬유아세포로부터 대식세포 제조하기 위해, 섬유아세포에 SOX2를 형질도입하여 과발현시킴으로써 이를 CMP로 성숙 배양한 후, 배양된 CMP를 대식세포로 분화시켰다.
도 1은 섬유아세포에서 SOX2 과발현을 이용하여 대식세포를 제조하기 위한 모식도이다.
(1) 섬유아세포에서 SOX2의 과발현에 의한 리프로그래밍
섬유아세포를 겔트렉스(geltrex) 또는 매트리겔(matrigel)이 코팅된 세포배양 접시에 배양하였다. SOX2를 형질도입하기 위한 렌티바이러스 벡터(pLM-mCitrin-SOX2)를 이용하여 293T 세포에서 바이러스를 생성하고, 생성된 바이러스가 포함된 배지를 상기 섬유아세포에 첨가하였다. 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 10% FBS (fetal bovine serum), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (P/S, 페니실린), 1% 글루타민 (glutaMAXTM-1), 1% NEAA (non-essential amino acid) 및 0.055 mM β-메르캅토에탄올이 첨가된 배지를 사용하였다.
상기와 같이 바이러스 처리 후, 리프로그래밍 배지를 2~3일에 한번씩 교환해가며 21일간 배양하였다. 상기 리프로그래밍 배지는 KnockOut DMEM 또는 DMEM/F-12에 15% KSR (Knockout Serum Replacement), 1% P/S, 1% 글루타민 (glutaMAXTM-I), 1% NEAA, 30 ng/ml IGFII (insulin-like growth factor II), 20 ng/ml bFGF2 (basic fibroblast growth factor 2) 및 0.1 mM β-메르캅토에탄올이 첨가된 배지를 사용하였다.
(2) 혈구세포 성숙(maturation) 배양
상기 SOX2 과발현으로 리프로그래밍된 세포를 아큐테이즈(accutase)를 이용하여 단일세포로 분리한 후, 초저부착 배양 디쉬(ultra-low attachment culture dish)에서 비부착 배양(suspended cultures)하였다. 비부착 배양을 14일간 진행하면서 혈구세포 성숙 배양 배지를 2-3일에 한번씩 교환해가며 세포를 배양하였다. 상기 혈구세포 성숙 배양 배지는 KnockOut DMEM에 20% BCS (Bovine calf serum), 1% P/S, 1% 글루타민 (glutaMAXTM-I), 1% NEAA, 1X 인슐린-트랜스페린-셀레니움, 20 ng/ml EGF (epidermal growth factor) 및 0.1 mM β-메르캅토에탄올이 첨가된 배지를 사용하였다.
(3) 대식세포로의 분화
상기 비부착 배양 방법으로 획득한 CMP를 아큐테이즈(accutase)를 이용하여 단일세포로 분리한 후, 대식세포 분화 배지에서 일주일간 배양하였다. 상기 대식세포 분화 배지는 RPMI1640에 10% FBS (fetal bovine serum), 1% P/S, 10 ng/ml M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), 10 ng/ml IL4 (interleukin-4) 및 0.055 mM β-메르캅토에탄올이 첨가된 배지를 사용하였다.
(4) 세포 특성 확인
도 2A는 신생아 섬유아세포에 mCitrine-SOX2 도입 후 21일 배양 후, mCitrine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, SOX2에 따른 형광이 발현되었으므로, SOX2가 성공적으로 과발현되었음을 확인하였다.
도 2B는 신생아 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 21일 배양 후, 혈액세포 마커인 CD45와 mCitirine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 2B에 나타낸 바와 같이, mCitirine-SOX2의 발현을 유도한 경우 미미하게 CD45가 발현됨을 확인하였다.
도 2C는 신생아 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 혈구세포 성숙(maturation) 배양 후, 혈액세포 마커인 CD45와 mCitirine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, 성숙 후에는 세포가 CD45를 발현하는 비율이 좀 더 증가함을 확인하였다.
도 2D는 신생아 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 CD45 발현하는 세포를 대식세포로 분화시켜 이의 대식작용을 평가한 결과이다. 도 2D에 나타낸 바와 같이, 분화된 대식세포는 대식 기능을 나타내었다.
도 3은 신생아 섬유아세포에 mCitrine-SOX2를 형질도입하여 21일 배양 후, 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 4A는 성인 섬유아세포에 mCitrine-SOX2 도입 후 21일 배양 후, mCitrine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, SOX2에 따른 형광이 발현되었으므로, SOX2가 성공적으로 과발현되었음을 확인하였다.
도 4B는 성인 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 21일 배양 후, 혈액세포 마커인 CD45와 mCitirine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, mCitirine-SOX2의 발현을 유도한 경우 미미하게 CD45가 발현됨을 확인하였다.
도 4C는 성인 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 혈구세포 성숙(maturation) 배양 후, 혈액세포 마커인 CD45와 mCitirine-SOX2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 4C에 나타낸 바와 같이, 신생아 섬유아세포와 유사하게 성숙 과정 후 CD45의 발현율이 증가하여 분화가 유도됨을 확인하였다. 분화 효율은 신생아 섬유아세포의 경우보다 더 높음을 알 수 있었다.
도 4D는 성인 섬유아세포에 mCitirine-SOX2 도입 후 CD45 발현하는 세포를 대식세포로 분화시켜 이의 대식작용을 평가한 결과이다. 도 4D에 나타낸 바와 같이, 분화된 대식세포는 대식 기능을 나타내었다.
도 5는 성인 섬유아세포에 mCitrine-SOX2를 형질도입하여 21일 배양 후, 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 2 내지 도 5를 종합해 보면, SOX2 단일 과발현만으로도 혈액세포 분화 관련 인자가 과발현되는 것을 확인할 수 있었다. 조혈모세포 마커인 CD34의 발현은 관찰되지 않았으나(data not shown), 혈액세포 마커인 CD45 발현을 확인하였으므로, 섬유아세포를 CMP로 리프로그래밍이 가능함을 확인하였다. 또한, SOX2 과발현을 통해 획득한 세포는 대식 기능을 갖는 대식세포로의 분화가 가능함을 확인하였다. 이와 관련하여, 기존 문헌(J. Pulecio et al., "Conversion of human fibroblasts into monocyte-like progenitor cells", Stem Cells. 2014 Nov;32(11):2923-2938. doi: 10.1002/stem.1800.)에서는 정상 섬유아세포에 SOX2와 miR-125b를 함께 처리하여 CMP로 직접교차분화 유도하였으나, SOX2 단독 도입만으로는 분화 효율이 낮고, miR-125b를 함께 사용하여야만 분화 효율이 증가함을 보고하였다.
실시예 2. 화합물 칵테일을 이용한 섬유아세포로부터 대식세포의 제조
섬유아세포로부터 대식세포 제조하기 위해, 섬유아세포에 SOX2 발현을 강화하기 위한 화합물을 첨가하여 CMP로 성숙 배양한 후, 배양된 CMP를 대식세포로 분화시켰다.
도 6은 섬유아세포에서 화합물 칵테일을 이용하여 SOX2의 발현을 강화시켜 대식세포를 제조하기 위한 모식도이다.
(1) 섬유아세포의 전처리
섬유아세포로부터 CMP로의 직접교차분화를 유도하기 전 단계에서, 섬유아세포를 전처리하였다. 섬유아세포의 전처리는 섬유아세포의 CMP로의 직접교차분화 효율을 증가시킬 수 있으며, 선택적인 단계이다.
섬유아세포를 겔트렉스(geltrex) 또는 매트리겔(matrigel)이 코팅된 세포배양 접시에 배양하였다. 전처리 배양 배지는 DMEM에 10% FBS, 1% P/S, 1% 글루타민 (glutaMAXTM-I), 1% NEAA, 50 μg/ml 비타민C (Vitamin C, VitC) 및 0.055 mM
Figure pat00001
-메르캅토에탄올이 첨가된 배지를 사용하였다. 배양 시작 24시간 후, VPA (valproic acid, 0.5 mM)를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다.
(2) 화합물 칵테일 첨가에 의한 섬유아세포로부터 CMP로의 직접교차분화
상기 전처리된 세포를 화합물 칵테일이 첨가된 리프로그래밍 배지에서 제1 배양하였다. 제1 배양 단계에서 배지는 2~3일에 한번씩 교환하고, 일주일에 한번씩 계대 배양하면서 총 14일간 배양하였다. 상기 화합물 칵테일은 TGF-β 수용체 억제제 (616452), 발프로산 (VPA), 및 비타민C (VitC)를 포함한다. 항산화제인 비타민C는 분화 효율을 증가시키기 위해 사용하였으나, 직접교차분화를 위해 반드시 필요한 물질은 아니다. 구체적인 배지 조성은 하기 표 2에 나타내었다.
구분 화합물 칵테일이 첨가된 리프로그래밍 배지 조성
기본 리프로그래밍 배지 KnockOut DMEM
15% KSR (Knockout Serum Replacement)
1% 페니실린 스트렙토마이신 (P/S, 페니실린)
1% 글루타민 (glutaMAXTM-I)
1% NEAA (non-essential amino acid)
30 ng/ml IGFII (insulin-like growth factor II)
20 ng/ml bFGF2 (basic fibroblast growth factor 2)
0.1 mM β-메르캅토에탄올
화합물 칵테일 TGFβRI 억제제 (616452, 10 μM)
0.5 mM VPA
100 μg/ml VitC
그 다음, 제2 배양 단계에서는 상기 배지 조성에 GSK-3 억제제 (Glycogen synthase kinase 3 inhibitor; CHIR99021)를 추가적으로 첨가한 배지에서 세포를 배양하였다. 상기 배지 중 GSK-3 억제제의 농도는 3 μM로 하였다. 배지는 2~3일에 한번씩 교환하고, 일주일에 한번씩 계대 배양하면서 총 14일간 배양하였다.
(3) 대식세포로의 분화
상기 직접교차분화를 통해 획득한 CMP를 대식세포 분화 배지에서 일주일간 배양하였다. 상기 대식세포 분화 배지는 RPMI1640에 10% FBS (fetal bovine serum), 1% P/S, 10 ng/ml M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), 10 ng/ml IL4 (interleukin-4) 및 0.055 mM β-메르캅토에탄올이 첨가된 배지를 사용하였다.
(4) 세포 특성 확인
도 7A는 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 조혈모세포 마커 CD34와 혈액세포 마커 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다. 도 7A에 나타낸 바와 같이, CD34는 발현되지 않았으므로 배양된 세포는 조혈모세포가 아님을 알 수 있다. 반면, CD45를 발현하는 세포들이 증가하였다.
도 7B는 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 혈액세포 마커 CD45와 CMP 마커 CD14의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, CD45 및 CD14의 발현이 확인되었으므로, 섬유아세포가 조혈모세포가 아닌 CMP 계열 세포로 분화되었음을 알 수 있었다.
도 7C는 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포를 대식세포로 분화시켜 이의 대식작용을 평가한 결과이다. 도 7C에 나타낸 바와 같이, 분화된 대식세포는 대식 기능을 나타내었다.
도 8은 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 9A는 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 조혈모세포 마커 CD34와 혈액세포 마커 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다. 도 9A에 나타낸 바와 같이, 신생아 섬유아세포와 마찬가지로 CD34는 발현되지 않았으므로 CD45를 발현하는 세포들이 증가되었고, 이들은 CD34가 발현되지 않았으므로, 배양된 세포는 조혈모세포가 아님을 알 수 있다. 반면, CD45를 발현하는 세포의 비율이 신생아 섬유아세포에 비해 훨씬 증가하였다.
도 9B는 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 혈액세포 마커 CD45와 CMP 마커 CD14의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다. 도 9B에 나타낸 바와 같이, CD45와 CD14를 발현하는 세포의 비율이 신생아 섬유아세포에 비해 훨씬 증가하였다. 즉, 성인 섬유아세포는 CMP 계통 세포로의 분화 효율이 신생아 섬유아세포에 비해 증가함을 확인할 수 있었다.
도 9C는 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포를 대식세포로 분화시켜 이의 대식작용을 평가한 결과이다. 도 9C에 나타낸 바와 같이, 분화된 대식세포는 대식 기능을 나타내었다.
도 10는 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 28일간 배양 후 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 7 내지 도 10을 종합해 보면, 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화 방법으로 획득한 세포는 CD34 발현이 거의 없고, CD45와 CD14의 발현이 확인되어 조혈모세포가 아닌 CMP 계열로 분화가 됨을 확인할 수 있었다. 또한, 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화를 통해 획득한 세포는 대식 기능을 갖는 대식세포로의 분화가 가능함을 확인할 수 있다. 이는 관련 유전자 분석을 통해서도 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 2의 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화 방법을 통해 획득한 CMP는 실시예 1의 SOX2 과발현을 이용한 직접교차분화 방법을 통해 획득한 CMP에 비해 CD45 발현이 높았으므로, 실시예 2의 방법이 더욱 우수한 분화 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 1. SOX2 과발현에 의한 직접교차분화와 화합물 칵테일에 의한 직접교차분화의 비교
도 11은 신생아 섬유아세포(HDF-N)에 SOX2를 형질도입하여 획득한 세포(SOX2 OE)와 화합물 칵테일을 첨가하여 획득한 세포(TβRIin)에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, Brachy; 그리고 혈구 생성에 필수 마커인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR 분석하여 비교한 결과이다.
도 12는 성인 섬유아세포(HDF-A)에 SOX2를 형질도입하여 획득한 세포(SOX2 OE)와 화합물 칵테일을 첨가하여 획득한 세포(TβRIin)에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, Brachy; 그리고 혈구 생성에 필수 마커인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR 분석하여 비교한 결과이다.
도 11 내지 도 12를 종합해 보면, SOX2 과발현 또는 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화에 의해 획득한 세포에서 모두 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, Brachy; 그리고 혈구 생성에 필수 마커인 C/EBPα, PU.1, SCL의 발현이 비슷한 양상으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화 조건에서 NANOG 및 OCT4의 발현이 더 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화 조건에서 중배엽 계통 마커인 MIXL1, Brachy; 그리고 혈구 생성에 필수 마커인 C/EBPα, PU.1의 발현이 더 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, SOX2 과발현을 이용한 직접교차분화 방법에 비해 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화 방법이 직접교차분화 효율이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화의 SOX2 의존성 확인
화합물에 의한 SOX2 강화가 분화 효율에 영향을 미치는지 상관 관계를 이해하기 위해 하기 실험을 준비하였다.
섬유아세포에 Tet-shSOX2 벡터를 도입한 후 독시사이클린(doxycycline)을 처리하여 SOX2 발현을 억제하였다. 다음으로, 세포에 실시예 2의 (1) 및 (2)와 동일한 방법으로 화합물 칵테일을 첨가하고 28일간 배양하여 직접교차분화를 유도하였다. SOX2-I과 SOX2-II는 동일한 방법으로 준비한 서로 다른 세포 배치이다.
도 13A은 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, SOX2의 발현 정도를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 13B은 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 혈액세포 마커 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 화합물 칵테일을 이용한 섬유아세포로부터 CMP 계열 세포로의 직접교차분화는 SOX2 발현 강화에 의존적으로 이루어짐을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 화합물 칵테일에 의한 SOX2 강화 효과와 TGF-β 수용체 타입 I의 활성 정도의 상관 관계 및 이들이 분화 효율에 미치는 영향 확인
화합물에 의한 SOX2 강화 효과가 TGF-β의 저해로부터 유도되는 것임을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
섬유아세포에 pcDNA3-ALK5 WT, pcDNA3-ALK5 T204D, 또는 pcDNA3-ALK5 K232R 벡터를 도입하여 TGFβRI의 야생형(WT), 항상 활성을 유지하는 변이체(CA, T204D), 또는 활성이 없는 변이체(KD, K232R)를 발현하는 세포주를 확립하였다. 상기 각각의 세포주에 실시예 2의 (1) 및 (2)와 동일한 방법으로 화합물 칵테일을 첨가하고 28일간 배양하여 직접교차분화를 유도하였다.
도 14는 정상 신생아 섬유아세포(HDF-N)와 WT, CA, 또는 KD를 과발현시킨 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 획득한 세포에서 혈액세포 마커 CD45와 CMP 마커 CD14의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 15는 정상 신생아 섬유아세포(HDF-N)와 WT, CA, 또는 KD를 과발현시킨 신생아 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 16은 정상 성인 섬유아세포(HDF-A)와 WT, CA, 또는 KD를 과발현시킨 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 획득한 세포에서 혈액세포 마커 CD45와 CMP 마커 CD14의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 17는 정상 성인 섬유아세포(HDF-A)와 WT, CA, 또는 KD를 과발현시킨 성인 섬유아세포에 화합물 칵테일을 첨가하여 직접교차분화 유도 후, 획득한 세포에서 전분화능 마커인 SOX2, NANOG, OCT4; 중배엽 계통 마커인 MIXL1, BRACHY; 그리고 혈구 생성에 필수 유전자인 C/EBPα, PU.1, SCL 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 14 내지 도 17을 종합해 보면, 신생아 섬유아세포 및 성인 섬유아세포에서 TGF-β 수용체 타입 I의 기능이 억제된 KD 세포에서 CD45 및 CD14 단백질 발현이 매우 증가하였으므로, 화합물 칵테일에 의한 직접교차분화 효과를 확인할 수 있었다. 또한, 정상 신생아 섬유아세포보다 KD 세포에서 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화 유도 후, BRACHY와 SCL 발현이 더 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, 정상 성인 섬유아세포보다 KD 세포에서 화합물 칵테일을 이용한 직접교차분화 유도 후, SOX2의 발현이 더 증가됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 섬유아세포에서 TGF-β 활성을 저해함에 따라 SOX2 발현이 증가하고, CMP로 직접교차분화 가능함을 알 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Composition for inducing direct conversion of somatic cell into common myeloid progenitor and use thereof <130> PN137002 <160> 18 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SOX2 forward primer <400> 1 gggggaaagt agtttgctgc ctct 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SOX2 reverse primer <400> 2 cctcctctgg ccgatcctgc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NANOG forward primer <400> 3 cagcctccag cagatgcaag aact 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NANOG reverse primer <400> 4 tgaggccttc tgcgtcacac c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oct4 forward primer <400> 5 agcaaaaccc ggaggagtcc c 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oct4 reverse primer <400> 6 gcagatggtc gtttggctga atacc 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MIXL1 forward primer <400> 7 aaactgagaa gtatcctctg ctaa 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MIXL1 reverse primer <400> 8 tcttctgcaa gcctccctaa caca 24 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRACHY forward primer <400> 9 atgagcctcg aatccacata gt 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRACHY reverse primer <400> 10 tcctcgttct gataagcagt ca 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> C/EBP-alpha forward primer <400> 11 gagggaccgg agttatgaca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> C/EBP-alpha reverse primer <400> 12 ttcacattgc acaaggcact 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PU.1 forward primer <400> 13 gacaggcagc aagaagaag 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PU.1 reverse primer <400> 14 ttggacgaga actggaagg 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SCL forward primer <400> 15 caaagttgtg cggcgtatct t 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SCL reverse primer <400> 16 tcattcttgc tgagcttctt gtc 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH forward primer <400> 17 ggagcgagat ccctccaaaa t 21 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 18 ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (20)

  1. TGF-β 수용체 억제제, HDAC(histone deacetylase) 억제제, 및 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 포함하는, 체세포로부터 공통골수계전구세포(Common myeloid progenitor, CMP)로의 직접교차분화 유도용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 TGF-β 수용체 억제제는 2-[3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-1,5-나프티리딘 (616452), SB431542, 갈루니서팁 (LY2157299), LY3200882, 백토서팁 (TEW-7197), PF-06952229, 또는 이들의 2 이상의 조합인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 HDAC 억제제는 발프로에이트(Valproate), 트리코스타틴 A, 페닐부틸레이트, 소듐 부틸레이트, 수베로일아닐리드 하이드록삼산(Suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA), 수베로하이드록삼산(Suberohydroxamic acid, SBHA), 또는 이들의 2 이상의 조합인 것인 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 발프로에이트는 발프로산(Valproic acid, VPA), 발프로에이트 나트륨(sodium valproate), 디발프로엑스 나트륨(divalproex sodium), 또는 이들의 2 이상의 조합인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 GSK-3 억제제는 6-((2-((4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일)아미노)에틸)아미노)니코티노니트릴 (CHIR99021), TD114-2, SB216763, SB415286, 또는 이들의 2 이상의 조합인 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 항산화제를 더 포함하는 것인 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 항산화제는 아스코르브산, 레스베라트롤, 아세틸시스테인, 에틸비스이미노메틸구아이아콜망가니즈클로라이드 (EUK-134), NADPH 산화효소 억제제, 또는 이들의 2 이상의 조합인 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 지방간질세포(adipose stromal cell), 상피세포, 근육세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 혈액세포, 모낭 줄기세포, 신경줄기세포, 조혈모세포, 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 공통골수계전구세포(CMP)는 골수아세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 과립구, 수지상세포, 또는 대식세포로 분화할 수 있는 것인 조성물.
  10. TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, 및 GSK-3 억제제를 포함하는 배지에서 체세포를 배양하여 공통골수계전구세포(CMP)를 제조하는 단계를 포함하는, 체세포를 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 직접교차분화하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 배지에 항산화제를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, TGF-β 수용체 억제제 및 HDAC 억제제를 포함하는 배지에서 체세포를 제1 배양하는 단계; 및 상기 배양된 체세포를 TGF-β 수용체 억제제, HDAC 억제제, 및 GSK-3 억제제를 포함하는 배지에서 제2 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 제1 배양의 배지 및 제2 배양의 배지 중 하나 이상에 항산화제를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 지방간질세포(adipose stromal cell), 상피세포, 근육세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 혈액세포, 모낭 줄기세포, 신경줄기세포, 조혈모세포, 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 방법.
  15. 청구항 10에 있어서, 상기 제조된 공통골수계전구세포(CMP)를 대식세포로 분화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 대식세포로 분화시키는 단계에서, 공통골수계전구세포(CMP)를 대식세포콜로니자극인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), IL-4, 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 배양하는 것인 방법.
  17. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 조성물, 또는 청구항 10 내지 16 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 청구항 10 내지 16 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료용 세포 치료제.
  19. 청구항 10 내지 16 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터의 예방 또는 치료 약물 스크리닝용 조성물.
  20. 청구항 10 내지 16 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 공통골수계전구세포(CMP) 및 대식세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 섬유증 또는 흉터 치료용 인공조직 제작을 위한 3D 프린팅 생체소재 조성물.
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