KR20220082698A - 항체, 약학 조성물, 및 방법 - Google Patents

항체, 약학 조성물, 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-C1s 항체와 같은 항체, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 항원-결합 영역 및 항체 정상 영역을 포함하는 단리된 항체로서, C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터의 C1q의 해리를 촉진하는 대체 기능 및/또는 C1r2s2에 결합하여 C1q의 C1r2s2에 대한 결합을 억제하는 차단 기능을 갖고, C1s에 pH-의존적 방식으로 결합하는 항체를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 항체 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물, 및 개체에게 상기 항체 중 어느 하나를 투여하는 것을 포함하는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체의 치료, 또는 보체-매개 질환 또는 장애를 가질 가능성이 있는 개체의 예방 방법을 제공한다.

Description

항체, 약학 조성물, 및 방법
본 발명은 항-C1s 항체와 같은 항체, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
C1 복합체는 고전적인 경로 연쇄반응(cascade)의 핵심 억제제로서 기능하는 거대 단백질 복합체이다. C1 복합체는 3개의 성분, C1q, C1r 및 C1s로 이루어지며, 이들은 각각 1:2:2의 몰비로 존재한다(비특허문헌 1). 상기 고전적 경로는, C1 복합체가 항체들에 의해 결합되는 표적에 결합할 때 개시된다. 6개의 구형 머리를 갖는 C1q는 Fc 영역과의 결합력(avidity) 상호작용에 의해 항체에 대한 C1 복합체의 결합을 매개한다. 일단 표적에 단단하게 결합되면, C1 복합체 내의 C1r은 자동활성화되고 효소적으로 활성이 된다. 이어서, 활성화된 C1r은 C1 복합체 내의 전효소 C1s를 절단하고 활성화시킨다(비특허문헌 2). 이어서, 활성 C1s는 그의 기질들인 보체 성분 C2 및 C4를 각각 C2a/C2b 및 C4a/C4b 단편으로 절단한다. 이에 의해, 표적 표면 상에서, C4b2a의 조립체인 C3 전환효소가 유도되고, 이것은 C3을 절단하여 C3b를 생성한다. C3b는 이어서 C5를 절단하여 말단 막 공격 복합체, C5b, C6, C7, C8 및 C9의 생성을 개시하며, 이들 복합체는 기공 형성을 통해 표적을 용해시킨다.
C1s 및 C1r 단백질은 둘 다 동일한 도메인 구성, 곧 CUB1-EGF-CUB2-CCP1-CCP2-세린 프로테아제를 갖는다(비특허문헌 3). CUB1-EGF-CUB2 도메인은 C1r과 C1s 사이의 상호작용을 매개하여 C1r2s2 사량체를 생성하고(비특허문헌 4), 또한 C1r2s2와 C1q 사이의 상호작용을 매개한다(비특허문헌 5). 대조적으로, C1r 및 C1s의 CCP1-CCP2-세린 프로테아제 도메인은 그들 각각의 기질의 단백질분해성 절단을 담당한다(비특허문헌 6, 비특허문헌 7). C1r2s2 사량체는 상기 사량체의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 6개 결합 부위를 통해 C1q중의 6개 줄기와 상호작용한다(비특허문헌 5).
적절하게 기능하는 보체 시스템은 숙주를 병원체로부터 지키지만, 고전적 경로의 조절장애 또는 부적절한 활성화는 다양한 보체-매개 질병들, 예를 들어, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 베체트(Behcet)병, 수포성 천포창(Bullous Pemphigus, BP), 면역 혈소판감소증 자반병(ITP) 등을 야기하나, 이로 한정되지는 않는다. 그러므로, 고전적 경로의 과도하거나 제어되지 않는 활성화의 억제는 상기 질병을 갖는 환자에게 임상적 이점을 제공할 수 있다.
C1s의 베타 도메인에 결합하는 항체인 HI532는 C1r2s2와 C1q의 상호작용을 억제할 수 있는 것으로 보고되었다(비특허문헌 8). 그러나, 상기 항체는 인간 혈청의 용혈 활성을 완전히 중화시킬 수 없었으며, 혈청을 항체와 함께 24 시간 배양한 후에도 활성의 30%가 남아 있었다.
항체는 혈장에서 안정하고, 그 표적에 대해 매우 특이적이며, 일반적으로 우수한 약동학적 프로필을 나타내기 때문에 매우 매력적인 약제이다. 그러나, 그들의 큰 분자 크기로 인해, 치료 항체의 투여량은 통상적으로 높다. 매우 풍부하게 존재하는 표적의 경우, 항체의 필요한 치료 용량은 훨씬 더 높다. 결과적으로, 항체 약동학, 약력학 및 항원 결합 특성을 개선하는 방법이 치료 항체와 연관된 투여량 및 높은 생산비용을 감소시키는 매력적인 방법이다.
pH-의존적 방식으로 항원에 결합하는 항체(본 명세서 이하에서 "pH-의존성 항체" 또는 "pH-의존성-결합 항체"로도 지칭됨)는 단일 항체 분자가 다수의 항원 분자들을 중화시킬 수 있게 하는 것으로 보고되었다(비특허문헌 9, 특허문헌 1). 상기 pH-의존성 항체는 혈장 내 중성 pH 조건에서 그의 항원에 강하게 결합하지만, 세포의 엔도솜 내의 산성 pH 조건하에서 항원으로부터 해리된다. 일단 항원으로부터 해리되면, 항체는 FcRn 수용체에 의해 혈장으로 다시 재순환되는 반면, 해리된 항원들은 세포의 리소좀 내에서 분해된다. 재순환된 항체는 이어서 항원 분자에 다시 자유롭게 결합하고 상기 항원 분자를 중화시키며, 이 과정은 항체가 계속 순환되는 한 계속 반복된다.
WO2009/125825
Wang et. al. Mol Cell. 2016 Jul 7;63(1):135-45 Mortensen et. al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jan 31;114(5):986-991 Gal et. al. Mol Immunol. 2009 Sep;46(14):2745-52 Almitairi et. al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Jan 23;115(4):768-773 Bally et. al. J Biol Chem. 2009 Jul 17;284(29):19340-8 Rossi et. al. 1998 J Biol Chem. 1998 Jan 9;273(2):1232-9 Lacroix et. al. J Biol Chem. 2001 Sep 28;276(39):36233-40 Tseng et. al. Mol Immunol. 1997 Jun;34(8-9):671-9 Igawa et. al. Nat Biotechnol. 2010 Nov;28(11):1203-7
본 발명은 항-C1s 항체와 같은 항-보체 성분 항체, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 항원-결합 영역 및 항체 정상 영역을 포함하는 단리된 항체로서, C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터의 C1q의 해리를 촉진하는 대체(displacement) 기능 및/또는 C1r2s2에 결합하여 C1q의 C1r2s2에 대한 결합을 억제하는 차단 기능을 갖고, C1s에 pH-의존적 방식으로 결합하는, 항체를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 다음에 관한 것이다:
[1] 항원-결합 영역 및 항체 정상 영역을 포함하는 단리된 항체로서,
상기 항체는 C1qrs 복합체로부터의 C1q의 해리를 촉진하고/하거나 C1q의 C1r2s2에 대한 결합을 억제하고, 여기에서,
인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대한 항체의 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명으로 측정하는 경우,
i) 중성 pH 범위에서의 해리 상수(KD) 값은 신뢰성 있게 계산할 수 있고, 산성 pH 범위에서의 KD 값은 결합 활성의 부재 또는 상당히 낮은 결합 활성으로 인해 신뢰성 있게 계산할 수 없거나, 또는
ii) 중성 pH 범위와 산성 pH 범위에서의 KD 값을 모두 신뢰성 있게 계산할 수 있을 경우, 산성 pH 범위에서의 KD 값 대 중성 pH 범위에서의 KD 값의 비, 산성 KD/중성 KD 비는 10보다 큰, 항체.
[2] 표면 플라즈몬 공명에 의한 결합 활성은 각 항체가 인간 Ig 카파 경쇄에 의해 50 공명 단위로 그 위에 포획된 센서 칩, 및 20 mM ACES(N-(2-아세트아마이도)-2-아미노에테인설폰산), 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 1 mg/mL CM-덱스트란 나트륨염(CMD), 0.05% 폴리소베이트 20, 0.005% NaN3을 포함하는 러닝 버퍼를 사용하여 37℃에서 측정되는, [1]의 항체.
[3] 항체의 pI가 9.00 미만, 8.90 미만, 8.80 미만 또는 8.78 이하, 4.28 이상인 [1] 또는 [2]의 항체.
[4] pI가, 0.1% m/v 메틸 셀룰로스(MC) 중의 0.08 M 인산 함유 용액을 양극액 용액으로서, 0.1% m/v MC 중의 0.1 M 수산화 나트륨 함유 용액을 음극액 용액으로서, 및 0.5 mg/mL 항체, 0.3% m/v MC, 6.0 mM 이미노다이아세트산(IDA), 10 mM 아르기닌, 4 M 요소, 및 pI 마커(7.65 및 9.77) 함유 용액을 항체 용해용 작용 용액으로서 사용하는 모세관 등전 포커싱에 의해 측정되는, [3]의 항체.
[5] 항원-결합 영역이 인간 C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 항체.
[6] 항원-결합 영역이 AYAMN(서열 번호: 1)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(서열 번호: 2)으로 이루어진 HVR-H2 및 GRSX7NYX8SX9FHL(서열 번호: 3)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 QAX10X11X12LHDKX13NLA(서열 번호: 4)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, X14ASX15X16ES(서열 번호: 5)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(서열 번호: 6)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기에서 각각의 X1 내지 X23은 천연 발생 아미노산으로부터 선택되는, [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 항체.
[7] 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 항체 정상 영역을 포함하는 단리된 항-C1s 항체로서, 상기 중쇄 가변 영역은 AYAMN(서열 번호: 1)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(서열 번호: 2)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 GRSX7NYX8SX9FHL(서열 번호: 3)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 QAX10X11X12LHDKX13NLA(서열 번호: 4)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, X14ASX15X16ES(서열 번호: 5)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(서열 번호: 6)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하고, 여기에서 각각의 X1 내지 X23은 천연 발생 아미노산으로부터 선택되는, 항체.
[8] X1은 Lys 또는 Ser이고,
X2는 Gly 또는 Lys이고,
X3은 His 또는 Ser이고,
X4는 Glu 또는 Thr이고,
X5는 Glu 또는 Lys이고,
X6은 Glu 또는 Gly이고,
X7은 Lys 또는 Val이고,
X8은 Asn 또는 Val이고,
X9는 Asp 또는 Gly이고,
X10은 Asn, Gln 또는 Ser이고,
X11은 Gly 또는 Gln이고,
X12는 Ile 또는 Ser이고,
X13은 Lys 또는 Arg이고,
X14는 Gly 또는 Gln이고,
X15는 Gln 또는 Thr이고,
X16은 Leu 또는 Arg이고,
X17은 His 또는 Gln이고,
X18은 Pro 또는 Ser이고,
X19는 Cys 또는 Tyr이고,
X20은 Glu 또는 Ser이고,
X21은 Glu 또는 Ser이고,
X22는 Cys 또는 Leu이고,
X23은 Gln 또는 Thr인, [6] 또는 [7]의 항체.
[9] HVR-H1은 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2는 서열 번호: 8 내지 10으로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-H3은 서열 번호: 11 내지 13으로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L1은 서열 번호: 14 내지 18로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L2는 서열 번호: 19 내지 22로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L3은 서열 번호: 23 내지 28로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, [6] 내지 [8] 중 어느 하나의 항체.
[10] HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 아미노산 서열의 조합은 이하의 1) 내지 9)로 이루어진 군으로부터 선택되는, [6] 내지 [9] 중 어느 하나의 항체:
1) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 8로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 14로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
2) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 9로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 12로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 14로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
3) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
4) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
5) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
6) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 17로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 26으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
7) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
8) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
9) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
[11] X19 및/또는 X22가 Cys가 아닌, [6] 또는 [7]의 항체.
[12] X19는 Trp 또는 Tyr이고, X22는 Leu 또는 Met인, [11]의 항체.
[13] X1은 Ser이고,
X2는 Gly이고,
X3은 His이고,
X4는 Glu이고,
X5는 Glu이고,
X6은 Glu이고,
X7은 Lys이고,
X8은 Asn 또는 Val이고,
X9는 Asp 또는 Gly이고,
X10은 Asn, Gln 또는 Ser이고,
X11은 Gly 또는 Gln이고,
X12는 Ile이고,
X13은 Lys 또는 Arg이고,
X14는 Gly 또는 Gln이고,
X15는 Gln 또는 Thr이고,
X16은 Leu 또는 Arg이고,
X17은 His이고,
X18은 Pro 또는 Ser이고,
X19는 Tyr이고,
X20은 Glu 또는 Ser이고,
X21은 Glu 또는 Ser이고,
X22는 Leu이고,
X23은 Gln 또는 Thr인, [11] 또는 [12]의 항체.
[14] HVR-H1은 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2는 서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H3은 서열 번호: 11 또는 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1은 서열 번호: 15 내지 18로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L2는 서열 번호: 19 내지 22로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L3은 서열 번호: 24 내지 28로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, [11] 내지 [13] 중 어느 하나의 항체.
[15] HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 아미노산 서열의 조합은 이하의 3) 내지 9)로 이루어진 군으로부터 선택되는, [11] 내지 [14] 중 어느 하나의 항체:
3) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
4) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
5) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
6) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 17로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 26으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
7) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
8) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
9) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
[16] 항체 정상 영역이 중쇄 및 경쇄를 포함하는 인간 항체의 정상 영역인, [1] 내지 [15] 중 어느 하나의 항체.
[17] 인간 항체가 인간 IgG1인, [16]의 항체.
[18] 중쇄 정상 영역은, 하기 하나 이상의 아미노산이 부재한 인간 항체의 정상 영역과 비교하여 C1q에 대한 결합능을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, [16] 또는 [17]의 항체.
[19] C1q에 대한 결합능을 저하시킬 수 있는 상기 아미노산이 EU 넘버링 시스템의 238번 위치 Asp인, [18]의 항체.
[20] 중쇄 정상 영역은, 하기 하나 이상의 아미노산이 부재한 인간 항체의 정상 영역과 비교하여 Fc 감마 RIIb에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, [16] 내지 [19] 중 어느 하나의 항체.
[21] 인간 Fc 감마 RIIa에 대한 중쇄 정상 영역의 KD 값 대 인간 Fc 감마 RIIb에 대한 중쇄 정상 영역의 KD 값의 비(KD(hFc 감마 RIIa/KD(hFc 감마 RIIb))가, 상기 [20]의 하나 이상의 아미노산이 부재한 인간 항체의 정상 영역과 비교하여 높은, [20]의 항체.
[22] 중쇄 정상 영역이 EU 넘버링 시스템에서 234번 위치의 Tyr, EU 넘버링 시스템에서 238번 위치의 Asp, EU 넘버링 시스템에서 264번 위치의 Ile, 및 EU 넘버링 시스템에서 330번 위치의 Lys를 포함하는, [20] 또는 [21]의 항체.
[23] 중쇄 정상 영역이 EU 넘버링 시스템에서 214번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템에서 250번 위치의 Val, EU 넘버링 시스템에서 307번 위치의 Pro, EU 넘버링 시스템에서 311번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템에서 343번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템에서 428번 위치의 Leu, EU 넘버링 시스템에서 434번 위치의 Ala, EU 넘버링 시스템에서 436번 위치의 Thr, EU 넘버링 시스템에서 438번 위치의 Arg, 및 EU 넘버링 시스템에서 440번 위치의 Glu로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, [20] 내지 [22] 중 어느 하나의 항체.
[24] 정상 영역의 EU 넘버링 시스템에서 446번 및 447번 위치의 아미노산이 결실된, [16] 내지 [23] 중 어느 하나의 항체.
[25] 항원-결합 영역이 인간화 항체 가변 영역인, [16] 내지 [24] 중 어느 하나의 항체.
[26] [1] 내지 [25] 중 어느 하나의 항체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
[27] 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하거나, 또는 보체-매개 질환 또는 장애를 가질 가능성이 있는 개체를 예방하는 데 사용하기 위한, [26]의 약학 조성물.
[28] [1] 내지 [25] 중 어느 하나의 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하거나, 또는 보체-매개 질환 또는 장애를 가질 가능성이 있는 개체를 예방하는 방법.
[도 1] 도 1은 인간 C1r2s2 단백질에 대한 항-C1s 항체의 결합능을 도시한다. 100 nM에서의 재조합 인간 C1r2s2 단백질에 대한 항-C1s 항체의 비아코어(BIACORE; 등록상표) 센서그램을 나타내었다. COS0637temp의 경쇄 중의 94번 위치(카밧 넘버링)에 단일 아미노산 치환에 의해 항체 변이체를 생성하였다. COS0637temp 데이터도 대조로서 나타내었다.
[도 2] 도 2는 인간 C1r2s2 단백질에 대한 항-C1s 항체의 결합능을 도시한다. 100 nM에서의 재조합 인간 C1r2s2 단백질에 대한 항-C1s 항체의 비아코어(등록상표) 센서그램을 나타내었다. COS0637temp의 경쇄 중의 95d번 위치(카밧 넘버링)에 단일 아미노산 치환에 의해 항체 변이체를 생성하였다. COS0637temp 데이터도 대조로서 나타내었다.
[도 3] 도 3은 인간 C1r2s2 단백질에 대한 항-C1s 항체의 결합능을 도시한다. 100 nM에서의 재조합 인간 C1r2s2 단백질에 대한 항-C1s 항체의 비아코어(등록상표) 센서그램을 나타내었다. COS0637temp의 경쇄 중의 94번 및 95d번 위치(카밧 넘버링)에 이중 아미노산 치환에 의해 항체 변이체를 생성하였다. COS0637temp 데이터도 대조로서 나타내었다. 변이체는 약간의 결합 응답을 나타냈으며 화살표로 강조 표시하였다.
[도 4a] 도 4a는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 필리핀원숭이(사이노) 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637cc-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4b] 도 4b는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637h-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(점선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4c] 도 4c는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637temp-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4d] 도 4d는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH-의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv1-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4e] 도 4e는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv2-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4f] 도 4f는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv3-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4g] 도 4g는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv4-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4h] 도 4h는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv5-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4i] 도 4i는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv6-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4j] 도 4j는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv7-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4k] 도 4k는 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv8-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 4l] 도 4l은 실시예 3.2에 기재한 바와 같이 사이노 및 인간 C1r2s2에 대한 pH 의존성 및 교차 반응성을 평가하기 위해 COS0637pHv9-TT91R과 인간 C1r2s2 및 사이노 C1r2s2의 상호작용을 보여주는 비아코어(등록상표) 센서그램을 도시한다. 센서그램은 각각 인간 C1r2s2(실선 곡선 [pH7.4], 일점쇄선 곡선 [pH5.8]), 사이노 C1r2s2(파선 곡선 [pH7.4], 점선 곡선 [pH5.8])를 항-C1s 항체로 고정화된 센서 표면 상에 각각 주입하여 수득하였다. pH7.4에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH7.4에서 해리되도록 하고, pH5.8에서 형성된 항체/항원 복합체는 pH5.8에서 해리되도록 하였다.
[도 5a] 도 5a는 비아코어(등록상표) 센서 표면 상에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 사량체로부터의 천연 인간 C1q의 항체-매개 해리를 도시한다. COS0637cc-SG1148에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상으로의 C1qrs의 안정된 포획을 기술한다. 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합과 C1r2s2로부터의 C1q의 대체를 기술한다. 센서그램 3(파선)은 C1q의 부재하에 항체만 C1r2s2에 결합된 기준선을 기술한다. 이들 센서그램의 비교를 위해, C1r2s2의 빙잉(binging) 응답을 100RU로 정규화시켰다.
[도 5b] 도 5b는 비아코어(등록상표) 센서 표면 상에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 사량체로부터의 천연 인간 C1q의 항체-매개 해리를 도시한다. COS0637pHv3-TT91R에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상으로의 C1qrs의 안정된 포획을 기술한다. 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합과 C1r2s2로부터의 C1q의 대체를 기술한다. 센서그램 3(파선)은 C1q의 부재하에 항체만 C1r2s2에 결합된 기준선을 기술한다. 이들 센서그램의 비교를 위해, C1r2s2의 빙잉 응답을 100RU로 정규화시켰다.
[도 5c] 도 5c는 비아코어(등록상표) 센서 표면 상에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 사량체로부터의 천연 인간 C1q의 항체-매개 해리를 도시한다. COS0637pHv8-TT91R에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상으로의 C1qrs의 안정된 포획을 기술한다. 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합과 C1r2s2로부터의 C1q의 대체를 기술한다. 센서그램 3(파선)은 C1q의 부재하에 항체만 C1r2s2에 결합된 기준선을 기술한다. 이들 센서그램의 비교를 위해, C1r2s2의 빙잉 응답을 100RU로 정규화시켰다.
[도 5d] 도 5d는 비아코어(등록상표) 센서 표면 상에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 사량체로부터의 천연 인간 C1q의 항체-매개 해리를 도시한다. COS0637pHv9-TT91R에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 3개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상으로의 C1qrs의 안정된 포획을 기술한다. 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합과 C1r2s2로부터의 C1q의 대체를 기술한다. 센서그램 3(파선)은 C1q의 부재하에 항체만 C1r2s2에 결합된 기준선을 기술한다. 이들 센서그램의 비교를 위해, C1r2s2의 빙잉 응답을 100RU로 정규화시켰다.
[도 6a] 도 6a는 비아코어(등록상표) 센서 표면 상에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 사량체로부터의 천연 인간 C1q의 항체-매개 해리를 도시한다. COS0637cc-SG1148에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 2개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상으로의 C1qrs의 안정된 포획을 기술한다. 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합과 C1r2s2로부터의 C1q의 대체를 기술한다. 이들 센서그램의 비교를 위해, 기준선(항체 주입 전)을 0RU로 조정하였다.
[도 6b] 도 6b는 비아코어(등록상표) 센서 표면 상에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 사량체로부터의 천연 인간 C1q의 항체-매개 해리를 도시한다. COS0637pHv3-TT91R에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 2개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상으로의 C1qrs의 안정된 포획을 기술한다. 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합과 C1r2s2로부터의 C1q의 대체를 기술한다. 이들 센서그램의 비교를 위해, 기준선(항체 주입 전)을 0 RU로 조정하였다.
[도 6c] 도 6c는 비아코어(등록상표) 센서 표면 상에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 사량체로부터의 천연 인간 C1q의 항체-매개 해리를 도시한다. COS0637pHv8-TT91R에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 2개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면에 C1qrs의 안정된 포획을 기술한다. 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합과 C1r2s2로부터의 C1q의 대체를 기술한다. 이들 센서그램의 비교를 위해, 기준선(항체 주입 전)을 0 RU로 조정하였다.
[도 6d] 도 6d는 비아코어(등록상표) 센서 표면 상에 고정화된 재조합 인간 C1r2s2 사량체로부터의 천연 인간 C1q의 항체-매개 해리를 도시한다. COS0637pHv9-TT91R에 의한 천연 인간 C1q의 대체는 2개 센서그램의 중첩으로 기술되어 있다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상으로의 C1qrs의 안정된 포획을 기술한다. 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합과 C1r2s2로부터의 C1q의 대체를 기술한다. 이들 센서그램의 비교를 위해, 기준선(항체 주입 전)을 0 RU로 조정하였다.
[도 7] 도 7은 배양된 세포 집단에서의 IL-2-분비 세포의 비를 측정한 결과를 나타낸다. 각 마크는 시험된 공여체의 결과를 나타낸다.
[도 8a] 도 8a는 세포 면적의 평균값의 결과를 도시한다. 통계적 유의성은 윌콕슨 순위 합계 시험(Wilcoxon rank sum test)(*p<0.05, **p<0.01)으로 평가하였다. 각 마크는 시험된 샘플의 결과를 나타낸다.
[도 8b] 도 8b는 세포 둘레의 평균값의 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 윌콕슨 순위 합계 시험(*p<0.05, **p<0.01)으로 평가하였다. 각 마크는 시험된 샘플의 결과를 나타낸다.
[도 8c] 도 8c는 배양된 세포 집단에서의 IL-2-분비 세포의 비를 측정한 결과를 나타낸다. 각 마크는 시험된 샘플의 결과를 나타낸다.
본 명세서에 기술되거나 참조된 기법 및 절차들은 당해 분야의 숙련가들에 의해 일반적으로 충분히 이해되며 통상적인 방법, 예를 들어, 하기의 문헌들에 기술된 널리 사용되는 방법들을 이용하여 통상적으로 사용된다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 문헌[March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당해 분야의 숙련가에게 본 출원에 사용된 용어들 중 다수에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공개를 포함하여, 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 내용 전체가 참고로 인용된다.
본 명세서를 해석하기 위해서 하기의 정의들을 적용할 것이며, 적합한 경우는 언제든, 단수로 사용되는 용어들은 또한 복수를 포함하고 이와 반대도 마찬가지일 것이다. 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정한 실시양태들을 기술하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 하기에 나타낸 임의의 정의가 본 명세서에 참고로 인용된 임의의 문서와 충돌하는 경우에, 하기에 나타낸 정의에 따를 것이다.
본 발명의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는, 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 일치한다.
"친화성"은 분자(예를 들어, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들어, 항원)의 단일 결합 부위간의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd 또는 KD)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본 명세서에 기술된 방법들을 포함하여 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 예시적이고 대표적인 실시양태들을 하기에 기술한다. "친화성", "결합 친화성", "결합능" 및 "결합 활성"은 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "결합 활성"은 한 분자(예를 들어, 항체)와 그의 결합 상대(예를 들어, 항원)의 단일 이상의 결합 부위들 간의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 본 명세서에서, 결합 활성은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 활성으로 엄격히 제한되지 않는다. 결합쌍의 구성원들이 1가 및 다가 결합 둘 다의 방식으로 서로에 결합할 수 있는 경우, 결합 활성은 이들 결합들의 총합의 강도이다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 결합 활성은 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 또는, 결합 속도 및 해리 속도(Kon 및 Koff)를 결합 평가에 사용할 수 있다. 결합 활성은 본 명세서에 기술된 방법들을 포함하여 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법들에 의해 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 예시적이고 대표적인 실시양태들을 하기에 기술한다.
"친화성 성숙된" 항체는, 개변을 갖지 않는 모 항체에 비해, 하나 이상의 초가변성 영역(HVR)에 하나 이상의 개변, 예를 들어, 항원에 대한 상기 항체의 친화성을 개선시키는 개변을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-C1s 항체" 및 "C1s에 결합하는 항체"는 항체가 C1s를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 C1s와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 비관련, 비-C1s 단백질에 대한 항-C1s 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사성면역어세이(RIA)에 의해 측정시 C1s에 대한 상기 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, C1s에 결합하는 항체는 1 마이크로몰(μM) 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.01 nM 이하, 또는 0.001 nM 이하(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-C1s 항체는 상이한 종으로부터의 C1s 중에서 보존되는 C1s의 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 항체 구조물들을 포함한다.
"항체 단편"은 완전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 완전한 항체의 일부를 포함하는, 완전한 항체가 아닌 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경합 어세이에서 그 항원에 대한 상기 참조 항체의 결합을 차단하는 항체, 및 반대로, 경합 어세이에서 그 항원에 대한 상기 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 참조 항체를 지칭한다. 예시적인 경합 어세이가 본 명세서에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면에 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 그 중쇄가 보유한 정상 도메인 또는 정상 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 서브클래스(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상기 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 정상 도메인들을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라 칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "세포상해제"란 용어는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포상해제는 방사성 동위원소(예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 인터캘레이트제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어, 핵산분해 효소; 항생제; 단편 및/또는 그의 변이체를 포함한 독소, 예를 들어, 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소; 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
"이펙터 기능"은, 항체의 아이소타입에 따라 변하는, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성들을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포상해(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포상해(ADCC); 탐식작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
어느 제, 예를 들어, 약학 제형의 "유효량"은 필요한 투여량으로 및 필요한 시간동안 목적하는 치료 또는 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합될 수 있는 임의의 결정인자를 포함한다. 에피토프는 항원을 표적화하는 항체에 의해 결합되는 상기 항원의 영역이며, 상기 항체와 직접 접촉하는 특정 아미노산들을 포함한다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기 또는 설포닐기와 같은 분자들의 화학 활성 표면 집단들을 포함할 수 있으며, 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 중의 표적 항원상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은 정상 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복실-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(잔기 446-447)은 존재할 수도, 또는 존재하지 않을 수도 있다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은 EU 넘버링 체계(EU 지수로도 지칭된다)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL) 중에 하기의 서열로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "완전한 항체" 및 "전체 항체"는 본 명세서에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본 명세서에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 호환적으로 사용되며, 상기 세포들의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 일치하지 않을 수도 있으며, 변이를 함유할 수 있다. 처음에 형질전환된 세포 중에서 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이 자손이 여기에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체에 대한 상기 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 특별히 제외한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 보편적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 일반적으로, 상기 서열의 서브그룹은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 서브그룹이다. 한 실시양태에서, 상기 VL에 대한 서브그룹은 카밧(Kabat) 등의 상기 문헌에서와 같은 서브그룹 카파 I이다. 한 실시양태에서, 상기 VH에 대한 서브그룹은 카밧 등의 상기 문헌에서와 같은 서브그룹 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 하나 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 상기 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 정상 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은, 서열이 초가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR, 즉 VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본 명세서에서 예시적인 HVR은
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 루프(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]);
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991)]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함한, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기들(예를 들어, FR 잔기)은 본 명세서에서 카밧 등의 상기 문헌에 따라 번호가 붙여진다.
"이뮤노컨주게이트"는 세포상해제를 포함하지만 이로 한정되지는 않는, 하나 이상의 이종 분자(들)에 컨주게이트된 항체이다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정시 95% 초과 또는 99% 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 핵산 분자를 통상적으로 함유하지만 상기 핵산 분자가 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
"항-C1s 항체를 코딩하는 단리된 핵산" 또는 "항-C1r 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(또는 그의 단편)를 지칭하며, 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중의 상기 핵산 분자(들), 및 숙주 세포 중의 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자(들)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 구성하는 개개 항체들은, 예를 들어, 천연 변이를 함유하거나 또는 단일클론 항체 제제의 제조시에 발생하는 가능한 변이 항체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 일치하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, "단일클론"이란 수식어는 항체들의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득되는 것으로서 상기 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 제조를 필요로 하는 것으로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기법들에 의해 제조될 수 있으며, 상기 방법들 및 단일클론 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법들은 본 명세서에 기술되어 있다.
"네이키드 항체"는 이종 부분(예를 들어, 세포상해 부분) 또는 방사성표지에 컨주게이트되지 않은 항체를 지칭한다. 상기 네이키드 항체는 약학 제형 중에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 돌턴의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단에서부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭된다)에 이어서 3개의 정상 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭된다)에 이어서 정상 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그의 정상 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"첨부 문서"란 용어는 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하며, 상기와 같은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"는, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 달성하도록 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입한 후에, 상기 서열 동일성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 상기 기준 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어, 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어, 또는 GENETYX(등록상표)(제네틱스 캄파니, 리미티드(Genetyx Co., Ltd.))를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은, 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬시키기에 적합한 파라미터들을 결정할 수 있다.
상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에게 저작권이 있으며, 소스 코드가 미국 저작권 사무소(미국 워싱턴 DC 20559 소재)에 사용자 문서(미국 저작권 등록번호 TXU510087하에 등록되어 있다)와 함께 제출되었다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 디지털 유닉스(UNIX) V4.0D를 포함한 유닉스 실행 시스템상에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다. ALIGN-2를 아미노산 서열 비교에 사용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 대한 %아미노산 서열 동일성(다르게는, 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 대해 특정한 %아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)는 다음과 같이 계산한다:
100 x 분율 X/Y;
여기에서, X는 A 및 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총수이다. 상기 아미노산 서열 A의 길이가 상기 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 %아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 %아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 알 것이다. 특별히 달리 서술되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 %아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 기술된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은, 그중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태이면서 상기 제형이 투여되는 대상에게 허용불가능하게 독성인 추가 성분들은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 외에, 대상에게 무독성인, 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 버퍼, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "특이적으로 결합한다"는 어구는, 배경(즉, 비-특이적) 결합은 포함하지만 유의적(즉, 특이적) 결합은 포함하지 않는 결합 수준으로 비관심 항원에 결합하는 항체의 활성 또는 특성을 지칭한다. 즉, "특이적으로 결합한다"는 배경(즉, 비-특이적) 결합에 더해 또는 그 대신에 유의적(즉, 특이적) 결합을 포함하는 결합 수준으로 관심 항원에 결합하는 항체의 활성 또는 특성을 지칭한다. 상기 특이성은 본 명세서에 언급되거나 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 전술된 비-특이적 또는 배경 결합의 수준은 제로이거나 또는 제로는 아니지만 거의 제로일 수 있거나 또는 당해 분야의 숙련가들이 기술적으로 무시하기에 충분히 매우 낮을 수 있다. 예를 들어, 숙련가가 적합한 결합 어세이에서 항체와 비관심 항원 사이의 결합에 대해 어떤 유의적인(또는 비교적 강한) 신호도 검출하거나 관찰할 수 없는 경우, 상기 항체는 상기 비관심 항원"에 특이적으로 결합하지 않는다"라고 할 수 있다. 대조적으로, 숙련가가 적합한 결합 어세이에서 항체와 관심 항원 사이의 결합에 대해 임의의 유의적인(또는 비교적 강한) 신호를 검출하거나 관찰할 수 있는 경우, 상기 항체는 상기 관심 항원"에 특이적으로 결합한다"고 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "C1s"는, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 C1s를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 미가공된 C1s뿐 아니라 세포에서의 가공으로부터 비롯된 임의 형태의 C1s도 포함한다. 상기 용어는 또한 C1s의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 C1s의 아미노산 서열을 서열 번호: 1에 나타내었다. 예시적인 필리핀원숭이, 및 래트 C1s의 아미노산 서열들도 각각 서열 번호: 3 및 2에 나타내었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "C1r"은, 달리 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 C1r을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 미가공된 C1r뿐 아니라 세포에서의 가공으로부터 비롯된 임의 형태의 C1r도 포함한다. 상기 용어는 또한 C1r의 천연 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 C1r의 아미노산 서열을 서열 번호: 4에 나타내었다. 예시적인 필리핀원숭이, 및 래트 C1r의 아미노산 서열들도 각각 서열 번호: 5 및 6에 나타내었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"(및 그의 문법적 변형, 예를 들면, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연적인 과정을 개변시키고자 하는 임상적 개입을 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 상기 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도의 감소, 상기 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 지체시키기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원 결합에 관련된 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원과 결합하는 항체는 상기 항원과 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리되어 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; 문헌[Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 상기 벡터에 결합되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제성 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 상기 벡터가 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭한다.
II. 항체
한 양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 항원-결합 영역 및 항체 정상 영역을 포함하는 항체에 기반한다. 특정 실시양태에서, C1s에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 특이적으로 C1s에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 보체-매개 질환 또는 장애의 진단 또는 치료에 유용하다.
한 실시양태에서, C1s의 종은 하나 이상의 종으로부터 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 종은 인간 및 비-인간 동물이다. 특정한 실시양태에서, 종은 인간, 래트 및 원숭이(예를 들어, 필리핀원숭이, 히말라야원숭이, 마모셋, 침팬지 및 비비)이다. 특정한 실시양태에서, 종은 인간 및 필리핀원숭이다.
실시양태들에서, 상기 항체는 항체 단편, 키메라 및 인간화 항체, 인간 항체, 라이브러리-유래 항체, 및 다중특이성 항체를 포함하는 다양한 타입의 항체를 포괄한다. 실시양태들에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들어, 완전한 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 아이소타입이다.
(항체 단편)
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에 기술된 다른 단편들을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토를 위해서는, 문헌[Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조한다; 또한 WO 1993/16185 호; 및 미국 특허 제 5,571,894 호 및 미국 특허 제 5,587,458 호를 참조한다. 구제(Salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 고찰을 위해, 미국 특허 제 5,869,046 호를 참조한다.
다이아보디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097 호; WO 1993/01161 호; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트라이아보디 및 테트라보디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월섬 소재); 예를 들어, 미국 특허 제 6,248,516 B1 호 참조).
항체 단편은, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 완전한 항체의 단백질분해적 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 다양한 기법에 의해 제조할 수 있다.
(키메라 및 인간화 항체)
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정한 키메라 항체들이, 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]에 기술되어 있다. 일례로, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 정상 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는, 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어, CDR(또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 인간 정상 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 중의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복원 또는 개선시키기 위해서 비-인간 항체(예를 들어, 상기 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 검토되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제 5,821,337 호, 미국 특허 제 7,527,791 호, 미국 특허 제 6,982,321 호 및 미국 특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)](특이성 결정 영역(SDR) 그래프트화를 기술하고 있음); 문헌[Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)]("재표면처리"를 기술하고 있음); 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음)에 추가로 기술되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다: "베스트-핏" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)]; 및 문헌[Presta et al. J. Immunol. 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙(체세포 변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포계열 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리로의 선별로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)] 및 문헌[Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조).
(인간 항체)
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 생산할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-374 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기술되어 있다.
인간 항체는, 항원 공격에 응답하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전한 항체를 생산하도록 수식된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하며, 상기 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 또는 상기 동물의 염색체내에 무작위로 통합된다. 상기와 같은 트랜스제닉 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법에 대한 검토는, 문헌[Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 6,075,181 호 및 미국 특허 제 6,150,584 호; 휴맵(HUMAB)(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 5,770,429 호; K-M 마우스(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허 제 7,041,870 호, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 기법을 기술하고 있는 미국 특허출원 공개 US 2007/0061900 호를 참조한다. 상기와 같은 동물에 의해 생성된 완전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 정상 영역과 결합시킴으로써 추가로 수식될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기술되었다(예를 들어, 문헌[Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 문헌[Boerner et al., J. Immunol. 147:86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006)]에 기술되어 있다. 추가의 방법들로는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터의 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 기술하고 있음) 및 문헌[Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마를 기술하고 있음)에 기술된 것들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기법(트라이오마(Trioma) 기법)이 또한 문헌[Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 문헌[Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-191 (2005)]에 기술되어 있다.
인간 항체는 또한, 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리에서 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 상기와 같은 가변 도메인 서열을 목적하는 인간 정상 도메인과 결합시킬 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 하기에서 기술된다.
(라이브러리-유래 항체)
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 상기와 같은 라이브러리를 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 선별하는 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법들은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있으며, 예를 들어, 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554]; 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)]; 문헌[Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]; 문헌[Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; 문헌[Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 문헌[Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)]에 추가로 기술되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자들의 레퍼토리들을 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고 파지 라이브러리 중에서 무작위로 재조합하고, 이어서 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요 없이 면역원에 고-친화성 항체를 제공한다. 또는, 나이브 레퍼토리를 클로닝하여(예를 들어, 인간으로부터) 항체의 단일 공급원을 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993)]에 기술된 바와 같은 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 제공할 수 있다. 최종적으로, 나이브 라이브러리는 또한, 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, PCR 프라이머 함유 랜덤 서열을 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하고 있는 특허 공보들은, 예를 들어, 미국 특허 제 5,750,373 호, 및 미국 특허 공개 제 2005/0079574 호, 제 2005/0119455 호, 제 2005/0266000 호, 제 2007/0117126 호, 제 2007/0160598 호, 제 2007/0237764 호, 제 2007/0292936 호, 및 제 2009/0002360 호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
(다중특이성 항체)
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 C1s에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 C1s의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수도 있다. 이중특이성 항체는 또한, C1s를 발현하는 세포에 세포상해제를 국소화시키는데 사용할 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)], WO 1993/08829 호, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어, 미국 특허 제 5,731,168 호 참조)을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자를 제조하기 위해 정전기 스티어링 효과를 조작함으로써(WO 2009/089004A1 호); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴으로써(예를 들어, 미국 특허 제 4,676,980 호 및 문헌[Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조); 이중특이성 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위해 "다이아보디" 기법을 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어, 문헌[Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]에 기술된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 명세서에 포함된다(예를 들어, US 2006/0025576A1 호 참조).
본 명세서의 항체 또는 단편은 또한 C1s뿐만 아니라 또 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어, US 2008/0069820 호 참조).
A. 단리된 항체
특정한 실시양태에서, 항체는 단리된 항체이다. 상기 실시양태에서, 단리된 항체는 항원-결합 영역 및 항체 정상 영역을 포함한다.
상기 실시양태에서, 단리된 항체는 C1s에 특이적으로 결합하여 Clqrs 복합체로부터의 Clq의 해리를 촉진하는 대체 기능을 가질 수 있다. 상기 실시양태에서, 단리된 항체는 C1s에 특이적으로 결합하여 C1q의 C1r2s2에 대한 결합을 억제하는 차단 기능을 가질 수 있다. 단리된 항체는 대체 기능 및 차단 기능 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 가질 수 있다. 상기 항체는 바람직하게는 양쪽의 기능을 갖는다.
한 실시양태에서, 상기 단리된 항체는 pH-의존적인 방식으로 C1s에 특이적으로 결합한다. 상기 실시양태의 특별한 예로서, 인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대한 항체의 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하는 경우,
i) 중성 pH 범위에서의 해리 상수(KD) 값은 신뢰성 있게 계산할 수 있고, 산성 pH 범위에서의 KD 값은 결합 활성의 부재 또는 상당히 낮은 결합 활성으로 인해 신뢰성 있게 계산할 수 없거나, 또는
ii) 중성 pH 범위와 산성 pH 범위에서의 KD 값을 모두 신뢰성 있게 계산할 수 있을 경우, 산성 pH 범위에서의 KD 값 대 중성 pH 범위에서의 KD 값의 비, 산성 KD/중성 KD 비는 10보다 크다.
상기와 같은 항체들은, 환자에서 투여 용량 및 횟수가 감소될 수 있고 결과적으로 전체 투여량이 감소될 수 있기 때문에, 약제로서 특히 우수할 것으로 예상된다. 항-C1s 항체는 C1qrs 복합체에 결합하여 혈장으로부터 C1qrs 복합체를 제거하는 항체에 비해 우수한 안전성 프로필을 가질 것으로 예상되는데, 그 이유는 이들이 혈장으로부터 C1r2s2만을 제거(C1s로의 결합을 통해)하고 혈장으로부터 C1q는 제거하지 않을 것이기 때문이다. 결과적으로, C1q 고갈과 연관된 부작용이 방지될 수 있다. 또한, C1q의 신속한 대체를 갖는 항체는 보체 활성의 더 빠른 중화를 가질 것으로 예상되며, 이것은 치료 효능의 더 빠른 개시로 이어질 수 있다.
(a1) 비아코어(등록상표)/대체 개념
한 실시양태에서, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 표면 플라즈몬 공명 어세이를 위한 칩, 예를 들어, 비아코어(등록상표) 칩 상에서 C1qrs 복합체에 결합하는 항체이고 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 C1qrs 복합체에 결합하여 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진하는 기능은 본 명세서에서 "대체 기능/활성" 또는 "C1q 대체 기능/활성"으로 지칭된다. 상기 기능/활성은 표면 플라즈몬 공명 어세이, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비아코어(등록상표) 어세이를 이용하여 정성적으로 또는 정량적으로 적절히 평가할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는, 항체의 존재하에서 응답 단위(RU)의 값이 충분한 시간이 지났을 때 표면 플라즈몬 공명 어세이, 예를 들어, 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시 항체의 부재하에서의 응답 단위(RU) 값보다 낮은 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다. 상기와 같은 어세이에서 수득된 센서그램에서, 항체 부재하에 C1q의 존재하에서의 곡선이 C1q 및 항체 존재하에서의 곡선과 교차하는 "크로스오버 시점"을 확인할 수 있다(상세사항에 대해 실시예 참조). 엄격하게, 상기 전자의 곡선과 교차시 상기 후자의 곡선의 노이즈 또는 요동으로 인해 단일 센서그램에서도 다수의 크로스오버 시점이 관찰될 수 있다. 상기와 같은 경우에서, 상기 다수의 크로스오버 시점들 중 임의의 시점을 "크로스오버 시점"으로 선택할 수 있다. "충분한 시간이 지난"은 응답 단위(RU) 값의 측정 시점이 측정을 위한 "크로스오버 시점"보다 충분히 이후인 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 응답 단위(RU) 값의 측정 시점은 항체 주입 시작 시점 후 적어도 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초이다. 또는, 상기 측정 시점은 크로스오버 시점 후 적어도 100초, 200초, 300초, 400초, 500초, 600 초, 700초, 800초, 900초, 1000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초일 수 있다.
한 실시양태에서, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 예를 들어, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 크로스오버 시점(예를 들어, 비아코어(등록상표) 어세이에서)이 항체 주입 시작 시점 후 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초 이내인 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM로 10 마이크로리터(μL)/분으로 주입한다.
한 실시양태에서, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체는, 예를 들어, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 항체 주입 시작 시점 후 100초, 300초, 500초, 700초, 1000초, 1500초, 2000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초 이내에 C1q의 거의 전부(또는 전부)가 C1qrs 복합체로부터 해리되는 경우 대체 기능을 갖는 항체로서 결정될 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM로 10 μL/분으로 주입한다. 예를 들어, 상기와 같은 어세이에서 수득된 센서그램에서, C1q 및 항체의 존재하에서의 값(RU)이 C1q 부재하에 항체 존재하에서의 값(RU)과 근접하거나 상기 값에 이르는 경우, "C1q의 거의 전부(또는 전부)가 C1qrs 복합체로부터 해리되는 것"을 측정할 수 있다. 본 명세서에서, "(C1q의) 거의 전부"는 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 백분율을 지칭하고; "(C1q의) 전부"는 100%의 백분율을 지칭한다. 해리된 C1q의 백분율은 본 명세서에 기술된 임의의 어세이에 의해 정량적으로 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 항체의 "대체 기능/활성"을 측정하는 전술된 방법을 이용하여, C1r2s2 복합체로부터 C1q를 대체하는 항체를 선별하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 선별 방법은 C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항체를 선택하는 것; 즉, C1qrs 복합체에 결합하고 C1qrs 복합체로부터 C1q의 해리를 촉진하는 항체를 선택하는 것을 포함한다. 상기 대체 기능/활성을 갖는 항체는 표면 플라즈몬 공명 어세이, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 비아코어(등록상표) 어세이를 이용하여 적절히 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 선별 방법은, 충분한 시간이 지났을 때, 표면 플라즈몬 공명 어세이, 예를 들어, 비아코어(등록상표) 어세이에 의해, (i) 항체 존재하에서의 응답 단위(RU)의 값, 및 (ii) 항체 부재하에서의 응답 단위(RU)의 값을 측정하는 것을 포함한다. 상기 선별 방법은 상기 (i)의 값과 상기 (ii)의 값을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 상기 선별 방법은 상기 (i)의 값이 상기 (ii)의 값보다 낮은 경우 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있다. 상기 선별 방법은, 항체 부재하에 C1q 존재하에서의 곡선이 C1q 및 항체 존재하에서의 곡선과 교차하는 "크로스오버 시점"을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 단일 센서그램에서도 다수의 크로스오버 시점이 관찰될 수 있으며, 상기 다수의 크로스오버 시점들 중 임의의 시점을 "크로스오버 시점"으로 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 선별 방법은 항체 주입 시작 시점 후 적어도 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초에 응답 단위(RU)의 값을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 상기 선별 방법은 크로스오버 시점 후 적어도 100초, 200초, 300초, 400초, 500초, 600초, 700초, 800초, 900초, 1000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초에 응답 단위(RU)의 값을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 선별 방법은, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항체, 또는 예를 들어, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 항체의 크로스오버 시점이 항체 주입 시작 시점 후 60초, 100초, 150초, 200초, 500초, 700초, 1000초, 1500초 또는 2000초 이내인 경우 대체 기능을 갖는 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM로 10 마이크로리터(μL)/분으로 주입한다. 일부 실시양태에서, 상기 선별 방법은, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 항체, 또는 예를 들어, 하기의 조건을 이용하는 비아코어(등록상표) 어세이에 의해 측정시, 항체 주입 시작 시점 후 100초, 300초, 500초, 700초, 1000초, 1500초, 2000초, 3000초, 5000초, 7000초 또는 10000초 이내에 C1q의 거의 전부(또는 전부)가 C1qrs 복합체로부터 해리되는 경우 대체 기능을 갖는 항체를 선택하는 것을 포함할 수 있다: C1r2s2 복합체 및 C1q의 포획 수준은 각각 200 공명 단위(RU) 및 200 공명 단위(RU)이고, 애널라이트로서 항체는 500 nM로 10 마이크로리터(μL)/분으로 주입한다. 상기 언급된 바와 같이, "(C1q의) 거의 전부"는 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 백분율을 지칭하고, "(C1q의) 전부"는 100%의 백분율을 지칭하며, 해리된 C1q의 백분율은, 비아코어(등록상표) 어세이를 포함하여 본 명세서에 기술된 임의의 어세이에 의해 정량적으로 측정할 수 있다.
(a2) 비아코어(등록상표)/차단 개념
한 실시양태에서, 본 발명은 C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는, 상기 항체가 C1r2s2에 결합하여 C1q의 C1r2s2에 대한 결합을 억제하는 차단 기능을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 상기 항체는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 차단 비를 갖는다. 상기 차단 기능/활성 또는 차단 비는 비아코어(등록상표) 어세이를 이용하여 측정할 수 있다. C1q 차단 수준을 평가하기 위해 하기의 조건을 이용할 수 있다: C1r2s2의 포획 수준은 50, 100, 200, 400 공명 단위(RU)를 목표로 한다. 항체 변이체를 250, 500, 1000, 2000 nM로 주입하여 항체 결합을 포화시킨 후, 250, 500, 1000, 2000 nM의 항체 변이체의 존재 또는 부재하에 인간 C1q를 50, 100, 200 nM로 주입한다. 차단 비는 다음 식으로 산출한다: [1-(항체 변이체 존재하의 인간 C1q 결합 응답/항체 변이체 부재하의 인간 C1q 결합 응답)] x 100%.
(a3) pH 의존성
한 실시양태에서, 단리된 항체는 pH-의존적 방식으로 C1s에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, C1s에 대한 항체의 결합 활성은 중성 pH 영역(예컨대 pH 7.4)에서보다 산성 pH 영역(예컨대 pH 5.8)에서 더 낮다.
상기 실시양태에서, 항체는 산성 pH 영역에서 C1s에 상당히 낮은 결합을 가져, 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하고 해리 상수(KD) 값을 데이터에 의해 계산할 경우, 산성 pH 영역에서의 KD 값은 더 낮은 신뢰성을 갖거나, 또는 산성 pH 영역에서의 C1s에 대한 결합 활성은 검출되지 않는다; 즉, 인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대한 항체의 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 경우,
i) 중성 pH 범위에서의 해리 상수(KD) 값은 신뢰성 있게 계산할 수 있고, 산성 pH 범위에서의 KD 값은 결합 활성의 부재 또는 상당히 낮은 결합 활성으로 인해 신뢰성 있게 계산할 수 없거나, 또는
ii) 중성 pH 범위와 산성 pH 범위에서의 KD 값을 모두 신뢰성 있게 계산할 수 있을 경우, 산성 pH 범위에서의 KD 값 대 중성 pH 범위에서의 KD 값의 비, 산성 KD/중성 KD 비는 10보다 크다.
상기 실시양태에서, ii)의 산성 KD/중성 KD 비는 바람직하게는 14 이상, 44 이상, 45 이상, 72 이상, 99 이상, 100 이상, 117 이상, 209 이상, 278 이상이다. 상기 실시양태에서, ii)의 산성 KD/중성 KD 비는 보다 바람직하게는 44 이상, 45 이상, 72 이상, 99 이상, 100 이상, 117 이상, 209 이상, 278 이상이다.
상기 경우에서 '신뢰성 있게'라는 말은 다음과 같이 설명된다. pH 7.4 및 pH 5.8에서의 각 샘플의 KD 값을 비아코어(등록상표) T200 기기(GE헬스케어)를 이용하여 37℃에서 측정한다. 정제된 마우스 항인간 Ig 카파 경쇄(GE헬스케어)는 아민 커플링 키트(GE헬스케어)를 사용하여 CM5 센서 칩의 모든 유동 세포 상에 고정화시킬 수 있다. 20mM ACES, 150mM NaCl, 1.2mM CaCl2, 1mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)(IgG 무 함유), 1mg/mL CMD (CM-덱스트란 나트륨염), 0.05% 트윈(Tween)(등록상표) 20 및 0.005% NaN3을 포함하는 버퍼(pH 7.4 또는 pH 5.8)를 러닝 버퍼로서 사용한다. 각 항체는 항인간 Ig 카파 경쇄를 통해 센서 표면 상에 포획될 수 있다. 항체 포획 수준은 50 RU(공명 단위)로 조정한다. pH 7.4에서의 KD 값의 경우, 단백질 복합체가 0, 25, 40, 100, 200, 400 nM, 0, 12.5, 25, 40, 100, 200 nM, 또는 0, 6.3, 12.5, 25, 50, 100 nM로, 30 마이크로L/분으로 주입될 수 있도록 인간 C1r2s2 복합체를 제조한다. pH 5.8에서의 KD 값의 경우, 단백질 복합체가 예를 들어 글리신 pH 2.0(GE헬스케어)과 함께 0, 200, 400, 800, 1600, 3200 nM 또는 0, 50, 100, 200, 400, 800 nM로, 30 마이크로L/분으로 주입될 수 있도록 인간 또는 필리핀원숭이 C1r2s2 복합체를 제조한다. 센서 표면은 예를 들어 글리신 pH 2.0(GE헬스케어)으로 매 사이클마다 재생한다. KD 값은 비아코어(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(GE헬스케어)을 사용하여 수득한다. pH 5.8의 KD 값을 pH 7.4(산성 KD/중성 KD 비)의 KD 값과 비교한다. 비아코어(등록상표) 소프트웨어의 정도관리(Quanlity control) 결과가 항체에 대해 "동력학 상수를 고유하게 측정할 수 없다"고 언급하면, 항체의 KD 값을 신뢰성 있게 계산할 수 없다고 판단하였다.
상기 경우의 한 실시양태에서, 표면 플라즈몬 공명에 의한 결합 활성은, 각 항체가 인간 Ig 카파 경쇄에 의해 50 공명 단위로 그 위에 포획된 센서 칩, 및 20mM ACES(N-(2-아세트아마이도)-2-아미노에테인설폰산), 150mM NaCl, 1.2mM CaCl2, 1mg/mL 양 혈청 알부민(BSA), 1mg/mL CM-덱스트란 나트륨염(CMD), 0.05% 폴리소베이트 20, 0.005% NaN3을 포함하는 러닝 버퍼를 사용하여 37℃에서 측정한다.
상기 실시양태에서, 항체는 결합 활성의 부재 또는 상당히 낮은 결합 활성으로 인해 중성 pH 범위에서 KD 값을 신뢰성 있게 계산할 수 없는 항체를 포함하지 않는다.
pH-의존적 방식으로 C1s에 결합하는 것 외에, C1s에 대한 pH-의존적 항체의 친화성에 대한 칼슘의 영향은 또 다른 중요한 특성일 수 있다. C1s는 고칼슘 농도에서 이량체를 형성하지만 저칼슘 농도에서는 단량체로 해리된다. C1s가 이량체 상태인 경우, 2가 항체는 다중 C1s 분자를 가교결합시킴으로써 면역 복합체를 형성할 수 있다. 이에 의해 상기 항체는 친화성 및 결합력 상호작용 둘 다에 의해 복합체 내의 C1s 분자에 결합하게 되고, 따라서 항체의 겉보기 친화성을 증가시킨다. 대조적으로, C1s가 단량체 상태인 경우, 상기 항체는 C1s에 대한 친화성 상호작용에 의해서만 결합한다. 이것은 pH-의존성 C1s 항체가 혈장내에서 이량체 C1s와 면역 복합체를 형성할 수 있지만, 일단 산성 엔도솜내에서는 C1s가 단량체로 해리될 것임을 의미한다. 이것은 면역 복합체의 분해를 초래하고, 이것은 이어서 항원으로부터 항체의 pH-의존성 해리를 증대시킨다.
한 양태에서, 단리된 항-C1s 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시 10보다 크다. 한 양태에서, 단리된 항-C1s 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 pH에서 고칼슘 농도에서 측정시 및 산성 pH에서 저칼슘 농도에서 측정시 10보다 크다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-C1s 항체에서, 산성 pH에서 그의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 저칼슘 농도에서 측정시 10보다 크며, 이때 상기 항-C1s 항체는 이량체 상태의 C1s에 결합한다.
특정 이론에 결부되지 않고, 1) 항체가 결합된 C1s의 에피토프 구조가 칼슘의 부재에 의해 입체구조적으로 변화됨으로써 항체의 친화성을 변화시킬 수 있거나, 또는 2) 항체의 상호작용(친화성 또는 결합력)이 C1s의 조건(단량체 상태 또는 이량체 상태)에 따라 달라질 수 있는 경우에, 상기 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))를 평가하기 위해 특정 조건(중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서)을 사용한 측정을 이용할 수 있다.
즉, 항체는 하기 (i) 또는 (ii)에 기술된 바와 같이 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합한다:
(i) 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 10보다 크고,
(ii) 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 10보다 크다.
보다 일반적으로, 특정 이론에 결부되지 않고, 1) 항체가 결합된 특정 항원의 에피토프 구조가 칼슘의 부재에 의해 입체구조적으로 변화됨으로써 항체의 친화성을 변화시킬 수 있거나, 또는 2) 항체의 상호작용(친화성 또는 결합력)이 항원의 조건(단량체 상태 또는 이량체 상태)에 따라 달라질 수 있는 경우에, 상기 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))를 평가하기 위해 특정 조건(중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서)을 사용한 측정을 이용할 수 있다.
그러므로, 항체는 다음과 같이, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 항원에 결합한다: 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시, 산성 pH에서의 항원 결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 항원 결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 10보다 크다.
전술된 KD 비, 즉, KD(산성 pH)/KD(중성 pH)는 모 항체(즉, 본 발명의 수식 전의 원래 항체)와 하나 이상의 아미노산 변이(예를 들어, 부가, 삽입, 결실 또는 치환)가 원래 (모) 항체에 대해 도입된 항체 사이에 비교될 수 있다. 원래의 (모) 항체는 C1s에 특이적으로 결합하는 한 임의의 알려져 있거나 새로 단리된 항체일 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 단리된 항-C1s 항체에서, 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 원래 (모) 항체의 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))보다 적어도 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 8배, 10배 더 높다. 즉, 본 발명은, 모(원래) 항체로부터 하나 이상의 아미노산 변이(예를 들어, 부가, 삽입, 결실 또는 치환)가 도입되고, 하기 (i) 대 (ii)의 비가 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 8, 또는 10인 단리된 항-C1s 항체를 제공한다: (i) 단리된 항-C1s 항체의 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH)); (ii) 모(원래) 항체의 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH)). 상기 KD 비는 임의의 (높거나 낮은) 칼슘 농도에서 측정될 수 있다, 예를 들어, 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정되거나 또는 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정될 수 있다.
한 양태에서, 상기 항체는 세포내 조건 및 세포외 조건 사이에서 상이한 항원-결합 활성을 갖는다. 세포내 및 세포외 조건은 세포의 내부와 외부 사이에서 상이한 조건을 지칭한다. 조건의 범주는, 예를 들어, 이온 농도, 보다 특히는 금속 이온 농도, 수소 이온 농도(pH) 및 칼슘 이온 농도를 포함한다. "세포내 조건"은 바람직하게는 엔도솜 내부의 환경에 대한 환경 특징을 지칭하는 반면, "세포외 조건"은 혈장 내 환경에 대한 환경 특징을 지칭한다. 이온 농도에 따라 변하는 항원-결합 활성을 갖는 특성을 가진 항체는 다수의 항체들을 상기 특성을 갖는 도메인에 대해 선별함으로써 수득할 수 있다. 예를 들어, 전술한 특성을 갖는 항체는, 하이브리도마 방법 또는 항체 라이브러리 방법에 의해 그 서열이 서로 상이한 다수의 항체들을 생성하고 상이한 이온 농도에서 그들의 항원 결합 활성을 측정함으로써 수득할 수 있다. B 세포 클로닝 방법은 상기 항체들을 선별하는 방법의 예들 중 하나이다. 또한, 하기에 기술하는 바와 같이, 항체에 이온 농도에 따라 변하는 항원-결합 활성을 갖는 특성을 부여할 수 있는 적어도 하나의 특유의 아미노산 잔기가, 공통 구조로서 상기 특유의 아미노산 잔기를 공유하면서 상이한 서열을 갖는 다수의 항체들의 라이브러리로서 제조하기 위해, 명시되어 있다. 상기 라이브러리를 선별하여 전술한 특성을 갖는 항체를 효과적으로 단리할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 C1s에 대한 pH-의존적 결합을 나타내는 항-C1s 항체를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "pH-의존적 결합"이란 표현은 "중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 결합"을 의미하고, 상기 두 표현 모두 호환적일 수 있다. 예를 들어, "pH-의존적 결합 특징을 갖는" 항-C1s 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 및 산성 pH 둘 다에서 고칼슘 농도에서 측정시 10보다 크다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 적어도 11, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 높은 친화성으로 C1s에 결합한다.
특정 실시양태에서, 산성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값 대 중성 pH에서의 C1s-결합 활성에 대한 KD 값의 비(KD(산성 pH)/KD(중성 pH))는 중성 pH하에 고칼슘 농도에서 및 산성 pH하에 저칼슘 농도에서 측정시 10보다 크다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 산성 pH에서보다 중성 pH에서 적어도 11, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 높은 친화성으로 C1s에 결합한다.
전술된 경우들에서, 예를 들어, 산성 pH는 5.8이고 중성 pH는 7.4이므로, KD(산성 pH)/KD(중성 pH)는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)이다. 이와 관련하여, 산성 pH 및 중성 pH의 예들은 본 명세서에서 이후에 상세히 기술한다. 일부 실시양태에서, KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)와 같은 KD(산성 pH)/KD(중성 pH)는 2 내지 10,000일 수 있다.
항원이 가용성 단백질인 경우, 상기 항원에 대한 항체의 결합은 혈장내 항원의 연장된 반감기(즉, 혈장으로부터 상기 항원의 감소된 클리어런스)를 야기할 수 있는데, 그 이유는 상기 항체가 항원 자체보다 혈장에서 더 긴 반감기를 가질 수 있으며 상기 항원에 대한 담체로 작용할 수 있기 때문이다. 이것은 세포내 엔도솜 경로를 통해 FcRn에 의한 항원-항체 복합체의 재순환에 기인한다(문헌[Roopenian and Akilesh (2007) Nat Rev Immunol 7(9): 715-725]). 그러나, 세포내로의 진입후에 항원을 산성 엔도솜 구획으로 방출시키면서 중성 세포외 환경에서 그의 항원에 결합하는, pH-의존적 결합 특징을 갖는 항체는, pH-비의존적 방식으로 결합하는 그의 상대에 비해 항원 중화 및 클리어런스의 면에서 우수한 특성을 갖는 것으로 예상된다(문헌[Igawa et al (2010) Nature Biotechnol 28(11); 1203-1207]; 문헌[Devanaboyina et al (2013) mAbs 5(6): 851-859]; 국제 특허출원 공개: WO 2009/125825).
한 양태에서, 본 발명은 저칼슘 농도 조건하에서보다 고칼슘 농도 조건하에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 바람직한 금속 이온은, 예를 들어, 칼슘 이온을 포함한다. 칼슘 이온은 골격근, 평활근 및 심장근과 같은 근육의 수축; 백혈구의 이동, 탐식작용 등의 활성화; 혈소판의 형태 변화, 분비 등의 활성화; 림프구의 활성화; 히스타민 분비를 포함한 비만 세포의 활성화; 카테콜아민 알파 수용체 또는 아세틸콜린 수용체에 의해 매개된 세포 응답; 세포외배출; 뉴런 말단으로부터 전달 물질의 방출; 및 뉴런에서 축삭형질 흐름을 포함한, 많은 생물학적 현상들의 조절에 관련된다. 알려진 세포내 칼슘 이온 수용체는 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민 및 미오신 경쇄를 포함하며, 이들은 다수의 칼슘 이온-결합 부위를 가지고 분자 진화 면에서 공통 기원으로부터 유래되는 것으로 생각된다. 또한 많은 공지된 칼슘-결합 모티프들이 있다. 상기 공지된 모티프는, 예를 들어, 카데린 도메인, 칼모듈린의 EF-핸드, 단백질 키나제 C의 C2 도메인, 혈액 응고 단백질 인자 IX의 G1a 도메인, 아시아로당단백질 수용체 및 만노스-결합 수용체의 C-형 렉틴, LDL 수용체의 A 도메인, 아넥신, 3형 트롬보스폰딘 도메인, 및 EGF-유사 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 금속 이온이 칼슘 이온인 경우, 항원-결합 활성은 고칼슘 이온 농도 조건하에서보다 저칼슘 이온 농도 조건하에서 더 낮은 것이 바람직하다. 한편, 세포내 칼슘 이온 농도는 세포외 칼슘 이온 농도보다 낮다. 반대로, 세포외 칼슘 이온 농도는 세포내 칼슘 이온 농도보다 높다. 한 실시양태에서, 저칼슘 이온 농도는 바람직하게는, 생체내 초기 엔도솜내 칼슘 이온 농도와 가까운 0.1 마이크로몰(μM) 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 0.5 μM 내지 10 μM, 및 특히 바람직하게는 1 μM 내지 5 μM이다. 한편, 한 실시양태에서, 고칼슘 이온 농도는 바람직하게는, 혈장내(혈중) 칼슘 이온 농도와 가까운 100 μM 내지 10 μM, 보다 바람직하게는 200 μM 내지 5 mM, 및 특히 바람직하게는 0.5 mM 내지 2.5 mM이다. 한 실시양태에서, 저칼슘 이온 농도는 엔도솜내 칼슘 이온 농도이고, 고칼슘 이온 농도는 혈장내 칼슘 이온 농도인 것이 바람직하다. 항원-결합 활성 수준을 저칼슘 및 고칼슘 이온 농도 사이에서 비교하는 경우, 항체의 결합은 저칼슘 이온 농도에서보다 고칼슘 이온 농도에서 더 강한 것이 바람직하다. 즉, 항체의 항원-결합 활성은 고칼슘 이온 농도에서보다 저칼슘 이온 농도에서 더 낮은 것이 바람직하다. 결합 활성 수준을 해리 상수(KD)로 나타내는 경우, KD(저칼슘 이온 농도)/KD(고칼슘 이온 농도)의 값은 1보다 크고, 바람직하게는 2 이상, 보다 더 바람직하게는 10 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상이다. KD(저칼슘 이온 농도)/KD(고칼슘 이온 농도) 값의 상한치는 특별히 제한되지 않으며, 숙련된 전문가의 기술로 생성될 수 있는 한 100, 400, 1000, 또는 10000과 같은 임의의 값일 수 있다. KD 대신 해리 속도 상수(kd)를 사용하는 것도 가능하다. KD 값을 산출하는 것이 어려운 경우, 상기 활성은 애널라이트가 동일한 농도로 통과할 때 비아코어(등록상표)에서의 결합 응답 수준에 근거하여 평가할 수 있다. 항원이 항원-결합 분자가 고정화된 칩 위로 통과할 때, 저칼슘 농도에서의 결합 응답은 바람직하게는 고칼슘 농도에서의 결합 반응의 1/2 이하, 보다 바람직하게는 1/3 이하, 보다 더 바람직하게는 1/5 이하, 및 특히 바람직하게는 1/10 이하이다. 일반적으로 생체내 세포외 칼슘 이온 농도(예를 들어, 혈장내)는 높고 세포내 칼슘 이온 농도(예를 들어, 엔도솜내)는 낮은 것으로 알려져 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 세포외 조건은 고칼슘 이온 농도이고 세포내 조건은 저칼슘 이온 농도인 것이 바람직하다. 항원-결합 활성이 세포외 칼슘 이온 농도 조건하에서보다 세포내 칼슘 이온 농도 조건하에서 더 낮은 특성이 항원-결합 분자(예를 들어, 항체)에 부여되는 경우, 세포 외부에서 항원-결합 분자에 결합된 항원은 세포 내부에서 항원-결합 분자로부터 해리됨으로써, 세포 외부로부터 세포 내로의 항원 혼입을 증대시킨다. 상기 항체는, 생체에 투여시, 생체내에서 혈장내 항원 농도를 감소시키고 항원의 생리학적 활성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 항체는 유용하다. 고칼슘 이온 농도 조건하에서보다 저칼슘 이온 농도 조건하에서 더 낮은 항원-결합 활성을 갖는 항원-결합 영역 또는 항체를 선별하는 방법은, 예를 들어, WO2012/073992 호(예를 들어, 단락 0200 내지 0213)에 기술된 방법을 포함한다. 항원-결합 영역에 고칼슘 이온 농도 조건하에서보다 저칼슘 이온 농도 조건하에서 항원에 보다 약하게 결합하는 특성을 부여하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 방법들은 일본 특허출원 제 2011-218006 호에 기술되어 있으며, 예를 들어, 항원-결합 영역중 적어도 하나의 아미노산 잔기를 금속 킬레이트화 활성을 갖는 아미노산 잔기로 치환시키고/시키거나 항원-결합 영역내에 금속 킬레이트화 활성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 방법을 포함한다. 항원-결합 영역의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 금속 킬레이트화 활성을 갖는 아미노산 잔기로 치환되고/되거나 금속 킬레이트화 활성을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기가 항원-결합 영역내에 삽입된 항원-결합 분자가 항원-결합 분자의 바람직한 실시양태이다.
금속 킬레이트화 활성을 갖는 아미노산 잔기는, 예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 칼슘 이온 농도에 따라 항원-결합 영역의 항원-결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기는 바람직하게는, 예를 들어, 칼슘-결합 모티프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 칼슘-결합 모티프는 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며, 상세하게 기술되었다(예를 들어, 문헌[Springer et al., (Cell (2000) 102, 275-277)]; 문헌[Kawasaki and Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490)]; 문헌[Moncrief et al., (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562)]; 문헌[Chauvaux et al., (Biochem. J. (1990) 265, 261-265)]; 문헌[Bairoch and Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456)]; 문헌[Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419)]; 문헌[Schaefer et al., (Genomics (1995) 25, 638 to 643)]; 문헌[Economou et al., (EMBO J. (1990) 9, 349-354)]; 문헌[Wurzburg et al., (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)]). 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민 및 미오신 경쇄의 EF 핸드; 단백질 키나제 C의 C2 도메인; 혈액 응고 단백질 인자 IX의 G1a 도메인; 아시아로당단백질 수용체 및 만노스-결합 수용체의 C-형 렉틴, ASGPR, CD23, 및 DC-SIGN; LDL 수용체의 A 도메인; 아넥신 도메인; 카데린 도메인; 3형 트롬보스폰딘 도메인; 및 EGF-유사 도메인이 바람직하게 칼슘 결합 모티프로 사용된다.
항원-결합 영역은 칼슘 이온 농도에 따라 항원-결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기, 예를 들어, 금속 킬레이트화 활성을 갖는 전술한 아미노산 잔기, 및 칼슘-결합 모티프를 형성하는 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 항원-결합 영역에서 상기 아미노산 잔기의 위치는 특별히 제한되지 않으며, 이들은 항원 결합 활성이 칼슘 이온 농도에 따라 변하는 한 임의의 위치에 위치할 수 있다. 한편, 상기 아미노산 잔기는, 상기 항원 결합 활성이 칼슘 이온 농도에 따라 변하는 한, 단독으로 또는 2개 이상의 조합으로 함유될 수 있다. 아미노산 잔기는 바람직하게는, 예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 항원-결합 영역이 항체 가변 영역인 경우, 아미노산 잔기는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 함유될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 중쇄 가변 영역의 CDR3에, 보다 바람직하게는 중쇄 가변 영역의 CDR3 중 카밧 넘버링에 따른 95, 96, 100a 및/또는 101번 위치에 함유될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 경쇄 가변 영역의 CDR1에, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR1 중 카밧 넘버링에 따른 30, 31 및/또는 32번 위치에 함유될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 경쇄 가변 영역의 CDR2에, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR2 중 카밧 넘버링에 따른 50번 위치에 함유될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 경쇄 가변 영역의 CDR3에, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 CDR3 중 카밧 넘버링에 따른 92번 위치에 함유될 수 있다.
또한, 전술한 실시양태들을 조합하는 것이 가능하다. 예를 들어, 아미노산 잔기는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에서 선택된 2개 또는 3개의 CDR에, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역 중 카밧 넘버링에 따른 30, 31, 32, 50 및/또는 92번 위치 중 임의의 하나 이상에 함유될 수 있다.
칼슘 이온 농도에 따라 항원-결합 활성을 변화시키는 전술한 아미노산 잔기를 공통 구조로 공유하면서 상이한 서열을 갖는 다수의 항원-결합 영역들을 라이브러리로서 제조한다. 상기 라이브러리를 선별하여, 그의 항원-결합 활성이 칼슘 이온 농도에 따라 변화되는, 목적 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항원-결합 영역을 효과적으로 수득할 수 있다.
본 개시의 목적을 위해, C1s에 대한 항체의 "친화성"은 항체의 KD의 항으로 표현된다. 항체의 KD는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다. 항원에 대한 항체 결합에 있어서 KD 값이 클수록, 상기 특정 항원에 대해 그의 결합 친화성은 더 약하다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성"(또는 등가의 표현 "pH-의존적 결합")이란 표현은 산성 pH에서의 항체의 KD가 중성 pH에서의 항체의 KD보다 더 큰 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, 항체는, 산성 pH에서 C1s에 대한 항체 결합의 KD가 중성 pH에서 C1s에 대한 항체 결합의 KD에 비해 10배보다 더 큰 경우, 산성 pH에서보다 중성 pH에서 더 높은 친화성으로 C1s에 결합하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 중성 pH에서 C1s에 대한 항체 결합의 KD보다 적어도 11, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 큰 KD하에 산성 pH에서 C1s에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
특정 항원에 대한 항체의 결합 특성은 또한 항체의 kd의 항으로 표현할 수 있다. 항체의 kd는 특정 항원에 관하여 항체의 해리 속도 상수를 지칭하며, 초의 역수(즉, 초-1)의 항으로 나타낸다. kd 값의 증가는 그 항원에 대한 항체의 더 약한 결합을 의미한다. 그러므로, 본 발명은 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 높은 kd 값 하에 C1s에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명은 중성 pH에서 C1s에 대한 항체 결합의 kd보다 적어도 11, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 배 이상 더 큰 kd 하에 산성 pH에서 C1s에 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서의 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다.
특정한 경우에서, "중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 결합"은 산성 pH에서의 항체의 KD 값 대 중성 pH에서의 항체의 KD 값의 비(또는 그 반대도 가능)의 항으로 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해, 항체가 10보다 큰 산성/중성 KD 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C1s에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 항체에 대한 산성/중성 KD 비는 11, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서 항체의 KD 값은 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서의 항체의 KD 값은 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M 이상일 수 있다.
특정한 경우에서, "중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 결합"은 산성 pH에서의 항체의 kd 값 대 중성 pH에서의 항체의 kd 값의 비(또는 그 반대도 가능)의 항으로 나타낸다. 예를 들어, 목적을 위해, 항체가 2 이상의 산성/중성 kd 비를 나타내는 경우, 항체는 "중성 pH에서의 그의 결합에 비해 산성 pH에서 C1s에 대한 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 특정한 예시적 실시양태에서, 항체에 대한 산성/중성 kd 비는 11, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000 이상일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중성 pH에서 항체의 kd 값은 10-2 1/s, 10-3 1/s, 10-4 1/s, 10-5 1/s, 10-6 1/s 이하일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 산성 pH에서 항체의 kd 값은 10-3 1/s, 10-2 1/s, 10-1 1/s 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "산성 pH"란 표현은 4.0 내지 6.5의 pH를 의미한다. "산성 pH"란 표현은 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 및 6.5의 pH 값을 포함한다. 특정 양태에서, "산성 pH"는 5.8이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "중성 pH"란 표현은 6.7 내지 약 10.0의 pH를 의미한다. "중성 pH"란 표현은 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0의 pH 값을 포함한다. 특정 양태에서, "중성 pH"는 7.4이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "고칼슘 농도 조건하에서" 또는 "고칼슘 농도에서"라는 표현은 혈장내(혈중) 칼슘 이온 농도에 가까운 100 μM 내지 10 mM, 보다 바람직하게는 200 μM 내지 5 mM, 및 특히 바람직하게는 0.5 mM 내지 2.5 mM을 의미한다. "고칼슘 농도 조건하에서" 또는 "고칼슘 농도에서"라는 표현은 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 900 μM, 0.5 mM, 0.7 mM, 0.9 mM, 1 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.5 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 및 10 mM Ca2+의 칼슘 농도 값을 포함한다. 특정한 양태에서, "고칼슘 농도 조건하에서" 또는 "고칼슘 농도에서"는 1.2 mM Ca2+를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "저칼슘 농도 조건하에서" 또는 "저칼슘 농도에서"라는 표현은 생체내에서 초기 엔도솜내 칼슘 이온 농도에 가까운 0.1 μM 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 0.5 μM 내지 10 μM, 및 특히 바람직하게는 1 μM 내지 5 μM을 의미한다. "저칼슘 농도 조건하에서" 또는 "저칼슘 농도에서"라는 표현은 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 1.5 μM, 2.0 μM, 2.5 μM, 2.6 μM, 2.7 μM, 2.8 μM, 2.9 μM, 3.0 μM, 3.1 μM, 3.2 μM, 3.3 μM, 3.4 μM, 3.5 μM, 4.0 μM, 5.0 μM, 6.0 μM, 7.0 μM, 8.0 μM, 9.0 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 및 30 μM Ca2+의 칼슘 농도 값을 포함한다. 특정한 양태에서, "저칼슘 농도 조건하에서" 또는 "저칼슘 농도에서"는 3.0 μM Ca2+를 지칭한다.
본 명세서에서 나타낸 바와 같이, KD 값 및 kd 값은 항체-항원 상호작용을 특성화하기 위해 표면 플라즈몬 공명-기반 바이오센서를 사용하여 측정할 수 있다(예를 들어, 본 명세서 실시예 3 참조). KD 값 및 kd 값은 25℃ 또는 37℃에서 측정할 수 있다. 상기 측정은 150 mM NaCl의 존재하에서 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 측정은 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 기술에서는 항체를 고정화시키고, 항원이 애널라이트로 사용되며, 하기의 조건을 이용한다: 37℃에서 10 mM MES 버퍼, 0.05% 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 및 150 mM NaCl.
한 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C1s의 클리어런스를 증대시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C1s의 클리어런스를 증대시키기에 효과적인 양의, 항-C1s 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 개체에서 혈장으로부터 C1r과 C1s의 복합체의 클리어런스를 증대시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C1r과 C1s의 복합체의 클리어런스를 증대시키기에 효과적인 양의, 항-C1s 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키기에 효과적인 양의, 항-C1s 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않도록 하는데 효과적인 양의, 항-C1s 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 혈장으로부터 C1s를 제거하는 방법을 제공한다: (a) 개체의 혈장으로부터 C1s가 제거될 필요가 있는 개체를 확인하고; (b) 항체의 항원-결합(C1s-결합) 도메인을 통해 C1s에 결합하며, KD를 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 측정시, 11 내지 10,000의, pH 5.8에서의 C1s에 대한 KD 및 pH 7.4에서의 C1s에 대한 KD의 비로 정의되는 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값을 갖는 항체를 제공하고(이때, 상기 항체는 생체내에서 혈장내에서 C1s에 결합하고 생체내에서 엔도솜내에 존재하는 조건하에서 결합된 C1s로부터 해리되고, 상기 항체는 인간 IgG 또는 인간화 IgG이다); (c) 상기 항체를 개체에게 투여한다. 추가의 양태에서, 상기 표면 플라즈몬 공명 기술은 37℃ 및 150 mM NaCl에서 이용될 수 있다. 추가의 양태에서, 항체를 고정화시키고, 항원이 애널라이트로 사용되며, 하기의 조건을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 기술이 사용될 수 있다: 37℃에서 10 mM MES 버퍼, 0.05% 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 및 150 mM NaCl.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 대상에서 혈장으로부터 C1s를 제거하는 방법을 제공한다: (a) 제1 항체의 항원-결합 영역을 통해 C1s에 결합하는 제1 항체를 확인하고; (b) (1) 제2 항체의 항원-결합(C1s-결합) 도메인을 통해 C1s에 결합하고, (2) 히스티딘으로 치환된 제1 항체의 가변 영역의 적어도 하나의 아미노산 및/또는 제1 항체의 가변 영역내에 삽입된 적어도 하나의 히스티딘을 갖는 것을 제외하고 아미노산 서열이 제1 항체와 일치하며, (3) 제1 항체의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값보다 더 높고 11 내지 10,000의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값을 가지고(이때, KD(pH5.8)/KD(pH7.4)는 KD를 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 측정시 pH 5.8에서의 C1s에 대한 KD 및 pH 7.4에서의 C1s에 대한 KD의 비로 정의된다), (4) 생체내에서 혈장내 C1s에 결합하고, (5) 생체내에서 엔도솜에 존재하는 조건하에서 결합된 C1s로부터 해리되고, (6) 인간 IgG 또는 인간화 IgG인 제2 항체를 확인하고; (c) 감소된 C1s의 혈장 수준을 가져야 하는 대상을 확인하고; (d) 대상에서 C1s의 혈장 수준이 감소되도록 상기 대상에게 상기 제2 항체를 투여한다. 추가의 양태에서, 상기 표면 플라즈몬 공명 기술은 37℃ 및 150 mM NaCl에서 이용될 수 있다. 추가의 양태에서, 항체를 고정화시키고, 항원이 애널라이트로 사용되며, 하기의 조건을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용할 수 있다: 37℃에서 10 mM MES 버퍼, 0.05% 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 및 150 mM NaCl.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 대상에서 혈장으로부터 C1s를 제거하는 방법을 제공한다: (a) (1) 제1 항체의 항원-결합 영역을 통해 C1s에 결합하고, (2) 제1 항체의 적어도 하나의 가변 영역이 제2 항체의 상응하는 가변 영역보다 적어도 하나 더 많은 히스티딘 잔기를 갖는 것을 제외하고, 제2 항체의 항원-결합(C1s-결합) 도메인을 통해 C1s에 결합하는 제2 항체와 아미노산 서열이 일치하며, (3) 제2 항체의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값보다 더 높고 11 내지 10,000의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 값을 가지고(이때, KD(pH5.8)/KD(pH7.4)는 KD를 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 측정시 pH 5.8에서의 C1s에 대한 KD 및 pH 7.4에서의 C1s에 대한 KD의 비로 정의된다), (4) 생체내에서 혈장내 C1s에 결합하고, (5) 생체내에서 엔도솜에 존재하는 조건하에서 결합된 C1s로부터 해리되고, (6) 인간 IgG 또는 인간화 IgG인 제1 항체를 확인하고; (b) 감소된 C1s의 혈장 수준을 가져야 하는 대상을 확인하고; (c) 대상에서 C1s의 혈장 수준이 감소되도록 상기 대상에게 상기 제1 항체를 적어도 1회 투여한다. 추가의 양태에서, 상기 상기 표면 플라즈몬 공명 기술은 37℃ 및 150 mM NaCl에서 이용될 수 있다. 추가의 양태에서, 항체를 고정화시키고, 항원이 애널라이트로 사용되며, 하기의 조건을 이용하는 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용할 수 있다: 37℃에서 10 mM MES 버퍼, 0.05% 폴리옥시에틸렌소비탄 모노라우레이트, 및 150 mM NaCl. 일부 경우에서, 상기 항체는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 고체 경로 성분은 C1s이다.
(a4) 단리된 항체의 pI
단리된 항체의 한 실시양태에서, 항체의 pI는 9.00 미만, 8.90 미만, 8.80 미만 또는 8.78 이하이다. pI는 바람직하게는 8.90 미만, 보다 바람직하게는 8.80 미만, 더욱 바람직하게는 8.78 이하이다. pI가 그들 중 어느 지점보다 작으면, 항체의 혈중반감기가 연장된다. 다른 한편, pI의 가능한 최소값은 보통 4.28 이상이다.
한 실시양태에서, 항체의 pI는 모세관 등전 포커싱(cIEF)에 의해 측정할 수있다. 실시양태의 한 예로서, cIEF는 플루오로카본-코팅된 모세관 카트리지를 사용하는 프로테인 심플 iCE3 전체-모세관 이미징 시스템에서 행한다. 양극액 및 음극액 용액은 각각 0.1% m/v MC(메틸 셀룰로스) 중의 0.08M 인산 및 0.1% m/v MC 중의 0.1M 수산화 나트륨이다. 분석된 모든 샘플은 0.5mg/mL 작용 항체, 0.3% m/v MC, 6mM IDA(이미노다이아세트산), 10mM 아르기닌, 4M 요소, pI 마커(7.65 및 9.77), 및 2% 파말라이트(Pharmalyte) 8-10.5, 2% 파말라이트 5-8의 v/v 혼합물 중 하나를 함유한다. 모든 샘플은 오토샘플러 구획에 로딩하기 전에 잠시 와동(vortex) 및 원심분리시킨다. 측정을 시작하기 전에 샘플을 오토샘플러에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 1.5 kV로 1분 동안, 이후 3.0 kV로 7분 동안의 조건에서 포커싱을 행한다. 오토샘플러 구획을 10℃에서 유지한다. 측정은 각 시료에 대해 2회 반복하고, 각 시료의 pI 값은 n=2 측정의 평균을 계산하여 수득하였다.
또는, 한 실시양태에서, 항체의 pI는 모세관 등전 포커싱(cIEF)에 의해 측정할 수 있다. 상기 실시양태의 한 예로서, cIEF는 플루오로카본-코팅된 모세관 카트리지를 사용하는 프로테인 심플 iCE3 전체-모세관 이미징 시스템에서 수행한다. 양극액 및 음극액 용액은 각각 0.1% m/v MC(메틸 셀룰로스) 중의 0.08M 인산 및 0.1% m/v MC의 0.1M 수산화 나트륨이다. 분석된 모든 샘플은 작용 0.35% m/v MC, 4mM IDA(이미노다이아세트산), 10mM 아르기닌, pI 마커(3.21 또는 4.22 또는 4.65 또는 5.12 또는 5.85 또는 6.14 또는 6.61 또는 7.05 또는 7.65 또는 8.40 또는 8.79 또는 9.46 또는 9.77 또는 10.1), 및 4% 파말라이트 3-10의 v/v 혼합물 중 하나를 함유한다. 모든 샘플은 오토샘플러 구획에 로딩하기 전에 잠시 와동 및 원심분리시킨다. 1.5 kV로 1분 동안, 이후 3.0 kV로 8분 동안의 조건에서 포커싱을 행한다. 오토샘플러 구획은 10℃에서 유지한다. 측정은 각 시료에 대해 2회 반복하고, 각 시료의 pI 값은 n=2 측정의 평균을 계산하여 수득하였다.
상기 경우의 한 실시양태에서, pI는 모세관 등전 포커싱에 의해 측정되며, 여기에서 0.1% m/v 메틸 셀룰로스(MC) 중 0.08M 인산을 함유하는 용액을 양극액 용액으로서, 0.1% m/v MC 중 0.1M 수산화 나트륨을 함유하는 용액을 음극액 용액으로서 사용하고, 0.5mg/mL 항체, 0.3% m/v MC, 6.0mM 이미노다이아세트산(IDA), 10mM 아르기닌, 4M 요소 및 pI 마커(7.65 및 9.77)를 함유하는 용액을 항체 용해용 작용 용액으로서 사용한다.
(a5) 항원-결합 영역
한 실시양태에서, 항체는 항원-결합 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항원-결합 영역은 C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 항원-결합 영역은 C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 실시양태에서, C1s는 인간 C1s를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. C1s는 바람직하게는 인간 C1s이다.
한 실시양태에서, 항원-결합 영역은 항체 가변 영역일 수 있다. 항체 가변 영역은 항원-결합 영역이 대체 기능 및/또는 차단 기능, 및 항체의 하기 결합 활성과 같은 단리된 항체의 특성을 파괴하지 않는 한 항체 가변 영역의 전체 또는 일부일 수 있고, 항체의 하기 결합 활성은;
인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대한 항체의 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하는 경우,
i) 중성 pH 범위에서의 해리 상수(KD)값은 신뢰성 있게 계산할 수 있고, 산성 pH 범위에서의 KD 값은 결합 활성의 부재 또는 상당히 낮은 결합 활성으로 인해 신뢰성 있게 계산할 수 없거나, 또는
ii) 중성 pH 범위와 산성 pH 범위에서의 KD 값을 모두 신뢰성 있게 계산할 수 있을 경우, 산성 pH 범위에서의 KD 값 대 중성 pH 범위에서의 KD 값의 비, 산성 KD/중성 KD 비는 10보다 크다.
상기 실시양태에서, 항체 가변 영역은 인간화된다. 항원-결합 영역은 바람직하게는 인간화 항체 가변 영역이다. 이러한 인간화 항체를 의약에 사용할 경우 비인간화 항체에 비해 부작용이 회피될 것으로 기대된다.
한 실시양태에서, 항원-결합 영역은 AYAMN(서열 번호: 1)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(서열 번호: 2)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 GRSX7NYX8SX9FHL(서열 번호: 3)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 실시양태에서, 항원-결합 영역은 QAX10X11X12LHDKX13NLA(서열 번호: 4)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, X14ASX15X16ES(서열 번호: 5)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(서열 번호: 6)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 실시양태에서, 각각의 X1 내지 X23은 각각 천연 발생 아미노산으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 단리된 항-C1s 항체는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 항체 정상 영역을 포함한다. 상기 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 AYAMN(서열 번호: 1)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(서열 번호: 2)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 GRSX7NYX8SX9FHL(서열 번호: 3)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 상기 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 QAX10X11X12LHDKX13NLA(서열 번호: 4)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, X14ASX15X16ES(서열 번호: 5)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(서열 번호: 6)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 상기 실시양태에서, 각각의 X1 내지 X23은 각각 천연 발생 아미노산으로부터 선택된다.
상기 아미노산 서열은 PCT/JP2019/015919에서 생성된 키메라 항체로부터 실시예 중의 재조합 및 특성화에 의해 생성된 '실시예', COS0637pHv1 내지 COS0637pHv9에 나타난 항체의 공통 서열을 포함한다. 항원-결합 영역이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 경우, 항원-결합 영역은, 비록 인간화되어 있지만, 키메라 항체보다 인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대한 더 높은 pH-의존성을 갖는 결합 활성을 갖는다.
한 실시양태에서, X1 내지 X23의 아미노산은 바람직하게는 하기 아미노산으로부터 선택된다.
X1은 Lys 또는 Ser이고,
X2는 Gly 또는 Lys이고,
X3은 His 또는 Ser이고,
X4는 Glu 또는 Thr이고,
X5는 Glu 또는 Lys이고,
X6은 Glu 또는 Gly이고,
X7은 Lys 또는 Val이고,
X8은 Asn 또는 Val이고,
X9는 Asp 또는 Gly이고,
X10은 Asn, Gln 또는 Ser이고,
X11은 Gly 또는 Gln이고,
X12는 Ile 또는 Ser이고,
X13은 Lys 또는 Arg이고,
X14는 Gly 또는 Gln이고,
X15는 Gln 또는 Thr이고,
X16은 Leu 또는 Arg이고,
X17은 His 또는 Gln이고,
X18은 Pro 또는 Ser이고,
X19는 Cys 또는 Tyr이고,
X20은 Glu 또는 Ser이고,
X21은 Glu 또는 Ser이고,
X22는 Cys 또는 Leu이고,
X23은 Gln 또는 Thr이다.
이러한 아미노산은 일반적으로 '실시예', COS0637pHv1 내지 COS0637pHv9의 항체에 공통적으로 존재한다. 항원-결합 영역이 아미노산을 포함하는 경우, 항원-결합 영역은, 비록 인간화되어 있지만, 키메라 항체보다 인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대한 더 높은 pH-의존성을 갖는 더 높은 결합 활성을 갖는다.
한 실시양태에서, HVR-H1은 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2는 서열 번호: 8 내지 10으로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-H3은 서열 번호: 11 내지 13으로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L1은 서열 번호: 14 내지 18로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L2는 서열 번호: 19 내지 22로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L3은 서열 번호: 23 내지 28로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
한 실시양태에서, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 아미노산 서열의 조합은 이하의 1) 내지 9)로 이루어진 군으로부터 선택된다;
1) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 8로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 14로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
2) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 9로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 12로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 14로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
3) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
4) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
5) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
6) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 17로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 26으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
7) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
8) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
9) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
한 실시양태에서, X19 및/또는 X22는 Cys가 아니다. X19 및/또는 X22가 Cys가 아닌 경우, 생성된 단리된 항체의 이질성(heterogeneity) 위험이 감소된다. 한 실시양태에서, X19는 Trp 또는 Tyr이고, X22는 Leu 또는 Met이다. X19 및/또는 X22가 Cys가 아닌 경우, X19에 Trp 또는 Tyr, X22에 Leu 또는 Met를 갖는 항원-결합 영역은 실시예 3에 나타나는 다른 아미노산을 갖는 것들보다 인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대한 더 높은 pH-의존성을 갖는 더 높은 결합 활성을 갖는다. 상기 실시양태에서, X19는 바람직하게는 Tyr이고, X22는 바람직하게는 Leu이다. 상기 위치에서 Tyr 및 Leu를 선택하면, X19 및 X22의 아미노산이 산화되는 것을 방지할 수 있다. 이러한 아미노산은 일반적으로 '실시예', COS0637pHv3 내지 COS0637pHv9의 항체에 공통적으로 존재한다.
한 실시양태에서, X1 내지 X23의 아미노산은 바람직하게는 하기 아미노산으로부터 선택된다.
X1은 Ser이고,
X2는 Gly이고,
X3은 His이고,
X4는 Glu이고,
X5는 Glu이고,
X6은 Glu이고,
X7은 Lys이고,
X8은 Asn 또는 Val이고,
X9는 Asp 또는 Gly이고,
X10은 Asn, Gln 또는 Ser이고,
X11은 Gly 또는 Gln이고,
X12는 Ile이고,
X13은 Lys 또는 Arg이고,
X14는 Gly 또는 Gln이고,
X15는 Gln 또는 Thr이고,
X16은 Leu 또는 Arg이고,
X17은 His이고,
X18은 Pro 또는 Ser이고,
X19는 Tyr이고,
X20은 Glu 또는 Ser이고,
X21은 Glu 또는 Ser이고,
X22는 Leu이고,
X23은 Gln 또는 Thr이다.
이러한 아미노산은 일반적으로 '실시예', COS0637pHv3 내지 COS0637pHv9의 항체에 공통적으로 존재한다. 항원-결합 영역이 상기 아미노산을 포함할 경우, 생성된 단리된 항체의 이질성 및 X19 및 X22에서의 아미노산의 산화 위험이 감소될 뿐만 아니라, 항원-결합 영역이 키메라 항체보다 인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대해 더 높은 pH-의존성을 갖는 더 높은 결합 활성을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, HVR-H1은 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2는 서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H3은 서열 번호: 11 또는 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1은 서열 번호: 15 내지 18로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L2는 서열 번호: 19 내지 22로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L3은 서열 번호: 24 내지 28로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 아미노산 서열의 조합은 이하의 3) 내지 9)로 이루어진 군으로부터 선택된다;
3) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
4) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
5) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
6) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 17로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 26으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
7) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
8) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
9) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
상기 조합 중, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 아미노산 서열의 조합은, 바람직하게는, PBMC와 같은 면역 세포에서 면역원성 잠재성이 적고 형태학적 변화를 유발할 잠재성이 적기 때문에 이하의 4개의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다;
3) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
5) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
8) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
9) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
서열 번호: 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
서열 번호: 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 40, 41, 98, 99 및 100으로 이루어진 산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 38, 101, 102, 103, 104, 105 및 106으로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 조합은 서열 번호: 40 및 38, 서열 번호: 41 및 38, 서열 번호: 98 및 101, 서열 번호: 99 및 101, 서열 번호: 99 및 102, 서열 번호: 99 및 103, 서열 번호: 100 및 104, 서열 번호: 100 및 105, 및 서열 번호: 100 및 106으로 이루어진 산 서열의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 98, 99 및 100으로 이루어진 산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 101, 102, 103, 104, 105 및 106으로 이루어진 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 조합은 서열 번호: 98 및 101, 서열 번호: 99 및 101, 서열 번호: 99 및 102, 서열 번호: 99 및 103, 서열 번호: 100 및 104, 서열 번호: 100 및 105, 및 서열 번호: 100 및 106으로 이루어진 산 서열의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
(a6) 항체 정상 영역
한 실시양태에서, 단리된 항체의 항체 정상 영역은 인간 항체의 정상 영역을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인간 항체의 정상 영역은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 IgG1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인간 항체는 바람직하게는 인간 IgG1이다.
한 실시양태에서, 항체 정상 영역은 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 아미노산은 그것이 부재한 단리된 항체와 비교하여 산성 pH 범위에서 단리된 항체의 FcRn에 대한 결합능을 증가시킬 수 있다.
상기 실시양태에서, 정상 영역은 다음을 포함한다:
(a) EU 넘버링에 따른 434번 위치의 Ala; 438번 위치의 Glu, Arg, Ser 또는 Lys; 및 440번 위치의 Glu, Asp 또는 Gln;
(b) EU 넘버링에 따른 434번 위치의 Ala; 438번 위치의 Arg 또는 Lys; 및 440번 위치의 Glu 또는 Asp;
(c) EU 넘버링에 따른 428번 위치의 Ile 또는 Leu; 434번 위치의 Ala; 436번 위치의 Ile, Leu, Val, Thr 또는 Phe; 438번 위치의 Glu, Arg, Ser 또는 Lys; 및 440번 위치의 Glu, Asp 또는 Gln;
(d) EU 넘버링에 따른 428번 위치의 Ile 또는 Leu; 434번 위치의 Ala; 436번 위치의 Ile, Leu, Val, Thr 또는 Phe; 438번 위치의 Arg 또는 Lys; 및 440번 위치의 Glu 또는 Asp;
(e) EU 넘버링에 따른 428번 위치의 Leu; 434번 위치의 Ala; 436번 위치의 Val 또는 Thr; 438번 위치의 Glu, Arg, Ser 또는 Lys; 및 440번 위치의 Glu, Asp 또는 Gln; 또는
(f) EU 넘버링에 따른 428번 위치의 Leu; 434번 위치의 Ala; 436번 위치의 Val 또는 Thr; 438번 위치의 Arg 또는 Lys; 및 440번 위치의 Glu 또는 Asp.
WO2013/046704는, 산성 조건하에서 FcRn 결합을 증가시킬 수 있는 아미노산 치환과 조합될 경우 류마토이드 인자 결합의 유의한 감소를 초래하는, EU 넘버링에 따른 Q438R/S440E, Q438R/S440D, Q438K/S440E 및 Q438K/S440D의 이중 아미노산 잔기 치환을 구체적으로 보고하였다.
상기 실시양태에서, 정상 영역은 바람직하게는 이하로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환의 조합을 포함한다:
(I) EU 넘버링에 따른 (a) N434A/Q438R/S440E; (b) N434A/Q438R/S440D; (c) N434A/Q438K/S440E; (d) N434A/Q438K/S440D; (e) N434A/Y436T/Q438R/S440E; (f) N434A/Y436T/Q438R/S440D; (g) N434A/Y436T/Q438K/S440E; (h) N434A/Y436T/Q438K/S440D; (i) N434A/Y436V/Q438R/S440E; (j) N434A/Y436V/Q438R/S440D; (k) N434A/Y436V/Q438K/S440E; (l) N434A/Y436V/Q438K/S440D; (m) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E; (n) N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D; (o) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E; (p) N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D; (q) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E; (r) N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D; (s) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E; (t) N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D; (u) M428L/N434A/Q438R/S440E; (v) M428L/N434A/Q438R/S440D; (w) M428L/N434A/Q438K/S440E; (x) M428L/N434A/Q438K/S440D; (y) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; (z) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D; (aa) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E; (ab) M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D; (ac) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E; (ad) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D; (ae) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E; (af) M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D; (ag) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; (ah) L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; 또는
(II) EU 넘버링에 따른 (a) N434A/Q438R/S440E; (b) N434A/Y436T/Q438R/S440E; (c) N434A/Y436V/Q438R/S440E; (d) M428L/N434A/Q438R/S440E; (e) M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; (f) M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E; (g) L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; 및 (h) L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E.
또 다른 실시양태에서, 정상 영역은 바람직하게는 428번 위치의 류신, 434번 위치의 알라닌 및 436번 위치의 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다(모든 숫자는 EU 넘버링 시스템에 따름). 상기 실시양태에서, 정상 영역은 보다 바람직하게는 428번 위치의 류신, 434번 위치의 알라닌 및 436번 위치의 트레오닌을 포함한다(모든 숫자는 EU 넘버링 시스템에 따름).
한 실시양태에서, 정상 영역은, 제2 참조 항체와 비교하여, 중성 pH 범위에서 Fc 감마 수용체에 대한 단리된 항체의 결합능을 증가시킬 수 있는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
상기 실시양태에서, 정상 영역은 바람직하게는 이하로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함한다:
EU 넘버링에 따른 정상 영역 사이트에서,
221번 아미노산 위치의 Lys 또는 Tyr;
222번 아미노산 위치의 Phe, Trp, Glu 및 Tyr 중 어느 하나;
223번 아미노산 위치의 Phe, Trp, Glu 및 Lys 중 어느 하나;
224번 아미노산 위치의 Phe, Trp, Glu 및 Tyr 중 어느 하나;
225번 아미노산 위치의 Glu, Lys 및 Trp 중 어느 하나;
227번 아미노산 위치의 Glu, Gly, Lys 및 Tyr 중 어느 하나;
228번 아미노산 위치의 Glu, Gly, Lys 및 Tyr 중 어느 하나;
230번 아미노산 위치의 Ala, Glu, Gly 및 Tyr 중 어느 하나;
231번 아미노산 위치의 Glu, Gly, Lys, Pro 및 Tyr 중 어느 하나;
232번 아미노산 위치의 Glu, Gly, Lys 및 Tyr 중 어느 하나;
233번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
234번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
235번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
236번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
237번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
238번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
239번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
240번 아미노산 위치의 Ala, Ile, Met 및 Thr 중 어느 하나;
241번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Leu, Arg, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
243번 아미노산 위치의 Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
244번 아미노산 위치의 His;
245번 아미노산 위치의 Ala;
246번 아미노산 위치의 Asp, Glu, His 및 Tyr 중 어느 하나;
247번 아미노산 위치의 Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val 및 Tyr 중 어느 하나;
249번 아미노산 위치의 Glu, His, Gln 및 Tyr 중 어느 하나;
250번 아미노산 위치의 Glu 또는 Gln;
251번 아미노산 위치의 Phe;
254번 아미노산 위치의 Phe, Met 및 Tyr 중 어느 하나;
255번 아미노산 위치의 Glu, Leu 및 Tyr 중 어느 하나;
256번 아미노산 위치의 Ala, Met 및 Pro 중 어느 하나;
258번 아미노산 위치의 Asp, Glu, His, Ser 및 Tyr 중 어느 하나;
260번 아미노산 위치의 Asp, Glu, His 및 Tyr 중 어느 하나;
262번 아미노산 위치의 Ala, Glu, Phe, Ile 및 Thr 중 어느 하나;
263번 아미노산 위치의 Ala, Ile, Met 및 Thr 중 어느 하나;
264번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
265번 아미노산 위치의 Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
266번 아미노산 위치의 Ala, Ile, Met 및 Thr 중 어느 하나;
267번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
268번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 및 Trp 중 어느 하나;
269번 아미노산 위치의 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
270번 아미노산 위치의 Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
271번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
272번 아미노산 위치의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
273번 아미노산 위치의 Phe 또는 Ile;
274번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
275번 아미노산 위치의 Leu 또는 Trp;
276번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
278번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 및 Trp 중 어느 하나;
279번 아미노산 위치의 Ala;
280번 아미노산 위치의 Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
281번 아미노산 위치의 Asp, Lys, Pro 및 Tyr 중 어느 하나;
282번 아미노산 위치의 Glu, Gly, Lys, Pro 및 Tyr 중 어느 하나;
283번 아미노산 위치의 Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg 및 Tyr 중 어느 하나;
284번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Leu, Asn, Thr 및 Tyr 중 어느 하나;
285번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Lys, Gln, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
286번 아미노산 위치의 Glu, Gly, Pro 및 Tyr 중 어느 하나;
288번 아미노산 위치의 Asn, Asp, Glu 및 Tyr 중 어느 하나;
290번 아미노산 위치의 Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
291번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln 및 Thr 중 어느 하나;
292번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Pro, Thr 및 Tyr 중 어느 하나;
293번 아미노산 위치의 Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
294번 아미노산 위치의 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
295번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
296번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 및 Val 중 어느 하나;
297번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
298번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
299번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
300번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 및 Trp 중 어느 하나;
301번 아미노산 위치의 Asp, Glu, His 및 Tyr 중 어느 하나;
302번 아미노산 위치의 Ile;
303번 아미노산 위치의 Asp, Gly, Tyr 중 어느 하나;
304번 아미노산 위치의 Asp, His, Leu, Asn 및 Thr 중 어느 하나;
305번 아미노산 위치의 Glu, Ile, Thr 및 Tyr 중 어느 하나;
311번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Asn, Thr, Val 및 Tyr 중 어느 하나;
313번 아미노산 위치의 Phe;
315번 아미노산 위치의 Leu;
317번 아미노산 위치의 Glu 또는 Gln;
318번 아미노산 위치의 His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 및 Tyr 중 어느 하나;
320번 아미노산 위치의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
322번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
323번 아미노산 위치의 Ile;
324번 아미노산 위치의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
325번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
326번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
327번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
328번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
329번 아미노산 위치의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
330번 아미노산 위치의 Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
331번 아미노산 위치의 Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
332번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
333번 아미노산 위치의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val 및 Tyr 중 어느 하나;
334번 아미노산 위치의 Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro 및 Thr 중 어느 하나;
335번 아미노산 위치의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp 및 Tyr 중 어느 하나;
336번 아미노산 위치의 Glu, Lys 및 Tyr 중 어느 하나;
337번 아미노산 위치의 Glu, His, Asn 중 어느 하나;
339번 아미노산 위치의 Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser 및 Thr 중 어느 하나;
376번 아미노산 위치의 Ala 또는 Val;
377번 아미노산 위치의 Gly 또는 Lys;
378번 아미노산 위치의 Asp;
379번 아미노산 위치의 Asn;,
380번 아미노산 위치의 Ala, Asn 및 Ser 중 어느 하나;
382번 아미노산 위치의 Ala 또는 Ile;
385번 아미노산 위치의 Glu;
392번 아미노산 위치의 Thr;
396번 아미노산 위치의 Leu;
421번 아미노산 위치의 Lys;
427번 아미노산 위치의 Asn;
428번 아미노산 위치의 Phe 또는 Leu;
429번 아미노산 위치의 Met;
434번 아미노산 위치의 Trp;
436번 위치의 Ile; 및
440번 아미노산 위치의 Gly, His, Ile, Leu, Tyr 중 어느 하나.
상기 실시양태에서, 정상 영역은 보다 바람직하게는 이하 중 하나 이상을 포함한다.
EU 넘버링에 따른 정상 영역 사이트에서
238번 아미노산 위치의 Asp, 및
328번 아미노산 위치의 Glu.
상기 실시양태에서, 정상 영역은 바람직하게는 하기 아미노산 중 하나 이상을 추가로 포함한다; 234번 위치의 티로신, 235번 위치의 트립토판, 236번 위치의 아스파라긴, 238번 위치의 아스파르트산, 250번 위치의 발린, 264번 위치의 아이소류신, 268번 위치의 아스파르트산, 295번 위치의 프롤린, 326번 위치의 트레오닌 및 330번 위치의 리신(모든 숫자는 EU 넘버링 시스템에 따름). 정상 영역은 추가로 바람직하게는 하기 (a) 또는 (b)의 아미노산을 포함한다;
(a) 235번 위치의 트립토판, 236번 위치의 아스파라긴, 268번 위치의 아스파르트산, 295번 위치의 류신, 326번 위치의 트레오닌 및 330번 위치의 리신, 또는
(b) 234번 위치의 티로신, 238번 위치의 아스파르트산, 250번 위치의 발린, 264번 위치의 아이소류신, 307번 위치의 프롤린 및 330번 위치의 리신(모든 숫자는 EU 넘버링 시스템에 따름).
한 실시양태에서, 단리된 항체의 등전점(pI)은 정상 영역의 개변에 의해 증가된다. 상기 실시양태에서, 증가된 pI를 갖는 단리된 항체는 모 정상 영역과 비교하여 정상 영역에 적어도 2개의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 각각의 아미노산 변경은 모 정상 영역의 것과 비교하여 정상 영역의 등전점(pI)을 증가시킨다. 추가적인 실시양태에서, 아미노산은 영역의 표면에 노출될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 단리된 항체는 정상 영역 및 항원-결합 도메인을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 항원-결합 도메인의 항원-결합 활성은 이온 농도 조건에 따라 변화한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명의 증가 된 pI를 갖는 정상 영역은 EU 넘버링에 따른 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422 및 431번 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 위치의 2개 이상의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 증가 된 pI를 갖는 정상 영역은 선택된 각각의 위치에서 Arg 또는 Lys를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 증가 된 pI를 갖는 정상 영역은 311번 위치의 아르기닌 및 343번 위치의 아르기닌을 포함한다(두 숫자 모두 EU 넘버링 시스템에 따름).
한 실시양태에서, 단리된 항체의 등전점(pI)은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 개변에 의해 감소된다. 상기 실시양태에서, pI가 감소된 단리된 항체는 모 영역과 비교하여 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에서 적어도 하나의 아미노산 개변을 포함한다. 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 개변에 의한 이러한 감소된 pI는 단리된 항체의 PK 개선에 기여할 수 있다.
상기 실시양태에서, 중쇄 정상 영역은 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산은 그것이 부재한 인간 항체의 정상 영역의 결합능과 비교하여 C1q에 대한 결합능을 감소시킬 수 있다. 단리된 항체의 정상 영역과 C1q의 불필요한 결합이 이러한 아미노산에 의해 감소될 경우, 단리된 항체가 의약으로 사용될 때에 불필요한 결합을 초래하는 부작용이 방지된다. C1q에 대한 항체 정상 영역의 결합이 감소된 예시적인 아미노산은 예를 들어 WO2014163101에 제시되어 있다. 특정 실시양태에서, C1q에 대한 결합능을 감소시킬 수 있는 아미노산은 EU 넘버링 시스템에서 238번 위치의 Asp이다.
한 실시양태에서, 모든 활성화 Fc 감마 R, 특히 Fc 감마 RIIa(R형)에 대한 단리된 항체의 정상 영역의 결합 활성은, WO2014163101에 개시된 바와 같은 천연 발생 IgG 항체 정상 영역을 포함하는 단리된 항체와 비교하여, 감소될 수 있지만, Fc 감마 RIIb-결합 활성은 유지된다. 이러한 정상 영역의 결합 활성에 의해, Fc 감마 RIIb를 통해 면역 복합체를 제거하는 특성은 천연 발생 IgG와 유사한 정도로 유지되는 조건하에서 Fc 감마 RIIb의 ITIM(면역수용체 티로신-기반 억제 모티프)의 인산화에 의해 생성되는 염증성 면역 응답-억제 신호를 향상시킬 수 있다. 또한, Fc 감마 RIIb에 선택적으로 결합하는 특성을 갖는 정상 영역을 부여함으로써, 항-항체 생성을 억제할 수 있다. 게다가, 활성화 Fc 감마 Rs에 대한 결합을 감소시킴으로써, 혈소판 상의 Fc 감마 RIIa와 면역 복합체 사이의 상호작용에 의해 매개되는 혈소판 활성화, 및 Fc 감마 Rs 활성화의 가교에 의한 수지상 세포 활성화를 피할 수 있다.
상기 실시양태에서, 중쇄 정상 영역은 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산은 그것이 부재한 인간 항체의 정상 영역과 비교하여 Fc 감마 RIIb에 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 실시양태에서, 인간 Fc 감마 RIIa에 대한 중쇄 정상 영역의 KD 값 대 인간 Fc 감마 RIIb에 대한 중쇄 정상 영역의 KD 값의 비(KD(hFc 감마 RIIa/KD(hFc 감마 RIIb))는 상기 하나 이상의 아미노산이 부재한 인간 항체의 정상 영역보다 더 높다. Fc 감마 RIIb에 선택적으로 결합하는 특성을 갖는 정상 영역 중의 예시적인 아미노산은 예를 들어 WO2014163101에 제시된다. 특정 실시양태에서, 중쇄 정상 영역은 EU 넘버링 시스템으로 234번 위치의 Tyr, EU 넘버링 시스템으로 238번 위치의 Asp, EU 넘버링 시스템으로 264번 위치의 Ile, 및 EU 넘버링 시스템으로 330번 위치의 Lys를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 중쇄 정상 영역은 EU 넘버링 시스템으로 214번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 250번 위치의 Val, EU 넘버링 시스템으로 307번 위치의 Pro, EU 넘버링 시스템으로 311번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 343번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 428번 위치의 Leu, EU 넘버링 시스템으로 434번 위치의 Ala, EU 넘버링 시스템으로 436번 위치의 Thr, EU 넘버링 시스템으로 438번 위치의 Arg, 및 EU 넘버링 시스템으로 440번 위치의 Glu로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 중쇄 정상 영역은 EU 넘버링 시스템으로 214번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 234번 위치의 Tyr, EU 넘버링 시스템으로 238번 위치의 Asp, EU 넘버링 시스템으로 250번 위치의 Val, EU 넘버링 시스템으로 264번 위치의 Ile, EU 넘버링 시스템으로 307번 위치의 Pro, EU 넘버링 시스템으로 311번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 330번 위치의 Lys, EU 넘버링 시스템으로 343번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 428번 위치의 Leu, EU 넘버링 시스템으로 434번 위치의 Ala, EU 넘버링 시스템으로 436번 위치의 Thr, EU 넘버링 시스템으로 438번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 440번 위치의 Glu로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 중쇄 정상 영역은 EU 넘버링 시스템으로 214번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 234번 위치의 Tyr, EU 넘버링 시스템으로 238번 위치의 Asp, EU 넘버링 시스템으로 250번 위치의 Val, EU 넘버링 시스템으로 264번 위치의 Ile, EU 넘버링 시스템으로 307번 위치의 Pro, EU 넘버링 시스템으로 311번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 330번 위치의 Lys, EU 넘버링 시스템으로 343번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 428번 위치의 Leu, EU 넘버링 시스템으로 434번 위치의 Ala, EU 넘버링 시스템으로 436번 위치의 Thr, EU 넘버링 시스템으로 438번 위치의 Arg, EU 넘버링 시스템으로 440번 위치의 Glu로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 이러한 실시양태의 아미노산이 상기 항원-결합 영역과 조합될 경우, 단리된 항체는 PBMC와 같은 면역 세포에서 더 적은 면역원성 잠재성 및/또는 형태학적 변화를 유발할 더 적은 잠재성을 갖는다.
한 실시양태에서, 중쇄 정상 영역의 C-말단 리신(EU 넘버링 시스템으로 447번 위치) 또는 C-말단 글리신-리신(EU 넘버링 시스템으로 446 및 447번 위치)을 제거하여, WO2009041613에 개시된 바와 같이 제조된 단리된 항체의 이질성을 감소시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 정상 영역에서 EU 넘버링 시스템으로 446 및 447번 위치의 아미노산이 결실된다.
Fc 영역 변이체
(스위핑 기법)
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 수식을 본 명세서에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 수식(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG1의 Fc 영역이다.
혈장 항원 농도의 감소를 증대시키고/시키거나 항체의 약동학을 개선하기 위해, IgG의 Fc 영역중 FcRn에 결합하기 위한 부위의 아미노산 잔기는 세포내로의 그의 흡수를 증대시키도록 수식시킬 수 있다. pH 의존성을 갖는 항체가 이러한 방식으로 수식될 때, 상기 변이체는, FcRn에 보다 강하게 결합할 수 있고 항원이 효과적으로 엔도솜내로 전달된(pH가 산성인 경우) 다음 분해되게 하지만, 자체로 더 효과적으로 세포 표면으로 재순환될 수 있는 "스위핑" 항체이다. 상기와 같은 수식된, "스위핑" 항체는 상기 수식을 갖지 않는 원래의 (모) 항체에 비해, 중성 pH에서 및 세포 표면상에서 FcRn에 강하게 결합하고 항원의 흡수 및 분해를 증대시킬 수 있다(문헌[Semin Immunopathol. 2018; 40(1): 125-140]).
일부 양태에서, 상기 항체는 혈장 항원 농도의 감소를 증대시키고/시키거나 항체의 약동학을 개선하기 위해 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 수식을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강한 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역이다. 예를 들어, WO 2013/047752 호에서 언급된 바와 같이, 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성을 증대시키기 위해, Fc 영역 중 아미노산 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, 및 440번 위치(EU 넘버링)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을, 모(원래) 항체인 천연 인간 IgG1의 Fc 영역 중 상응하는 부위들의 아미노산들과 상이하도록 수식시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 활성화 Fc 감마 수용체에 대한 것보다 더 강한 억제 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역이다. 예를 들어, WO 2013/125667 호에서 언급된 바와 같이, 억제 Fc 감마 수용체에 대한 결합 활성을 증대시키기 위해, Fc 영역 중 아미노산 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442, 및 447번 위치(EU 넘버링)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을, 천연 인간 IgG1의 Fc 영역 중 상응하는 부위들의 아미노산들과 상이하도록 수식시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 천연 인간 IgG1의 Fc 영역의 결합 활성보다 더 강한, 중성 pH에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 인간 Fc 영역이다. 예를 들어, WO 2011/122011에서 언급된 바와 같이, 중성 pH에서 FcRn에 대한 결합 활성을 증대시키기 위해, Fc 영역 중 아미노산 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434, 및 436번 위치(EU 넘버링)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을, 천연 인간 IgG1의 Fc 영역 중 상응하는 부위들의 아미노산들과 상이하도록 수식시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능(예를 들어, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보가 되게 하는 일부의(전부는 아닌) 이펙터 기능을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포상해 어세이를 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 측정할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 어세이를 수행하여, 항체가 Fc 감마 R 결합이 결여되어(따라서 아마도 ADCC 활성이 결여되어) 있지만, FcRn 결합능을 유지하는지를 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 Fc 감마 RIII 만을 발현하는 반면, 단핵세포는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII 및 Fc 감마 RIII를 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 어세이의 비제한적인 예들이 미국 특허 제 5,500,362 호(예를 들어, 문헌[Hellstrom et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기술되어 있다. 또는, 비-방사성 어세이 방법을 사용할 수 있다(예를 들어, 플로 사이토메트리를 위한 ACTI(등록상표) 비-방사성 세포상해 어세이(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포상해 어세이(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 상기와 같은 어세이에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있는지를 확인하기 위해 C1q 결합 어세이를 또한 수행할 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 호 및 WO　2005/100402 호의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 어세이를 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 변이체(미국 특허 제 7,332,581 호)를 포함하여, 아미노산 265, 269, 270, 297 및 327번 위치 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 변이체를 포함한다.
FcR에 대해 증가 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체들이 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312 호, 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 상기 Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치(잔기들의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 미국 특허 제 6,194,551 호, WO　99/51642 호, 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기술된 바와 같이, 변화된(즉, 증가되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포상해(CDC)을 야기하는 개변이 Fc 영역에서 수행된다.
증가된 반감기, 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)(모체 IgG의 태아로의 전달을 담당)(문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976)] 및 문헌[Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 증가된 결합을 갖는 항체들이 US2005/0014934 A1 호(힌톤(Hinton) 등)에 기술되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 증가시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기들: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제 7,371,826 호)을 갖는 것들을 포함한다. 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-740 (1988)]; 미국 특허 제 5,648,260 호; 미국 특허 제 5,624,821 호; 및 WO 94/29351 호를 참조한다.
(a7) 다른 실시양태
(항체 변이체)
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 상기 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열내에 적절한 수식을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 수식은, 예를 들어, 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 삽입 및/또는 상기 서열내 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물에 도달할 수 있으나, 단 상기 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들어, 항원-결합을 가져야 한다.
a7-1) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 변이도입을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 표 1에 "바람직한 치환"의 제목하에 나타내었다. 보다 실질적인 변화들이, 표 1에 "예시적인 치환"의 제목하에, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술된 바와 같이 제공되어 있다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입시킬 수 있으며 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해서 선별할 수 있다.
Figure pct00001
아미노산들은 공통 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 상기 클래스들 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성된 변이체(들)은 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성들(예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변화(예를 들어, 개선)를 갖고/갖거나, 상기 모 항체의 특정 생물학적 특성들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 증진된 항체이며, 상기 항체는 편의상, 예를 들어, 파지 디스플레이-기반 친화성 증진 기법, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 기법들을 사용하여 생성할 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기를 변이시키고, 변이체 항체를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대해 선별한다.
예를 들어, 항체 친화성을 개선시키기 위해 HVR에 개변(예를 들어, 치환)이 수행될 수 있다. 상기와 같은 개변은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 변이가 일어나는 코돈에 의해 코딩된 잔기들(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196(2008)] 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 수행될 수 있으며, 이때 생성되는 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리의 제작 및 그로부터의 재선택에 의한 친화성 증진은, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기술되었다. 친화성 증진에 대한 일부 실시양태에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들어, 에러-프론 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-특이적 변이도입)에 의해 증진을 위해 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킨다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서, 상기 라이브러리를 선별하여 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-유도 접근방법을 포함하며, 상기 접근방법에서는 다수의 HVR 잔기들(예를 들어, 한 번에 4 내지 6개의 잔기)이 무작위 선정된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 변이도입 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 개변이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실이 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 개변(예를 들어, 본 명세서에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 수행될 수 있다. 상기 개변은, 예를 들어, 상기 HVR 중의 항원 접촉 잔기들 밖에 존재할 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변이되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
변이도입을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989), Science 244:1081-1085]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 변이도입"이라 칭한다. 상기 방법에서는, 표적 잔기들(예를 들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기)의 잔기 또는 기를 확인하고, 이들을, 상기 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 추가의 치환을 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 상기 아미노산 위치들에 도입시킬 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원간의 접촉점들을 확인할 수 있다. 상기와 같은 접촉 잔기 및 주변 잔기들을 치환 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체들은, 이들이 목적하는 특성을 함유하는지를 측정하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 길이가 1개 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들어, ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈장 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
a7-2) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 상기 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 변이된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 편리하게는 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 개변시킴으로써 수행할 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 결합된 탄수화물을 변이시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 결합되는 분지된 바이안테너리 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 수식은 특정한 개선된 특성들을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 결합된(직접 또는 간접적으로) 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 푸코스의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546 호에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정시 Asn297에 결합된 모든 당구조물들(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고-만노스 구조물)의 합에 대해, Asn297에서의 상기 당쇄내 푸코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역내의 대략 297번 위치(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하나; Asn297은 또한 항체내 미미한 서열 변화로 인해 297번 위치의 대략 ±3개 아미노산 상류 또는 하류에, 즉, 294 내지 300번 위치에 위치할 수도 있다. 상기와 같은 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 US 2003/0157108 호(프레스타 엘 (Presta, L.)); US 2004/0093621 호(교와 학코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 간행물의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; 문헌[Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허출원 US 2003/0157108 A1 호, 프레스타 엘; 및 WO 2004/056312 A1 호, 아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)]; 문헌[Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107 호 참조)를 포함한다.
이등분 올리고사카라이드, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 결합된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 이등분 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878 호(장 마레(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 제 6,602,684 호(우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 호(우마나 등)에 기술되어 있다. 상기 Fc 영역에 결합된 올리고사카라이드에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087 호(파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 호(라주 에스(Raju, S.); 및 WO 1999/22764 호(라주 에스)에 기술되어 있다.
a7-3) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "싸이오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 싸이올기가 상기 항체의 접근가능한 부위에 위치하고, 상기 반응성 싸이올기를 사용하여 상기 항체를 다른 잔기, 예를 들어, 약물 잔기 또는 링커-약물 잔기에 컨주게이트시켜, 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같은 이뮤노컨주게이트를 생성시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,521,541 호에 기술된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
a7-4) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 수식될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 상기 항체에 결합된 중합체들의 수는 달라질 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 결합되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 상기 항체의 특정한 특성 또는 기능, 상기 항체 유도체가 한정된 조건하에서 치료에 사용될 것인지의 여부 등을 포함한(이로 한정되지는 않는다) 고려사항들에 기반하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 잔기의 컨주게이트가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 비단백질성 잔기는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 정상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 잔기를 상기 항체-비단백질성 잔기에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 가열시키는 파장을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호에 기술된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 항-C1s 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예컨대, 이들로 변형되었다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 항-C1s 항체의 제조 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기에 제공된 바와 같은, 상기 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항-C1s 항체의 재조합 제조를 위해, 예를 들어, 전술한 바와 같은, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내에 삽입한다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 명세서에 기술된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 제조할 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제 5,648,237 호, 미국 특허 제 5,789,199 호 및 미국 특허 제 5,840,523 호를 참조한다(또한 대장균에서의 항체 단편의 발현을 기술하고 있는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 상기 항체는 가용성 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 제조하는 진균 및 효모 균주를 포함한 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)]; 및 문헌[Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,959,177 호, 미국 특허 제 6,040,498 호, 미국 특허 제 6,420,548 호, 미국 특허 제 7,125,978 호 및 미국 특허 제　6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티보디스(PLANTIBODIES)(등록상표) 기법을 기술하고 있음)를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주; 인간 배아 신장주(예를 들어,문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 서톨리 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-252 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)])를 포함한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예를 들어, Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주에 대한 검토를 위해서는, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)]을 참조한다.
pH-의존적 특징을 갖는 항체를, 예를 들어, WO 2009/125825 호에 기술된 바와 같은 선별 방법 및/또는 변이도입 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 상기 선별 방법은, pH-의존적 결합 특징을 갖는 항체를 특정 항원에 특이적인 항체들의 집단 내에서 확인하는 임의의 과정을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별 방법은 산성 pH 및 중성 pH 둘 다에서 항체들의 초기 집단 내의 개개 항체들의 하나 이상의 결합 파라미터(예를 들어, KD 또는 kd)를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 항체들의 결합 파라미터는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명을 이용하여, 또는 특정 항원에 대한 항체의 결합 특징에 대한 정량적 또는 정성적 평가를 가능하게 하는 임의의 다른 어세이 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 선별 방법은 2 이상의 산성 KD/중성 KD 비로 항원에 결합하는 항체를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 또는, 상기 선별 방법은 2 이상의 산성 kd/중성 kd 비로 항원에 결합하는 항체를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 변이도입 방법은 항원에 대한 항체의 pH-의존적 결합을 증대시키기 위해 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 내에 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 혼입시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 변이도입은 항체의 하나 이상의 가변 도메인 내에서, 예를 들어, 하나 이상의 HVR(예를 들어, CDR) 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 변이도입은 항체의 하나 이상의 HVR(예를 들어, CDR) 내의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 변이도입은 항체의 적어도 하나의 HVR(예를 들어, CDR) 중의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, "증대된 pH-의존적 결합"은 항체의 변이된 버전이 변이도입 이전의 항체의 원래 "모"항체(즉, 덜 pH-의존적인) 버전보다 더 큰 산성 KD/중성 KD 비 또는 더 큰 산성 kd/중성 kd 비를 나타내는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체의 변이된 버전은 2 이상의 산성 KD/중성 KD 비를 갖는다. 또는, 상기 항체의 변이된 버전은 2 이상의 산성 kd/중성 kd 비를 갖는다.
다중클론 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 증가된다. 이작용성 물질 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 컨주게이트), N-하이드록시석신이미드(리신 잔기를 통해), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(여기에서, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 컨주게이트시키는 것이 유용할 수 있다.
동물(통상적으로 비-인간 포유동물)을, 예를 들어, 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 컨주게이트(각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3개 부피의 프로인트(Freund's) 완전 보조제와 혼합시키고 상기 용액을 다수의 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 컨주게이트 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후에 상기 동물을 프로인트 완전 보조제 중의 펩티드 또는 컨주게이트의 원래량의 1/5 내지 1/10로 다수의 부위에 피하 주사함으로써 추가접종한다. 7 내지 14일 후에 상기 동물을 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대해 어세이한다. 동물들은 역가 평탄역까지 추가접종한다. 바람직하게는, 상기 동물은, 동일 항원이지만 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된 컨주게이트로 추가접종한다. 컨주게이트는 또한 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물 중에서 제조될 수 있다. 또한, 알룸과 같은 응집제가 상기 면역 응답을 증대시키기 위해 적절히 사용된다.
단일클론 항체는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 수득한다, 즉, 상기 집단을 구성하는 개개의 항체들은, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 변이 및/또는 번역후 수식(예를 들어, 이성질체화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 따라서, 상기 "단일클론"이라는 수식어는 상기 항체의 특성이 별개의 항체들의 혼합물은 아닌 것을 가리킨다.
예를 들어, 상기 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature 256(5517): 495-497 (1975)]에 처음 기술된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터를 본 명세서에서 상기에 기술된 바와 같이 면역화시켜, 상기 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 또는, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
상기 면역화제는 전형적으로 항원 단백질 또는 그의 융합 변이체를 포함할 것이다. 일반적으로 인간 기원의 세포를 목적하는 경우 말초혈 림프구(PBL)가 사용되거나, 또는 비-인간 포유동물 공급원을 목적하는 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 상기 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103]).
불멸화 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 상기와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종하고 성장시킨다. 예를 들어, 상기 모 골수종 세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 상기 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질들인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화 골수종 세포는, 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고-수준 생산을 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 이들 중에서, 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양(미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)에서 입수할 수 있다) 및 SP-2 세포(및 그의 유도체, 예를 들어, X63-Ag8-653)(미국 버지니아주 머내서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 입수할 수 있다)로부터 유래된 것들이 바람직하다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 기술되었다(문헌[Kozbor et al. J. Immunol. 133(6):3001-3005 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대해 유도된 단일클론 항체의 생성에 대해 어세이한다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해서 또는 시험관내 결합 어세이, 예를 들어, 방사성면역어세이(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA)에 의해서 측정한다. 상기와 같은 기법 및 어세이들은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 결합 친화성은 문헌[Munson, Anal. Biochem. 107(1):220-239 (1980)]의 스캐처드(Scatchard) 어세이에 의해 측정할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성, 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론들을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법(고딩(Goding)의 상기 문헌)에 의해 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 상기 하이브리도마 세포는 포유동물에서 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
상기 서브클론들에 의해 분비된 단일클론 항체는 상기 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이드 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 적절히 분리시킨다.
III. 어세이
본 명세서에 제공된 항-C1s 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 어세이에 의해 그의 물리/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성화할 수 있다.
A. 결합 어세이 및 다른 어세이
한 양태에서, 본 발명의 항체를, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또 다른 양태에서, C1s에 대한 결합에 있어서 본 명세서에 기술된 임의의 항-C1s 항체와 경합하는 항체를 확인하거나, 또는 본 명세서에 기술된 임의의 항-C1s 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 확인하기 위해, 경합 어세이를 이용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 경합 항체가 과량으로 존재하는 경우, 상기 항체는 C1s에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 이상만큼 차단한다(예를 들어, 감소시킨다). 특정 실시양태에서, 상기와 같은 경합 항체는 본 명세서에 기술된 임의의 항-C1s 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체구조적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 지도화에 대한 상세한 예시적인 방법들이 문헌[Morris(1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 특정 실시양태에서, 상기와 같은 경합 어세이는 중성 pH 조건에서 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 경합 어세이는, 예를 들어, 옥텟(Octet)(등록상표) 시스템을 이용하는 탠덤 경합 어세이이다.
예시적인 경합 어세이에서는, 고정화된 C1s를, C1s에 결합하는 제1 표지된 항체(예를 들어, 본 명세서에 기술된 항체들 중 하나), 및 C1s에 대한 결합에 있어서 제1 항체와 경합하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2의 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 배양한다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 C1s를, 상기 제1 표지된 항체는 포함하지만 상기 제2의 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. C1s에 대한 상기 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후에, 과잉의 비결합 항체를 제거하고, 고정화된 C1s와 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 C1s와 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이는 상기 제2 항체가 상기 C1s에 대한 결합에 있어서 상기 제1 항체와 경합함을 시사한다(문헌[Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조).
또 다른 양태에서, 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 C1s에 대한 결합에 있어서 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 경합하는 항체를 샌드위치 어세이를 이용하여 확인할 수 있다. 샌드위치 어세이는, 각각 검출될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 항체를 이용하는 것을 포함한다. 샌드위치 어세이에서는, 시험 샘플 애널라이트에 고체 지지체상에 고정화된 제1 항체가 결합된 다음, 제2 항체가 상기 애널라이트에 결합하므로, 불용성인 3-부분 복합체를 형성한다(데이빗 및 그린(David & Greene), 미국 특허 제 4,376,110 호 참조). 제2 항체는 자체로 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나(직접적 샌드위치 어세이), 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다(간접적 샌드위치 어세이). 예를 들어, 샌드위치 어세이의 한 유형은 ELISA 어세이로, 이 경우에는 검출가능한 잔기가 효소이다. 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 동시에 C1s에 결합하는 항체는 항-C1s 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 항체인 것으로 측정할 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체와 동시에 C1s에 결합하지 않는 항체는 항-C1s 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 C1s에 대한 결합에 있어서 항-C1s 항체와 경합하는 항체인 것으로 측정할 수 있다.
B. 활성 어세이
한 양태에서, 생물 활성을 갖는 그의 항-C1s 항체를 확인하기 위한 어세이가 제공된다. 생물 활성은 고전적 경로의 활성화 및 상기 경로의 활성화로부터 비롯되는 절단 생성물, C2a, C2b, C3a, C4a, C4b, C5a 및 C5b의 생성을 차단하는 것을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 항체도 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체를 상기 생물 활성에 대해 시험한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체를, 즉 RBC 어세이를 이용하여, 양 RBC 항원에 대해 유도된 항체에 의해 감작된 양 적혈구 세포(RBC)의 보체-매개 용혈을 억제하는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체를, cRBC 항원에 대해 유도된 항체에 의해 감작된 닭 적혈구 세포(cRBC)의 보체-매개 용혈을 억제하는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다. 보체 단백질의 공급원으로서 인간 혈청을 이용하여, 방출된 헤모글로빈의 양을 분광광도 방법으로 측정함으로써 본 발명 항체의 활성을 측정할 수 있다.
RBC 어세이는 문헌[J. Vis. Exp. 2010; (37): 1923]에 개시된 방법과 같은 공지된 방법을 이용하여 적절하게 수행할 수 있다. 상기 논문은 RBC 용해 어세이로서 50% 용혈성 보체(CH50) 어세이를 수행하는 방법을 기술하고 있다. 간략하게, 상기 어세이는 고전적 보체 경로의 활성화를 측정하고, 상기 경로의 임의 성분의 감소, 부재 또는 불활성을 검출한다. 상기 어세이는 혈청내 보체 성분의 적혈구 세포를 용해시키는 활성을 평가한다. 항체를 시험 혈청과 함께 배양하면, 상기 경로가 활성화되고 용혈을 야기한다. 상기 고전적 경로의 하나 이상의 성분이 감소되면, CH50 값이 감소된다. 상기 CH50 어세이는, 더 정확하게는 보체 성분들에 의한 세포 용해에 대한 %억제를 측정하는 본 명세서의 실시예들에서 사용된 어세이와 정확히 동일하지는 않지만; 개념 및 기본 구성은 본 발명과 실질적으로 동일하다. 한 실시양태에서, 상기 RBC 어세이를 다음과 같이 수행한다. 인간 혈청을 관심 항체와 함께 예비-배양한다(예를 들어, 섭씨 37 도(℃)에서 3 시간동안). 이어서, 상기 혈청을 동 부피의 감작된 양 적혈구 세포에 첨가하고 배양(예를 들어, 37℃에서 1 시간동안)하여 적혈구 세포를 용해시킨다. 이어서, 반응을 중단시킨다. 혼합물을 원심분리하여 미용해 세포를 펠릿화하고, 상등액을 회수하고, 415 nm에서의 흡광도(OD)에서 630 nm에서의 OD를 감한 값을 이용하여 헤모글로빈의 방출을 분석한다. 적혈구 세포 용해의 %억제를 계산하기 위해, 0% 억제는 항체가 첨가되지 않은(버퍼만) 조건으로 설정하고, 100% 억제는 EDTA가 5 mM의 최종 농도로 첨가된 조건으로 설정한다(예를 들어, 실시예 7 참조). 항체가 적혈구 세포 용해의 %억제를 나타내는 경우, 이것은 상기 항체가 인간 혈청 보체에 대한 중화 활성, 예를 들어, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 활성을 가짐을 의미한다.
따라서, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 활성을 평가하기 위해, RBC 어세이를 이용하여 항체의 인간 혈청 보체에 대한 중화 활성을 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은, RBC 어세이에서 인간 혈청 보체에 대해 70% 이상의 중화 활성을 갖는, C1q와 C1r2s2 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 단리된 항체를 제공한다.
C. 면역원성 잠재성의 평가
항체의 면역 원성 잠재성은 WO2018/124005(구보 씨. 등)에 기재된 바와 같이 활성 증식이 나타나기 전의 IL-2-분비 CD4+ T 세포의 비율을 지표로 사용하여 평가한다. 구체적으로, 인간 PBMC로부터 CD8-CD25low PBMC(말초혈 단핵 세포)를 제조하고, 항체 존재하에 세포를 67시간 배양한다.
IV. 이뮤노컨주게이트
본 발명은 또한 하나 이상의 세포상해제, 예를 들어, 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-C1s 항체를 포함하는 이뮤노컨주게이트를 제공한다.
한 실시양태에서, 이뮤노컨주게이트는, 다음을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 약물에 항체가 접합된 항체-약물 컨주게이트(ADC)이다: 메이탄시노이드(미국 특허 제　5,208,020 호, 미국 특허 제 5,416,064 호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 호 참조); 오리스타틴, 예를 들어, 모노메틸오리스타틴 약물 잔기 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제 5,635,483 호 및 미국 특허 제 5,780,588 호 및 미국 특허 제 7,498,298 호 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체(미국 특허 제 5,712,374 호, 미국 특허 제 5,714,586 호, 미국 특허 제 5,739,116 호, 미국 특허 제 5,767,285 호, 미국 특허 제 5,770,701 호, 미국 특허 제 5,770,710 호, 미국 특허 제 5,773,001 호, 및 미국 특허 제 5,877,296 호; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)]; 및 문헌[Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린, 예를 들어, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)]; 문헌[Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)]; 문헌[Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)]; 문헌[Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)]; 문헌[Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)]; 문헌[King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 제 6,630,579 호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065.
또 다른 실시양태에서, 이뮤노컨주게이트는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 미국자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀(saponaria officinalis), 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센을 포함하나 이로 한정되지 않는 효소 활성 독소 또는 그의 단편에 접합된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 이뮤노컨주게이트는 방사성 원자에 접합되어 방사성컨주게이트를 형성하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성컨주게이트의 생성에 이용할 수 있다. 예로는 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 상기 방사성컨주게이트가 검출에 사용되는 경우, 상기 방사성컨주게이트는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어, Tc-99m 또는 123I, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(자기공명 영상화, MRI로도 알려짐)용 스핀 표지, 예를 들어, 또한 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이싸이오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노싸이올레인(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들어, 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아자이도 화합물(예를 들어, 비스(p-아자이도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포상해제의 컨주게이트를 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신(ricin) 면역독소를 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소싸이오사이아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다(WO94/11026 호 참조). 상기 링커는 세포 중에서 세포상해 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131(1992)]; 미국 특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
본 발명의 이뮤노컨주게이트 또는 ADC는 특별히, (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 록포드 소재)로부터) 상업적으로 시판하는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하나 이로 한정되지는 않는 가교결합제 시약을 사용하여 제조된 상기 컨주게이트를 고려하나, 이로 한정되지는 않는다.
V. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 항-C1s 항체는 생물 샘플 중의 C1s의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적인 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어, 혈청, 전혈, 혈장, 생검 샘플, 조직 샘플, 세포 현탁액, 타액, 객담, 구강액, 뇌척수액, 양막액, 복수, 유즙, 초유, 유선 분비물, 림프, 소변, 땀, 누액, 위액, 활액, 복막액, 수정체액 또는 점액을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물 샘플내 C1s의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 생물 샘플을 항-C1s 항체의 C1s에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-C1s 항체와 접촉시키고, 상기 항-C1s 항체와 C1s 간에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-C1s 항체를 사용하여, 예를 들어, C1s가 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우, 항-C1s 항체를 사용한 요법에 적격인 대상을 선택한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 다음을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다: 연령-관련 황반 변성, 알츠하이머(Alzheimer)병, 근위축성 측삭 경화증, 아나필락시스, 은친화 과립성 치매, 관절염(예를 들어, 류마티스성 관절염), 천식, 죽상동맥경화증, 비정형 용혈 요독 증후군, 자가면역 질환, 바라퀘-시몬스(Barraquer-Simons) 증후군, 베체트(Behcet)병, 영국형 아밀로이드 혈관병증, 수포성 유사천포창, 버거씨(Buerger)병, C1q 신장병증, 암, 치명적 항인지질 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 한랭 응집소병, 피질기저핵 변성, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 크론(Crohn)병, 한랭글로불린혈증성 혈관염, 권투선수 치매, 루이소체(Lewy Bodies) 치매(DLB), 석회화를 갖는 미만성 신경섬유 다발, 원반모양 홍반성 루푸스, 다운(Down) 증후군, 국소분절 사구체경화증, 형식적 사고 장애, 전두측두엽 치매(FTD), 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker)병, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 할러포르덴-스파츠(Hallervorden-Spatz)병, 용혈성 요독 증후군, 유전성 혈관부종, 저인산염혈증, 특발성 폐렴 증후군, 면역 복합체병, 봉입체 근염, 감염성 질환(예를 들어, 세균(예, 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 또는 스트렙토코커스), 바이러스(예, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)), 또는 다른 감염원에 의해 야기된 질환), 염증 질환, 허혈/재관류 손상, 경도 인지 장애, 면역성혈소판감소증 자반병(ITP), A형 몰리브데넘 조효소 결핍(MoCD), 1형 미증식 사구체신염(MPGN), 2형 미증식 사구체신염(MPGN)(조밀 침착병), 미증식 신염, 다발경색 치매, 루푸스(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스(SLE)), 사구체신염, 가와사키(Kawasaki)병, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증, 다발계 위축증, 중증 근무력증, 심근경색, 근긴장 장애, 시신경 척수염, C형 니만-피크(Niemann-Pick)병, 신경섬유 다발을 갖는 비-괌주민 운동 신경 질환, 파킨슨(Parkinson)병, 치매 동반 파킨슨병, 발작성 야간 헤모글로빈뇨, 심상성 천포창, 피크병, 뇌염후 파킨슨증, 다발근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경아교증, 진행성 책상 마비, 건선, 패혈증, 쉬가(Shiga)-독소생성 대장균(STEC)-HuS, 척추근 위축증, 뇌졸중, 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유다발 치매, 이식 거부반응, 혈관염(예를 들어, ANCA 관련 혈관염), 베게너(Wegner) 육아종증, 겸상세포 질환, 한랭글로불린혈증, 혼합 한랭글로불린혈증, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 2형 혼합 한랭글로불린혈증, 3형 혼합 한랭글로불린혈증, 신염, 약물-유도성 혈소판감소증, 루푸스 신염, 수포성 유사천포창, 후천성 수포성 표피박리증, 지연 용혈성 수혈 반응, 저보체혈성 두드러기성 혈관염 증후군, 위수정체 수포 각막병증, 및 혈소판 수혈불응증.
특정 실시양태에서, 표지된 항-C1s 항체가 제공된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 잔기(예를 들어, 형광성, 발색성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 잔기들, 예를 들어, 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 표지로는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들어, 반딧불 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국 특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 서양와사비 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, 유리카제 및 잔틴 옥시다제(과산화수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어, HRP를 산화시키는 효소와 결합된 것들), 락토퍼옥시다제 또는 미세퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다.
VI. 약학 제형
본 명세서에 기술된 바와 같은 항-C1s 항체의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 일반적으로 무독성이며, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 버퍼, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소비톨; 염-형성 짝이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본 발명에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공개 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어, 콘드로이티나제와 복합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형들이 미국 특허 제 6,267,958 호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제 6,171,586 호 및 WO2006/044908 호에 기술된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 버퍼를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 병용 치료에 사용되는 제형을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분들은 적절하게, 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 매크로에멀션 중의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 봉입할 수 있다. 상기 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 무균이다. 무균은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행할 수 있다.
VII. 치료 방법 및 조성물
본 명세서에 제공된 임의의 항-C1s 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항-C1s 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 보체-매개 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-C1s 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 유효량의 상기 항-C1s 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 적어도 하나의 추가 치료제 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 보체-매개 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1s의 클리어런스를 증대시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 항-C1s 항체는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않도록 하는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 항체는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 보체-매개 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 C1s의 클리어런스를 증대시키는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스를 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 고전적 보체 경로의 성분을 억제하는 방법에 사용하기 위한 항-C1s 항체를 제공하고; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
한 양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 예를 들어, C4b2a의 생성을 감소시키기 위해 보체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에서 보체 활성화를 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체를 포함하는 본 개시내용의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 보체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 개체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 상기 개체는 인간이다. 투여는 본 명세서에 개시된 경로들을 포함하여 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 임의의 경로에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥내 또는 피하 투여이다. 일부 실시양태에서, 투여는 척추강내 투여이다.
보체-매개 질환 또는 장애는 개체의 세포, 조직 또는 체액 중에서 비정상적인 양의 보체 C1s 또는 비정상적 수준의 보체 C1s 단백질분해 활성을 특징으로 하는 질병이다.
일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 장애는 세포, 조직 또는 체액 중에 증가된(정상보다 높은) 양의 C1s 또는 증가된 수준의 보체 C1s 활성의 존재를 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 장애는 뇌조직 및/또는 뇌척수액 중에 C1s의 증가된 양 및/또는 증가된 활성의 존재를 특징으로 한다. 세포, 조직 또는 체액 중 "정상보다 높은" 양의 C1s는, 세포, 조직 또는 체액 중 C1s의 양이 정상적인 대조군 수준보다 높은 것, 예를 들어, 동일 연령군의 개체 또는 개체 집단에 대해 정상적인 대조군 수준보다 더 높은 것을 의미한다. 세포, 조직 또는 체액 중에서의 "정상보다 높은" 수준의 C1s 활성은, 세포, 조직 또는 체액 중에서 C1s에 의해 수행된 단백질분해성 절단이 정상적인 대조군 수준보다 높은 것, 예를 들어, 동일 연령군의 개체 또는 개체 집단에 대해 정상적인 대조군 수준보다 더 높은 것을 의미한다. 일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체는 상기 질환 또는 장애의 하나 이상의 추가의 증상을 나타낸다.
다른 경우에서, 보체-매개 질환 또는 장애는 세포, 조직 또는 체액 중에 정상보다 낮은 양의 C1s 또는 더 낮은 수준의 보체 C1s 활성의 존재를 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 장애는 뇌조직 및/또는 뇌척수액 중 C1s의 더 낮은 양 및/또는 더 낮은 활성의 존재를 특징으로 한다. 세포, 조직 또는 체액 중 C1s의 "정상보다 낮은" 양은, 세포, 조직 또는 체액 중 C1s의 양이 정상적인 대조군 수준보다 낮은 것, 예를 들어, 동일 연령군의 개체 또는 개체 집단에 대해 정상적인 대조군 수준보다 더 낮은 것을 의미한다. 세포, 조직 또는 체액 중에서의 C1s 활성의 "정상보다 낮은" 수준은, 세포, 조직 또는 체액 중에서 C1s에 의해 수행된 단백질분해성 절단이 정상적인 대조군 수준보다 낮은 것, 예를 들어, 동일 연령군의 개체 또는 개체 집단에 대해 정상적인 대조군 수준보다 더 낮은 것을 의미한다. 일부 경우에서, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체는 상기 질환 또는 장애의 하나 이상의 추가의 증상을 나타낸다.
보체-매개 질환 또는 장애는 보체 C1s의 양 또는 활성이 개체에서 질환 또는 장애를 야기하게 하는 정도인 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 자가면역 질환, 암, 혈액 질환, 감염성 질환, 염증 질환, 허혈-재관류 손상, 신경퇴행성 질환, 신경퇴행성 질병, 안질환, 신장 질환, 이식 거부반응, 혈관 질환 및 혈관염 질환으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 감염성 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 염증 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 혈액 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 허혈-재관류 손상이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 안질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 신장 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 이식 거부반응이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 항체-매개 이식 거부반응이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 혈관 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 혈관염 질병이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 신경퇴행성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 신경퇴행성 질환이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 신경퇴행성 질병이다. 일부 실시양태에서, 상기 보체-매개 질환 또는 장애는 타우병증이다.
보체-매개 질환 또는 장애의 예는 연령-관련 황반 변성, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 아나필락시스, 은친화 과립성 치매, 관절염(예를 들어, 류마티스성 관절염), 천식, 죽상동맥경화증, 비정형 용혈 요독 증후군, 자가면역 질환, 바라퀘-시몬스 증후군, 베체트병, 영국형 아밀로이드 혈관병증, 수포성 유사천포창, 버거씨병, C1q 신장병증, 암, 치명적 항인지질 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 한랭 응집소병, 피질기저핵 변성, 크로이츠펠트-야콥병, 크론병, 한랭글로불린혈증성 혈관염, 권투선수 치매, 루이소체 치매(DLB), 석회화를 갖는 미만성 신경섬유 다발, 원반모양 홍반성 루푸스, 다운 증후군, 국소분절 사구체경화증, 형식적 사고 장애, 전두측두엽 치매(FTD), 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 길랑-바레 증후군, 할러포르덴-스파츠병, 용혈성 요독 증후군, 유전성 혈관부종, 저인산염혈증, 특발성 폐렴 증후군, 면역 복합체병, 봉입체 근염, 감염성 질환(예를 들어, 세균(예, 나이세리아 메닌지디티스 또는 스트렙토코커스), 바이러스(예, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)), 또는 다른 감염원에 의해 야기된 질환), 염증 질환, 허혈/재관류 손상, 경도 인지 장애, 면역성혈소판감소증 자반병(ITP), A형 몰리브데넘 조효소 결핍(MoCD), 1형 미증식 사구체신염(MPGN), 2형 미증식 사구체신염(MPGN)(조밀 침착병), 미증식 신염, 다발경색 치매, 루푸스(예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스(SLE)), 사구체신염, 가와사키병, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증, 다발계 위축증, 중증 근무력증, 심근경색, 근긴장 장애, 시신경 척수염, C형 니만-피크병, 신경섬유 다발을 갖는 비-괌주민 운동 신경 질환, 파킨슨병, 치매를 갖는 파킨슨병, 발작성 야간 헤모글로빈뇨, 심상성 천포창, 피크병, 뇌염후 파킨슨증, 다발근염, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경아교증, 진행성 책상 마비, 건선, 패혈증, 쉬가-독소생성 대장균(STEC)-HuS, 척추근 위축증, 뇌졸중, 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유다발 치매, 이식 거부반응, 혈관염(예를 들어, ANCA 관련 혈관염), 베게너 육아종증, 겸상세포 질환, 한랭글로불린혈증, 혼합 한랭글로불린혈증, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 2형 혼합 한랭글로불린혈증, 3형 혼합 한랭글로불린혈증, 신염, 약물-유도성 혈소판감소증, 루푸스 신염, 수포성 유사천포창, 후천성 수포성 표피박리증, 지연 용혈성 수혈 반응, 저보체혈성 두드러기성 혈관염 증후군, 위수정체 수포 각막병증, 및 혈소판 수혈불응증을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
알츠하이머병 및 특정 형태의 전두측두엽 치매(피크병, 산발성 전두측두엽 치매 및 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매)가 타우병증의 가장 흔한 형태이다. 이에 따라서, 본 발명은, 타우병증이 알츠하이머병, 피크병, 산발성 전두측두엽 치매 및 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매인, 전술한 임의의 방법에 관한 것이다. 다른 타우병증은 진행성 책상 마비(PSP), 피질기저핵 변성(CBD) 및 아급성 경화성 범뇌염을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
신경퇴행성 타우병증은 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 은친화 과립성 치매, 영국형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 피질기저핵 변성, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 석회화를 갖는 미만성 신경섬유 다발, 다운 증후군, 전두측두엽 치매, 염색체 17과 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 할러포르덴-스파츠병, 봉입체 근염, 다발계 위축증, 근긴장 장애, C형 니만-피크병, 신경섬유 다발을 갖는 비-괌주민 운동 신경 질환, 피크병, 뇌염후 파킨슨증, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경아교증, 진행성 책상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 신경섬유다발 치매, 다발경색 치매, 허혈성 뇌졸중, 만성 외상성 뇌질환(CTE), 외상성 뇌 손상(TBI), 및 뇌졸중을 포함한다.
본 개시내용은 또한 시누클레인병증, 예를 들어, 파킨슨병(PD); 루이소체 치매(DLB); 다발계 위축증(MSA); 등을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 치매 동반 PD(PDD)를 본 개시내용의 방법으로 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 장애는 알츠하이머병을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 장애는 파킨슨병을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 장애는 이식 거부반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보체-매개 질환 또는 장애는 항체-매개 이식 거부반응을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 개체에서 보체-매개 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 개시를 예방하거나 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 개체에서 보체-매개 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상을 경감시키거나 제거한다. 증상의 예는 자가면역 질환, 암, 혈액 질환, 감염성 질환, 염증 질환, 허혈-재관류 손상, 신경퇴행성 질환, 신경퇴행성 질병, 신장 질환, 이식 거부반응, 안질환, 혈관 질환 또는 혈관염 질병과 연관된 증상들을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 상기 증상은 신경학적 증상, 예를 들어, 손상된 인지 기능, 기억 장애, 운동 기능의 소실 등일 수 있다. 상기 증상은 또한 개체의 세포, 조직 또는 체액 중 C1s 단백질의 활성일 수 있다. 상기 증상은 또한 개체의 세포, 조직 또는 체액 중 보체 활성화의 정도일 수 있다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하는 것은 개체의 세포, 조직 또는 체액 중에서의 보체 활성화를 조절한다. 일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하는 것은 개체의 세포, 조직 또는 체액 중에서의 보체 활성화를 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 보체 활성화에 비해, 개체에서의 보체 활성화를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 적혈구 세포 상의 C3 침착을 감소시킨다; 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 RBC 상에 C3b, iC3b 등의 침착을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 보체-매개 적혈구 세포 용해를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 혈소판 상의 C3 침착을 감소시킨다; 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는 혈소판 상에 C3b, iC3b 등의 침착을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하는 것은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 결과를 제공한다: (a) 보체 활성화의 감소; (b) 인지 기능의 개선; (c) 뉴런 손실의 감소; (d) 뉴런내 포스포-타우 수준의 감소; (e) 아교세포 활성화의 감소; (f) 림프구 침윤의 감소; (g) 대식세포 침윤의 감소; (h) 항체 침착의 감소; (i) 아교세포 손실의 감소; (j) 희소돌기아교세포 손실의 감소; (k) 수지상 세포 침윤의 감소; (l) 호중구 침윤의 감소; (m) 적혈구 세포 용해의 감소; (n) 적혈구 세포 탐식작용의 감소; (o) 혈소판 탐식작용의 감소; (p) 혈소판 용해의 감소; (q) 이식편 생존율의 개선; (r) 대식세포 매개 탐식작용의 감소; (s) 시력의 개선; (t) 운동 조절의 개선; (u) 혈전 형성의 개선; (v) 응고의 개선; (w) 신장 기능의 개선; (x) 항체 매개 보체 활성화의 감소; (y) 자가항체 매개 보체 활성화의 감소; (z) 빈혈의 개선: (aa) 수초탈락의 감소; (ab) 호산구증가증의 감소; (ac) 적혈구 세포 상의 C3 침착의 감소(예를 들어, RBC 상에 C3b, iC3b 등의 침착의 감소); 및 (ad) 혈소판 상의 C3 침착의 감소(예를 들어, 혈소판 상에 C3b, iC3b 등의 침착의 감소); 및 (ae) 아나필라톡신 독소 생성의 감소; (af) 자가항체 매개 수포 형성의 감소; (ag) 자가항체 유도성 소양증의 감소; (ah) 자가항체 유도성 홍반의 감소; (ai) 자가항체 매개 피부 미란의 감소; (aj) 수혈 반응으로 인한 적혈구 세포 파괴의 감소; (ak) 동종항체로 인한 적혈구 세포 용해의 감소; (al) 수혈 반응으로 인한 용혈의 감소; (am) 동종항체 매개 혈소판 용해의 감소; (an) 수혈 반응으로 인한 혈소판 용해의 감소; (ao) 비만세포 활성화의 감소; (ap) 비만세포 히스타민 방출의 감소; (aq) 혈관 투과성의 감소; (ar) 부종의 감소; (as) 이식편 내피 상에 보체 침착의 감소; (at) 이식편 내피중 아나필라톡신 생성의 감소; (au) 표피-진피 접합부 분리의 감소; (av) 표피-진피 접합부에서 아나필라톡신 생성의 감소; (aw) 이식편 내피에서 동종항체 매개 보체 활성화의 감소; (ax) 신경근 접합부의 항체 매개 손실의 감소; (ay) 신경근 접합부에서 보체 활성화의 감소; (az) 신경근 접합부에서 아나필라톡신 생성의 감소; (ba) 신경근 접합부에서 보체 침착의 감소; (bb) 마비의 감소; (be) 저림의 감소; (bd) 증가된 방광 조절; (be) 증가된 장 조절; (bf) 자가항체와 관련된 사망률의 감소; 및 (bg) 자가항체와 관련된 이환율의 감소.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 결과들의 수준 또는 정도에 비해, 하기의 결과들 중 하나 이상의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많은 감소를 달성하는데 효과적이다: (a) 보체 활성화; (b) 인지 기능의 저하; (c) 뉴런 손실; (d) 뉴런내 포스포-타우 수준; (e) 아교세포 활성화; (f) 림프구 침윤; (g) 대식세포 침윤; (h) 항체 침착; (i) 아교세포 손실; (j) 희소돌기아교세포 손실; (k) 수지상 세포 침윤; (l) 호중구 침윤; (m) 적혈구 세포 용해; (n) 적혈구 세포 탐식작용; (o) 혈소판 탐식작용; (p) 혈소판 용해; (q) 이식편 거부반응; (r) 대식세포 매개 탐식작용; (s) 시력 손실; (t) 항체 매개 보체 활성화; (u) 자가항체 매개 보체 활성화; (v) 수초탈락; (w) 호중구증가증.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 결과들의 수준 또는 정도에 비해, 하기의 결과들 중 하나 이상의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많은 감소를 달성하는데 효과적이다: a) 인지 기능,; b) 이식편 생존율; c) 시력; d) 운동 조절; e) 혈전 혈성; f) 응고; g) 신장 기능; 및 h) 적혈구용적율(적혈구 세포수).
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 보체 활성화를 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 보체 활성화에 비해, 개체에서 보체 활성화를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 인지 기능을 개선시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 인지 기능에 비해, 개체에서 인지 기능을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 인지 기능의 저하 속도를 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 인지 기능 저하 속도에 비해, 개체에서 인지 기능의 저하 속도를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 뉴런 손실을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 뉴런 손실에 비해, 개체에서 뉴런 손실을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 포스포-타우 수준을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 포스포-타우 수준에 비해, 개체에서 포스포-타우 수준을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 아교세포 활성화를 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 아교세포 활성화에 비해, 개체에서 아교세포 활성화를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 아교세포는 별아교세포 또는 미세아교세포이다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 림프구 침윤을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 림프구 침윤에 비해, 개체에서 림프구 침윤을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 대식세포 침윤을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 대식세포 침윤에 비해, 개체에서 대식세포 침윤을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 항체 침착을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 항체 침착에 비해, 개체에서 항체 침착을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 개체에게 본 개시내용의 항-C1s 항체를 투여하면 개체에서 아나필라톡신(예를 들어, C3a, C4a, C5a) 생성을 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-C1s 항체는, 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 단일요법 또는 병용 요법으로 하나 이상의 용량으로 투여될 때, 항-C1s 항체를 사용한 치료전의 개체에서의 아나필라톡신 생성 수준에 비해, 개체에서 아나필라톡신 생성을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 90% 보다 많이 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하기 위한 본 개시내용의 항-C1s 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 항-C1s 항체의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 억제하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에서 보체 활성화를 억제하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에서 보체 활성화를 억제하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에서 보체 활성화를 억제하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 항-C1s 항체의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 보체 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에서 보체 활성화를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 치료에 사용하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 치료에 사용하기 위한 본 개시내용의 항-C1s 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 의학적 치료에 사용하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하기 위한 본 개시내용의 항-C1s 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체, 또는 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한 본 개시내용의 항-C1s 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 보체 활성화를 조절하기 위한, 본 개시내용의 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 항-C1s 항체는 보체 활성화를 억제한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서 항-C1s 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 유효량의 상기 약제를 투여하는 것을 포함하는, 보체-매개 질환 또는 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게, 예를 들어, 하기에 기술되는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1s의 클리어런스(또는 제거)를 증대시키는데 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)를 증대시키는데 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)는 증대시키지만 혈장으로부터 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않도록 하는데 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 고전적 보체 경로의 성분을 억제하는데 사용하기 위한 것이며; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다.
추가의 실시양태에서, 상기 약제는 보체-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체에게 유효량의 상기 약제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 보체-매개 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기와 같은 보체-매개 질환 또는 장애가 있는 개체에게 유효량의 항-C1s 항체를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 하기에 기술되는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C1s의 클리어런스(또는 제거)를 증대시키는 방법을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)를 증대시키는 방법을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈장으로부터 C1r2s2의 클리어런스(또는 제거)는 증대시키지만 C1q의 클리어런스는 증대시키지 않는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 본 발명은 개체에서 고전적 보체 경로의 성분을 억제하는 방법을 제공하며; 일부 경우에서, 상기 고전적 보체 경로 성분은 C1s이다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 임의의 항-C1s 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 항-C1s 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 제형은 본 명세서에 제공된 임의의 항-C1s 항체, 및 예를 들어, 하기에 기술하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료에 단독으로 또는 다른 제와 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공-투여될 수 있다.
상기에 언급된 상기와 같은 병용 치료법은 병행 투여(여기서 2개 이상의 치료제가 동일한 제형 또는 별도의 제형에 포함된다), 및 별도 투여(이 경우, 본 발명의 항체의 투여는 상기 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다)를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 항-C1s 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 일어난다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 치료와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가적인 치료제)는, 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 필요한 경우, 병변내 투여를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은, 부분적으로 투여가 단기간인지 또는 장기적인지에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명에서는 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지 않는 다양한 투약 스케줄이 고려된다.
본 발명의 항체는 우량 의료 규범(good medical practice)과 일치되는 방식으로 제형화되고, 복용되고, 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 요인들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 조건, 질환의 원인, 제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지된 다른 요인들을 포함한다. 상기 항체는, 문제의 질병을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제와, 반드시는 아니지만, 선택적으로 함께 제형화된다. 상기와 같은 다른 제의 유효량은 제형중에 존재하는 제의 양, 질병 또는 치료의 유형, 및 상기에서 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본 명세서에 기술된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 따라서 사용되거나, 또는 본 명세서에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 상기 질환의 중증도 및 과정, 상기 항체가 예방 목적으로 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 상기 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체 약 1 μg/kg 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어, 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)가, 예를 들어, 1회 이상의 별개 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 요인들에 따라 약 1 μg/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 조건에 따라서, 치료는 일반적으로는 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 수 있다. 상기 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다(예를 들어, 환자가 상기 항체의 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어, 약 6회 용량을 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 더 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 그러나, 다른 투여법이 유용할 수도 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기법 및 어세이에 의해 용이하게 모니터된다.
임의의 상기 제형들 또는 치료 방법들은 항-C1s 항체 대신에 또는 상기 항체에 더하여 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
VIII. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 첨부 문서를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 유지하며, 무균적 억세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 상기 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성 성분은 본 발명의 항체이다. 상기 표지 또는 첨부 문서는 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용됨을 나타낸다. 더욱이, 상기 제품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포상해제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서 제품은 상기 조성물을 사용하여 특정 병태를 치료할 수 있음을 나타내는 첨부 문서를 추가로 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 상기 제품은 약학적으로 허용되는 버퍼, 예를 들어, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은, 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 항-C1s 항체 대신에 또는 상기 항체에 더하여 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
하기는 본 발명의 방법들 및 조성물들의 실시예이다. 상기에서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 실시양태들도 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
명확한 이해를 위해 상기 본 발명을 도시 및 예로 다소 상세하게 기술하였지만, 설명 및 예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 본 명세서에 인용된 모든 특히 및 과학 문헌의 개시내용은 분명하게 전체적으로 참고로 도입된다.
실시예 1
재조합 C1r2s2의 제조
1.1. 사이노 C1r2s2 His/FLAG(등록상표) 사량체의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용되는 서열은 C-말단 GGGGS 링커 및 FLAG(등록상표) 태그(서열 번호: 29)를 갖는 필리핀원숭이(사이노) C1s, 및 C-말단 GGGGS 링커 및 8x 히스티딘 태그를 갖는 사이노 C1r이다. 사이노 C1r 서열은 R463Q S654A 변이(서열 번호: 30)를 갖는다. 재조합 사이노 C1r2s2 His/FLAG(등록상표) 사량체의 발현을 위해, 사이노 C1s-FLAG(등록상표) 및 사이노 C1r-His를 FreeStyle(등록상표) 293-F 세포주(Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 일시적으로(transiently) 공-발현시켰다. 재조합 사이노 C1r2s2 His/FLAG(등록상표) 사량체를 발현하는 컨디셔닝된 배지를 항-FLAG(등록상표) M2 친화성 수지(Sigma)에 적용하고 FLAG(등록상표) 펩티드(Sigma)로 용출시켰다. 재조합 사이노 C1r2s2 His/FLAG(등록상표) 사량체를 함유하는 분획을 IMAC 컬럼(GE헬스케어)에 적용하고 이미다졸 구배로 용출시켰다. 재조합 C1r2s2 His/FLAG(등록상표) 사량체를 함유하는 용출된 분획을 수집하고 농축한 후 1XTBS, 2mM CaCl2 버퍼로 평형화된 Superdex(등록상표) 200 겔 여과 컬럼(GE헬스케어)에 적용하였다. 그 후 재조합 사이노 C1r2s2 His/FLAG(등록상표)를 포함하는 분획을 풀링하고, 농축하고, -80℃에서 보관하였다.
1.2. 인간 C1r2s2 사량체의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용되는 서열은 인간 C1(NCBI 참조 서열: NP_958850.1)(서열 번호: 31) 및 인간 C1r(NCBI 참조 서열: NP_001724.3)이다. 인간 C1r 서열은 R463Q S654A 변이(서열 번호: 32)를 갖는다. 재조합 인간 C1r2s2 사량체의 발현을 위해, 인간 C1s와 인간 C1r을 HEK293(Expi293(등록상표)) 세포주(Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA) 또는 FreeStyle(등록상표) 293-F 세포주(Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 일시적으로 공-발현시켰다. 재조합 인간 C1r2s2를 발현하는 컨디셔닝된 배지를 MilliQ(등록상표) 물로 1/3까지 희석하고, 1M CaCl2를 최종 2mM로 첨가하고, 1N NaOH로 pH를 8로 조정하고, 50mM Tris-HCl, 2mM CaCl2 pH 8.0으로 평형화된 Q Sepharose HP 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(GE헬스케어)에 적용하고, NaCl 구배로 용출시켰다. 재조합 인간 C1r2s2 사량체를 함유하는 용출된 분획을 수집하고, 농축한 후 1X TBS, 2mM CaCl2 버퍼로 평형화된 Superdex(등록상표) 200 겔 여과 컬럼(GE헬스케어)에 적용하였다. 그 후 재조합 인간 C1r2s2 사량체를 함유하는 분획을 풀링하고, 필요에 따라 농축하고, -80℃에서 보관하였다.
1.3. 사이노 C1r2s2 사량체의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용되는 서열은 필리핀원숭이 C1s(서열 번호: 33) 및 필리핀원숭이 C1r이다. 필리핀원숭이 C1r 서열은 R463Q S654A 변이(서열 번호: 34)를 갖는다. 재조합 사이노 C1r2s2 사량체의 발현을 위해, 필리핀원숭이 C1s 및 필리핀원숭이 C1r을 HEK293(Expi293(등록상표)) 세포주(Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 일시적으로 공-발현시켰다. 재조합 사이노 C1r2s2를 발현하는 컨디셔닝된 배지를 MilliQ(등록상표) 물로 1/3까지 희석하고, 0.1M CaCl2를 최종 2mM로 추가하고, 1N NaOH로 pH를 8로 조정하고, HiTrap(등록상표) Q HP 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(GE헬스케어)에 적용하고, NaCl 구배로 용출시켰다. 재조합 인간 C1r2s2 사량체를 함유하는 용출 분획을 수집하고, 농축한 후 1X TBS, 2mM CaCl2 버퍼로 평형화된 Superdex(등록상표) 200 겔 여과 컬럼(GE헬스케어)에 적용하였다. 그 후 재조합 사이노 C1r2s2 사량체를 함유하는 분획을 풀링하고, -80℃에서 보관하였다.
실시예 2
항-C1s 항체의 제조
2.1. COS0637cc로부터 최적화된 항체의 생성 및 제조
항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해 일부 항-C1 항체 COS0637cc(VH, 서열 번호: 35; VL, 서열 번호: 36, WO2019/198807에 기재됨)의 가변 영역의 인간화를 행하였다. 항-C1s 토끼 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 통상적인 CDR 이식 접근법(Nature 321: 522-525 (1986))을 이용하여 상동 인간 항체 프레임워크(FR)에 이식하였다. 이렇게 하여 인간화 가변 영역, COS0637h를 생성하였다(VH, 서열 번호: 37; VL, 서열 번호: 38).
COS0637cc의 CDR 영역의 아미노산은 히스티딘으로 철저히(comprehensively) 치환시켰다. 효과적인 변이 중 하나인, HCDR3에서의 K101H를 발견하여 COS0637h에 적용하였다. 이렇게 하여 pH-의존성 인간화 항-C1s 항체의 가변 영역, COS0637temp를 생성하였다(VH, 서열 번호: 39; VL, 서열 번호: 38).
다수의 변이 및 변이 조합을 조사하여 리드(lead) 항체의 결합 특성을 개선한 변이 및 변이 조합을 확인하였다. 이어서 COS0637temp의 가변 영역에 중성 pH에서 C1s(인간 C1r2s2 또는 사이노 C1r2s2 또는 사이노 C1r2s2 His/FLAG(등록상표))에 대한 결합 친화성을 향상시키거나 산성 pH에서 C1s에 대한 결합 친화성을 감소시키는 다중 변이를 도입시켰다. 이와 같이 최적화된 변이체, COS0637pHv1 및 COS0637pHv2를 COS0637temp로부터 생성하였다. 두 항체의 VH, VL, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 서열 번호는 표 2에 열기되어 있다.
Figure pct00002
인간화 pH-의존성 항-C1 항체가 생성되었지만, COS0637pHv1 및 COS0637pHv2는 경쇄의 94번 및 95d번 위치(카밧 넘버링)에서 시스테인으로 인해 이종 생성물을 형성할 잠재적 위험이 있었다. 이질성의 위험을 줄이기 위해, COS0637temp의 두 위치에 대한 철저한 단일 아미노산 치환을 수행하여 결합능을 유지하는 아미노산을 찾았다. 38개 항체의 VH 및 VL의 서열 번호와 이들의 변이(카밧 넘버링)는 표 3에 열기되어 있다.
Figure pct00003
그러나, 단일 아미노산 치환을 갖는 어떠한 변이체도 SPR(표면 플라즈몬 공명) 어세이에서 결합 응답을 나타내지 않아, COS0637temp의 각각의 단일 치환의 조합을 행하였다.
18개 항체의 VH 및 VL의 서열 번호와 이들의 변이(카밧 넘버링)는 표 4에 열기되어 있다. 18개 중 3개의 항체(AL0737, AL0743, AL0744)는 약간의 결합 응답을 나타내었다. 메티오닌 및 트립토판 산화의 잠재적 위험을 배제하기 위해 AL0743(C94Y 및 C95dL 치환 포함)을 추가적인 최적화를 위한 템플릿으로 선택하였다.
Figure pct00004
AL0743의 결합 친화성이 약했기 때문에, 결합 특성(pH 7.4에서의 친화성 및 pH 의존성)을 개선하기 위해 AL0743에 다수의 변이 조합을 도입시켰다. 또한 COS0637pHv1 및 COS0637pHv2보다 pI를 낮추기 위해 추가적인 조작을 행하였다. 이렇게 하여, 7개의 조작된 항체가 생성되었다. VH, VL, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 서열 번호는 표 5-1에 열기되어 있다.
[표 5-1]
Figure pct00005
VH를 코딩하는 유전자를 합성하고 인간 IgG1 중쇄 정상 영역(CH)(SG1, 서열 번호: 107), 수식된 인간 IgG1 CH, 예컨대 SG1077R(서열 번호: 108), TT91R(서열 번호: 109) 및 SG1148(서열 번호: 110)과 조합하였다. VL을 코딩하는 유전자를 합성하고 인간 CL(SK1, 서열 번호: 111), 및 수식된 인간 CL(K0MC, 서열 번호: 112)과 조합하였다. 상기 조합된 서열을 발현 벡터로 클로닝하였다.
중쇄 및 경쇄 발현 벡터의 혼합물로 공-세포감염된 HEK293 세포에서 항체를 발현시키고 단백질 A로 정제시켰다. 필요한 경우 겔 여과를 추가로 행하였다. 제조 된 항체는 표 5-2에 열기된 바와 같이 명명하였다. AH0813-SG1을 실시예 5에서 어세이 대조군으로 사용하였다.
[표 5-2]
Figure pct00006
2.1. IPN009VH2VK3-SG1148의 제조
항-C1s 항체, IPN009VH2(서열 번호: 113) 및 IPN009VK3(서열 번호: 114)(WO2019/098212에 기재됨)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 폴리뉴클레오티드를 합성하였다. 중쇄 정상 영역 SG1148(서열 번호: 110) 및 경쇄 정상 영역 SK1(서열 번호: 111)을 각각 함유하는 발현 벡터에 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝하였다.
항-C1s 항체 IPN009VH2VK3-SG1148은 제조업체의 지침에 따라 Expi293(등록상표) F 세포(Life technologies)를 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 재조합 항체를 단백질 A(GE헬스케어)로 정제하고, D-PBS, Tris 완충된 염수(TBS) 또는 His 버퍼(20mM 히스티딘, 150mM NaCl, pH6.0)로 용출시켰다. 필요한 경우 고 분자량 및/또는 저 분자량 성분을 제거하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 추가로 행하였다.
실시예 3
항-C1s 항체의 결합 특성
3.1. COS0637temp의 LCDR3에서 시스테인의 치환을 위한 비아코어(등록상표) 선별
상기와 같이 제조된 항체 변이체와 인간 C1r2s2 사이의 상호작용의 분석을 비아코어(등록상표) T200 기기(GE헬스케어) 또는 비아코어(등록상표) 4000(GE헬스케어)을 사용하여 37℃에서 pH 7.4에서 행하였다. ProL(BioVision)은 GE헬스케어에 의한 권장 설정에 따라 아민 커플링 키트(GE헬스케어)를 사용하여 CM4 센서 칩 상에 고정화시켰다. 항체 및 애널라이트를 각각의 러닝 버퍼, ACES pH7.4(20mM ACES(N-(2-아세트아마이도)-2-아미노에테인설폰산), 150mM NaCl, 1.2mM CaCl2, 1mg/ml 소 혈청 알부민(BSA), 1mg/ml CMD(CM-덱스트란 나트륨염), 0.05% 트윈(등록상표) 20(폴리소베이트 20), 0.005w/v% NaN3)로 희석시켰다. 각 항체를 ProL에 의해 센서 표면 상으로 포획하였다. 항체 포획 수준은 200 공명 단위(RU)를 목표로 하였다. 그 다음, 재조합 인간 C1r2s2를 25 및 100 nM 농도로 주입한 후 pH 7.4에서 해리시켰다. 표면은 10mM 글리신-HCl, pH 1.5를 사용하여 재생시켰다. 100 nM의 항원 농도에서의 모든 항체의 센서그램을 도 1, 2 및 3에 나타낸다. 도 1은 COS0637temp의 경쇄에서 94번 위치(카밧 넘버링)에 단일 아미노산 치환된 변이체의 센서그램을 나타낸다. 도 2는 COS0637temp의 경쇄에서 95d번 위치(카밧 넘버링)에 단일 아미노산 치환된 변이체의 센서그램을 나타낸다. 도 3은 COS0637temp의 경쇄에서 94번 및 95d번 위치(카밧 넘버링)에 이중 아미노산 치환된 변이체의 센서그램을 보여준다. 3개의 항체(AL0737, AL0743, AL0744)에서 약간의 결합 응답이 관찰되었으며, 이는 도 3에서 화살표로 강조 표시되어 있다.
3.2. 비아코어(등록상표) 센서그램을 사용한 pH 7.4 및 pH 5.8에서의 C1r2s2에 대한 결합 활성 평가
pH 7.4 및 pH 5.8 조건과의 비아코어 센서그램 비교
pH 7.4 및 pH 5.8에서의 각 샘플의 결합 특성을 비아코어(등록상표) T200 기기(GE헬스케어)를 사용하여 37℃에서 측정한다. 정제된 마우스 항-인간 Ig 카파 경쇄(GE헬스케어)는 아민 커플링 키트(GE헬스케어)를 사용하여 CM5 센서 칩의 모든 유동 세포 상에 고정화시킬 수 있다. 20mM ACES, 150mM NaCl, 1.2mM CaCl2, 1mg/mL BSA(IgG-무 함유), 1mg/mL CMD, 0.05% 트윈(등록상표) 20, 0.005% NaN3, pH 7.4 또는 pH 5.8 버퍼를 러닝 버퍼로서 사용하였다. 각 항체를 항-인간 Ig 카파 경쇄에 의해 센서 표면 상에 포획할 수 있다. 항체 포획 수준은 50 공명 단위(RU)를 목표로 한다. 예컨대 800 또는 1600 nM(COS0637temp-TT91R에 대해 1600 nM, 다른 것에 대해 800 nM)로 30 마이크로L/분으로 주입될 수 있는 인간 및 사이노 C1r2s2를 제조하였다. 센서 표면을 매 사이클마다 예를 들어 글리신 pH 2.0(GE헬스케어)으로 재생한다. 센서그램(도 4a 내지 4l)은 비아코어(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(GE헬스케어)을 사용하여 수득하였다. 각 센서그램은 다음과 같이 나타낸다: 실선은 pH 7.4에서의 인간 C1r2s2, 일점쇄선은 pH 5.8에서의 인간 C1r2s2, 작은 파선은 pH 7.4에서의 사이노 C1r2s2, 점선은 pH 5.8에서의 사이노 C1r2s2이다. COS637cc-TT91R 및 COS0637h-TT91R은 pH 7.4 및 pH 5.8 조건에서 유사한 결합 응답을 나타냈지만, pH 의존성을 목표로 하는 조작된 변이체는 산성 조건에서 분명히 더 적은 결합을 나타내었다.
3.3. 운동 점수(kinetic scores)를 사용하여 인간 C1r2s2에 대한 pH-의존적 결합 평가
pH 7.4 및 pH 5.8에서의 각 샘플의 KD(해리 상수) 값은 비아코어(등록상표) T200 기기(GE헬스케어)를 사용하여 37℃에서 측정한다. 정제된 마우스 항-인간 Ig 카파 경쇄(GE헬스케어)는 아민 커플링 키트(GE헬스케어)를 사용하여 CM5 센서 칩의 모든 유동 세포 상에 고정화시킬 수 있다. 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-무 함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈(등록상표) 20, 0.005% NaN3, pH 7.4 또는 pH 5.8 버퍼를 러닝 버퍼로서 사용하였다. 각 항체는 항-인간 Ig 카파 경쇄에 의해 센서 표면 상에 포획될 수 있다. 항체 포획 수준은 50 공명 단위(RU)를 목표로 한다. pH 7.4에서의 KD 값을 위해, 0, 25, 40, 100, 200, 400 nM 또는 0, 12.5, 25, 40, 100, 200 nM 또는 0, 6.3, 12.5, 25, 50, 100 nM로 30 마이크로L/분으로 주입할 수 있는 인간 C1r2s2를 제조하였다. pH 5.8에서의 KD 값을 위해, 예를 들어 글리신 pH 2.0(GE헬스케어)과 함께 0, 200, 400, 800, 1600, 3200 nM 또는 0, 50, 100, 200, 400, 800 nM로 30 마이크로L/분으로 주입할 수 있는 인간 C1r2s2를 제조하였다. 센서 표면은 예를 들어 글리신 pH 2.0(GE헬스케어)으로 매 사이클마다 재생한다. KD 값은 비아코어(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(GE헬스케어)을 사용하여 수득하였다. pH 5.8에서의 KD 값을 pH 7.4에서의 KD 값과 비교하였다((pH 5.8에서의 KD)/(pH 7.4에서의 KD))(표 6). 비아코어(등록상표) 소프트웨어의 정도관리 결과가 항체에 대해 "운동 상수를 고유하게 측정할 수 없다"고 언급한 경우 KD 값은 거부되고 표 6에 ND(검출 불가)로 기술된다. 조작된 변이체의 KD(pH5.8)/KD(pH7.4) 점수는 COS637cc-TT91R 및 COS0637h-TT91R보다 높았다. 모든 COS0637 변이체는 COS0637cc-TT91R보다 강한 pH 의존성을 가졌음이 설명된다.
Figure pct00007
3.4. 항-C1s 항체의 C1q 대체 기능 평가
항체의 C1q 대체 기능은 37℃에서 비아코어(등록상표) T200 기기(GE헬스케어)를 사용한 C1r2s2 포획 방법으로 입증하였다. 항-인간 C1r2s2 항체, IPN009VH2Vk3-SG1148은 아민 커플링 키트(GE헬스케어)를 사용하여 CM5 센서 칩 상에 고정화시켰다. 항체, 재조합 인간 C1r2s2 사량체 및 천연 인간 C1q(CompTech)는 pH 7.4 버퍼(20 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA(IgG-무 함유), 1 mg/mL CMD, 0.05% 트윈(등록상표) 20, 0.005% NaN3, pH 7.4) 중에서 제조하였다. 재조합 인간 C1r2s2 사량체는 먼저 항-C1r2s2 항체에 의해 센서 표면 상에 포획되었다. 포획 레벨은 200 RU(공명 단위)를 목표로 하였다. 그 후, 천연 인간 C1q를 약 100 nM로 주입한 후, 즉시 항체를 900초 동안 약 500 nM로 10 마이크로L/분으로 주입하였다. 센서 표면은 3M MgCl2로 매 사이클마다 재생하였다. 결과를 도 5 및 6에 나타낸다. 센서그램은 비아코어(등록상표) T200 평가 소프트웨어, 버전 2.0(GE헬스케어)을 사용하여 수득하였다. 센서그램 1(실선)은 센서 표면 상으로의 C1qrs의 안정된 포획을 나타낸다("C1r2s2+C1q"). 센서그램 2(일점쇄선)는 C1qrs에 대한 항체의 결합 및 C1r2s2로부터의 Clq의 대체를 나타낸다("C1r2s2+C1q+Ab"). 센서그램 3(점선)은 센서 칩 표면 상의 C1r2s2만에 대한 항체의 결합을 나타낸다("C1r2s2+Ab"). 도 5는 모든 센서그램 "C1r2s2+C1q+Ab", "C1r2s2+C1q+버퍼" 및 "C1r2s2+Ab"를 나타낸다. 상기 센서그램의 비교를 위해, C1r2s2의 빙잉 응답을 100 RU로 정규화시켰다. 도 6은 "C1r2s2+C1q+Ab"와 "C1r2s2+C1q+버퍼" 사이의 비교 결과를 나타낸다. 상기 센서그램의 비교를 위해, 기준선(항체 주입 전)을 0 RU로 조정하였다.
C1q 대체 기능을 갖는 항체의 경우, 센서그램 2에서의 응답 유닛은 센서그램 1에서의 응답 유닛보다 낮거나 센서그램 1의 감소 정도보다 더 많이 감소하였다. 그리고 센서그램 3이 감소하지 않을 경우, Ab(항체)는 C1r2s2에 안정적으로 결합할 수 있다고 간주된다. 도 5의 센서그램 3으로부터, 각 Ab는 C1q 없이 C1r2s2에 안정적으로 결합할 수 있는 것으로 간주되었다. 또한 센서그램 1에서 C1q는 Ab 없이 안정적으로 C1r2s2에 결합되었다. 한편, 도 6에서는 모든 Ab의 센서그램 2가 감소되었다. 따라서 모든 조작된 항체는 C1qrs 복합체로부터 C1q를 해리시킬 수 있었다.
실시예 4
항-C1s 항체의 등전점(pI) 추정
4.1. 모세관 등전 포커싱(cIEF)을 사용하여 항-C1s 항체 등전점(pI) 측정
cIEF는 플루오로카본-코팅된 모세관 카트리지를 사용하여 프로테인 심플 iCE3 전체-모세관 이미징 시스템에서 행하였다. 양극액 및 음극액 용액은 각각 0.1% m/v 메틸 셀룰로스(MC) 중의 0.08M 인산 및 0.1% m/v MC 중의 0.1M 수산화 나트륨이었다. 분석된 모든 샘플은 0.5mg/mL 작용 항체, 0.3% m/v MC, 6.0mM IDA(이미노다이아세트산), 10mM 아르기닌, 4M 요소, pI 마커(7.65 및 9.77), 및 2% 파말라이트 8-10.5, 2% 파말라이트 5-8의 v/v 혼합물 중 하나를 함유하였다. 모든 샘플은 오토샘플러 구획에 로딩하기 전에 잠시 와동하고 원심 분리하였다. 측정을 시작하기 전에 샘플을 오토샘플러에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 1.5 kV에서 1분 동안, 이후 3.0 kV에서 7분 동안의 조건에서 포커싱을 행하였다. 오토샘플러 구획은 10℃로 유지되었다. 측정은 각 샘플에 대해 2회 반복했고, 각 샘플의 pI 값은 n=2 측정값의 평균을 계산하여 구하였다. pI 값은 표 7에 기재되어 있다. 이 표에서 COS0637 변이체(COS0637pHv3-TT91R 내지 COS0637pHv9-TT91R)의 pI 값은 COS0637pHv1-TT91R 및 COS0637pHv2-TT91R보다 낮았다.
Figure pct00008
실시예 5
5.1. 항-C1s 항체의 면역원성 잠재성 평가
항체의 면역원성 잠재성은 WO2018/124005(구보 씨. 등)에 기재된 바와 같이 활성 증식이 나타나기 전의 IL-2-분비 CD4+ T 세포의 비율을 지표로 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 인간 PBMC로부터 CD8-CD25low PBMC(말초혈 단핵 세포)를 제조하고, 항체 존재하에 67시간 동안 배양하였다. 도 7은 배양된 세포 집단에서 IL-2-분비 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸다. 도 7에 나타난 바와 같이, COS0637 시리즈 항체에 대한 양성 공여체의 빈도는 항체 A(도 7의 Ab-A)에 비해 비슷하거나 약간 높았지만 항-hA33 항체(hA33)에 비해 낮았다. 따라서 이러한 항체는 높은 면역원성 잠재성을 갖지 않는 것으로 간주하였다. 특히, COS0637pHv3-TT91R, COS0637pHv5-TT91R, COS0637pHv8-TT91R, 및 COS0637pHv9-TT91R은 다른 항-C1s 항체 변이체보다 덜 양성인 공여체를 나타냈고, 이는 상기 변이체가 조작된 항-C1s 항체에서 더 적은 면역원성 잠재성을 가짐을 시사하였다.
5.2 항-C1s 항체에 의해 유발된 면역 세포의 형태학적 변화 평가.
세포의 생리학적 상태를 평가하기 위해 고-함량 형광 이미지 분석을 기반으로 세포 형태의 동적(dynamic) 변화를 평가하였다. 구체적으로, CD8-CD25low PBMC를 제조하고 5.1에 기재된 바와 같은 항체로 처리하였다. 상기 항체와 함께 67시간 동안 배양한 후, PBMC를 고정하고 Hoechst33258 및 항-알파-튜불린 항체로 염색하여 각각 핵 및 미세관(microtubule)을 시각화시켰다. IN Cell Analyzer(등록상표) 6000(GE헬스케어)에 의해 획득된 형광 이미지를 IN Cell Developer Toolbox(GE헬스케어)에서 분석하였다. 간단히 말해서, 세포 형태는 핵과 미세소관의 이미지로 정의하였다. 형상 변화의 정량적 마커(세포 면적 및 세포 둘레)를 각 세포에 대해 계산하고, 각 웰에서 약 1,000개의 세포를 분석하였다. 형태학적 변화의 통계적 유의성은 시험품으로 처리된 PBMC 중에서 세포 면적(도 8a) 및 세포 둘레(도 8b)의 평균값을 기반으로 윌콕슨 순위 합계 시험(*p<0.05, **p<0.01)으로 평가하였다. 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, AH0813-SG1, COS0637pHv1-SG1 및 COS0637pHv2-SG1에서는 음성 대조군(무 항원)과 비교하여 세포 면적과 세포 둘레가 크게 확장되었다. 대조적으로, COS0637pHv1-TT91R 및 COS0637pHv2-TT91R 항체를 함유하는 TT91R 변이체에서는 세포 면적 및 세포 둘레의 증가가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 TT91R 변이체가 PBMC에서 다른 항-C1 항체 변이체보다 형태학적 변화를 유발할 잠재성이 적음을 시사하였다.
또한 5.1에 기재된 형태학적 변화와 면역원성 잠재성 사이의 관계와 관련하여, 형태학적 변화를 유발한 AH0813-SG1, COS0637pHv1-SG1 및 COS0637pHv2-SG1은 높은 면역원성 잠재성을 유의하게 나타냈고(도 8c), 반면에 형태학적 변화를 유발하지 않은 TT91R 변이체는 낮은 면역원성 잠재성을 나타내었다. 또한, 높은 수준의 면역원성으로 인해 임상 시험이 중단된 항-PCSK9 항체인 보코시주마브(bococizumab)는 높은 면역원성 잠재성과 유의한 형태학적 변화를 나타내었다(데이터는 미도시). 항-C1s 항체 변이체 및 보코시주마브의 결과를 종합하면, 면역원성 잠재성의 수준은 형태학적 변화의 정도와 일치함이 시사되었다. 형태학적 변화에 대한 평가는 면역원성 잠재성을 평가하고 면역원성 메커니즘을 이해하는 데 효과적인 것으로 생각된다. 세포 형태의 정의와 형태학적 변화의 정량화는 면역 세포의 형태학적 변화를 정확히 평가하는 데 필수적이었다. 세포 형태를 정의하기 위해, 세포 미세관을 액틴 세포골격과 같은 다른 분자로 대체할 수 있었다. 또한, 형태학적 변화를 정량화하기 위해 형태(form) 인자 및 장/단축의 길이와 같은 다른 정량적 마커를 적용할 수 있었으며, 이는 면역원성 잠재성 평가를 위해 형태학적 변화를 평가하는 몇 가지 대체 방법이 있음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> AN ANTIBODY, A PHARMACEUTICAL COMPOSITION, AND A METHOD <130> C1-A1923P <150> JP 2019-189148 <151> 2019-10-16 <160> 115 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> COS0637pH_HVR-H1 <400> 1 Ala Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> COS0637pH_HVR-H2 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Leu Ile Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> COS0637pH_HVR-H3 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any 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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Glu Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 111 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 112 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Cys 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 113 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Phe Thr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 114 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Arg Leu Pro 85 90 95 Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 115 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Gly Ser Gly His Thr Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Ser 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Arg Ser Val Asn Tyr Val Ser Gly Phe His Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (14)

  1. 항원-결합 영역 및 항체 정상 영역을 포함하는 단리된 항체로서,
    상기 항체는 C1qrs 복합체로부터의 C1q의 해리를 촉진하고/하거나 C1q의 C1r2s2에 대한 결합을 억제하고, 여기에서,
    인간 및/또는 필리핀원숭이 C1s에 대한 항체의 결합 활성을 표면 플라즈몬 공명으로 측정하는 경우,
    i) 중성 pH 범위에서의 해리 상수(KD) 값은 신뢰성 있게 계산할 수 있고, 산성 pH 범위에서의 KD 값은 결합 활성의 부재 또는 상당히 낮은 결합 활성으로 인해 신뢰성 있게 계산할 수 없거나, 또는
    ii) 중성 pH 범위와 산성 pH 범위에서의 KD 값을 모두 신뢰성 있게 계산할 수 있을 경우, 산성 pH 범위에서의 KD 값 대 중성 pH 범위에서의 KD 값의 비, 산성 KD/중성 KD 비는 10보다 큰,
    항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    표면 플라즈몬 공명에 의한 결합 활성은, 각 항체가 인간 Ig 카파 경쇄에 의해 50 공명 단위로 그 위에 포획된 센서 칩, 및 20 mM ACES(N-(2-아세트아마이도)-2-아미노에테인설폰산), 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 1 mg/mL CM-덱스트란 나트륨염(CMD), 0.05% 폴리소베이트 20, 0.005% NaN3을 포함하는 러닝 버퍼를 사용하여 37℃에서 측정되는, 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항체의 pI가 9.00 미만, 8.90 미만, 8.80 미만 또는 8.78 이하, 4.28 이상인, 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 영역이 인간 C1s의 CUB1-EGF-CUB2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는, 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 영역이 AYAMN(서열 번호: 1)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(서열 번호: 2)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 GRSX7NYX8SX9FHL(서열 번호: 3)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 QAX10X11X12LHDKX13NLA(서열 번호: 4)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, X14ASX15X16ES(서열 번호: 5)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(서열 번호: 6)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기에서 각각의 X1 내지 X23은 천연 발생 아미노산으로부터 선택되는, 항체.
  6. 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 항체 정상 영역을 포함하는 단리된 항-C1s 항체로서, 상기 중쇄 가변 영역은 AYAMN(서열 번호: 1)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(서열 번호: 2)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 GRSX7NYX8SX9FHL(서열 번호: 3)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 QAX10X11X12LHDKX13NLA(서열 번호: 4)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, X14ASX15X16ES(서열 번호: 5)로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(서열 번호: 6)으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하고, 여기에서 각각의 X1 내지 X23은 천연 발생 아미노산으로부터 선택되는, 항체.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    X1은 Lys 또는 Ser이고,
    X2는 Gly 또는 Lys이고,
    X3은 His 또는 Ser이고,
    X4는 Glu 또는 Thr이고,
    X5는 Glu 또는 Lys이고,
    X6은 Glu 또는 Gly이고,
    X7은 Lys 또는 Val이고,
    X8은 Asn 또는 Val이고,
    X9는 Asp 또는 Gly이고,
    X10은 Asn, Gln 또는 Ser이고,
    X11은 Gly 또는 Gln이고,
    X12는 Ile 또는 Ser이고,
    X13은 Lys 또는 Arg이고,
    X14는 Gly 또는 Gln이고,
    X15는 Gln 또는 Thr이고,
    X16은 Leu 또는 Arg이고,
    X17은 His 또는 Gln이고,
    X18은 Pro 또는 Ser이고,
    X19는 Cys 또는 Tyr이고,
    X20은 Glu 또는 Ser이고,
    X21은 Glu 또는 Ser이고,
    X22는 Cys 또는 Leu이고,
    X23은 Gln 또는 Thr인, 항체.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    HVR-H1은 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2는 서열 번호: 8 내지 10으로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-H3은 서열 번호: 11 내지 13으로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L1은 서열 번호: 14 내지 18로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L2는 서열 번호: 19 내지 22로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L3은 서열 번호: 23 내지 28로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, 항체.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 아미노산 서열의 조합은 이하의 1) 내지 8)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체:
    1) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 8로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 14로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    2) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 9로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 12로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 14로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    3) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    4) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    5) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 17로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 26으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    6) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    7) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
    8) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
  10. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    X19 및/또는 X22가 Cys가 아닌, 항체.
  11. 제 10 항에 있어서,
    X19는 Trp 또는 Tyr이고, X22는 Leu 또는 Met인, 항체.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    X1은 Ser이고,
    X2는 Gly이고,
    X3은 His이고,
    X4는 Glu이고,
    X5는 Glu이고,
    X6은 Glu이고,
    X7은 Lys이고,
    X8은 Asn 또는 Val이고,
    X9는 Asp 또는 Gly이고,
    X10은 Asn, Gln 또는 Ser이고,
    X11은 Gly 또는 Gln이고,
    X12는 Ile이고,
    X13은 Lys 또는 Arg이고,
    X14는 Gly 또는 Gln이고,
    X15는 Gln 또는 Thr이고,
    X16은 Leu 또는 Arg이고,
    X17은 His이고,
    X18은 Pro 또는 Ser이고,
    X19는 Tyr이고,
    X20은 Glu 또는 Ser이고,
    X21은 Glu 또는 Ser이고,
    X22는 Leu이고,
    X23은 Gln 또는 Thr인, 항체.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    HVR-H1은 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2는 서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H3은 서열 번호: 11 또는 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L1은 서열 번호: 15 내지 18로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L2는 서열 번호: 19 내지 22로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, HVR-L3은 서열 번호: 24 내지 28로 이루어진 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, 항체.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 아미노산 서열의 조합은 이하의 3) 내지 9)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체:
    3) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    4) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 24로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    5) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 16으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 25로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    6) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 13으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 17로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 26으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    7) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 15로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 20으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    8) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 19로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 27로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
    9) 서열 번호: 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열 번호: 10으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열 번호: 11로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열 번호: 18로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열 번호: 22로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열 번호: 28로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
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