CN114829604A - 抗体、药物组合物和方法 - Google Patents

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目次正一
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Abstract

本发明涉及诸如抗Cls抗体的抗体、包含其的药物组合物以及使用其的方法。本发明提供抗体，所述抗体包含抗原结合区和抗体恒定区，具有取代功能和/或阻断功能并以pH依赖性方式与Cls结合，所述取代功能使得抗体结合Clqrs复合体并促进Clq从Clqrs复合体的解离，所述阻断功能使得抗体结合Clr2s2并抑制Clq与Clr2s2的结合。本发明还提供了包含任何一种抗体的药物组合物，以及治疗患有补体介导的疾病或病症的个体，或预防可能患有补体介导的疾病或病症的个体的方法，包括向个体施用任何一种抗体。

Description

抗体、药物组合物和方法
技术领域
本发明涉及抗体例如抗Cls抗体及其使用方法。
背景技术
C1复合体是一种大型蛋白质复合体，其功能为经典途径级联反应的关键引发剂。C1复合体由三种成分Clq、Clr和Cls组成，它们的摩尔比分别为1∶2∶2(NPL 1)。当C1复合体与抗体结合的靶标结合时，就会启动经典途径。Clq具有6个球状头部，通过与Fc区的亲合力相互作用介导C1复合体与抗体的结合。一旦与靶标紧密结合，C1复合体中的Clr就会自动活化并变得具有酶活性。活化的Clr然后切割并激活C1复合体中的酶原Cls(NPL 2)。随后，活性Cls将其底物补体成分C2和C4分别切割成C2a/C2b和C4a/C4b片段。这导致C4b2a(一种C3转化酶)在靶标表面上的组装，其切割C3以形成C3b。C3b反过来切割C5以启动末端膜攻击复合体C5b、C6、C7、C8和C9的形成，其通过孔形成裂解靶标。
Cls和Clr蛋白都具有相同的结构域组织，即CUB1-EGF-CUB2-CCP1-CCP2-丝氨酸蛋白酶(NPL 3)。CUB1-EGF-CUB2结构域介导Clr和Cls之间的相互作用以形成Clr2s2四聚体(NPL 4)，以及介导Clr2s2和Clq之间的相互作用(NPL 5)。相反，Clr和Cls的CCP1-CCP2-丝氨酸蛋白酶结构域负责其各自底物的蛋白水解切割(NPL 6、NPL 7)。Clr2s2四聚体通过四聚体的CUB1-EGF-CUB2结构域内的六个结合位点与Clq中的六个茎相互作用(NPL 5)。
虽然功能正常的补体系统保护宿主免受病原体的侵害，但经典途径的失调或不适当激活会导致各种补体介导的病症，例如但不限于自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、白塞氏病、大疱性天疱疮(BP)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)等。因此，抑制经典途径的过度或不受控制的激活可为患有此类病症的患者提供临床益处。
据报道，HI532是一种与Cls的β结构域结合的抗体，能够抑制Clr2s2与Clq的相互作用(NPL 8)。然而，这种抗体不能完全中和人血清的溶血活性，即使在血清与抗体温育24小时后，仍有30％的活性。
抗体是极具吸引力的药物，因为它们在血浆中稳定，对其靶标具有高度特异性，并且通常表现出良好的药代动力学特征。然而，由于它们的分子大小很大，治疗性抗体的剂量通常很高。在靶标大量存在的情况下，所需的抗体治疗剂量甚至更高。因此，改善抗体药代动力学、药效学和抗原结合特性的方法是减少与治疗性抗体相关的剂量和高生产成本的有吸引力的方法。
已经报道了以pH依赖性方式与抗原结合的抗体(以下也被称为“pH依赖性抗体”或“pH依赖性结合抗体”)使得单个抗体分子能够中和多个抗原分子(NPL 9、PTL 1)。pH依赖性抗体在血浆中的中性pH条件下与其抗原强烈结合，但在细胞内体中的酸性pH条件下与抗原解离。一旦与抗原解离，抗体就会通过FcRn受体循环回血浆，而解离的抗原在细胞的溶酶体内降解。然后再循环的抗体可以自由地再次结合并中和抗原分子，只要抗体仍在循环中，这个过程就会继续重复。
引用列表
专利文献
[PTL 1]WO2009/125825
非专利文献
[NPL 1]Wang et.al.Mol Cell.2016 Jul 7；63(1)：135-45
[NPL2]Mortensen et.al.Proc Natl Acad Sci U S A.2017 Jan 31；114(5)：986-991
[NPL 3]Gal et.al.Mol Immunol.2009 Sep；46(14)：2745-52
[NPL4]Almitairi et.al.Proc Natl Acad Sci U S A.2018 Jan 23；115(4)：768-773
[NPL 5]Bally et.al.J Biol Chem.2009Jul 17；284(29)：19340-8
[NPL 6]Rossi et.al.1998 J Biol Chem.1998 Jan 9；273(2)：1232-9
[NPL 7]Lacroix et.al.J Biol Chem.2001 Sep 28；276(39)：36233-40
[NPL 8]Tseng et.al.Mol Immunol.1997 Jun；34(8-9)：671-9
[NPL 9]Igawa et.al.Nat Biotechnol.2010 Nov；28(11)：1203-7
发明内容
技术问题
本发明提供了抗补体成分抗体，例如抗Cls抗体，包含它们的药物组合物，以及使用它们的方法。
问题的解决方案
本发明提供了分离的抗体，其包含抗原结合区和抗体恒定区，具有置换功能和/或阻断功能并以pH依赖性方式与Cls结合，所述置换功能使得抗体结合Clqrs复合体并促进Clq从lqrs复合体的解离，所述阻断功能使得抗体结合Clr2s2并抑制Clq与Clr2s2的结合。
具体而言，本发明涉及以下内容：
[1]分离的抗体，其包含抗原结合区和抗体恒定区，其中
所述抗体促进Clq从Clqrs复合体的解离和/或抑制Clq与Clr2s2的结合，其中，
在通过表面等离子共振测量抗体与人和/或食蟹猴Cls的结合活性的情况下，
i)中性pH范围内的解离常数(KD)值可以可靠地计算，而酸性pH范围内的KD值由于没有结合活性或结合活性相当低而不能可靠地计算，或
ii)在中性pH范围和酸性pH范围内的KD值都可以能够可靠地计算的前提下，酸性pH范围内的KD值与中性pH范围内的KD值的比值，即酸性KD/中性KD比大于10。
[2][1]所述的抗体，其中结合活性通过表面等离子共振使用传感器芯片和运行缓冲液在37摄氏度下测量，每个抗体在50共振单位被人Igκ轻链捕获到所述传感器芯片上，所述运行缓冲液包含20mM ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、150mM NaCl、1.2mMCaCl2、1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、1mg/mL CM-葡聚糖钠盐(CMD)、0.05％聚山梨醇酯20、0.005％NaN3。
[3][1]或[2]所述的抗体，其中抗体的pI为小于9.00、小于8.90、小于8.80或8.78或更小、以及4.28或更大。
[4][3]所述的抗体，其中通过毛细管等电聚焦测量pI，其中在0.1％m/v甲基纤维素(MC)中含有0.08M磷酸的溶液用作阳极液溶液，在0.1％m/v MC中含有0.1M氢氧化钠的溶液用作阴极液溶液，含有0.5mg/mL抗体、0.3％m/v MC、6.0mM亚氨基二乙酸(IDA)、10mM精氨酸、4M尿素和pI标记物(7.65和9.77)的溶液用作裂解抗体的工作溶液。
[5][1]至[4]中任一项所述的抗体，其中，所述抗原结合区能够特异性结合人Cls的CUB1-EGF-CUB2结构域。
[6][1]至[5]中任一项所述的抗体，其中所述抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，所述HVR-H1包含由AYAMN(SEQ IDNo.1)组成的氨基酸序列，所述HVR-H2包含由LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(SEQ ID No.2)组成的氨基酸序列，所述HVR-H3包含由GRSX7NYX8SX9FHL(SEQ ID No.3)组成的氨基酸序列，所述轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，所述HVR-L1包含由QAX10X11X12LHDKX13NLA(SEQ IDNo.4)组成的氨基酸序列，所述HVR-L2包含由X14ASX15X16ES(SEQ ID No.5)组成的氨基酸序列，所述HVR-L3包含由X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(SEQ ID No.6)组成的氨基酸序列，其中X1至X23中的每一个选自天然存在的氨基酸。
[7]分离的抗Cls抗体，其包含重链可变区、轻链可变区和抗体恒定区，其中所述重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，所述HVR-H1包含由AYAMN(SEQ ID No.1)组成的氨基酸序列，所述HVR-H2包含由LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(SEQ ID No.2)组成的氨基酸序列，所述HVR-H3包含由GRSX7NYX8SX9FHL(SEQ ID No.3)组成的氨基酸序列，所述轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，所述HVR-L1包含由QAX10X11X12LHDKX13NLA(SEQ ID No.4)组成的氨基酸序列，所述HVR-L2包含由X14ASX15X16ES(SEQ ID No.5)组成的氨基酸序列，所述HVR-L3包含由X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(SEQ ID No.6)组成的氨基酸序列，其中X1至X23中的每一个选自天然存在的氨基酸。
[8][6]或[7]所述的抗体，其中
X1是Lys或Ser，
X2是Gly或Lys，
X3是His或Ser，
X4是Glu或Thr，
X5是Glu或Lys，
X6是Glu或Gly，
X7是Lys或Val，
X8是Asn或Val，
X9是Asp或Gly，
X10是Asn、Gln或Ser，
X11是Gly或Gln，
X12是Ile或Ser，
X13是Lys或Arg，
X14是Gly或Gln，
X15是Gln或Thr，
X16是Leu或Arg，
X17是His或Gln，
X18是Pro或Ser，
X19是Cys或Tyr，
X20是Glu或Ser，
X21是Glu或Ser，
X22是Cys或Leu，和
X23是Gln或Thr。
[9][6]至[8]中任一项所述的抗体，其中HVR-H1包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，HVR-H2包含由SEQ ID No.8至10组成的氨基酸序列中任一项，HVR-H3包含由SEQ IDNo.11至13组成的氨基酸序列中任一项，HVR-L1包含由SEQ ID No.14至18组成的氨基酸序列中任一项，HVR-L2包含由SEQ ID No.19至22组成的氨基酸序列中任一项，并且HVR-L3包含由SEQ ID No.23至28组成的氨基酸序列中任一项。
[10][6]至[9]中任一项所述的抗体，其中HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的氨基酸序列的组合，选自由以下1)至9)组成的组；
1)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.8组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.14组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.23组成的氨基酸序列；
2)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.9组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.12组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.14组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.23组成的氨基酸序列；
3)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID N.o15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
4)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
5)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.16组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.21组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.25组成的氨基酸序列；
6)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.17组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.26组成的氨基酸序列；
7)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列；
8)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列，和
9)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.22组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.28组成的氨基酸序列。
[11][6]或[7]所述的抗体，其中X19和/或X22不是Cys。
[12][11]所述的抗体，其中X19是Trp或Tyr，并且X22是Leu或Met。
[13][11]或[12]所述的抗体，其中
X1是Ser，
X2是Gly，
X3是His，
X4是Glu，
X5是Glu，
X6是Glu，
X7是Lys，
X8是Asn或Val，
X9是Asp或Gly，
X10是Asn、Gln或Ser，
X11是Gly或Gln，
X12是Ile，
X13是Lys或Arg，
X14是Gly或Gln，
X15是Gln或Thr，
X16是Leu或Arg，
X17是His，
X18是Pro或Ser，
X19是Tyr，
X20是Glu或Ser，
X21是Glu或Ser，
X22是Leu，和
X23是Gln或Thr。
[14][11]至[13]中任一项所述的抗体，其中HVR-H1包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，HVR-H2包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，HVR-H3包含由SEQ ID No.11或13组成的氨基酸序列，HVR-L1包含由SEQ ID No.15至18组成的氨基酸序列中任一项，HVR-L2包含由SEQ ID No.19至22组成的氨基酸序列中任一项，并且HVR-L3包含由SEQ ID No.24至28组成的氨基酸序列中任一项。
[15][11]至[14]中任一项所述的抗体，其中HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的氨基酸序列的组合，选自由以下3)至9)组成的组；
3)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
4)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
5)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.16组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.21组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.25组成的氨基酸序列；
6)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.17组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.26组成的氨基酸序列；
7)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列；
8)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列，和
9)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.22组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.28组成的氨基酸序列。
[16][1]至[15]中任一项所述的抗体，其中所述抗体恒定区是包括重链和轻链的人抗体的恒定区。
[17][16]所述的抗体，其中人抗体是人IgG1。
[18][16]或[17]所述的抗体，其中重链中的恒定区包含至少一个氨基酸，与没有所述至少一个氨基酸的人抗体的恒定区相比，所述至少一个氨基酸降低与Clq的结合能力。
[19][18]所述的抗体，其中降低与Clq结合能力的氨基酸是EU编号系统中第238位的Asp。
[20][16]至[19]中任一项所述的抗体，其中重链中的恒定区包含至少一个氨基酸，与没有所述至少一个氨基酸的人抗体的恒定区相比，所述至少一个氨基酸选择性地结合FcγRIIb。
[21][20]所述的抗体，其中重链中恒定区与人FcγRIIa的KD值与重链中恒定区与人FcγRIIb的KD值之比(KD(hFcβRIIa/KD(hFcγRIIb))高于[20]中没有所述至少一个氨基酸的人抗体恒定区。
[22][20]或[21]所述的抗体，其中重链中的恒定区包含EU编号系统中第234位的Tyr、EU编号系统中第238位的Asp、EU编号系统中第264位的Ile，和EU编号系统中第330位的Lys。
[23][20]至[22]中任一项所述的抗体，其中重链中的恒定区包含选自由EU编号系统中第214位的Arg、EU编号系统中的第250位的Val，EU编号系统中第307位的Pro、EU编号系统中第311位的Arg、EU编号系统中第343位的Arg、EU编号系统中第428位的Leu、EU编号系统中第434位的Ala、EU编号系统中第436位的Thr、EU编号系统中第438位的Arg、EU编号系统中第440位的Glu组成的组中的至少一种。
[24][16]至[23]中任一项所述的抗体，其中，恒定区的EU编号系统的第446位和第447位的氨基酸缺失。
[25][16]至[24]中任一项所述的抗体，其中，抗原结合区是人源化抗体可变区。
[26]药物组合物，其包含[1]至[25]中任一项所述的抗体和至少一种药学上可接受的载体。
[27][26]所述的药物组合物，其用于治疗患有补体介导的疾病或病症的个体，或预防可能患有补体介导的疾病或病症的个体。
[28]治疗患有补体介导的疾病或病症的个体或预防可能患有补体介导的疾病或病症的个体的方法，包括向个体施用有效量的[1]至[25]中任一项所述的抗体。
附图说明
[图1]
图1说明了抗Cls抗体与人Clr2s2蛋白的结合能力。示出了针对100nM的重组人Clr2s2蛋白的抗Cls抗体的BIACORE(注册商标)传感图。抗体变体是通过在COS0637temp轻链中第94位(kabat编号)的单个氨基酸置换产生的。COS0637temp数据也作为对照示出。
[图2]
图2说明了抗Cls抗体与人Clr2s2蛋白的结合能力。示出了针对100nM重组人Clr2s2蛋白的抗Cls抗体的BIACORE(注册商标)传感图。抗体变体是通过在COS0637temp轻链中第95d位(kabat编号)的单个氨基酸置换产生的。COS0637temp数据也作为对照示出。
[图3]
图3说明了抗Cls抗体与人Clr2s2蛋白的结合能力。示出了针对100nM的重组人Clr2s2蛋白的抗Cls抗体的BIACORE(注册商标)传感图。抗体变体是通过在COS0637temp轻链中第94位和第95d位(kabat编号)的双氨基酸置换产生的。COS0637temp数据也作为对照示出。显示出轻微的结合反应的变体用箭头突出显示。
[图4-1]
图4-1说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637cc-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-2]
图4-2说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637h-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-3]
图4-3说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637temp-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-4]
图4-4说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHvl-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-5]
图4-5说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHv2-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-6]
图4-6说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHv3-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-7]
图4-7说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHv4-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-8]
图4-8说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHv5-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-9]
图4-9说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHv6-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-10]
图4-10说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHv7-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-11]
图4-11说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHv8-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图4-12]
图4-12说明了BIACORE(注册商标)传感图，显示了COS0637pHv9-TT91R与人Clr2s2和食蟹猴Clr2s2的相互作用，以评估针对食蟹猴和人Clr2s2的pH依赖性和交叉反应性，如实施例3.2中所述。通过分别在固定有抗Cls抗体的传感器表面上注射人Clr2s2(实线[pH7.4]、点划线[pH5.8])、食蟹猴Clr2s2(短划线[pH7.4]、虚线[pH5.8])获得传感图。在pH7.4形成的抗体/抗原复合体允许在pH7.4解离，在pH5.8形成的抗体/抗原复合体允许在pH5.8解离。
[图5-1]
图5-1说明了抗体介导的天然人Clq从固定在BIACORE(注册商标)传感器表面上的重组人Clr2s2四聚体的解离。COS0637cc-SG1148对天然人Clq的取代通过覆盖3张传感图来描述。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代。传感图3(虚线)描述了在没有任何Clq的情况下只有抗体与Clr2s2结合时的基线。为了比较这些传感图，将Clr2s2的结合(binging)反应归一化为100RU。
[图5-2]
图5-2说明了抗体介导的天然人Clq从固定在BIACORE(注册商标)传感器表面上的重组人Clr2s2四聚体的解离。COS0637pHv3-TT91R对天然人Clq的取代通过覆盖3张传感图来描述。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代。传感图3(虚线)描述了在没有任何Clq的情况下只有抗体与Clr2s2结合时的基线。为了比较这些传感图，将Clr2s2的结合(binging)反应归一化为100RU。
[图5-3]
图5-3说明了抗体介导的天然人Clq从固定在BIACORE(注册商标)传感器表面上的重组人Clr2s2四聚体的解离。COS0637pHv8-TT91R对天然人Clq的取代通过覆盖3张传感图来描述。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代。传感图3(虚线)描述了在没有任何Clq的情况下只有抗体与Clr2s2结合时的基线。为了比较这些传感图，将Clr2s2的结合(binging)反应归一化为100RU。
[图5-4]
图5-4说明了抗体介导的天然人Clq从固定在BIACORE(注册商标)传感器表面上的重组人Clr2s2四聚体的解离。COS0637pHv9-TT91R对天然人Clq的取代通过覆盖3张传感图来描述。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代。传感图3(虚线)描述了在没有任何Clq的情况下只有抗体与Clr2s2合时的基线。为了比较这些传感图，将Clr2s2的结合(binging)反应归一化为100RU。
[图6-1]
图6-1说明了抗体介导的天然人Clq从固定在BIACORE(注册商标)传感器表面上的重组人Clr2s2四聚体的解离。COS0637cc-SG1148对天然人Clq的取代通过覆盖2张传感图来描述。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代。为了比较这些传感图，将基线(注射抗体之前)调整为0RU。
[图6-2]
图6-2说明了抗体介导的天然人Clq从固定在BIACORE(注册商标)传感器表面上的重组人Clr2s2四聚体的解离。COS0637pHv3-TT91R对天然人Clq的取代通过覆盖2张传感图来描述。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代。为了比较这些传感图，将基线(注射抗体之前)调整为0RU。
[图6-3]
图6-3说明了抗体介导的天然人Clq从固定在BIACORE(注册商标)传感器表面上的重组人Clr2s2四聚体的解离。COS0637pHv8-TT91R对天然人Clq的取代通过覆盖2张传感图来描述。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代。为了比较这些传感图，将基线(注射抗体之前)调整为0RU。
[图6-4]
图6-4说明了抗体介导的天然人Clq从固定在BIACORE(注册商标)传感器表面上的重组人Clr2s2四聚体的解离。COS0637pHv9-TT91R对天然人Clq的取代通过覆盖2张传感图来描述。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代。为了比较这些传感图，将基线(注射抗体之前)调整为0RU。
[图7]
图7示出了确定培养的细胞群中分泌IL-2的细胞的比例的结果。每个标记示出了测试供体的结果。
[图8-1]
图8-1说明了细胞面积平均值的结果。通过Wilcoxon秩和检验评估统计显著性(*p＜0.05，**p＜0.01)。每个标记示出了测试样品的结果。
[图8-2]
图8-2说明了细胞周长平均值的结果。通过Wilcoxon秩和检验评估统计显著性(*p＜0.05，**p＜0.01)。每个标记示出了测试样品的结果。
[图8-3]
图8-3说明了确定培养的细胞群中分泌IL-2的细胞的比例的结果。每个标记示出了测试样品的结果。
实施方式的说明
本文描述或引用的技术和程序通常被本领域技术人员充分理解并且通常使用常规方法学来使用，如，例如，以下中所述的广泛使用的方法：Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual第三版(2001)Cold Spring HarborLaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等编，(2003))；the series Methods in Enzymology(AcademicPress，Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))，Harlow和Lane编(1988)Antibodies，A Laboratory Manual和AnimalCellCulture(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编，1993-8)J.Wiley和Sons；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编，1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.编，IRLPress，1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编，Oxford University Press，2000)；Using Antibodies：ALaboratory Manual(E.Harlow和D.Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers，1995)；以及Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编，J.B.LippincottCompany，1993)。
I.定义
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology第2版，J.Wiley&Sons(纽约，N.Y.1994)和March，Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms and Structure第4版，John Wiley&Sons(纽约，N.Y.1992)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体纳入。
出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制。如果下文列出的任何定义与通过引用纳入本文的任何文件相冲突，则应以下文列出的定义为准。
用于本文目的的“受体人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下所定义的。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以包含氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd或KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所述的那些。下面描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。“亲和力”、“结合亲和力”、“结合能力”和“结合活性”可以互换使用。术语“结合活性”是指分子(例如抗体)的单个或多个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。在此，结合活性不严格限于反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1∶1相互作用的活性。当结合对的成员可以以单价和多价结合的方式相互结合时，结合活性是这些结合总和的强度。分子X与其伴侣Y的结合活性通常可以用解离常数(KD)表示。或者，结合率和解离率(Kon和Koff)可用于评估结合。结合活性可以通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所描述的那些。下面描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有这种改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一种或多种改变的抗体，这种改变导致抗体对抗原的亲和力提高。
术语“抗Cls抗体”和“结合Cls的抗体”是指能够以足够的亲和力结合Cls使得该抗体可用作靶向Cls的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗Cls抗体与无关的非Cls蛋白的结合程度小于抗体与Cls结合的约10％，如通过例如放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合Cls的抗体的解离常数(Kd)为1微摩尔(microM)或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小，或0.001nM或更小(例如10-8M或更小，例如从10-8M到10-13M，例如从10-9M到10-13M)。在某些实施方案中，抗Cls抗体结合在来自不同物种的Cls中保守的Cls表位。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原-结合活性。
“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的一部分，与完整抗体结合的抗原结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原结合达50％或更多的抗体，反之，在竞争测定中，参考抗体阻断抗体与其抗原结合的50％或更多。本文提供了示例性竞争测定。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。主要有五类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
试剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。
术语“表位”包括能够被抗体结合的任何决定簇。表位是由靶向该抗原的抗体结合的抗原区域，并且包括直接接触抗体的特定氨基酸。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面集簇，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原特异的抗体将优先识别蛋白质和/或大分子复杂混合物中靶抗原上的表位。
术语“Fc区”在本文中用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(残基446-447)可能存在也可能不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所描述的。
“框架”或“FR”是指高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。相应地，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般按以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化的细胞和由其衍生的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可能包含突变。在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变后代包括在本文中。
“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的或源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIHPublication 91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是上述Kabat等人中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是上述Kabat等人中的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体包含基本上所有的至少一个且通常为两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如，非人抗体的“人源化形式”是指经过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的抗体可变结构域的每个区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，Naional Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等编号，见上文。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子缀合的抗体，所述一种或多种异源分子包括但不限于细胞毒性剂。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物例如猴子)、兔子和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经从其自然环境的组分中分离出来的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至纯度超过95％或99％，例如通过电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在细胞中的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
“分离的编码抗Cls抗体的核酸”或“分离的编码抗Clr抗体的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这种核酸分子以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这种核酸分子。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，组成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中出现，此类变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N末端到C末端，每条重链都有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，然后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链都有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，然后是恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链可以根据其恒定结构域的氨基酸序列被分配到两种类型中的一种，称为κ和λ。
术语“包装插页”用于指通常包含在治疗产品商业包装中的说明，其中包含有关使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症和/或警告的信息。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在对序列进行比对并且在必要时引入空位(gap)以实现最大百分比序列同一性，而不将任何保守置换认为是序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)软件，或GENETYX(注册商标)(Genetyx Co.，Ltd.)。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，源代码已与用户文档一起提交给华盛顿特区美国版权局，20559，在美国版权注册号为TXU510087。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南圣弗朗西斯科的Genentech，Inc.公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，不会发生变化。在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、和或针对给定氨基酸序列B(可以任选地表述为给定氨基酸A与、和或针对给定氨基酸序列B具有或包括特定％氨基酸序列同一性)的％氨基酸序列同一性计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是序列在该程序的A和B比对中由比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解，氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另有特别说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值都是如上一段所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物制剂”是指这样一种制剂，其形式允许包含在其中的活性成分的生物活性是有效的，并且不包含对将要施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，短语“特异性结合”是指抗体以包括背景(即非特异性)结合但不包括显著的(即特异性的)结合的结合水平结合非目的抗原的活性或特征。换言之，“特异性结合”是指抗体以一定的结合水平与目的抗原结合的活性或特征，该结合水平包括除了背景之外或代替背景(即，非特异性)结合的显著的(即特异性的)结合。可以通过本说明书中提及的或本领域已知的任何方法测量特异性。上述非特异性或背景结合的水平可以为零，或者可以不为零但接近于零，或者可以足够低以至于被本领域技术人员在技术上忽略。例如，当技术人员在合适的结合测定中不能检测或观察到抗体与非目的抗原之间结合的任何显著(或相对强)信号时，可以说抗体“不特异性结合”非目的抗原。相反，当技术人员可以在合适的结合测定中检测或观察到抗体与目的抗原之间结合的任何显著(或相对强)信号时，可以说抗体“特异性结合”目的抗原。
除非另有说明，本文使用的术语“Cls”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然Cls，包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”未加工的Cls以及在细胞中加工产生的任何形式的Cls。该术语还包括天然存在的Cls变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人Cls的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中示出。示例性食蟹猴和大鼠Cls的氨基酸序列分别在SEQ ID No：3和2中示出。
除非另有说明，本文使用的术语“Clr”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然Clr，包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”未加工的Clr以及由细胞中加工产生的任何形式的Clr。该术语还包括天然存在的Clr变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人Clr的氨基酸序列在SEQ ID NO：4中示出。示例性食蟹猴和大鼠Clr的氨基酸序列在SEQ ID No：5和6中示出。
如本文所用，“治疗(treatment″)”(及其语法变体，例如“治疗(treat″)”或“治疗(treating)”)是指临床干预以试图改变被治疗个体的自然过程，并且可以用于预防或在临床病理学过程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如Kindt等，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分别筛选互补VL或VH结构域的文库，从而分离结合特定抗原的抗体。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合到其已被引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.抗体
一方面，本发明部分地基于包含抗原结合区和抗体恒定区的抗体。在某些实施方案中，提供了与Cls结合的抗体。在某些实施方案中，提供了与Cls特异性结合的抗体。本发明的抗体可用于例如诊断或治疗补体介导的疾病或病症。
在一个实施方案中，Cls的种类可以选自一个或多个物种。在特定实施方案中，物种是人和非人动物。在特定实施方案中，物种是人、大鼠和猴子(例如食蟹猴、恒河猴、狨猴、黑猩猩和狒狒)。在特定实施方案中，物种是人和猴子(例如食蟹猴、恒河猴、狨猴、黑猩猩和狒狒)。在特定实施方案中，物种是人和食蟹猴。
在实施方案中，抗体包括各种类型的抗体，包括抗体片段、嵌合和人源化抗体、人抗体、文库衍生的抗体和多特异性抗体。在实施方案中，抗体可以是全长抗体，例如完整的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或本文定义的其他抗体类别或同种型。
(抗体片段)
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv和scFv片段，以及下文描述的其他片段。有关某些抗体片段的综述，请参见Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。有关scFv片段的综述，参见例如Pluckthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，纽约)，第269-315页(1994年)；另见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)中也描述了三链抗体(triabody)和四体(tetrabody)。
单域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516 B1)。
如本文所述，抗体片段可通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
(嵌合和人源化抗体)
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体在例如美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))中进行了描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物，例如猴的可变区)和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类中改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR，(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基来源的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
例如，在Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中回顾了人源化抗体及其制备方法，并进一步描述于，例如，Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36：25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall′Acqua等，Methods 36：43-60(2005)(描述“FR重排”)；和Osboum等，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述FR重排的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等J.Immunol.151：2296(1993))；源自特定轻链或重链可变区亚组的人抗体共有序列的框架区(参见，例如，Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta等J.Immunol.，151：2623(1993)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和来自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
(人抗体)
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体。van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中大体描述了人抗体。
人抗体可以通过向转基因动物施用免疫原来制备，该转基因动物已被修饰以产生完整的人抗体或具有响应抗原激发的人可变区的完整抗体。此类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合到动物染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。有关从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，请参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。另见，例如描述XENOMOUSE(注册商标)技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述HUMAB(注册商标)技术的美国专利号5,770,429；描述K-M MOUSE(注册商标)技术的美国专利号7,041,870和描述VELOCIMOUSE(注册商标)技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。可以进一步修饰来自此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异质骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boemer et al.，J.Immunol.，147：86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein，Histology andHistopathology，20(3)：927-937(2005)和Vollmers和Brandlein，Methods and Findingsin Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)中。
人抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。下面描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。
(文库衍生的抗体)
本发明的抗体可以通过筛选具有所需活性的抗体的组合文库来分离。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有所需结合特性的抗体。例如，在Hoogenboom等在Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien等，编辑HumanPress，Totowa，NJ，2001)中回顾了这些方法，并进一步描述于，例如，McCafferty等，Nature348：552-554；Clackson等，Nature 352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，在Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo编辑Human Press，Totowa，NJ，2003)中；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库并在噬菌体文库中随机重组，然后可以筛选抗原结合噬菌体，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段的形式展示抗体片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。或者，如Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)中所描述的，可以克隆(例如，从人类)幼稚(naive)库以提供针对广泛的非自身和自身抗原的抗体的单一来源，无需任何免疫。最后，也可以通过从干细胞中克隆未重排的V基因片段并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域并在体外完成重排来合成制备幼稚文库，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0290236和2009/0002360。
从人抗体文库中分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
(多特异性抗体)
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对Cls的，而另一种是针对任何其他抗原的。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合Cls的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达Cls的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker et al.，EMBO J.10：3655(1991))和“杵臼(knob-in-hole)”工程(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过设计用于制造抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应来制造(WO 2009/089004A1)；交联两个或多个抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；和制备三特异性抗体，例如在Tutt等J.Immunol.147：60(1991)中所描述的。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双作用Fab”或“DAF”，其包含与Cls以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(参见，例如，US 2008/0069820)。
A.分离的抗体
在某些实施方案中，抗体是分离的抗体。在实施方案中，分离的抗体包含抗原结合区和抗体恒定区。
在实施方案中，分离的抗体可以具有取代功能，使得抗体特异性结合Cls并促进Clq从Clqrs复合体的解离。在实施方案中，分离的抗体可以具有阻断功能，使得抗体特异性结合Cls，抑制Clq与Clr2s2的结合。分离的抗体可以具有取代功能和阻断功能中的一种或两种。抗体优选地具有这两种功能。
在一个实施方案中，分离的抗体以pH依赖性方式特异性结合Cls。作为实施方案的具体实例，在通过表面等离子共振测定抗体与人和/或食蟹猴Cls的结合活性的情况下，
i)中性pH范围内的解离常数(KD)值可以可靠地计算，而酸性pH范围内的KD值由于没有结合活性或结合活性相当低而不能可靠地计算，或
ii)在中性pH范围和酸性pH范围内的KD值都可以能够可靠地计算的前提下，酸性pH范围内的KD值与中性pH范围内的KD值的比值，即酸性KD/中性KD比大于10。
这样的抗体作为药物有望特别优越，因为可以减少患者的施用剂量和频率，从而可以减少总剂量。与结合并从血浆中去除Clqrs复合体的抗体相比，抗Cls抗体预计具有更高的安全性谱，因为它们只会从血浆中去除Clr2s2(通过与Cls的结合)而不是从血浆中去除Clq。因此，可以避免与Clq消耗相关的副作用。此外，具有快速取代Clq的抗体有望更快地中和补体活性，这可以转化为治疗效果起效更快。
(a1)BIACORE(注册商标)/取代构思
在一个实施方案中，抑制Clq和Clr2s2复合体之间相互作用的分离的抗体是在用于表面等离子共振测定的芯片上与Clqrs复合体结合的抗体，例如BIACORE(注册商标)芯片并促进Clq与Clqrs复合体的解离。在一些实施方案中，上述与Clqrs复合体结合并促进Clq从Clqrs复合体解离的功能在本文中称为“取代功能/活性”或“Clq取代功能/活性”。可以使用表面等离子共振测定法，例如本文所述的BIACORE(注册商标)测定法，对功能/活性进行适当的定性或定量评估。在进一步的实施方案中，当抗体存在时的反应单位(RU)值低于不存在抗体时的反应单位(RU)值时，该抗体可以被确定为具有取代功能的抗体，如当经过足够的时间时，通过表面等离子共振测定，例如BIACORE(注册商标)测定确定的。在从这种测定获得的传感图中，可以识别“交叉时间点”，其中存在Clq与不存在抗体时的曲线与存在Clq和抗体时的曲线交叉(参见实施例以获得详情)。严格地说，即使在单个传感图中，由于在交叉前一条曲线时后一条曲线的噪声或振荡，也可能观察到多个交叉时间点。在这种情况下，可以选择多个交叉的时间点中的任何一个作为“交叉的时间点”。“经过足够的时间”是指响应单位(RU)值的测量时间点在“交叉的时间点”之后足够用于测量目的。在一些实施方案中，响应单位(RU)值的测量时间点为抗体注射开始时间点后至少60s、100s、150s、200s、500s、700s、1000s、1500s或2000s。或者，测量的时间点可以是交叉的时间点之后的至少100s、200s、300s、400s、500s、600s、700s、800s、900s、1000s、3000s、5000s、7000s或10000s。
在一个实施方案中，当交叉的时间点(例如，在BIACORE(注册商标)测定中)在开始抗体注射的时间点之后的60s、100s、150s、200s、500s、700s、1000s、1500s或2000s时，抑制Clq和Clr2s2复合体之间相互作用的分离的抗体可以被确定为具有取代功能的抗体，如通过例如BIACORE(注册商标)测定使用以下条件确定：Clr2s2复合体和Clq的捕获水平分别为200个共振单位(RU)和200个共振单位(RU)，作为分析物的抗体以500nM，10微升(μL)/min注射。
在一个实施方案中，当几乎所有(或所有)Clq在开始抗体注射的时间点之后的100s、300s、500s、700s、1000s、1500s、2000s、3000s、5000s、7000s或10000s内从Clqrs复合体解离时，抑制Clq和Clr2s2复合体之间相互作用的分离的抗体可以被确定为具有取代功能的抗体，如通过例如BIACORE(注册商标)测定使用以下条件确定：Clr2s2复合体和Clq的捕获水平分别为200个共振单位(RU)和200个共振单位(RU)，作为分析物的抗体以500nM，10微升/分钟注射。例如，在从这种测定获得的传感图中，当存在Clq和抗体时的值(RU)接近或达到在存在抗体没有Clq时达到该值(RU)时，可以确定“几乎所有(或所有)Clq都从Clqrs复合体解离”。在本文中，“几乎所有(Clq)”是指70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的百分比；而“所有(Clq)”是指100％的百分比。解离的Clq的百分比可以通过本文所述的任何测定来定量确定。在一些实施方案中，本发明提供了使用上述测量这种抗体的“取代功能/活性”的方法筛选从Clr2s2复合体中取代Clq的抗体的方法。在一个实施方案中，筛选方法包括选择抑制Clq和Clr2s2复合体之间相互作用的抗体；即，选择与Clqrs复合体结合并促进Clq从Clqrs复合体解离的抗体。具有取代功能/活性的抗体可以使用表面等离子共振测定法适当地选择，例如，如本文所述的BIACORE(注册商标)测定法。在一些实施方案中，筛选方法包括通过表面等离子共振测定，例如BIACORE(注册商标)测定确定当经过足够的时间时，(i)在抗体存在下的响应单位(RU)的值和(ii)在不存在抗体时响应单位(RU)的值。筛选方法可以包括比较以上(i)的值和以上(ii)的值。筛选方法可以包括当上述(i)的值低于上述(ii)的值时选择抗体。筛选方法可以包括鉴定“交叉的时间点”，其中存在Clq与不存在抗体时的曲线与存在Clq和抗体时的曲线交叉。如上所述，即使在单个传感图中也可以观察到多个交叉的时间点，并且可以选择多个交叉的时间点中的任何一个作为“交叉的时间点”。在一些实施方案中，筛选方法可以包括在抗体注射开始的时间点之后至少60s、100s、150s、200s、500s、700s、1000s、1500s或2000s测量响应单位(RU)的值。或者，筛选方法可包括在交叉的时间点之后至少100s、200s、300s、400s、500s、600s、700s、800s、900s、1000s、3000s、5000s、7000s或10000s测量响应单位(RU)的值。在一些实施方案中，筛选方法可以包括当抗体的交叉的时间点在抗体注射开始时间点后的60s、100s、150s、200s、500s700s、1000s、1500s或2000s内时，选择抑制Clq和Clr2s2复合体之间相互作用的抗体或具有取代功能的抗体，如通过例如BIACORE(注册商标)测定法使用以下条件确定的：Clr2s2复合体和Clq的捕获水平分别为200个共振单位(RU)和200个共振单位(RU)，抗体作为分析物以500nM，10微升(μL)/min注射。在一些实施方案中，筛选方法可以包括当几乎所有(或所有)Clq在开始抗体注射的时间点之后的100s、300s、500s、700s、1000s、1500s、2000s、3000s、5000s、7000s或10000s内从Clqrs复合体解离时，选择抑制Clq和Clr2s2复合体之间相互作用的抗体或具有取代功能的抗体，如通过例如BIACORE(注册商标)测定使用以下条件确定的：Clr2s2复合体和Clq的捕获水平分别为200个共振单位(RU)和200个共振单位(RU)，抗体作为分析物以500nM，10微升/分钟注射。如上所述，“几乎所有(Clq)”是指70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的百分比，并且“所有(Clq)”是指100％，并且解离的Clq的百分比可以通过本文所述的任何测定法定量测定，包括BIACORE(注册商标)测定法。
(a2)BIACORE(注册商标)/阻断构思
在一个实施方案中，本发明提供了抑制Clq和Clr2s2复合体之间相互作用的分离的抗体，其中该抗体具有阻断功能，使得该抗体结合Clr2s2并抑制Clq与Clr2s2的结合。在进一步的实施方案中，抗体具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的阻断率。阻断功能/活性或阻断率可以通过使用BIACORE(注册商标)测定来确定。以下条件可用于评估Clq阻断水平：Clr2s2的捕获水平针对50、100、200、400个共振单位(RU)。以250、500、1000、2000nM注射抗体变体以使抗体结合饱和，然后以50、100、200nM注射人Clq，有或无抗体变体250、500、1000、2000nM。阻断率由以下公式计算：[1-(存在抗体变体时的人Clq结合反应/不存在抗体变体时的人Clq结合反应)]x 100％。
(a3)pH依赖性
在一个实施方案中，分离的抗体以pH依赖性方式特异性结合Cls。在优选的实施方案中，抗体与Cls的结合活性在酸性pH范围内(例如在pH5.8)低于在中性pH范围内(例如在pH 7.4)的。
在实施方案中，在酸性pH范围内，抗体与Cls的结合相当低，因此，当通过表面等离子共振测量结合活性并通过数据计算解离常数(KD)值时，酸性pH范围内的KD值具有较低的可靠性或在酸性pH范围内无法检测到与Cls的结合活性；即，在通过表面等离子共振测定抗体与人和/或食蟹猴Cls的结合活性的情况下，
i)中性pH范围内的KD值可以可靠地计算，而酸性pH范围内的KD值由于没有结合活性或结合活性相当低而不能可靠地计算，或
ii)在中性pH范围和酸性pH范围内的KD值都可以能够可靠地计算的前提下，酸性pH范围内的KD值与中性pH范围内的KD值的比值，即酸性KD/中性KD比大于10。
在实施方案中，酸性KD/中性KD的比值ii)优选地为14或更多、44或更多、45或更多、72或更多、99或更多、100或更多、117或更多、209或更多、278或更多。在实施方案中，酸性KD/中性KD的比值ii)更优选地为44或更多、45或更多、72或更多、99或更多、100或更多、117或更多、209或更多、278或更多。
情况中的“可靠地”一词如下所述。使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GEHealthcare)在37℃测定每个样品在pH 7.4和pH 5.8下的KD值。可以使用胺偶联试剂盒(GEHealthcare)将纯化的小鼠抗人Ig κ轻链(GE Healthcare)固定在CM5传感器芯片的所有流通池上。包含20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2、1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)(不含IgG)、1mg/mL CMD(CM-葡聚糖钠盐)、0.05％吐温(注册商标)20和0.005％NaN3(pH 7.4或pH 5.8)的缓冲液用作运行缓冲液。每种抗体都可以通过抗人Ig κ轻链被捕获到传感器表面。抗体捕获水平被调整为50个共振单位(RU)。对于pH7.4的KD值，制备人Clr2s2复合体，使得蛋白质复合体可以在0、25、40、100、200、400nM、0、12.5、25、40、100、200nM或0、6.3、12.5、25、50、100nM，以30微升/分钟注射。对于pH5.8的KD值，制备人或食蟹猴Clr2s2复合体，使得蛋白质复合体可以在0、200、400、800、1600、3200nM或0、50、100、200、400、800nM，以30微升/分钟注射，例如使用甘氨酸pH 2.0(GE Healthcare)。每个循环使用例如甘氨酸pH 2.0(GEHealthcare)再生传感器表面。KD值是使用BIACORE(注册商标)T200评估软件2.0版(GEHealthcare)获得的。将pH5.8的KD值与pH7.4的KD值(酸性KD/中性KD比值)进行比较。如果BIACORE(注册商标)软件的质量控制结果中提到抗体的“动力学常数不能唯一地确定”，我们认为不能可靠地计算抗体的KD值。
在该情况的一个实施方案中，通过表面等离子共振测量的结合活性在37℃下使用传感器芯片和运行缓冲液进行，在传感器芯片上，通过人Ig κ轻链以50个共振单位捕获每种抗体，运行缓冲液包含20mM ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、150mM NaCl、1.2mMCaCl2、1mg/mL羊血清白蛋白(BSA)、1mg/mL CM-葡聚糖钠盐(CMD)、0.05％聚山梨醇酯20、0.005％NaN3。
在实施方案中，抗体不包含由于没有结合活性或结合活性相当低而不能可靠地计算其在中性pH范围内的KD值的抗体。
除了以pH依赖性方式与Cls结合外，钙对Cls的pH依赖性抗体亲和力的影响可能是另一个重要特性。Cls在高钙浓度下形成二聚体，但在低钙浓度下解离成单体。当Cls处于二聚状态时，二价抗体能够通过交联多个Cls分子形成免疫复合物。这允许抗体通过亲和力和亲合力相互作用两者与复合体中的Cls分子结合，从而增加抗体的表观亲和力。相反，当Cls处于单体状态时，抗体仅通过亲和力相互作用与Cls结合。这意味着pH依赖性Cls抗体可以与血浆中的二聚Cls形成免疫复合物，但一旦进入酸性内体，Cls就会解离成单体。这导致免疫复合物的分解，其然后增强抗体与抗原的pH依赖性解离。
一方面，在分离的抗Cls抗体中，在中性和酸性pH值下在高钙浓度下测量时，其在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下的Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性)pH))大于10。一方面，在分离的抗Cls抗体中，在中性pH高钙浓度和酸性pH低钙浓度下测量时，其在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下的Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性)pH))大于10。在一些实施方案中，在分离的抗Cls抗体中，在中性和酸性pH值在低钙浓度下测量时，其在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下的Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性)pH))大于10，其中抗Cls抗体与Cls的二聚体状态结合。
不受特定理论的束缚，如果1)与抗体结合的Cls的表位结构可以通过不存在钙而在构象上改变，从而改变抗体的亲和力或2)抗体的相互作用(亲和力或亲合力)可根据Cls的条件(单体状态或二聚状态)而变化，使用特定条件(在中性pH高钙浓度和酸性pH低钙浓度)的测量可用于评估KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))。
换言之，抗体在中性pH下以比在酸性pH下以更高的亲和力与Cls结合，如下文(i)或(ii)所述：
(i)当在中性和酸性pH值高钙浓度下测量时，酸性pH值的Cls结合活性的KD值与中性pH值的Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))大于10，
(ii)当在中性pH高钙浓度和酸性pH低钙浓度测量时，酸性pH下Cls结合活性的KD值与中性pH下Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))大于10。
更一般地，不受特定理论的束缚，如果1)与抗体结合的某种抗原的表位结构可以通过不存在钙而在构象上改变，从而改变抗体的亲和力或2)抗体的相互作用(亲和力或亲合力)可能因抗原条件(单体状态或二聚体状态)而改变，使用特定条件(在中性pH值高钙浓度和酸性pH低钙浓度)的测量可用于评估KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))。
因此，抗体在中性pH下以比在酸性pH下更高的亲和力与抗原结合，如下所示：当在中性pH值高钙浓度和酸性pH值低钙浓度下测量时，酸性pH下的抗原结合活性与中性pH下的抗原结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))大于10。
上述KD比值，即KD(酸性pH)/KD(中性pH)可以在亲本抗体(即本发明修饰前的原始抗体)和相对于原始(亲本)抗体其中已被引入一个或多个氨基酸突变(例如，添加、插入、缺失或置换)的抗体之间进行比较。原始(亲本)抗体可以是任何已知或新分离的抗体，只要它与Cls特异性结合即可。因此，一方面，在分离的抗Cls抗体中，在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))比原始(亲本)抗体的在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下的Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))高至少1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、8倍、10倍。换言之，本发明提供了分离的抗Cls抗体，其中分离的抗Cls抗体已经从亲本(原始)抗体引入了一个或多个氨基酸突变(例如，添加、插入、缺失或置换)，且以下(i)与(ii)的比值为至少1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.5、3、3.5、4、5、8或10：(i)分离的抗Cls抗体在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下的Cls结合活性的KD值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))的比值；(ii)亲本(原始)抗体的在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下的Cls结合活性的KD值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))的比值。这些KD比值可以在任何(高或低)钙浓度下测量，例如在中性和酸性pH在高钙浓度下测量，或在中性pH在高钙浓度下和在酸性pH在低钙浓度下测量。
一方面，抗体具有在细胞内条件和细胞外条件之间不同的抗原结合活性。细胞内和细胞外条件是指细胞内外条件不同。条件的种类包括例如离子浓度，更具体地，金属离子浓度、氢离子浓度(pH)和钙离子浓度。“细胞内条件”优选地是指内体内部环境的环境特征，而“细胞外条件”优选地是指血浆中环境的环境特征。具有根据离子浓度而变化的抗原结合活性的性质的抗体可以通过针对具有这种性质的结构域筛选大量抗体来获得。例如，具有上述特性的抗体可以通过杂交瘤法或抗体文库法产生大量序列互不相同的抗体，并在不同离子浓度下测定它们的抗原结合活性来获得。B细胞克隆方法是筛选此类抗体的方法的实例之一。此外，如下所述，指定至少一种独特的氨基酸残基，该氨基酸残基可以赋予抗体具有根据离子浓度而变化的抗原结合活性的特性，以制备具有不同的序列的大量抗体的文库，同时具有独特氨基酸残基作为共同结构。可以筛选这样的文库以有效地分离具有上述特性的抗体。
在一个方面，本发明提供了抗体，该抗体在中性pH下以比在酸性pH下更高的亲和力结合Cls。在另一个方面，本发明提供了表现出与Cls的pH依赖性结合的抗Cls抗体。如本文所用，表述“pH依赖性结合”是指“与中性pH相比，酸性pH下的结合减少”，两种表述可以互换。例如，“具有pH依赖性结合特性”的抗Cls抗体包括在中性pH下比在酸性pH下以更高亲和力结合Cls的抗体。
在某些实施方案中，当在中性和酸性pH值均在高钙浓度测量时，在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下的Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))大于10。在特定实施方案中，抗体以在中性pH下比在酸性pH下的亲和力高至少11、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍结合Cls。
在某些实施方案中，当在中性pH高钙浓度和酸性pH低钙浓度测量时，在酸性pH下的Cls结合活性的KD值与在中性pH下的Cls结合活性的KD值的比值(KD(酸性pH)/KD(中性pH))大于10。在特定实施方案中，抗体以在中性pH下比在酸性pH下的亲和力高至少11、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍结合Cls。
在上述情况下，例如酸性pH为5.8，中性pH为7.4，因此KD(酸性pH)/KD(中性pH)为KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)。在这点上，酸性pH和中性pH的实例将在后面详细描述。在一些实施方案中，KD(酸性pH)/KD(中性pH)例如KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)可以是11至10,000。
当抗原是可溶性蛋白质时，抗体与抗原的结合会导致抗原在血浆中的半衰期延长(即，抗原从血浆中的清除率降低)，因为抗体在血浆中可以具有比抗原本身更长的半衰期，并作为抗原的载体。这是由于FcRn通过细胞内的内体途径循环利用抗原-抗体复合物(Roopenian和Akilesh(2007)Nat Rev Immunol 7(9)：715-725)。然而，具有pH依赖性结合特性的抗体，它在中性细胞外环境中与其抗原结合，而在其进入细胞后将抗原释放到酸性内体区室中，预期相对于其以不依赖pH的方式结合的对应物在抗原中和和清除方面具有优越的特性(Igawa等人(2010)Nature Biotechnol 28(11)；1203-1207；Devanaboyina等人(2013)mAbs 5(6)：851-859；国际专利申请公开号WO 2009/125825)。
在一个方面，本发明提供了一种抗体，其在高钙浓度条件下比在低钙浓度条件下以更高的亲和力结合Cls。
在一个实施方案中，优选的金属离子包括例如钙离子。钙离子参与调节许多生物现象，包括肌肉例如骨骼肌、平滑肌和心肌的收缩；白细胞的运动、吞噬作用等的激活；血小板的形状变化、分泌等的激活；淋巴细胞的活化；肥大细胞的活化，包括组胺的分泌；由儿茶酚胺α受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答；胞吐作用；从神经元末梢释放递质物质；和神经元中的轴浆流。已知的细胞内钙离子受体包括肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白和肌球蛋白轻链，它们具有几个钙离子结合位点，并且被认为在分子进化方面源自共同的起源。还有许多已知的钙结合基序。此类众所周知的基序包括例如钙粘蛋白结构域、钙调蛋白的EF-手部、蛋白激酶C的C2结构域、凝血蛋白因子IX的Gla结构域、酰基糖蛋白受体和甘露糖结合受体的C型凝集素、LDL受体的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
在一个实施方案中，当金属离子为钙离子时，希望抗原结合活性在低钙离子浓度条件下低于在高钙离子浓度条件下。同时，细胞内钙离子浓度低于细胞外钙离子浓度。相反，细胞外钙离子浓度高于细胞内钙离子浓度。在一个实施方案中，低钙离子浓度优选地为0.1微摩尔(μM)至30微摩尔，更优选地0.5微摩尔至10微摩尔，特别优选地1微摩尔至5微摩尔，接近在体内的早期内体中的钙离子浓度。同时，在一个实施方案中，高钙离子浓度优选地为100μM至10μM，更优选地200μM至5mM，特别优选地0.5mM至2.5mM，接近血浆(在血液)中钙离子浓度。在一个实施方案中，优选低钙离子浓度为内体中的钙离子浓度，高钙离子浓度为血浆中的钙离子浓度。当比较低钙离子浓度和高钙离子浓度之间的抗原结合活性水平时，优选在高钙离子浓度下抗体的结合比在低钙离子浓度下更强。换言之，优选抗体的抗原结合活性在低钙离子浓度下低于在高钙离子浓度下。当结合活性的水平用解离常数(KD)表示时，KD(低钙离子浓度)/KD(高钙离子浓度)的值大于1，优选地2或更多，更优选地10或更多，更优选地40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多。KD(低钙离子浓度)/KD(高钙离子浓度)的值的上限没有特别限制，只要是技术人员用技术可以制造的，可以是任意值例如100、400、1000、10000。可以使用解离速率常数(kd)代替KD。当难以计算KD值时，当分析物以相同浓度通过时可以根据BIACORE(注册商标)中的结合反应水平来评估活性。当抗原通过固定有抗原结合分子的芯片时，低钙浓度下的结合反应优选地为高钙浓度下的结合反应的1/2或更小，更优选地1/3或更小，还更优选地1/5或更小，特别优选地1/10或更小。已知通常体内细胞外钙离子浓度(例如血浆中)高，而细胞内钙离子浓度(例如内体中)低。因此，在一个实施方案中，优选细胞外条件是高钙离子浓度，而细胞内条件是低钙离子浓度。将细胞内钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于细胞外钙离子浓度条件下的抗原结合活性赋予抗原结合分子(例如抗体)的情况下，与细胞外的本发明的抗原结合分子结合的抗原从细胞内的抗原结合分子解离，从而增强抗原从细胞外掺入细胞内。当施用于生物体时，此类抗体可降低血浆中的抗原浓度并降低体内抗原的生理活性。因此，抗体是有用的。筛选在低钙离子浓度条件下比在高钙离子浓度条件下抗原结合活性低的抗原结合区或抗体的方法包括，例如，WO2012/073992(例如，第0200-0213段)中描述的方法。赋予抗原结合区在低钙离子浓度条件下比在高钙离子浓度条件下与抗原结合更弱的特性的方法没有特别限制，可以通过任何方法进行。具体而言，在日本专利申请号2011-218006中记载了方法，并包括例如将抗原结合区的至少1个氨基酸残基置换为具有金属螯合活性的氨基酸残基和/或将至少一个具有金属螯合活性的氨基酸残基插入抗原结合区的方法。其中抗原结合区的至少一个氨基酸残基已被具有金属螯合活性的氨基酸残基置换和/或至少一个具有金属螯合活性的氨基酸残基已插入抗原结合区的抗原结合分子是抗原结合分子的优选实施方案。
具有金属螯合活性的氨基酸残基优选地包括例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。此外，根据钙离子浓度改变抗原结合区的抗原结合活性的氨基酸残基优选地包括例如形成钙结合基序的氨基酸残基。钙结合基序为本领域技术人员所熟知，并已详细描述(例如，Springer等人，(Cell(2000)102，275-277)；Kawasaki和Kretsinger(Protein Prof.(1995))2，305-490)；Moncrief等人，(J.Mol.Evol.(1990)30，522-562)；Chauvaux等人，(Biochem.J.(1990)265，261-265)；Bairoch和Cox(FEBSLett.(1990)269，454-456)；Davis(New Biol.(1990)2，410-419)；Schaefer等人，(Genomics(1995)25，638-643)；Economou等人，(EMBO J.(1990)9，349-354)；Wurzburg等人，(Structure.(2006)14，6，1049-1058))。肌钙蛋白C中的EF手部、钙调蛋白、小白蛋白和肌球蛋白轻链；蛋白激酶C中的C2结构域；凝血蛋白因子IX中的Gla结构域；酰基糖蛋白受体和甘露糖结合受体的C型凝集素、ASGPR、CD23和DC-SIGN；低密度脂蛋白受体中的A结构域；膜联蛋白结构域；钙粘蛋白结构域；血小板反应蛋白3型结构域；和EGF样结构域优选地用作钙结合基序。
抗原结合区可以包含根据钙离子浓度改变抗原结合活性的氨基酸残基，例如上述具有金属螯合活性的氨基酸残基和形成钙结合基序的氨基酸残基。这些氨基酸残基在抗原结合区中的位置没有特别限定，只要抗原结合活性根据钙离子浓度而变化，则它们可以位于任意位置。同时，只要抗原结合活性根据钙离子浓度而变化，这些氨基酸残基可以单独包含或包含两个或更多个的组合。氨基酸残基优选地包括例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。当抗原结合区是抗体可变区时，氨基酸残基可以包含在重链可变区和/或轻链可变区中。在优选的实施方案中，氨基酸残基可以包含在重链可变区的CDR3中，更优选地在重链可变区CDR3中根据Kabat编号的第95、96、100a和/或101位。
在另一个优选的实施方案中，氨基酸残基可以包含在轻链可变区的CDR1中，更优选地在轻链可变区CDR1中根据Kabat编号的第30、31和/或32位。在还另一个优选的实施方案中，氨基酸残基可以包含在轻链可变区的CDR2中，更优选地在轻链可变区CDR2中根据Kabat编号的第50位。在还另一个优选的实施方案中，氨基酸残基可以包含在轻链可变区的CDR3中，更优选地在轻链可变区CDR3中根据Kabat编号的第92位。
此外，可以组合上述实施方案。例如，氨基酸残基可以包含在选自轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的两个或三个CDR中，更优选在轻链可变区中根据Kabat编号的第30、31、32、50和/或92位中的任何一个或多个位置。
大量具有不同序列且共享上述氨基酸残基(其根据钙离子浓度改变抗原结合活性)作为共同结构的抗原结合区被制备为文库。可以筛选文库以有效地获得对所需抗原具有结合活性的抗原结合区，其中它们的抗原结合活性根据钙离子浓度而变化。
为了本公开的目的，抗体对Cls的“亲和力”以抗体的KD表示。抗体的KD是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。抗体与其抗原结合的KD值越大，其对该特定抗原的结合亲和力越弱。因此，如本文所用，表述“在中性pH下比在酸性pH下更高的亲和力”(或等效表述“pH依赖性结合”)是指抗体在酸性pH下的KD大于抗体在中性pH的KD。例如，在本发明的上下文中，如果在酸性pH下抗体与Cls结合的KD与中性pH下抗体与Cls结合的KD相比超过10倍，则认为抗体在中性pH下以比在酸性pH更高的亲和力结合Cls。因此，本发明包括在酸性pH下结合Cls的抗体，其KD比在中性pH下与c1结合的抗体的KD大至少11、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍。在另一个实施方案中，抗体在中性pH下的KD值可以是10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更小。在另一个实施方案中，抗体在酸性pH下的KD值可以是10-9M、10-8M、10-7M、10-6M或更大。
抗体对特定抗原的结合特性也可以用抗体的kd表示。抗体的kd是指抗体相对于特定抗原的解离速率常数，以倒数秒(即sec-1)表示。kd值的增加表明抗体与其抗原的结合较弱。因此，本发明包括与Cls结合的抗体，其在酸性pH下比在中性pH下具有更高的kd值。本发明包括在酸性pH下结合Cls的kd比在中性pH下结合Cls的kd大至少11、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍的抗体。在另一个实施方案中，抗体在中性pH下的kd值可以是10-2l/s、10-3l/s、10-4l/s、10-5l/s、10-6l/s、或更少。在另一个实施方案中，抗体在酸性pH下的kd值可以是10-3l/s、10-2l/s、10-1l/s或更大。
在某些情况下，“与在中性pH下相比，在酸性pH下的结合减少”表示为抗体在酸性pH下的KD值与抗体在中性pH下的KD值的比值(或反之亦然)。例如，为了本发明的目的，如果抗体表现出10或更大的酸性/中性KD比值，则抗体可被视为“与其在中性pH下的结合相比，在酸性pH下与Cls的结合减少”。在某些示例性实施方案中，抗体的酸性/中性KD比值可以是11、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一个实施方案中，抗体在中性pH下的KD值可以是10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更小。在另一个实施方案中，抗体在酸性pH下的KD值可以是10-9M、10-8M、10-7M、10-6M或更大。
在某些情况下，“与在中性pH下相比，在酸性pH下的结合减少”表示为抗体在酸性pH下的Kd值与抗体在中性pH下的Kd值的比值(或反之亦然)。例如，为了目的，如果抗体表现出2或更大的酸性/中性kd比值，则抗体可被视为“与其在中性pH下的结合相比，在酸性pH下与Cls的结合减少”。在某些示例性实施方案中，抗体的酸性/中性Kd比值可以是11、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一个实施方案中，抗体在中性pH下的kd值可以是10-2l/s、10-3l/s、10-4l/s、10-5l/s、10- 6l/s、或更少。在另一个实施方案中，抗体在酸性pH下的kd值可以是10-3l/s、10-2l/s、10-1l/s或更大。
如本文所用，表述“酸性pH”是指4.0至6.5的pH。表述“酸性pH”包括pH值4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4和6.5。在特定方面，“酸性pH”为5.8。
如本文所用，表述“中性pH”是指6.7至约10.0的pH。表述“中性pH”包括pH值6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9和10.0。在特定方面，“中性pH”为7.4。
如本文所用，表述“在高钙浓度条件下”或“在高钙浓度下”是指100μM至10mM，更优选地200μM至5mM，特别优选地0.5mM至2.5mM，其接近于血浆中(血液中)的钙离子浓度。表述“在高钙浓度条件下”或“在高钙浓度下”包括钙浓度值100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、0.5mM、0.7mM、0.9mM、1mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM、2.2mM、2.4mM、2.5mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM和10mM Ca2+。在特定方面，“在高钙浓度条件下”或“在高钙浓度下”是指1.2mM Ca2+。
如本文所用，表述“在低钙浓度条件下”或“在低钙浓度下”是指0.1μM至30μM，更优地选0.5μM至10μM，特别优选地1μM至5μM，其接近体内早期内体中的钙离子浓度。表述“在低钙浓度条件下”或“在低钙浓度下”包括钙浓度值0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3.0μM、3.1μM、3.2μM、3.3μM、3.4μM、3.5μM、4.0μM、5.0μM、6.0μM、7.0μM、8.0μM、9.0μM、10μM、15μM、20μM、25μM和30μM Ca2+。在特定方面，“在低钙浓度条件下”或“在低钙浓度下”是指3.0μM Ca2+。
如本文所表达的KD值和kd值可以使用基于表面等离子共振的生物传感器来确定以表征抗体-抗原相互作用。(参见例如本文的实施例3)。KD值和kd值可在25摄氏度(C)或37摄氏度下测定。该测定可在150mM NaCl存在下进行。在一些实施方案中，该测定可以通过使用表面等离子共振技术进行，其中抗体被固定，抗原作为分析物，并且使用以下条件：10mMMES缓冲液、0.05％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯和150mM NaCl，37摄氏度(C)。
一方面，本发明提供了提高个体血浆中Cls清除率的方法。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的抗Cls抗体以增强Cls从血浆的清除率。本发明还提供了增强个体中Clr和Cls复合体从血浆的清除率的方法。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的抗Cls抗体以增强Clr和Cls复合体从血浆的清除率。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的抗Cls抗体以增强Clr2s2从血浆的清除率。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的抗Cls抗体以增强Clr2s2从血浆的清除率而不是Clq从血浆的清除率。
在另一方面，本发明提供了从血浆中去除Cls的方法，所述方法包括：(a)鉴定需要从其血浆中去除Cls的个体；(b)提供抗体，所述抗体通过抗体的抗原结合(Cls-结合)结构域与Cls结合并且具有KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值定义为当KD使用表面等离子共振技术测定时，在pH 5.8对Cls的KD和在pH 7.4对Cl的KD的比值为11至10,000，其中抗体在体内与血浆中的Cl结合并在体内存在于内体中的条件下从结合的Cls解离，并且其中所述抗体是人IgG或人源化IgG；并且(c)将抗体施用于个体。在另一方面，这种表面等离子体共振技术可以在37摄氏度和150mM NaCl下使用。在另一方面，可以使用这样的表面等离子共振技术，其中抗体被固定，抗原用作分析物，并且使用以下条件：10mM MES缓冲液、0.05％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯和150mM NaCl，37摄氏度。
在另一个方面，本发明提供了从受试者的血浆中去除Cls的方法，所述方法包括：(a)鉴定第一抗体，所述第一抗体通过第一抗体的抗原结合区与Cls结合；(b)鉴定第二抗体，所述第二抗体：(1)通过第二抗体的抗原结合(Cls-结合)结构域与Cls结合，(2)与第一抗体的氨基酸序列相同，除了具有第一抗体的可变区的至少一个氨基酸被组氨酸置换和/或至少一个组氨酸插入第一抗体的可变区，(3)具有高于第一抗体的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值，并且在11和10,000之间，其中KD(pH5.8)/KD(pH7.4)定义为当使用表面等离子共振技术确定KD时，pH 5.8下对Cls的KD与pH7.4下对Cls的KD的比值，(4)在体内与血浆中的Cls结合，(5)在体内内体中存在的条件下从结合的Cls上解离，和(6)是人IgG或人源化IgG；(c)确定需要降低他或她血浆Cls水平的受试者；和(d)将第二抗体施用于受试者，从而降低受试者中Cls的血浆水平。在另一方面，这种表面等离子体共振技术可以在37摄氏度和150mM NaCl下使用。在另一方面，这种表面等离子体共振技术可以在37摄氏度和150mM NaCl下使用。在另一方面，可以使用这样的表面等离子共振技术，其中抗体被固定，抗原用作分析物，并且使用以下条件：10mM MES缓冲液、0.05％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯和150mM NaCl，37摄氏度。
在另一个方面，本发明提供了从受试者的血浆中去除Cls的方法，所述方法包括：(a)鉴定第一抗体，所述第一抗体：(1)通过第一抗体的抗原结合区与Cls结合，(2)与通过第二抗体的抗原结合(Cls-结合)结构域与Cls结合的第二抗体的氨基酸序列相同，除了第一抗体的至少一个可变区比第二抗体的相应可变区多至少一个组氨酸残基之外，(3)具有高于第二抗体的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)值，并且在11和10000之间，其中KD(pH5.8)/KD(pH7.4)定义为当使用表面等离子体共振技术确定KD时，在pH 5.8下对Cls的KD与在pH 7.4下对Cls的KD的比值，(4)在体内与血浆中的Cls结合，(5)在体内内体中存在的条件下从结合的Cls解离，和(6)是人IgG或人源化IgG；(b)确定需要降低他或她血浆Cls水平的受试者；(c)将第一抗体施用至受试者至少一次，以降低受试者的血浆Cls水平。在另一方面，这种表面等离子体共振技术可以在37摄氏度和150mM NaCl下使用。在另一方面，这种表面等离子体共振技术可以在37摄氏度和150mM NaCl下使用。在另一方面，可以使用这样的表面等离子共振技术，其中抗体被固定，抗原用作分析物，并且使用以下条件：10mM MES缓冲液、0.05％聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯和150mM NaCl，37摄氏度。在某些情况下，抗体抑制经典补体途径的组分；在某些情况下，经典的补体途径组分是Cls。
(a4)分离的抗体的pI
在分离的抗体的一个实施方案中，抗体的pI小于9.00、小于8.90、小于8.80、或8.78或更小。pI优选地小于8.90，更优选地小于8.80，进一步优选地8.78或更小。当pI小于它们中的任何一点时，血液中抗体的半衰期就会延长。另一方面，pI的可能最小值通常为4.28或更大。
在一个实施方案中，可以通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量抗体的pI。作为实施方案的实例，cIEF是在Protein Simple iCE3全毛细管成像系统上使用碳氟化合物涂层的毛细管盒进行的。阳极液和阴极溶液分别是0.1％m/v甲基纤维素(MC)中的0.08M磷酸和0.1％m/v MC中的0.1M氢氧化钠。所有分析的样品均包含0.5mg/mL工作抗体、0.3％m/v MC、6mMIDA(亚氨基二乙酸)、10mM精氨酸、4M尿素、pI标记物(7.65和9.77)，以及以下2％pharmalyte 8-10.5、2％pharmalyte 5-8的v/v混合物之一。所有样品在上样到自动进样器隔室之前都经过短暂涡旋和离心。在开始测量之前，样品在自动进样器中温育2小时。在1.5kV条件下聚焦1分钟，然后在3.0kV条件下聚焦7分钟。自动进样器隔室保持在10摄氏度。每个样品重复测量两次，每个样品的pI值通过计算n＝2测量的平均值获得。
或者，在一个实施方案中，可以通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量抗体的pI。作为实施方案的实例，cIEF是在Protein Simple iCE3全毛细管成像系统上使用碳氟化合物涂层的毛细管盒进行的。阳极液和阴极溶液分别是0.1％m/v甲基纤维素(MC)中的0.08M磷酸和0.1％m/v MC中的0.1M氢氧化钠。所有分析的样品均含有0.35％m/v MC、4mM IDA(亚氨基二乙酸)、10mM精氨酸、pI标记物(3.21或4.22或4.65或5.12或5.85或6.14或6.61或7.05或7.65或8.40或8.79或9.46或9.77或10.1)，以及4％pharmalyte 3-10的以下v/v混合物之一。所有样品在上样到自动进样器隔室之前都经过短暂涡旋和离心。在1.5kV条件下聚焦1分钟，然后在3.0kV条件下聚焦8分钟。自动进样器隔室保持在10摄氏度。每个样品重复测量两次，每个样品的pI值通过计算n＝2测量的平均值获得。
在案例的一个实施方案中，通过毛细管等电聚焦测量pI，其中在0.1％m/v甲基纤维素(MC)中含有0.08M磷酸的溶液用作阳极液溶液，在0.1％m/v MC中含有0.1M氢氧化钠的溶液用作阴极液溶液，含有0.5mg/mL抗体、0.3％m/v MC、6.0mM亚氨基二乙酸(IDA)、10mM精氨酸、4M尿素和pI标记物(7.65和9.77)的溶液用作裂解抗体的工作溶液。
(a5)抗原结合区
在一个实施方案中，抗体包含抗原结合区。在优选的实施方案中，抗原结合区可以特异性结合Cls的CUB1-EGF-CUB2结构域内的表位。在进一步优选的实施方案中，抗原结合区可以特异性结合Cls的CUB1-EGF-CUB2结构域。在这些实施方案中，Cls包括但不限于人Cls。Cls优选地是人Cls。
在一个实施方案中，抗原结合区可以是抗体可变区。抗体可变区可以是抗体可变区的全部或部分，只要该抗原结合区不破坏分离的抗体的性质，例如取代功能和/或阻断功能，以及抗体的以下结合活性即可；
在通过表面等离子共振测量抗体与人和/或食蟹猴Cls的结合活性的情况下，
i)中性pH范围内的解离常数(KD)值可以可靠地计算，而酸性pH范围内的KD值由于没有结合活性或结合活性相当低而不能可靠地计算，或
ii)在中性pH范围和酸性pH范围内的KD值都可以能够可靠地计算的前提下，酸性pH范围内的KD值与中性pH范围内的KD值的比值，即酸性KD/中性KD的比值大于10。
在实施方案中，抗体可变区是人源化的。抗原结合区优选地为人源化抗体可变区。当这种人源化抗体用于药物时，预期与非人源化抗体相比可以避免副作用。
在一个实施方案中，抗原结合区包含重链可变区，所述重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，所述HVR-H1包含由AYAMN(SEQ ID No.1)组成的氨基酸序列，所述HVR-H2包含由LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(SEQ ID No.2)组成的氨基酸序列，所述HVR-H3包含由GRSX7NYX8SX9FHL(SEQ ID No.3)组成的氨基酸序列。在实施方案中，抗原结合区包含轻链可变区，所述轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，所述HVR-L1包含由QAX10X11X12LHDKX13NLA(SEQ ID No.4)组成的氨基酸序列，所述HVR-L2包含由X14ASX15X16ES(SEQ ID No.5)组成的氨基酸序列，所述HVR-L3包含由X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(SEQ IDNo.6)组成的氨基酸序列。在实施方案中，X1至X23中的每一个均选自天然存在的氨基酸。
在本发明的另一个实施方案中，分离的抗Cls抗体包含重链可变区、轻链可变区和抗体恒定区。在实施方案中，重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，所述HVR-H1包含由AYAMN(SEQ ID No.1)组成的氨基酸序列，所述HVR-H2包含由LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(SEQID No.2)组成的氨基酸序列，所述HVR-H3包含由GRSX7NYX8SX9FHL(SEQ ID No.3)组成的氨基酸序列。在实施方案中，轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，所述HVR-L1包含由QAX10X11X12LHDKX13NLA(SEQ ID No.4)组成的氨基酸序列，所述HVR-L2包含由X14ASX15X16ES(SEQ ID No.5)组成的氨基酸序列，所述HVR-L3包含由X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(SEQ IDNo.6)组成的氨基酸序列。在实施方案中，X1至X23中的每一个均选自天然存在的氨基酸。
这些氨基酸序列包含在“实施例”中揭示的抗体中的共同序列，COS0637pHv1至COS0637pHv9，其是通过在实施例中从PCT/JP2019/015919中产生的嵌合抗体重组和表征而产生的。当抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区时，抗原结合区具有比嵌合抗体更高的对人和/或食蟹猴Cls的pH依赖性的结合活性，尽管抗原结合区是人源化的。
在一个实施方案中，X1至X23的氨基酸优选地选自以下氨基酸。
X1是Lys或Ser，
X2是Gly或Lys，
X3是His或Ser，
X4是Glu或Thr，
X5是Glu或Lys，
X6是Glu或Gly，
X7是Lys或Val，
X8是Asn或Val，
X9是Asp或Gly，
X10是Asn、Gln或Ser，
X11是Gly或Gln，
X12是Ile或Ser，
X13是Lys或Arg，
X14是Gly或Gln，
X15是Gln或Thr，
X16是Leu或Arg，
X17是His或Gln，
X18是Pro或Ser，
X19是Cys或Tyr，
X20是Glu或Ser，
X21是Glu或Ser，
X22是Cys或Leu，和
X23是Gln或Thr。
这些氨基酸共同存在于“实施例”中揭示的抗体中，COS0637pHv1至COS0637pHv9共同。当抗原结合区包含氨基酸时，抗原结合区与嵌合抗体相比具有更高的结合活性更高的pH依赖性，尽管抗原结合区是人源化的。
在一个实施方案中，HVR-H1包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，HVR-H2包含由SEQ ID No.8至10组成的氨基酸序列中的任一项，HVR-H3包含由SEQ ID No.11至13组成的氨基酸序列中的任一项，HVR-L1包含由SEQ ID No.14至18组成的氨基酸序列中的任一项，HVR-L2包含由SEQ ID No.19至22组成的氨基酸序列中的任一项，并且HVR-L3包含由SEQ IDNo.23至28组成的氨基酸序列中的任一项。
在一个实施方案中，HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的氨基酸序列的组合选自由以下1)至9)组成的组；
1)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.8组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.14组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.23组成的氨基酸序列；
2)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.9组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.12组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.14组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.23组成的氨基酸序列；
3)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
4)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
5)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.16组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.21组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.25组成的氨基酸序列；
6)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.17组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.26组成的氨基酸序列；
7)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列；
8)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列，和
9)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.22组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.28组成的氨基酸序列。
在一个实施方案中，X19和/或X22不是Cys。当X19和/或X22不是Cys时，产生的分离抗体的异质性风险将降低。在一个实施方案中，X19是Trp或Tyr，并且X22是Leu或Met。当X19和/或X22不是Cys时，在X19处具有Trp或Tyr，在X22处具有Leu或Met的抗原结合区比如实施例3中所揭示的具有其他氨基酸对人和/或食蟹猴Cls具有更高的结合活性更高的pH依赖性。在实施方案中，X19优选地为Tyr，X22优选地为Leu。在该位置选择Tyr和Leu可以防止X19和X22的氨基酸被氧化。这些氨基酸共同存在于“实施例”中揭示的抗体中，COS0637pHv3至COS0637pHv9共同。
在一个实施方案中，X1至X23的氨基酸优选地选自以下氨基酸。
X1是Ser，
X2是Gly，
X3是His，
X4是Glu，
X5是Glu，
X6是Glu，
X7是Lys，
X8是Asn或Val，
X9是Asp或Gly，
X10是Asn、Gln或Ser，
X11是Gly或Gln，
X12是Ile，
X13是Lys或Arg，
X14是Gly或Gln，
X15是Gln或Thr，
X16是Leu或Arg，
X17是His，
X18是Pro或Ser，
X19是Tyr，
X20是Glu或Ser，
X21是Glu或Ser，
X22是Leu，和
X23是Gln或Thr。
这些氨基酸共同存在于“实施例”中揭示的抗体中，COS0637pHv3至COS0637pHv9共同。当抗原结合区包含氨基酸时，产生的分离抗体中的异质性和X19和X22处氨基酸氧化的风险降低，并且抗原结合区比嵌合抗体对人和/或食蟹猴Cls具有更高的结合活性更高的pH依赖性。
在优选的实施方案中，HVR-H1包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，HVR-H2包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，HVR-H3包含由SEQ ID No.11或13组成的氨基酸序列，HVR-L1包含由SEQ ID No.15至18组成的氨基酸序列中的任一项，HVR-L2包含由SEQ IDNo.19至22组成的氨基酸序列中的任一项，并且HVR-L3包含由SEQ ID No.24至28组成的氨基酸序列中的任一项。
在进一步优选的实施方案中，HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的氨基酸序列的组合选自由以下3)至9)组成的组；
3)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
4)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
5)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.16组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.21组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.25组成的氨基酸序列；
6)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.17组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.26组成的氨基酸序列；
7)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列；
8)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列，和
9)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.22组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.28组成的氨基酸序列。
在这些组合中，HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的氨基酸序列的组合优选地选自由以下四种组合组成的组，因为这四种具有较小的免疫原性潜力和诱导免疫细胞例如PBMC形态变化的可能性较小；
3)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
5)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.16组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.21组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.25组成的氨基酸序列；
8)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列，和
9)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.22组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.28组成的氨基酸序列。
在一个实施方案中，重链可变区的氨基酸序列选自由SEQ ID No.40、41、98、99和100组成的氨基酸序列组成的组。在一个实施方案中，轻链可变区的氨基酸序列选自由SEQID No.38、101、102、103、104、105和106组成的氨基酸序列组成的组。在优选的实施方案中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的组合选自由SEQ ID No.40和38、SEQ ID No.41和38、SEQ ID No.98和101、SEQ ID No.99和101、SEQ ID No.99和102、SEQ ID No.99和103、SEQ ID.No100和104、SEQ ID No.100和105，以及SEQ ID No.100和106组成的氨基酸序列组合组成的组。
在一个实施方案中，重链可变区的氨基酸序列选自由SEQ ID No.98、99和100组成的酸序列组成的组。在一个实施方案中，轻链可变区的氨基酸序列选自由SEQ ID No.101、102、103、104、105和106组成的氨基酸序列组成的组。在优选的实施方案中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的组合选自由SEQ ID No.98和101、SEQ ID No.99和101、SEQ IDNo.99和102、SEQ ID No.99和103、SEQ ID No.100和104、SEQ ID No.100和105，以及SEQ IDNo.100和106组成的氨基酸序列组合组成的组。
(a6)抗体恒定区
在一个实施方案中，分离的抗体中的抗体恒定区包括但不限于人抗体的恒定区。人抗体的恒定区可以包括重链和轻链。人抗体包括但不限于人IgG1。人抗体优选地是人IgG1。
在一个实施方案中，抗体恒定区包含至少一个氨基酸，与不含所述至少一个氨基酸的分离的抗体相比，所述至少一个氨基酸可以增加分离的抗体在酸性pH范围内对FcRn的结合能力。
在实施方案中，恒定区包括
(a)根据EU编号，第434位的Ala；第438位的Glu、Arg、Ser或LVs；和第440位的Glu、Asp或Gln；
(b)根据EU编号，第434位的Ala；第438位的Arg或Lys；和第440位的Glu或Asp；
(c)根据EU编号，第428位的Ile或Leu；第434位的Ala；第436位的Ile、Leu、Val、Thr或Phe；第438位的Glu、Arg、Ser或Lys；第440位的Glu、Asp或Gln；
(d)根据EU编号，第428位的Ile或Leu；第434位的Ala；第436位的Ile、Leu、Val、Thr或Phe；第438位的Arg或Lys；和第440位的Glu或Asp；
(e)根据EU编号，第428位的Leu；第434位的Ala；第436位的Val或Thr；第438位的Glu、Arg、Ser或Lys；第440位的Glu、Asp或Gln；或者
(f)根据EU编号，第428位的Leu；第434位的Ala；第436位的Val或Thr；第438位的Arg或Lys；和第440位的Glu或Asp。
WO2013/046704具体报道了根据EU编号Q438R/S440E、Q438R/S440D、Q438K/S440E和Q438K/S440D的双氨基酸残基置换，当与可以增加酸性条件下的FcRn结合的氨基酸置换结合时，这导致类风湿因子结合的显著降低。
在实施方案中，恒定区优选地包含选自由以下组成的组的氨基酸置换的组合：
(I)根据EU编号(a)N434A/Q438R/S440E；(b)N434A/Q438R/S440D；(c)N434A/Q438K/S440E；(d)N434A/Q438K/S440D；(e)N434A/Y436T/Q438R/S440E；(f)N434A/Y436T/Q438R/S440D；(g)N434A/Y436T/Q438K/S440E；(h)N434A/Y436T/Q438K/S440D；(i)N434A/Y436V/Q438R/S440E；(j)N434A/Y436V/Q438R/S440D；(k)N434A/Y436V/Q438K/S440E；(l)N434A/Y436V/Q438K/S440D；(m)N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；(n)N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D；(o)N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；(p)N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D；(q)N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；(r)N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D；(s)N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；(t)N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D；(u)M428L/N434A/Q438R/S440E；(v)M428L/N434A/Q438R/S440D；(w)M428L/N434A/Q438K/S440E；(x)M428L/N434A/Q438K/S440D；(y)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；(z)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D；(aa)M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；(ab)M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D；(ac)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；(ad)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D；(ae)M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；(af)M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D；(ag)L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；(ah)L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；或
(II)根据EU编号(a)N434A/Q438R/S440E；(b)N434A/Y436T/Q438R/S440E；(c)N434A/Y436V/Q438R/S440E；(d)M428L/N434A/Q438R/S440E；(e)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；(f)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；(g)L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；和(h)L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E。
在另一个实施方案中，恒定区优选地包含至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由第428位的亮氨酸、第434位的丙氨酸和第436位的苏氨酸(所有编号均根据EU编号系统)组成的组。在实施方案中，恒定区更优选地包含第428位的亮氨酸、第434位的丙氨酸和第436位的苏氨酸(所有编号均根据EU编号系统)。
在一个实施方案中，与第二参考抗体相比，恒定区包含至少一个氨基酸，该氨基酸可以增加分离的抗体在中性pH范围内与Fcγ受体的结合能力。
在实施方案中，恒定区优选地包含选自根据EU编号，在恒定区位点中，由以下组成的组的至少一个或多个氨基酸：
第221位氨基酸的Lys或Tyr任一个；
第222位氨基酸的Phe、Trp、Glu和Tyr中的任一个；
第223位氨基酸的Phe、Trp、Glu和Lys中的任一个；
第224位氨基酸的Phe、Trp、Glu和Tyr中的任一个；
第225位氨基酸的Glu、Lys和Trp中的任一个；
第227位氨基酸的Glu、Gly、Lys和Tyr中的任一个；
第228位氨基酸的Glu、Gly、Lys和Tyr中的任一个；
第230位氨基酸的Ala、Glu、Gly和Tyr中的任一个；
第231位氨基酸的Glu、Gly、Lys、Pro和Tyr中的任一个；
第232位氨基酸的Glu、Gly、Lys和Tyr中的任一个；
第233位氨基酸的Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第234位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第235位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第236位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第237位氨基酸的Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第238位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第239位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第240位氨基酸的Ala、Ile、Met和Thr中的任一个；
第241位氨基酸的Asp、Glu、Leu、Arg、Trp和Tyr中的任一个；
第243位氨基酸的Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp和Tyr中的任一个；
第244位氨基酸的His；
第245位氨基酸的Ala；
第246位氨基酸的Asp、Glu、His和Tyr中的任一个；
第247位氨基酸的Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val和Tyr中的任一个；
第249位氨基酸的Glu、His、Gln和Tyr中的任一个；
第250位氨基酸的Glu或Gln中的任一个；
第251位氨基酸的Phe；
第254位氨基酸的Phe、Met和Tyr中的任一个；
第255位氨基酸的Glu、Leu和Tyr中的任一个；
第256位氨基酸的Ala、Met和Pro中的任一个；
第258位氨基酸的Asp、Glu、His、Ser和Tyr中的任一个；
第260位氨基酸的Asp、Glu、His和Tyr中的任一个；
第262位氨基酸的Ala、Glu、Phe、Ile和Thr中的任一个；
第263位氨基酸的Ala、Ile、Met和Thr中的任一个；
第264位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp和Tyr中的任一个；
第265位氨基酸的Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、LVs、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第266位氨基酸的Ala、Ile、Met和Thr中的任一个；
第267位氨基酸的Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第268位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val和Trp中的任一个；
第269位氨基酸的Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第270位氨基酸的Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp和Tyr中的任一个；
第271位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第272位氨基酸的Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第273位氨基酸的Phe或Ile中的任一个；
第274位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第275位氨基酸的Leu或Trp中的任一个；
第276位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第278位氨基酸的Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val和Trp中的任一个；
第279位氨基酸的Ala；
第280位氨基酸的Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp和Tyr中的任一个；
第281位氨基酸的Asp、Lys、Pro和Tyr中的任一个；
第282位氨基酸的Glu、Gly、Lys、Pro和Tyr中的任一个；
第283位氨基酸的Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg和Tyr中的任一个；
第284位氨基酸的Asp、Glu、Leu、Asn、Thr和Tyr中的任一个；
第285位氨基酸的Asp、Glu、Lys、Gln、Trp和Tyr中的任一个；
第286位氨基酸的Glu、Gly、Pro和Tyr中的任一个；
第288位氨基酸的Asn、Asp、Glu和Tyr中的任一个；
第290位氨基酸的Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp和Tyr中的任一个；
第291位氨基酸的Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln和Thr中的任一个；
第292位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Pro、Thr和Tyr中的任一个；
第293位氨基酸的Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第294位氨基酸的Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第295位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第296位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr和Val中的任一个；
第297位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第298位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第299位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第300位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val和Trp中的任一个；
第301位氨基酸的Asp、Glu、His和Tyr中的任一个；
第302位氨基酸的Ile；
第303位氨基酸的Asp、Gly和Tyr中的任一个；
第304位氨基酸的Asp、His、Leu、Asn和Thr中的任一个；
第305位氨基酸的Glu、Ile、Thr和Tyr中的任一个；
第311位氨基酸的Ala、Asp、Asn、Thr、Val和Tyr中的任一个；
第313位氨基酸的Phe；
第315位氨基酸的Leu；
第317位氨基酸的Glu或Gln中的任一个；
第318位氨基酸的His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val和Tyr中的任一个；
第320位氨基酸的Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第322位氨基酸的Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第323位氨基酸的Ile；
第324位氨基酸的Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第325位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第326位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第327位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第328位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第329位氨基酸的Asp、Glu、Phe、Gly、His、Tle、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第330位氨基酸的Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第331位氨基酸的Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第332位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第333位氨基酸的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val和Tyr中的任一个；
第334位氨基酸的Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro和Thr中的任一个；
第335位氨基酸的Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp和Tyr中的任一个；
第336位氨基酸的Glu、Lys和Tyr中的任一个；
第337位氨基酸的Glu、His和Asn中的任一个；
第339位氨基酸的Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser和Thr中的任一个；
第376位氨基酸的Ala或Val中的任一个；
第377位氨基酸的Gly或Lys中的任一个；
第378位氨基酸的Asp；
第379位氨基酸的Asn；
第380位氨基酸的Ala、Asn和Ser中的任一个；
第382位氨基酸的Ala或Ile中的任一个；
第385位氨基酸的Glu；
第392位氨基酸的Thr；
第396位氨基酸的Leu；
第421位氨基酸的Lys；
第427位氨基酸的Asn；
第428位氨基酸的Phe或Leu中的任一个；
第429位氨基酸的Met；
第434位氨基酸的Trp；
第436位氨基酸的Ile；和
第440位氨基酸的Gly、His、Ile、Leu和Tyr中的任一个。
在实施方案中，恒定区更优选地包括根据EU编号，在恒定区位点中，以下至少一种或多种：
第238位氨基酸的Asp；和
第328位氨基酸的Glu。
在实施方案中，恒定区进一步优选地包括以下氨基酸中的至少一种：第234位的酪氨酸、第235位的色氨酸、第236位的天冬酰胺、第238位的天冬氨酸、第250位的缬氨酸、第264位的异亮氨酸、第268位的天冬氨酸、第295位的亮氨酸、第307位的脯氨酸、第326位的苏氨酸、第330位的赖氨酸(所有编号均根据EU编号系统)。
恒定区进一步优选地包括下述(a)或(b)的氨基酸；
(a)第235位的色氨酸、第236位的天冬酰胺、第268位的天冬氨酸、第295位的亮氨酸、第326位的苏氨酸和第330位的赖氨酸，或
(b)第234位的酪氨酸、第238位的天冬氨酸、第250位的缬氨酸、第264位的异亮氨酸、第307位的脯氨酸和第330位的赖氨酸(所有编号均根据EU编号系统)。
在一个实施方案中，分离的抗体的等电点(pI)通过改变恒定区而增加。在实施方案中，与其亲本恒定区相比，具有增加的pI的分离的抗体在恒定区中包括至少两个氨基酸改变。在进一步的实施方案中，与亲本恒定区相比，每个氨基酸改变增加恒定区的等电点(pI)。在进一步的实施方案中，氨基酸可以暴露在该区域的表面上。在进一步的实施方案中，分离的抗体包括恒定区和抗原结合结构域。在进一步的实施方案中，抗原结合结构域的抗原结合活性根据离子浓度条件而变化。
在进一步的实施方案中，本发明的具有增加的pI的恒定区包括选自由以下组成的组的至少两个位置的至少两个氨基酸改变：根据EU编号，285，311，312，315，318，333，335，337，341，342，343，384，385，388，390，399，400，401，402，413，420，422和431。在进一步的实施方案中，具有增加的pI的恒定区在所选位置的每一个处包含Arg或Lys。
在具体实施方案中，具有增加的pI的恒定区包括在第311位的精氨酸和第343位的精氨酸(这两个编号均根据EU编号系统)。
在一个实施方案中，分离的抗体的等电点(pI)通过改变重链可变区和/或轻链可变区而降低。在实施方案中，与其亲本区相比，具有降低的pI的分离的抗体在重链可变区和/或轻链可变区中包含至少一个氨基酸改变。这种通过改变重链可变区和/或轻链可变区而降低的pI可以有助于提高分离的抗体的PK。
在实施方案中，重链中的恒定区中，与没有所述至少一个氨基酸的人抗体恒定区相比，包含可以降低与Clq的结合能力的至少一个氨基酸。当分离的抗体中恒定区与Clq的不必要结合被这种氨基酸减少时，当分离的抗体用于药物时，避免了导致不必要结合的副作用。减少抗体恒定区与Clq的结合的相关氨基酸例如显示在WO2014163101中。在特定的实施方案中，可以降低对Clq的结合能力的氨基酸是EU编号系统中第238位的Asp。
在一个实施方案中，与包含如WO2014163101中公开的天然存在的IgG抗体恒定区的分离的抗体相比，分离的抗体中的恒定区与所有活化FcγR，特别是FcγRIIa(R型)的结合活性可以降低，同时它们的FcγRIIb结合活性被维持。通过恒定区的这种结合活性，在通过FcγRIIb消除免疫复合物的特性被维持在与天然存在的IgG相似的程度的条件下，可以增强由FcγRIIb的ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)磷酸化产生的炎症免疫应答抑制信号。此外，通过赋予恒定区选择性结合FcγRIIb的性质，可以抑制抗抗体产生。此外，通过减少与活化FcγR的结合，可以避免由血小板上的FcγRIIa与免疫复合物之间的相互作用介导的血小板活化，以及由活化FcγR交联引起的树突状细胞活化。
在实施方案中，与没有所述至少一个氨基酸的人抗体的恒定区相比，重链中的恒定区包括可以选择性结合FcγRIIb的至少一个氨基酸。在实施方案中，重链中恒定区对人FcγRIIa的KD值与对人FcγRIIb的KD值之比(KD(hFcγRIIa/KD(hFcγRIIb))高于没有所述至少一个氨基酸的人抗体恒定区的KD值比。具有选择性结合FcγRIIb的特性的恒定区中的示例性氨基酸例如显示在WO2014163101中。在特定实施方案中，重链中的恒定区包括EU编号系统第234位的Tyr、EU编号系统第238位的Asp、EU编号系统第264位的Ile和EU编号系统第330位的Lys。
在具体实施方案中，重链中的恒定区包括选自由以下组成的组中的至少一个：EU编号系统第214位的Arg、EU编号系统第250位的Val、EU编号系统第307位的Pro、EU编号系统第311位的Arg、EU编号系统第343位的Arg、EU编号系统第428位的Leu、EU编号系统第434位的Ala、EU编号系统第436位的Thr、EU编号系统第438位的Arg和EU编号系统第440位的Glu。在优选的实施方案中，重链中的恒定区包括选自由以下组成的组中的至少一个：EU编号系统第214位的Arg、EU编号系统第234位的Tyr、EU编号系统第238位的Asp、EU编号系统第250位的Val、EU编号系统第264位的Ile、EU编号系统第307位的Pro、EU编号系统第311位的Arg、EU编号系统第330位的Lys、EU编号系统第343位的Arg、EU编号系统第428位的Leu、EU编号系统第434位的Ala、EU编号系统的第436位的Thr、EU编号系统第438位的Arg和EU编号系统第440位的Glu。在优选的实施方案中，重链中的恒定区包含EU编号系统第214位的Arg、EU编号系统第234位的Tyr、EU编号系统第238位的Asp、EU编号系统第250位的Val、EU编号系统第264位的Ile、EU编号系统第307位的Pro、EU编号系统第311位的Arg、EU编号系统第330位的Lys、EU编号系统第343位的Arg、EU编号系统第428位的Leu、EU编号系统第434位的Ala、EU编号系统的第436位的Thr、EU编号系统第438位的Arg和EU编号系统第440位的Glu。当这些实施方案中的氨基酸与上述抗原结合区组合时，分离的抗体具有较小的免疫原性潜力和/或较小的诱导免疫细胞(例如PBMC)形态变化的潜力。
在一个实施方案中，可以去除重链的恒定区的C末端赖氨酸(EU编号系统中的第447位)或C末端甘氨酸-赖氨酸(EU编号系统中的第446位和第447位)，以在如WO2009041613中所揭示的产生的分离的抗体中减少异质性。在优选的实施方案中，恒定区中EU编号系统中第446位和第447位的氨基酸被缺失。
Fc区变体
(清扫技术)
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，所述人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如置换)。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1的Fc区。
为了增强血浆抗原浓度的降低和/或改善抗体的药代动力学，可以修饰IgG Fc区中与FcRn结合的位点的氨基酸残基以增强它们在细胞中的摄取。当以这种方式修饰具有pH依赖性的抗体时，突变体将是一种“清扫”抗体，可以更牢固地与FcRn结合并允许抗原有效地转移到内体(其中pH为酸性)然后降解，但本身可以更有效地循环到细胞表面。与未经修饰的原始(亲本)抗体相比，这种修饰的“清扫”抗体可在中性pH值和细胞表面与FcRn牢固地结合，并增强抗原的摄取和降解。(Semin Immunopathol.2018；40(1)：125-140)。
在一些方面，抗体是在Fc区具有至少一个氨基酸修饰的Fc区，以增强血浆抗原浓度的降低和/或改善抗体的药代动力学。
在一些实施方案中，Fc区是人Fc区，其与活化的Fcγ受体的结合活性强于与天然人IgGl的Fc区的结合活性。如在例如WO 2013/047752中提到的，为了增强对活化Fcγ受体的结合活性，选自由Fc区中由以下位置的氨基酸组成的组的一个或多个氨基酸可以被修饰为与作为亲本(原始)抗体的天然人IgG1的Fc区中对应位点的氨基酸不同：221，222，223，224，225，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，243，244，245，246，247，249，250，251，254，255，256，258，260，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，278，279，280，281，282，283，284，285，286，288，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，311，313，315，317，318，320，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，339，376，377，378，379，380，382，385，392，396，421，427，428，429，434，436和440(EU编号)。
在一些实施方案中，Fc区是对抑制性Fcγ受体的结合活性强于对活化性Fcγ受体的结合活性的人Fc区。如在例如WO 2013/125667中提到的，为了增强对抑制性Fcγ受体的结合活性，选自由Fc区中以下位置的氨基酸组成的组的一个或多个氨基酸可以被修饰为与天然人IgG1的Fc区中对应位点的氨基酸不同：244，245，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，260，262，265，270，272，279，283，285，286，288，293，303，305，307，308，309，311，312，314，316，317，318，332，339，340，341，343，356，360，362，375，376，377，378，380，382，385，386，387，388，389，400，413，415，423，424，427，428，430，431，433，434，435，436，438，439，440，442和447(EU编号)。
在一些实施方案中，Fc区是在中性pH下对FcRn的结合活性强于天然人IgGl的Fc区的结合活性的人Fc区。如在例如WO 2011/122011中提到的，为了增强在中性pH对FcRn的结合活性，选自由Fc区中以下位置的氨基酸组成的组的一个或多个氨基酸可以被修饰为与天然人IgG1的Fc区中对应位点的氨基酸不同：237，238，239，248，250，252，254，255，256，257，258，265，270，286，289，297，298，303，305，307，308，309，311，312，314，315，317，325，332，334，360，376，380，382，384，385，386，387，389，424，428，433，434和436(EU编号)。
在某些实施方案中，本发明考虑了一种抗体变体，它具有一些但不是所有的效应子功能，这使其成为其中抗体在体内的半衰期很重要但某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的应用的理想候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞、NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464页的表3总结了造血细胞上的FcR表达。在美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中描述了评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如流式细胞术的ACT1(注册商标)非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox 96(注册商标)非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外地，例如在诸如Clynes等Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中公开的动物模型中，在体内评估目标分子的ADCC活性。也可以进行Clq结合测定以确认抗体不能结合Clq并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的Clq和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg，M.S.等，Blood 101：1045-1052(2003)；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103：2738-2743(2004)。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见，例如，Petkova，S.B.等，Int′l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被置换的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个处具有置换的Fc突变体，包括将残基265和297置换为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR结合增加或减少的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包括具有提高ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的置换(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，导致改变(即增加或减少)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所描述的。
US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了这样的抗体，所述抗体具有增加的半衰期和增加的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，新生儿Fc受体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。那些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其增加Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基处具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。还参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351，涉及Fc区变体的其他实例。
(a7)其他实施方案
(抗体变体)
在某些实施方案中，设想了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如，抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，前提是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
a7-1)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。置换诱变的目的位点包括HVR和FR。保守性置换在“优选置换”标题下的表1中。在“示例性置换”标题下的表1中提供了更多实质性变化，并在下文中参考氨基酸侧链类别进一步描述。可以将氨基酸置换引入目的抗体，并筛选产物以获得所需的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
[表1]
Figure BDA0003685714400000731
氨基酸可以根据共同的侧链特性进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守置换将需要将这些类别中的一个成员置换为另一个类别。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物学特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)方面具有修饰(例如，改进)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文描述的那些。简而言之，一个或多个HVR残基被突变，变体抗体被展示在噬菌体上并筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中进行改变(例如置换)，例如以提高抗体亲和力。例如，可以在HVR“热点”即由在体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，和/或接触抗原的残基中进行改变，对所得变体VH或VL进行结合亲和力测试。例如在Hoogenboom等在Methods in Molecular Biology178：1-37(O′Brien等，编辑，Human Press，Totowa，NJ，(2001)中，已经描述了构建二级文库并从二级文库重新选择的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR定向的方法，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。可以特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别是经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个HVR内发生，只要此类改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不显著降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守置换)。例如，这种改变可以在HVR中的抗原接触残基之外。在上面提供的变体VH和VL序列的一些实施方案中，每个HVR或者是未改变的，或者包含不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
如Cunningham和Wells(1989)Science，244：1081-1085所述，用于鉴定可作为诱变所靶向的抗体残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，一个残基或一组靶标残基(例如，带电荷的残基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被鉴定并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在显示对初始置换的功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的置换。或者或另外地，可以分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到包含一百个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括酶(例如对于ADEPT)或增加抗体血浆半衰期的多肽与抗体的N-或C-末端的融合。
a7-2)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可以方便地通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来完成。
在抗体包括Fc区的情况下，可以改变其连接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包括分枝的双触角寡糖，所述寡糖通常通过N键连接到Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中与GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改进特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，该碳水化合物结构缺乏(直接或间接)连接至Fc区的岩藻糖。例如，此类抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过计算相对于与Asn 297连接的所有糖结构(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)的总和，Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来确定，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约第297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体的微小序列变异，Asn297也可位于第297位上游或下游约+/-3个氨基酸，即，第294位和第300位之间。这种岩藻糖基化变体可能具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷”抗体变体相关的出版物实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是在实施例11中)，以及敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki etal.Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
进一步为抗体变体提供二等分的寡糖，例如，其中连接到抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可能具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；和US 2005/0123546(Umana等)中。还提供了在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可能具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO 1999/22764(Raju，S.)中。
a7-3)半胱氨酸工程化的抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可接近位点并且可用于将抗体与其他部分(例如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基的任意一个或多个可以被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化的抗体可以如美国专利号7,521,541中所述产生。
a7-4)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文提供的抗体可进一步修饰以包含本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适用于衍生化抗体的适当部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。连接至抗体上的聚合物的数量可能会有所不同，如果连接的聚合物多于一种，它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑来确定，包括但不限于待改进抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于限定的条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射而选择性地加热的抗体和非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞但将非蛋白质加热到接近抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度的波长。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述抗-Cls抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含此类核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包括(例如，已用以下转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包括抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如YO、NSO、Sp2/O细胞)。在一个实施方案中，提供了一种制备抗-Cls抗体的方法，其中所述方法包括在适合表达抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
对于本文所述抗-Cls抗体的重组生产，分离例如如上所述编码抗体的核酸，将其插入一种或多种载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。
用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(另见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，pp.245-254，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。)表达后，抗体可从可溶部分中的细菌细胞糊中分离，并可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人的糖基化模式的抗体。参见Gemgross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)和Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIES(注册商标)技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293或293细胞，如Graham等，J.Gen Virol.36：59所述(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠滋养细胞(TM4细胞，如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如Mather等，Annals NY Acad.Sci.383：44-68(1982)中所描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，例如YO、NSO和Sp2/O。有关适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，N.J.)，pp.255-268(2003)。
可以通过使用筛选方法和/或诱变方法获得具有pH依赖性特征的抗体，例如，如WO2009/125825中所述。筛选方法可以包括在对特定抗原特异的抗体群体中鉴定具有pH依赖性结合特征的抗体的任何过程。在某些实施方案中，筛选方法可以包括在酸性pH和中性pH下测量初始抗体群体中单个抗体的一个或多个结合参数(例如KD或kd)。可以使用例如表面等离子共振或允许定量或定性评估抗体与特定抗原的结合特性的任何其他分析方法来测量抗体的结合参数。在某些实施方案中，筛选方法可以包括鉴定以2或更大的酸性KD/中性KD比值结合抗原的抗体。或者，筛选方法可以包括鉴定以2或更大的酸性kd/中性kd的比值结合抗原的抗体。
在另一个实施方案中，诱变方法包括在抗体的重链和/或轻链内掺入氨基酸的缺失、置换或添加，以增强抗体与抗原的pH依赖性结合。在某些实施方案中，诱变在抗体的一个或多个可变结构域内进行，例如在一个或多个HVR(例如CDR)内进行。例如，诱变包括用另一种氨基酸置换抗体的一个或多个HVR(例如，CDR)内的氨基酸。在某些实施方案中，诱变包括用组氨酸置换抗体的至少一个HVR(例如，CDR)中的一个或多个氨基酸。在某些实施方案中，“增强的pH依赖性结合”是指抗体的突变形式比诱变前抗体的原始“亲本”(即，较小的pH依赖性)形式表现出更大的酸性KD/中性KD比值，或更大的酸性kd/中性kd比值。在某些实施方案中，抗体的突变形式具有2或更大的酸性KD/中性KD比值。或者，抗体的突变形式具有2或更大的酸性kd/中性kd比值。
多克隆抗体优选地通过相关抗原和佐剂的多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射在动物中产生。使用双功能或衍生剂(例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基)将相关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可能是有用的。
动物(通常是非人类哺乳动物)通过将例如100微克或5微克蛋白质或缀合物(分别用于兔子或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂组合来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物进行免疫，并在多个部位皮内注射溶液。一个月后，通过在多个部位皮下注射，用弗氏完全佐剂中1/5至1/10的原始量的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7至14天后，将动物放血并测定血清的抗体滴度。动物被加强直到滴度稳定期。优选地，动物用相同抗原的缀合物加强，但缀合到不同的蛋白质和/或通过不同的交联剂。缀合物也可以在重组细胞培养物中制成蛋白质融合物。此外，凝集剂如明矾也适用于增强免疫反应。
单克隆抗体获自基本上均质的抗体群体，即，构成该群体的个体抗体是相同的，除了可能存在的少量天然突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。
例如，可以使用由Kohler等，Nature 256(5517)：495-497(1975)首次描述的杂交瘤方法制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物，例如仓鼠，以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。
免疫剂通常包括抗原蛋白或其融合变体。通常，如果需要人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(PBL)，如果需要非人类哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press(1986)，pp.59-103)。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，该培养基优选地含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常会包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们是阻止HGPRT-缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定地高水平产生抗体并且对培养基(如HAT培养基)敏感的细胞。其中，优选的是鼠骨髓瘤系，例如源自美国加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA)的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，以及SP-2细胞(及其衍生物，例如，X63-Ag8-653)可从美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia USA)获得。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于生产人单克隆抗体(Kozbor等J.Immunol.133(6)：3001-3005(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.51-63(1987))。
对于针对抗原的单克隆抗体的产生，测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外结合测定来确定，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。这样的技术和测定是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson，Anal.Biochem.107(1)：220-239(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序将克隆亚克隆并通过标准方法(Goding，同上)生长。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内作为肿瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规的免疫球蛋白纯化程序例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析适当地从培养基、腹水或血清中分离。
III.测定
本文提供的抗Cls抗体可以通过本领域已知的各种测定来鉴定、筛选或表征它们的物理/化学性质和/或生物学活性。
A.结合测定和其他测定
一方面，测试本发明抗体的抗原结合活性，例如通过已知方法如ELISA、蛋白质印迹等。
在另一方面，竞争测定可用于鉴定与本文所述的任何抗Cls抗体竞争结合Cls的抗体，或鉴定与本文所述的任何抗Cls抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，当这种竞争性抗体过量存在时，它阻断(例如，减少)参考抗体与Cls的结合至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多。在某些实施方案中，这样的竞争性抗体结合与本文所述的任何抗Cls抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，在Methods in MolecularBiology卷66(Humana Press，Totowa，NJ)中提供了映射了抗体结合的表位的详细示例性方法。在某些实施方案中，这样的竞争测定可以在中性pH条件下进行。在一些实施方案中，竞争测定是使用例如Octet(注册商标)系统的串联竞争测定。
在示例性竞争测定中，固定的Cls在溶液中温育，该溶液包含与Cl结合的第一标记抗体(例如，本文所述的抗体之一)和第二未标记抗体，测试所述第二未标记抗体与第一抗体竞争结合Cls的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，固定的Cls在溶液中温育，该溶液包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体。在允许第一抗体与Cls结合的条件下温育后，去除多余的未结合抗体，并测量与固定的Cls相关的标记量。如果与对照样品相比，测试样品中与固定Cls相关的标记量显著减少，则表明第二抗体正在与第一抗体竞争与Cls的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
在另一方面，与本文提供的抗Cls抗体结合相同表位或与本文提供的抗Cls抗体竞争结合Cls的抗体可使用夹心测定法鉴定。夹心测定法涉及使用两种抗体，每种都能够结合待检测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定中，测试样品分析物与第一抗体结合，所述第一抗体固定在固体支持物，随后第二抗体与分析物结合，从而形成不溶性三部分复合物。参见David&Greene，美国专利号4,376,110。第二抗体本身可以用可检测部分标记(直接夹心测定)或可以使用用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，一种夹心测定是ELISA测定法，在这种情况下，可检测部分是酶。与本文提供的抗Cls抗体同时结合Cls的抗体可被确定为结合与抗Cls抗体不同的表位的抗体。因此，可以将不与本文提供的抗Cls抗体同时结合Cls的抗体确定为与抗Cls抗体结合相同表位或与抗Cls抗体竞争结合Cls的抗体。
B.活性测定
一方面，提供了用于鉴定抗Cls抗体具有生物学活性的测定法。生物学活性可以包括阻断经典途径的激活和由所述途径的激活引起的切割产物C2a、C2b、C3a、C3b、C4a、C4b、C5a和C5b的产生。还提供了在体内和/或体外具有这种生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，测试本发明的抗体的此类生物学活性。在一些实施方案中，可以评估本发明的抗体抑制补体介导的绵羊红细胞(RBC)溶血的能力，所述绵羊红细胞(RBC)已经被针对绵羊RBC抗原的抗体敏化，即使用RBC测定。在一些实施方案中，可以评估本发明的抗体抑制补体介导的鸡红细胞(cRBC)溶血的能力，所述鸡红细胞已被针对cRBC抗原的抗体致敏。使用人血清作为补体蛋白的来源，本发明的抗体的活性可以通过用分光光度法测量释放的血红蛋白的量来确定。
RBC测定可以使用已知方法适当地进行，例如J.Vis.Exp.2010；(37)：1923中公开的方法。该文介绍了如何进行50％溶血补体(CH50)测定作为RBC裂解测定。简而言之，该测定法测量经典补体途径的激活，并检测该途径任何成分的减少、缺失或失活。它评估血清中补体组分溶解红细胞的活性。当抗体与测试血清温育时，该途径被激活并引起溶血。如果经典途径的一种或多种组分减少，则CH50值会降低。CH50测定与本文实施例中使用的测定不完全相同，CH50测定测量补体组分对细胞溶解的抑制百分比；然而，构思和基本设置与本发明基本相同。在实施方案中，RBC测定如下进行。人血清与目的抗体预温育(例如，在37摄氏度(℃)下温育3小时)。然后将血清添加到等体积的致敏绵羊红细胞中并温育(例如，在37℃下1小时)以使红细胞溶解。然后停止反应。离心该混合物以沉淀未裂解的细胞，取出上清液，用415nm的吸光度(OD)减去630nm的OD，用于分析血红蛋白的释放。为了计算红细胞裂解的抑制百分比，0％抑制设置为不添加抗体(仅缓冲液)的条件，100％抑制设置为添加终浓度为5mM的EDTA的条件(参见，例如，实施例7)。当抗体显示出对红细胞裂解的抑制百分比时，这意味着该抗体对人血清补体具有中和活性，例如，具有抑制Clq和Clr2s2复合物之间相互作用的活性。
因此，RBC测定可用于评估抗体对人血清补体的中和活性，以评估抑制Clq和Clr2s2复合物之间相互作用的活性。在实施方案中，本发明提供了分离的抗体，其抑制Clq和Clr2s2复合物之间的相互作用，其中该抗体在RBC测定中对人血清补体具有至少70％的中和活性。
C.免疫原性潜力评估
如WO2018/124005(Kubo C.等)中所述，抗体的免疫原性潜力通过使用表现出活跃增殖之前分泌IL-2的CD4+T细胞的比例作为指标来评估。具体而言，CD8-CD25low PBMC(外周血单个核细胞)由人PBMC制备，在抗体存在下培养67小时。
IV.免疫缀合物
本发明还提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含与一种或多种细胞毒剂如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合的本文中的抗Cls抗体。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235)B1)；澳瑞他汀，例如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；尾海兔素；刺孢霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；和Lode等，Cancer Res.58：2925-2928(1998)；蒽环类，例如道诺霉素或多柔比星(参见Kratz等，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov et al.，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等，Bioorg.&Med.Chem.Letters12：1529-1532(2002)；King等，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地新；紫杉烷，例如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛(1arotaxel)、替西他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合的如本文所述的抗体以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32p、212Pb和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如Tc-99m或123I，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如又如碘123、碘131、铟111、氟19、碳13、氮15、氧17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己基-1-羧酸盐(SMCC)、亚氨基噻吩(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(如己二亚胺酸二甲酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种示例性螯合剂，用于将放射性核素缀合至抗体。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等，Cancer Res.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，所述交联剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其是可商购的(例如，来自美国伊利诺伊州罗克福德的Pierce Biotechnology，Inc.)。
V.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何抗Cls抗体可用于检测生物样品中Cls的存在。如本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织，例如血清、全血、血浆、活检样品、组织样品、细胞悬液、唾液、痰液、口腔液、脑脊液、羊水、腹水、乳汁、初乳、乳腺分泌物、淋巴液、尿液、汗液、泪液、胃液、滑液、腹膜液、晶状体液或粘液。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法的抗Cls抗体。在另一方面，提供了检测生物样品中Cls存在的方法。在某些实施方案中，方法包括在允许抗Cls抗体与Cls结合的条件下使生物样品与如本文所述的抗Cls抗体接触，并检测抗Cls抗体和Cls之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗Cls抗体用于选择适合用抗Cls抗体治疗的受试者，例如其中Cls是用于选择患者的生物标志物。
可使用本发明的抗体诊断的示例性病症包括但不限于年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、过敏性反应、嗜银粒性痴呆、关节炎(例如，类风湿性关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、非典型溶血性尿毒症综合征、自身免疫性疾病、巴-西(Barraquer-Simons)综合征、白塞氏病、英国型淀粉样血管病、大疱性类天疱疮、血栓闭塞性脉管炎、Clq肾病、癌症、灾难性抗磷脂综合征、脑淀粉样血管病、冷凝集素病、皮质基底节变性、克雅氏病、克罗恩病、冷球蛋白血症性血管炎、拳击员痴呆、路易体痴呆(DLB)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、盘状红斑狼疮、唐氏综合征、局灶节段性肾小球硬化、形式思维障碍、额颞叶痴呆(FTD)、与17号染色体相关的帕金森综合征的额颞叶痴呆、额颞叶变性、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、吉兰-巴雷(Guillain-Barre)综合征、Hallervorden-Spatz病、溶血性尿毒症综合征、遗传性血管性水肿、低磷酸血症(hypophosphastasis)、特发性肺炎综合征、免疫复合物疾病、包涵体肌炎、传染病(例如，由细菌(例如，脑膜炎奈瑟菌或链球菌)、病毒(例如，人类免疫缺陷病毒(HIV))或其他传染性剂引起的疾病)、炎症性疾病、缺血/再灌注损伤、轻度认知障碍、免疫血小板减少性紫癜(ITP)、钼辅因子缺乏症(MoCD)A型、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)I、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)II(致密沉积物病)、膜性肾炎、多发梗塞性痴呆、狼疮(例如，系统性红斑狼疮(SLE))、肾小球性肾炎、川崎病、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩、重症肌无力、心肌梗塞、强直性营养不良、视神经脊髓炎、尼曼-皮克病C型、非瓜马尼亚运动神经元病伴神经原纤维缠结、帕金森病、帕金森病伴痴呆、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、寻常型天疱疮、皮克氏病、脑炎后帕金森病、多发性肌炎、朊蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质过多症、进行性核上性麻痹、银屑病、败血症、志贺毒素大肠杆菌(STEC)-HuS、脊髓性肌萎缩、中风、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆、移植排斥反应、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、韦格纳氏肉芽肿病、镰状细胞病、冷球蛋白血症、混合型冷球蛋白血症、原发性混合型冷球蛋白血症、II型混合型冷球蛋白血症、III型混合型冷球蛋白血症、肾炎、药物诱导的血小板减少症、狼疮性肾炎、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、迟发性溶血性输血反应、低补体性荨麻疹性血管炎综合征、假晶状体大疱性角膜病和血小板难治性。
在某些实施方案中，提供了标记的抗Cls抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及例如，通过酶反应或分子相互作用间接检测的部分，例如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰基、伞形酮、萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、与使用过氧化氢氧化染料前体的酶结合的那些(如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、噬菌体标记、稳定的自由基等等。
VI.药物制剂
本文所述的抗Cls抗体的药物制剂通过将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合以冻干制剂或水溶液的形式来制备。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX(注册商标)，Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文的制剂还可以包含多于一种活性成分，如果需要用于治疗特定适应症，优选地那些具有互补活性且不会相互产生不利影响的活性成分。例如，可能需要进一步提供用于联合治疗的制剂。这样的活性成分可能以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，在胶体药物递送系统(例如脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质是成形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地实现，例如通过无菌过滤膜过滤。
VII.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗Cls抗体可用于治疗方法。
一方面，提供了用作药物的抗Cls抗体。在其他方面，提供了用于治疗补体介导的疾病或病症的抗Cls抗体。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的抗Cls抗体。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患有补体介导的疾病或病症的个体的方法中的抗Cls抗体，所述方法包括对个体施用有效量的抗Cls抗体。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。
在进一步的实施方案中，本发明提供了用于治疗补体介导的疾病或病症的抗Cls抗体。在进一步的实施方案中，抗Cls抗体可用于增强Cls从血浆中的清除。在进一步的实施方案中，抗Cls抗体可用于增强Clr2s2从血浆中的清除。在进一步的实施方案中，抗Cls抗体可用于增强Clr2s2从血浆中的清除而不是Clq从血浆中的清除。在某些情况下，抗体会抑制经典补体途径的组分；在某些情况下，经典补体途径组分是Cls。在某些实施方案中，本发明提供了抗Cls抗体，其用于治疗补体介导的疾病或病症的方法中。在某些实施方案中，本发明提供了抗Cls抗体，其用于提高Cls从血浆中的清除的方法中。在某些实施方案中，本发明提供了抗Cls抗体，其用于增强Clr2s2从血浆中的清除的方法中。在某些实施方案中，本发明提供了抗Cls抗体，其用于增强Clr2s2从血浆中的清除而不是Clq从血浆中的清除的方法中。在某些实施方案中，本发明提供了抗Cls抗体，其用于抑制经典补体途径的组分的方法中；在一些情况下，经典补体途径组分是Cls。根据任何上述实施方案的“个体”优选地是人。
在一个方面，本公开提供了调节补体活化的方法。在一些实施方案中，该方法抑制补体活化，例如减少C4b2a的产生。在一些实施方案中，本公开提供了在患有补体介导的疾病或病症的个体中调节补体活化的方法，该方法包括向个体施用本公开的抗Cls抗体或本公开的药物组合物，其中所述药物组合物包含本公开的抗Cls抗体。在一些实施方案中，这种方法抑制补体活化。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，个体是人。可以通过本领域技术人员已知的任何途径施用，包括本文公开的那些。在一些实施方案中，施用是静脉内或皮下。在一些实施方案中，施用是鞘内的。
补体介导的疾病或病症是以个体的细胞、组织或体液中补体Cls量异常或补体Cls蛋白水解活性异常水平为特征的病症。
在一些情况下，补体介导的疾病或病症的特征在于细胞、组织或体液中存在升高的(高于正常)量的Cls或升高水平的补体Cls活性。例如，在一些情况下，补体介导的疾病或病症的特征在于脑组织和/或脑脊液中存在升高量和/或升高活性的Cls。细胞、组织或体液中Cls的“高于正常”量表示细胞、组织或体液中Cls的量高于正常对照水平，例如高于同一年龄组的个体或个体群体正常对照水平。细胞、组织或体液中Cls活性的“高于正常”水平表明细胞、组织或体液中通过Cls起作用的蛋白水解切割高于正常对照水平，例如高于同一年龄组的个体或个体群体的正常对照水平。在一些情况下，患有补体介导的疾病或病症的个体表现出此类疾病或病症的一种或多种另外的症状。
在其他情况下，补体介导的疾病或病症的特征在于在细胞、组织或体液中存在低于正常量的Cls或具有较低水平的补体Cls活性。例如，在一些情况下，补体介导的疾病或病症的特征在于脑组织和/或脑脊液中存在较低量和/或较低活性的Cls。细胞、组织或体液中Cls的“低于正常”量表示细胞、组织或体液中Cls的量低于正常对照水平，例如低于同一年龄组的个体或个体群体的正常对照水平。细胞、组织或体液中Cls活性的“低于正常”水平表明细胞、组织或体液中通过Cls起作用的蛋白水解切割低于正常对照水平，例如低于同一年龄组的个体或个体群体的正常对照水平。在一些情况下，患有补体介导的疾病或病症的个体表现出此类疾病或病症的一种或多种另外的症状。
补体介导的疾病或病症是其中补体Cls的量或活性使得其在个体中引起疾病或病症的疾病或病症。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症选自由自身免疫疾病、癌症、血液病、传染病、炎症性疾病、缺血-再灌注损伤、神经退行性疾病、神经退行性病症、眼部疾病、肾病、移植排斥反应、血管疾病和血管炎疾病组成的组。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是自身免疫疾病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是传染病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是炎症性疾病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是血液病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是缺血-再灌注损伤。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是眼部疾病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是肾病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是移植排斥。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是抗体介导的移植排斥。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是血管疾病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是血管炎病症。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是神经退行性疾病或病症。在一些实施方案中，补体介导的疾病是神经退行性疾病。在一些实施方案中，补体介导的病症是神经退行性病症。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是tau蛋白病。
补体介导的疾病或病症的实例包括但不限于年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、过敏性反应、嗜银粒性痴呆、关节炎(例如，类风湿性关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、非典型溶血性尿毒症综合征、自身免疫疾病、巴-西(Barraquer-Simons)综合征、白塞氏病、英国型淀粉样血管病、大疱性类天疱疮、血栓闭塞性脉管炎、Clq肾病、癌症、灾难性抗磷脂综合征、脑淀粉样血管病、冷凝集素病、皮质基底节变性、克雅氏病、克罗恩病、冷球蛋白血症性血管炎、拳击员痴呆、路易体痴呆(DLB)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、盘状红斑狼疮、唐氏综合征、局灶节段性肾小球硬化、形式思维障碍、额颞叶痴呆(FTD)、与17号染色体相关的帕金森综合征的额颞叶痴呆、额颞叶变性、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、吉兰-巴雷(Guillain-Barre)综合征、Hallervorden-Spatz病、溶血性尿毒症综合征、遗传性血管性水肿、低磷酸血症(hypophosphastasis)、特发性肺炎综合征、免疫复合物疾病、包涵体肌炎、传染病(例如，由细菌(例如，脑膜炎奈瑟菌或链球菌)病毒(例如，人类免疫缺陷病毒(HIV))或其他感染因子引起的疾病、炎症性疾病、缺血/再灌注损伤、轻度认知障碍、免疫血小板减少性紫癜(ITP)、钼辅因子缺乏(MoCD)A型、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)I、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)II(致密沉积物病)、膜性肾炎、多发梗塞性痴呆、狼疮(例如，系统性红斑狼疮(SLE))、肾小球性肾炎、川崎病、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩、重症肌无力、心肌梗塞、强直性营养不良、视神经脊髓炎、C型尼曼-匹克病、非瓜马尼亚运动神经元病伴有神经原纤维缠结、帕金森病、帕金森病伴痴呆、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、寻常型天疱疮、皮克氏病、脑炎后帕金森病、多发性肌炎、朊蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质过多症、进行性核上性麻痹、银屑病、败血症、志贺毒素大肠杆菌(STEC)-HuS、脊髓性肌萎缩、中风、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆、移植排斥反应、血管炎(例如ANCA相关血管炎)、韦格纳氏肉芽肿病、镰状细胞病、冷球蛋白血症、混合型冷球蛋白血症、原发性混合型冷球蛋白血症、II型混合型冷球蛋白血症、III型混合型冷球蛋白血症、肾炎、药物诱导的血小板减少症、狼疮性肾炎、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、迟发性溶血性输血反应、低补体性荨麻疹性血管炎综合征、假晶状体大疱性角膜病和血小板难治性。
阿尔茨海默病和某些形式的额颞叶痴呆(皮克氏病、散发性额颞叶痴呆和与17号染色体相关的帕金森症额颞叶痴呆)是最常见的tau蛋白病形式。据此，本发明涉及如上所述的任何方法，其中所述tau蛋白病是阿尔茨海默病、皮克氏病、散发性额颞叶痴呆和与17号染色体相关的帕金森症的额颞叶痴呆。其他tau蛋白病包括但不限于进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)和亚急性硬化性全脑炎。
神经退行性tau蛋白病包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森-痴呆综合征、嗜银粒性痴呆、英国型淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底节变性、克雅氏病、拳击员痴呆、弥漫性神经纤维缠结伴钙化、唐氏综合征、额颞叶痴呆、与17号染色体相关的额颞叶痴呆伴帕金森病、额颞叶变性、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallervorden-Spatz病、包涵体肌炎、多系统萎缩、强直性肌营养不良、C型尼曼-皮克病、非瓜马尼亚运动神经元病伴神经原纤维缠结、皮克氏病、脑炎后帕金森病、朊蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质过多症、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆、多发性脑梗死性痴呆、缺血性中风、慢性外伤性脑病(CTE)、创伤性脑损伤(TBI)和中风。
本公开还提供了治疗突触核蛋白病，例如帕金森病(PD)；路易体痴呆(DLB)；多系统萎缩(MSA)等的方法。例如，患有痴呆症的PD(PDD)可使用本公开的方法进行治疗。
在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症包括阿尔茨海默病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症包括帕金森病。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症包括移植排斥。在一些实施方案中，补体介导的疾病或病症是抗体介导的移植排斥。
在一些实施方案中，本公开的抗Cls抗体预防或延迟个体中补体介导的疾病或病症的至少一种症状的发作。在一些实施方案中，本公开的抗Cls抗体减少或消除个体中补体介导的疾病或病症的至少一种症状。症状的实例包括但不限于与自身免疫病、癌症、血液病、传染病、炎症性疾病、缺血-再灌注损伤、神经退行性疾病、神经退行性病症、肾病、移植排斥、眼部疾病、血管疾病或血管炎相关的症状。症状可以是神经症状，例如认知功能受损、记忆受损、运动功能丧失等。症状还可以是个体细胞、组织或体液中Cls蛋白的活性。症状还可以是个体的细胞、组织或体液中补体活化的程度。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体调节个体的细胞、组织或体液中的补体活化。在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体抑制个体的细胞、组织或体液中的补体活化。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的补体活化相比，本公开的抗Cls抗体抑制个体中的补体活化至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约与70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，本公开的抗Cls抗体减少C3在红细胞上的沉积；例如，在一些实施方案中，本公开的抗Cls抗体减少C3b、iC3b等在RBC上的沉积。在一些实施方案中，本公开的抗Cls抗体抑制补体介导的红细胞溶解。
在一些实施方案中，本公开的抗Cls抗体减少C3在血小板上的沉积；例如，在一些实施方案中，本公开的抗Cls抗体减少C3b、iC3b等在血小板上的沉积。
在一些实施方案中，施用本公开的抗Cls抗体导致选自由以下组成的组的结果：(a)补体活化减少；(b)认知功能改善；(c)神经元丢失减少；(d)神经元中磷酸化Tau水平降低；(e)神经胶质细胞活化减少；(f)淋巴细胞浸润减少；(g)巨噬细胞浸润减少；(h)抗体沉积减少，(i)神经胶质细胞损失减少；(j)少突胶质细胞损失减少；(k)树突状细胞浸润减少；(l)中性粒细胞浸润减少；(m)红细胞溶解减少；(n)红细胞吞噬作用减少；(o)血小板吞噬作用减少；(p)血小板溶解减少；(q)移植物存活率的提高；(r)巨噬细胞介导的吞噬作用的减少；(s)视力的改善；(t)运动控制的改善；(u)血栓形成的改善；(v)凝血的改善；(w)肾功能的改善；(x)抗体介导的补体活化减少；(y)自身抗体介导的补体活化减少；(z)贫血改善；(aa)脱髓鞘减少；(ab)嗜酸性粒细胞增多的减少；(ac)C3在红细胞上的沉积减少(例如，C3b、iC3b等在红细胞上的沉积减少)；和(ad)C3在血小板上的沉积减少(例如C3b、iC3b等在血小板上的沉积减少)；和(ae)过敏毒素的产生减少；(af)自身抗体介导的水疱形成减少；(ag)自身抗体引起的瘙痒减少；(ah)自身抗体引起的红斑减少；(ai)自身抗体介导的皮肤糜烂减少；(aj)因输血反应导致的红细胞破坏减少；(ak)因同种抗体导致的红细胞溶解减少；(al)因输血反应导致的溶血减少；(am)同种抗体介导的血小板溶解减少；(an)因输血反应导致的血小板溶解减少；(ao)肥大细胞活化减少；(ap)肥大细胞组胺释放减少；(aq)血管通透性降低；(ar)水肿减少；(as)移植物内皮上的补体沉积减少；(at)移植物内皮中过敏毒素的产生减少；(au)真皮-表皮连接处的分离减少；(av)真皮-表皮连接处过敏毒素的产生减少；(aw)在移植物内皮中同种抗体介导的补体活化减少；(ax)抗体介导的神经肌肉接点丧失的减少；(ay)神经肌肉接点处补体活化减少；(az)神经肌肉接点处过敏毒素生成减少；(ba)神经肌肉接点处补体沉积减少；(bb)麻痹减少；(be)麻木减少；(bd)膀胱控制增加；(be)肠道控制增加；(bf)与自身抗体相关的死亡率降低；和(bg)与自身抗体相关的发病率降低。
在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的结果的水平或程度相比，本公开的抗Cls抗体有效地实现以下结果的一个或多个降低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约与70％、至少约80％、至少约90％或超过90％：(a)补体活化；(b)认知功能下降；(c)神经元丢失；(d)神经元中的磷酸化Tau水平；(e)神经胶质细胞活化；(f)淋巴细胞浸润；(g)巨噬细胞浸润；(h)抗体沉积，(i)神经胶质细胞丢失；(j)少突胶质细胞丢失；(k)树突状细胞浸润；(l)中性粒细胞浸润；(m)红细胞溶解；(n)红细胞吞噬作用；(o)血小板吞噬作用；(p)血小板溶解；(q)移植物排斥；(r)巨噬细胞介导的吞噬作用；(s)视力丧失；(t)抗体介导的补体活化；(u)自身抗体介导的补体活化；(v)脱髓鞘；(w)嗜酸性粒细胞增多。
在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的结果的水平或程度相比，本公开的抗Cls抗体有效地实现改善以下结果的一个或多个至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约与70％、至少约80％、至少约90％或超过90％：a)认知功能；b)移植物存活率；c)视力；d)运动控制；e)血栓形成；f)凝血；g)肾功能；和h)血细胞比容(红细胞计数)。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体降低个体中的补体活化。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的补体活化相比，本公开的抗Cls抗体降低个体中的补体活化至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约与70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体改善个体的认知功能。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗前个体的认知功能相比，本公开的抗Cls抗体改善个体的认知功能至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体降低个体认知功能下降的速率。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗前个体的认知功能下降的速率相比，本公开的抗Cls抗体降低个体认知功能下降的速率至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体降低个体中的神经元丢失。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的神经元丢失相比，本公开的抗Cls抗体降低个体中的神经元丢失至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约与70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体降低个体中的磷酸化Tau水平。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗前个体的磷酸化Tau水平相比，本公开的抗Cls抗体降低个体的磷酸化Tau至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体降低个体中的胶质细胞活化。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的胶质细胞活化相比，本公开的抗Cls抗体降低个体中的胶质细胞活化至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。在一些实施方案中，胶质细胞是星形胶质细胞或小胶质细胞。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体降低个体中的淋巴细胞浸润。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的淋巴细胞浸润相比，本公开的抗Cls抗体降低个体中的淋巴细胞浸润至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体降低个体中的巨噬细胞浸润。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的巨噬细胞浸润相比，本公开的抗Cls抗体降低个体中的巨噬细胞浸润至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cl s抗体降低个体中的抗体沉积。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗之前个体中的抗体沉积相比，本公开的抗Cls抗体降低个体中的抗体沉积至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，向个体施用本公开的抗Cls抗体降低个体中的过敏毒素(例如，C3a、C4a、C5a)的产生。例如，在一些实施方案中，当以一个或多个剂量作为单一疗法或联合疗法向患有补体介导的疾病或病症的个体施用时，与用抗Cls抗体治疗前个体的过敏毒素的产生相比，本公开的抗Cls抗体降低个体的过敏毒素的产生至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％。
在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体或包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物用于治疗患有补体介导的疾病或病症的个体的用途。在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体在治疗患有补体介导的疾病或病症的个体中的用途。在一些实施方案中，本公开提供了包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物在治疗患有补体介导的疾病或病症的个体中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体在制备用于治疗患有补体介导的疾病或病症的个体的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体或包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物用于抑制补体活化的用途。在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体或包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物在抑制患有补体介导的疾病或病症的个体中的补体活化的用途。在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体在患有补体介导的疾病或病症的个体中抑制补体活化的用途。在一些实施方案中，本公开提供了包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物在患有补体介导的疾病或病症的个体中抑制补体活化的用途。
在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体在制备用于调节补体活化的药物中的用途。在一些实施方案中，药物抑制补体活化。在一些实施方案中，药物抑制患有补体介导的疾病或病症的个体中的补体活化。
在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体或包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物用于医学治疗。在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体用于医学治疗。在一些实施方案中，本公开提供了包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，用于医学治疗。
在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体或包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，用于治疗患有补体介导的疾病或病症的个体。在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体，用于治疗患有补体介导的疾病或病症的个体。在一些实施方案中，本公开提供了包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，用于治疗患有补体介导的疾病或病症的个体。
在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体或包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，用于调节补体活化。在一些实施方案中，本公开提供了本公开的抗Cls抗体，用于调节补体活化。在一些实施方案中，本公开提供了包含本公开的抗Cls抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，用于调节补体活化。在一些实施方案中，抗Cls抗体抑制补体活化。
在另一方面，本发明提供抗Cls抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗补体介导的疾病或病症。在进一步的实施方案中，该药物用于治疗补体介导的疾病或病症的方法中，包括向患有补体介导的疾病或病症的个体施用有效量的药物。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。在进一步的实施方案中，该药物用于增强Cls从血浆中的清除(或去除)。在进一步的实施方案中，该药物用于增强Clr2s2从血浆中的清除(或去除)。在进一步的实施方案中，该药物用于增强Clr2s2从血浆中的清除(或去除)而不是Clq从血浆中的清除(或去除)。在进一步的实施方案中，该药物用于抑制经典补体途径的成分；在一些情况下，经典补体途径成分是Cls。
在进一步的实施方案中，该药物用于治疗患有补体介导的疾病或病症的个体的方法中，包括向个体施用有效量的药物。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在进一步的方面，本发明提供了治疗补体介导的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，该方法向患有这种补体介导的疾病或病症的个体施用有效量的抗Cls抗体。在一个这样的实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在进一步的方面，本发明提供了增强Cls从个体血浆中的清除(或去除)的方法。在进一步的方面，本发明提供了增强Clr2s2从个体血浆中的清除(或去除)的方法。在另一方面，本发明提供了增强Clr2s2从血浆中的清除(或去除)而不是Clq从个体血浆中的清除(或去除)的方法。在一些情况下，本发明提供了抑制个体中的经典补体途径中组分的方法；在一些情况下，经典补体途径组分是Cls。在一个实施方案中，“个体”是人。
在进一步的方面，本发明提供了包含本文提供的任何抗Cls抗体的药物制剂，例如，用于任何上述治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包括本文提供的任何抗Cls抗体和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包括本文提供的任何抗Cls抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。
本发明的抗体可以单独使用或与治疗中的其他试剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
上述的此类联合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在相同或单独的制剂中)和单独施用，在这种情况下，本发明的抗体的施用可以在另外的一种或多种治疗剂的施用之前、同时和/或随后。在一个实施方案中，抗Cls抗体的施用和另外的治疗剂的施用发生在彼此的约一个月内，或约一、二或三周内，或约一、二、三、四、五或六天内。本发明的抗体也可以与放射疗法联合使用。
本发明的抗体(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，可以在病灶内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文中设想了包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注的各种给药方案。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的特定病症、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、试剂的递送部位、施用方法、施用时间安排，以及医生已知的其他因素。抗体不需要但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的试剂一起配制。此类其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体量、病症或治疗的类型以及上述其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％，或以通过经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
对于疾病的预防或治疗，本发明抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体类型、疾病的严重程度和病程，抗体是用于预防还是治疗目的，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医师的判断。抗体适合一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于施用至患者的初始候选剂量，无论是例如，通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。取决于上述因素，一种典型的每日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复施用，取决于病情，治疗通常会持续到出现所需的疾病症状的抑制。抗体的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20剂，或例如约6剂抗体)。可以施用初始较高负荷剂量，随后施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定来监测。
应当理解，任何上述制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物代替抗Cls抗体或除了抗Cls抗体之外进行。
VIII.制品
在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述疾病的材料的制品。制品包括容器和容器上的标签或与容器相关的包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料制成。容器容纳组合物，该组合物本身或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一种组合物组合，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性成分是本发明的抗体。标签或包装插页表明该组合物用于治疗所选择的病症。此外，该制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，所述组合物含有进一步的细胞毒性或其他治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可进一步包括包装插页，所述包装插页说明该组合物可用于治疗特定病症。或者或另外地，制品可进一步包括第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户角度看需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
应当理解，任何上述制品可以包括本发明的免疫缀合物来代替抗Cls抗体或除了抗Cls抗体之外。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上面提供的大体描述，可以实践各种其他实施例。
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是这些描述和示例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用明确纳入其全部内容。
实施例1
重组Clr2s2的制备
1.1.食蟹猴Clr2s2 His/FLAG(注册商标)四聚体的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：具有C末端GGGGS接头和FLAG(注册商标)标签(SEQ IDNO：29)的食蟹猴Cls和具有C末端GGGGS接头和8x组氨酸标签的食蟹猴Clr。食蟹猴Clr序列具有R463Q S654A突变(SEQ ID NO：30)。对于重组食蟹猴Clr2s2 His/FLAG(注册商标)四聚体的表达，使用FreeStyle(注册商标)293-F细胞系(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA))瞬时共表达食蟹猴Cls-FLAG(注册商标)和食蟹猴Clr-His。将表达重组食蟹猴Clr2s2 His/FLAG(注册商标)四聚体的条件培养基应用于抗FLAG(注册商标)M2亲和树脂(Sigma)，并用FLAG(注册商标)肽(Sigma)洗脱。将含有重组食蟹猴Clr2s2 His/FLAG(注册商标)四聚体的级分进行IMAC柱(GE Healthcare)，并用咪唑梯度洗脱。收集、浓缩含有重组Clr2s2 His/FLAG(注册商标)四聚体的洗脱级分，随后使其经受用1X TBS、2mM CaCl2缓冲液平衡的Superdex(注册商标)200凝胶过滤柱(GE Healthcare)。然后将含有重组食蟹猴Clr2s2His/FLAG(注册商标)的级分合并、浓缩并储存在-80℃。
1.2.人Clr2s2四聚体的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：人Cls(NCBI参考序列：NP_958850.1)(SEQ ID NO：31)和人Clr(NCBI参考序列：NP_001724.3)。人Clr序列具有R463Q S654A突变(SEQ ID NO：32)。对于重组人Clr2s2四聚体的表达，使用HEK293(Expi293(注册商标))细胞系(ThermoFisher，Carlsbad，CA，USA)或FreeStyle(注册商标)293-F细胞系(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)瞬时共表达人Cls和人Clr。将表达重组人Clr2s2的条件培养基用MilliQ(注册商标)水稀释至三分之一，加入1M CaCl2至最终2mM，用1N NaOH调节pH至8，然后上样到用50mM Tris-HCl、2mM CaCl2 pH8.0的Q琼脂糖HP阴离子交换色谱柱(GE healthcare)，并用NaCl梯度洗脱。收集、浓缩含有重组人Clr2s2四聚体的洗脱级分，随后使其经受用1XTBS、2mM CaCl2缓冲液平衡的Superdex(注册商标)200凝胶过滤柱(GE Healthcare)。然后将含有重组人Clr2s2四聚体的级分合并，如果需要浓缩，并储存在-80℃。
1.3.食蟹猴Clr2s2四聚体的表达和纯化
用于表达和纯化的序列是：食蟹猴Cls(SEQ ID NO：33)和食蟹猴Clr。食蟹猴Clr序列具有R463Q S654A突变(SEQ ID NO：34)。对于重组食蟹猴Clr2s2四聚体的表达，使用HEK293(Expi293(注册商标))细胞系(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)瞬时共表达食蟹猴Cls和食蟹猴Clr。将表达重组食蟹猴Clr2s2的条件培养基用MilliQ(注册商标)水稀释至三分之一，加入0.1M CaCl2至最终2mM，用1NNaOH调节pH至8，上样至HiTrap(注册商标)Q HP阴离子交换层析柱(GE healthcare)，并用NaCl梯度洗脱。收集、浓缩含有重组人Clr2s2四聚体的洗脱级分，随后使其经受用1X TBS、2mM CaCl2缓冲液平衡的Superdex(注册商标)200凝胶过滤柱(GE Healthcare)。然后将含有重组食蟹猴Clr2s2四聚体的级分合并，并储存在-80℃。
实施例2
抗Cls抗体的制备
2.1.从COS0637cc生成和制备优化的抗体
为了降低抗体的潜在免疫原性，对一些抗Cls抗体COS0637cc(VH，SEQ ID NO：35；VL，SEQ ID NO：36，如WO2019/198807中所述)的可变区进行人源化。使用常规CDR移植方法(Nature321：522-525(1986))将抗Cls兔抗体的互补决定区(CDR)移植到同源人抗体框架(FR)上。因此产生了人源化可变区COS0637h(VH，SEQ ID NO：37；VL，SEQ ID NO：38)。
COS0637cc的CDR区的氨基酸被组氨酸全面置换。发现了一种有效的突变，即HCDR3中的K101H，并将其应用于COS0637h。产生了pH依赖性人源化抗Cls抗体COS0637temp的可变区(VH，SEQ ID NO：39；VL，SEQ ID NO：38)。
检查了许多突变和突变组合以鉴定改善先导抗体的结合特性的突变和突变组合。然后将多个突变引入COS0637temp的可变区，以增强在中性pH下与Cls(人Clr2s2或食蟹猴Clr2s2或食蟹猴Clr2s2 His/FLAG(注册商标))的结合亲和力，或降低在酸性pH降低与Cls的结合亲和力。因此，优化的变体COS0637pHv1和COS0637pHv2是从COS0637temp生成的。2种抗体的VH、VL、HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的序列ID号列于表2中。
[表2]
Figure BDA0003685714400001051
尽管产生了人源化pH依赖性抗Cls抗体，但COS0637pHv1和COS0637pHv2由于轻链中第94位和第95d位(kabat编号)的半胱氨酸而具有形成异质产物的潜在风险。为了降低异质性的风险，对COS0637temp的两个位置进行全面的单氨基酸置换，以找到保留结合能力的氨基酸。38种抗体的VH和VL的序列ID号及其突变(kabat编号)列于表3中。
[表3]
Figure BDA0003685714400001061
然而，任何具有单一氨基酸置换的变体在SPR(表面等离子共振)测定中均未显示结合反应，进行了COS0637temp的每个单一置换的组合。18种抗体的VH和VL的序列ID号及其突变(kabat编号)列于表4中。18种抗体中的三种抗体(AL0737、AL0743、AL0744)显示出轻微的结合反应。为了排除甲硫氨酸和色氨酸氧化的潜在风险，选择AL0743(包含C94Y和C95dL置换)作为模板进行进一步优化。
[表4]
Figure BDA0003685714400001071
由于AL0743的结合亲和力较弱，因此将许多突变组合引入AL0743以改善结合特性(pH7.4的亲和力和pH依赖性)。除此之外，进行了进一步的工程化以降低它们的pI低于COS0637pHv1和COS0637pHv2。因此，产生了7种工程化的抗体。其中VH、VL、HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3的序号D编号在表5-1中列出。
[表5-1]
Figure BDA0003685714400001072
合成编码VH的基因并与人IgG1重链恒定区(CH)(SG1，SEQ ID NO：107)、修饰的人IgG1 CH(例如SG1077R(SEQ ID NO：108)、TT91R(SEQ ID NO：109)和SG1148(SEQ ID NO：110))组合。合成编码VL的基因并与人CL(SK1，SEQ ID NO：111)和修饰的人CL(KOMC，SEQ IDNO：112)组合，将组合的序列的基因克隆到表达载体中。
抗体在用重链和轻链表达载体的混合物共转染的HEK293细胞中表达，并通过蛋白A纯化。如果需要，进一步进行凝胶过滤。制备的抗体名称如表5-2所列出的。AH0813-SG1在实施例5中用作测定对照。
[表5-2]
Figure BDA0003685714400001081
2.1.IPN009VH2VK3-SG1148的制备
合成了抗Cls抗体重链和轻链可变区的多核苷酸，IPN009VH2(SEQ TD NO：113)和IPN009VK3(SEQ ID NO：114)(如WO2019/098212中所述)。将重链和轻链可变区分别克隆到含有重链恒定区SG1148(SEQ ID NO：110)和轻链恒定区SK1(SEQ ID No：111)的表达载体中。
根据制造商的说明，使用Expi293(注册商标)F细胞(Life Technologies)瞬时表达抗Cls抗体IPN009VH2VK3-SG1148。用蛋白A(GE Healthcare)纯化重组抗体，并在D-PBS、Tris缓冲盐水(TBS)或His缓冲液(20mM组氨酸、150mM NaCl，pH 6.0)中洗脱。如果需要，进一步进行尺寸排阻色谱以去除高分子量和/或低分子量组分。
实施例3
抗Cls抗体的结合表征
3.1.BIACORE(注册商标)筛选COS0637temp的LCDR3中的半胱氨酸置换
使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)或BIACORE(注册商标)4000(GE Healthcare)在pH7.4、37℃下进行抗体变体与如上制备的人Clr2s2之间相互作用的分析。根据GE Healthcare推荐的设置，使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将ProL(BioVision)固定到CM4传感器芯片上。将抗体和分析物稀释到各自的运行缓冲液ACESpH7.4(20mM ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、150mM NaCl、1.2mM CaCl2、1mg/ml牛血清白蛋白BSA)、1mg/ml CMD(CM-葡聚糖钠盐)、0.05％吐温(注册商标)20(聚山梨醇酯20)、0.005w/v％NaN3)。ProL将每种抗体捕获到传感器表面。抗体捕获水平针对200个共振单位(RU)。然后，以25和100nM的浓度注射重组人Clr2s2，然后在pH 7.4下解离。使用10mM甘氨酸-HCl，pH 1.5再生表面。抗原浓度为100nM的所有抗体的传感图如图1、2和3所示。图1显示了COS0637temp的轻链中第94位(kabat编号)的单个氨基酸置换变体的传感图。图2显示了COS0637temp的轻链中第95d位(kabat编号)的单个氨基酸置换变体的传感图。图3显示了COS0637temp的轻链中第94位和第95d位(kabat编号)的双氨基酸置换变体的传感图。在三种抗体(AL0737、AL0743、AL0744)中观察到轻微的结合反应，在图3中用箭头突出显示。
3.2.使用BIACORE(注册商标)传感图评估在pH7.4和pH5.8中与Clr2s2的结合活性
pH7.4和pH5.8条件BIACORE传感图的比较
使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)在37℃下测定每个样品在pH7.4和pH 5.8下的结合特性。可以使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将纯化的小鼠抗人Igκ轻链(GE Healthcare)固定在CM5传感器芯片的所有流通池上。使用20mM ACES、150mMNaCl、1.2mM CaCl2、1mg/mL BSA(不含IgG)、1mg/mL CMD、0.05％吐温(注册商标)20、0.005％NaN3、pH 7.4或pH 5.8缓冲液作为运行缓冲液。每种抗体都可以通过抗人Ig κ轻链捕获到传感器表面上。抗体捕获水平针对50个共振单位(RU)。制备了人和食蟹猴Clr2s2，它们可以以例如800或1600nM以30微升/分钟的速度注射(对于COS0637temp-TT91R为1600nM，对于其他为800nM)。每个循环使用例如甘氨酸pH 2.0(GE Healthcare)再生传感器表面。使用BIACORE(注册商标)T200评估软件2.0版(GE Healthcare)获得传感图(图4-1至4-12)。每个传感图表示如下：实线是pH7.4的人Clr2s2，点划线是pH5.8的人Clr2s2，小虚线是pH7.4的食蟹猴Clr2s2，虚线是pH5.8的食蟹猴Clr2s2。虽然COS637cc-TT91R和COS0637h-TT91R在pH7.4和pH5.8条件下均显示出相当的结合反应，但针对pH依赖性的工程化的变体在酸性条件下显示出明显较少的结合。
3.3.使用动力学评分评估对人Clr2s2的pH依赖性结合
使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)在37℃下测定每个样品在pH7.4和pH 5.8下的KD值(解离常数)。可以使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将纯化的小鼠抗人Ig κ轻链(GE Healthcare)固定在CM5传感器芯片的所有流通池上。使用20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2、1mg/mL BSA(不含IgG)、1mg/mL CMD、0.05％吐温(注册商标)20、0.005％NaN3、pH 7.4或pH 5.8缓冲液作为运行缓冲液。每种抗体都可以通过抗人Ig κ轻链捕获到传感器表面上。抗体捕获水平针对50个共振单位(RU)。对于具有pH7.4的KD值，制备人Clr2s2，其可以在0、25、40、100、200、400nM或0、12.5、25、40、100、200nM或0、6.3、12.5、25、50、100nM，以30微升/分钟注射。对于具有pH5.8的KD值，制备人Clr2s2，其可以用例如，甘氨酸pH 2.0(GE Healthcare)以0、200、400、800、1600、3200nM或0、50、100、200、400、800nM以30微升/分钟注射。每个循环使用例如甘氨酸pH 2.0(GE Healthcare)再生传感器表面。KD值是使用BIACORE(注册商标)T200评估软件2.0版(GE Healthcare)获得的。将具有pH5.8的KD值与pH7.4KD进行比较((具有pH5.8的KD)/(具有pH7.4的KD))(表6)。如果BIACORE(注册商标)软件的质量控制结果中提到抗体的“动力学常数不能唯一地确定”并在表6中描述为ND(不可检测)，则KD值被拒绝。工程化的变体的KD(pH5.8)/KD(pH7.4)得分高于COS637cc-TT91R和COS0637h-TT91R。据描述，所有COS0637变体都比COS0637cc-TT91R具有更强的pH依赖性。
[表6]
Figure BDA0003685714400001111
＊ND：无法检测的
3.4.评价抗Cls抗体的Clq取代功能
抗体的Clq取代功能通过使用BIACORE(注册商标)T200仪器(GE Healthcare)在37摄氏度的Clr2s2捕获方法证明。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗人Clr2s2抗体IPN009VH2Vk3-SG1148固定到CM5传感器芯片上。在pH 7.4缓冲液(20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2、1mg/mL BSA(不含IgG)、1mg/mL CMD、0.05％吐温(注册商标)20，0.005％NaN3，pH 7.4)中制备抗体、重组人Clr2s2四聚体和天然人Clq(CompTech)。重组人Clr2s2四聚体首先被抗Clr2s2抗体捕获到传感器表面。捕获水平针对200个共振单位(RU)。然后，以大约100nM注射天然人Clq，然后立即以大约500nM，10微升/分钟注射抗体900秒。传感器表面在每个循环中用3M MgCl2再生。结果如图5和图6所示。传感图是使用BIACORE(注册商标)T200评估软件2.0版(GE Healthcare)获得的。传感图1(实线)描述了Clqrs在传感器表面上的稳定捕获。(″Clr2s2+Clq″)。传感图2(点划线)描述了抗体与Clqrs的结合以及Clq从Clr2s2的取代(“Clr2s2+Clq+Ab”)。传感图3(虚线)描述了抗体仅与传感器芯片表面上的Clr2s2结合(“Clr2s2+Ab”)。图5显示所有传感图“Clr2s2+Clq+Ab”、“Clr2s2+Clq+缓冲液”和“Clr2s2+Ab”。为了比较这些传感图，将Clr2s2的结合(binging)反应归一化为100RU。图6显示了“Clr2s2+Clq+Ab”和“Clr2s2+Clq+缓冲液”之间的比较结果。为了比较这些传感图，将基线(注射抗体之前)调整为0RU。
对于具有Clq取代功能的抗体，传感图2的响应单位低于传感图1中的响应单位或下降幅度大于传感图1的下降幅度。如果传感图3没有下降，则认为Ab(抗体)可以稳定地与Clr2s2结合。从图5中的传感图3，每个Ab被认为能够在没有Clq的情况下稳定地结合到Clr2s2。此外，从传感图1，在没有Ab的情况下Clq与Clr2s2稳定地结合。同时，从图6中，所有Ab的传感图2均下降。因此，所有工程化的抗体都可以将Clq从Clqrs复合体中解离。
实施例4
抗Cls抗体的等电点(pI)的估算
4.1.使用毛细管等电聚焦(cIEF)测定抗Cls抗体等电点(pI)
cIEF是在Protein Simple iCE3全毛细管成像系统上使用碳氟化合物涂层毛细管盒进行的。阳极液和阴极液溶液分别是0.1％m/v甲基纤维素(MC)中的0.08M磷酸和0.1％m/vMC中的0.1M氢氧化钠。所有分析的样品均含有0.5mg/mL工作抗体、O.3％m/v MC、6.0mMIDA(亚氨基二乙酸)、10mM精氨酸、4M尿素、pI标记物(7.65和9.77)，以及以下2％pharmalyte 8-10.5、2％pharmalyte 5-8的v/v化合物之一。在上样到自动进样器隔室之前，所有样品都经过涡旋和短暂地离心。在开始测量之前，样品在自动进样器中温育2小时。在1.5kV条件下聚焦1分钟，然后在3.0kV条件下聚焦7分钟。自动进样器隔室保持在10摄氏度。每个样品重复测量两次，通过计算n＝2次测量的平均值，得到每个样品的pI值。pI值在表7中描述。从这个表中可以看出，COS0637变体(COS0637pHv3-TT91R至COS0637pHv9-TT91R)的pI值小于COS0637pHv1-TT91R和COS0637pHv2-TT91R。
[表7]
抗体名称 pI(n＝2)
COS0637cc-TT91R 9.00
COS0637h-TT91R 9.41
COS0637temp-TT91R 9.25
COS0637pHv1-TT91R 9.21
COS0637pHv2-TT91R 9.39
COS0637pHv3-TT91R 8.71
COS0637pHv4-TT91R 8.71
COS0637pHv5-TT91R 8.52
COS0637pHv6-TT91R 8.69
COS0637pHv7-TT91R 8.72
COS0637pHv8-TT91R 8.71
COS0637pHv9-TT91R 8.78
实施例5
5.1.评估抗Cls抗体的免疫原性潜力
如WO2018/124005(Kubo C.等)中所述，抗体的免疫原性潜力通过使用表现出活性增殖之前分泌IL-2的CD4+T细胞的比例作为指标来评估。具体而言，由人PBMC制备CD8-CD25low PBMC(外周血单核细胞)，在抗体存在下培养细胞67小时。图7示出了确定培养的细胞群中分泌IL-2的细胞的比例的结果。如图7所示，COS0637系列抗体的阳性供体频率与抗体A(图7中的Ab-A)相似或略高，但与抗hA33抗体(hA33)相比较低。因此，这些抗体被认为不具有高免疫原性潜力。特别是，COS0637pHv3-TT91R、COS0637pHv5-TT91R、COS0637pHv8-TT91R和COS0637pHv9-TT91R显示出比其他抗Cls抗体变体更少的阳性供体，这表明这些变体在工程化的抗Cls抗体中具有较低的免疫原性潜力。
5.2评估抗Cls抗体诱导的免疫细胞形态变化。
基于高含量荧光图像分析评估细胞形态的动态变化，以评估细胞的生理状态。具体而言，制备CD8-CD25low PBMC，并如5.1中所述用抗体处理。用抗体培养67小时后，将PBMC固定并用Hoechst33258和抗α-微管蛋白抗体染色以分别观察细胞核和微管。通过IN细胞分析仪(注册商标)6000(GE Healthcare)获得的荧光图像在IN Cell Developer Toolbox(GEHealthcare)中进行分析。简而言之，细胞形态由细胞核和微管的图像定义。计算每个细胞的形状变化的定量标记(细胞面积和细胞周长)，并在每个孔中分析约1,000个细胞。基于用试验品处理的PBMC中细胞面积(图8-1)和细胞周长(图8-2)的平均值，通过Wilcoxon秩和检验(*p＜0.05，**p＜0.01)评估形态变化的统计显著性。如图8-1和图8-2所示，与阴性对照(无抗原)相比，AH0813-SG1、COS0637pHv1-SG1和COS0637pHv2-SG1的细胞面积和细胞周长显著扩大。相反，在包括COS0637pHv1-TT91R和COS0637pHv2-TT91R抗体的TT91R变体中未观察到细胞面积和细胞周长的增加。这些结果表明，在PBMC中，与其他抗Cls抗体变体相比，TT91R变体诱导形态变化的潜力较小。
同样关于5.1中描述的形态变化和免疫原性潜力之间的关系，显著诱导形态变化的AH0813-SG1、COS0637pHv1-SG1和COS0637pHv2-SG1显示出高免疫原性潜力(图8-3)，另一方面，不诱导形态变化的TT91R变体显示低免疫原性潜力。此外，伯考赛珠单抗(bococizumab)是一种抗PCSK9抗体(由于其高水平的免疫原性其临床试验已停止)，显示出高免疫原性潜力和显著的形态变化(数据未显示)。结合抗Cls抗体变体和伯考赛珠单抗的结果，表明免疫原性潜力水平与形态学变化程度一致。形态学变化的评估被认为有效评估免疫原性潜力和了解免疫原性机制。细胞形态的定义和形态变化的定量对于精确评估免疫细胞的形态变化至关重要。为了定义细胞形态，其他分子(例如肌动蛋白细胞骨架)能够替代细胞微管。此外，其他定量标记如形式因子和长/短轴的长度可用于定量形态变化，表明存在一些替代方法来评估形态变化，以评估免疫原性潜力。
Figure IDA0003685714450000011
Figure IDA0003685714450000021
Figure IDA0003685714450000031
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Claims (14)

1.分离的抗体，其包含抗原结合区和抗体恒定区，其中
所述抗体促进Clq从Clqrs复合体中解离和/或抑制Clq与Clr2s2结合，其中，
在通过表面等离子共振测量抗体与人和/或食蟹猴C1s的结合活性的情况下，
i)中性pH范围内的解离常数(KD)值可以可靠地计算，而酸性pH范围内的KD值由于没有结合活性或结合活性相当低而不能可靠地计算，或
ii)在中性pH范围和酸性pH范围内的KD值都可以可靠地计算的前提下，酸性pH范围内的KD值与中性pH范围内的KD值的比值，即酸性KD/中性KD比大于10。
2.权利要求1所述的抗体，其中结合活性通过表面等离子共振使用传感器芯片和运行缓冲液在37摄氏度下测量，每个抗体以50个共振单位被人Igκ轻链捕获到所述传感器芯片上，所述运行缓冲液包含20mMACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、150mM NaCl、1.2mMCaCl2、1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、1mg/mL CM-葡聚糖钠盐(CMD)、0.05％聚山梨醇酯20、0.005％NaN3。
3.权利要求1或2所述的抗体，其中抗体的pI为小于9.00、小于8.90、小于8.80或8.78或更小、以及4.28或更大。
4.权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，所述抗原结合区特异性地结合人C1s的CUB1-EGF-CUB2结构域。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，所述HVR-H1包含由AYAMN(SEQ IDNo.1)组成的氨基酸序列，所述HVR-H2包含由LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(SEQ ID No.2)组成的氨基酸序列，所述HVR-H3包含由GRSX7NYX8SX9FHL(SEQ ID No.3)组成的氨基酸序列，所述轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，所述HVR-L1包含由QAX10X11X12LHDKX13NLA(SEQ IDNo.4)组成的氨基酸序列，所述HVR-L2包含由X14ASX15X16ES(SEQ ID No.5)组成的氨基酸序列，所述HVR-L3包含由X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(SEQ ID No.6)组成的氨基酸序列，其中X1至X23中的每一个选自天然存在的氨基酸。
6.分离的抗C1s抗体，其包含重链可变区、轻链可变区和抗体恒定区，其中所述重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，所述HVR-H1包含由AYAMN(SEQ ID No.1)组成的氨基酸序列，所述HVR-H2包含由LIYGX1X2X3X4FYASWAX5X6(SEQ ID No.2)组成的氨基酸序列，所述HVR-H3包含由GRSX7NYX8SX9FHL(SEQ ID No.3)组成的氨基酸序列，所述轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，所述HVR-L1包含由QAX10X11X12LHDKX13NLA(SEQ ID No.4)组成的氨基酸序列，所述HVR-L2包含由X14ASX15X16ES(SEQ ID No.5)组成的氨基酸序列，所述HVR-L3包含由X17GEFX18X19X20X21ADX22NX23(SEQ ID No.6)组成的氨基酸序列，其中X1至X23中的每一个选自天然存在的氨基酸。
7.权利要求5或6所述的抗体，其中
X1是Lys或Ser，
X2是Gly或Lys，
X3是His或Ser，
X4是G1u或Thr，
X5是Glu或Lys，
X6是Glu或Gly，
X7是LVs或Val，
X8是Asn或Val，
X9是Asp或G1y，
X10是Asn、Gln或Ser，
X11是Gly或Gln，
X12是I1e或Ser，
X13是Lys或Arg，
X14是Gly或Gln，
X15是Gln或Thr，
X16是Leu或Arg，
X17是His或Gln，
X18是Pro或Ser，
X19是Cys或Tyr，
X20是Glu或Ser，
X21是Glu或Ser，
X22是Cys或Leu，和
X23是Gln或Thr。
8.权利要求5至7中任一项所述的抗体，其中HVR-H1包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，HVR-H2包含由SEQ ID No.8至10组成的氨基酸序列中任一项，HVR-H3包含由SEQ IDNo.11至13组成的氨基酸序列中任一项，HVR-L1包含由SEQ ID No.14至18组成的氨基酸序列中任一项，HVR-L2包含由SEQ ID No.19至22组成的氨基酸序列中任一项，并且HVR-L3包含由SEQ ID No.23至28组成的氨基酸序列中任一项。
9.权利要求5至8中任一项所述的抗体，其中HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的氨基酸序列的组合，选自由以下1)至8)组成的组；
1)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.8组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.14组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.23组成的氨基酸序列；
2)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.9组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.12组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.14组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.23组成的氨基酸序列；
3)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
4)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.16组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.21组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.25组成的氨基酸序列；
5)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.17组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.26组成的氨基酸序列；
6)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列；
7)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.19组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.27组成的氨基酸序列，和
8)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.18组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.22组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.28组成的氨基酸序列。
10.权利要求5或6所述的抗体，其中X19和/或X22不是Cys。
11.权利要求10所述的抗体，其中X19是Trp或Tyr，并且X22是Leu或Met。
12.权利要求10或11所述的抗体，其中
X1是Ser，
X2是Gly，
X3是His，
X4是Glu，
X5是Glu，
X6是Glu，
X7是Lys，
X8是Asn或Val，
X9是Asp或Gly，
X10是Asn、Gln或Ser，
X11是Gly或Gln，
X12是Ile，
X13是Lys或Arg，
X14是Gly或Gln，
X15是Gln或Thr，
X16是Leu或Arg，
X17是His，
X18是Pro或Ser，
X19是Tyr，
X20是Glu或Ser，
X21是Glu或Ser，
X22是Leu，和
X23是G1n或Thr。
13.权利要求10至12中任一项所述的抗体，其中HVR-H1包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，HVR-H2包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，HVR-H3包含由SEQ ID No.11或13组成的氨基酸序列，HVR-L1包含由SEQ ID No.15至18组成的氨基酸序列中任一项，HVR-L2包含由SEQ ID No.19至22组成的氨基酸序列中任一项，并且HVR-L3包含由SEQ ID No.24至28组成的氨基酸序列中任一项。
14.权利要求10至13中任一项所述的抗体，其中HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的氨基酸序列的组合，选自由以下3)至9)组成的组；
3)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
4)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.24组成的氨基酸序列；
5)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.16组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.21组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.25组成的氨基酸序列；
6)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.13组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.17组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含由SEQ ID No.26组成的氨基酸序列；
7)HVR-H1，其包含由SEQ ID No.7组成的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含由SEQ ID No.10组成的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含由SEQ ID No.11组成的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含由SEQ ID No.15组成的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含由SEQ ID No.20组成的氨基酸序列，和
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