KR20220076453A - 올리고-dT 역전사된 RNA로부터 TCR 알파 및 베타 쇄 VDJ를 회수하는 프로브 포획 방법 - Google Patents

올리고-dT 역전사된 RNA로부터 TCR 알파 및 베타 쇄 VDJ를 회수하는 프로브 포획 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 올리고-dT 프라이머를 사용하여 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 mRNA로부터 적어도 하나의 제1 cDNA 가닥을 역전사하고, TCR 알파 쇄 VDJ 및/또는 TCR 베타 쇄 VDJ 서열에 결합하도록 구성된 프라이머의 다중체 프라이머 혼합물을 사용하여 상기 cDNA를 증폭하고, 프로브 포획을 사용하여 TCR VDJ 특이적 앰플리콘을 포획하고 비-TCR VDJ 특이적 앰플리콘을 용출하고, 추가 PCR 라운드를 수행하여 TCR 알파 쇄 VDJ 및 TCR 베타 쇄 VDJ 앰플리콘을 더 농후화하고 차세대 서열분석을 사용하여 생성된 앰플리콘을 서열분석함으로써, TCR 알파 쇄 VDJ 및/또는 TCR 베타 쇄 VDJ 서열을 증폭하는 방법에 관한 것이다.

Description

올리고-dT 역전사된 RNA로부터 TCR 알파 및 베타 쇄 VDJ를 회수하는 프로브 포획 방법
관련 출원의 교차참조
본원은 본원에 참고로 포함된, 2019년 8월 14일에 출원된 "Probe-Capture Method for TCR Alpha and Beta Chain VDF-Recovery from Oligo-dT Reverse Transcribed RNA" 명칭의 미국 가특허출원 제62/886,663호에 대한 우선권을 주장한다.
단일 세포 전사 분석은 샘플의 RNA를 대량으로 분석할 때 모호한 많은 정보를 보여준다. 나아가, 각각의 개별 세포의 표현형 상태와 관련된 T 세포 수용체(TCR) 또는 B 세포 수용체(BCR) 쇄 VDJ 재배열의 정체를 아는 것이 중요하다. TCR 유전자는 게놈의 상이한 영역에 의해 코딩된 수많은 V 영역(가변 영역, V), J 영역(연결 영역, J), D 영역(다양성 영역, D) 및 불변 영역인 C 영역(C)으로 구성된다. 이러한 유전자 단편은 T 세포 분화 과정에서 다양한 조합으로 유전적으로 재배열된다. 이 정보는 다양한 세포 서브세트들에서의 클론 빈도의 직접적인 계산을 제공할 수 있고 치료로 특정 림프구를 추적할 수 있고 다운스트림 기능 분석 또는 Car-T 개발을 위한 상기 수용체의 두 쇄 모두에 대한 페어링된 정보를 보여줄 수 있기 때문에 가치가 있다. 시판되는 많은 단일 세포 시스템들은 바코딩된 올리고-dT 프라이머를 이용하여 단리된 단일 세포로부터의 RNA를 역전사하는 올리고-dT 기반 역전사(RT) 단계를 사용한다. 그 결과 RNA 서열분석은 RT 동안 도입된 바코드를 통해 동일한 세포로 역추적된 세포에서 발현된 다양한 유전자들과 관련된 정보를 제공할 수 있으나, 이 방법은 페어링된 수용체 VDJ 재배열의 서열을 신뢰 가능한 정도로 보여줄 수 없다.
이 단점은 부분적으로, 드 노보(de novo) VDJ 재배열이 RNA의 폴리-A 꼬리(tail)로부터 멀리 떨어져 있어, 생성된 생성물의 길이가 1 내지 1.5 kb이기 때문에, 특정 고처리율 차세대 서열분석 플랫폼에서의 서열분석을 어렵게 만든다는 사실에 기인한다. 이것은 더 긴 판독 길이 NGS 플랫폼으로 전환하거나 상업적으로 입수 가능한 일루미나(Illumina) 서열분석 키트를 고유 방식으로 사용함으로써 극복될 수 있다. 그러나, 이 전환은 여전히 통상의 방법의 단점을 극복하지 못한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 5' 말단에서 조작된 서열을 포함하는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 mRNA로부터 cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 역전사함으로써 제1 가닥 cDNA를 생성하는 단계; TCR 알파 쇄 VDJ 및 TCR 베타 쇄 VDJ 서열로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 서열에 결합하도록 구성된 2개 이상의 프라이머, 및 올리고-dT 프라이머의 5' 말단의 상기 조작된 서열에 결합하도록 구성된 역방향 프라이머를 포함하는 다중체 프라이머 혼합물을 사용하여 제1 가닥 cDNA를 증폭함으로써 제1 앰플리콘 세트를 생성하는 단계; TCR 알파 쇄 불변 유전자 영역 및 TCR 베타 쇄 불변 유전자 영역에 결합하도록 구성된 프라이머를 포함하는 프로브 비드를 사용하여 제1 앰플리콘 세트로부터 TCR 알파 쇄 VDJ 서열 및 TCR 베타 쇄 VDJ 서열을 포함하는 앰플리콘을 포획하는 단계; 샘플을 세척하여 제1 앰플리콘 세트로부터 포획되지 않은 앰플리콘을 제거하는 단계; 프로브 비드로부터 포획된 앰플리콘을 용출하여 용출된 앰플리콘의 풀(pool)을 생성하는 단계; 및 PCR을 사용하여 용출된 앰플리콘을 증폭하여 제2 앰플리콘 세트를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 용출된 앰플리콘을 증폭한 후, 차세대 서열분석을 사용하여 제2 앰플리콘 세트를 서열분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 차세대 서열분석을 사용하여 제2 앰플리콘 세트를 서열분석한 후, 서열을 평가하여 TCR 알파 쇄 VDJ 서열 및 TCR 베타 쇄 VDJ 서열의 빈도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 프로브 비드 프라이머는 TCR 알파 쇄 불변 유전자 영역 내의 적어도 하나의 위치 및 TCR 베타 쇄 불변 유전자 영역 내의 적어도 하나의 위치에 결합하도록 구성된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 프로브 비드 프라이머는 TCR 알파 쇄 불변 유전자 영역 내의 적어도 하나의 위치에 결합하도록 구성된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 프로브 비드 프라이머는 TCR 베타 쇄 불변 유전자 영역 내의 적어도 하나의 위치에 결합하도록 구성된다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 올리고-dT 프라이머는 분자 바코드를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 다중체 프라이머 혼합물은 프라이머의 5' 말단에 있고 보편적인 결합 부위로서 구성되어 있는 조작된 서열을 포함한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 다중체 프라이머 혼합물의 2개 이상의 프라이머들의 대부분은 센스 가닥 VDJ 서열의 증폭에 유리하도록 구성된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 다중체 프라이머 혼합물의 2개 이상의 프라이머들의 대부분은 하나 이상의 TCR 알파 쇄 VDJ 서열에 결합하도록 구성된다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 다중체 프라이머 혼합물의 2개 이상의 프라이머들의 대부분은 하나 이상의 TCR 베타 쇄 VDJ 서열에 결합하도록 구성된다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 프로브 비드를 사용하기 전, 제1 앰플리콘 세트를 SPRI 비드 선택으로 세척하고 추가 PCR 라운드를 수행한다.
본 개시내용은 하기 도면을 참고함으로써 더 잘 이해될 수 있다. 도면의 요소들은 반드시 서로에 대해 축척일 필요는 없고, 그 대신 본 개시내용의 원리를 명확히 설명하는 데 중점을 둔다. 나아가, 유사한 참조번호는 여러 도면들 전체에 걸쳐 상응하는 부분을 표시한다.
도 1은 표적화된 다중체 혼합물 생성물로부터의 제2 가닥 cDNA의 비대칭 농후화, 유전자 특이적 프로브 하이브리드화, 표적화된 제2 가닥 cDNA 생성물의 포획 및 세척에 의한 오프-표적 생성물의 제거, 및 태그부착된 생성물의 2 단계 PCR 및 증폭을 포함하는 프로브 포획 전략의 4개 단계를 나타낸다.
도 2는 TCR 알파 쇄 VDJ, TCR 베타 쇄 VDJ, 및 TCR VDJ와 관련 없는 부위에 대한 차세대 서열분석 결과를 총 리드(read)의 백분율로서 보여주는 히스토그램을 나타낸다. (A) 프로브 포획을 사용하지 않는 벌크 RNA. (B) 프로브 포획을 사용하는 벌크 RNA. (C) 프로브 포획을 사용하지 않는 단일 세포. (D) 프로브 포획을 사용하는 단일 세포.
본 개시내용은 일반적으로 올리고-dT 프라이머를 사용하여 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 mRNA로부터 cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 역전사하고, TCR 알파 쇄 VDJ 및/또는 TCR 베타 쇄 VDJ 서열에 결합하도록 구성된 프라이머의 다중체 프라이머 혼합물을 사용하여 cDNA를 증폭하고, 프로브 포획을 사용하여 TCR VDJ 특이적 앰플리콘을 포획하고 비-TCR VDJ 특이적 앰플리콘을 용출하고, 추가 PCR 라운드를 수행하여 TCR 알파 쇄 VDJ 및 TCR 베타 쇄 VDJ 앰플리콘을 더 농후화하고 차세대 서열분석을 사용하여 생성된 앰플리콘을 서열분석함으로써, TCR 알파 쇄 VDJ 및/또는 TCR 베타 쇄 VDJ 서열을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조작된 서열"은 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조작된 서열은 특정 목적을 위해 구성될 수 있다. 예를 들면, 조작된 서열은 보편적인 결합 부위로서 사용되도록 디자인될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "올리고-dT"는 전형적으로 타이미딘으로만 구성된 단독중합체를 지칭한다. 올리고-dT 분자의 바람직한 길이는 10개 내지 100개 염기이고, 10개 내지 30개 염기의 길이가 더 바람직하고, 20개 염기의 길이가 가장 바람직하다. 올리고-dT 분자는 바람직하게는 중합효소 반응에 의한 연장을 방지하기 위해 그의 3'-하이드록실 기에서 차단기에 의해 차단된다. 분자가 폴리A-RNA에 하이브리드화할 수 있는 한, 올리고-dT가 변형될 수도 있다는 것은 당분야에서 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 변형은 모든 유형의 타이미딘 유사체들, 예컨대, 2'-데옥시유리딘, 2'-O-메틸-유리딘, LNA(잠긴 핵산) 타이미딘 또는 유리딘 유도체, PNA(펩타이드 핵산) 타이민 또는 우라실 유도체, HNA(헥시톨 핵산) 타이미딘 또는 유리딘 유도체, 또는 5-프로피닐-우라실과 같은 염기 변형된 우라실 유도체뿐만 아니라, 형광 표지 또는 햅텐과 같은 표지를 사용한 변형 또는 타이미딘 및 유리딘 이외의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 사용한 변형도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로브 비드"는 하나 이상의 프라이머가 부착될 수 있고 컬럼 정제와 같은 하나 이상의 정제 방법과 함께 사용되기에 적합한 비드를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 또는 다른 동물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 면역화되었거나, 감염, 암, 자가면역 상태 또는 임의의 다른 질환을 앓고 있다. 예를 들면, 대상체는 질환을 진단받았거나, 질환의 증상을 나타내거나, 질환을 진단받지 않았거나 질환의 증상을 나타내지 않는 인간일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 서열"은 하이브리드화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 검출되고 프로브 또는 프라이머와 어닐링하는 핵산 서열을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "TCR 알파 쇄" 및 "TCR 베타 쇄"는 TCR을 구성하고 조립되어 이종이량체를 형성하고 CD3 형질도입 서브유닛과 회합하여 T 세포 표면에 존재하는 T 세포 수용체 복합체를 형성하는 알파 및 베타 쇄를 지칭한다. TCR의 각각의 알파 및 베타 쇄는 면역글로불린 유사 N-말단 가변(V) 및 불변(C) 영역, 소수성 막횡단 도메인 및 짧은 세포질 영역으로 구성된다. 면역글로불린 분자의 경우, 알파 및 베타 쇄의 가변 영역은 T 세포 집단 내에서 항원 특이성의 큰 다양성을 생성하는 V(D)J 재조합에 의해 생성된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 올리고-dT 프라이머를 사용하여 적어도 하나의 TCR 알파 쇄 VDJ 또는 TCR 베타 쇄 VDJ 서열을 포함하는 mRNA로부터 cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 역전사하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 올리고-dT 프라이머는 올리고-dT 부분의 5'에서 조작된 서열을 포함한다. 올리고-dT 부분의 5'에 있는 조작된 서열은 다운스트림 증폭의 단순화라는 이점을 제공한다. 다른 실시양태에서, 올리고-dT 프라이머는 올리고-dT 부분의 5'에서 조작된 서열을 포함하지 않는다. 올리고-dT 프라이머는 고유 식별자로서 분자 바코드도 포함할 수 있다. 예를 들면, 분자 바코드는 약 4개 내지 15개의 무작위로 생성된 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 분자 바코드는 본원에 참고로 포함된 미국 특허출원 공개 제US20150132754호(Wang, et al.) 및 제US20120171725호(Han)에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.
mRNA는 하나 이상의 T 세포를 포함하는 임의의 공급원으로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 대상체의 말초 혈액 또는 다른 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. mRNA를 추출하는 방법은 당분야에서 기술을 가진 자에게 공지되어 있다.
그 다음, TCR 알파 쇄 VDJ만 또는 TCR 베타 쇄 VDJ만, 또는 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄 VDJ 둘 다를 커버하는 표적화된 다중체 프라이머 혼합물을 사용하여, 올리고-dT 프라이머를 사용한 역전사 후 생성된 제1 가닥 cDNA를 증폭한다. VDJ-프라이머 혼합물은 다운스트림 PCR을 위한 보편적인 결합 부위를 제공하기 위해 5' 말단에서 조작된 서열을 함유할 수도 있다. 다중체 PCR 혼합물은 관심 있는 VDJ 서열의 최적화된 프라이머 세트, 및 역전사 동안 올리고-dT 프라이머의 5' 말단에 위치된 조작된 서열에 대한 역방향 프라이머를 포함한다(도 1).
특정 실시양태에서, 센스 가닥 VDJ의 생성에 유리하도록 구성된 프라이머의 비대칭 균형을 사용하여 PCR을 수행한다. 특정 실시양태에서, 제1 증폭의 PCR 생성물을 SPRI 비드 선택 또는 또 다른 표준 PCR 세척 방법으로 세척하고, 주형 양을 증가시키기 위해 PCR을 반복한다. 본 출원인은 라이브러리가 하나 이상의 비대칭 PCR 단계의 완료 후 서열분석된 경우조차도, 알파 쇄 VDJ 서열이 서열분석 데이터에서 베타 쇄 서열에 비해 여전히 매우 드물었음을 발견하였다.
다음으로, 프로브 포획을 통해 전체 PCR 생성물을 선택한다. 요약하건대, TCR 알파 쇄 불변 유전자 영역 및 TCR 베타 쇄 불변 유전자 영역에 특이적인 불변 영역 포획 프라이머를 사용하여 프로브 비드를 생성한다. 이 포획 서열들은 그들 각각의 쇄에 대한 연접 또는 불변 유전자 내의 하나의 특정 위치 또는 다수의 위치들을 위한 것일 수 있다. 일부 위치들이 VDJ 서열 회수에 있어서 다른 위치들보다 더 좋기 때문에 연접 또는 불변 프로브 프라이머의 위치도 중요한 고려사항이다. 하이브리드화 단계 후, 예를 들면, 당분야에서 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 컬럼 정제 방법을 사용함으로써 결합되지 않은 종을 세척하여 제거하고, 포획된 서열을 비드로부터 용출한다. 그 후, 또 다른 PCR 라운드를 수행하여, 주형을 다시 농후화하고 서열분석을 위해 추가 인덱스를 배정한다. 이어서, 차세대 서열분석을 사용하여 라이브러리를 서열분석하고, TCR 알파 쇄 및 베타 쇄 VDJ 서열의 빈도에 대해 데이터를 평가한다.
TCR 베타 쇄 및 TCR 알파 쇄를 커버하는 다중체 프라이머 혼합물을 사용하여 VDJ 재배열을 증폭하는 본 개시된 방법(표적화된 서열분석 방법)의 개발 동안, 본 출원인은 시스템이 단일 세포 포획 시스템이든 아니면 올리고-dT 프라이머에 의해 역전사된 벌크 RNA이든 관계없이 올리고-dT 역전사된 cDNA로부터 알파 쇄에 대한 VDJ 정보를 수집하는 것이 일관되게 매우 어렵다는 것을 발견하였다. 이 정보가 수용체 쌍의 쇄들 중 하나를 형성하기 때문에, 이 정보를 회수하는 것도 매우 중요하다.
개시된 방법의 장점은 프로브 포획에 커플링된 표적화된 서열분석 방법을 사용하여 TCR 알파 및 베타 쇄 VDJ 재배열 정보 둘 다를 일관되게 회수하는 것이다. 이 방법은 VDJ 특이적 서열분석 리드의 수를 증가시키면서 TCR 알파 쇄 VDJ의 서열을 구출한다(rescue). 결과적으로, 본 개시된 방법은 통상의 방법에 비해 알파 쇄 서열의 훨씬 더 높은 포획을 야기함으로써, 알파 쇄 면역 레퍼토리의 발견 및 전체 수용체 페어링 성공률을 증가시킨다. 상기 방법은 TCR 베타 쇄 서열의 발견도 증가되게 할 수 있다. 추가로, 더 적은 서열분석 깊이가 각각의 쇄에 대한 클론형 발견을 최대화하는 데 요구되기 때문에, 개시된 방법에 의해 제공된 오프-표적 서열분석 리드 수의 감소는 실험 관련 비용을 전체적으로 감소시킨다. 결과적으로, 올리고-dT 역전사된 주형으로부터의 면역 레퍼토리 발견 및 단일 세포 페어링 둘 다가 기재된 방법에 의해 개선된다.
프로브 포획에 대한 필요성을 입증하는 실험
TCR 알파 쇄 VDJ, TCR 베타 쇄 VDJ, 및 이들 둘 다를 벌크 RNA의 역전사된 cDNA에서 증폭하였다. NGS 데이터의 분석은 데이터의 대략 90% 내지 94%가 TCR VDJ 서열과 관련 없었고 대략 8%가 TCR 베타 쇄 서열이었고 대략 6%가 TCR 알파 쇄 서열이었음을 보여주었다. TCR 알파 쇄 서열과 베타 쇄 서열이 동시 증폭되었을 때, 데이터의 대략 92%는 VDJ 서열과 관련 없었고 5.8%는 TCR 베타 쇄 서열이었고 1.9%는 TCR 알파 쇄 서열이었다.
이 실험을 단일 세포 시스템으로부터의 역전사된 RNA에 대해 반복하였을 때, 데이터의 89% 내지 95%가 TCR VDJ 서열과 관련 없고 11%가 TCR 베타 쇄 서열이고 5%가 TCR 알파 쇄 서열인 유사한 결과가 달성되었다. 본 출원인은 표적화된 서열분석 어세이에서 데이터의 98% 이상이 재배열된 VDJ 서열을 함유할 것으로 예상하였기 때문에, VDJ 정보와 관련 없는 모든 데이터들은 "쓰레기"로서 간주되었다. 이것은 불변 영역 유전자 프라이머 및 V-프라이머 혼합물이 증폭 동안 사용된 경우이다. 이 "쓰레기" 데이터는 서열분석 리드의 낭비 및 관심 있는 VDJ 재배열의 낙오를 초래함으로써, 실험 비용을 증가시키고 VDJ 페어링된 수용체 성공률을 감소시킨다.
서열분석 쓰레기를 감소시키기 위한 시도로 프라이머 시스템 및 처리의 변형
NGS 데이터의 분석 후, 본 출원인은 상기 쓰레기의 대부분이 하나의 프라이머인 V-알파 4의 결과임을 발견하였다. 따라서, 본 출원인은 원래의 프라이머 혼합물, 및 V-알파 4 프라이머가 제거된 프라이머 혼합물을 사용하여 실험을 반복하였다. 본 출원인은 임의의 원치 않는 "쓰레기"를 제거하는 데 도움이 되기 위해 비드를 세척하는 다수의 방식들도 시험하였다. 다시, NGS 데이터의 분석은 TCR VDJ 서열과 관련 없는 92%의 데이터(쓰레기) 및 8%의 TCR 알파 쇄로 TCR 알파 쇄 발견의 미미한 2% 개선만을 보여주었다. 그 다음, 본 출원인은 V-프라이머가 완전히 상이한 위치에 있는(RNA의 5' 말단에 더 가까운) 상이한 프라이머 세트를 시도하였다. 다시, 프라이머 위치와 관계없이 동일한 문제점이 지속되었다. 본 출원인은 긴 리드 프라이머 세트가 제1 PCR 라운드에서 사용되고 짧은 리드 V-프라이머 혼합물을 이용한 추가 PCR이 뒤따르는 방법도 시도하였다. 여기서 아이디어는 V-알파 영역에 특이적인 2개의 프라이머 세트의 사용이 V-알파 서열의 증가를 누적적으로 야기할 것이라는 것이다. 이 조절도 결과를 개선하지 못하였다.
특정 V-알파 서열을 변형하거나 제거하여 온(on)-표적 V-알파 결과의 백분율을 증가시킬 수 있는지 알아보기 위해 오프(off)-표적 서열분석 결과를 다양한 성분들의 백분율에 대해 재분석하였다. 오프-표적 앰플리콘과 관련된 모든 정보를 사용하여, 오프-표적 결과를 피하도록 전체 프라이머 시스템을 재디자인하였다. 본 출원인의 벌크 RNA 올리고-dT 시스템에 대한 분석을 반복하였다. NGS 데이터의 분석은 데이터의 90%가 TCR VDJ 서열과 관련 없었고(쓰레기) 6% 내지 7%가 TCR 알파 쇄 서열이었음을 보여준다. 따라서, 프라이머의 재디자인조차도 TCR 알파 쇄 VDJ를 특이적으로 증폭할 때 오프-표적 증폭이라는 문제점을 해결하지 못하였고, 이것은 TCR 알파 쇄 좌위가 올리고-dT 프라이머에 의해 생성된 cDNA로부터 유전자 특이적 프라이머를 증폭하기 어렵다는 것을 입증한다. 이 어려움은 PCR 전략의 변형, 다양한 PCR 세척 단계의 변형 및 증폭에 사용된 유전자 특이적 프라이머의 재디자인 후조차도 지속되었다.
PCR 생성물에 대한 프로브 포획
TCR 알파 쇄와 관련된 문제점이 TCR 알파 쇄의 비효율적인 역전사 때문인지를 확인하기 위해, 본 출원인은 V 및 C 특이적 프라이머 혼합물로 증폭하여 제1 가닥 cDNA를 시험함으로써, TCR 알파 가닥 RNA의 올리고-dT 전환이 일어나고 있음을 확신하였고 제1 가닥 cDNA 생성물로서 실제로 생성된 TCR 알파 쇄 VDJ 서열의 수를 평가하였다. 이 농후화 단계를 수행하지 않은 동일한 라이브러리의 경우, 본 출원인은 대략 300개의 클론형을 발견하였다. 그러나, 농후화 후 본 출원인은 대략 1,600개의 클론형을 발견하였다. 이 데이터는 TCR 알파 쇄 제1 가닥 cDNA가 존재함을 입증한다. 따라서, TCR 알파 쇄의 낙오는 올리고-dT 혼합물에서 오프-표적 종들로부터의 경쟁으로 인해 (RT 동안이 아니라) PCR의 나중 단계에서 발생한다.
벌크 RNA의 경우, NGS 데이터는 TCR 알파 쇄에 대해서만 프로브 풀 다운(pull down)을 사용하지 않음으로써, 데이터의 85%가 TCR VDJ와 관련 없었음(쓰레기)을 보여준다. TCR 베타 쇄만이 데이터의 87%가 TCR VDJ와 관련 없었음을 보여준다. 포획하기 위한 프로브를 사용하지 않고 TCR 알파 쇄 서열과 베타 쇄 서열 둘 다를 동시 증폭할 때, 데이터의 73%는 TCR VDJ 서열과 관련 없었고, 24%는 TCR 베타 쇄 서열이었고 2%는 TCR 알파 쇄 서열이었다(도 2의 A). 본 출원인은 제2 가닥 cDNA 생성물의 비대칭 농후화 후 프로브 포획 시스템을 사용하였다. 사용될 수 있는 TCR 알파 및 베타 쇄 데이터의 증가는 비-프로브 포획에 비해 7배이다. TCR 알파 및 베타 쇄에 대해 따로 프로브 포획 방법을 사용하였을 때, 데이터의 23%는 TCR VDJ 서열과 관련 없었다. TCR 알파 쇄 서열과 베타 쇄 서열을 함께 동시 증폭하고 프로브로 포획하였을 때, 데이터의 20%는 TCR VDJ 서열과 관련 없었고 57%는 TCR 베타 쇄 서열이었고 22%는 TCR 알파 쇄 서열이었다(도 2의 B).
이것을 단일 세포 시스템의 환경에서 TCR 알파 쇄를 사용한 프로브 포획의 부재 하에서 반복하였을 때, 데이터의 85%는 TCR VDJ 서열과 관련 없었다(쓰레기). TCR 베타 쇄만은 데이터의 83%가 TCR VDJ 서열과 관련 없었음을 보여준다. 비-프로브 포획 시스템을 사용하여 TCR 알파 쇄 서열과 베타 쇄 서열 둘 다를 동시 증폭하였을 때, 데이터의 85%는 TCR VDJ 서열과 관련 없었고, 11%는 TCR 베타 쇄 서열이었고 3%는 TCR 알파 쇄 서열이었다(도 2의 C). 본 출원인은 제2 가닥 cDNA 생성물의 비대칭 농후화 후 프로브 포획 시스템을 사용하였다. 사용될 수 있는 TCR 알파 및 베타 쇄 데이터의 증가는 비-프로브 포획에 비해 7배이다. TCR 알파 및 베타 쇄 서열에 대해 따로 프로브 포획 방법을 사용하였을 때, TCR 알파 쇄 데이터의 25%는 TCR VDJ 서열과 관련 없었고 TCR 베타 쇄 데이터의 29%는 관련 없었다. TCR 알파 쇄 서열과 베타 쇄 서열을 함께 동시 증폭하고 프로브로 포획하였을 때, 데이터의 19%는 TCR VDJ 서열과 관련 없었고, 51%는 TCR 베타 쇄 서열이었고 28%는 TCR 알파 쇄 서열이었다(도 2의 D).
본원에 기재된 시스템, 방법 및 이들의 다양한 실시양태들은 예시하기 위한 것이다. 본원에 기재된 시스템 및 방법의 다양한 다른 실시양태들은 가능하다.

Claims (12)

  1. 5' 말단 상에 조작된 서열을 포함하는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 mRNA로부터 cDNA의 적어도 하나의 제1 가닥을 역전사함으로써 제1 가닥 cDNA를 생성하는 단계;
    TCR 알파 쇄 VDJ 및 TCR 베타 쇄 VDJ 서열로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 서열에 결합하도록 구성된 2개 이상의 프라이머, 및 올리고-dT 프라이머의 5' 말단 상의 상기 조작된 서열에 결합하도록 구성된 역방향 프라이머를 포함하는 다중체 프라이머 혼합물을 사용하여 제1 가닥 cDNA를 증폭함으로써 제1 앰플리콘 세트를 생성하는 단계;
    TCR 알파 쇄 불변 유전자 영역 및 TCR 베타 쇄 불변 유전자 영역에 결합하도록 구성된 프라이머를 포함하는 프로브 비드를 사용하여 제1 앰플리콘 세트로부터 TCR 알파 쇄 VDJ 서열 및 TCR 베타 쇄 VDJ 서열을 포함하는 앰플리콘을 포획하는 단계;
    샘플을 세척하여 제1 앰플리콘 세트로부터 포획되지 않은 앰플리콘을 제거하는 단계;
    프로브 비드로부터 포획된 앰플리콘을 용출하여 용출된 앰플리콘의 풀(pool)을 생성하는 단계; 및
    PCR을 사용하여 용출된 앰플리콘을 증폭하여 제2 앰플리콘 세트를 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 용출된 앰플리콘을 증폭한 후, 차세대 서열분석을 사용하여 제2 앰플리콘 세트를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 차세대 서열분석을 사용하여 제2 앰플리콘 세트를 서열분석한 후, 서열을 평가하여 TCR 알파 쇄 VDJ 서열 및 TCR 베타 쇄 VDJ 서열의 빈도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 프로브 비드 프라이머가 TCR 알파 쇄 불변 유전자 영역 내의 적어도 하나의 위치 및 TCR 베타 쇄 불변 유전자 영역 내의 적어도 하나의 위치에 결합하도록 구성된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 프로브 비드 프라이머가 TCR 알파 쇄 불변 유전자 영역 내의 적어도 하나의 위치에 결합하도록 구성된 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 프로브 비드 프라이머가 TCR 베타 쇄 불변 유전자 영역 내의 적어도 하나의 위치에 결합하도록 구성된 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 올리고-dT 프라이머가 분자 바코드를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 다중체 프라이머 혼합물이 프라이머의 5' 말단 상에 있고 보편적인 결합 부위로서 구성되어 있는 조작된 서열을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 다중체 프라이머 혼합물의 2개 이상의 프라이머의 대부분이 센스 가닥 VDJ 서열의 증폭에 유리하도록 구성된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 다중체 프라이머 혼합물의 2개 이상의 프라이머의 대부분이 하나 이상의 TCR 알파 쇄 VDJ 서열에 결합하도록 구성된 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 다중체 프라이머 혼합물의 2개 이상의 프라이머의 대부분이 하나 이상의 TCR 베타 쇄 VDJ 서열에 결합하도록 구성된 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 프로브 비드를 사용하기 전, 제1 앰플리콘 세트를 SPRI 비드 선택으로 세척하고 추가 PCR 라운드를 수행하는 것인 방법.
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