KR20220074047A

KR20220074047A - 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 황기 시들음병 또는 뿌리썩음병 방제용 조성물

Info

Publication number: KR20220074047A
Application number: KR1020200162100A
Authority: KR
Inventors: 이재형; 이기욱; 모영문; 윤예지; 홍지은; 임수정; 엄남용
Original assignee: 강원도
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-06-03
Also published as: KR102509861B1

Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주 및 이를 이용한 황기의 시들음병 또는 뿌리썩음병에 대한 방제용 조성물에 관한 것으로, 상기 균주를 활용하여 부작용이 낮으면서도 시들음병 또는 뿌리썩음병 예방에 효과적인 방제용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 황기의 안정적인 생산과 친환경 재배를 위한 생물학적 방제제를 제공할 수 있다.

Description

신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 황기 시들음병 또는 뿌리썩음병 방제용 조성물{Novel Bacillus amyloliquefaciens strain and composition for controlling Fusarium oxysporum or Phytophthora drechsleri of Astragalus membranaceus Bunge root comprising the same as an active ingredient}

본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주 및 이를 이용한 황기의 시들음병 또는 뿌리썩음병에 대한 방제용 조성물에 관한 것이다.

황기는 뿌리와 잎과 싹을 식품으로도 이용 가능한 약용작물이나 대부분 뿌리 생산 위주로 농가에서 재배되고 있다. 황기의 뿌리는 재배 년 수가 높을수록 항산화 활성이 높은 것으로 나타나 있으며, 주요성분의 함량이 재배 년 수에 따라 증가하는 경향을 보여 총 astrogaloside, astrogalosideⅣ, flavonoid 등 유효성분의 함량이 1∼2년 근 보다 3년 근에서 50% 이상 높으며, polysaccharide 함량 또한 3년 근이 2년 근에 비해 50% 이상 높아 경제성을 고려한 황기의 최적년근을 3년근으로 보고된 바, 일반적으로 재배 년 수에 따라 효능과 지표성분의 차이가 있다고 알려져 있다. 이에 황기 뿌리 1년생은 대부분 식품으로 소비되고 약용으로는 3년생 이상의 고년근을 이용하고 있는데 3년생 이상의 고년근 생산 시 토양전염성 병원균에 의한 수량감소 등으로 최근 3년근 생산의 주산지인 정선의 황기 재배면적이 (‘13) 89.7ha에서 (’18) 26.3ha로 감소되고 있는 추세이다. 황기 수량감소의 원인이 되는 주요 토양전염병은 시들음병(Fusarium oxysporum)과 뿌리썩음병(Phytophthora drechsleri) 등이 보고되어 있다. 시들음병의 경우 1년근에서는 발생 빈도가 미미하지만 재배 년 수가 늘어나면 그 빈도가 증가하고, 뿌리썩음병 역시 1년근은 1.3(발병정도에 따라 0∼9까지 표기)정도이나 3년근의 경우 6.0까지 크게 증가해 농가에서는 주로 1년근을 생산하고 있는 실정이며 이러한 이유로 황기 재배 농가를 중심으로 황기 토양전염성 병해 저감기술 개발에 대한 현장 요구가 크다.

토양전염성병에 대해 다양한 방제가 시도되고 있는 인삼의 경우 뿌리썩음병(Fusarium solani) 방제를 위해 토양 훈증제를 이용한 토양 소독법을 활용하고 있는데 해당 방법은 토양 내 유익한 미생물까지 사멸되어 처리 후에는 토양 미생물상을 복원하는 기술이 요구되고, 토양훈증제가 분해 후 남게 되는 각종 산물이 인삼 생육에 영향을 미칠 수 있다고 하여 화학적 방제에 대한 부작용이 해결되지 않은 실정이다.

이처럼 토양전염성 병해의 특성으로 인한 화학약제의 한계 및 부작용 등을 해결하고자 길항미생물 등을 이용한 생물학적 방제가 이미 많은 작물에 대해 도입되어 있으나 황기 재배에 있어서는 아직 시도된 적이 없다. 따라서 본 발명은 황기의 토양전염성 병해를 유발하는 원인균에 대해 길항능력을 나타내는 미생물을 활용하여 황기의 안정적인 생산과 친환경 재배를 위한 생물학적 방제제를 개발하고자 하였다.

등록특허공보 제10-1073932호 등록특허공보 제10-1089149호

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 방제에 활용할 수 있는 신규한 바실러스 균주를 제공하고자 한다.

또한, 상기 균주를 활용한 황기의 시들음병 또는 뿌리썩음병을 방제할 수 있는 식물 방제용 조성물을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주를 제공한다.

상기 균주는 서열번호 1의 서열을 갖는다.

상기 균주는 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum (F. oxysporum)) 및/또는 뿌리썩음병 원인균인 파이토프토라 드레흐슬러리(Phytophthora drechsleri(P. drechsleri)) 중 어느 하나 이상의 균에 대한 방제 효과가 인정된다.

또한, 상기 균주는 식물의 생장을 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 식물 생장 촉진에 도움이 되는 효소의 활성화시키거나 분비를 촉진시킬 수 있다.

상기 효소는 프로테아제(Protease), 사이드로포어(Siderophore), 셀룰라아제(Cellulase) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주 및/또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 방제용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 배양액은 균주를 배양한 배양물 자체 또는 배양 여액, 또는 추출용매를 이용하여 상기 배양물에서 통상의 정제방법으로 추출한 추출물 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 추출물은 상기 배양물을 원심분리하여 얻어진 상등액에 클로로포름, 에탄올 등을 추출 용매로 이용하여 추출된 추출액일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식물 방제용 조성물은 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포럼(usarium oxysporum (F. oxysporum)) 및/또는 뿌리썩음병 원인균인 파이토프토라 드레흐슬러리(Phytophthora drechsleri(P. drechsleri)) 중 어느 하나 이상의 균에 대해 방제 효과가 인정된다.

또한, 상기 방제용 조성물은 식물의 생장을 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 식물 생장 촉진에 도움이 되는 효소를 활성화 시킨다.

상기 식물 방제용 조성물은 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 황기, 더욱 바람직하게는 황기의 뿌리 방제용 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 방제용 조성물은 유효성분 이외에 당 업계에서 방제용 조성물을 제조하기 위해 통상적으로 사용되는 용매, 혼합제, 첨가제 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다.

본 발명은 화학 약품이 아닌 생물학적 제제를 활용하여 부작용이 낮으면서도 시들음병 또는 뿌리썩음병 예방에 효과적인 방제용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 황기의 안정적인 생산과 친환경 재배를 위한 생물학적 방제용 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 F. oxysporum 및 P. drechsleri에 대한 분리 균주의 균사 성장 억제 시험 결과를 나타낸 것이다. (A) : NA 50% 및 PDA 50%배지에 대해 25℃에서 10일 동안 이중 배양 테스트 결과이다.
도 2는 길항미생물 4종 배양여액 분주시 무 종자 생장촉진효과 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 항미생물 4종 배양여액의 무종자 초장 및 생체중 수준을 나타낸 것이다.
도 4는 길항미생물 4종의 Proteinase 생성 평가 결과를 나타낸 것이다(투명환 생성 수준).
도 5은 길항미생물 4종의 Sideropore 생성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 길항미생물 4종의 Cellulase 생성 평가 결과를 나타낸 것이다(투명환 생성 수준).
도 7은 전기영동을 통한 길항미생물 4종 항생물질 유전자 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 8은 길항미생물 4종 4주 접종 후 황기 유묘 생장 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 황기 시들음병(F. oxysporum) 병징에 따른 발병 기준 및 분생자 특성을 나타낸 것이다.
도 10은 황기 뿌리썩음병(P. drechsleri) 병징에 따른 발병 기준 및 분생자 특성을 나타낸 것이다.
도 11는 길항미생물-병원균 교호 접종시 지하부 발병 수준을 나타낸 것이다.
도 12은 길항미생물-병원균 교호 접종시 토양전염병 발병율(%)을 나타낸 것이다.
도 13은 선군 신동읍 예미리 262-6(3년생)(좌) / 철원군 청양리 356(2년생)(우)을 나타낸 것이다.
도 14는 환경농자재 처리별 황기 3년생 지하부 생육 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 황기 3년생 실증지 처리구별 지하부 수량지수 및 방제가 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 친환경농자재 처리별 황기 2년생 지하부 생육 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 황기 2년생 실증지 처리구별 지하부 수량지수 및 방제가 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 재배 기간 중(6월～8월) 처리구별 이병주율 추이(2020. 철원)를 나타낸 것이다.
도 19는 재배 기간 중(6월～8월) 일강수량(2020. 철원)을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법 및 재료>

1. 균주 및 병원균 준비

황기의 주요 토양전염성 병해인 시들음병과 뿌리썩음병 원인균에 대해 항균 활성을 나타내는 균주를 분리하고자 토양전염병 발생빈도가 높은 8월 집중강우시기 이후에 강원도 정선과 철원지역의 황기 및 인삼 재배지에서 건전하게 생육중인 식물체의 근권 토양을 채취하였다. 채취한 시료에서 미생물을 분리하기 위해 토양 시료 1g을 멸균수(sterile water) 9ml에 현탁하고 conical tube에 10^-5의 농도로 희석하여 NA[Nutrient agar; beef extract 0.3%(w/v), peptone 0.5%(w/v), agar 1.5%(w/v), Difco, USA] 배지에 도말하여 25℃에서 2일간 배양하였다. 배양 후 육안으로 모양과 색이 서로 다른 미생물의 단일 콜로니를 루프를 이용하여 1차 분리한 뒤 다시 순수 분리하여 73종을 준비하였다. 추가로 강원도농업기술원 농식품연구소에서 김치 등 한국 전통식품에서 유래한 고초균 96종을 분양받았으며 준비된 모든 균주는 20% 글리세롤에 현탁하여 deep freezer에서 -70℃에 보관하였다.

황기 토양전염성 병해의 주요 병원균인 뿌리썩음병 원인균과 시들음병 원인균은 농촌진흥청 농업유전자원정보센터로부터 Phytophthora drechsleri(KACC 40196)와 Fusarium oxysporum f. sp. gladioli(KACC 40051)를 분양받아 사용하였다.

2. 병원균억제능력 평가

준비한 미생물이 시들음병 원인균 F. oxysporum과 뿌리썩음병 원인균 P. drechsleri에 대해 항균활성을 나타내는지 확인하기 위해 대치배양을 통해 균사생장 억제능력을 평가하였다. 시들음병 원인균은 PDA[Potato Dextrose Agar; potato starch 0.4%(w/v), dextrose 2.0%(w/v), agar 1.5%(w/v), Difco, USA]배지에 접종하고 뿌리썩음병 원인균은 V8A배지에 접종하여 25℃에서 3일간 배양하여 준비하였다. 준비된 병원균은 균사 선단부에서 cork borer(직경 5mm)로 분리하여 agar disk로 사용하였고, 미생물은 LB Broth[Tryptone 1.0%(w/v), Yeast extract 0.5%(w/v), sodium chloride 1.0%(w/v), Difco, USA]에 접종하여 25℃에서 1일간 배양한 배양액을 8mm paper disk에 100㎕ 접종하여 사용하였다.

대치배양은 PDA와 NA를 각각 50%씩 혼합한 배지의 petri-dish 가운데 병원균 agar disk를 치상하고 3cm 떨어진 곳에 미생물을 접종한 paper disk를 치상하여 25℃에서 7일간 배양한 후 clear zone을 관찰하였다. 병원균 균사생장을 억제하는 미생물의 길항능력은 Clear zone 길이를 3반복으로 3차례 시험하여 측정하였다.

3. Protease 생성 평가

대치배양에서 병원균에 대해 균사생장 억제능력이 높은 미생물의 protease 분비를 확인하기 위해 증류수 200ml에 Nutrient Agar 5g과 Skim milk powder 3%를 혼합한 배지를 autoclave(121℃, 30min)하여 petri dish에 분주하여 준비하였다. 준비된 배지에 cork borer를 이용하여 직경 5mm의 구멍을 뚫은 후 미리 배양해놓은 미생물 배양액 20㎕를 접종하였다. 그리고 25℃에서 5일간 배양한 뒤 배지의 clear zone 형성을 관찰하여 protease 분비를 확인하였다.

4. Siderophore 활성 평가

선발된 균주의 Siderophore 활성을 알아보기 위해 Chrome azurol sulfonate(CAS, sigma, USA) assay를 간단하게 변형한 방법을 사용하였다(Han et al., 2015). 먼저 염료용액 60.5mg을 증류수 50ml에 녹이고 HDTMA 72.9mg은 증류수 50ml에 녹인 뒤 광차단하여 준비한 뒤, Nutrient Agar 20.7g을 900ml 증류수에 녹인 다음 두 가지 용액을 혼합하여 autoclave에 고압 멸균하였다. 고압 멸균된 용액은 50℃로 식힌 뒤 거품이 나지 않도록 천천히 섞어 petri dish에 분주하여 CAS 평판배지를 만들었다. 이 후 위의 방법으로 미리 배양해놓은 미생물 배양액을 접종하고 25℃에서 5일간 배양하여 배지의 clear zone 형성으로 sideorophore 생성 여부를 확인하였다.

5. Cellulase 활성 평가

선발된 균주의 Cellulase 분해 효소 생성 여부를 확인하기 위해 CMC agar배지를 Sazci등(1986)에서 사용한 방법을 변형하여 제조하였다. Nutrient Agar 5g을 증류수 200ml에 녹인 후 Sodium carboxymethyl cellulose(CMC) 1%와 congo red 0.01%을 함께 넣어 섞어준 뒤 autoclave에서 고압 멸균하여 준비하였다. Cellulase 활성 평가 역시 위 방법처럼 미생물 배양액을 접종하여 25℃에서 5일간 배양하여 배지의 clear zone 형성을 관찰하였다.

6. 미생물 배양여액의 생장촉진 효과 평가

선발된 균주가 식물 생장촉진에 관여하는 생장촉진물질을 분비하는지 확인하기 위해 각각의 균주를 배양한 배양여액과 무 종자(관동여름무, 국내채종)를 이용하여 생장촉진 실험을 수행하였다. 먼저 필터페이퍼를 2매씩 넣은 Petri dish에 1% sodium hypo chlorc acid가 포함된 멸균수를 5ml씩 넣어 충분히 적신 후 무종자를 12개씩 일정한 간격으로 치상한 후 1일간 실온에 경과시켰다. 배양여액은 각각의 균주를 LB Broth에서 1일간 배양한 뒤 Syringe filter(RC 0.45㎛)로 필터링하여 멸균수와 1:1로 혼합하여 준비하였다. Petri dish에 치상한 무종자는 24시간 중 16시간의 광 조건에서 각각의 배양여액을 1ml씩 5일간 분주한 뒤 발아한 개체의 초장과 생체중량을 측정하였다.

7. 포트실험을 통한 생장촉진 효과 평가

균주 3종의 식물생장 촉진 효과를 확인하기 위해 온실에서 포트실험을 실시하였다. 건조기에서 뒤엎기를 포함하여 105℃, 2시간 동안 소토법으로 살균한 원예상토를 넣은 4×4 연결포트에 황기(A. membranaceus Bunge) 종자를 파종한 뒤 안정적인 양분 흡수 및 뿌리 활착을 위해 저면관수로 30일간 육묘하여 생장이 균일한 개체를 준비하였다. 미생물 배양액은 1.0×10⁵colony/ml 농도로 멸균수와 1:1로 희석하여 식물체 지제부에 10ml씩 7일 간격으로 4회 관주처리 하였고 마지막 처리일로부터 7일이 경과한 후 지상부 및 지하부의 생육정도를 측정하였다.

8. 포트실험을 통한 방제효과 평가

황기의 토양전염성 병원균인 뿌리썩음병 원인균(P. drechsleri)과 시들음병 원인균(F. oxysporum)에 대한 균주 3종의 방제효과를 확인하기 위해 상기 방법으로 살균처리한 원예 상토를 넣은 포트에 황기 종자를 파종한 뒤 온실 내에서 포트실험을 실시하였다. 처리방법은 처리구별로 균주 배양액을 먼저 관주한 후 관주일로부터 3일 경과 후 원인균을 관주하는 방법으로 4주간 교호처리 하였다. 각각의 균주는 위 평가에서처럼 1.0×10⁵colony/ml 농도로 멸균수와 1:1 희석한 배양액을 사용하였고 시들음병 원인균(F. oxysporum)은 PDB 배지에서 30℃, 1일간 배양하여 멸균수와 1:1 희석 후 발병을 유도하였다. 뿌리썩음병 원인균(P. drechsleri)은 10% V8A배지에서 5일간 배양한 균사 절편을 cork borer로 떼어내 멸균수 20ml을 넣은 petri dish에 4∼5개를 침지하고 빛이 조사되는 24℃ 항온기에서 1∼2일간 배양하여 유주자낭이 충분히 발생한 배양액으로 접종 전 10℃ 저온에서 30분간 저온처리 후 실온에서 1시간 방치하여 유주자가 다량 유출된 배양액을 사용하였다. 원인균에 의한 발병정도는 황기 개체별로 뿌리에 진전된 병반의 크기에 따라 0에서 3까지 분류하여 0은 0%, 1은 1∼30%, 2는 31∼60%, 3은 61%이상으로 측정하였으며 3반복 실시하였고 방제가는 (무처리구발병정도－처리구발병정도)/무처리구발병정도×100으로 계산하였다.

9. 균주 동정방법

선발된 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 및 gyrA 유전자 계통 발생 분석에 기반한 분자생물학적 방법과 생화학적 방법을 이용하여 특성 분석을 실시하였다. 16S rDNA 염기서열 분석을 위해 Chromosomal DNA 추출은 LB Broth에서 24시간 동안 배양시킨 배양액 3ml을 Higene^™Genomic DNA Prep Kit(BIOFACT, Korea)의 방법으로 추출하였다. 16s rRNA 부분 증폭은 universal primer인 27F와 1492R primer를 이용하였다. PCR은 CFX96^™Touch Thermal Cycler(BIO-RAD, USA)를 사용하여 95℃에서 30초간 denaturation 후 65℃에서 30초, 72℃에서 30초 과정을 35회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응시켰다. PCR 산물은 1×TAE(Tris-acrtate-EDTA) buffer를 이용하여 1% agarose gel에서 30분간 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV-transilluminator에서 밴드를 확인하였다. 1,600bp 범위에서 증폭된 밴드를 확인 후 Macrogen, Inc. 에 염기서열 분석을 의뢰하였다. gyrA 유전자를 이용한 염기서열 분석은 표 1의 프라이머를 사용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원 NICEM에 의뢰하여 동정하였다. 각각의 염기서열 분석결과는 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 BLASTN 프로그램을 이용하여 등록된 염기서열과 비교한 뒤 MEGA X 프로그램을 이용하여 계통도를 작성하였다. 균주의 생화학적 분석은 VITEK2 compact(Biomerieux, France) 시스템을 이용하여 제품 매뉴얼에 따라 LB Broth에서 25℃, 1일간 배양한 선발미생물의 집락을 원심분리하여 루프로 따낸 뒤 이를 멸균된 생리식염수에서 2.0 McF의 탁도로 맞춰 BCL card에 침지시켰다. 침지한 card는 제품 카세트에 장착한 뒤 판독과정을 거쳤다.

No.	Gene	Primer	Primer sequence(5’-3’)	References
1	16S rRNA	27F	AGAGTTTGATCCTGGCAC (서열번호2)	Kim et al.
1	16S rRNA	1492R	TACGGYTACCTTGTTACGACTT(서열번호3)	Song et al.
2	gyrA	47F	CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT(서열번호4)	Roberts and Cohan
2	gyrA	1066R	CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT(서열번호5)	Roberts and Cohan

10. 통계분석

균주와 병원균의 균사생장 억제능력 평가와 포트시험을 통한 생육촉진 및 방제효과 평가 등 모든 실험은 3회 반복 실시하였고, 각 처리별 평균값 차이에 의한 유의성 평가는 SPSS v.24.0(IBM SPSS Statistics 24) Duncan 다중평가방법(Duncan’s multiple range test)으로 p<0.05 수준에서 통계 분석하였다.

<실시예> 균주의 선발 및 동정

강원도 정선과 철원지역의 황기 및 인삼 재배지 근권 토양에서 분리한 미생물 73종을 황기 시들음병(F. oxysporum)과 뿌리썩음병(P. drechsleri) 원인균과 대치배양하여 항균활성이 높은 균주를 선발하였다. 준비한 미생물을 황기 토양전염성 병원균 2종(F. oxysporum, P. drechsleri)과 대치배양한 결과 측정한 Clear zone의 길이에 따라 균사억제 능력이 가장 높은 균주 4종을 선발하였다(도 1). 항균활성이 가장 높은 4종의 균주를 본 실험에서 A5(KCGW34N16-2), A10(KCGW34N16-4), A11(KCGW34N16-5), 10201 균주에 대해 분류 및 동정하기 위해 16S rRNA와 gyrA 유전자를 이용한 염기서열 분석과 VITEK2 system을 이용한 생화학적 분석으로 동정하였다. 동정 결과는 표 3에 나타내었다. A5 및 A10은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis), 10201은 Pseudomanas putida, A11은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 분류되었다. 이중 A11의 서열을 서열번호 1에 서열을 나타내었다.

길항미생물 4종의 병원균 균사억제능력 결과

No	Pathogens Treatment	*Fusarium oxysporum*	*Phytophthora drechsleri*
1	A5(KCGW34N16-2)	++*	+++
2	A10(KCGW34N16-4)	++	+++
3	A11(KCGW34N16-5)	+++	++++
4	10201	++	++

*: Determined by measuring the average distance of inhibition zone: + for less than 0.5cm, ++ for 0.5 to 0.8cm, +++ for 0.9 to 1.2cm, ++++ for 1.3 to 1.6cm in distance of inhibition zone.

No.	Strains	Identification	Homology(%)	Origin
1	A5	Bacillus amyloliquefaciens	99	김치
2	A10	Bacillus velezensis	98	김치
3	A11	Bacillus amyloliquefaciens	98	김치
4	10201	Pseudomanas putida	-	토양

<실험예1> 길항미생물 식물생장 촉진 및 병원균 억제능 검정

길항미생물 4종 배양여액을 이용한 무 종자의 생장촉진효과 평가하였다. 우선 길항미생물 4종을 배양(LB Broth, 1일간, 25℃)한 뒤 1:1 로 희석한 배양여액을 syringe filter(RC 0.45㎛)로 필터링하여 1㎖씩 5일간 분주 후 발아 개체의 초장과 생체중량을 측정하였고, 그 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.

실험 결과, A11 및 10201 균주에 의한 식물 생장 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.

<실험예2> 본 발명에 따른 균주의 활성효소 생성 평가

선발한 균주 4종에 대해 Clear zone을 형성함으로서 미생물의 활성효소 분비 여부를 확인할 수 있는 배지를 제작하여 측정하였다. Protease 생성 평가 결과, 미생물의 난용성 단백질 분해 능력은 식물이 이용 가능한 무기태 전환에 용이하며 일반 진균의 세포벽을 분해시킬 수 있음을 확인하였다. Protease 생성 검정 결과: A11 > A10 > A5 순으로 나타났고, 10201은 활성이 없었다(도 4).

미생물의 Siderophore 생성을 통해 토양 내 결합된 Fe을 해리시키거나 흡수하여 식물의 Fe 흡수를 돕고 병원균의 Fe 이용을 억제하는데 Siderophore 생성 검정 결과: 10201 > A10 = A11 > A5 순으로 나타났다. Cellulase 활성은 A10과 B2-087에서 확인되었다(도 5).

셀룰라아제는 셀룰로오스 가수분해효소로 황기 뿌리썩음병 원인균(Phytophthora 속)의 세포벽(셀룰로오스로 구성)을 분해하여 직접적인 항균활성을 나타낸다. Cellulase 생성 검정 결과: A5 > A10 로 확인되었으며, A11과 10201은 활성이 없었다(도 6).

<실험예3> 길항미생물 4종의 항생물질 생성 유전자 검정

본 발명에 따른 길항미생물 4종에 대해 항생물질(Iturin A, Surfactin, Fengycin) 유전자 발현을 검정한 결과, A10(6개) > A11(5개) > 10201(1개) > A5(0개) 로 나타났다(도 7).

<실험예4> 본 발명에 따른 길항미생물 4종 황기 유묘 생장촉진능력 평가

선발한 균주의 생장촉진능력을 평가하기 위해 포트에서 한 달간 육묘한 황기에 처리별로 5일 간격으로 4회 처리(10ml/회) 후 마지막 처리일로부터 5일 후 결과를 측정하였다. 평가 결과, 생체중 기준으로 10201 > A5 > A11 > A10 > 무처리 순으로 생육이 촉진된 것으로 확인되었다(도 8).

구분 처리	초장(cm)	엽수(장)	근장(cm)	근수(개)	근경(cm)	생근중(g)	생체중(g)
Control	12.13	5.8	13.3	4.4	1.8	0.20	0.83
A5	13.08	6.5	11.0	7.0	2.4	0.22	1.20
A10	12.49	6.3	11.4	4.2	1.9	0.20	0.98
A11	12.58	6.3	12.1	5.9	2.2	0.24	1.16
10201	12.99	6.7	10.5	3.5	2.0	0.20	1.27

<실험예5> 선발미생물 4종의 황기 토양전염병 원인균 억제능력 평가

황기 유묘에 길항미생물과 병원균을 4일 간격으로 4주간 교호처리(길항균 접종 후 4일 뒤 원인균 접종, 10ml/1:1희석 배양액)후 황기 지하부 병징 발병 기준을 참고하여 병징의 크기에 따라 0~3(0: 0%, 1: 1~30%, 2: 31~60%, 3: 61%이상)으로 구분하여 측정하였다. 그 결과, 길항미생물 4종 발병율(%) 측정 결과: A11 > A10 > 10201 > A5 순으로 나타났고, A11의 경우 무처리와 비교하여 시들음병 원인균과 뿌리썩음병 원인균에 대해 각각 72.0%, 68.2%의 방제가를 나타냈다(도 9 내지 도 12 참조).

상기 실험 결과를 토대로 황기 재배지 효과 검정 길항미생물 2종 최종 선발하였고, 그 결과는 표 5에 나타냈다.

No.	Strains	Identification	Origin	Note
1	A11	Bacillus amyloliquefaciens	김치	병원균 방제효과 우수
2	10201	Pseudomanas putida	토양	생육촉진효과 우수

대치배양 및 포트시험(생육촉진효과 검정, 병원균 억제능력 검정) 결과 병원균 억제능력이 높은 A11과 생육촉진효과가 높은 10201을 최종 길항미생물로 선발하였다.

<실험예6> 황기 안정생산을 위한 친환경 농자재 활용기술 평가

6-1. 길항미생물 재배지 효과 검정

본 검정 평가는 2, 3년생 황기를 재배하는 재배지 3개소(정선, 철원)를 선정하여 황기에 선발미생물1, 선발미생물2, 선발미생물1+2, 무처리, 대조구(화학약제)를 미생물제(1×10⁵CFU/ml) 관주 처리하였고, 그 외에 기준량을 처리하였다. 처리횟수 5~9월에 걸쳐 월 2회 처리하여 총 10회 처리하였다. 처리 후 평가 내용은 지상부 및 지하부 생육특성, 방제가 등을 평가하였다(도 13).

구체적으로는 관수시설을 설치 후 선발 길항균 2종(A11, 10201, 1×10⁵CFU/ml 이상)을 2주 간격으로 총 8회 처리하였고(5~8월) 대조구로는 물과 화학약제(하이멕사졸)를 처리하였다. 1회 처리시 3,000L/10a 기준으로 하였다.

6-2. 길항미생물 대량생산을 위한 특성 검정

본 검정 평가는 2년차 선발 유용균주 9점 및 추가 선발 유용균주를 사용하였고, 유용균주별 최적 배양 조건(온도, pH, 배지조성) 검정을 실히였다. 사용된 배지종류는 LB(Luria Bertani broth) 등 3종이었고, 배양온도 및 pH는 20~35℃, pH 5~8로 처리하였다.

6-3. 평가 결과 종합

실증지 친환경농자재 처리별 지하부 생육 특성 평가 결과, 처리구별 지하부 수량지수 결과는 A11 > 10201 > 화학약제 > 무처리 순으로 나타났다. 또한, 처리구별 토양전염병 방제가 결과(무처리 대비)는 A11 > 화학약제 > 10201로 나타났다. 이 중 선발미생물 A11의 경우 무처리 대비 30.5% 방제가를 나타냈으며, 화학약제(하이멕사졸)와 비교하여 9.0% 수준에서 소폭 효과적임을 확인하였다 (도 14 및 도 15).

지하부 생육 특성(10. 8.기준)

연생	구분	근장 (㎝)	근경 (㎜)	지근수 (개/주)	근중(g/주)
연생	구분	근장 (㎝)	근경 (㎜)	지근수 (개/주)	생	건	건물률(%)
3년생 (정선)	무처리	43.5	15.5	1.6	37.0	11.85	32.03
	A11	46.3	16.1	3.3	47.3	15.63	33.04
	10201	50.4	15.7	2.8	46.9	16.26	34.68
	화학약제	44.2	15.3	2.1	39.7	13.04	32.84

또한, 황기 2년생 지하부 생육 특성 평가 결과, 처리구별 지하부 수량지수 결과는 A11 > 화학약제 > 무처리 > 10201로 나타났다. 또한, 처리구별 토양전염병 방제가 결과(무처리 대비)는 A11 > 화학약제 > 10201 순으로 나타났고, 선발미생물 A11의 경우 무처리 대비 53.8% 방제가를 나타냈으며, 화학약제(하이멕사졸)와 비교하여 28.0% 수준에서 효과적임을 확인하였다(도 16 내지 도 19).

추가적으로 8. 1.~8. 11. 기간 동안 총 783.7㎜(최대 일일강수량 155.5㎜)의 집중호우가 발생하였으며, 집중호우 직후 조사시기(8. 17.)부터 미생물 처리구의 이병주율이 급격히 증가함.

지하부 수량 특성(8. 10.기준)

연생	구분	근장 (㎝)	근경 (㎜)	지근수 (개/주)	근중(g/주)
연생	구분	근장 (㎝)	근경 (㎜)	지근수 (개/주)	생	건	건물률(%)
2년생 (철원)	무처리	36.6	15.4	5.8	38.9	12.5	32.13
	A11	38.4	37.6	7.1	46.1	14.7	31.88
	10201	34.9	14.1	4.2	37.4	11.2	29.80
	화학약제	42.4	16.6	5.5	43.7	14.1	32.27

기탁기관명 : 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원정보센터

수탁번호 : KACC92327P

수탁일자 : 20201105

<110> Gangwon-do <120> Novel Bacillus amyloliquefaciens strain and composition for controlling Fusarium oxysporum or Phytophthora drechsleri of Astragalus membranaceus Bunge root comprising the same as an active ingredient <130> 20-11778 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA sequence of Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 ggcgctcgtt ggcggacagc cgaaggtact gagcctgaag caatgcctgg agcattacct 60 tgagctttgt acgcaatgaa tgatttaggc atgaccagtg acaaaccata taaaaaatct 120 gcccgtatcg tcggtgaagt tatcggtaag taccacccgc acggtgactc agcggtttac 180 gaatcaatgg tcagaatggc gcaggatttt aactaccgct acatgcttgt tgacggacac 240 ggcaacttcg gttcggttga cggcgactca gcggccgcga tgcgttacac agaagcgaga 300 atgtcaaaaa tcgcaatgga aattctgcgt gacattacga aagacacgat tgactatcaa 360 gataactatg acggttcaga aagagagcct gccgtcatgc cttcgagatt tccgaatctg 420 ctcgtaaacg gggctgccgg tattgcggtc ggaatggcga caaacattcc cccgcatcag 480 cttggggaag tcattgaagg cgtgcttgcc gtaagtgaga atcctgagat tacaaaccag 540 gagctgatgg aatacatccc gggcccggat tttccgactg caggtcagat tttgggccgg 600 agcggcatcc gcaaggcata tgaatccgga cggggatcaa tcacgatccg ggctaaggct 660 gaaatcgaag agacttcatc gggaaaagaa agaattattg tcacggaact tccttatcag 720 gtgaacaaag cgagattaat tgaaaaaatc gcggatcttg tccgagacaa aaaaatcgaa 780 ggaattaccg atctgcgaga cgaatccgac cgtaacggaa tgagaatcgt cattgagatc 840 cgccgtgacg cccatgctca cgtcattttg aataacctgt acaaacaaac ggccctgcag 900 acgtctttcg gaatcaatct gctggcgctc gttgacggac agccgaagta ctaagcctga 960 agcaatgc 968 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer for 16S rRNA <400> 2 agagtttgat cctggcac 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer for 16S rRNA <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 47F primer for gyrA <400> 4 cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1066R primer for gyrA <400> 5 caaggtaatg ctccaggcat tgct 24

Claims

서열번호 1의 gyrA 서열을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 파이토프토라 드레흐슬러리(Phytophthora drechsleri) 중 어느 하나 이상의 균을 방제하는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 프로테아제(Protease), 사이드로포어(Siderophore), 셀룰라아제(Cellulase) 중 어느 하나 이상의 효소를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주.
서열번호 1의 gyrA 서열을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 방제용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 방제용 조성물은 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 파이토프토라 드레흐슬러리(Phytophthora drechsleri) 중 어느 하나 이상의 균을 방제하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 식물 방제용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 방제용 조성물은 프로테아제(Protease), 사이드로포어(Siderophore), 셀룰라아제(Cellulase) 중 어느 하나 이상의 효소를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 식물 방제용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 배양액은 균주를 배양한 배양물 자체 또는 배양 여액, 또는 추출용매를 이용하여 상기 배양물에서 통상의 정제방법으로 추출한 추출물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식물 방제용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 식물은 황기 또는 황기의 뿌리인 것을 특징으로 하는 식물 방제용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 방제용 조성물은 유효 성분 이외에 용매, 혼합제, 첨가제를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 방제용 조성물.