KR20220072449A - 나이트릭 옥사이드 리덕타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 및 그를 이용한 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법 - Google Patents

나이트릭 옥사이드 리덕타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 및 그를 이용한 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

나이트릭 옥사이드 리덕타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 포함하는 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물 및 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

나이트릭 옥사이드 리덕타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 및 그를 이용한 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법{Microorganism including genetic modification that increases activity of nitric oxide reductase and method for reducing concentration of nitric oxide in sample}
나이트릭 옥사이드 리덕타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 포함하는 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물 및 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
질소산화물(NOx)은 주로 연료의 연소과정에서 배출되는 대기오염물질 중의 하나인데 이에는 N2O, NO, N2O3, NO2, N2O4 및 N2O5 등이 있으며, 이 가운데 주로 대기오염을 일으키는 것은 NO와 NO2이다. N2O는 이산화탄소(CO2), 메탄(CH4), 프레온 가스(CFCs)와 함께 대기 중의 열을 흡수하여 저장함으로써 온실 효과를 일으키는 주범으로 교토의정서 규제대상 6대 온실가스 중 하나이며, 지구온난화 지수 (GWP : Global Warming Potential)가 310으로 단위 질량당 온난화 효과가 이산화탄소 (1)와 메탄 (21) 대비 높다. 또한, 질소산화물은 스모그와 산성비의 원인이기도 하며, 공기 중 화학 작용을 거쳐 2차 생성 초미세먼지를 형성하고 지상 오존 농도를 높여 호흡기 건강에 악영향을 준다.
질소산화물 제거 공정은 대부분 화학적 환원 방법인 선택적 촉매환원 (selective catalytic reduction, SCR)과 선택적 비촉매환원 (selective non-catalytic reduction, SNCR), 그리고 흡수 (scrubbing) 및 흡착 (adsorption) 등의 기술이 적용되고 있다. 화학적 방법은 공정의 전체 과정에서 소요되는 에너지 및 촉매 비용, 이로부터 발생하는 2차 폐기물의 처리 등의 문제가 존재한다. 또한 SCR이나 SNCR의 경우, NO 및 NO2가 환원되는 과정에서 불완전 환원의 결과로 또 다른 온실가스인 N2O가 발생할 수 있다. 이와 같은 문제점을 갖는 화학적 기술들과 달리, 생물학적 공정은 비교적 단순한 원리, 고온 고압 등의 극한 조건 미사용, 낮은 2차폐기물 내지 폐수 발생 등 장점이 있는 환경친화적인 공정이다. 생물학적 공정에서는 화학적 촉매 대신 생물학적 촉매 역할을 하는 미생물을 이용하여 NOx를 산화 또는 환원 분해하거나 세포의 일부분으로 고정하게 된다.
탈질 미생물들은 이화적 환원작용(dissimilatory reductive process)을 통하여 질소산화물을 N2로 환원한다. 지난 여러 연구를 통해, Pseudomonas putida, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas stutzeri, Paracoccus denitrificans, Klebsiella pneumonia 등 많은 탈질 미생물들이 보고되었다. 이들 중 Paracoccus 속은 상대적으로 많은 연구가 이루어졌다. Paracoccus는 Rhodobacteraceae 패밀리에 속하는 속으로 그람-음성 미생물이다.
그러나, 상기한 선행기술에 의하더라도 Escherichia 속 또는 Paracoccus 속 미생물과 같은 미생물을 이용한 생물학적 탈질 방법에 대안적 방법이 여전히 요구되고 있다.
일 양상은 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase: NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
다른 양상은 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase: NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 포함하는, 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase: NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 나이트릭 옥사이드 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한증가를 나타낸다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)" 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낸다. "세포의 활성"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낸다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
효소 또는 폴리펩티드의 활성 증가는 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻을 수 있다. 상기 발현 증가는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자가 도입되는 미생물은 내재적으로 상기 유전자를 포함하는 것, 또는 포함하고 있지 않은 것일 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 가능하게 하는 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 폴리 아데닐화 부위, 또는 그 조합과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. "이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다. 상기 "카피 수 증가"는 여러 폴리펩티드가 복합체를 형성하여 하나의 나이트릭 옥사이드 릭덕타제 활성을 나타내는 경우, 상기 복합체를 구성하는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가일 수 있다.
상기 유전자의 도입은 형질전환, 형질도입(transfection), 전기천공 (electroporation)과 같은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 유전자는 운반체(vehicle)를 통하여 도입되거나, 그 자체로서 도입될 수 있다. 본 명세서에 있어서, "운반체"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 운반체는, 벡터, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 포함한다. 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터, 예를 들면, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스, 또는 그 조합이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 유전자의 조작은 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의할 수 있다.
용어 "친세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 미생물에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "친세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질 (예를 들면, 나이트릭 옥사이드 리덕타제와 약 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다. 동일한 비교가 다른 유전적 변형에도 적용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), BLASTP(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
일 양상은 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase: NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
나이트릭 옥사이드 리덕타제는 나이트릭 옥사이드를 나이트러스 옥사이드로 환원 전환하는 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 반응은 2 나이트릭 옥사이드 + 2H+ + 2 e- ⇔ 나이트러스 옥사이드 + H2O (반응식 1)의 화학 반응을 촉매하는 것일 수 있다.
일 예에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드는 Fe(II)(L)-NO의 형태일 수 있다. 상기 Fe(II)(L)-NO는 킬레이팅제(chelating agent) L과 Fe2+와 NO가 착화되어(chelate) 복합체를 형성한 것을 나타낸다. 상기 L은 예를 들면, 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 헥사메틸렌테트라아민, N-(2-히드록시에틸)에틸렌디아민-트리아세트산(HEDTA), 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA), 이미노디아세트산, 니트릴로-트리아세트산(NTA), 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)인 것일 수 있다. 따라서, 상기 Fe(II)(L)-NO는 N2O, NO, N2O3, NO2, N2O4 및 N2O5와 같은 산화 질소가 수성 용액에 용해가능하게 변형된 형태일 수 있다. 상기 Fe(II)(L)-NO의 형성은 Fe(II)(L) 함유 수성 용액과 산화 질소를 접촉시킴으로써 형성될 수 있다. 상기 접촉은 수성 매질과 액체 산화 질소를 혼합하거나 수성 매질과 기체 산화 질소를 접촉시키는 것일 수 있다. 그러나, 상기 재조합 미생물이 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 있어서 이러한 특정한 기작에 한정되는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
일 예에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 플라보루브레독신(flavorubredoxin, FlRd)으로서 플라보디아이언 단백질(Flavodiiron protein, FDP)에 속하는 것일 수 있다. 상기 효소는 예를 들면, 2 나이트릭 옥사이드 + 환원된 플라보루브레독신 ⇔ 나이트러스 옥사이드 + 산화된 플라보루브레독신 + H20의 화학 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 Escherichia 속 유래 NorV일 수 있다. 이 경우, 반응식 1의 상기 전자(2e-)는 NADH: 플라보루브레독신 리덕타제(NADH: flavorubredoxin reductase)에 의해 제공된 환원된 플라보루브레독신의 형태일 수 있다. 상기 효소 NADH: 플라보루브레독신 리덕타제는 산화된 플라보루브레독신 [Fe(III)] + NADH ⇔ 환원된 플라보루브레독신(reduced flavorubredoxin)[Fe(II)] + H2O 화학 반응을 촉매하는 것으로 EC 1.18.1.- 에 속하는 것일 수 있다. 상기 효소 NADH: 플라보루브레독신 리덕타제는 Escherichia 속 유래 NorW일 수 있다. 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 NorV가 NorW를 통해 전자공여체 NADH로부터 전자를 전달받아 환원되어 나이트릭 옥사이드를 나이트러스 옥사이드로 환원 전환하는 형태일 수 있다. 이 경우, 반응식 1의 상기 전자(2e-)는 환원된 플라보루브레독신의 형태일 수 있다.
일 예에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 시토크롬 c-의존성 나이트릭 옥사이드 리덕타제(cNOR)에 속하는 것일 수 있다. 상기 효소는 예를 들면, 2 나이트릭 옥사이드 + 2 페로시토크롬 c [Fe(II)cytochrome c] + 2H+ ⇔ 나이트러스 옥사이드 + 2 페리시토크롬 c [Fe(III)cytochrome c] + H2O의 화학 반응을 촉매하는 것으로 EC 1.7.2.5 에 속하는 것일 수 있다. 상기 효소는 Paracoccus 속 유래 cNOR(NorCB)일 수 있다. 상기 cNOR은 NorB 서브유닛과 NorC 서브유닛이 복합체 형태로 존재하고 NorC를 통해 전자가 도입되어 촉매 활성을 가지는 NorB로 전달되는 것일 수 있다. NorC는 시토크롬 c를 포함할 수 있다. 이 경우, 반응식 1의 상기 전자(2e-)는 환원된 시토크롬 c의 형태일 수 있다.
상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 외래 또는 내재적인 것일 수 있다. 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 세포질 내 또는 세포막에 존재하는 것일 수 있다. 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 Escherichia 속, 및 Paracoccus 속 유래의 나이트릭 옥사이드 리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 Paracoccus versutus 및 Escherichia coli로 이루어진 군으로부터 선택된 균주로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 두 개 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다. 서열번호 1 및 2는 각각 대장균 유래 norV 및 norW의 아미노산 서열이고, 서열번호 3 및 4는 각각 Paracoccus versutus 유래 norB 및 norC의 아미노산 서열이다.
상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자는 서열번호 5, 6, 7, 및 8의 뉴클레오티드 서열과 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 5 및 6은 각각 대장균 유래 norV 및 norW의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 서열번호 7 및 8은 각각 Paracoccus versutus 유래 norB 및 norC의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
상기 미생물에 있어서, 상기 유전적 변형은 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 나이트릭 옥사이드 리덕타제 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 아미노산 서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 5, 6, 7, 및 8의 뉴클레오티드 서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자가 도입된 것, 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 도입된 것일 수 있다. 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자는 염색체 내 또는 염색체 외에 존재할 수 있다. 도입된 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자는 복수 개, 예를 들면, 2이상, 5이상, 10이상, 10이상, 50이상, 100이상, 또는 1000이상일 수 있다.
상기 미생물은 Escherichia 속, 또는 Paracoccus 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 미생물은 대장균, 또는 Paracoccus versutus일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시킬 수 있다. 상기 감소는 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제가 나이트릭 옥사이드를 나이트러스 옥사이드(nitrous oxide, N2O)로 전환하거나, 전환된 나이트러스 옥사이드를 나이트러스 옥사이드 리덕타제(nitrous oxide reductase)에 의하여 질소(N2)로 전환하는 것에 의하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 시료는 액체 또는 기체 상태인 것일 수 있다. 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체일 수 있다. 상기 시료는 상기 나이트릭 옥사이드와 같은 질소 산화물을 포함하는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 질소 산화물은 N2O, NO, N2O3, NO2, N2O4, N2O5, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase: NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 포함하는, 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 재조합 미생물, 시료 및 나이트릭 옥사이드에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 조성물에 있어서, 용어 "감소"는 시료 중의 나이트릭 옥사이드 농도를 감소시키는 것으로서, 완전하게 제거하는 것을 포함한다. 상기 시료는 기체 또는 액체일 수 있다. 상기 시료는 상기 미생물이 포함되지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 배지 또는 배양물에 대한 상기 나이트릭 옥사이드의 용해도를 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드는 Fe(II)(L)-NO의 형태일 수 있다. 상기 Fe(II)(L)-NO는 킬레이팅제(chelating agent) L과 Fe2+와 NO가 착화되어(chelate) 복합체를 형성한 것을 나타낸다. 상기 L은 예를 들면, 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 헥사메틸렌테트라아민, N-(2-히드록시에틸)에틸렌디아민-트리아세트산(HEDTA), 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA), 이미노디아세트산, 니트릴로-트리아세트산(NTA), 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)인 것일 수 있다. 따라서, 상기 Fe(II)(L)-NO는 N2O, NO, N2O3, NO2, N2O4 및 N2O5와 같은 산화 질소가 수성 용액에 용해가능하게 변형된 형태일 수 있다. 상기 Fe(II)(L)-NO의 형성은 Fe(II)(L) 함유 수성 용액과 산화 질소를 접촉시킴으로써 형성될 수 있다. 상기 접촉은 수성 매질과 액체 산화 질소를 혼합하거나 수성 매질과 기체 산화 질소를 접촉시키는 것일 수 있다. 그러나, 상기 재조합 미생물이 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 있어서 이러한 특정한 기작에 한정되는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
상기 조성물은 시료와 접촉시킴으로써 시료 중의 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 접촉은 액체상에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면 배지 중에 배양되는 미생물의 배양물과 상기 시료를 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기 배양은 미생물을 증식하는 조건하에서 이루어질 수 있다. 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 접촉은 상기 재조합 미생물을 나이트릭 옥사이드 함유 시료와 접촉시키면서 배양 또는 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 재조합 미생물이 증식하는 조건에서 배양하는 것은 포함한다.
다른 양상은 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase: NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 나이트릭 옥사이드 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 재조합 미생물 및 나이트릭 옥사이드 함유 시료에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드는 Fe(II)(L)-NO의 형태일 수 있다. 상기 Fe(II)(L)-NO는 킬레이팅제(chelating agent) L과 Fe2+와 NO가 착화되어(chelate) 복합체를 형성한 것을 나타낸다. 상기 L은 예를 들면, 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 헥사메틸렌테트라아민, N-(2-히드록시에틸)에틸렌디아민-트리아세트산(HEDTA), 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA), 이미노디아세트산, 니트릴로-트리아세트산(NTA), 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)인 것일 수 있다. 따라서, 상기 Fe(II)(L)-NO는 N2O, NO, N2O3, NO2, N2O4 및 N2O5와 같은 산화 질소가 수성 용액에 용해가능하게 변형된 형태일 수 있다. 상기 Fe(II)(L)-NO의 형성은 Fe(II)(L) 함유 수성 용액과 산화 질소를 접촉시킴으로써 형성될 수 있다. 상기 접촉은 수성 매질과 액체 산화 질소를 혼합하거나 수성 매질과 기체 산화 질소를 접촉시키는 것일 수 있다. 그러나, 상기 재조합 미생물이 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 있어서 이러한 특정한 기작에 한정되는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 상기 접촉은 액체상에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면 배지 중에 배양되는 미생물의 배양물과 상기 시료를 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기 배양은 미생물이 증식하는 조건하에서 이루어질 수 있다. 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 접촉은 상기 미생물의 생육 단계가 지수기(exponential phase), 또는 정체기(stationary phase)인 때에 이루어지는 것일 수 있다. 상기 배양은 호기 또는 혐기 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 재조합 미생물이 생존가능한 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 생존가능한 조건은 재조합 미생물이 증식가능한 조건 또는 휴지 상태(resting sate)로 있게 하는 조건일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 시료는 액체 또는 기체 상태일 수 있다. 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체일 수 있다. 상기 시료는 상기 미생물의 배양물에 수동적으로 접촉되는 것뿐만 아니라, 능동적으로 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 시료는 예를 들면, 상기 미생물의 배양액 중에 스파르징(sparging)하는 것일 수 있다. 즉, 시료를 배지 또는 배양액을 통하여 불어넣는 것일 수 있다. 상기 스파르징은 배지 또는 배양액의 하부로부터 상부로 불어넣는 것일 수 있다. 상기 스파르징은 상기 시료의 방울을 만들면서 주입하는 것일 수 있다. 상기 나이트릭 옥사이드는 Fe(II)(L)-NO의 형태일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 접촉은 배치(batch) 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면, 상기 감소시키는 단계에서 얻어진 접촉된 시료를 신선한 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase: NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 신선한 미생물과의 접촉은 2회 이상, 예를 들면, 2, 3, 5, 또는 10 회 이상 이루어질 수 있다. 상기 접촉은 시료 중의 나이트릭 옥사이드의 원하는 감소된 농도가 달성될 때까지의 시간 동안 지속되거나, 반복될 수 있다.
다른 양상은 미생물에 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase:NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 단계를 포함하는, 미생물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 미생물에 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 미생물을 제조하는 방법일 수 있다. 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계는 상기 유전자를 포함하는 비히클을 상기 미생물에 도입하는 것일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 유전자를 증폭하는 것, 상기 유전자의 조절 서열을 조작하는 것, 또는 상기 유전자 자체의 서열을 조작하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조작은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 전환 또는 부가인 것일 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 미생물은 시료 중 나이트릭 옥사이드를 제거하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 조성물은 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법은 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 효율적으로 감소시킬 수 있다.
도 1은 NOR 경로가 강화된 재조합 대장균을 이용하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2O로 전환한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 NOR 경로가 강화된 재조합 Paracoccus versutus를 이용하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2로 전환한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 NOR 경로가 강화된 재조합 Paracoccus versutus를 이용하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2로 전환한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 대장균 나이트릭 옥사이드(NOR) 유전자 조작을 통해 대장균의 Fe(II)EDTA-NO에서 N 2 O로의 전환능 확인 및 개선
1.1. 돌연변이 및 재조합 대장균 제작
대장균 W3110에서 원-스텝 불활성화(one-step inactivation) 방법 (KA Datsenko and BL Wanner, Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6; 97(12):6640-5)을 이용하여 norV 및 norW 유전자를 결실시켰다.
norVW 유전자를 결실시키기 위해, pKD3 벡터를 주형으로 하고 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 수득된 DNA 절편을 람다-레드 리콤비나제 (λ-red recombinase)가 발현되는 W3110 균주의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하여 norVW 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였다. 상기 norVW 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 11 및 12의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다. 그 결과, norVW 유전자가 결실된 W3110 △norVW 균주를 얻었다.
다음으로, 대장균 W3110에 대장균 유래 norVW 유전자가 과발현된 재조합 균주를 제작하였다. 구체적으로, 대장균 W3110을 배지 중에서 배양하고, 배양물로부터 분리된 대장균 gDNA를 추출하고, 이 gDNA를 주형으로 하고, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 PCR을 통하여 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 대장균 norVW 유전자를 증폭하였다. 벡터 pIND4 (AC Ind et al. Appl Environ Microbiol. 2009 Oct; 75(20): 6613-5)를 주형으로 하고 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 PCR 증폭하여 벡터 절편을 확보하였다. norVW 유전자를 벡터 pIND4에 InFusion Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.)에 따른 방법을 사용하여 연결하여 norVW 과발현 벡터 pIND4-norVW를 제작하였다. 이때 상기 norVW 유전자는 IPTG에 의하여 발현이 유도되도록 하였다.
상기 norVW 과발현 벡터를 일렉트로포레이션 방법(Sambrook, J & Russell, D.W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)으로 대장균 W3110 세포로 도입함으로써, Fe(II)EDTA-NO 환원능 개선 균주를 제작하였다. 상기 형질전환 균주는 카나마이신 (Kanamycin, 50 μg/ml)이 포함된 LB 평판 배지에서 선별하여 수득하였다.
1.2. Fe(II)EDTA-NO의 N 2 O로의 환원 전환능 확인 및 향상
norVW 유전자가 결실된 대장균 W3110△norVW를 LB 배지에서 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 배양하였다. norVW 유전자가 과발현된 대장균 W3110 균주(W3110/pIND4-norVW)를 LB 배지 중에서 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 0.5mM IPTG를 첨가하여 norVW 유전자 발현을 유도하였다. 다음으로, norVW 결실 대장균 및 norVW 유전자가 과발현된 대장균 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 글루코스 5g/L 및 Fe(II)EDTA-15NO 5mM, pH 7.0 함유 M9 배지에 OD600 =1이 되도록 첨가하여 반응 혼합물을 얻었다.
상기 반응 혼합물 30mL를 60mL 혈청 병(serum bottle)에 첨가하고 30℃에서 140rpm으로 교반하면서 5 시간 동안 배양하였다. 상기 혈청 병은 혐기 챔버 내에 유지시켜 혐기 조건이 되도록 하였다. 대조군으로는 대조군 균주 즉, 공벡터를 포함한 대장균을 사용한 것을 제외하고 동일하다.
다음으로, 상기 반응 혈청 병의 헤드스페이스 내 기체를 샘플링하여 GC-MS로 15N2O 생성량을 분석하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 NOR 경로가 강화된 재조합 대장균을 이용하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2O로 전환한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, norVW 유전자가 결실된 대장균 W3110 △norVW 균주는 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2O로 환원시키는 능력이 100% 소실되었다. 또한, norVW를 과발현하는 대장균 균주는 대조군에 비하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2O로 환원시키는 능력이 현저하게 향상되었다.
실시예 2: 대장균 나이트릭 옥사이드(NOR) 유전자(norV, norW)를 포함하는 재조합 Paracoccus versutus 균주를 이용하여 Fe(II)EDTA-NO를 N 2 로 환원하는 능력 개선
1.1. 재조합 Paracoccus versutus 균주 제작
자연 탈질 미생물인 Paracoccus versutus DSM 582 (이하 'Pv'라고도 한다.) 균주에 실시예1에서 얻은 대장균 유래 norVW 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 통하여 도입하였다. 대장균 유래 norVW 과발현 벡터를 전기 충격 방법 (Sambrook, J & Russell, D.W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)으로 Paracoccus versutus DSM 582 세포로 도입함으로써, Fe(II)EDTA-NO의 환원을 통한 N2 생성능이 개선된 균주를 제작하였다. 상기 형질전환 균주(Pv/pIND4-Ec norVW)는 카나마이신 (Kanamycin, 50 μg/ml)이 포함된 LB 평판 배지에서 선별하여 수득하였다. 상기 재조합 벡터는 pIND4-Ec norVW로서 실시예1에 기재된 방법과 동일하게 제조되었다. 그 결과, 최종적으로 Pv/pIND4-Ec norVW 균주를 얻었다.
2.2. Fe(II)EDTA-NO의 N 2 로의 환원 전환능 향상
Paracoccus versutus 균주에 대장균 유래 norVW 유전자가 도입된 재조합 Paracoccus versutus 균주 (Pv/pIND4-Ec norVW)를 LB 배지 중에서 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 0.5mM IPTG를 첨가하여 norVW 유전자 발현을 유도하였다. 다음으로, norVW 유전자가 과발현된 Paracoccus versutus 세포를 분리하였다.
분리된 세포를 글루코스 5g/L 및 Fe(II)EDTA-15NO 5mM, pH 7.0 함유 M9 배지에 OD600 =1이 되도록 첨가하여 반응 혼합물을 얻었다.
상기 반응 혼합물 30mL를 60mL 혈청 병에 첨가하고 30℃에서 140rpm으로 교반하면서 5 시간 동안 배양하였다. 상기 혈청 병은 혐기 챔버 내에 유지시켜 혐기 조건이 되도록 하였다. 대조군으로는 Paracoccus versutus 세포 대조군 균주 즉, 공벡터를 포함한 Paracoccus versutus을 사용한 것을 제외하고 동일하다.
다음으로, 상기 반응 혈청 병의 헤드스페이스 내 기체를 샘플링하여 GC-MS로 15N2O 생성량을 분석하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 NOR 경로가 강화된 재조합 Paracoccus versutus를 이용하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2로 전환한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Pv/pIND4-Ec norVW는 대조군 대비하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2로 환원시키는 능력이 현저하게 향상되었다.
실시예 3: Paracoccus versutus 유래 나이트릭 옥사이드 유전자(norC, norB)가 과발현된 재조합 Paracoccus versutus 균주를 이용하여 Fe(II)EDTA-NO를 N 2 로 환원하는 능력 개선
3.1. 재조합 Paracoccus versutus 균주 제작
자연 탈질 미생물인 Paracoccus versutus DSM 582 (Pv) 균주 유래 NorCB 유전자가 과발현된 재조합 Pv 균주를 제작하였다. 구체적으로, Paracoccus versutus DSM 582를 LB 배지 중에서 배양하고, 배양물로부터 분리된 Paracoccus versutus DSM 582 gDNA를 추출하고, 이 gDNA를 주형으로 하고, 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 PCR을 통하여 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 Paracoccus versutus DSM 582 norCB 유전자를 증폭하였다. 벡터 pIND4 (AC Ind et al. Appl Environ Microbiol. 2009 Oct; 75(20): 6613-5)를 주형으로 하고 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 PCR 증폭하여 벡터 절편을 확보하였다. norCB 유전자를 벡터 pIND4에 InFusion Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.)에 기재된 방법을 사용하여 연결하여 norCB 과발현 벡터 pIND4-Pv norCB를 제작하였다. 이때 상기 norCB 유전자는 IPTG에 의하여 발현이 유도되도록 하였다.
상기 norCB 과발현 벡터를 전기 충격 방법 (Sambrook, J & Russell, D.W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)으로 Paracoccus versutus DSM 582 세포로 도입함으로써, Fe(II)EDTA-NO 환원능 개선 균주를 제작하였다. 상기 형질전환 균주(Pv/pIND4-Pv NorCB)는 카나마이신 (Kanamycin, 50 μg/ml)이 포함된 LB 평판 배지에서 선별하여 수득하였다.
3.2. Fe(II)EDTA-NO의 N 2 로의 환원 전환능 향상
Pv/pIND4-Pv NorCB 균주를 LB 배지 중에서 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 0.5mM IPTG를 첨가하여 NorCB 유전자 발현을 유도하였다. 다음으로, NorCB 유전자가 과발현된 Pv/pIND4-Pv NorCB 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 글루코스 5g/L 및 Fe(II)EDTA-15NO 5mM, pH 7.0 함유 M9 배지에 OD600 =1이 되도록 첨가하여 반응 혼합물을 얻었다.
상기 반응 혼합물 30mL를 60mL 혈청 병에 첨가하고 30℃에서 140rpm으로 교반하면서 5 시간 동안 배양하였다. 상기 혈청 병은 혐기 챔버 내에 유지시켜 혐기 조건이 되도록 하였다. 대조군으로는 대조군 균주 즉, 공벡터를 포함한 대장균을 사용한 것을 제외하고 동일하다.
다음으로, 상기 반응 혈청 병의 헤드스페이스 내 기체를 샘플링하여 GC-MS로 15N2 생성량을 분석하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 NOR 경로가 강화된 재조합 Paracoccus versutus를 이용하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2로 전환한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, NorCB를 과발현하는 Paracoccus versutus 균주는 대조군에 비하여 Fe(II)EDTA-15NO를 15N2로 환원시키는 능력이 현저하게 향상되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Samsung Inc. Ltd. <120> Microorganism including genetic modification that increases activity of nitric oxide reductase and method for reducing concentration of nitric oxide in sample <130> PN135845KR <160> 20 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 479 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Ile Val Val Lys Asn Asn Ile His Trp Val Gly Gln Arg Asp 1 5 10 15 Trp Glu Val Arg Asp Phe His Gly Thr Glu Tyr Lys Thr Leu Arg Gly 20 25 30 Ser Ser Tyr Asn Ser Tyr Leu Ile Arg Glu Glu Lys Asn Val Leu Ile 35 40 45 Asp Thr Val Asp His Lys Phe Ser Arg Glu Phe Val Gln Asn Leu Arg 50 55 60 Asn Glu Ile Asp Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Val Ile Asn His Ala 65 70 75 80 Glu Glu Asp His Ala Gly Ala Leu Thr Glu Leu Met Ala Gln Ile Pro 85 90 95 Asp Thr Pro Ile Tyr Cys Thr Ala Asn Ala Ile Asp Ser Ile Asn Gly 100 105 110 His His His His Pro Glu Trp Asn Phe Asn Val Val Lys Thr Gly Asp 115 120 125 Thr Leu Asp Ile Gly Asn Gly Lys Gln Leu Ile Phe Val Glu Thr Pro 130 135 140 Met Leu His Trp Pro Asp Ser Met Met Thr Tyr Leu Thr Gly Asp Ala 145 150 155 160 Val Leu Phe Ser Asn Asp Ala Phe Gly Gln His Tyr Cys Asp Glu His 165 170 175 Leu Phe Asn Asp Glu Val Asp Gln Thr Glu Leu Phe Glu Gln Cys Gln 180 185 190 Arg Tyr Tyr Ala Asn Ile Leu Thr Pro Phe Ser Arg Leu Val Thr Pro 195 200 205 Lys Ile Thr Glu Ile Leu Gly Phe Asn Leu Pro Val Asp Met Ile Ala 210 215 220 Thr Ser His Gly Val Val Trp Arg Asp Asn Pro Thr Gln Ile Val Glu 225 230 235 240 Leu Tyr Leu Lys Trp Ala Ala Asp Tyr Gln Glu Asp Arg Ile Thr Ile 245 250 255 Phe Tyr Asp Thr Met Ser Asn Asn Thr Arg Met Met Ala Asp Ala Ile 260 265 270 Ala Gln Gly Ile Ala Glu Thr Asp Pro Arg Val Ala Val Lys Ile Phe 275 280 285 Asn Val Ala Arg Ser Asp Lys Asn Glu Ile Leu Thr Asn Val Phe Arg 290 295 300 Ser Lys Gly Val Leu Val Gly Thr Ser Thr Met Asn Asn Val Met Met 305 310 315 320 Pro Lys Ile Ala Gly Leu Val Glu Glu Met Thr Gly Leu Arg Phe Arg 325 330 335 Asn Lys Arg Ala Ser Ala Phe Gly Ser His Gly Trp Ser Gly Gly Ala 340 345 350 Val Asp Arg Leu Ser Thr Arg Leu Gln Asp Ala Gly Phe Glu Met Ser 355 360 365 Leu Ser Leu Lys Ala Lys Trp Arg Pro Asp Gln Asp Ala Leu Lys Leu 370 375 380 Cys Arg Glu His Gly Arg Glu Ile Ala Arg Gln Trp Ala Leu Ala Pro 385 390 395 400 Leu Pro Gln Ser Thr Val Asn Thr Val Val Lys Glu Glu Thr Ser Ala 405 410 415 Thr Thr Thr Ala Asp Leu Gly Pro Arg Met Gln Cys Ser Val Cys Gln 420 425 430 Trp Ile Tyr Asp Pro Ala Lys Gly Glu Pro Met Gln Asp Val Ala Pro 435 440 445 Gly Thr Pro Trp Ser Glu Val Pro Asp Asn Phe Leu Cys Pro Glu Cys 450 455 460 Ser Leu Gly Lys Asp Val Phe Glu Glu Leu Ala Ser Glu Ala Lys 465 470 475 <210> 2 <211> 377 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Ser Asn Gly Ile Val Ile Ile Gly Ser Gly Phe Ala Ala Arg Gln 1 5 10 15 Leu Val Lys Asn Ile Arg Lys Gln Asp Ala Thr Ile Pro Leu Thr Leu 20 25 30 Ile Ala Ala Asp Ser Met Asp Glu Tyr Asn Lys Pro Asp Leu Ser His 35 40 45 Val Ile Ser Gln Gly Gln Arg Ala Asp Asp Leu Thr Arg Gln Thr Ala 50 55 60 Gly Glu Phe Ala Glu Gln Phe Asn Leu His Leu Phe Pro Gln Thr Trp 65 70 75 80 Val Thr Asp Ile Asp Ala Glu Ala Arg Val Val Lys Ser Gln Asn Asn 85 90 95 Gln Trp Gln Tyr Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Ala Ser Ala Phe 100 105 110 Val Pro Pro Val Pro Gly Arg Glu Leu Met Leu Thr Leu Asn Ser Gln 115 120 125 Gln Glu Tyr Arg Ala Cys Glu Thr Gln Leu Arg Asp Ala Arg Arg Val 130 135 140 Leu Ile Val Gly Gly Gly Leu Ile Gly Ser Glu Leu Ala Met Asp Phe 145 150 155 160 Cys Arg Ala Gly Lys Ala Val Thr Leu Ile Asp Asn Ala Ala Ser Ile 165 170 175 Leu Ala Ser Leu Met Pro Pro Glu Val Ser Ser Arg Leu Gln His Arg 180 185 190 Leu Thr Glu Met Gly Val His Leu Leu Leu Lys Ser Gln Leu Gln Gly 195 200 205 Leu Glu Lys Thr Asp Ser Gly Ile Gln Ala Thr Leu Asp Arg Gln Arg 210 215 220 Asn Ile Glu Val Asp Ala Val Ile Ala Ala Thr Gly Leu Arg Pro Glu 225 230 235 240 Thr Ala Leu Ala Arg Arg Ala Gly Leu Thr Ile Asn Arg Gly Val Cys 245 250 255 Val Asp Ser Tyr Leu Gln Thr Ser Asn Thr Asp Ile Tyr Ala Leu Gly 260 265 270 Asp Cys Ala Glu Ile Asn Gly Gln Val Leu Pro Phe Leu Gln Pro Ile 275 280 285 Gln Leu Ser Ala Met Val Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Asn Asn Thr 290 295 300 Pro Leu Lys Leu Pro Ala Met Leu Val Lys Ile Lys Thr Pro Glu Leu 305 310 315 320 Pro Leu His Leu Ala Gly Glu Thr Gln Arg Gln Asp Leu Arg Trp Gln 325 330 335 Ile Asn Thr Glu Arg Gln Gly Met Val Ala Arg Gly Val Asp Asp Ala 340 345 350 Asp Gln Leu Arg Ala Phe Val Val Ser Glu Asp Arg Met Lys Glu Ala 355 360 365 Phe Gly Leu Leu Lys Thr Leu Pro Met 370 375 <210> 3 <211> 462 <212> PRT <213> Paracoccus versutus DSM 582 <400> 3 Met Arg Tyr His Ser Gln Arg Ile Ala Tyr Ala Tyr Phe Leu Val Ala 1 5 10 15 Met Ala Leu Phe Ala Val Gln Val Ile Phe Gly Leu Ile Met Gly Trp 20 25 30 Ile Tyr Val Ser Pro Asn Phe Leu Ser Glu Leu Leu Pro Phe Asn Ile 35 40 45 Ala Arg Met Leu His Thr Asn Ser Leu Val Val Trp Leu Leu Leu Gly 50 55 60 Phe Phe Gly Ala Thr Tyr Tyr Ile Leu Pro Glu Glu Ala Glu Arg Glu 65 70 75 80 Ile His Ser Pro Met Leu Ala Tyr Ile Gln Leu Gly Ile Phe Val Leu 85 90 95 Gly Thr Leu Gly Val Val Val Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Phe His Gly 100 105 110 His Trp Leu Leu Gly Lys Glu Gly Arg Glu Phe Leu Glu Gln Pro Lys 115 120 125 Trp Val Lys Val Gly Ile Ala Val Ala Ala Val Ile Phe Met Tyr Asn 130 135 140 Val Ser Met Thr Ala Leu Lys Gly Arg Arg Thr Ala Val Thr Asn Val 145 150 155 160 Leu Leu Met Gly Leu Trp Gly Leu Val Leu Leu Trp Leu Phe Ala Phe 165 170 175 Tyr Asn Pro Ala Asn Leu Val Leu Asp Lys Gln Tyr Trp Trp Trp Val 180 185 190 Ile His Leu Trp Val Glu Gly Val Trp Glu Leu Ile Met Ala Ala Ile 195 200 205 Leu Ala Phe Leu Met Leu Lys Leu Thr Gly Val Asp Arg Glu Val Val 210 215 220 Glu Lys Trp Leu Tyr Val Ile Val Ala Thr Ala Leu Phe Ser Gly Ile 225 230 235 240 Leu Gly Thr Gly His His Tyr Tyr Trp Ile Gly Leu Pro Ala Tyr Trp 245 250 255 Gln Trp Ile Gly Ser Ile Phe Ser Ser Phe Glu Ile Val Pro Phe Phe 260 265 270 Ala Met Met Ser Phe Ala Phe Val Met Val Trp Lys Gly Arg Arg Asp 275 280 285 His Pro Asn Lys Ala Ala Leu Val Trp Ser Leu Gly Cys Thr Val Leu 290 295 300 Ala Phe Phe Gly Ala Gly Val Trp Gly Phe Leu His Thr Leu His Gly 305 310 315 320 Val Asn Tyr Tyr Thr His Gly Thr Gln Ile Thr Ala Ala His Gly His 325 330 335 Leu Ala Phe Tyr Gly Ala Tyr Val Cys Leu Val Leu Ala Leu Val Thr 340 345 350 Tyr Cys Met Pro Leu Met Lys Asn Arg Asp Pro Tyr Asn Gln Val Leu 355 360 365 Asn Met Ala Ser Phe Trp Leu Met Ser Ser Gly Met Val Phe Met Thr 370 375 380 Val Thr Leu Thr Phe Ala Gly Thr Val Gln Thr His Leu Gln Arg Val 385 390 395 400 Glu Gly Gly Phe Phe Met Asp Val Gln Asp Gly Leu Ala Leu Phe Tyr 405 410 415 Trp Met Arg Phe Gly Ser Gly Val Ala Val Val Leu Gly Ala Leu Leu 420 425 430 Phe Ile Tyr Ala Val Leu Phe Pro Arg Arg Glu Val Val Thr Ala Gly 435 440 445 Pro Val Gln Ala His Lys Asp Gly His Leu Glu Ala Ala Glu 450 455 460 <210> 4 <211> 150 <212> PRT <213> Paracoccus versutus DSM 582 <400> 4 Met Ser Glu Ile Met Thr Lys Asn Met Ala Arg Asn Val Phe Tyr Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ile Phe Phe Ile Leu Ile Phe Gly Ala Leu Thr Val His Ser 20 25 30 His Ile Tyr Ala Arg Thr Lys Ala Val Asp Glu Ser Gln Leu Thr Pro 35 40 45 Ser Val Ala Glu Gly Lys His Ile Trp Glu Arg Asn Ala Cys Ile Asp 50 55 60 Cys His Thr Ile Leu Gly Glu Gly Ala Tyr Phe Ala Pro Glu Leu Gly 65 70 75 80 Asn Val Met Lys Arg Trp Gly Val Gln Asp Asp Pro Glu Ser Ala Phe 85 90 95 Glu Thr Leu Lys Gly Trp Met Glu Ser Met Pro Thr Gly Ile Glu Gly 100 105 110 Arg Arg Gln Met Pro Arg Phe Asp Leu Thr Asp Glu Glu Phe Arg Ala 115 120 125 Leu Ser Asp Phe Leu Leu Trp Thr Gly Thr Ile Asn Thr Gln Asn Trp 130 135 140 Pro Pro Asn Asp Ala Gly 145 150 <210> 5 <211> 1440 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 atgtctattg tggtgaaaaa taacattcat tgggttggtc aacgtgactg ggaagtgcgt 60 gattttcacg gcacggaata taaaacgctg cgcggcagca gctacaatag ctacctcatc 120 cgcgaagaaa aaaacgtgct gatcgacacc gtcgaccata aattcagccg cgaatttgtg 180 cagaacctgc gtaatgaaat cgatctggcg gatatcgatt acatcgtgat taaccatgca 240 gaagaggacc acgctggggc gctgaccgaa ctgatggcac aaattcccga tacgccgatc 300 tactgtacag ccaacgctat cgactcgata aatggtcatc accatcatcc ggagtggaat 360 tttaatgtgg tgaaaactgg cgacacgctg gatatcggca acggcaaaca gctcattttt 420 gtcgaaacac caatgctgca ctggccggac agcatgatga cttacctgac aggcgacgcg 480 gtgctgttca gtaacgatgc tttcggtcaa cactactgcg acgagcatct gttcaacgat 540 gaagtggatc agacggagct tttcgagcag tgccagcgtt actacgccaa tatcctgacg 600 ccgttcagcc gcctggtaac accgaaaatt accgagatcc tgggctttaa cttaccagtc 660 gatatgatag ccacttccca cggcgtggta tggcgcgata acccgacgca aattgtcgag 720 ctgtacctga aatgggcggc tgattatcag gaagacagaa tcaccatttt ctacgacacc 780 atgtcgaata acacccgcat gatggctgac gctatcgccc aggggattgc ggaaaccgac 840 ccacgcgtgg cggtgaaaat tttcaacgtc gcccgaagcg ataaaaacga aatcctgact 900 aatgtcttcc gctcaaaagg cgtgctggtc ggcacttcga cgatgaataa cgtgatgatg 960 ccgaaaatcg ccgggctggt ggaggagatg actggtttac gcttccgtaa caaacgcgcc 1020 agtgctttcg gctctcacgg ctggagcggc ggtgcggtgg atcgtctttc cacgcgcctg 1080 caggatgcgg gtttcgaaat gtcgcttagc ctgaaagcga aatggcgacc agaccaggac 1140 gctctgaagt tatgccgtga acacggtcgc gaaatcgccc gtcagtgggc gctcgcgccg 1200 ctgccgcaga gcacggtgaa tacggtagtt aaagaagaaa cctctgccac cacgacggct 1260 gacctcggcc cacggatgca gtgcagcgtc tgccagtgga tttacgatcc ggcaaaaggc 1320 gagccaatgc aggacgttgc gccaggaacg ccgtggagtg aagtcccgga taacttcctc 1380 tgcccggaat gctccctcgg caaagacgtc tttgaagaac tggcatcgga ggcaaaatga 1440 <210> 6 <211> 1134 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atgagtaacg gcattgtgat catcggttcg ggcttcgccg cccgccaact ggtgaaaaat 60 attcgcaaac aggacgccac tattccatta accctgattg ccgccgacag catggatgag 120 tacaacaaac ctgacctcag ccatgttatc agtcaggggc aacgtgccga tgaccttacc 180 cgccagacgg cgggtgaatt tgccgagcag tttaatctgc acctgtttcc acaaacctgg 240 gtgacggata tcgatgccga agcccgtgtg gtgaaaagcc agaataatca gtggcaatac 300 gacaagctag tactggcaac cggtgccagt gcctttgtcc cgcctgtgcc tgggcgtgag 360 ttaatgctga cgttaaatag tcagcaagag tatcgcgcct gtgaaacgca actgcgggat 420 gcccgacgcg tgttgattgt tggcggtggt ttgattggta gcgaactggc gatggatttt 480 tgtcgtgcag gcaaagcggt cacgctaatc gacaacgctg ccagtattct ggcgtcgtta 540 atgccaccgg aagtaagcag ccgcttgcag catcggttga cggagatggg cgttcatctg 600 ctgttgaaat ctcagttaca ggggctggaa aaaacggatt ctggcattca ggcaacgctg 660 gaccgccagc gcaatatcga agtggatgcg gtaattgccg ccaccggact gcgcccggaa 720 accgccctgg cacgacgcgc cgggctgacg attaatcgcg gcgtttgcgt cgatagttat 780 ctgcaaacca gtaataccga tatttacgcg ctgggcgatt gcgcggaaat taacggtcag 840 gtattgccgt tcctccagcc gattcaactt agcgcgatgg tgctggcaaa aaatcttctc 900 ggcaataaca cgccgctgaa actcccggcg atgctggtga aaatcaaaac gccggaatta 960 ccgctgcatc tggcaggcga aacccagcgt caggatttac gctggcaaat taataccgaa 1020 cgccagggaa tggtggcgcg cggcgttgac gatgctgacc agcttcgcgc ctttgtggtc 1080 agtgaggatc ggatgaaaga ggcatttgga ttgttgaaaa cattgccgat gtag 1134 <210> 7 <211> 1389 <212> DNA <213> Paracoccus versutus DSM 582 <400> 7 atgagatacc attcgcaacg catcgcctat gcctatttcc tggtggccat ggcgcttttc 60 gccgttcagg tgattttcgg cctgatcatg ggctggatct atgtcagccc gaatttcctg 120 tccgaattgc tgccctttaa tatcgcgcgg atgctgcata ccaacagcct ggtcgtctgg 180 ctgctcttgg gctttttcgg cgcgacctat tacatcctgc ccgaagaggc cgagcgcgaa 240 atccattcgc cgatgctggc ctatatccag ctgggcattt tcgtgctggg cacgctgggc 300 gtggtcgtga cctatctgtt cgaccttttc catggccatt ggcttttggg caaggagggg 360 cgcgagttcc tggaacaacc gaaatgggtc aaggtcggca tcgccgtggc cgcggtgatc 420 ttcatgtaca acgtcagcat gaccgcgctg aagggccggc ggacggcggt cacgaacgtg 480 ctgctgatgg gcctgtgggg gctggtgctg ctgtggctct ttgccttcta caacccggcg 540 aacctggtcc tcgacaagca atactggtgg tgggtgatcc acctgtgggt cgagggcgtg 600 tgggagctga tcatggccgc catcctcgcc ttcctgatgc tcaagctgac cggcgtggac 660 cgcgaggtgg tcgagaaatg gctttacgtc atcgtcgcca cggcgctgtt ctcgggcatc 720 ctgggcaccg ggcaccacta ctactggatc ggcctgccgg cctattggca gtggatcggc 780 tcgatcttct cgagcttcga gatcgtgccc ttcttcgcga tgatgtcctt tgccttcgtc 840 atggtctgga agggccggcg cgaccacccg aacaaggcgg cgctggtctg gagcctgggc 900 tgcaccgtgc tggccttctt cggggccggg gtctggggct tcctgcacac gctgcacggg 960 gtgaactact atacccacgg cacgcagatc accgccgcgc atggccacct ggccttctat 1020 ggcgcctatg tctgcctggt gctggcgctg gtgacctatt gcatgccgct gatgaagaac 1080 cgcgacccct acaaccaggt gctgaacatg gcctcgttct ggctgatgtc ctcgggcatg 1140 gtgttcatga cggtgacgct gaccttcgcc ggcacggtgc agacccatct gcagcgggtc 1200 gagggcgggt tcttcatgga cgtgcaggac gggctggcgc tgttctactg gatgcgcttc 1260 ggctcgggcg tcgcggtggt gctgggcgcg ctgctcttca tctatgcggt gctgttcccg 1320 cgccgcgagg tggtcacagc cggcccggtg caggcgcaca aggacggcca cctggaggct 1380 gcggagtaa 1389 <210> 8 <211> 453 <212> DNA <213> Paracoccus versutus DSM 582 <400> 8 atgagcgaaa tcatgaccaa gaacatggcc cggaacgtct tctacggcgg gtccatattc 60 ttcatcctga tctttggcgc gttaaccgtg catagccata tctatgcccg caccaaggca 120 gtggatgaaa gccagctcac cccctcggtc gccgagggca agcatatctg ggaacgcaac 180 gcctgcattg actgccatac catcctgggc gagggcgcct atttcgcccc cgagcttggc 240 aatgtgatga aacgctgggg cgtgcaggat gatcccgaat ccgccttcga gacgctgaag 300 ggctggatgg aatccatgcc caccggaatc gagggtcgcc gccagatgcc ccgcttcgat 360 ctgacggacg aggaattccg ggcgctgtcg gatttcctgc tgtggaccgg cacgatcaac 420 acccagaact ggccaccgaa cgacgcgggc tga 453 <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 gcaattagca agacatcttt ttagaacacg ctgaataaat tgaggttgct gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 10 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 10 ggataagacg cgccagcgtc gcatccgaca ttttaggcac agtagcccac catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 tcatctttgc ctcactgtca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 gaagtccaga acggataaaa 20 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 13 taaagaggag aaattaacca tgtctattgt ggtgaaaa 38 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 14 ccaagctcag ctaattaagc ttacatcggc aatgttttc 39 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 15 ttttcaccac aatagacatg gttaatttct cctcttta 38 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 gaaaacattg ccgatgtaag cttaattagc tgagcttgg 39 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 taaagaggag aaattaacca tgagcgaaat catgaccaa 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 ccaagctcag ctaattaagc ttactccgca gcctccagg 39 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 ttggtcatga tttcgctcat ggttaatttc tcctcttta 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 cctggaggct gcggagtaag cttaattagc tgagcttgg 39

Claims (20)

  1. 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase, NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 유전적 변형인 것인 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 Escherichia 속 및Paracoccus 속 유래의 나이트릭 옥사이드 리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 미생물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 Escherichia coli 및 Paracoccus versutus로 이루어진 군으로부터 선택된 균주로부터 유래된 것인 미생물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 플라보디아이언 단백질(flavodiiron protein, FDP)에 속하는 플라보루브레독신(flavorubredoxin, FlRd) 또는 EC 1.7.2.5에 속하는 시토크롬 c 의존성 나이트릭 옥사이드 리덕타제인 것인 미생물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 아미노산 서열과 각각 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 두 개 폴리펩티드를 포함하는 것인 미생물.
  7. 청구항 1에 있어서, Escherichia 속 또는 Paracoccus 속에 속하는 것인 미생물.
  8. 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 포함하는, 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 유전적 변형인 것인 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 플라보디아이언 단백질(flavodiiron protein, FDP)에 속하는 플라보루브레독신(flavorubredoxin, FlRd) 또는 EC 1.7.2.5에 속하는 시토크롬 c 의존성 나이트릭 옥사이드 리덕타제인 것인 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드는 Fe(II)(L)-NO의 형태로서, 킬레이팅제(chelating agent) L과 Fe2+와 NO가 착화되어 복합체를 형성한 것인 조성물.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 시료는 액체 또는 기체 상태인 것인 조성물.
  13. 청구항 8에 있어서, 상기 미생물은 Escherichia 속 또는 Paracoccus 속에 속하는 것인 조성물.
  14. 나이트릭 옥사이드 리덕타제(nitric oxide reductase: NOR)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 나이트릭 옥사이드 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 나이트릭 옥사이드의 농도를 감소시키는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 유전적 변형인 것인 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드 리덕타제는 플라보디아이언 단백질(flavodiiron protein, FDP)에 속하는 플라보루브레독신(flavorubredoxin, FlRd) 또는 EC 1.7.2.5에 속하는 시토크롬 c 의존성 나이트릭 옥사이드 리덕타제인 것인 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 나이트릭 옥사이드는 Fe(II)(L)-NO의 형태로서, 킬레이팅제(chelating agent) L과 Fe2+와 NO가 착화되어 복합체를 형성한 것인 방법.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것인 방법.
  19. 청구항 14에 있어서, 상기 접촉은 상기 재조합 미생물을 나이트릭 옥사이드 함유 시료와 접촉시키면서 배양 또는 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 14에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 재조합 미생물이 증식하는 조건에서 배양하는 것은 포함하는 것인 방법.
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