KR20220071892A - 신규한 항-c-mpl 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 골수 내, 거핵구의 성숙을 통한 혈소판 생성 및 수적 증가 효과를 갖는 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 항-C-MPL 항체(2R13)는 고분자 물질로서 종래 치료 제제에 비해 긴 반감기를 가지며, 항체 제제로써 자가 항체 생성 및 면역원성 가능성이 낮다는 장점이 있다. 또한, 만성 또는 합병증으로 유도되는 면역 혈소판 감소증이 나타나는 환자의 혈소판 수치를 증가시켜, 혈소판 감소증의 치료 제제로 사용될 수 있다.

Description

신규한 항-C-MPL 항체 및 이의 용도{Novel anti-C-MPL antibodies and uses thereof}

본 발명은 신규한 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 골수 내, 거핵구의 성숙을 통한 혈소판 생성 및 수적 증가 효과를 갖는 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

면역 혈소판 감소증(ITP)은 가속화된 혈소판 파괴 및 혈소판 생성 장애로 인한 낮은 혈소판 수(분리된 말초 혈소판 수 100 × 10⁹ L 미만)를 특징으로 한다. 병원성 자가반응 항체, 혈소판 항원에 대한 T 세포, 사이토카인 불균형 및 골수 틈새의 미세 환경은 말초 혈소판 수치 감소에 기여하여, 주로 만성 질환으로 이어진다. ITP 환자의 약 18%는 무증상이지만, 활동성 출혈은 ITP 환자의 주요 위험인자이며 비출혈을 포함하는 점상출혈, 자반병, 요로 점막출혈, 위장관 또는 구강 내 출혈 등 다양한 증상으로 나타날 수 있다. 따라서 충분한 지혈이 가능한 내구성 혈소판 수를 회복시키는 것이 ITP 환자의 주요한 치료 전략이 되었다.

생리학적으로 혈전의 생성은 다양한 사이토카인에 의해 여러 단계에서 조절되며, 그 중 가장 중요한 것은 트롬보포이에틴(TPO)이다. TPO는 HSC에서 거핵구 계통을 결정하고 TPO 수용체인 c-MPL을 통해 골수 틈새에서 거핵구의 성숙을 자극한다. 이러한 과정은 순환하는 혈소판에 의한 TPO에 대한 결합 및 제거를 수반하는 음성 피드백 루프를 통해 혈장 TPO 수준에 의해 조절된다. 따라서, 감소된 혈소판 수는 순환 TPO 수준을 증가시키고, 이는 차례로 거대핵세포 생성을 촉진하여 혈소판 수를 정상화한다. 실제로 재생 불량성 빈혈에 의해 유발된 이차 유발성 혈소판 감소증 환자에서 TPO 수준의 상승이 나타났다. 그러나 ITP 환자에서 TPO 수치와 혈소판 회전율은 유의한 변화가 없었다. 오히려 건강한 피험자와 비교할 때 정상 또는 감소된 TPO 수준과 더 짧은 생존 시간을 가진 혈소판이 관찰되었다. 또한 일부 환자에서 거핵구의 수가 증가하였으나, 이러한 거핵구는 종종 미성숙하거나 형태학적 이상을 나타내면서 caspase-3가 활성화되어 혈소판 생산성을 저하시켰다. 이러한 임상 결과는 항상성에 도달하기 위해 내인성 TPO를 모방하는 치료제의 개발로 이어졌다.

현재까지 FDA에서 ITP 치료제로 승인한 TPO 모방체(TPO-RA)는 로미플로스팀(Romiplostim), 엘레트롬보팍(Eltrombopag) 및 아바트롬보팍(Avatrombopag)이다. 로미플로스팀이 세포외 분자에 작용하는 펩티바디인 반면, 나머지는 막횡단 부위에 결합하는 비 펩티드 분자이며, 임상 시험에서 혈소판 생성 및 지혈에 대한 이러한 제제들의 효능 및 내약성이 이미 검증되었다. 그럼에도 불구하고 로미플로스팀을 투여받는 일련의 1차 ITP 성인 환자의 경우, 피험자의 59.5%가 내인성 TPO와의 교차 반응성 없이 원치 않는 중화 항체로 인해 반응 상실을 나타냈으며, 엘레트롬보팍은 비특이성으로 보고되었다. 이러한 제제는 강력한 철 킬레이트제 역할을 하여 백혈병 세포주에 항증식 효과를 일으키고 일부 환자에서는 드물게 철 결핍을 유발한다. 또한 식이 제한 및 간독성과 같은 비교적 빈번한 부작용이 기술되었다. 아바트롬보팍은 기존 치료제 부족에 대한 대안으로 2018년 FDA 승인을 받았다. 이로써 기존 의약품(로미플로스팀, 엘레트롬보팍)의 문제점은 해결됐지만, 일일 투여 빈도가 요구되었다. 아바트롬보팍 및 그 대사체의 88%는 주로 대변으로 배설되며, 그 중 34%는 대사되지 않은 상태로 배설된다. 이러한 결과는 더 오래 지속되고 더 효과적인 치료법이 개발될 필요성이 있음을 의미한다.

TPO 작용제 미니바디, Fab 및 도메인 하위 분류 변환된 TPO 작용제 항체를 설정하려는 이전의 시도에도 불구하고, 항체 기반 TPO 작용제의 임상 연구는 아직 보고되지 않았다. 본 발명에서, 본 발명자들은 TPO 수용체 작용제 항체를 개발하였다. 이 작용제 ab는 인간 1차 세포에서 거핵 생성 및 혈소판 활성화를 자극하도록 구성되었으며, 동시에 혈소판 감소증 유발 마우스 모델에서 혈소판 수를 회복하여 천연 리간드 TPO의 생물학적 기능을 복제함을 입증하였다. 본 발명은 치료적 관점에서, 연장된 반감기와 효능 및 임상 안전성을 보장하는 우수한 TPO 모방체로서 제공될 수 있다.

국제특허공개공보 WO 2015-029074

본 발명의 목적은 신규 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 신규한 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 대한 것으로, 구체적으로 골수 내, 거핵구의 성숙을 통한 혈소판 생성 및 수적 증가 효과를 갖는 항-C-MPL 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 항-C-MPL 항체(2R13)는 고분자 물질로서 종래 치료 제제에 비해 긴 반감기를 가지며, 항체 제제로써 자가 항체 생성 및 면역원성 가능성이 낮다는 장점이 있다. 또한, 만성 또는 합병증으로 유도되는 면역 혈소판 감소증이 나타나는 환자의 혈소판 수치를 증가시켜, 혈소판 감소증의 치료 제제로 사용될 수 있다.

도 1은 기능성 scFv-Fc 항체인 2R13이 TPOR에 특이적으로 결합함을 나타내는 것이다.
도 2는 2R13이 세포 성장을 촉진하고 BaF3/MPL 세포에서 JAK/STAT 신호 전달 경로를 자극함을 나타낸 것이다.
도 3 내지 도 5는 2R13이 PB CD34+ 세포의 거핵세포 분화를 유도함을 나타낸 것이다.
도 6 내지 도 8은 2R13이 PB-CD34+ 세포로부터 높은 배수성 거핵구 분화를 유도함을 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 2R13이 인간 혈소판에서 TPOR 신호 전달 경로를 자극함을 나타낸 것이다.
도 11은 WT 마우스 모델에서 혈소판 및 WBC에 대한 2R13의 효과 및 HSPC 유도 가능성을 나타낸 것이다.
도 12는 혈소판 감소증 모델에서 혈소판 및 WBC에 대한 2R13의 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

한편, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시되는 아미노산으로 이루어진 CDR들은 아래 표 1에 기재하였다.

Antibody 2R13 CDR sequence
VH CDR Seq.	CDR1	RDTFNTYG	서열번호 1
	CDR2	IIPIFGTA	서열번호 2
	CDR3	ARDRRAGGYDY	서열번호 3
VL CDR Seq.	CDR1	QGLGRW	서열번호 4
	CDR2	AAS	서열번호 5
	CDR3	QQSNSFPWT	서열번호 6

본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 서브타입(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.

본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "CDR"이란, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에 항체마다 다른 아미노산 서열을 가지는 부위인 초가변영역(hypervariable region)으로서, 항원과 결합하는 부위를 의미한다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 GFRAL에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.

본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.

본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.

또한, 본 발명은 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 약학조성물은 거대핵세포 생성, 혈소판 활성화 및 혈소판 수 증가를 유도할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 전이 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화하여 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 조성물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물에 함유된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 세포주 및 세포 배양

Arthur J. Sykowski (Beth Israel Deaconedd Medical Center, Boston, MA)로부터 얻은 뮤린 pre-B 세포주 BaF3 세포를 10% 소태아혈청(FBS) 및 5% WEHI-3B 세포 조건 배지(WEHI-CM, 즉 인터루킨-3 (IL-3)의 공급원)를 함유하는 RPMI-1640(Lonza)에서 유지했다. 인간 트롬보포이에틴 수용체(hTPOR, 유전자명 MPL)를 발현하는 BaF3/MPL 세포주를 확립하기 위해 BaF3 세포를 pCMV-hMPL 플라스미드(Origene)로 안정적으로 형질감염 시켰다. hTPOR의 표면 발현은 CD110-APC(MiltenyiBiotech)를 사용한 유세포 분석에 의해 확인되었다. 급성 거핵모구성 백혈병 세포주 MO7e는 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에서 구입하여 10% FBS 및 10ng/mL IL-3가 보충된 Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM)에서 유지했다. 고신대학교 복음병원(KUGH) 혈액은행에서 유통기한 1~2일 이내의 정상 인간 혈소판을 채취했다. 인간 유래 샘플(혈소판 및 말초혈액, PB)을 사용한 본 발명의 연구는 KUGH의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다.

2. 세포 증식 분석

TPOR 작용제의 활성을 결정하기 위해 BaF3/MPL의 경우 1 × 10⁴ cells/㎖ 또는 Mo7e의 경우 5 × 10⁵ cells/㎖를 사용하여 세포 증식 분석을 수행했다. 10% FBS가 포함된 RPMI의 BaF3/MPL 세포 및 10% FBS가 포함된 IMDM의 MO7e 세포(IL-3 보충 없음)는 다양한 농도의 TPOR 작용제의 존재 또는 부재 하에 96웰 플레이트에서 48시간 동안 배양되었다. 세포 증식은 제조사의 지침에 따라 Cell Titer-Glo 발광 세포 생존력 분석 키트(Promega)에 의해 평가되었고 발광 신호는 Victor 3 1420 Multilabel Counter(Perkin Elmer)에서 측정되었다.

3. 신호 변환 실험

BaF3/MPL 세포(4 × 10⁵ cells/㎖) 또는 인간 혈소판을 PBS로 세척하고 0.5% FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 각각 밤새 또는 3시간 동안 혈청-고갈시켰다. 지정된 시간 동안 표시된 농도의 TPOR 작용제로 세포 또는 혈소판을 자극했다. 세포는 프로테아제 억제제 칵테일(Calbiochem) 및 단백질 포스파타제 억제제 칵테일(Calbiochem)이 보충된 RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay) 완충액(Elpis Biotech)으로 용해하였다. BCA 분석 키트(Pierce)를 사용하여 용해물을 정량화하고 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 샘플 완충액에서 95℃에서 5분 동안 가열했다. 샘플(10μg/웰)을 SDS-PAGE 겔(Bio-Rad)에서 분리하고 니트로셀룰로오스 막(Millipore)으로 옮겼다. 1차 및 2차 항체와 순차적으로 배양한 후 Thermo ECL 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 화학발광 신호를 검출한 후 Amersham Imager 600(GE Healthcare Life Sciences)으로 시각화했다. Janus 계열의 티로신 키나제(Jak2), p-Jak2, 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT5), p-STAT5(Y925), STAT3, p-STAT3(Y705), AKT, p-AKT(S473)에 대한 1차 항체, ERK 및 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)는 Cell Signaling Technology에서 구입하였으며 베타 액틴에 대한 항체는 Novus Biological에서 구입했다.

4. PB-CD34+ 세포의 분리

G-CSF가 동원된 인간 성분채집 샘플의 분취량은 서면 동의를 얻은 후 KUGH에서 조혈 전구 세포 성분채집을 위한 표준 절차의 가이드 내에서 건강한 기증자로부터 얻었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Ficolle-Hypaque(sigma)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 분리되었고 제조업체의 지침에 따라 MACS CD34 MicroBead 키트 UltraPure(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 PB-CD34+ 세포의 면역선택을 거쳤다. PB-CD34+ 세포 순도는 CD34-PE를 사용한 유동 분석에 의해 통상적으로 95%보다 높았다.

5. 유세포 분석을 이용한 거핵 생성 분석

PB-CD34+ 세포(4×10⁴/㎖)는 25ng/㎖ rhSCF(PeproTech), 10ng/㎖ rhIL6(PeproTech), 10ng/㎖ rhIL9(PeproTech), 25μg/㎖ LDL(Stem Cell Technologies) 및 다양한 농도의 TPOR 작용제가 보충된 무혈청 확장 배지(SFEM, Stem Cell Technologies)에서 최대 14일 동안 배양되었다. 배양 배지의 절반을 3-4일마다 새로운 배지와 사이토카인으로 교체하였다. 거대핵생성은 유세포분석에 의해 거핵세포에 특이적인 분화 마커를 검출함으로써 평가되었다. 표시된 각각의 시점에서 세포를 수확하여 차가운 PBS로 세척하고 CD41a-FITC(Miltenyi Biotec), CD42b-PE(Miltenyi Biotec) 및 7-AAD(eBioscience)로 30분 동안 4℃ 암실에서 표지하였다. 세척 후 세포는 CytoFlex 유세포분석기(Beckman Coulter Inc.)를 사용하여 분석하였다.

6. 거핵구 배수성 분석

13일 동안 배양된 PB-CD34+ 세포를 4℃에서 30분 동안 CD41a-FITC로 표지하고 차가운 PBS로 세척하였다. 표지된 세포를 실온에서 15분 동안 1% 파라포름알데히드와 함께 인큐베이션하여 고정시켰다. 세포를 -20℃에서 1시간 동안 70% 메탄올로 투과화시켰다. 투과화 후 세포를 10 ㎍/㎖ RNase(Roche)로 처리하고 10 ㎍/㎖ propidium iodide(sigma)로 실온에서 30분간 염색한 후 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.

7. 생체 내(in vivo ) 실험

혈소판 및 백혈구(WBC)에 대한 2R13의 효과는 야생형(WT) 및 5-플루오로우라실(5-FU)로 유도된 혈소판 감소증 마우스 모델에서 확인하였다. 8-10주령 BALB/c 야생형 암컷 마우스(나라바이오텍, 서울, 한국)에 2R13, 재조합 인간 TPO(rHuTPO)를 피하 주사하였다. 5, 50, 100, 500 μg/kg 농도의 1회 주입용 2R13을 주입하였다. 7일 동안 양성 대조군으로 2.5㎍/kg/day의 rHuTPO 주사를, 음성 대조군으로 BSA를 함유하는 PBS(PBS-BSA)를 사용하였다. 혈소판 감소증 모델을 확립하기 위해 2R13 및 rHuTPO를 주사하기 1시간 전에 5-FU(Sigma, USA)를 150 mg/kg의 용량으로 각 그룹의 마우스에 복강내 주사하였다. 1회 주입된 2R13의 농도는 0.5 및 1mg/kg으로 증가되었다. rHuTPO 및 PBS-BSA를 동일한 농도로 7일 동안 주입하였다. 각 마우스에 케타민(90 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취하고, 14일 동안 격일로 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 모세관(Marienfeld, Germany)을 사용하여 안와후동에서 50 μl의 혈액 샘플을 채취했다 (주사 전 0일, 치료 후 4, 7, 11 및 14일). 혈액을 450㎕의 2.5mM EDTA 완충액으로 미리 채워진 EDTA 튜브에 옮겼다. 혈소판과 백혈구는 EONE 연구소(한국 인천)에서 계산하였으며, 동물 실험은 University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee(2020-022)에서 승인한 지침에 따라 수행되었다.

8. 유세포 분석

1일 동안 2R13(0.5, 1mg/kg/일), 7일 동안 rHuTPO(2.5㎍/kg/일) 및 PBS-BSA를 마우스에 주사하였다. 7일째에, 마우스를 희생시킨 후, 수집된 골수 세포(BM)를 PBS로 대퇴골 및 경골로부터 세척하였다. BM 적혈구(RBC)를 실온에서 1분 동안 용해 완충액으로 용해시켰다. LSK 세포의 비율을 조사하기 위해, BM 세포를 PBS에 현탁시키고 PerCP-Cy5.5-표지된 계통 항체, FITC-접합된 항-Sca-1 및 APC-접합된 항-c-Kit 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양했다(미국 BD). FACS CantoII 유세포 분석기와 FlowJo 소프트웨어(BD, USA)를 사용하여 형광을 분석했다.

< 실시예 1> TPOR을 특이적으로 활성화시키는 기능성 항체 개발

나이브한 인간 조합 Ab 파지 라이브러리(다양성:

10⁹)에서 c-MPL에 대한 결합 후보를 찾기 위해 도 1A과 같이 솔루션 패닝을 수행했다. 3 라운드의 패닝 후, TPOR 결합 클론이 명확하게 풍부하고 TPOR에 양성 결합을 갖는 6개의 클론을 선택했음을 확인했다(도 1B, 도 1C). 다음으로, 이들 클론 사이에 잠재적인 작용제 항체가 있는지 평가했다. 선별된 클론을 scFv-Fc 융합 형태로 전환한 후 키메라 세포(BaF3/MPL)의 TPO 의존적 성장을 통해 기능적 활성을 조사하였다. 6개의 클론 중 2R13이 낮은 농도에서 가장 높은 활성을 나타내어 최종 후보로 선정하였다(도 1D). 2R13의 결합 친화도를 특성화하기 위해 항체 ELISA를 수행하였다(도 1E). 2R13의 EC50은 55.27ng/ml였다. 또한, 2R13은 농도 의존적 방식으로 BaF3/MPL에 대해 염색된 반면, 모 BaF3 세포에서는 염색되지 않았으며, 이는 TPOR에 대한 특이적 결합을 나타냄을 알 수 있다(도 1F).

< 실시예 2> 세포 증식을 촉진하고 BaF3 / MPL 세포에서 TPOR 신호 전달 경로를 자극하는 2R13

2R13의 증식 능력을 조사하기 위해, BaF3/MPL 세포를 다양한 농도의 2R13 또는 rhTPO의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 2R13과 rhTPO는 모두 농도 의존적 방식으로 BaF3/MPL 세포의 성장을 촉진했다(도 2A). 상대 세포 증식은 100ng/ml rhTPO의 최대 증식 능력으로 계산되었다. 그 결과, 2R13과 rhTPO의 EC50s는 각각 53.4ng/ml와 1.3ng/ml이었다. hMPL을 발현하지 않는 모 BaF3 세포에서, 세포 증식은 mIL-3를 함유하는 WEHI-CM을 처리한 경우에만 증가했지만, 2R13 또는 rhTPO를 처리한 경우에는 증가하지 않았으며(도 2B), 이는 도 1A에 표시된 증가된 세포 증식이 TPOR에 특이적임을 입증한다. 2R13과 rhTPO는 또한 내인성 수준의 TPOR을 발현하는 것으로 알려진 MO7e 세포의 증식을 촉진했다(도 2C). TPO는 TPOR에 결합하고 JAK/STAT 경로를 포함한 세포 내 신호 전달을 유발한다. 2R13이 BaF3/MPL 세포에서 세포 증식을 촉진하는 메커니즘을 확인하기 위해 JAK2, STAT5, STAT3, AKT 및 ERK의 인산화를 조사했다. rhTPO의 결과와 유사하게 2R13은 농도 의존적으로 JAK2, STAT5, STAT3, AKT 및 ERK의 인산화를 증가시켰다(도 2D). 또한 STAT5 활성화에 의해 매개되는 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 통해 2R13 신호 전달을 검증했다(도 2E). 따라서, 2R13은 TPOR에 결합하여 AKT 및 ERK 경로와 함께 JAK/STAT 경로의 인산화를 자극하여 세포 증식을 증가시킴을 알 수 있다.

< 실시예 3> PB -CD34+ 세포의 거대핵생성을 촉진하는 2R13

다음으로, 2R13이 정상 기증자로부터 분리된 PB-CD34+ 세포에서 거핵구 형성을 자극할 수 있는지 여부를 조사하였다. PB-CD34+ 세포를 2R13(50,300 및 1000ng/ml) 또는 50ng/ml rhTPO의 부재 또는 존재 하에 거핵세포 분화 배지에서 14일 동안 배양하였다. 4, 7, 11 및 14일에 CD41a 및 CD42b의 발현에 대해 유세포 분석으로 전체 및 성숙한 거핵구의 백분율을 분석했다(도 3A). 배양 11일째에(대표적인 유세포 분석 플롯은 도 3B에 표시됨), 전체 및 거핵 세포 수는 모든 조건에서 최대였으며, CD41a+ 세포의 백분율은 50ng/ml에서 56.4%, 300 ng/ml에서 59.2% 및 1000ng/ml 2R13에서 59.6% 였으며, 50ng/ml rhTPO에서 62.1% 였다(도 3C). 성숙한 거핵구(CD41a+CD42b+ 이중 양성) 세포의 백분율은 50ng/ml에서 43.4%, 300ng/ml에서 44.7%, 1000ng/ml 2R13에서 43.1%, 50/ml rhTPO에서 45.2%였다. 2R13과 rhTPO 사이에 %CD41a+ 및 %CD41a+CD42b+에는 유의한 차이가 없었지만, 총 세포 수는 2R13 처리보다 rhTPO 처리에서 더 컸다. 따라서 CD41a+ 세포의 수는 대조군과 비교하여 50ng/ml에서 5.7배, 300ng/ml에서 6.9배, 1000ng/ml 2R13에서 7.9배, 50ng/ml rhTPO에서 11.7배 증가했다. CD41a+CD42b+ 세포의 수는 대조군과 비교하여 50ng/ml에서 6.5배, 300ng/ml에서 7.7배, 1000ng/ml에서 8.4배, 50ng/ml rhTPO에서 12.5배 증가했다. 추가 기증자의 PB-CD34+ 세포를 2R13 또는 TPO로 처리한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다(도 4 및 도 5).

< 실시예 4> 거핵구의 높은 배수성을 증가시키는 2R13

2R13(50,300 및 1000ng/ml) 또는 50ng/ml rhTPO의 부재 또는 존재 하에 거핵구 분화 배지에서 13일 동안 배양된 PB-CD34+ 세포의 DNA 배수성을 분석하여 이들 세포가 성숙한 거핵구인지 확인하고자 하였다. 2N 거핵구의 비율은 50ng/ml에서 40.5%, 300ng/ml에서 43.9%, 1000ng/ml 2R13에서 47.92%, 50ng/ml rhTPO에서 54.6%였다(도 6A). 대표적인 히스토그램은 도 6B에 나타내었다. 2R13을 처리한 세포는 rhTPO를 처리한 세포보다 8N 이상의 거핵구 비율이 더 높았다(도 6C). 따라서, 2R13 처리된 세포는 rhTPO보다 2N 거핵구의 비율이 낮고 배수성이 높았다. 그 다음 높은 배수성 세포의 수는 높은 배수성을 갖는 세포의 수가 50ng/ml에서 2.2개, 300ng/ml에서 2.3개, 1000ng/ml 2R13에서 2.8개, 및 50ng/ml rhTPO에서 4.9개임을 나타내는 높은 배수성(≥8N) CD41a+ 세포의 비율과 총 세포 수를 곱하여 계산되었다(도 6D). 따라서, 2R13은 rhTPO만큼 총 세포 수를 증가시키지 않았지만, rhTPO보다 더 높은 배수성 거핵 세포 비율을 유도하였다. 추가 기증자의 PB-CD34+ 세포를 2R13 또는 TPO로 처리한 경우에도 유사한 결과가 나타났다(도 7 및 도 8).

< 실시예 5> 인간 혈소판에서 TPOR 신호 전달 경로를 자극하는 2R13

상기와 같이, 2R13은 TPOR의 이소성 발현과 함께 BaF3/MPL 세포에서 세포내 신호전달 경로 및 세포 증식을 자극하였다. 2R13이 1차 인간 혈소판에서 신호 전달 경로를 자극하는지 여부를 추가로 확인했다. 인간 혈소판을 3시간 동안 혈청 결핍시키고 50, 300 및 1000ng/ml 2R13 또는 50ng/ml rhTPO로 처리했다. 2R13에 의해 유도된 신호 전달은 rhTPO에 의해 유도된 신호 전달보다 약했지만, 2R13은 농도 의존적으로 JAK2, STAT5 및 AKT를 명확하게 인산화시켰다(도 9A). 또한, 혈소판은 최대 18시간 동안 표시된 시간 동안 300ng/ml 2R13 및 50ng/ml rhTPO로 처리되었다. 2R13 및 rhTPO 처리는 장기간(0.25-18시간, 도 9B) 높은 수준의 인산화를 유지했다. 추가 개인의 혈소판을 2R13 또는 TPO로 처리한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다(도 10).

< 실시예 6> 1회 주입으로 WT 마우스 모델에서 혈소판 수를 증가시킬 수 있는 2R13

WT 마우스 모델에서 1일 치료 기간 중 및 치료 기간 후 마우스에서 14일 동안 혈소판 및 WBC 수준을 모니터링하여 2R13의 효과를 평가하였다(도 11A). 마우스는 PBS-BSA를 음성 대조군으로, rHuTPO를 양성 대조군으로 받았다. 혈소판 수와 백혈구 수는 일주일에 두 번 수행되었다. 2R13을 주사한 마우스의 혈소판은 4일째부터 용량 의존적으로 점차 증가하여 7일째에 정점에 도달함을 발견하였다(도 11B). 각 시점에서 rHuTPO 7일 주사에 비해 1회 주사한 2R13의 혈소판 수가 상대적으로 많았다. 모든 처리군에서 11일째부터 혈소판 수가 점차 감소하였고, 5㎍/kg의 2R13은 14일째에 주사 전 수준으로 회복되었다. 백혈구 수는 혈소판 수와 다른 것으로 나타났다 (도 11C). 2R13을 주사한 마우스의 백혈구 수에는 유의한 변화가 없었다. 주사 4일째에는 고농도의 2R13을 제외하고는 다른 처리군의 백혈구수가 정상치보다 낮았고, 7일째에는 정상치로 돌아왔다. 위의 결과에 따르면 WT 마우스 모델에서 2R13의 효과는 혈소판에 특이적일 가능성이 높지만 WBC에는 거의 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

다음으로 2R13이 생체 내 조혈에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 1일 동안 2R13(0.5, 1mg/kg/day), 7일 동안 rHuTPO(2.5μg/kg/day) 및 PBS-BSA를 주입했다. 그 결과 2R13 처리군의 BM의 LSK 세포가 대조군에 비해 증가하였다(도 11D). 이는 2R13이 HSPC를 유도할 수 있음을 나타낸다. 위의 WT 마우스 모델 실험을 통해, 2R13의 1회 주입으로 얻은 혈소판 수가 rHuTPO 주입 7일보다 우수하고 조혈 기능이 있으며 WBC에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

< 실시예 7> 혈소판 감소증 마우스 모델에서 혈소판 감소를 예방할 수 있는 2R13

5-FU로 유도된 혈소판 감소증 모델 후 혈소판의 회복 여부를 확인하였다. 5-FU 150 mg/kg을 복강내 주사하기 1시간 전에 마우스에 2R13(0.5, 1 mg/kg)을 1회, rHuTPO(2.5 μg/kg/day) 및 PBS-BSA를 7일 동안 피하 주사하였다 (도 12A). 다른 그룹의 마우스는 5-FU 치료를 받지 않았지만 여전히 PBS-BSA 주사를 받았다. 대조군을 제외하고 0.5 mg/kg의 2R13을 주사한 마우스의 혈소판은 가장 낮은 수치를 보였고, 1 mg/kg을 주사한 마우스의 혈소판은 양성대조군과 정상군보다 높았다(도 12B). 7일째부터 모든 처리군의 혈소판이 증가하였고, 특히 0.5mg/kg의 2R13 주사는 10일째에 정점에 도달하였다. 1mg/kg/day를 주사한 쥐의 혈소판은 7일째에 증가했지만, 혈소판 수는 0.5mg/kg을 주사한 2R13과 매우 유사하였다. 10일째 혈소판 수는 0.5 mg/kg의 2R13보다 낮았다. 2R13에서 혈소판 수가 용량 의존적으로 증가하지 않는 것을 찾는 것은 어렵지 않지만, rHuTPO에 비해 혈소판 증가의 효과는 명확히 확인되었다. 이를 통해 WBC 수를 확인하였으며(도 12C), 2R13은 여전히 백혈구에 영향을 미치지 않으므로, 생체 내 2R13의 효과는 혈소판에 특이적으로 적용되지만 백혈구에는 변화가 없음을 명확하게 확인하였다. 혈소판 감소증 모델에서 또한 2R13이 정상보다 초기 단계에서 혈소판 감소를 예방하고 혈소판 회복이 rHuTPO보다 우수함을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology KOSIN UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMY COOPERATION Inje university industry-academic cooperation foundation <120> Novel anti-C-MPL antibodies and uses thereof <130> ADP-2021-0461 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Arg Asp Thr Phe Asn Thr Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 Ala Arg Asp Arg Arg Ala Gly Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 4 Gln Gly Leu Gly Arg Trp 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 5 Ala Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 6 Gln Gln Ser Asn Ser Phe Pro Trp Thr 1 5

Claims (7)

1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 따른 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
3. 제2항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
4. 제3항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
5. 제1항에 따른 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 약학조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 약학조성물은 거대핵세포 생성, 혈소판 활성화 및 혈소판 수 증가를 유도하는 것을 특징으로 하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 약학조성물.
7. 제1항에 따른 항-c-MPL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

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