KR20220066618A - 톨-유사 수용체 1/2 및/또는 4 활성화 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae)는 다양한 식물 작물에 병원성인 편모 박테리아로, 혈액암, 열병 또는 패혈증 환자에게서 발견되기도 한다. 그러나 인간에 대한 정확한 감염 메커니즘은 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 인간 면역 시스템이 상기 박테리아에서 분리된, 정제된 플라젤린('FLA-AA')에 반응한다고 가정했다. 본 발명에서는, 인간 대식세포, 섬유아세포 및 TLR5-과발현 세포주를 FLA-AA로 처리하여, 분자 수준에서 TLR5 및 NLRC4를 통한 전염증성 신호전달 경로의 활성화를 확인하였다. FLA-AA에서 유효한 영역을 찾기 위해 N 및 C 말단의 α-나선에서 4개의 펩타이드('AF1 내지 AF4')를 설계하고, 여러 세포 유형에서 그 효능을 분석했다. 펩타이드 AF1 및 AF2는 TLR1/2 및 TLR4를 통해 작용적 활성을 보였지만, TLR5를 통해서는 그렇지 않았다. 이는 동일 패밀리의 톨-유사 수용체의 구성원과 플라젤린 단편의 교차 반응성을 시사한다. 짧은 플라젤린 단편은 암 면역요법(immunotherapy)에서 치료 작용제(agonist) 또는 보조제(adjuvant)로서의 잠재력을 가지고 있다.

Description

톨-유사 수용체 1/2 및/또는 4 활성화 펩타이드 및 이의 용도{Toll-like receptor 1/2 and/or 4 Activating Peptides and Uses Thereof}

본 발명은 TLR(Toll-like receptor)1/2 및/또는 TLR4 신호전달 경로를 활성화하는 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TLR1/2 및/또는 TLR4 신호전달 경로를 활성화하여 전염증성 사이토카인 분비 및 NF-κB와 MAPKs의 활성화를 유도하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 TLR 작용제, 면역보조제, 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae)는 산화효소-양성, 비-락토오스 분해성, 호기성, 간상형, 무색소 그람-음성 박테리아로서, 쌀, 수수, 옥수수, 조, 사탕수수, 귀리와 같은 경제적으로 중요한 다양한 작물에 병원성이다(Song, W. et al., Journal of Phytopathology 2004, 152, 667-676). 아프리카, 아시아, 유럽 및 북미의 일부 지역에서 세균성줄무늬병(bacterial brown stripe)이라 불리는 치명적인 벼 질병의 원인이 된다. 이 종은 식물에 많은 피해를 입힘에도 인간에서의 기회 감염(opportunistic infection)에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. PCR 증폭으로 혈액암(hematological cancer)과 열병(fever) 환자에서 A. avenae의 존재가 확인되었고, whole-cell long-chain-fatty-acid 분석을 통해 패혈증(sepsis) 환자에서 확인되었다. 또 다른 종인 Acidovorax oryzae도 catheter와 함께 인간에서 균혈증(bacteremia)을 유발하는 것으로 보고된 바 있다. Acidovorax spp.는 처음에 Pseudomonas spp.로 분류되었으며, 동물 또는 인간 병원체로서의 그들의 역할은 자세히 조사되지 않았다(Willems, A. et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 1990, 40, 384-398).

병원체(pathogen)는 "병원체-관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern; PAMP)”이라 하는 특정 신호 분자를 가지고 있는데, 톨-유사 수용체(Toll-like receptors; TLR)와 같은 숙주의 패턴 인식 수용체(PRR)에 의해 인식되어, 인간의 선천성 면역계를 촉발한다(Medzhitov, R. et al., Nature 1997, 388, 394). TLR은 세포외 도메인에서 루신-고반복(leucine-rich repeat)의 도움으로 특정 PAMP를 인식하는 세포외, 막통과 및 세포내 도메인을 갖는 I 유형 막통과 단백질이다. 이러한 TLR은 세포 표면이나 엔도솜 또는 리소좀의 막에 위치하여 각각의 리간드와 상호작용한다(Uematsu, S. et al., In Toll-like receptors ( TLRs ) and innate immunity, Springer: 2008; pp. 1-20). TLR은 다양한 박테리아 산물에 의해 활성화된다. 펩티도글리칸, 리포아라비노마난(lipoarabinomannan) 및 박테리아 지질 단백질은 TLR2와 상호작용하고, 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)는 주로 TLR4에 관여하며, 박테리아 플라젤린은 TLR5에 의해 인식된다. 엔도솜 TLR은 다양한 리간드 세트를 인식한다. 이중가닥 RNA는 TLR3에 의해 인식되고, 단일가닥 RNA는 TLR7 및 TLR8에 의해 검출되며, TLR9는 바이러스 및 박테리아 CpG DNA 모티프 및 말라리아 색소 헤모조인(hemozoin)과 상호작용한다. 리간드 인식은 그들의 톨/인터루킨-1 수용체(Toll/interleukin-1 receptor; TIR) 도메인이 TIR 도메인을 포함하는 세포기질 어댑터 분자와 상호작용하게 하여, 결국 NF-κB(nuclear factor kappa light-chain-enhancer of activated B cells), AP-1(activating protein 1) 및 IRFs(interferon-regulatory factors)를 활성화시킨다(Gay, N.J. et al., Nature Reviews Immunology 2014, 14, 546). 이러한 전사 인자들은 침입자에 대해 숙주가 대비하도록 여러 사이토카인의 발현을 조절한다. 그럼에도 불구하고, TLR의 부적절한 활성화는 암, 류마티스 관절염 및 패혈증과 같은 다양한 건강 문제를 초래할 수 있다.

톨-유사 수용체(Toll-like receptors; TLRs)는 세포막과 엔도솜 막에 위치한 주요 막-결합 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors; PRRs)로서, 병원체 또는 손상과 관련된 분자 패턴을 인식하고, 종양 괴사 인자 α(tumor necrosis factor α; TNF-α), 인터루킨 1(IL-1), IL-6, IL-10 및 I 형 인터페론(IFN-α/β)과 같은 전염증성 사이토카인의 발현으로 완결되는 다운스트림 신호전달의 복합적인 cascade를 일으킨다. 이 분자들은 백혈구를 감염 부위로 이동하도록 유도하고, 항원-제시 세포를 활성화시킨 후, 지속적인 적응 면역 반응을 위한 T 세포 분화를 일으킨다.

세포 표면 TLR 중 TLR2는 triacylated lipopeptides(Pam3CSK4), diacylated lipopeptides(Pam2CSK4), lipoteichoic acids, zymosan, bacterial 및 fungal lipids, acylated sugars, proteins과 같은 광범위한 스펙트럼의 병원성 성분을 인식하기 위해 TLR1 또는 TLR6와 함께 이종이합체를 독특하게 형성한다. TLR2는 triacylated lipopeptides의 인식을 위해 TLR10과 관련이 있는 것으로 밝혀졌지만, 명확한 메커니즘이나 이 경로에서 방출된 사이토카인은 알려지지 않았다(Guan Y, et al. (2010) Journal of immunology 184(9):5094-5103). 활성화된 TLR2는 myeloid differentiation primary response 88(MyD88) 단백질을 모집하고, TIR 도메인 상호작용을 통해 Toll/interleukin-1 receptor(TIR) homology domain-containing adaptor protein(TIRAP)에 의해 보조된다. MyD88은 인산화를 통해 IRAK1을 활성화시키는 interleukin-receptor-associated kinase 4(IRAK4)를 모집한다. ‘Myddosome’으로 불리는 TLR-MyD88-IRAK4-IRAK1/2의 복잡한 어셈블리의 실제 화학 양론은 명확하지 않다. 여러 adaptors와 kinases가 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 발현을 위해 수많은 인산화 및 ubiquitination을 통해 참여하여 NF-κB를 핵으로 이동시킨다(Kawasaki T & Kawai T (2014) Frontiers in immunology 5:461).

TLR은 선천면역 및 적응면역 체계 모두를 활성화시키는 능력 때문에 백신 보조제의 매력적인 표적이 된다. 유효하고 독성이 적은 TLR 작용제(agonists)는 예방 백신과 함께 사용하기 위한 필수 안전 기준을 충족시키며, 이는 의약 분야에 큰 관심을 불러일으켰다(Casella CR & Mitchell TC (2008) Cellular and molecular life sciences: CMLS 65(20):3231-3240). 다수의 TLR agonists는 현재 임상 조사의 다양한 단계에 있다. 예를 들어, TLR2 agonists가 HIV, HBV 및 HPV 감염을 치료하는 데 가장 효과적인 보조제가 될 수 있다는 전임상 보고서가 있다(Borsutzky S, et al. (2006) Vaccine 24(12):2049-2056). TLR2의 지질펩타이드 모방 agonists는 다양한 항원과 함께 강력한 보조 효과를 나타낸다(Willems MM, et al. (2014) Journal of medicinal chemistry 57(15):6873-6878). 약화된 TLR1/2 신호는 고령화에 따른 감염 관련 질병이환률과 사망률의 증가와 관련이 있다. 이러한 질병의 발생은 단일 요법 또는 병합 요법으로 TLR1/2 agonist를 적용함으로써 예방할 수 있으며(Shechter R, et al. (2013) Scientific reports 3:1254), 최근 보고에 따르면, TLR2 신호전달은 희돌기교세포(oligodendrocyte; OL)의 사멸과 탈수초(demyelination)로 특징지어지는 백질에서의 허혈성 뇌졸중을 예방하는데 중심적인 역할을 하는 것이 밝혀졌다.

TLR2 agonist는 폐 종양, 방광암, 유방암, 췌장 궤양을 줄이는 데 유망한 결과를 보였다(Zhang Y, et al., (2011) Journal of immunology 186(4):1963-1969 등). TLR1/2 agonist는 항암제와는 별도로, 만성 및 급성 인플루엔자, 천식 및 연령 관련 비만과 같은 각종 전염병을 치료하는 데 효과적이라는 것이 밝혀졌다(Tan AC, et al. (2012) Molecular pharmaceutics 9(9):2710-2718). 그러나, 이러한 잠재적인 임상 효능에도 불구하고, TLR2를 자극할 수 있는 짧은 펩타이드의 발견을 위한 고효율 스크리닝은 소수의 작은 분자들을 제외하고 현재까지 보고된 바 없다(Cheng K, et al. (2015) Science advances 1(3)).

이에, 본 발명자들은 순수한 펩타이드 기반 TLR1/2 또는 TLR4 작용제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 식물 병원성 박테리아의 플라젤린 단백질로부터 유래된 펩타이드('AF(A = Acidovorax avenae; F = flagellin)'로 명명)가 TLR5와 독립적으로 TLR1/2 및/또는 TLR4를 통한 선천성 면역 반응을 효과적으로 유도하므로, 면역보조제 또는 암 치료제로서의 응용 가능성이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 TLR1/2 및/또는 TLR4 신호전달 경로를 활성화하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 TLR 작용제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 면역보조제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 암 또는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 또는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 또는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드의 사용을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 면역보조제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 암 또는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 암 또는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 암 또는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드의 사용을 제공한다.

본 발명에서는 A. avenae N1141로부터 정제된 플라젤린(FLA-AA)이 TLR5 및 NLRC4와 상호작용하여 인간의 선천성 면역계를 촉발할 수 있음을 확인하였다. 플라젤린의 α-나선의 펩타이드 단편은 TLR5를 활성화할 수 없는 반면, 본 발명에 따른 펩타이드 단편 AF1 및 AF2는 TLR1/2 및 TLR4를 통해 선천성 면역 반응을 유도할 수 있으므로, 암 면역요법에서 치료적 작용제 또는 보조제로서의 잠재력을 가지고 있다.

도 1: FLA-AA 및 FLA-ST에서 유래된 플라젤린 서열의 정렬(alignment)을 나타낸 도면이다. EMBL-EBI의 pairwise local sequence alignment tool인 "EMBOSS water"를 통해 FLA-AA와 FLA-ST에서 유래된 플라젤린의 단백질 서열을 비교하여 이들 간의 유사성을 평가하였다.
도 2: FLA-AA는 인간 대식세포 및 섬유아세포에서 면역 신호전달을 활성화한다. (도 2a, d) THP-1 대식세포(a) 및 HDF(b)의 생존력은 세포를 지정된 농도에서 24시간 동안 FLA-AA 또는 FLA-ST로 처리한 후 MTT 분석에 의해 결정되었다. (도 2b, c, e, f) THP-1 대식세포(b, c) 및 섬유아세포(e, f)를 지정된 농도의 FLA-AA 또는 FLA-ST로 24시간 동안 처리하였다. 배양 상층액을 수집하고, 각각의 ELISA 키트를 사용하여 IL-8(b, e), TNF-α(c) 및 IL-6(f)를 포함한 사이토카인의 정량화를 위해 처리되었다. (도 2g) 표시된 기간 동안 THP-1 세포를 FLA-AA(200ng/ml)로 처리한 후, NF-κB 및 MAPK 활성화를 분석하기 위해 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. β-Actin은 내인성 대조군으로 사용되었다. (도 2h) PMA-분화 THP-1 세포를 LPS로 4시간 동안 프라이밍하고, 2시간 동안 대조군과 함께 표시된 농도의 FLA-AA 또는 FLA-ST로 형질감염시켰다. 배양 상층액을 관련 ELISA 키트를 사용하여 IL-1β의 분비에 대해 분석하였다. 모든 실험은 독립적으로 4회 수행되었으며, 실험군의 평균 ± SEM 차이는 two-tailed paired Student's t test (*P < 0.05)로 평가되었다. FLA-AA: flagellin from A. avenae; FLA-ST: flagellin from S. Typhimurium; IL-6: interleukin 6; IL-8: interleukin 8; LPS: lipopolysaccharide; MAPKs: mitogen-activated protein kinases; NF-κB: nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B cells; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; TNF-α: tumor necrosis factor α.
도 3: FLA-AA 매개 신호전달은 TLR5에 특이적이다. (도 3a, b, c, d) THP-1 세포(10⁵/well) (a, b) 및 HDF(10⁴/well) (c, d)를 다양한 농도(1.5, 3 또는 6μM)의 TH1020로 1시간 동안 전처리하고, 표시된 농도의 FLA-ST 또는 FLA-AA로 후처리하였다. 후처리 24시간 후, 처리된 THP-1 세포의 배양 상층액을 분석하여 인간 IL-8(hIL-8) (a) 및 hTNF-α(b)의 수준을 계산하였으며, HDF의 배양 상층액은 ELISA로 hIL-8(c) 및 hIL-6(d)에 대해 분석하였다. (도 3e) 293/hTLR5 세포(3×10⁴/well)의 생존력은 24시간 동안 표시된 농도의 FLA-AA 또는 FLA-ST로 처리한 후, MTT 분석으로 결정하였다. (도 3f) 293/hTLR5 세포(3×10⁴/well)에 의한 hIL-8 분비 정도는 표시된 농도의 FLA-AA 또는 FLA-ST로 24시간 처리한 후, ELISA에 의해 결정되었다. 실험은 독립적으로 4회 수행되었으며, 실험군의 평균 ± SEM 차이는 two-tailed paired Student's t test (*P < 0.05)로 평가되었다.
도 4: 면역형광 분석은 TLR5에 대한 FLA-AA의 특이성을 보여준다. (도 4a, b) THP-1 대식세포(a) 및 HDF(b)를 24-웰 플레이트에서 밤새 성장시켰다. 그 다음, 표시된 농도의 TH1020으로 세포를 1시간 동안 전처리하였다. 후처리는 FLA-AA 또는 FLA-ST를 기반으로 하였으며, 특이적 항-p-p65 및 항-β-actin 1차 항체 및 Alexa Fluor-접합 2차 항체를 사용하여 면역형광 분석을 진행하였다. 빨간색은 NF-κB의 인산화된 서브유닛(p-p65)을 나타내고, 초록색은 β-actin, Hoechst 33258 dye의 파란색은 핵을 나타낸다. 이미지는 도립 현미경(Olympus IX53; Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 ×40 배율로 포착되었다. Scale bar: 50μm.
도 5: FLA-AA 유래 AF 펩타이드들을 나타낸 도면이다. FLA-AA의 전장 아미노산 서열을 나타내었으며, AF 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 서로 다른 색 및/또는 밑줄로 표시되었다.
도 6: AF 펩타이드의 독성 평가를 나타낸 도면이다. THP-1 세포(10⁵/well) (a) 및 HDF(10⁴/well) (b)를 표시된 농도의 펩타이드 및 FLA-ST로 24시간 동안 처리한 후 MTT 분석을 수행하여 세포 생존력을 계산하였다. 모든 실험은 독립적으로 4회 수행되었으며, 실험군의 평균 ± SEM 차이는 two-tailed paired Student's t test (*P < 0.05)로 평가되었다. FLA-ST: flagellin from S. Typhimurium.
도 7: 작용적 펩타이드의 스크리닝 및 식별. (도 7a, b) PMA-분화 THP-1 세포를 다양한 농도의 펩타이드 및 FLA-ST로 24시간 동안 처리하였다. hIL-8(a) 및 hTNF-α(b) 분비 수준은 ELISA에 의해 결정되었다. (도 7c, d) HDF는 다양한 농도의 펩타이드 및 FLA-ST로 처리되었고, hIL-8(c) 및 hTNF-α(d) 분비 수준은 ELISA에 의해 24시간 후에 결정되었다. (도 7e) 표시된 기간 동안 HDF를 AF1(5μM)로 처리한 후, NF-κB 및 MAPK의 활성화를 분석하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. β-actin은 내인성 대조군으로 사용되었다. 모든 실험은 독립적으로 4회 수행되었으며, 실험군의 평균 ± SEM 차이는 two-tailed paired Student's t test (*P < 0.05)로 평가되었다. FLA-ST: flagellin from S. Typhimurium; hIL-8: human interleukin 8; hTNF-α: human tumor necrosis factor α; MAPKs: mitogen-activated protein kinases; NF-κB: nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B cells.
도 8: AF1 및 AF2는 TLR5와 독립적으로 MyD88 신호전달을 개시한다. (도 8a, b, c, d) THP-1 세포(10⁵/well) (a, b) 및 HDF(10⁴/well) (c, d)를 다양한 농도(1.5, 3 또는 6μM)의 TH1020로 1시간 동안 전처리하고, 표시된 농도의 FLA-ST, AF1 또는 AF2로 후처리하였다. 24시간 후처리 후, 처리된 THP-1 세포의 배양 상층액을 분석하여 hIL-8(a) 및 hTNF-α(b)의 수준을 결정하고, HDF의 배양 상층액을 ELISA로 분석하여 hIL-8(c) 및 hIL-6(d) 수준을 평가하였다. (도 8e) AF1(5μM) 처리 동안 NF-κB 및 MAPK 인산화에 있어서 TH1020(6μM)-매개 감소는 표시된 시점에서 THP-1 세포 용해물의 웨스턴 블랏팅에 의해 분석되었다. (도 8f, g) RAW 264.7 세포(10⁵/well)를 표시된 농도의 PAM3CSK4, LPS, FLA-ST, AF1 또는 AF2로 처리했다. 24시간 처리 후, murine TNF-a(mTNF-α) (f) 및 mIL-6 (g)의 분비를 정량화하기 위해, 배양 상층액을 ELISA로 분석하였다. (도 8h) HEK-hTLR5 세포(3×10⁴/well)에 의한 hIL-8의 분비 정도는 표시된 농도의 펩타이드 및 FLA-ST로 처리 24시간 후, ELISA에 의해 결정되었다. 실험은 독립적으로 4회 수행되었으며, 실험군의 평균 ± SEM 차이는 two-tailed paired Student's t test (*P < 0.05)로 평가되었다. FLA-ST: flagellin from S. Typhimurium; hIL-6: human interleukin 6; hIL-8: human interleukin 8; hTNF-α: human tumor necrosis factor α; MAPKs: mitogen-activated protein kinases; NF-κB: nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B cells.
도 9: AF1 및 AF2는 TLR1/2 및 TLR4를 통해 신호전달을 활성화한다. (도 9a) RAW 264.7 세포(10⁵/well)를 표시된 농도의 Cu-CPT22, TAK-242 또는 둘 모두로 1시간 동안 전처리하였다. 표시된 농도의 AF1 및 AF2로 24시간 동안 후처리하였다. ELISA로 mTNF-α의 분비를 정량화하기 위해 배양 상층액을 수집하였다. (도 9b) HEK-hTLR2 세포(3×10⁴/well)에 의한 hIL-8 분비 수준은 표시된 농도의 펩타이드, PAM3CSK4 및 FSL-1로 처리 24시간 후에 ELISA로 측정하였다. (도 9c) HEK-Blue™ hTLR4 세포(3×10⁴/well)의 SEAP 활성은 표시된 농도의 펩타이드, PAM3CSK4, FSL-1, FLA-ST 또는 LPS로 처리 24시간 후에 SEAP Reporter Assay Kit를 사용하여 결정하였다. (도 9d) IL-8 분비 수준은 상기 언급된 시약으로 293/hTLR2-TLR6 세포를 24시간 처리한 후 결정되었다. (도 9e) RAW 264.7 세포(10⁵/well)를 L48H37로 1시간 동안 전처리하고, 표시된 농도의 화합물로 24시간 동안 후처리하였다. 그 다음, TNF-α의 분비 수준은 ELISA로 결정하였다. 실험은 독립적으로 4회 수행되었으며, 실험군의 평균 ± SEM 차이는 two-tailed paired Student's t test (*P < 0.05)로 평가되었다. FLA-ST: flagellin from S. Typhimurium; mTNF-α: mouse tumor necrosis factor α; mIL-6: mouse interleukin 6; SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase.
도 10: 면역형광 분석은 AF1의 TLR2 및 TLR4에 대한 특이성을 보여준다. (도 10a, b) RAW 264.7 세포(a) 및 HDF(b)를 24-웰 플레이트에서 밤새 성장시켰다. 다음으로, 표시된 농도의 Cu-CPT22, TAK-242, 둘 다 또는 DMSO로 세포를 전처리하였다. 후처리는 AF1(5 μM)을 기반으로 하였으며, 특이적 항-p-p65 및 항-β-actin 1차 항체와 Alexa Fluor-접합 2차 항체를 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다. 빨간색은 인산화된 NF-κB(p-p65)를 나타내고, 초록색은 β-actin을 나타내며, Hoechst 33258 dye에 의한 파란색 염색은 핵을 나타낸다. 이미지는 도립 현미경(Olympus IX53; Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 ×40 배율로 포착되었다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

통성(facultative) 또는 기회(opportunistic) 병원성 박테리아는 숙주가 심각한 면역손상 및 쇠약 상태에 있을 때, 해당 숙주에 들어간 후 질병을 유발한다(Parke, J.L. et al., Annual review of phytopathology 2001, 39, 225-258). 그 중에서 특수한 그룹의 박테리아가 병원내 감염(nosocomial infections)으로 알려진 병원 감염 질병을 유발한다. 예를 들면, 유럽에서 중환자실에 있는 환자의 45%가 기회 병원균에 감염된 것으로 보고되었다(Vincent, J.-L. et al., Jama 1995, 274, 639-644). A. avenae는 쌀, 옥수수, 사탕수수, 귀리와 같은 다양한 작물을 감염시키는 식물 병원성 박테리아다(Lipuma, J.J. et al., In Manual of Clinical Microbiology, Eleventh Edition, American Society of Microbiology: 2015; pp. 791-812). 식물 이외에도 열병, 혈액암, 패혈증 및 기타 혈류 감염 인간 환자에게서 발견되었다(Malkan, A.D. et al., Journal of clinical microbiology 2009, 47, 3358-3361). 그러나, 지금까지 인간에 대한 분자 수준에서 면역조절 작용은 조사되지 않았다.

식물에서 벼-독성 균주 A. avenae N1141로부터 분리된 플라젤린('FLA-AA'로 명명)에 의한 PAMP 유발 면역의 유도가 보고된 바 있다. 인간 병원성 박테리아와의 서열 유사성을 토대로, 정제된 플라젤린이 기회 감염 동안 인간의 세포 및 분자 수준에서 면역 신호전달을 유도할 수 있다는 가설을 세웠다. PAMP는 처음에 선천성 면역계의 PRR에 의해 인식되며, TLR은 동족 리간드를 인식하여 TLR 신호전달을 시작할 수 있는 PRR 중 일부이다. 세포외 TLR 중 TLR5는 병원성 박테리아 편모의 플라젤린 단백질을 인식하는 동종이합체(homodimer)다. 리간드 인식은 TLR이 NF-κB, AP-1 및 IRF와 같은 전사 인자의 활성화를 위해 세포기질 어댑터 분자 및 다운스트림 신호전달 분자와 상호작용할 수 있도록 한다(Ve, T. et al., Current drug targets 2012, 13, 1360-1374). 본 발명자들은, 전염증성 사이토카인의 분비 측면에서, FLA-AA가 분자 수준에서 인간 대식세포와 섬유아세포에 대한 항원 특성을 가지고 있음을 확인하였다(도 2). TLR5 억제제(TH1020)와 TLR5 과발현 세포주(293/hTLR5)를 이용하여 FLA-AA의 특이성을 확인하였으며, FLA-AA 유도 신호전달이 TLR5에 의해 매개되는 것을 확인하였다(도 3). 또한, FLA-AA에 의한 신호전달 경로의 TLR5-매개 활성화는 면역형광 분석 결과에 의해 뒷받침되었다(도 4).

인플라마솜(inflammasome)은 대식세포와 수지상세포에서 발견되는 다중단백질 세포질 복합체로서, caspase 1을 활성화하여 염증 세포 사멸(파이롭토시스(pyroptosis))과 성숙한 IL-1β 및 IL-18의 방출을 유도한다(Martinon, F. et al., Molecular cell 2002, 10, 417-426). 다양한 세포질 PRR은 인플라마솜의 조립과 후속 인플라마솜-기반 선천면역을 매개한다(Miao, E.A. et al., Nature immunology 2010, 11, 1136). 그 중에서 NLRC4는 세균성 플라젤린을 인식하는 것으로 보고된 NLR의 NLRC 서브패밀리의 일원이다. 박테리아 플라젤린 단백질은 C 말단에 진화적으로 보존된 두 개의 류신 잔기를 포함하고 있으며, 이는 type IV 분비 시스템의 많은 기질에서 흔히 볼 수 있다(Nagai, H. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 2005, 102, 826-831). 이들은 전체적으로 caspase 1의 활성화를 위한 플라젤린의 세포질 전달에 기여한다. 감염에 의해 또는 S. Typhimurium, Legionella pneumophila , Pseudomonas aeruginosa 및 Listeria monocytogenes와 같은 포유동물 병원성 박테리아의 정제된 플라젤린에 의해 NLRC4 인플라마솜이 촉발될 수 있다고 보고된 바 있다(Warren, S.E. et al., The Journal of Immunology 2008, 180, 7558-7564 등). 본 발명에서는, 식물 병원성 박테리아 A. avenae로부터 정제된 플라젤린이 성숙한 IL-1β의 방출을 위해 caspase 1을 활성화하는 것을 확인하였다(도 2).

플라젤린의 N 및 C 말단은 D0/D1 도메인을 구성하며, 이는 다운스트림 신호전달 경로에 대한 TLR5의 결합 및 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Murthy, K.G. et al., Journal of Biological Chemistry 2004, 279, 5667-5675). 따라서, 본 발명자들은 C-말단 D0/D1 도메인에서 아미노산 잔기의 한 구간(AF1)과 N-말단 D0/D1 도메인에서 3개 구간(AF2, AF3 및 AF4)을 선택하였다(도 5). 유효 영역의 길이 때문에 어떠한 펩타이드도 TLR5에 대한 작용적 활성을 나타내지 않았다. TLR5 특이적 재조합 작용제인 entolimod(CBLB502)는 유연한 링커를 통해 플라젤린의 N 및 C 말단을 완전히 연결하여 개발되었으며, 높은 특이성을 가진 감소된 면역원성을 위해 약리학적으로 최적화되었다(Burdelya, L.G. et al., Science 2008, 320, 226-230). 플라젤린의 N 말단은 두 개의 α-나선을 형성한다. 첫 번째 α-나선은 아미노산 잔기 57-99로 구성되고, 두 번째는 잔기 104-129로 구성된다. 반면 C 말단은 N 말단의 첫 번째 α-나선 길이와 동일한 단일 α-나선(잔기 406-447)을 형성한다(Samatey, F.A. et al., Nature 2001, 410, 331-337). 이 나선들은 플라젤린의 기능을 담당하는 주요 구조다. N 말단 내의 14개 아미노산 "motif N"(잔기 95-108)은 그 결실이 플라젤린의 전염증성 활성을 없애기 때문에 매우 중요하다. 펩타이드 AF1(잔기 408-443) 및 AF2(잔기 85-120)는 각각 C- 및 N-말단 α-나선의 잔기들을 대부분을 포함하고 있음에도 불구하고, TLR5와는 독립적인 전염증성 신호전달을 개시한다. 이는 N 말단으로부터 85번째 이전 또는 C 말단 내의 9개 아미노산 "motif C"(잔기 441-449)로서의 잔기 443 이후의 일부 잔기가 TLR5 활성화를 위해 기능적으로 필수적이기 때문일 수 있다(Murthy, K.G. et al., Journal of Biological Chemistry 2004, 279, 5667-5675). 펩타이드 AF3(잔기 65-96) 및 AF4(잔기 31-48 + 90-101)는 잔기 552-561로 구성된 TLR5 부위에 결합하는 것으로 알려진 잔기 88-97을 포함하기 때문에, 전염증성 신호전달을 활성화하지 않았다(Jacchieri, S.G. et al., Journal of bacteriology 2003, 185, 4243-4247). 본 발명자들은 이들이 신호전달을 촉발시키지 않고 TLR5에 결합하며, 전장 플라젤린의 결합을 차단하여 신호전달을 억제한다고 가정하였다.

본 발명에서는, 플라젤린 유래 펩타이드가 TLR5 이외의 TLR에 의해 인식될 수 있음을 확인하였다. 이 결과는 일부 TLR이 주요 PAMP에 대한 높은 특이성에도 불구하고 흔하지 않은 리간드를 인식할 수 있음을 의미한다:

(1) TLR4는 순차적인 방식으로 LPS를 인식한다: LPS는 CD14에 이어 TLR4 자체에 의해 인식되는 LPS 결합 단백질과 복합체를 형성한다. MD-2는 TLR4의 세포외 영역에 결합함으로써 LPS 반응성을 향상시킨다. TLR4는 탁솔(taxol), 열충격 단백질(heat shock protein; HSP) 60, 피브로넥틴(fibronectin), 히알루론산, 헤파린 설페이트(heparin sulfate), 피브리노겐(fibrinogen)과 같은 LPS 이외의 리간드를 인식하는 것으로 보고되었다(Smiley, S.T. et al., The Journal of Immunology 2001, 167, 2887-2894 등).

(2) TLR1 및 TLR6과 함께 TLR2는 지질단백질(lipoproteins), 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 리포테이코산(lipoteichoic acid), 리포아라비노마난(lipoarabinomannan), 글리코이노시톨 인지질(glycoinositol phospholipids), 지모산(zymosan), 글리코리피드(glycolipids) 및 포린(porins)과 같은 다양한 미생물 성분을 인식한다(Aliprantis, A.O. et al., Science 1999, 285, 736-739 등).

본 발명에서는, TLR4에 의해 인식된 펩타이드가 TLR1/2에 의해서도 인식되고, 다운스트림 신호전달 경로를 개시하는 것을 확인하였다. 이는 하나의 TLR에 특이적인 리간드가 다른 세포외 또는 세포내 분자에 의해서도 인식될 수 있음을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서, 식물 병원성 박테리아 A. avenae N1141로부터 분리된 플라젤린(FLA-AA)과 그로부터 유래된 펩타이드 단편들인 AF1 내지 AF4의 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

이름	아미노산 서열	서열번호
AF1	IDAALSAVNGQRASFGALQSRFETTVNNLQSTSEN	1
AF2	GDILQRVRELAVQSANATNSSGDRKAIQAEVGQLL	2
AF3	VRNANDGISLAQTAEGALKSTGDILQRVRELA	3
AF4	RLSSGLRINSAKDDAAGLQRVRELAVQSAN	4
FLA-AA	MASTINTNVSSLTAQRNLSLSQSSLNTSIQRLSSGLRINSAKDDAAGLAISERFTSQIRGLNQAVRNANDGISLAQTAEGALKSTGDILQRVRELAVQSANATNSSGDRKAIQAEVGQLLSEMDRIAGNTEFNGQKLLDGSFGSATFQVGANANQTITATTGNFRTNNYGAQLTASATGAATTGATAGSAGAAAGTVVIAGLQTKTVNVAAAGTASDIASAVNAVADSTGVTASARNVSEMKFSGTGSFTLAVKGDNSTAANVTFNVSATSTAAGLAEAVKAFNDVSSQTGVTAKLNSDSSGLILTNESGNDINIANGSSSAAGITLASQDAVTTQSSGTLTFTSATAAGTGVTVASRGTVEYKSDKGYTVSGTGGTMTNATATSSTLTKVSDIDVSTVDGSTKALKIIDAALSAVNGQRASFGALQSRFETTVNNLQSTSENMSASRSRIQDADFAAETANLSRSQILQQAGTAMVAQANQLPQGVLSLLK	5

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 TLR(Toll-like receptor)1/2 및/또는 TLR4 신호전달 경로를 활성화하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어, “TLR1/2 신호전달 경로”는 TLR1 및/또는 TLR2를 통한 신호전달 경로를 말하며, TLR1 및 TLR2에 의해 형성된 막-횡단 복합체인 TLR1/TLR2 복합체에 의존하는 lipopeptides 반응일 수 있으며, 이를 통해 신호가 전달된다.

“TLR2“는 Pam₃CSK₄, Pam₂CSK₄, lipotoichoic acids, zymosan, bacterial 및 fungal lipids, acylated sugars, proteins과 같은 광범위한 병원성 성분을 인식하기 위해 TLR1와 함께 이종이합체를 독특하게 형성한다. 활성화된 TLR2는 MyD88 단백질을 모집하고, MyD88은 인산화를 통해 IRAK1을 활성화시키는 interleukin-receptor-associated kinase 4(IRAK4)를 모집한다.

본 발명에서 용어, “TLR4”는 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(tranmembrane) 단백질 패밀리인 TLRs에 속하는 단백질로서, TLR4 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, CD 284(cluster of differentiation 284)로 명명되기도 한다. 상기 TLR4는 그람-음성 박테리아의 LPS를 비롯한 다양한 PAMPs를 인지하기 때문에 선천성 면역 시스템의 활성화에 매우 중요하다.

본 발명에서 용어, “TLR4 신호전달 경로”는 TLR4를 통한 신호전달 경로를 말하며, TLR4 및 MD2에 의해 형성된 막-횡단 복합체인 TLR4/MD2 복합체에 의존하는 LPS 반응일 수 있으며, 이를 통해 신호가 전달된다. TLR4는 여러가지 어댑터 단백질에 의해 신호를 전달하며, 상기 신호전달 경로는 Mal(TIRAP로도 지칭됨)과 MyD88, 및 트램(TRAM)과 트리프(TRIF)로 작동한다. TLR4 매개 신호전달 경로는 다양한 하위 신호전달 분자를 통해 MyD88-의존적 및 MyD88-비의존적 신호전달의 활성화를 유도한다. MyD88-의존 경로의 개시는 NF-κB의 초기 단계 활성화 및 TNF-α 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 분비를 유도하며, MyD88-비의존적 경로의 개시는 IRF3 및 7의 활성화, IFNs의 분비 및 NF-κB의 후기 단계 활성화를 유도한다. 또한, TLR4는 ERK, JNK 및 p38를 포함하는 MAPK의 활성화를 유발하고, 염증성 사이토카인 및 IFN을 분비한다. 대식세포에서 관련 리간드에 의한 TLR4의 자극이 COX2와 iNOS를 유도하고 NO의 생성을 유도하며, 미토콘드리아와 세포내 ROS를 생성한다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 NF-κB(nuclear factor kappa B) 활성화 또는 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)의 인산화를 유발시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6) 또는 IL-8(interleukin-8)의 발현을 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, AF1 및 AF2의 TLR 신호전달 경로 활성화를 통한 전염증성 사이토카인 분비 효과를 확인하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 TLR(Toll-like receptor) 작용제(agonist)에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “TLR 작용제(agonist)”는 TLR을 활성화하고, 특히 생물학적 반응을 유도한다.

TLR의 agonists 또는 antagonists(길항제)는 수용체상의 동일한 부위를 표적으로 하는 것으로 나타났다(Manavalan B, Basith S, & Choi S (2011) Frontiers in physiology 2:41). 따라서, 특정 TLR의 활성화 또는 억제는 주어진 물질이 결합 시에 얼마나 많은 입체적 변형을 부여하는지에 의존할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 면역 회피 단백질인 staphylococcus super antigen-like 3(SSL3)은 TLR2의 지질 펩타이드 결합 cavity를 표적으로 하는 것으로 나타났으며, 결합된 agonist와는 상관없이 면역 신호를 지배한다(Koymans KJ, et al. (2015) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112(35):11018-11023). CU-CPT22와 같은 작은 분자 antagonist는 TLR1 채널에서 확장된 소수성 cavity를 차지하고 agonist 자극 시 TLR1/2 활성화를 억제한다고 보고되었다.

본 발명에 있어서, 상기 TLR은 TLR1/2 및/또는 TLR4인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, AF1 및 AF2는 TLR1/2 및/또는 TLR4의 생물학적 활성을 직간접적으로, 또는 실질적으로 유도, 증가 또는 촉발시킬 수 있다. 따라서, 상기 TLR 작용제는 TLR1/2 및/또는 TLR4 작용제인 것을 특징으로 할 수 있다.

TLR은 선천면역 및 적응면역 체계 모두를 활성화시키는 능력 때문에 백신 보조제의 매력적인 표적이 된다. TLR2 agonists가 바이러스 감염 치료의 효과적인 보조제가 될 수 있다고 보고된 바 있으며, TLR2의 지질펩타이드 모방 agonists는 다양한 항원과 함께 강력한 보조 효과를 나타냄이 보고되었다. 또한, 약화된 TLR1/2 신호는 고령화에 따른 감염 관련 질병이환률 등과 관련이 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 면역보조제(adjuvant)에 관한 것이다.

면역보조제는 항원-제시 세포에 항원을 연결시키거나, 약하거나 비면역원성 성분에 대한 특이적인 염증 반응을 일으켜 면역 체계를 강화시킨다(Coffman RL, et al. (2010) Immunity 33(4):492-503). 면역반응은 신호전달 cascade를 통해 TLR에 의해 시작되어 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 NF-κB-매개 전사를 유발한다.

TLR agonist는 폐 종양, 방광암, 유방암, 췌장 궤양을 줄이는 데 유망한 결과를 나타내었으며, TLR1/2 agonist는 항암제와는 별도로, 만성 및 급성 인플루엔자, 천식 및 연령 관련 비만과 같은 각종 전염병을 치료하는 데 효과적이라는 것이 보고된 바 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 암의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 암의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 종양과 동일한 의미로 사용되며, 폐 종양, 방광암, 자궁경부암, 흑색종, 전립선암, 간암, 림프종, 대장암, 난소암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은, 상기 펩타이드의 투여로 암을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는, 상기 펩타이드의 투여로 암 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 암의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 펩타이드를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

상기 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

용어 "담체(carrier)"라 함은 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미한다. 용어 "희석제(diluent)"라 함은 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키는 물에서 희석되는 물질로 정의된다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 펩타이드와 함께 암의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 암의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 TLR1/2 및 또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 TLR1/2 및 또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, TLR1/2 및 또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 상기 펩타이드의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, TLR1/2 및 또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 펩타이드의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 TLR1/2 및 또는 TLR4 관련 질병은 라임병(lime disease), 만성 또는 급성 인플루엔자 감염 및 바이러스 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스질환은 ssRNA, dsRNA, dsDNA 또는 ssDNA로 이루어진 바이러스 그룹을 모두 포함하는 바이러스성 질병을 의미한다. ssRNA 바이러스로는 아스트로바이러스과(positive-sense ssRNA; 인간 아스트로바이러스), 칼리시바이러스과(positive-sense ssRNA; 노로바이러스), 피코르나바이러스과(positive-sense ssRNA; coxsackievirus, A형 간염, poliovirus, rhinovirus), 코로나바이러스과(positive-sense ssRNA; 중증급성호흡기증후군 바이러스, SARS-CoV-2), 플라비바이러스과(positive-sense ssRNA; Hepatitis C virus, yellow fever virus, dengue virus, West Nile virus TBE virus), 토가바이러스과(positive-sense ssRNA; 풍진 바이러스), 헤페바이러스과(positive-sense ssRNA; Hepatitis E virus), 레트로바이러스과(ssRNA-RT; 인간면역결핍 바이러스 HIV), 오르토믹소바이러스과(negative-sense ssRNA; 오르토믹소바이러스), 아레나바이러스과(negative-sense ssRNA; Lassa virus), 부니아바이러스과(negative-sense ssRNA; 크림-콩고 출혈열, Hantaan virus), 필로바이러스과(negative-sense ssRNA; 에볼라바이러스, Marburg virus), 파라믹소바이러스과(negative-sense ssRNA; Measles virus, Mumps virus, Parainfluenza virus, 호흡기 세포융합 바이러스), 랍도바이러스과(negative-sense ssRNA; Rabies virus), Hepatitis D(negative-sense ssRNA)가 포함되고, dsRNA 바이러스로는 레오바이러스과(dsRNA; 로타바이러스, Orbivirus, Coltivirus, Banna virus)가 있으며, dsDNA 바이러스로는 아데노바이러스과(dsDNA; 아데노바이러스), 단순포진바이러스과(dsDNA; 단순포진 제1형, 단순포진 제2형, Varicella-zoster virus, Epstein-Barr virus, Human cytomegalovirus, KSHV), 파필로마바이러스과(dsDNA; 인간 유두종바이러스), 폴리오마바이러스과(dsDNA; BK 바이러스, JC 바이러스), 폭스바이러스과(dsDNA; 천연두), 헤파드나바이러스과(dsDNA-RT; B형 간염 바이러스)가 포함되고, ssDNA 바이러스로는 파르보바이러스과(ssDNA; 파르보바이러스 B19)가 있으며, 이러한 바이러스 군에 의해 유발된 바이러스질환에서 선택된 질환인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바이러스질환의 예는, 비제한적 예로서, 감기, 독감(인플루엔자), 수두, 대상포진, 단순포진, 감염성 단핵구증, 거대세포바이러스감염, 홍역, 볼거리, 풍진, 파보바이러스감염, 소아마비(폴리오), 바이러스성 출혈열, 황열, 뎅기열, 공수병, 에이즈 및 코비드-19를 포함한다.

상기 TLR1/2 및 또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상술한 상기 펩타이드를 포함하는 약학적 제제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.

기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

실시예 1-1: 세포주 및 시약

THP-1 세포(아주대학교 의료원(Suwon, Korea) 서창희 교수로부터 입수), A549 세포(ATCC, Manassas, VA, USA) 및 MDA-MB-231 세포(아주대학교 의료원(Suwon, Korea) 최경숙 교수로부터 입수)는 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액과 10% 우태아혈청(FBS; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)이 보충된 RPMI1640에서 배양되었다. THP-1 세포는 80nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 24시간 동안 대식세포로 분화시켰다. 인간 진피 섬유아세포(HDF; ATCC); 293/hTLR5, 293/hTLR2 및 HEK-Blue™ hTLR4 세포(InvivoGen, San Diego, CA, USA); 및 MCF-7 231 세포(최경숙 교수로부터 입수)는 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액, 10% FBS 및 0.2% 노르모신(normocin)을 함유하는 고-글루코스 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에서 배양되었다. RAW 264.7 세포(대식세포; 한국 세포주 은행, Seoul, Korea)를 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액과 10% FBS(Thermo Fisher Scientific, Inc.)가 함유된 고-글루코스 DMEM에서 배양했다. 모든 세포는 5% CO₂, 37℃의 습한 조건(Thermo Fisher Scientific, Inc.)에서 배양하였다. Lipofectamine 2000 및 PAM₃CSK₄는 Thermo Fisher Scientific, Inc.에서 구입하였고, FSL-1 및 FLA-ST는 InvivoGen으로부터, TH1020는 Tocris(Cookson, Bristol, UK)에서 구입하였으며, LPS(Escherichia coli 0111:B4), Cu-CPT22, TAK-242 및 PMA는 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하였다. FLA-AA(flagellin from A. avenae)는 이전에 설명된 프로토콜에 따라 정제되었다(Hirai, H. et al., Purification of Flagellin from Acidovorax avenae and Analysis of Plant Immune Responses Induced by the Purified Flagellin. 2016). 실험에 사용된 모든 펩타이드는 BioStem(Ansan, Korea)에서 합성하였다.

실시예 1-2: 세포 생존력(cell viability) 분석

Colorimetric 1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan(MTT) 분석(Sigma-Aldrich Co.)을 수행하여 세포 생존력을 계산하였다. THP-1 세포(10⁵/well), HDFs(10⁴/well), A549 세포(10⁴/well), MCF-7 세포(1.5×10⁴/well) 및 MDA-MB-231 세포(1.5×10⁴/well)를 96-웰 플레이트(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 분주하고 밤새 성장시켰다. 세포를 다양한 농도의 FLA-ST, FLA-AA 또는 AF1-4로 24시간 처리하였다. 다음날, 10% MTT 용액 포함 배지(100μl/well)로 배지를 교체하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. DMSO(100μl/well)로 교체하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 배양했다. 플레이트는 마이크로플레이트 분광 광도계 시스템(Molecular Devices, Silicon Valley, California)을 사용하여 540nm 파장에서 판독되었다.

실시예 1-3: SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase ) 활성 분석

HEK-Blue™ hTLR4 세포(3×10⁴/well)를 96-웰 플레이트(BD Biosciences)에서 밤새 성장시켰다. 세포는 다양한 농도의 AF1, AF2, PAM3CSK4, FSL-1, LPS 또는 FLA-ST로 24시간 처리되었다. 수집된 배양 상층액(200μl)을 65℃, 10분 동안 heating block(FINEPCR Co., Seoul, Korea)에서 가열한 다음, 새로운 96-웰 플레이트(BD Biosciences)로 옮겨 SEAP Reporter Assay Kit(InvivoGen)로 SEAP 생산을 검출하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더 분광 광도계 시스템(Molecular Devices Inc., Silicon Valley, CA, USA)으로 620nm에서 측정되었다.

실시예 1-4: 웨스턴 블랏 (western blot) 분석

M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 사용하여 총 세포 단백질을 추출하고, 단백질 농도는 Bicinchoninic Acid(BCA) Assay Kit(Sigma-Aldrich)로 측정하였다. 단백질 샘플을 전기영동하고, Mini-PROTEAN Tetra Cell and Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell System(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)의 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 4℃에서 밤새 부드럽게 흔들어주면서, phospho-(p-)p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, Iκ-Bα(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA) 및 β-actin(Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA)에 대한 특이적 1차 항체(1:500-1:1000 희석)로 면역 블랏시켰다. 0.1% Tween 20이 보충된 PBS로 철저하게 세척한 후, 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 peroxidase-conjugated 항-마우스 또는 항-토끼 IgG 항체(1:1,000)와 함께 배양하였다. 단백질 밴드는 SuperSignal West Pico ECL Solution(Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 사용하여 검출하고, ChemiDoc™ Touch Imaging System(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 시각화하였다.

실시예 1-5: 면역형광법 ( Immunofluorescence )

THP-1 세포, RAW 264.7 세포 또는 HDFs를 24-웰 플레이트(BD Biosciences)에 10⁴/well의 밀도로 커버 슬립에서 성장시켰다. THP-1 세포 및 HDFs는 FLA-ST 또는 FLA-AA(200ng/ml)로 처리 전, TH1020(3μM)으로 1시간 동안 전처리되거나, 전처리되지 않았다. 이와 유사하게, RAW 264.7 세포와 HDFs는 AF1(5μM)로 자극하기 전에, Cu-CPT22(20μM), TAK-242(20μM), 또는 둘 다 또는 DMSO로 1시간 동안 전처리되거나, 전처리되지 않았다. 그 다음, 세포를 고정시키고, 냉각된 메탄올(Samchun Chemicals, Korea)에 10분간 투과시킨 후, PBS로 세척하고, 3% BSA 용액 포함 PBS(Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 30분간 블로킹하였다. 세포를 항-p-p65 항체(1:1000; Cell Signaling Technology Inc.) 및 항-β-actin 항체(1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 철저한 세척 후, 세포를 Alexa Fluor 488- 또는 Alexa Fluor 546-접합 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 세척 한 후, 핵을 Hoechst 33258 용액(5μM; Sigma-Aldrich)으로 10분 동안 염색하였다. 이미지는 형광 현미경(Olympus IX53; Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 포착하였다.

실시예 1-6: 사이토카인( cytokine ) 검출 분석

THP-1 유래 대식세포(10⁵/well), HDFs(10⁴/well), 293/hTLR5 세포(3×10⁴/well), A549 세포(10⁴/well), MCF-7 세포(1.5×10⁴/well), MDA-MB-231 세포(1.5×10⁴/well), 293-hTLR2 세포(3×10⁴/well) 및 RAW 264.7 세포(10⁵/well)를 96-웰 플레이트(BD Biosciences)에 분주하고, 밤새 성장시켰다. 처리 24시간 후, TNF-α 생산은 Human and Mouse TNF Alpha Uncoated ELISA Kit(eBioscience, San Diego, CA, USA)로, IL-6는 Human IL-6 ELISA MAX Deluxe Kit(BioLegend, San Diego, CA, USA)로, IL-8은 Human IL-8 Uncoated ELISA Kit(eBioscience)로 평가하였다. NLRC4 활성화를 위해, THP-1 대식세포를 LPS(1μg/ml)로 4시간 동안 프라이밍한 다음, Lipofectamine 2000을 이용하여 FLA-AA 및 FLA-ST로 2시간 동안 형질감염시켰다. IL-1β의 분비량을 평가하기 위해, IL-1 beta Human Uncoated ELISA Kit(Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 배양 상층액을 수집하였다. 그 다음, 플레이트를 각 파장에서 마이크로플레이트 분광 광도계 시스템(Molecular Devices)으로 분석하였다.

실시예 1-7: 통계 분석

제시된 데이터는 4번의 독립적인 실험의 평균이며, 실험군의 평균±SEM 사이의 차이는 two-tailed paired Student's t test(*P < 0.05)로 평가하였다.

실시예 2: 인간 대식세포(macrophages) 및 섬유아세포(fibroblasts)에서 면역 신호전달을 활성화시키는 FLA-AA

FLA-AA의 기능적 분석에 앞서, TLR5(Hayashi, F. et al., Nature 2001, 410, 1099-1103)와 NLRC4(Zhao, Y. et al., Nature 2011, 477, 596-600)를 통해 인간 면역계를 활성화시키는 것으로 보고된 Salmonella typhimurium에서 추출한 플라젤린 단백질과의 서열 유사성을 확인하였다. EMBL-EBI의 pairwise local sequence alignment tool인 "EMBOSS water"를 사용하여, 서열 간 40.1%의 동일성을 확인하였다(도 1).

PAMP는 TLR과 같은 다양한 숙주 PRR에 의해 인식되어, 다운스트림 신호전달 경로의 후속 활성화를 위해 이합체화 할 수 있다. 시작된 신호전달 경로는 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터루킨 6(IL-6) 및 인터루킨 8(IL-8)과 같은 다양한 사이토카인의 분비를 유도한다(Akira, S. et al., Nature reviews immunology 2004, 4, 499). PMA-분화 인간 대식세포 (THP-1 세포) 및 섬유아세포(HDF)에서 면역 신호전달 경로의 활성화와 관련하여, FLA-AA 및 FLA-ST(양성 대조군)의 독성 및 면역원성(immunogenicity)을 평가하였다.

FLA-AA의 독성 프로파일은 THP-1 세포(고농도에서 독성; 도 2a) 및 HDF(무독성; 도 2d)에 대한 FLA-ST의 독성 프로파일과 일치했다. 또한, 24시간 처리 후, THP-1 세포에 의한 IL-8(도 2b) 및 TNF-α(도 2c)의 용량 의존적 분비를 관찰하였다. 마찬가지로, 24시간 동안 FLA-AA 또는 FLA-ST로 처리한 후, HDF에 의한 IL-8(도 2e) 및 IL-6(도 2f)의 용량 의존적 분비를 검출하였다. TLR에 의한 리간드 인식은 extracellular signal-regulated kinase(ERK), c-Jun N-terminal kinase(JNK) 및 p38을 포함하여 다운스트림 NF-κB 및 mitogen-activated protein kinases(MAPKs)를 활성화시킨다. 따라서, 인간 대식세포(THP-1 세포)를 FLA-AA로 처리한 후, NF-κB(p65의 인산화)와 MAPKs(ERK, JNK, p38의 인산화)의 활성화를 시간 의존적 방식으로 관찰하였다(도 2g).

PAMP로 프라이밍된 세포는 세포내 플라젤린 단백질을 인식하면 NLRC4를 활성화하여 caspase 1이 IL-1β 및 IL-18과 같은 염증성 사이토카인을 방출하도록 도와준다(Miao, E.A. et al., Nature immunology 2006, 7, 569). NLRC4를 활성화하는 플라젤린 단백질의 능력을 고려하여, 식물 병원체에서 유래된 플라젤린(FLA-AA)이 인간 병원체에서 유래된 것(예를 들어 FLA-ST)과 마찬가지로 인간 세포에서 NLRC4를 자극할 수 있는지 여부를 테스트하였다. FLA-AA 또는 FLA-ST의 세포내 전달을 위해 Lipofectamine 2000을 이용하였으며, FLA-AA 및 Lipofectamine 2000의 혼합물을 사용하여 용량 의존적 방식으로 IL-1β의 상당한 분비를 확인하였다. 그러나, FLA-AA 단독으로 처리했을 때 IL-1β는 검출되지 않았다(도 2h).

종합하면, TLR 신호전달 경로를 시작하고 표적 세포 처리시 NLRC4를 유발하는 측면에서 FLA-AA는 면역원성임을 시사한다.

실시예 3: TLR5에 특이적인 FLA-AA-매개 신호전달

박테리아 편모의 주요 구성 요소인 플라젤린은 다양한 세포에서 발현되는 TLR5에 의해 인식되는, 진화적으로 보존된 부위를 가지고 있다(Gewirtz, A.T. et al., The Journal of Immunology 2001, 167, 1882-1885). 소분자 TH1020은 TLR5에 대한 결합에 있어 플라젤린과 경쟁하여, TLR5 억제제로 작용한다(Yan, L. et al., ChemMedChem 2016, 11, 822-826).

THP-1 세포(도 3a 및 3b) 및 HDFs(도 3c 및 3d)에서 TLR5에 대한 FLA-AA의 특이성을 평가하기 위해, FLA-AA(200ng/ml) 또는 FLA-ST(200ng/ml)과 함께 다양한 농도의 TH1020(1.5, 3 또는 6μM)를 세포에 처리하고, 분비된 사이토카인의 농도를 조사하였다. THP-1 세포에서는, IL-8(도 3a) 및 TNF-α(도 3b) 분비의 TH1020 의존적 감소가 관찰된 반면, HDFs에서는, IL-8(도 3c) 및 IL-6(도 3d)의 분비 감소가 관찰되었다.

다음으로, TLR5 과발현 세포주(293/hTLR5)에서 FLA-AA 독성 및 신호전달 활성화를 평가하였다. 500ng/ml까지의 FLA-AA 처리 동안 유의미한 독성은 없었으며(도 3e), 처리 24시간 후에 IL-8의 유의한 분비가 관찰되었다(도 3f). TLR5 신호전달의 활성화는 NF-κB의 p65 서브유닛의 인산화로 이어지며, 이는 세포내 마커로 작용할 수 있다. THP-1 세포(도 4a) 및 HDFs(도 4b)와 함께 FLA-AA(200ng/ml)를 배양한 후, 면역형광을 이용하여 p65의 인산화(p-p65)를 시각화하였다. 이전 결과와 마찬가지로, FLA-AA 및 TLR5 억제제 TH1020으로 세포를 공동 처리한 후, THP-1 세포(도 4a) 및 HDFs(도 4b)에서 p-p65의 형광 강도가 감소하였다. 이러한 결과들을 통해, FLA-AA가 TLR5에 의해 특이적으로 인식되어 다운스트림 신호전달 경로를 시작하게 함을 확인할 수 있다.

실시예 4: 인간 대식세포와 섬유아세포에서 면역 신호전달을 활성화하는 FLA-AA 유래 펩타이드

플라젤린 단백질은 여러 도메인을 포함하며, 그 중 D0 및 D1은 다운스트림 신호전달 경로에 대한 TLR5의 결합 및 촉발에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Yoon, S.-i. et al., Science 2012, 335, 859-864). 따라서, C-말단 D0/D1 도메인에서 아미노산 잔기의 한 구간(AF1)을 선택하고, N-말단 D0/D1 도메인에서 3개의 구간(AF2, AF3 및 AF4)을 선택하였다(도 5).

먼저, FLA-ST(양성 대조군)와 함께, PMA-분화 인간 대식세포(THP-1) 및 HDFs에 대한 펩타이드 AF1-AF4의 독성 및 면역원성을 평가하였다. THP-1 세포에 대해 펩타이드 AF1 및 AF2는 고농도에서 약간의 독성을 보였고, AF3 및 AF4는 무독성인 반면(도 6a), 모든 펩타이드(AF1-AF4)는 고농도에서 HDFs에 대해 독성이 있었다(도 6b). THP-1 세포(도 7a 및 7b)와 HDF(도 7c 및 7d)를 각 펩타이드로 24시간 동안 처리한 후, 펩타이드 AF1 및 AF2에서만 IL-8의 용량 의존적 분비가 관찰되었다(도 7a 및 7c). 또한, AF1과 AF2는 TNF-α(도 7b)와 IL-6(도 7d)의 용량 의존적 분비를 유도했다. TLR에 의한 리간드의 인식은 JNK 및 p38을 포함하는 다운스트림 NF-κB 및 MAPKs를 활성화시킨다. AF2보다 AF1의 면역원성이 더 강하였으므로 다운스트림 신호전달 경로의 분석을 위해 선택하였다. 예상대로 AF1으로 처리한 후 NF-κB(p65의 인산화 및 IKBα의 분해) 및 MAPKs(p38 및 JNK의 인산화)의 시간 의존적 활성화가 나타났다(도 7e).

종합하면, 이러한 결과들은 표적 세포와의 배양시 TLR 신호전달 경로를 시작하는 측면에서 AF1 및 AF2가 면역원성임을 시사한다.

실시예 5: TLR5와 독립적으로 TLR 신호전달 경로를 자극하는 AF1 및 AF2

박테리아 편모는 진화적으로 보존된 부위로 인해 TLR5에 의해 인식되는 플라젤린 단백질로 주로 구성된다. 펩타이드 AF1과 AF2는 A. avenae 박테리아의 플라젤린에서 유래되었으므로, TLR5를 통해 TLR 신호전달을 활성화하는지 여부를 테스트하였다. TH1020은 TLR5에 대한 결합에 대해 플라젤린과 경쟁함으로써 TLR5 신호전달을 억제한다.

THP-1 세포(도 8a 및 8b) 및 HDFs(도 8c 및 8d)에서 TLR5 특이성을 테스트하기 위해, 다양한 농도의 TH1020(1.5, 3 또는 6μM)과 AF1 또는 AF2(5 μM)를 세포와 함께 배양하여, 사이토카인 분비 억제를 조사하였다. THP-1 세포에서 IL-8(도 8a) 및 TNF-α(도 8b) 분비의 TH1020 의존적 감소가 관찰되었다. AF2의 낮은 효능을 고려하여, AF1만으로 HDFs에서 동일한 실험을 수행하고, IL-8(도 8c) 및 IL-6(도 8d) 분비의 감소를 관찰했다. 또한, AF1(750nM)에 의해 활성화된 다운스트림 TLR 신호전달 경로의 TH1020(6μM) 의존적 억제를 관찰하였다(도 8e). 마우스 대식세포(RAW 264.7 세포)는 기능적 TLR5를 발현하지 않으므로(Means, T.K. et al., The Journal of Immunology 2003, 170, 5165-5175), 추가 확인을 위해 음성 대조군 세포주로 사용하였다. 참고로, 두 펩타이드 모두 TNF-α(도 8f)와 IL-6(도 8g)의 분비를 크게 향상시켰다. 이 결과와 일치하게, 어떠한 펩타이드도 TLR5 과발현 세포주(293/hTLR5) 처리 후 사이토카인 분비를 유도하지 않았다(도 8h). 결과적으로, AF1 및 AF2는 TLR5와 독립적으로 TLR 신호전달을 활성화한다는 것을 시사한다.

실시예 6: MD-2 의존적 방식으로 TLR1 /2 및 TLR4를 통한 신호전달을 활성화하는 AF1 및 AF2

TLR5 독립적 신호전달 시작을 감지한 후, AF1 및 AF2가 다른 세포외 TLR, 즉 TLR1/2, TLR2/6 또는 TLR4와 상호작용한다는 가설을 세웠다. 이 가설을 테스트하기 위해, TLR2 과발현 세포(293/hTLR2; 도 9a) 또는 TLR4 과발현 세포(HEK-Blue™ hTLR4; 도 9b)와 함께 펩타이드 AF1 및 AF2를 배양하였다. 두 세포주에서, 두 펩타이드 모두 신호전달, 즉 TLR2와 TLR4를 통한 신호전달을 유의하게 자극했지만, TLR5를 통한 신호전달은 자극하지 않았다. TLR2는 그의 코어 수용체(coreceptors)인 TLR1 및/또는 TLR6와 함께 이종이합체(heterodimer)를 형성함으로써 신호전달을 활성화한다(Triantafilou, M. et al., Journal of Biological Chemistry 2006, 281, 31002-31011). 따라서, 어떠한 TLR2 이종이합체(들)가 펩타이드에 의해 활성화되는지 결정하는 것이 중요하다.

TLR1/2를 테스트하기 위해, TLR1/2 억제제(Cu-CPT 22), TLR4 억제제(TAK-242) 또는 둘 다를 사용하여 마우스 대식세포 (RAW 264.7 세포)를 별도로 전처리 하였다. 후처리에는 24시간 동안 AF1(5μM) 또는 AF2(10μM)가 포함되었다. 이러한 억제제들은 염증성 사이토카인 TNF-α의 분비를 현저히 감소시켰다(도 9c). RAW 264.7 세포(도 10a) 및 HDFs(도 10b)의 면역 형광 분석에 의해 이러한 결과를 확인하였다. 이 결과들은 신호전달에서 TLR4와 함께 TLR1/2 이종이합체의 관련성에 대한 단서를 제공한다.

TLR2/6를 테스트하기 위해 TLR2/6 과발현 세포주(293/hTLR2-TLR6)를 두 펩타이드와 적절한 대조군 리간드로 처리하였다. TLR2/6 리간드인 FSL-1과 달리, 어떠한 펩타이드도 사이토카인 분비를 유발하지 않았다(도 9d). 더욱이, AF1 및 AF2는 MD-2 억제제(L48H37)에 의해 확인되는 바와 같이, MD-2 의존적 방식으로 신호전달을 활성화하였다(도 9e).

결과적으로, AF1 및 AF2는 TLR1/2 및 TLR4를 통해 TLR 신호전달을 활성화함을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Toll-like receptor 1/2 and/or 4 Activating Peptides and Uses Thereof <130> P20-B218 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AF1 <400> 1 Ile Asp Ala Ala Leu Ser Ala Val Asn Gly Gln Arg Ala Ser Phe Gly 1 5 10 15 Ala Leu Gln Ser Arg Phe Glu Thr Thr Val Asn Asn Leu Gln Ser Thr 20 25 30 Ser Glu Asn 35 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AF2 <400> 2 Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn 1 5 10 15 Ala Thr Asn Ser Ser Gly Asp Arg Lys Ala Ile Gln Ala Glu Val Gly 20 25 30 Gln Leu Leu 35 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AF3 <400> 3 Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Leu Ala Gln Thr Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ala Leu Lys Ser Thr Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AF4 <400> 4 Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala 1 5 10 15 Gly Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn 20 25 30 <210> 5 <211> 492 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLA-AA <400> 5 Met Ala Ser Thr Ile Asn Thr Asn Val Ser Ser Leu Thr Ala Gln Arg 1 5 10 15 Asn Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ser Leu Asn Thr Ser Ile Gln Arg Leu 20 25 30 Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu 35 40 45 Ala Ile Ser Glu Arg Phe Thr Ser Gln Ile Arg Gly Leu Asn Gln Ala 50 55 60 Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Leu Ala Gln Thr Ala Glu Gly 65 70 75 80 Ala Leu Lys Ser Thr Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala 85 90 95 Val Gln Ser Ala Asn Ala Thr Asn Ser Ser Gly Asp Arg Lys Ala Ile 100 105 110 Gln Ala Glu Val Gly Gln Leu Leu Ser Glu Met Asp Arg Ile Ala Gly 115 120 125 Asn Thr Glu Phe Asn Gly Gln Lys Leu Leu Asp Gly Ser Phe Gly Ser 130 135 140 Ala Thr Phe Gln Val Gly Ala Asn Ala Asn Gln Thr Ile Thr Ala Thr 145 150 155 160 Thr Gly Asn Phe Arg Thr Asn Asn Tyr Gly Ala Gln Leu Thr Ala Ser 165 170 175 Ala Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Ala Thr Ala Gly Ser Ala Gly Ala 180 185 190 Ala Ala Gly Thr Val Val Ile Ala Gly Leu Gln Thr Lys Thr Val Asn 195 200 205 Val Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ser Asp Ile Ala Ser Ala Val Asn Ala 210 215 220 Val Ala Asp Ser Thr Gly Val Thr Ala Ser Ala Arg Asn Val Ser Glu 225 230 235 240 Met Lys Phe Ser Gly Thr Gly Ser Phe Thr Leu Ala Val Lys Gly Asp 245 250 255 Asn Ser Thr Ala Ala Asn Val Thr Phe Asn Val Ser Ala Thr Ser Thr 260 265 270 Ala Ala Gly Leu Ala Glu Ala Val Lys Ala Phe Asn Asp Val Ser Ser 275 280 285 Gln Thr Gly Val Thr Ala Lys Leu Asn Ser Asp Ser Ser Gly Leu Ile 290 295 300 Leu Thr Asn Glu Ser Gly Asn Asp Ile Asn Ile Ala Asn Gly Ser Ser 305 310 315 320 Ser Ala Ala Gly Ile Thr Leu Ala Ser Gln Asp Ala Val Thr Thr Gln 325 330 335 Ser Ser Gly Thr Leu Thr Phe Thr Ser Ala Thr Ala Ala Gly Thr Gly 340 345 350 Val Thr Val Ala Ser Arg Gly Thr Val Glu Tyr Lys Ser Asp Lys Gly 355 360 365 Tyr Thr Val Ser Gly Thr Gly Gly Thr Met Thr Asn Ala Thr Ala Thr 370 375 380 Ser Ser Thr Leu Thr Lys Val Ser Asp Ile Asp Val Ser Thr Val Asp 385 390 395 400 Gly Ser Thr Lys Ala Leu Lys Ile Ile Asp Ala Ala Leu Ser Ala Val 405 410 415 Asn Gly Gln Arg Ala Ser Phe Gly Ala Leu Gln Ser Arg Phe Glu Thr 420 425 430 Thr Val Asn Asn Leu Gln Ser Thr Ser Glu Asn Met Ser Ala Ser Arg 435 440 445 Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Phe Ala Ala Glu Thr Ala Asn Leu Ser 450 455 460 Arg Ser Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ala Met Val Ala Gln Ala 465 470 475 480 Asn Gln Leu Pro Gln Gly Val Leu Ser Leu Leu Lys 485 490

Claims (11)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 TLR(Toll-like receptor)1/2 및/또는 TLR4 신호전달 경로를 활성화하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 NF-κB(nuclear factor kappa B) 활성화 또는 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)의 인산화를 유발시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6) 또는 IL-8(interleukin-8)의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 TLR(Toll-like receptor) 작용제(agonist).
   
6. 제5항에 있어서, 상기 TLR은 TLR1/2 및/또는 TLR4인 것을 특징으로 하는 작용제.
   
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 면역보조제(adjuvant).
   
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 암은 폐 종양, 방광암, 자궁경부암, 흑색종, 전립선암, 간암, 림프종, 대장암, 난소암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병은 라임병(lime disease), 만성 또는 급성 인플루엔자 감염 및 바이러스 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 TLR1/2 및/또는 TLR4 관련 질병의 예방 또는 치료용 조성물.

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