KR20220066269A - 락토바실러스 루테리 - Google Patents
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Abstract
NCIMB 기탁번호 42835를 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)균주는 신규한 계통발생적 클레이드(clade)로부터의 것이며, 인간 장내 독특한 면역 자극 특성 및 향상된 생태학적 성능을 갖는다. 라피노오스(raffinose)와 같은, 균주를 위한 기질(substrate)은 상기 균주와 동일하거나 별도로 투여될 수 있다.
Description
본 발명의 분야
본 발명은 독특한 면역 자극 특성 및 인간 장내에서의 향상된 생태학적 성능을 갖는 신규한 계통발생적 클레이드(phylogenetic clade)로부터의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri(L. reuteri))에 관한 것이다.
본 발명의 배경
장내 미생물군(gut microbiota)은 병리에 직접적으로 기여함으로써 질병에 대한 숙주의 소인에 영향을 미치는 인간 건강의 중요한 결정 인자이다. 현대 생활 방식과 산업화로 인해 장내 미생물군의 박테리아 다양성이 감소했으며, 이는 항생제 사용, 현대 임상 관행, 위생 및 식이 습관의 변화와 같은 요인의 조합 때문일 수 있다는 실질적인 증거가 있다(Blaser & Falkow 2009; Segata, 2015). 전 세계 모든 지역에서 NCDs(non-communicable disease:비전염성 질병) 발병률 증가는 풍요로운 생활 방식과 관련이 있으며, 적어도 부분적으로는 미생물 다양성의 손실로 인한 것으로 생각된다(Haahtela et al., 2015; Hanski et al., 2012; Rook, 2013). 이러한 연결에 대한 메커니즘은 알려져 있지 않으며, '위생 가설(hygiene hypothesis)'과 같은 개념에서 병원성 미생물에 가장 중점을 두었다(Jarchum et al., 2011). 인간 진화 동안 미생물이 우리 면역 체계를 조절하는 데 필수적인 역할로 진화했다는 대안적이고 아마도 더 그럴듯한 가설이 제안되었다. 미생물은 감염이 아니라 우리 인간의 미생물군집(microbiome)을 구성하는 친근하고 공생하는 미생물이다. 이들은 우리 자연 환경에서 다른 인간이나 동물 및 미생물군에 노출되어 획득된다. 연구자들은 이제 제왕절개(C-section) 출산의 증가, 모유 수유 감소, 가족 규모 축소, 및 야외 활동 시간 감소 등 다양한 생활 방식 변화가 친화적인 미생물에 대한 감소된 노출의 근본적인 원인이 되는 반면, 변경된 식단과 항생제는 미생물군집 구성에 악영향을 미치는 것에 동의한다.
따라서, 장내 미생물군의 박테리아 다양성을 개선할 필요가 있다.
락토바실러스 루테리(L. reuteri)는 인간 GI관의 진정한 토착 박테리아 중 하나로 밝혀졌다(Sinkiewicz, 2010). 그것은 자연적으로 인간, 돼지, 햄스터, 생쥐, 쥐, 개, 양, 소 및 다른 종의 새(닭 포함)를 포함한 다양한 척추동물에 서식하며 인간의 비뇨 생식로 및 모유에서도 발견되었다.(Mitsuoka, 1992).
락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 유병률은 현재 이 종이 가끔 발견되는 서양(western) 인간 개체군에서 매우 낮다(Walter J, 2008). 인간 분변 샘플에서 락토바실러스 루테리의 유병률이 지난 세기 중반에 더 높았다는 몇 가지 증거가 있다. 1960년대와 1970년대에 인간 소화관의 락토바실러스 생물군(biota)을 집중적으로 연구한 Gerhard Reuter와 Tomonari Mitsuoka는 락토바실러스 루테리가 당시 우점한 락토바실러스 중 하나였으며 정기적으로 검출되었다고 보고했다(Mitsuoka T., 1992; Reuter G., 2001 ). 보다 최근의 연구에서 인간의 낮은 유병률은 지난 50년 동안 락토바실러스 루테리 개체군 규모의 감소를 시사한다.
단일 계통군(monophyletic group)이라고도 알려진 "클레이드(clade)"(고대 그리스어:
, klados,"분기")이라는 용어는 공통 조상과 모든 직계 후손으로 구성된 유기체 그룹으로 정의되며, "생명의 나무(tree of life)"의 한 "분기(branch)"를 나타낸다.
공통 조상은 개인, 집단, 종(멸종 또는 현존) 등이 될 수 있으며 계(kingdom)에 이르기까지 그리고 더 나아가 계속될 수 있습니다. 클레이드는 각 분기가 차례로 더 작은 분기로 분할됨에 따라 서로 중첩된다. 이러한 분할은 개체군이 독립적으로 분기되고 진화함에 따라 진화의 역사를 반영한다.
락토바실러스 루테리 종은 락토바실리의 이형 발효성(heterofermentative) 클레이드에서 락토바실러스 루테리 그룹을 나타낸다(Duar et. Al. 2017b). 락토바실러스 루테리는 유전적으로나 생리학적으로 잘 특성화되어 있는 것으로 생각되었으며 곡물 및 장 생태계에서 생태학적 적합성에 기여하는 대사 특성이 잘 알려져 있다(Zhao and Ganzle, 2018).
인간 유래 락토바실러스 루테리 균주는 클레이드 II 및 VI로 지정된 두 개의 별개의 MLSA 클레이드에 속한다. 클레이드 II는 반추동물의 분리물(isolate)과 함께 대부분의 인간 장내 분리물 및 클러스터(cluster)를 포함하는 반면, 클레이드 VI의 인간 균주는 닭의 분리물과 밀접한 관련이 있다(Oh, et al. 2010).
본 발명의 요약
본 발명은 NCIMB 기탁번호 42835를 갖는 락토바실러스 루테리 균주를 제공한다.
BALST 알고리즘 사용을 사용하는 ANI(Average Nucleotide Identity measurement)로 생성한 종의 639개의 연결된 핵심(core) 유전자를 사용하여 NCIMB 42835와 다른 락토바실러스 루테리의 게놈 분석은 NCIMB 42835가 락토바실러스 루테리의 가장 긴밀하게 알려진 균주와 97.5% 미만(< 97.5%)의 유사성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서 이 균주는 현재 알려진 락토바실러스 루테리 종의 균주와 크게 다르다.
균주 42835는 인간 장내에서 독특한 면역 자극 특성 및 향상된 생태학적 성능을 갖는 신규한 계통발생적 클레이드로부터의 락토바실러스 루테리이다.
당업자는 균주 NCIMB 42835와의 DNA 서열 상동성 분석에 의해 균주가 확인될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예시적인 표현형 또는 측정가능한 기능적 차이없이 균주 NCIMB 42835와 긴밀한 서열 동일성을 갖는 균주가 본 발명의 범위 내에 있다. NCIMB 42835의 DNA 서열과 97% 이상, 97.5% 이상, 97.75% 이상, 98% 이상, 98.25% 이상, 98.5% 이상, 98.75% 이상, 99% 이상, 99.25% 이상, 99.5% 이상, 99.75% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 균주는 본 발명의 범위 내에 있다. 서열 상동성은, http://www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/에서 공개적으로 입수가능한 온라인 상동성 알고리즘, "BLAST" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 균주는 인간 공생체이다.
본 발명은 NCIMB 기탁번호 42835 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 갖는 락토바실러스 루테리 균주를 제공한다.
상기 돌연변이체는 야생형 NCIMB 42835의 유전적으로 변형된 균주일 수 있다.
상기 변이체는 자연 발생 변이체일 수 있다.
상기 균주는 생물학적으로 순수 배양(pure culture)의 형태일 수 있다.
또한, 락토바실러스 루테리(NCIMB 42835)의 분리된 균주가 제공된다.
상기 균주는 프로바이오틱(probiotic)일 수 있다.
하나의 경우에, 상기 균주는 생존 세포의 형태이다.
다른 경우에, 상기 균주는 비-생존 세포의 형태이다.
락토바실러스 루테리 균주 NCIMB 42835는 투여량 106 cfu 초과, 전형적으로는 107 내지 1010, 전형적으로는 108 내지 109 cfu의 양으로 조성물(formulation)에 존재할 수 있다. 하나의 경우에, 락토바실러스 루테리 균주 NCIMB 42835는 투여량 당 약 lxlO9 cfu의 양으로 조성물에 존재한다.
박테리아 생존력은 샘플 내의 배양 가능한 박테리아의 수, 즉 최적 조건(생존 세포)하에서 성장할 때 재생할 수 있는 능력을 보유하는 박테리아의 수를 반영한다. 환언하면, 생존력은 더 큰 박테리아 콜로니(colony)(콜로니 형성 단위:colony forming units(CFU))로 복제하는 능력을 보유하는 개별 박테리아 세포의 수를 반영한다.
생존력은 일반적으로 플레이트-카운팅(plate-counting) 방법을 사용하여 결정되며, 이에 의해 박테리아 샘플은 희석되고, 그 후 성장 동안 필요한 영양소를 함유하는 한천 플레이트 상에서 배양된다. 그런 다음, 플레이트 상에서 식별된 박테리아 콜로니들의 수로부터 생존력이 계산된다. 이러한 방법은 Modern Food Biology 2005 7th edition, James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden, Springer Science, New York에 요약되어 있다.
플레이트 카운팅은 생존력의 좋은 지표를 제공하지만 샘플의 모든 살아있는 박테리아 세포를 포함하지는 않는다. (Kell, Douglas B., et al. "Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. "Antonie van Leeuwenhoek73.2 (1998): 169-187).
샘플에는 또한 대사적으로 활성 상태를 유지하지만 플레이트 카운트에 의한 분석 시점에 복제 능력을 상실한 "생존 가능하지만 배양 불가능"(Viable but non-culturable(VBNC)) 세포가 함유되므로 살아 있음에도 불구하고 CFU를 형성하지 않을 것이다. 마지막으로 샘플에는 죽은 세포도 함유할 것이다. 이 두 그룹은 "비-생존 세포(Non-Viable cells)"로 함께 그룹화될 수 있다. 따라서, 비-생존 세포는 생존 세포의 역, 즉 테스트될 때 복제 능력을 상실한 모든 세포이다.
생존 세포를 함유하는 모든 샘플은 또한 비-생존 세포를 함유할 것이므로, 따라서, 생존 세포 배양의 정의는 CFU 측정을 사용하여 명확해 진다.
모든 비-생존 샘플은 적어도 VNBCs 및 가능하게는 소량의 생존 세포를 함유할 것이다. 103 CFU/g 생존 세포의 산업 표준 하위 레벨 검출 한계는 비-생존 샘플에서 특정 수의 VBNCs/생존 세포의 존재에 의해 야기되는 고유의 공정 가변성을 허용한다.
일부 실시 양태에서, 이에 제한되지는 않지만, 특정 멸균 식료품 또는 약제, 비-복제 형태의 프로바이오틱 균주가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 99%의 락토바실러스 루테리 균주가 상기 조성물에서 비복제될 수 있다.
하나의 경우에, 상기 균주는 인간에서의 경구 섭취 후에 유의하게 면역조절성이 있다.
일 실시 양태에서, 상기 균주는 박테리아 브로스(bacterial broth)의 형태이다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 균주는 동결 건조된 분말의 형태이다.
본 발명은 본 발명의 균주를 포함하는 조성물(formulation)을 제공한다.
상기 조성물은 또 다른 프로바이오틱(probiotic) 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 프리바이오틱(prebiotic) 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 섭취 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 경우에, 상기 섭취 가능한 담체는 캡슐, 정제 또는 분말과 같은 약학적으로 허용 가능한 담체이다.
다른 경우에, 상기 섭취 가능한 담체는 산성화된 우유, 요구르트, 냉동 요구르트, 우유 분말, 우유 농축액, 아이스크림, 치즈 스프레드, 드레싱 또는 음료와 같은 식료품이다.
일부 실시 양태에서, 상기 조성물은 단백질 및/또는 펩타이드, 특히 글루타민/글루타민산염, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및/또는 미량 원소가 풍부한 단백질 및/또는 펩타이드를 포함한다.
하나의 경우에, 상기 균주는 상기 조성물의 그램 당 106 cfu 이상의 양으로 존재한다.
상기 조성물은 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 박테리아 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약물 개체(drug entity)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 생물학적 화합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 균주 또는 조성물을 포함하는 식품(foodstuff)을 제공한다.
또한, 본 발명의 균주 또는 조성물를 포함하는 약제(medicament)가 제공된다.
일 실시 양태에서, 상기 조성물은 탄수화물을 추가로 포함한다.
상기 조성물은 비-소화성(non-digestible)일 수 있는 올리고당을 포함할 수 있다.
하나의 경우에, 상기 올리고당은 라피노오스(raffinose)를 포함한다.
본 발명은 또한 산업화된 인간 사회의 구성원이 아닌 개체(individual)로부터 분리된 락토바실러스 루테리 균주를 투여하는 단계를 포함하는 산업화된 인간 사회의 구성원인 개체의 미생물군을 향상시키는 방법을 제공한다.
상기 미생물군은 장내 미생물군일 수 있다.
상기 균주는 본원에 정의된 바와 같은 균주일 수 있다.
상기 균주는 본원에 정의된 바와 같은 조성물의 성분일 수 있다.
일 실시예 양태에서, 상기 방법은 상기 균주을 위한 탄수화물 기질을 투여하는 것을 포함한다. 상기 기질은 비-소화성일 수 있는 올리고당을 포함할 수 있다. 하나의 경우에, 상기 올리고당은 라피노오스를 포함한다.
상기 기질은 상기 균주와 동시에 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 균주는 캡슐, 마이크로캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로치(troche), 환제, 좌약, 현탁액 및 시럽과 같은 통상적인 제조의 경구 섭취가능한 형태로 동물(인간 포함)에게 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 적합한 조성물은 통상적인 유기 및 무기 첨가제를 사용하여 일반적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 의약 조성물 중 활성 성분의 양은 원하는 치료 효과를 발휘할 수준일 수 있다.
상기 조성물은 또한 박테리아 성분, 약물 개체 또는 생물학적 화합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 균주를 포함하는 백신은 임의의 적합한 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 기탁된 균주의 돌연변이체 및 변이체를 포함한다. 명세서 전체에 걸쳐 돌연변이체, 변이체 및 유전적으로 변형된 돌연변이체라는 용어는 그 유전적 및/또는 표현형 특성이 모(parent) 균주와 비교하여 변경된 균주를 포함한다. 자연 발생 변이체는 선택적으로 분리된 표적 특성의 자발적인 변경을 포함한다. 모 균주 특성의 의도적인 변경은 유전자 파괴, 접합 전달 등과 같은 기존의 (시험관 내(in vitro)) 유전자 조작 기술에 의해 수행된다. 유전자 변형은, 예를 들어 플라스미드 DNA 또는 박테리오파지(bacteriophages)를 포함하는 벡터에 의해 박테리아 균주의 게놈 내로 삽입에 의해 균주의 게놈 내로 외인성 및/또는 내인성 DNA 서열의 도입을 포함한다.
자연적 또는 유도된 돌연변이체는 DNA 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 변경을 초래할 수 있는 결실, 삽입, 전이(transversion) 또는 기타 DNA 변형과 같은 적어도 단일 염기 변경을 포함한다.
돌연변이체, 변이체 및 유전적으로 변형된 돌연변이체라는 용어는 게놈의 의도적인(시험관 내) 조작에 의해 달성되지 않지만 항생제와 같은 환경적 압력에 노출되었을 때 박테리아의 생존을 지원하는 선택적 이점을 제공하는 변이체 및/또는 돌연변이체의 자연 선택을 통해 달성되는 자발적 돌연변이 및/또는 유전자 획득 및/또는 유전자 소실을 통해 발생하는 모든 미생물 및/또는 유전적 변경에 대해 본질적으로 일치하는 일정 비율로 게놈에 축적되는 유전적 변경을 겪은 균주를 포함한다. 돌연변이체는 유기체의 생화학적 기능성을 근본적으로 변경하지 않지만, 예를들어 항생제 내성의 박테리아의 식별 또는 선택을 위해 사용될 수 있는 특정 유전자를 게놈에 의도적인(시험관 내) 삽입에 의해 생성될 수 있다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 첨부 도면을 참조하여 단지 예로서 주어진 이하의 설명으로부터 더 명확하게 이해될 것이다:
도 1은 다수의 숙주에서 유래한 신규 및 공개된 락토바실러스 루테리(L.reuteri) 게놈(n = 54)의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다. 계통수는 모든 핵심 유전자(n = 639)의 정렬을 기반으로 구성되었다. MLSA 데이터에서 ClonalFrame에 의해 추론된 계보(재조합 영역을 제외한 베이지안 방법(Bayesian method));
도 2는 시골 파푸아뉴기니인(Papua New Guineans)과 미국에 거주하는 개인의 분변 미생물군의 차이를 나타낸다. A)분변 샘플의 전체 박테리아 개체군 차이(Bray-Curtis 비유사성), B)박테리아 개체군의 Shannon 다양성(Martinez et al 2015);
도 3은 락토바실러스 루테리가 하나인 북미의 장내 미생물군에는 없는 47종-수준 작동 분류 단위(Operational Taxonomic Units(OPUs))가 시골 파푸아뉴기니인의 장내에 존재를 나타낸다. 이 도면은 시골 파푸아뉴기니인의 장내 미생물군에서 높은 수준의 L. reuteri의 존재를 강조하는 반면, L. reuteri는 미국에 살고 있는 개체의 장내 미생물군에서는 부재한다;
도 4는 L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Strain 2 및 L. reuteri NCIMB 42835의 한 농도로 시험관 내 자극 후 PBMC에서 TNF-α의 유도 프로필을 나타낸다;
도 5는 L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Strain 2 및 L. reuteri NCIMB 42835의 농도를 증가시키면서 시험관 내 자극 후 PBMC에서 TNF-α의 유도 프로파일을 나타낸다;
도 6은 L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Strain 2 및 L. reuteri NCIMB 42835의 한 농도로 시험관 내 자극 후 PBMC에서 IL-10의 유도 프로필을 나타낸다;
도 7은 L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Strain 2 및 L. reuteri NCIMB 42835의 한 농도로 시험관 내 자극 후 PBMC에서 IL-6의 유도 프로필을 나타낸다;
도 8은 PBMC 분석에서 1회 투여량의 락토바실러스 루테리 균주의 사이토카인(cytokine) 반응의 주요 성분 분석(Principle component analysis(PCA)) 플롯이다;
도 9는 PBMC 분석에서 3회 투여량의 락토바실러스 루테리 균주의 사이토카인 반응의 주요 성분 분석(PCA) 플롯이다;
도 10은 기초(Basal) MRS 성장 배지(3%(m/v))에서 단독 탄수화물로서 라피노오스 또는 글루코오스를 사용하는 L. reuteri NCIMB 42835의 성장 곡선을 나타내며 B-MRS에서 성장 기질로서 글루코오스보다 라피노오스에 대한 L. reuteri NCIMB 42835의 선호도를 입증한다. OD600 값의 통계적 분석은 GraphPad Prism 5.0 with two-way ANOVA로 수행되었으며, P<0.05가 유의미한 것으로 간주된다. ***: P<0.001; **: P<0.01; *: P<0.05;
도 11은 4일째에 L. reuteri의 약 1010개 세포를 1회 투여한 후 정량 플레이팅으로 결정한 분변 샘플에서 락토바실러스 루테리의 세포 수를 나타낸다(PB-W1의 경우 n = 8, DSM 20016의 경우 n = 10). 일수는 이 처리 단계에서 식이 요법이 비-서양식(non-western)(설계된)으로 전환된 후의 시간을 나타낸다. 데이터는 CFU의 log10의 평균 ± SE로 표시된다. 같은 날, 다른 문자로 표시된 각 처리의 세포 수는 p < 0.05인 반복 측정 양방향 ANOVA를 기반으로 크게 다르다. N.S. 유의하지 않음(not significant); 그리고
도 12는 비-서양식(설계된) 식단과 일반 식단 중 세포 수를 비교하여 균주별로 분리된 정량 플레이팅에 의해 결정된 분변 샘플에서 락토바실러스 루테리의 동일한 세포 수를 나타낸다. L. reuteri NCIMB 42835(n=8)(A) 및 L. reuteri DSM 20016(n=10)(B)의 세포 수가 표시된다. 데이터는 CFU의 log10의 평균 ± SE로 표시된다. 같은 날에 설계된 비-서양식 식단과 *로 표시된 일반 식단 간의 세포 수는 p < 0.05인 쌍체(paired) t-테스트에 따라 유의하게 다르다.
본 발명은 첨부 도면을 참조하여 단지 예로서 주어진 이하의 설명으로부터 더 명확하게 이해될 것이다:
도 1은 다수의 숙주에서 유래한 신규 및 공개된 락토바실러스 루테리(L.reuteri) 게놈(n = 54)의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다. 계통수는 모든 핵심 유전자(n = 639)의 정렬을 기반으로 구성되었다. MLSA 데이터에서 ClonalFrame에 의해 추론된 계보(재조합 영역을 제외한 베이지안 방법(Bayesian method));
도 2는 시골 파푸아뉴기니인(Papua New Guineans)과 미국에 거주하는 개인의 분변 미생물군의 차이를 나타낸다. A)분변 샘플의 전체 박테리아 개체군 차이(Bray-Curtis 비유사성), B)박테리아 개체군의 Shannon 다양성(Martinez et al 2015);
도 3은 락토바실러스 루테리가 하나인 북미의 장내 미생물군에는 없는 47종-수준 작동 분류 단위(Operational Taxonomic Units(OPUs))가 시골 파푸아뉴기니인의 장내에 존재를 나타낸다. 이 도면은 시골 파푸아뉴기니인의 장내 미생물군에서 높은 수준의 L. reuteri의 존재를 강조하는 반면, L. reuteri는 미국에 살고 있는 개체의 장내 미생물군에서는 부재한다;
도 4는 L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Strain 2 및 L. reuteri NCIMB 42835의 한 농도로 시험관 내 자극 후 PBMC에서 TNF-α의 유도 프로필을 나타낸다;
도 5는 L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Strain 2 및 L. reuteri NCIMB 42835의 농도를 증가시키면서 시험관 내 자극 후 PBMC에서 TNF-α의 유도 프로파일을 나타낸다;
도 6은 L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Strain 2 및 L. reuteri NCIMB 42835의 한 농도로 시험관 내 자극 후 PBMC에서 IL-10의 유도 프로필을 나타낸다;
도 7은 L. reuteri DSM 20016, L. reuteri ATCC PTA 6475, L. reuteri DSM 17938, L. reuteri Strain 2 및 L. reuteri NCIMB 42835의 한 농도로 시험관 내 자극 후 PBMC에서 IL-6의 유도 프로필을 나타낸다;
도 8은 PBMC 분석에서 1회 투여량의 락토바실러스 루테리 균주의 사이토카인(cytokine) 반응의 주요 성분 분석(Principle component analysis(PCA)) 플롯이다;
도 9는 PBMC 분석에서 3회 투여량의 락토바실러스 루테리 균주의 사이토카인 반응의 주요 성분 분석(PCA) 플롯이다;
도 10은 기초(Basal) MRS 성장 배지(3%(m/v))에서 단독 탄수화물로서 라피노오스 또는 글루코오스를 사용하는 L. reuteri NCIMB 42835의 성장 곡선을 나타내며 B-MRS에서 성장 기질로서 글루코오스보다 라피노오스에 대한 L. reuteri NCIMB 42835의 선호도를 입증한다. OD600 값의 통계적 분석은 GraphPad Prism 5.0 with two-way ANOVA로 수행되었으며, P<0.05가 유의미한 것으로 간주된다. ***: P<0.001; **: P<0.01; *: P<0.05;
도 11은 4일째에 L. reuteri의 약 1010개 세포를 1회 투여한 후 정량 플레이팅으로 결정한 분변 샘플에서 락토바실러스 루테리의 세포 수를 나타낸다(PB-W1의 경우 n = 8, DSM 20016의 경우 n = 10). 일수는 이 처리 단계에서 식이 요법이 비-서양식(non-western)(설계된)으로 전환된 후의 시간을 나타낸다. 데이터는 CFU의 log10의 평균 ± SE로 표시된다. 같은 날, 다른 문자로 표시된 각 처리의 세포 수는 p < 0.05인 반복 측정 양방향 ANOVA를 기반으로 크게 다르다. N.S. 유의하지 않음(not significant); 그리고
도 12는 비-서양식(설계된) 식단과 일반 식단 중 세포 수를 비교하여 균주별로 분리된 정량 플레이팅에 의해 결정된 분변 샘플에서 락토바실러스 루테리의 동일한 세포 수를 나타낸다. L. reuteri NCIMB 42835(n=8)(A) 및 L. reuteri DSM 20016(n=10)(B)의 세포 수가 표시된다. 데이터는 CFU의 log10의 평균 ± SE로 표시된다. 같은 날에 설계된 비-서양식 식단과 *로 표시된 일반 식단 간의 세포 수는 p < 0.05인 쌍체(paired) t-테스트에 따라 유의하게 다르다.
본 발명의 상세한 설명
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri(L. reuteri)) 균주 1 균주는 2017년 9월 29일 영국 스코틀랜드 AB21 9YA, 벅스번, 에버든, 크래입스톤 에스테이트, 퍼거슨 빌딩(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland, UK)에 있는 NCIMB(National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited)에 기탁되었으며 기탁번호 NCIMB 42835가 부여되었다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범위 내에서 실시 양태를 추가로 설명하고 입증한다. 실시예는 단지 예시를 위해 제공되며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 많은 변형이 가능하기 때문에 본 발명의 제한으로 해석되어서는 안 된다.
새로운 계통발생적 클레이드
L. reuteri는 1960년경에 실시된 연구에서 인간에게서 정기적으로 검출되었지만 현대 인간에서는 매우 드물게 발견되어, 최근 서양인에서 L. reuteri 개체군이 감소했음을 시사한다(Walter et al., 2011). L. reuteri는 각각의 숙주 종과 높은 수준의 특이성을 가지고 진화한 척추동물의 실제 공생체로, 진화론적 시대에 걸쳐 유지된 긴밀한 관계를 나타낸다(Oh et. al., 2010; Frese et al., 2011; Duar et al., 2017; Frese et al., 2013). 중요하게도, L. reuteri는 영향력이 큰 여러 간행물(Zelante et al. 2013; Buffington et al. 2016; Lamas et al. 2016; He et al. 2017)에서 입증된 바와 같이, 숙주 면역 기능 및 발달에 상당한 이점을 발휘한다. 그러나 국제 데이터베이스에서 이용할 수 있는 서양 L. reuteri 균주의 게놈은 20개 미만이다. 대부분의 인간 분리물(isolates)은 하나의 계통발생적 혈통(혈통 II)에 모여 있다(Oh et. al., 2010). 이 혈통의 개체군 구조는 매우 낮은 수준의 다양성을 특징으로 하며, 다른 종에 비해 사용 가능한 게놈에 대해 <50개의 단일 뉴클레오타이드 다형성(Single Nucleotide Polymorphisms(SNP))을 보여준다(도 1). 전반적으로, 이러한 발견은 서양인의 L. reuteri 개체군의 최근 감소와 유전적 또는 개체군 병목 현상을 시사한다.
도 2는 시골 파푸아뉴기니인의 장내 미생물군을 보여준다. 오늘날 현대 생활 방식과 산업화로 인해 장내 미생물군의 박테리아 다양성이 상당히 감소했다는 실질적인 증거가 있는데, 이는 아마도 항생제 사용, 현대 임상 관행, 위생 및 식이 습관의 변화와 같은 요인의 조합 때문일 것이다(Blaser & Falkow 2009, Segata, 2015). 도 2a는 파푸아뉴기니인과 북미인 사이에 장내 미생물군이 상당히 다르다는 것을 보여준다. 도 2b는 파푸아뉴기니의 시골 부족 개인의 분변 미생물군에서 더 높은 다양성을 보여준다. 도 3은 47종-유사(like) OTU가 북미인의 장내 미생물군에서 완전히 검출되지 않는다는 것을 보여준다. 이 작업은 서양 사회의 '미생물군집고갈(microbiome depletion)'의 전반적인 전제를 확인한다. 흥미롭게도, 16S rRNA 시퀀싱으로 모든 파푸아뉴기니인 개체에서 검출할 수 있지만 단일 US 대조군에서 검출할 수 없는, 하나의 종은 락토바실러스 루테리이다(도 3). 자폐증 및 IBD와 같은 서양의 비전염성 질병은 파푸아뉴기니인에서 거의 존재하지 않았다(비록 최근에 더 도시화된 생활 방식으로 전파되면서 발생하고 있음). 우리는 시골 파푸아뉴기니인의 분변 샘플에서 얻은 L. reuteri의 분리물을 조사했으며 서양 인간에서 분리된 L. reuteri 균주와 상당히 다른 새로운 L. reuteri 균주를 확인했다. 파푸아뉴기니 부족인의 L. reuteri 균주는 이전에 분리되거나 특성화된 적이 없다.
전체 길이의 16S rRNA 유전자 서열을 얻기 위해 BLAST를 사용하여 각 균주의 어셈블리를 DSM 20016T의 16S rRNA 유전자 서열에 정렬하고, 정렬된 서열 단편을 수동으로 추가로 조립했다. 16S rRNA 유전자간의 유사성(similarity) 값은 BLAST를 사용하여 계산되었다. 이 분석의 결과는 PB-W1이 종의 기준주(type strain)를 포함하는 L. reuteri의 다른 균주와 >99.5% 서열 동일성을 공유함을 보여주었으며, 이는 균주가 L. reuteri임을 결정적으로 입증했다.
시골 파푸아뉴기니인에서 분리된 L. reuteri 균주와 서양 인간의 L. reuteri 균주에 대한 추가 게놈 분석 및 비교는 L. reuteri NCIMB 42835의 게놈 서열이 평균 뉴클레오타이드 동일성(Average Nucleotide Identity(ANI))을 기준으로 임의의 공지된 인간 L. reuteri와 >2.5% 상이함을 나타낸다(표 1). 특히, L. reuteri NCIMB 42835는 L. reuteri 계통수 내에서 확립된 계통발생적 혈통 중 어느 하나에도 속하지 않는다(도 1). 따라서 L. reuteri NCIMB 42835는 새로 확인된 클레이드를 나타낸다.
대조적으로, 또한 시골 파푸아뉴기니인에서 분리된 L. reuteri 균주 2는 클레이드 VI에 속한다.
[표 1]
로어리 파이프라인(Roary pipeline)은 신규 및 게시된 L. reuteri 게놈(n = 54)의 주석이 달린 어셈블리를 기반으로 핵심 유전자를 식별하기 위해 적용되었다. BLAST 알고리즘을 사용하여 JSpeciesWS(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/#analyse/)의 연결된 핵심 유전자를 기반으로 5가지 다른 균주 간의 평균 뉴클레오타이드 서열 동일성(ANI) 값을 계산했다.
결과 요약
종 수준에서 전체 16S 99.5% 유사성은 PB-W1이 L. reuteri 종으로 지정될 수 있음을 나타낸다. ANI 결과는 NCIMB 42835가 알려진 균주와 비교할 때 상당한 균주 수준 변동을 보여준다(전체 게놈의 핵심 유전자에서 >2.5% 평균 차이). 이 차이는 L. reuteri NCIMB 42835가 L. reuteri 계통수 내에서 확립된 계통발생적 혈통 중 임의의 것 내에 속하지 않음을 확인시켜 줌으로, L. reuteri NCIMB 42835는 새로 확인된 클레이드를 나타낸다.
추가 게놈 분석
NCIMB 42835의 16s, ITS 및 IGS 영역은 NCIMB 42835의 전체 게놈에서 분리되었다. 전체 게놈에서 제거된 모든 영역은 균주가 L. reuteri 종의 구성원임을 식별했다.
16s rRNA 식별
NCIMB 42835의 16s rRNA 식별은 인실리코(in silico) 방법을 사용하여 수행되었다. NCIMB 42835의 게놈은 나노포아(Nanopore) 기술 https://nanoporetech.com/과 함께 일루미나(Illumina) 시퀀싱 플랫폼 https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/sequencing-technology.html을 사용하여 얻어져 게놈의 22배 적용 범위(coverage)가 되었다. NCIMB 42835 균주는 유니버설 16s rRNA 프라이머 세트 CO1 5' AGTTTGATCCTGGCTCAG 3'(서열 식별 번호 1) 및 CO2 5' TACCTTGTTACGACT 3'(서열 번호 2)의 존재에 대해 조사(mined)되었다. 16s rRNA 영역의 식별을 용이하게 하기 위해 Carver et al이 설명한 대로 게놈 시각화 도구인 아르테미스(Artemis)가 사용되었다. 두 프라이머 모두 NCIMB 42835의 게놈 내에서 식별되었다. 그런 다음 서열 데이터를 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에 대해 검색하여 뉴클레오타이드 상동성에 의한 균주 종의 동일성을 결정했다. DNA 서열은 NCBI 표준 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 상동성 BLAST 검색 엔진 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에 적용되었다. 16s rRNA 유전자에 대한 클로짓 매치(closet match)는 이 균주가 L. reuteri 종의 구성원임을 식별했다.
표 2: L. reuteri NCIMB 42835의 16s rRNA 서열(서열 식별 번호 3).
TTATATATTTTATATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAACTCGCGAGAGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCTTTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAAACCTGCGGCTGGATC
내부 전사 스페이서(Internal Transcribed Spacer(ITS)) 프로파일링:
NCIMB 42835 균주는 락토바실러스 유니버설 ITS 프라이머 Probio-lac_Uni 5' CGTAACAAGGTAGCCGTAGG 3'(서열 식별 번호 4) 및 Probio-lac_Rev 5' GTYVCGTCCTTCWTCGSC 3'(서열 식별 번호 5)의 존재에 대해 조사되었으며, Milani et al., 2018에 의해 수행된 연구에서 획득했다. Carver et al.에 의해 설명된 게놈 시각화 도구인 Artemis는 ITS 프라이머 세트의 식별을 용이하게 하기 위해 사용되었다. 두 프라이머 모두 NCIMB 42835의 게놈 내에서 식별되었다.
그런 다음 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에 대해 서열 데이터를 검색하여 뉴클레오타이드 상동성에 의한 균주 종의 동일성을 결정했다. DNA 서열은 NCBI 표준 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 상동성 BLAST 검색 엔진에 적용되었다. 획득한 ITS 서열 데이터에 대한 클로짓 매치는 균주가 L. reuteri 종의 구성원임을 식별했다.
표 3: L. Leuteri NCIMB 42835의 ITS 서열(서열 식별 번호 6).
TAGTACCAAGGCATTCACCATGCGCCCTTCATAACTTAACCTAAACAATCAAAGATTGTC
TGATTAATTGAGTTAGCGATTATAATTCGTTAATTAAAACTCAAATAACGCGGTGTTCTC
GGTTTATTGTTTTGTTAATAAAGAAATTAGATAGTATTTAGTTTTCAAAGTACAAGCTCT
GAGGGTAAACCCCTCAAAACTAAACAAAGTTTCTTTGATGTGTAGGTTCCGTTTTATTCC
TTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGGTTCTCC
유전자간 스페이서(InterGenic Spacer(IGS))
NCIMB 42835 균주는 락도바실러스 IGS 프라이머 세트의 존재에 대해 조사되었다. 16S-23S 유전자간 스페이서 영역 분리물은 16S 및 23S 유전자의 보존 영역에 어닐링되는 프라이머를 사용하여 확인되었다: 16-1A 5'-GAATCGCTAGTAATCG-3'(서열 식별 번호 7) 및 23-1B 5'-GGGTTCCCCCATTCGGA-3'(서열 식별 번호 8). 프라이머 세트는 Tannock et al., 1999에 의해 수행된 연구에서 얻었다. 게놈 시각화 도구인 Carver et al.에 의해 설명된 Artemis는 IGS 프라이머 세트의 식별을 용이하게 하기 위해 사용되었다. 두 프라이머 모두 NCIMB 42835의 게놈 내에서 식별되었다.
그 후 얻어진 서열 데이터를 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에 대해 검색하여 뉴클레오타이드 상동성에 의한 균주 종의 동일성을 결정했다. DNA 서열은 NCBI 표준 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 상동성 BLAST 검색 엔진에 적용되었다. 획득한 IGS 서열 데이터에 대한 클로짓 매치는 균주가 L. reuteri 종의 구성원임을 식별했다.
표 4: L. reuteri NCIMB 42835의 IGS 서열(서열 식별 번호 9).
AATCTCCGGATCAAAGCGTACTTACCGCTCCCCGAAGCATATCGGTGTTAGTCCCGTCC
TTCATCGGCTCCTAGTACCAAGGCATTCACCATGCGCCCTTCATAACTTAACCTAAACAA
TCAAAGATTGTCTGATTAATTGAGTTAGCGATTATAATTCGTTAATTAAAACTCAAATAA
CGCGGTGTTCTCGGTTTATTGTTTTGTTAATAAAGAAATTAGATAGTATTTAGTTTTCAA
AGTACAAGCTCTGAGGGTAAACCCCTCAAAACTAAACAAAGTTTCTTTGATGTGTAGGTT
CCGTTTTATTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGGTTCTCCTACGGCTACCTTGTT
ACGACTTCACCCCAGTCATCTGTCCCGCCTTAGGCGGCTCCCTCCATAAAGGTTAGGCCA
CCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAA
CGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCG
NCIMB 42835는 인간 면역 세포(human immune cells)에서 다양한 사이토카인 반응을 유도한다
우리는 인간 면역 세포(PBMC)에 의한 사이토카인 생산에 대한 L. reuteri 균주의 효과에 대한 기능적 데이터로 이러한 게놈 비교를 보완했다. 분석은 동일한 계통발생적 혈통의 균주가 유사한 반응을 보여 L. reuteri 균주의 진화 역사가 이전 연구 결과와 일치하여 숙주와의 상호 작용에 영향을 미친다는 것을 나타낸다(Spinler et al., 2014). 이 연구 결과는 추가로 NCIMB 42835와 인간 유래 프로바이오틱 L. reuteri의 다른 두 하위-집단(sub-population)으로부터의 균주 사이의 분명한 차이점을 입증한다.
파푸아뉴기니(Papua New Guinea(PNG))와 같이 미생물 부담(burden)이 매우 높은 개발도상국의 지역에서 태어난 신생아에 대한 연구는, 호주와 같이 고도로 발달된 지역의 신생아와 비교하여 신생아 면역 기능에서 광범위한 차이를 보여준다(Lisciandro et al., 2012a ; 2012b). 임신 말기에 PNG 신생아의 항원 제시 세포(antigen-presenting cells(APC))는 이미 호주 신생아에 비해 활성화(HLA-DR 및 CD86) 및 억제(면역글로불린 유사 전사체 3 및 4) 마커(marker)의 훨씬 더 높은 기준선 발현을 보여준다. PNG 환경에서 미생물 부담의 면역 자극 특성은 APC의 활성화 마커의 기준선 수준이 증가한 이유 중 하나일 수 있다. 그러나 활성화 시 PNG 제대혈로부터의 APC는 활성화 및 항원 처리가 감소하여 상대적으로 진행이 휴지(quiescent)되고 호주인 신생아에 비해 약화된 T 세포 반응을 유발한다. 이러한 설정 사이에 많은 환경적 차이가 있지만 미생물 부담이 가장 두드러진 것 중 하나이며, PNG 신생아의 더 강한 면역 관용 반응(tolergenic response)은 초기 생애에 유해한 염증 반응의 발병을 예방할 수 있다. 이와 관련하여, L. reuteri 균주가 설치류 연구에서 면역 조절 및 조절 T 세포를 유도하는 것으로 나타났음을 강조하는 것이 중요하다(Liu et al., 2013; 2017). PNG의 기증자로부터 미생물을 분리함으로써, 우리는 아기가 면역 관용 상태를 만드는 초기 생애에 받는 추가 자극을 약화시킬 수 있는 이러한 균주의 면역 자극력을 활용하고 있다.
이러한 및 기타 유형(nature) 실험은 모두 조기 면역 프로그래밍에서 산전 산모 환경의 역할을 강력하게 지지하며, 알레르기 및 기타 만성 염증성 질환에 대한 경향이 전 세계적으로 증가하는 상황에서 이를 활용하여 면역 건강을 개선하는 방법에 대한 도전적인 질문을 제기한다.
다양한 균주를 검사하는 연구에 따르면 임상 효과는 균주-특이적이라는 것을 보여준다(Wickens et al., 2008). 이것은 파푸아뉴기니 원주민의 신규한 NCIMB 42835 L reuteri를 고갈된 서양 미생물군집에 보충하는 것과 같은 개입이 건강 관련 면역 반응을 가질 수 있음을 의미한다(Abrahamson et al., 2012; Van Nimwegen et al. 2011; Bisgard et al., 2011 ).
Lactobacillus reuteri DSM 20016은 락토바실러스 루테리의 기준주이고 Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475는 상업적으로 이용 가능한 균주이며 둘 다 서양 개체로부터 분리되었으며 Human II 클레이드에서 유래했다(도 1). Lactobacillus reuteri DSM 17938은 페루 인디언의 모유에서 분리된 상업적으로 이용 가능한 균주이며 이 균주는 가금류/인간 클레이드 VI에 속한다. 우리는 산업화되지 않은 생활 방식을 살고 있는 파푸아뉴기니 토착인 개체, Lactobacillus reuteri NCIMB 42835에서 신규한 균주를 분리했다. 이 연구의 목적은 시험관 내에서 건강한 지원자의 PBMC와 함께 배양할 때 이러한 균주가 다른 사이토카인 프로파일을 갖는지 결정하는 것이었다.
PBMC 분리(isolation)
3명의 건강한 기증자(30세에서 45세 사이의 남성)의 말초 정맥 전혈(whole blood)을 멸균 EDTA 튜브에 수집하고, 역전으로 몇 번 혼합하고 멸균 PBS로 1/1 희석했다. 새로운 멸균 50mL 원추형 튜브에 20mL의 피콜(Ficoll)을 각 기증자에 대해 분취(aliquote) 했다. 각 기증자에 대해 희석된 EDTA 전혈 25ml를 2단계에서 분취한 피콜 위에 적층했다. 튜브는 브레이크 오프로 4°C에서 30분 동안 800g에서 원심분리했다. 혈장 아래의 백색 버피 코트(buffy coat)(PBMC 층)를 수집하고 세포를 멸균 PBS로 2회 세척했다. PBMC를 신선한 따뜻한 RPMI 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신에 재현탁하고 자동 세포 계수기를 사용하여 계수했다. 각 기증자에 대한 세포 수는 ml당 1*106으로 조정되었고 24개의 웰 플레이트에 분취되었다.
균주 제조
냉동 및 동결건조된 L. reuteri 균주를 간단히 원심분리하고 멸균 조건에서 따뜻한 RPMI 10ml로 재현탁하여 스톡 농도(stock concetration)를 만들었다. 최고, 중간 및 낮은 농도가 제조되었다(100:1) 최고 투여량: 1ml의 스톡 농도를 4.5ml의 완전한 RPMI에 첨가했다. (50:1) 중간 투여량: 최고 투여량을 완전한 RPMI로 1:1 희석했다. (10:1) 낮은 투여량을 만들기 위해: 최고 투여량을 1:9로 희석했다.
배양 및 제어
500㎕ 중 5x105 세포의 PBMC 현탁액을 24개 웰에 분취했다. PBMC는 5% CO2(37°C, 95% 공기, 100% 습도)의 가습 인큐베이터에서, 24시간 동안 50㎕의 균주와 함께 배양되었다. 상청액을 수집하고 원심분리하여 펠릿(pellet) 세포로 만들고 깨끗한 무세포 조건 배지를 새로운 에펜도르프(Eppendorf)로 옮기고 즉시 -80℃에 보관했다. 대조군은 PBMC + 비히클(균주 동결 보호제)로 표시된다.
루미넥스(Luminex) 다중 면역 분석
샘플을 분석 직전에 분석 희석제에 1/100로 희석했다. 각 웰에 대해, 50μL의 표준 또는 희석 샘플을 웰 + 50μL에 분배했다.
측정하고자 하는 분석물질은 3가지 사이토카인 IL-10, TNF-α, IL-6)이었다. 플레이트를 제조사의 프로토콜에 따라 배양하고 Luminex MAGPIX 분석기에서 판독했다.
Lactobacillus reuteri NCIMB 42835는 다른 모든 L. reuteri보다 PBMC에서 더 많은 TNF-α, IL-10, IL-6을 유도했다(도 4, 5, 6 및 7). L. reuteri NCIMB 42835의 모든 3회 투여 후 PBMC에서 TNF-α 유도를 분석할 때, 이 사이토카인의 투여량 의존적 유도를 나타내는 독특한 프로파일을 갖는다(도 4, 5).
주성분 분석(Principle component analysis(PCA))은 데이터의 주요 구성 요소를 분석하여 서로 가장 많이 분산되고 분리된 데이터의 기본 구조를 시각화한다. L. reuteri 균주의 1회 투여량 또는 3회 투여량의 모든 사이토카인 데이터에 대한 PCA는 NCIMB 42835가 플롯의 오른쪽에서 가장 먼 점이므로 사이토카인의 가장 높은 유도를 나타내는 것으로 나타났다. 그것은 두 개의 서양 균주에서 가장 멀리 떨어져 있으며 서양 균주와 NCIMB 42835의 중간인 것처럼 보이는 다른 두 개의 비-서양 균주와도 분명히 분리된다(도 8, 9). 사이토카인 데이터는 NCIMB 42835가 인간 세포의 주요 사이토카인에 대한 균주 특이적 효과를 갖는 독특한 분리주임을 보여주는 계통발생적 데이터와 일치한다. 우리는 PNG의 기증자로부터 분리된 NCIMB 42835가 세계의 다른 지역에서 분리된 다른 L. reuteri 균주에 비해 증가된 사이토카인 수준에 의해 입증되는 바와 같이 면역 자극을 나타낸다는 것을 발견했다.
L. reuteri
NCIMB 42835에 의한 특정 탄수화물의 우선적(preferential) 사용
라피노오스와 같은 탄수화물은 서양 식단에서 매우 적은 양으로 존재하는 반면, 라피노오스(식물 기반 당(plant based sugar))가 풍부한 식물 기반 식단을 주로 소비하는 집단인 파푸아뉴기니인의 식단에는 풍부하다. 이전에 언급했듯이, L. reuteri는 고도로 적응되었으며 서양 분리주에서 중요한 성장 기질과 중요한 형질의 손실은 서양인에서 L. reuteri 개체군의 감소를 설명할 수 있다. 장내에서 L. reuteri의 성장을 지원하기 위한 라피노오스의 용도는 이전에 보고된 적이 없다. 도 10은 글루코오스에 비해 라피노오스에 대한 L. reuteri NCIMB 42835의 더 높은 성장을 보여준다.
이러한 결과는 라피노오스가 서양 균주에 비해 우수한 성장을 달성한 비-서양 L. reuteri 균주에 대한 우수한 성장 기질임을 입증한다. 비-서양 L. reuteri와 함께 라피노오스의 사용은 서양 사회의 장내 미생물군에서 이 유익한 균주의 재확립을 지원하는 데 도움을 줄 수 있다.
L. reuteri
NCIMB 42835는 인간의 내장에서
L. reuteri
DSM20016
T
(기준주)보다 더 높은 지속성을 나타내며 라피노오스가 많은 식단에서 유익하다.
L. reuteri NCIMB 42835가 인간의 내장과 풍부한 식물 기반 식단에 대한 적응을 보이는지 확인하기 위해, Walter 연구소는 인간의 내장에서 균주의 성능을 평가하는 인간 연구를 수행했다. 이 연구의 목표는 서양화되지 않은 미생물군집에서 우세한 박테리아 종이 박테리아의 성장을 촉진하도록 설계된 식단을 섭취한 캐나다인의 내장에 '재도입'될 수 있다는 가설을 테스트하는 것이다.
인간 시험. 참가자는 앨버타 대학(University of Alberta) 캠퍼스에서 모집되었으며 사전 동의를 받았다. 3부문 시험(three-arm trial) 설계에서, L. reuteri의 두 가지 균주(NCIMB 42835 및 DSM 20016T)의 효과를 위약(placebo) 그룹과 비교했다. 비-서양식 식단의 영향은 모든 연구 부문에서 교차 설계로 테스트된다. BMI가 20-29.9kg/m²이고, 최근 항생제 사용 이력이 없고(<3개월), 18-45세의 건강한 남성 및 폐경 전, 비임신 및 비수유 여성(N=30). 참가자들은 무작위로 3개 그룹 중 1개 그룹에 배정되었다. 그룹 1과 그룹 2는 Duar et al.(Duar et al., 2017). Duar et al.에 의해 기술된 바와 같이, 그룹 1과 2는 각각 직접 섭취를 위해 물에 제공된 L. reuteri 균주 중 하나를 받을 것이다(Duar et al., 2017). 두 균주 모두 약 1010개의 생존 세포의 1회 투여량으로 제공되었으며, 이는 L. reuteri가 인간이 쉽게 견딜 수 있는 투여량이다(Duar et al., 2017). 그룹 3은 미생물군집에 영향을 미치지 않는 것으로 알려진 위약(물에 희석된 말토덱스트린 2g)을 투여받을 것이다. 모든 그룹은 개입 4일째와 39일째에 프로바이오틱 또는 위약을 단일 투여량을 받았다. 참가자들은 1주일의 심사 기간(screening period) 동안 평소 식단을 유지하도록 요청받을 것이다. 1주일 후, 부문당 피험자의 절반은 '비-서양식 식단'(또는 설계된 식단)을 따르도록 할당되었고, 나머지 절반은 3주 동안 평소 식단(일반 식단)을 계속 섭취했다. 2주간의 장세척(washout) 후, 참가자들은 연구의 두 번째 3주 기간 동안 식단을 바꿨다. 참가자들은 연구 기간 동안 총 12회의 클리닉 방문에 참석했다. 기준 방문(baseline visit)은 각 식단 기간 시작 전날(0일 및 35일) 발생할 것이다; 이러한 방문 동안 인체 측정, 생체 전기 임피던스 분석(bioelectrical impedance analysis(BIA))에 의해 측정된 체성분, 혈압 측정, 혈액 및 분변 샘플을 수집하고 참가자는 인지된 스트레스 및 GI 내성에 대한 설문지를 작성했다. 연구 4일째와 39일째에 참가자들은 할당된 그룹에 따라 L. reuteri 균주 또는 위약을 받았다. 예정된 방문 외에도 참가자들은 각 식단 기간 동안 약 2일에 한 번씩 분변 샘플을 제공하도록 요청되었다.
식단(diet). 월터 연구실(Walter Lab)은 앨버타 대학의 다른 연구실과 협력하여, 농업 생활 방식을 따르는 개인과 유사한 식이 개입을 설계하면서 특히 L. reuteri에 소화되지 않는 기질을 제공하는 식료품을 선택했다. 전형적인 서양 식단은 붉은 고기와 가공육, 계란 정제된 곡물 및 설탕을 많이 섭취하는 것이 특징인 반면, 파푸아뉴기니 원주민의 식단은 식물성 식품, 섬유질 및 탄수화물이 상대적으로 높고 지방 및 동물성 공급원 단백질이 적다(Martinez et al, 2015). 특히, 라피노오스는 파푸아뉴기니인 식단에서 흔하지만 서양 식단에서는 드물며 인간의 장내에서 L. reuteri의 성장을 지원할 것으로 예상된다(우리의 예비 데이터 참조). 연구의 비-서양식(설계된) 식단 기간에 배정되는 동안 참가자들은 2000칼로리당 약 42g/d의 총 섬유질 섭취량(캐나다인의 평균 섬유질 섭취량의 두 배 이상)으로 농업 사회의 개인이 섭취하는 탄수화물 공급원(예: 참마, 고구마 및 카사바)의 양과 유형과 유사한 식료품으로 구성된 완전히 준비되고 미리 포장된 아침, 점심, 저녁 및 간식이 제공되었다. 또한, 식단은 파바빈(fava bean) 및 쪼개서 말린 완두콩(split pea)과 같은 식물성 단백질 공급원을 강조하여 제공되는 동물성 단백질의 양(1일 1회 이하의 빈도)에서 보존적(conservative)이었다.
섭취를 위한 L. reuteri 균주의 생산. L. reuteri 균주는 식품 등급 조건하에 Walter lab에서 섭취를 위해 제조되었으며, 세포 수는 수확 전에 설정되었으며 투여량은 Duar et al.(2017)에 의해 설명된 대로 ml당 약 109개 세포로 표준화되어 샘물(spring water)로 피험자에게 제공되었습니다.
분변 샘플에서
L. reuteri
세포 수의 측정.
분변 샘플은 2일마다 수집되었다(L. reuteri 또는 위약 섭취 전과 섭취 후 2주 동안 2회). LRIM 한천을 사용한 세균 배양에 의한 분변 샘플의 L. reuteri 균주의 절대 정량화. 이 한천은 인간 분변 샘플에서 L. reuteri를 정량적으로 분리하기에 충분히 선택적인 것으로 나타났다(Duar et al., 2017).
결과:
도 11에 도시된 바와 같이, 균주 NCIMB 42835는 투여 2일 후에 DSM 20016T와 비교할 때 세포 수의 10배 이상에 도달한다. 이후에는 수치가 떨어지지만 DSM20016T와 비교할 때 NCIMB 42835의 경우 더 높게 유지된다. 또한, 비-서양식 고 식물성 식단(설계된 식단)의 식단 전환은 투여 후 8일째에 더 높은 지속성을 나타내는 반면(도 11 및 12A), DSM2016T는 식물성 식단으로부터 어떠한 이점도 얻지 못한다(도 12B). 이러한 결과는 균주 NCIMB 42835가 인간 장내에서의 적합성을 증가시켰고 L. reuteri 종의 기준주(또한 인간 분리주)와 비교할 때 산업화되지 않은 농업 인간 집단의 식단을 재샘플링하는 식단의 이점을 갖는다는 것을 보여준다. NCIMB 42835는 더 높은 수준에서 설정될 뿐만 아니라 향상된 지속성을 보여준다.
현대 생활 방식이 만성 질환의 실질적인 증가와 관련되어 있다는 점을 감안할 때 생활 방식으로 인한 미생물군집 고갈을 교정하는 것은 엄청난 치료 잠재력을 가지고 있다. 파푸아뉴기니 시골에서 유래한 L. reuteri 분리주는 산업화된 사회에 살고 있는 개인의 장내에 다시 넣어지면 건강상의 이점을 발휘할 것이며 자폐증과 같은 서양의 비전염성 질병을 예방하는 데 도움이 될 수 있다. 본 발명에서 이 중요한 공생체(상호 이익을 초래하는 장기적 진화 관계를 가진 종)는 비-산업화 개인으로부터 분리되어 독특한 특성을 나타낸다. 라피노오스와 같은 기질을 병행 투여하거나 투여하지 않고 프로바이오틱으로 사용하는 것을 포함하는 산업화된 인간 또는 서양인의 식단에 도입하는 것은 이전에 제안된 적이 없다.
영유아, 어린이, 임산부 또는 산후 산모의 미생물군을 향상하는 데 특별한 이점이 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 균주는 캡슐, 마이크로캡슐, 정제, 과립, 분말, 트로치(troche), 환제, 좌약, 현탁제 및 시럽과 같은 통상적인 제조의 경구 섭취가능한 형태로 동물(인간 포함)에게 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 적합한 조성물(formulation)은 통상적인 유기 및 무기 첨가제를 사용하여 일반적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 의약 조성물 중 활성 성분의 양은 원하는 치료 효과를 발휘할 수준일 수 있다.
조성물은 또한 박테리아 성분, 약물 개체(drug entity) 또는 생물학적 화합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 균주를 포함하는 백신은 임의의 적합한 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있고 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다.
인간 면역 체계는 광범위한 인간 질병의 병인학 및 병리학에서 중요한 역할을 한다. 과다 및 과소(hyper and hypo) 면역 반응은 대부분의 질병 상태를 초래하거나 그 구성 요소이다. 사이토카인이라고 하는 생물학적 실체의 한 계열은 면역 과정의 제어에 특히 중요하다. 이러한 섬세한 사이토카인 네트워크의 섭동(perturbance)은 점점 더 많은 질병과 연관되고 있다. 이러한 질병에는 염증성 장애, 면역결핍, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 암(특히 위장 및 면역계의 질환), 설사 질환, 항생제 관련 설사, 소아 설사, 맹장염, 자가면역 질환, 알츠하이머병, 류마티스 관절염, 체강 질환, 당뇨병, 장기 이식, 세균 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 치주 질환, 비뇨 생식기 질환, 성병, HIV 감염, HIV 복제, HIV 관련 설사, 수술 관련 외상, 수술 유발 전이 질병, 패혈증, 체중 감소, 식욕 부진, 발열 조절, 악액질, 상처 치유, 궤양, 장 장벽 기능, 알레르기, 천식, 호흡기 질환, 순환기 장애, 관상 동맥 심장 질환, 빈혈, 혈액 응고 시스템 장애, 신장 질환, 중추신경계 장애, 간질환, 허혈, 영양 장애, 골다공증, 내분비 장애, 표피 장애, 심상성 건선 및 여드름이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 사이토카인 생산에 대한 효과는 조사된 프로바이오틱 균주에 대해 특이적이다. 따라서 특정 질병 유형에 대해 특정한 배타적 사이토카인 불균형을 정상화하기 위해 특정 프로바이오틱 균주가 선택될 수 있다. 질병 특이적 치료법의 맞춤화는 단일 균주 또는 돌연변이체 또는 이의 변이체 또는 이들 균주의 선택을 사용하여 달성될 수 있다.
장내 미생물군은 장 면역계의 발달과 적절한 기능에 중요하다. 장내 미생물군이 없는 경우, 무균 동물 모델에서 입증된 바와 같이, 장 면역계가 저개발되고 대식세포 식세포 능력 및 면역글로불린 생산과 같은 특정 기능적 파라미터(parameter)가 감소한다. 손상되지 않는 면역 반응을 자극하는 장내 미생물군의 중요성이 점점 더 분명해지고 있다. 서양 세계에서 알레르기 발병률 및 중증도의 증가는 보건 및 위생의 증가와 관련되어 있으며, 동시에 숙주가 직면하는 감염 문제의 수 및 범위의 감소와 관련이 있다. 이러한 면역 자극의 결여는 숙주가 비병원성이지만 항원성 물질에 반응하도록 하여 알레르기 또는 자가면역을 야기할 수 있다. 일련의 비병원성 면역조절 박테리아의 고의적인 섭취는 면역 기능의 적절한 발달과 제어를 위해 필요하고 적절한 교육적 자극을 숙주에게 제공할 것이다.
프리바이오틱스
프로바이오틱 유기체의 도입은 적절한 담체에서 미생물의 섭취에 의해 달성된다. 대장에서 이러한 프로바이오틱 균주의 성장을 촉진할 배지를 제공하는 것이 유리할 것이다. 하나 이상의 올리고당, 다당류 또는 기타 프리바이오틱스를 추가하면 위장관에서 유산균의 성장이 향상된다. 프리바이오틱스는 긍정적인 가치가 있는 것으로 생각되는 토착 박테리아, 예를 들어 비피더스균(bifidobacteria), 유산균(lactobacilli)에 의해 결장에서 구체적으로 발효되는 생존할 수 없는 모든 식품 성분을 의미한다. L. reuteri의 경우, 조합에 사용될 수 있는 가장 유망한 프리바이오틱은 라피노오스와 AlphaGOS와 같은 라피노오스 관련 기질이다. 하나 이상의 프리바이오틱 화합물과 프로바이오틱 균주의 조합 투여는 생체내(in vivo) 투여된 프로바이오틱의 성장을 향상시켜 보다 확연한 건강상의 이점을 가져올 수 있으며, 이를 신바이오틱(synbiotic)이라고 한다.
기타 활성 성분
프로바이오틱 균주는 그 자체로 또는 상기 기재된 바와 같은 다른 프로바이오틱 및/또는 프리바이오틱 물질과 함께 예방적으로 또는 치료 방법으로서 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 박테리아는 염증 또는 기타 장애, 특히 면역학적 관련 질환을 치료하는 데 사용되는 것과 같은 다른 활성 물질을 사용하는 예방 또는 치료 요법의 일부로 사용될 수 있다. 이러한 조합은 단일 조성물로 또는 동일하거나 상이한 시간에 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 투여되는 별도의 조성물로 투여될 수 있다.
약학적 조성물
약학적 조성물은 치료학적 유효량의 약학적 활성제를 포함하거나 이로 구성된 조성물이다. 이는 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제(이들의 조합 포함)를 포함한다. 치료용으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 제약 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약학적 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이에 추가하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들), 추진제(들)를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 예는, 예를 들어 물, 염 용액, 알코올, 실리콘, 왁스, 바셀린, 식물성 기름, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포솜, 당, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 페트로에트랄(petroethral) 지방산 에스테르, 히드록시메틸-셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
적절한 경우, 약학적 조성물은 흡입, 좌약 또는 페서리(pessary) 형태로, 국소적으로 로션, 용액, 크림, 연고 또는 더스팅(dusting) 분말 형태로, 피부 패치의 사용으로, 전분 또는 유당과 같은 부형제를 함유하는 정제 형태로, 단독으로 또는 부형제와 혼합하여 캡슐 또는 질좌제(ovule) 형태로, 또는 향미제 또는 착색제를 함유하는 엘릭시르(elixir), 용액 또는 현탁액 형태로 경구로 중 어느 하나 이상으로 투여될 수 있거나. 비경구적으로, 예를 들어 해면체내, 정맥내, 근육내 또는 피하로 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 조성물은 다른 물질, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성으로 만들기에 충분한 염 또는 단당류를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용될 수 있다. 부칼(buccal) 또는 설하 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태로 투여될 수 있다.
비강내 투여는 비강 스프레이, 비강 세척액 또는 코 내 직접 도포를 사용하여 달성될 수 있다.
폐에 대한 투여는 건조 분말 형태일 수 있으며, 흡입 장치를 사용하여 흡입할 수 있다. 어떤 경우에는 제형이 에어로졸 형태이다. 에어로졸은 용액, 현탁액, 스프레이, 미스트, 증기, 액적, 입자 또는 건조 분말일 수 있으며, 예를 들어 HFA 추진제를 갖는 방법 투여 흡입기(method dose inhaler), 비-HFA 추진제를 갖는 계량 투여 흡입기(metered dose inhaler), 분무기, 가압 캔, 연속 스프레이를 사용할 수 있다.
다른 전달 시스템에 따라 다른 구성/조성물 요구 사항이 있을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 미니 펌프를 사용하여, 또는 점막 경로에 의해, 예를 들어 흡입 또는 섭취 가능한 용액을 위한 비강 스프레이 또는 에어로졸로서 전달되도록 제조될 수 있으며, 또는 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 경로에 의한 전달을 위한 주사 가능한 형태로 제조되어, 비경구적으로 전달되도록 제조될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 두 경로 모두에 의해 전달되도록 설계될 수 있다.
본 발명은 전술한 실시예로 제한되지 않고, 상세하게 변경될 수 있다.
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tacatgcaag tcgtacgcac tggcccaact gattgatggt gcttgcacct gattgacgat 180
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ttgttggaga agaacgtgcg tgagagtaac tgttcacgca gtgacggtat ccaaccagaa 600
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ctggtctgca actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct 900
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cgttttattc cttagaaagg aggtgatcca gccgcaggtt ctcctacggc taccttgtta 360
cgacttcacc ccagtcatct gtcccgcctt aggcggctcc ctccataaag gttaggccac 420
cgactttggg cgttacaaac tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac 480
gtattcaccg cggcatgctg atccgcg 507
Claims (16)
- NCIMB 기탁번호 42835를 갖는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 생물학적으로 순수 배양(pure culture), 박테리아 브로스(bacterial broth) 또는 동결 건조된 분말의 형태인, 균주. - NCIMB 기탁번호 42835를 갖는 분리된 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
생존 및/또는 비-생존 세포의 형태인, 균주. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 청구된 균주를 포함하는, 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 균주를 위한 기질(substrate)을 추가로 포함하는, 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 기질이 탄수화물인, 제제. - 제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 기질이 비-소화성(non-digestible)인 올리고당인, 조성물. - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기질이 식물 공급원으로부터 유래되는, 조성물. - 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기질이 라피노오스(raffinose)를 포함하는, 조성물. - 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
프리바이오틱(prebiotic) 물질 및/또는 다른 프로바이오틱(probiotic) 물질을 추가로 포함하는, 조성물. - 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
섭취 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물. - 제12항에 있어서,
상기 섭취 가능한 담체가 캡슐, 정제 또는 분말과 같은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물. - 제12항에 있어서,
섭취 가능한 담체가 산성화된 우유, 요구르트, 냉동 요구르트, 우유 분말, 우유 농축액, 아이스크림, 치즈 스프레드, 드레싱 또는 음료와 같은 식료품인, 조성물. - 향상된 미생물군(microbiota)을 필요로 하는 개체의 미생물군을 향상시키는데 사용하기 위한 NCIMB 기탁번호 42835를 갖는 락토바실러스 루테리(lactobacillus reuteri) 균주.
- 제 15 항에 있어서,
상기 개체는 유아, 소아, 임산부 또는 산후 산모인, NCIMB 기탁번호 42835 를 갖는 락토바실러스 루테리 균주.
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