CN114269897A - 罗伊乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
具有NCIMB保藏编号42835的罗伊乳杆菌菌株(Lactobacillus reuteri)来自一种新型的系统发生进化枝，具有独特的免疫刺激特性和增强的人肠道生态性能。用于所述菌株的底物诸如棉子糖可以与所述菌株同时或分开施用。
Description
发明领域
本发明涉及来自一种新型系统发生进化枝的罗伊乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，其具有独特的免疫刺激特性和增强的人肠道生态性能。
发明背景
肠道微生物群是人类健康的一个关键决定因素，其直接促成病理，影响宿主对疾病的易感性。现在有大量证据表明，现代生活方式和工业化导致肠道微生物群的细菌多样性减少，这可能是由于抗生素的使用、现代临床实践、公共卫生和饮食习惯的改变等因素的综合作用(Blaser&Falkow 2009；Segata,2015)。世界各地NCD(非传染性疾病)发病率的增加与富裕的生活方式有关，并且被认为至少部分是由于微生物多样性的丧失所致(Haahtela等,2015；Hanski等,2012；Rook,2013)。这些关联的机制尚不清楚，大多数关注点都集中在如“卫生学假说”等概念中的病原微生物(Jarchum等,2011)。有人提出了另一种可能更合理的假设，即在人类进化过程中，微生物已经进化成为调节我们免疫系统的重要角色。所涉及的微生物不是感染性的，而是构成我们人类微生物组的友好共生的微生物。这些微生物是通过暴露于我们自然环境中的其他人或动物和微生物群而获得的。研究人员现在同意，一系列生活方式的改变，包括剖腹产(C-section)的增加、母乳喂养的减少、家庭人数的减少以及户外时间的减少，是减少暴露于友好微生物的根本原因，同时改变的饮食和抗生素对微生物组的组成产生不利影响。
因此，需要改善肠道微生物群的细菌多样性。
罗伊乳杆菌(L.reuteri)已被证明是人类胃肠道真正的固有细菌之一(Sinkiewicz,2010)。其自然地寄居于广泛的脊椎动物，包括人、猪、仓鼠、小鼠、大鼠、狗、羊、牛和不同种类的鸟类(包括鸡)，并且发现在人泌尿生殖道和母乳中也有存在(Mitsuoka,1992)。
目前罗伊乳杆菌在西方人群中的发生率非常低，该物种只是偶尔被发现(WalterJ,2008)。有一些证据表明，在上一世纪中叶，罗伊乳杆菌在人粪便样本中的发生率较高。Gerhard Reuter和Tomonari Mitsuoka在1960年代和1970年代深入研究了人消化道的乳杆菌属(Lactobacillus)生物群，他们报告罗伊乳杆菌是当时主要的乳杆菌之一，并且经常被检测到(Mitsuoka T.,1992；Reuter G.,2001)。在较新的研究中，在人体中的低发生率表明在过去50年中，罗伊乳杆菌种群规模有所降低。
术语“进化枝”(来自古希腊语
klados，“分支(branch)”)，也称作单系群，被定义为由一个共同祖先及其所有直系后代组成的一组生物，代表在“生命树”上的一个“分支”。
共同的祖先可能是一个个体、一个种群、一个物种(已灭绝或现存)等等，直到一个界，甚至更远。进化枝是嵌套的，一个接一个，每个分支依次分成更小的分支。这些分叉反映了种群分化和独立进化的进化历史。
罗伊乳杆菌物种代表乳杆菌(lactobacilli)异型发酵进化枝中的罗伊乳杆菌类群(Duar等2017b)。罗伊乳杆菌被认为在遗传和生理学已经充分表征，并且已经充分了解有助于其在谷类和肠道生态系统中的生态适应性的代谢特性(Zhao和Ganzle,2018)。
人源的罗伊乳杆菌菌株属于两个不同的MLSA进化枝，称为进化枝II和VI。进化枝II含有大多数人肠道分离株和簇以及来自反刍动物的分离株，而进化枝VI中的人菌株与来自鸡的分离株密切相关(Oh,等2010)。
发明概述
本发明提供了一种罗伊乳杆菌菌株，其具有NCIMB保藏编号42835。
使用所述物种的639个多联核心基因对NCIMB 42835与其他罗伊乳杆菌的基因组使用BALST算法进行分析，获得平均核苷酸相同性测量(ANI)，结果表明NCIMB 42835与最接近的已知罗伊乳杆菌菌株的相似性小于97.5％。因此，所述菌株与目前已知的罗伊乳杆菌物种的菌株显著不同。
菌株42835是一种来自新型系统发生进化枝的罗伊乳杆菌，其具有独特的免疫刺激特性和增强的人肠道生态性能。
本领域技术人员将理解菌株可以通过用菌株NCIMB 42835进行DNA序列同源性分析来鉴定。与菌株NCIMB 42835具有密切序列相同性而没有可证明的表型或可测量的功能差异的菌株在本发明的范围内。与NCIMB 42835的DNA序列具有97％或更多、97.5％或更多、97.75％或更多、98％或更多、98.25％或更多、98.5％或更多、98.75％或更多、99％或更多、99.25％或更多、99.5％或更多、99.75％或更多的序列相同性(同源性)的菌株在本发明的范围内。序列同源性可以使用在线同源性算法“BLAST”程序确定，该程序可在http://www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/公开获得。
在一个实施方案中，所述菌株是人共生生物(symbiont)。
本发明提供了具有NCIMB保藏编号42835的罗伊乳杆菌菌株或其突变体或变体。
所述突变体可以是野生型NCIMB 42835的经遗传修饰的菌株。
所述变体可以是天然存在的变体。
所述菌株可以是生物学纯培养物的形式。
还提供了罗伊乳杆菌(NCIMB 42835)的分离的菌株。
所述菌株可以是益生菌。
在一种情况下，所述菌株是活细胞的形式。
在另一种情况下，所述菌株是非活细胞的形式。
罗伊乳杆菌NCIMB 42835菌株存在于制剂中的量可以超过每剂106cfu，通常为每剂107至1010，通常为108至109cfu。在一种情况下，罗伊乳杆菌菌株NCIMB 42835以每剂约1×109cfu的量存在于制剂中。
细菌生存力反映了样品内可培养细菌的数目，即当在最佳条件生长时保持繁殖能力的细菌(活细胞)的数目。换句话说，生存力反映了保留复制成更大细菌菌落能力的单个细菌细胞(菌落形成单位(CFU))的数目。
生存力通常使用平板计数方法确定，即稀释细菌样品，然后在含有生长所需营养物质的琼脂板上温育。然后根据平板上鉴定的细菌菌落数目计算生存力。这种方法总结在Modern Food Biology 2005 7th edition,James Monroe Jay,Martin J.Loessner,DavidA.Golden,Springer Science,New York中。
虽然平板计数可以很好地指示生存力，但其并不包括样品中的所有活的细菌细胞(Kell,Douglas B.,等"Viability and activity in readily culturable bacteria:areview and discussion of the practical issues."Antonie van Leeuwenhoek73.2(1998):169-187)。
样品还将含有“有活力但不可培养的”(VBNC)细胞，这些细胞保持代谢活性，但在通过平板计数分析时失去了复制能力，因此尽管还活着，但不会形成CFU。最后，样本也将包含死细胞。这两组细胞可以归为“非活细胞”。因此，非活细胞与活细胞相反，即在测试时所有那些已经失去复制能力的细胞。
所有含有活细胞的样本也将含有非活细胞，因此活细胞培养物的定义通过CFU测量得以阐明。
所有非活样本将至少含有VNBC和可能少量的活细胞。103CFU/g活细胞的行业标准较低水平检测限允许由于非活样品中存在一定数量的VBNC/活细胞而导致的固有方法可变性。
在一些实施方案中，例如但不限于特殊无菌食品或药物，可以优选益生菌菌株的非复制形式。例如，至少95％、优选至少97％、更优选至少99％的罗伊乳杆菌菌株在组合物中可以是非复制的。
在一种情况下，所述菌株在人口服后具有显著的免疫调节作用。
在一个实施方案中，所述菌株是细菌肉汤的形式。
在另一个实施方案中，所述菌株是冻干粉的形式。
本发明提供了包含本发明菌株的制剂。
所述制剂可进一步包含另一种益生菌材料。
所述制剂可进一步包含益生元材料。
所述制剂可进一步包含可摄入的载体。
在一种情况下，所述可摄入的载体是药学上可接受的载体诸如胶囊、片剂或粉剂。
在另一种情况下，所述可摄入的载体是食品，例如酸化牛奶、酸奶、冷冻酸奶、奶粉、奶浓缩物、冰淇淋、软干酪、沙拉酱(dressing)或饮料。
在一些实施方案中，所述制剂进一步包含蛋白质和/或肽，特别是富含谷氨酰胺/谷氨酸、脂质、碳水化合物、维生素、矿物质和/或微量元素的蛋白质和/或肽。
在一种情况下，所述菌株以每克制剂超过106cfu的量存在。
所述制剂可进一步包含佐剂。
所述制剂可进一步包含细菌组分。
所述制剂可进一步包含药物实体。
所述制剂可进一步包含生物学化合物。
本发明还提供了包含本发明的菌株或制剂的食物。
还提供了包含本发明的菌株或制剂的药物。
在一个实施方案中，所述制剂进一步包含碳水化合物。
所述制剂可以包含寡糖，所述寡糖可以是不可消化的。
在一种情况下，所述寡糖包含棉子糖。
本发明还提供一种用于增强作为工业化人类社会成员的个体的微生物群的方法，包含施用从非工业化人类社会成员的个体分离的罗伊乳杆菌菌株的步骤。
所述微生物群可以是肠道微生物群。
所述菌株可以是如本文定义的菌株。
所述菌株可以是本文定义的制剂的组分。
在一个实施方案中，所述方法包含施用用于所述菌株的碳水化合物底物(substrate)。所述底物可以包含寡糖，所述寡糖可以是不可消化的。在一种情况下，所述寡糖包含棉子糖。
所述底物可以与所述菌株同时或分开施用。
应当理解，本发明的菌株可以以常规剂型诸如胶囊、微胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、锭剂、丸剂、栓剂、混悬剂和糖浆剂的口服吸收形式施用于动物(包括人)。合适的制剂可以通过常用的方法使用常规的有机和无机添加剂来制备。药物组合物中活性成分的量可以处于将发挥所需治疗效果的水平。
所述制剂还可以包括细菌组分、药物实体或生物学化合物。
此外，可以使用任何合适的已知方法制备包含本发明所述菌株的疫苗，并且可以包括药学上可接受的载体或佐剂。
本发明还包括所述保藏菌株的突变体和变体。在整个说明书中，术语突变体、变体和遗传修饰的突变体包括其遗传和/或表型特性与亲本菌株相比发生改变的菌株。天然发生的变体包括选择性分离的目标特性的自发改变。有意改变亲本菌株特性是通过常规(体外)遗传操作技术完成的，例如基因破坏、接合转移等。遗传修饰包括将外源和/或内源DNA序列引入菌株的基因组中，例如通过载体、包括质粒DNA或噬菌体插入到细菌菌株的基因组中。
天然或诱导的突变包括至少单个碱基改变，例如缺失、插入、颠换或其他可能导致由所述DNA序列编码的氨基酸序列的改变的DNA修饰。
术语突变体、变体和遗传修饰的突变体还包括已经历遗传改变的菌株，所述遗传改变在基因组中积累的速度对于所有微-生物在本质上是一致，和/或所述遗传改变是通过基因的自发突变和/或获得发生的，和/或基因的丢失不是通过有意(在体外)操纵基因组实现的，而是通过自然选择变体和/或突变体来实现的，其提供了当暴露于环境压力例如抗生素时支持细菌存活的选择优势。突变体可以通过有意(在体外)将特定基因插入到基因组而产生，这些基因不会从根本上改变生物的生物化学功能，但其产物可用于细菌的鉴定或选择，例如抗生素抗性。
附图简述
本发明将从以下仅参考附图以示例方式给出的描述中得到更清楚的理解，其中：
图1示例了来源于多个宿主的新的和公布的罗伊乳杆菌基因组(n＝54)的系统发生树。基于所有核心基因的比对构建系统发生树(n＝639)。通过ClonalFrame从MLSA数据中推断谱系(Bayesian方法，不包括重组区域)；
图2示例了居住在巴布亚新几内亚农村的个体和居住在美国的个体粪便微生物群的差异。A)粪便样本中总体细菌种群的差异(Bray-Curtis差异)，B)细菌种群的Shannon多样性(Martinez等2015)；
图3示例了巴布亚新几内亚农村个体肠道中存在47个物种级操作分类单元(OTU)，这些在北美个体的肠道微生物群中不存在，罗伊乳杆菌就是其中之一。该图突出显示了巴布亚新几内亚农村个体的肠道微生物群中存在高水平的罗伊乳杆菌，而居住在美国的个体的肠道微生物群中没有罗伊乳杆菌；
图4示例了用一种浓度的罗伊乳杆菌DSM 20016、罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌DSM 17938、罗伊乳杆菌菌株2和罗伊乳杆菌NCIMB 42835进行体外刺激后PBMC中TNF-α的诱导曲线；
图5示例了用增加浓度的罗伊乳杆菌DSM 20016、罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌DSM 17938、罗伊乳杆菌菌株2和罗伊乳杆菌NCIMB 42835在体外进行刺激后，PBMC中TNF-α的诱导曲线；
图6示例了用一种浓度的罗伊乳杆菌DSM 20016、罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌DSM 17938、罗伊乳杆菌菌株2和罗伊乳杆菌NCIMB 42835在体外进行刺激后，PBMC中IL-10的诱导曲线；
图7示例了用一种浓度的罗伊乳杆菌DSM 20016、罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475、罗伊乳杆菌DSM 17938、罗伊乳杆菌菌株2和罗伊乳杆菌NCIMB 42835在体外进行刺激后，PBMC中IL-6的诱导曲线；
图8是PBMC测定中一剂罗伊乳杆菌菌株的细胞因子反应的主组分分析(PCA)图；
图9是PBMC测定中三剂的罗伊乳杆菌菌株的细胞因子反应的主组分分析(PCA)图；
图10示例了罗伊乳杆菌NCIMB 42835的生长曲线，使用棉子糖或葡萄糖作为基础MRS生长培养基(3％(m/v))中的唯一碳水化合物，并证明了相比于葡萄糖，棉子糖对于罗伊乳杆菌NCIMB 42835更优选作为B-MRS中的生长底物。通过GraphPad Prism 5.0进行ANOVA对OD600值进行统计分析，P<0.05被认为是显著的。***：P<0.001；**：P<0.01；*：P<0.05；
图11示例了在第4天一次性施用约1010个罗伊乳杆菌细胞后，通过定量平板测定的粪便样品中罗伊乳杆菌的细胞数目(对于PB-W1，n＝8；对于DSM 20016，n＝10)。天数是指在这个治疗阶段在饮食转换为非西方(设计的)后的时间。数据以CFU的log10的平均值±SE表示。在同一天内，基于重复测量的双向ANOVA及p<0.05，用不同字母标记的每个处理的细胞数目是显著不同的。N.S.，无意义；及
图12示例了通过菌株间隔的定量平板测定的粪便样品中罗伊乳杆菌的相同细胞数目，比较了非西方(设计的)饮食与普通饮食期间的细胞数目。图中示出了罗伊乳杆菌NCIMB 42835(n＝8)(A)和罗伊乳杆菌DSM 20016(n＝10)(B)的细胞数目。数据以CFU的log10的平均值±SE表示。在同一天，基于成对的t检验及p<0.05，设计的非西方饮食和标有*的常规饮食之间的细胞数目显著不同。
发明详述
罗伊乳杆菌菌株1菌株于2017年9月29日保藏在英国工业食品海洋菌种保藏中心(National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB))Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA,苏格兰,英国,并获得保藏编号NCIMB 42835。
实施例
以下实施例进一步描述和证实了本发明范围内的实施方案。给出的实施例仅用于示例说明本发明而不应解释为对本发明的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行多种变化。
新型系统发生进化枝
在约1960年代进行的研究中，经常在人类中检测到罗伊乳杆菌，但在当代人类中却很少发现，这表明最近西方人的罗伊乳杆菌种群数量有所下降(Walter等,2011)。罗伊乳杆菌是一种真正的脊椎动物共生生物，其与各自的宿主物种进化出了高水平的特异性，表明在进化时期保持着紧密的关系(Oh等,2010；Frese等,2011；Duar等,2017；Frese等,2013)。重要的是，罗伊乳杆菌对宿主免疫功能和发育发挥了巨大的益处，正如许多高影响力出版物所证明的那样(Zelante等2013；Buffington等2016；Lamas等2016；He等2017)。然而，在国际数据库中可用的西方罗伊乳杆菌菌株基因组不到20个。大多数人类分离株聚集在一个系统发生谱系(谱系II)中(Oh等,2010)。这个谱系的种群结构的特征在于多样性水平非常低，与其他物种相比，在可用的基因组上示出<50的单核苷酸多态性(SNP)(图1)。总体而言，这些发现表明最近西方人中罗伊乳杆菌种群的降低以及遗传或种群的瓶颈。
图2示例了巴布亚新几内亚农村个体的肠道微生物群。现在有大量证据表明，现代生活方式和工业化导致肠道微生物群的细菌多样性大幅下降，这可能是由于抗生素使用、现代临床实践、卫生和饮食习惯改变等因素的综合作用(Blaser&Falkow 2009；Segata,2015)。图2a示出巴布亚新几内亚人和北美人的肠道微生物群存在显著差异。图2b示出来自巴布亚新几内亚农村的个体粪便微生物群的更高多样性。图3示例了47个物种样OTU在北美个体的肠道微生物群中完全无法检测到。这项工作证实了西方社会“微生物组耗竭”的总体前提。有趣的是，通过16S rRNA测序在每个巴布亚新几内亚个体中均可检测到但在单个美国对照个体中未检测到的物种是罗伊乳杆菌(图3)。如自闭症和IBD等西方非传染性疾病在巴布亚新几内亚几乎不存在(尽管由于更加城市化的生活方式的传播，这些疾病最近已经出现)。我们研究了从巴布亚新几内亚农村人粪便样本中获得的罗伊乳杆菌分离株，并确定了一种新的罗伊乳杆菌菌株，该菌株与从西方人分离的罗伊乳杆菌菌株显著不同。巴布亚新几内亚部落居民的罗伊乳杆菌菌株以前从未被分离或鉴定过。
为了获得全长的16S rRNA基因序列，使用BLAST将每个菌株的组装(assembly)均与DSM 20016T的16S rRNA基因序列进行比对，并进一步手动组装这些比对的序列片段。使用BLAST计算16S rRNA基因之间的相似性值。这个分析的结果表明，PB-W1与罗伊乳杆菌的其他菌株(其包括该物种的模式菌株)具有>99.5％的序列相同性，最终证明所述菌株是罗伊乳杆菌。
对分离自巴布亚新几内亚农村的罗伊乳杆菌菌株与来自西方人的罗伊乳杆菌菌株的进一步的基因组分析和比较，表明基于平均核苷酸相同性(ANI)，罗伊乳杆菌NCIMB42835的基因组序列与任何已知的人罗伊乳杆菌的基因组序列差异>2.5％(表1)。特别地，罗伊乳杆菌NCIMB 42835不属于罗伊乳杆菌系统发生树中任何已建立的系统发生联系(图1)。因此，罗伊乳杆菌NCIMB 42835代表了一个新鉴定的进化枝。
相比之下，同样从巴布亚新几内亚农村分离的罗伊乳杆菌菌株2属于进化枝VI。
表1
基于新的和已公布的罗伊乳杆菌基因组的注释装配，Roary pipeline用于鉴定核心基因(n＝54)。使用BLAST算法基于JSpeciesWS(http://jspecies.ribohost.com/ jspeciesws/#analyse/)中的这些多联核心基因计算5个不同菌株的平均核苷酸序列相同性(ANI)值。
结果概述
在物种水平的总体16S的99.5％相似性表明PB-W1可以被分配为罗伊乳杆菌种。当将NCIMB 42835与已知菌株相比时，ANI结果显示出明显菌株水平变化(全基因组核心基因的平均差异>2.5％)。这种差异证实罗伊乳杆菌NCIMB 42835不属于罗伊乳杆菌系统发生树内任何已建立的系统发生联系，因此罗伊乳杆菌NCIMB 42835代表一个新鉴定的进化枝。
进一步的基因组分析
NCIMB 42835的16s、ITS和IGS区域是从NCIMB 42835的全基因组中分离出来的。从全基因组中提取的所有区域都将该菌株鉴定是罗伊乳杆菌种的成员。
16s rRNA鉴定
NCIMB 42835的16s rRNA鉴定使用计算机执行方法进行。NCIMB 42835的基因组是使用Illumina测序平台https://www.illumina.com/science/technology/next- generation-sequencing/seque ncing-technology.html以及Nanopore technologyhttps://nanoporetech.com/获得，产生基因组的22倍覆盖范围。挖掘NCIMB 42835菌株以发现通用16s rRNA引物组CO1 5’AGTTTGATCCTGGCTCAG 3’(SEQ ID No:1)和CO2 5’TACCTTGTTACGACT 3’(SEQ ID No:2)的存在。Artemis是一种基因组可视化工具，如Carver等人所述，用于促进16s rRNA区域的鉴别。两种引物均在NCIMB 42835的基因组中鉴别。然后针对NCBI核苷酸数据库搜索序列数据，以通过核苷酸同源性确定菌株物种的相同性。对DNA序列进行NCBI标准核苷酸-核苷酸同源性BLAST搜索引擎https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi搜索。与16s rRNA基因的最接近匹配鉴定所述菌株是罗伊乳杆菌种的成员。
表2：罗伊乳杆菌NCIMB 42835的16s rRNA序列(SEQ ID No:3)
TTATATATTTTATATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAACTCGCGAGAGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCTTTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGGGACAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAAACCTGCGGCTGGATC
内转录间隔区(ITS)分析：
挖掘NCIMB 42835菌株以发现乳酸杆菌通用ITS引物Probio-lac_Uni 5’CGTAACAAGGTAGCCGTAGG 3’(SEQ ID No:4)和Probio-lac_Rev 5’GTYVCGTCCTTCWTCGSC 3’(SEQ ID No:5)的存在，所述引物得自Milani等人于2018年进行的一项研究。使用Carver等人描述的基因组可视化工具Artemis以促进识别ITS引物组。这两种引物均在NCIMB 42835的基因组中鉴定。
然后针对NCBI核苷酸数据库搜索序列数据，以通过核苷酸同源性确定所述菌株物种的相同性。对DNA序列进行NCBI标准核苷酸-核苷酸同源性BLAST搜索引擎搜索。与获得的ITS序列数据的最接近匹配确定所述菌株是罗伊乳杆菌种的成员。
表3：罗伊乳杆菌NCIMB 42835的ITS序列(SEQ ID No:6)
TAGTACCAAGGCATTCACCATGCGCCCTTCATAACTTAACCTAAACAATCAAAGATTGTCTGATTAATTGAGTTAGCGATTATAATTCGTTAATTAAAACTCAAATAACGCGGTGTTCTCGGTTTATTGTTTTGTTAATAAAGAAATTAGATAGTATTTAGTTTTCAAAGTACAAGCTCTGAGGGTAAACCCCTCAAAACTAAACAAAGTTTCTTTGATGTGTAGGTTCCGTTTTATTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGGTTCTCC
基因间间隔区(IGS)
挖掘NCIMB 42835菌株以发现乳酸杆菌IGS引物组的存在。使用与16S和23S基因的保守区域退火的引物鉴定16S-23S基因间间隔区分离物；所述引物为16-1A 5’-GAATCGCTAGTAATCG-3’(SEQ ID No:7)和23-1B 5’-GGGTTCCCCCATTCGGA-3’(SEQ ID No:8)。所述引物组得自Tannock等人在1999年进行的一项研究。使用Carver等人描述的基因组可视化工具Artemis以促进IGS引物组的识别。两种引物均在NCIMB 42835的基因组中鉴定。
然后针对NCBI核苷酸数据库搜索获得的序列数据，以通过核苷酸同源性确定菌株物种的相同性。对DNA序列经NCBI标准核苷酸-核苷酸同源性BLAST搜索引擎搜索。与获得的IGS序列数据的最接近匹配确定了所述菌株是罗伊乳杆菌属的成员。
表4：罗伊乳杆菌NCIMB 42835的IGS序列(SEQ ID No:9)
AATCTCCGGATCAAAGCGTACTTACCGCTCCCCGAAGCATATCGGTGTTAGTCCCGTCCTTCATCGGCTCCTAGTACCAAGGCATTCACCATGCGCCCTTCATAACTTAACCTAAACAATCAAAGATTGTCTGATTAATTGAGTTAGCGATTATAATTCGTTAATTAAAACTCAAATAACGCGGTGTTCTCGGTTTATTGTTTTGTTAATAAAGAAATTAGATAGTATTTAGTTTTCAAAGTACAAGCTCTGAGGGTAAACCCCTCAAAACTAAACAAAGTTTCTTTGATGTGTAGGTTCCGTTTTATTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGGTTCTCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATCTGTCCCGCCTTAGGCGGCTCCCTCCATAAAGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCG
NCIMB 42835在人免疫细胞中诱导不同的细胞因子反应
我们用关于罗伊乳杆菌菌株对人免疫细胞(PBMC)产生细胞因子的影响的功能数据补充了这些基因组比较。分析表明，来自相同系统发生谱系的菌株表现出相似的反应，表明罗伊乳杆菌菌株的进化历史会影响其与宿主的相互作用，这与之前的研究结果一致(Spinler等,2014)。研究结果进一步证实NCIMB 42835与来自人源的益生菌罗伊乳杆菌其他两个亚群的菌株之间的明显差异。
对在微生物负荷非常高的发展中国家地区如巴布亚新几内亚(PNG)出的新生儿的研究表明，与诸如澳大利亚等高度发达地区的新生儿相比，新生儿免疫功能存在巨大差异(Lisciandro等,2012a；2012b)。在妊娠结束时，与澳大利亚新生儿相比，来自PNG新生儿的抗原呈递细胞(APC)已经显示出更高的激活标志物(HLA-DR和CD86)的基线表达和抑制(免疫球蛋白样转录物3和4)。PNG环境中微生物负荷的免疫刺激性质可能是APC上激活标志物基线水平增加的一个可能原因。然而，与澳大利亚新生儿相比，在激活时，来自PNG脐带血的APC相对静止，具有降低的激活和抗原加工，并引起减弱的T细胞反应。尽管这些背景之间存在许多环境差异，但微生物负荷是最引人注目的之一，而且PNG新生儿的耐受性更强的反应可以防止在生命早期产生有害的炎症反应。在这方面，重要的是要强调罗伊乳杆菌菌株在啮齿动物研究中已被证明具有免疫调节作用并诱导调节性T细胞(Liu等,2013；2017)。通过从PNG的供体中分离微生物，我们正在利用这些菌株的免疫刺激能力，其可以抑制婴儿在生命早期受到的进一步刺激，从而产生致免疫耐受状态。
这些和其他自然实验均强力支持产前母体环境在早期免疫程序设计中的作用，并提出了一个具有挑战性的问题，即在全球过敏和其他慢性炎症性疾病倾向增加的情况，如何利用它来改善免疫健康。
检验不同菌株的研究表明，临床效果是菌株特异性的(Wickens等,2008)。这意味着诸如将来自巴布亚新几内亚当地人的新NCIMB 42835罗伊乳杆菌补充到耗竭的西方人微生物组等干预措施可具有与健康相关的免疫反应(Abrahamson等,2012；Van Nimwegen等2011；Bisgard等,2011)。
罗伊乳杆菌DSM 20016是罗伊乳杆菌的模式菌株，且罗伊乳杆菌ATCC PTA 6475是可商购的菌株，且两者均分离自西方受试者，并且来自人类II进化枝(图1)。罗伊乳杆菌DSM17938是可商购的分离自秘鲁印第安人的母乳，这个菌株属于家禽/人类进化枝VI。我们从以非工业化生活方式生活的巴布亚新几内亚当地受试者中分离出一种新菌株，即罗伊乳杆菌NCIMB 42835。这项研究的目的是确定这些菌株与来自健康志愿者的PBMC在体外一起温育时是否具有不同的细胞因子谱。
PBMC分离
将来自3名健康供体(30至45岁男性)的外周静脉全血收集在无菌EDTA管中，通过倒置混合几次并用无菌PBS稀释1/1。将在新的50mL无菌锥形管中的20mL Ficoll等分以供每个供体使用。对于每个供体，将25ml稀释的EDTA全血铺层在步骤2中等分的Ficoll顶部。将试管在4℃以800g离心30分钟，松开制动。收集血浆下方的白色棕黄层(PBMC层)并用无菌PBS洗涤细胞两次。将PBMC重新悬浮在新鲜的温热RPMI 10％FBS+1％青霉素/链霉素中，并使用自动细胞计数器进行计数。将每个供体的细胞数目调整为1*106个/ml，并分装在24孔板中。
菌株制备
将冷冻和冻干的罗伊乳杆菌菌株短暂离心，并在无菌条件用10ml温热的RPMI重新悬浮以使原液浓缩。制备高浓度、中浓度和低浓度，(100:1)高剂量：将1ml原液浓度加入4.5ml完全RPMI中。(50:1)中等剂量：将高剂量用完全RPMI以1:1稀释。为了制备(10:1)低剂量：将高剂量以1:9稀释。
温育和对照
将500μl中5×105个细胞的PBMC悬浮液等分到24个孔中。将PBMC在5％的CO2(37℃，95％空气，100％湿度)的加湿温育仪中与50μl菌株一起温育24小时。收集上清液并离心以沉淀细胞，将干净的无细胞条件培养基移入新的Eppendorf中并立即储存在-80℃。
对照组表示为：PBMC+运载体(菌株冷冻保护剂)。
Luminex多重免疫测定
在即将测定前将样品在测定稀释液中稀释1/100。对于每个孔，将50μL标准或稀释样品分配到孔中+50μL。
待测分析物是3种细胞因子IL-10、TNF-α、IL-6。根据制造商的方案将平板进行温育并在Luminex MAGPIX分析仪中读取。
罗伊乳杆菌NCIMB 42835比所有其他罗伊乳杆菌从PBMC诱导更多的TNF-α、IL-10、IL-6(图4、5、6和7)。在施用所有3剂罗伊乳杆菌NCIMB 42835后分析PBMC中的TNF-α诱导时具有独特的特征，其显示这个细胞因子的剂量依赖性诱导(图4，图5)。
主组分分析(PCA)是对数据的主组分的分析，以可视化数据的底层结构，其中存在彼此最大的差异和分离。对来自一剂或三剂罗伊乳杆菌菌株的所有细胞因子数据进行PCA发现NCIMB 42835是图右侧最远的点，因此显示细胞因子的最高诱导。其与两个西方菌株相距最远，并且与其他两个非西方菌株明显分开，后者似乎介于西方菌株与NCIMB 42835之间(图8，图9)。细胞因子数据与系统发生数据一致，表明NCIMB 42835是一种独特的分离物，对人细胞中的关键细胞因子具有菌株特异性作用。我们发现分离自PNG供体的NCIMB 42835显示出免疫刺激作用，其被与分离自世界其他地区的其他罗伊乳杆菌菌株相比增加的细胞因子水平所证明。
罗伊乳杆菌NCIMB 42835对某些碳水化合物的优选使用
诸如棉子糖的碳水化合物在西方饮食中的含量非常低，而在巴布亚新几内亚人的饮食中却很丰富，巴布亚新几内亚人主要食用富含棉子糖(一种植物糖)的植物性饮食。如前所述，罗伊乳杆菌是高度适应性的，西方分离株中重要生长底物和重要性状的丧失可能解释西方人中罗伊乳杆菌种群的下降。先前没有报道使用棉子糖来支持肠道中罗伊乳杆菌的生长。图10示出与葡萄糖相比，罗伊乳杆菌NCIMB 42835在棉子糖上的生长更高。
这些结果表明，棉子糖是非西方罗伊乳杆菌菌株获得比西方菌株更好的生长的极佳生长底物。将棉子糖与非西方罗伊乳杆菌组合使用有助于支持在西方社会的肠道微生物群中重建这种有益菌株。
罗伊乳杆菌NCIMB 42835显示在人肠道中的持久性高于罗伊乳杆菌DSM20016T(模式菌株)，并且受益于高棉子糖的饮食。
为了确定罗伊乳杆菌NCIMB 42835是否显示出对人类肠道和富含植物的饮食的适应性，Walter实验室进行了一项人体研究，评估该菌株在人肠道中的表现。这项研究的目的是检验这样一个假设，即在非西方化微生物组中占主导地位的细菌物种可以被“重新引入”其饮食设计为促进所述细菌生长的加拿大人的肠道中。
人体试验：参与者是从Alberta大学校园招募的，并获得了知情同意。在一项三臂试验设计中，将两种罗伊乳杆菌(NCIMB 42835和DSM 20016T)的效果与安慰剂组进行了比较。非西方饮食的影响在所有研究臂中作为交叉设计进行了测试。健康男性和绝经前、非妊娠和非哺乳期女性，年龄18至45岁，BMI在20-29.9kg/m2之间，近期(<3个月)无抗生素使用史(N＝30)。参与者被随机分配至3组之一。如Duar等(Duar等,2017)所述，第1组和第2组各自接受一种在水中的罗伊乳杆菌菌株以供直接食用。两种菌株均以约1010个活细胞的单次剂量提供，这是人类容易耐受罗伊乳杆菌的剂量(Duar等,2017)。第三组接受安慰剂(在水中稀释的2g麦芽糖糊精)，已知其不会影响微生物组。所有组在干预的第4天和第39天都接受了单剂量的益生菌或安慰剂。参与者将被要求在为期一周的筛选期间保持其惯常饮食。一周后，每臂一半的受试者被分配遵循“非西方饮食”(或设计的饮食)，而另一半继续食用其惯常饮食三周(常规饮食)。经过2周的淘汰(washout)后，参与者在研究的第二个3周期间改变饮食。在整个研究过程中，参与者总共参加了12次诊所随访。基础随访在每个饮食周期开始前一天(第0天和第35天)进行；在这些随访期间，收集了人体测量学、通过生物电阻抗分析(BIA)测量的身体成分、血压测量、血液和粪便样本，参与者完成了关于感知压力和GI耐受性的问卷调查。在研究的第4天和第39天，参与者根据其被分配的组接受了罗伊乳杆菌菌株或安慰剂。除了预定的随访之外，参与者被要求在每个饮食周期期间大约每两天提供一次粪便样本。
饮食：Walter实验室与Alberta大学的其他实验室合作，设计了一种类似于遵循农业生活方式的个体的饮食干预措施，同时专门选择为罗伊乳杆菌提供难消化底物的食品。虽然典型的西方饮食的特点是大量摄入红肉和加工肉类、鸡蛋、精制谷物和糖，但巴布亚新几内亚人的饮食中植物性食物、纤维和碳水化合物含量相对较高，而脂肪和动物来源的蛋白质含量较低(Martínez et al,2015)。具体而言，棉子糖在巴布亚新几内亚饮食中很常见，但在西方饮食中很少见，并且预计会支持罗伊乳杆菌在人肠道中的生长(参见我们的初步数据)。虽然被分配到研究的非西方(设计的)饮食周期，但为参与者提供了完全准备好的、预先包装好的早餐、午餐、晚餐和零食，这些食品由类似于来自农业社会的个体所消耗的碳水化合物源的数量和类型组成(如山药、甘薯和木薯)，总纤维摄入量约为每天每2000卡路里42克(是加拿大人平均纤维摄入量的两倍多)。此外，饮食中提供的动物蛋白质的量(频率为每天一次或更少)是保守的，强调植物源的蛋白质，如蚕豆和豌豆(split peas)。
供食用的罗伊乳杆菌菌株的生产：罗伊乳杆菌菌株在Walter实验室在食品级条件制备供食用，并在收获前确定细胞数目，并按照Duar等(2017)的描述将剂量标准化为约109个细胞/ml，并在矿泉水中提供给受试者。
确定粪便样品中罗伊乳杆菌细胞数目
每2天收集一次粪便样本(在食用罗伊乳杆菌或安慰剂之前收集两次及在之后收集两周)。使用LRIM琼脂通过细菌培养对粪便样品中的罗伊乳杆菌菌株进行绝对定量。这种琼脂已被证明对从人粪便样本中定量分离罗伊乳杆菌具有足够的选择性(Duar等,2017)。
发现：
如图11所示，与DSM 20016T相比，菌株NCIMB 42835在施用两天后细胞数目达到10倍以上。之后数目有所下降，但与DSM20016T相比，NCIMB 42835的数目仍然较高。此外，饮食转换为非西方高植物饮食(设计的饮食)导致施用后8天的较高持久性(图11和12A)，而DSM2016T并没有从植物性饮食中获得任何益处(图12B)。这些发现表明，与罗伊乳杆菌种的模式菌株(也是人分离株)相比，NCIMB 42835菌株增加了在人肠道中的适应性，并受益于对非工业化农业人类种群重新采样的饮食。NCIMB 42835在更高水平确立，并显示出增强的持久性。
鉴于现代生活方式与慢性病的大量增加有关，纠正生活方式引起的微生物组耗竭具有巨大的治疗潜力。源自巴布亚新几内亚农村的罗伊乳杆菌分离株，当放回生活在工业化社会中的个体的肠道中时，可能会产生健康益处，并有助于预防西方非传染性疾病，如自闭症。在本发明中，这种重要的共生生物(具有导致互惠互利的长期进化关系的物种)分离自非工业化社会个体并表现出独特的性质。将其引入工业化或西方人的饮食中，包括将其作为一种益生菌，同时或不同时使用棉子糖等底物，这在以前从未被提出过。
预计其在增强婴儿、幼儿、孕妇或产后母亲的微生物群等方面将具有特别的优势。
应当理解，本发明的菌株可以以常规剂型诸如胶囊、微胶囊、片剂、颗粒剂、粉剂、锭剂、丸剂、栓剂、混悬剂和糖浆剂等口服吸收形式施用于动物(包括人)。合适的制剂可以通过常用的方法使用常规的有机和无机添加剂来制备。药物组合物中活性成分的量可以处于发挥所需治疗效果的水平。
所述制剂还可以包括细菌组分、药物实体或生物学化合物。
此外，可以使用任何合适的已知方法制备包含本发明菌株的疫苗，并且可以包括药学上可接受的载体或佐剂。
人体免疫系统在大量人类疾病的病因和病理学中发挥着重要作用。高免疫反应和低免疫反应导致大多数疾病状态，或者是大多数疾病状态的组成部分。一类称为细胞因子的生物学实体对免疫过程的控制特别重要。这些精微的细胞因子网络的扰动正越来越多地与许多疾病相关联。这些疾病包括但不限于炎症性疾病、免疫缺陷、炎症性肠病、肠易激综合征、癌症(尤其是胃肠道和免疫系统的癌症)、腹泻性疾病、抗生素相关性腹泻、小儿腹泻、阑尾炎、自身免疫性疾病、阿尔茨海默病、类风湿性关节炎、乳糜泻、糖尿病、器官移植、细菌感染、病毒感染、真菌感染、牙周病、泌尿生殖系统疾病、性传播疾病、HIV感染、HIV复制、HIV相关腹泻、手术相关创伤、手术引起的转移性疾病、败血症、体重减轻、厌食、发热控制、恶病质、伤口愈合、溃疡、肠道屏障功能、过敏、哮喘、呼吸系统疾病、循环系统疾病、冠心病、贫血、凝血系统疾病、肾脏疾病、中枢神经系统疾病、肝脏疾病、缺血、营养失调、骨质疏松症、内分泌失调、表皮病症、银屑病和寻常痤疮。对细胞因子产生的影响特异于所检验的益生菌菌株。因此，可以选择特定的益生菌菌株来使特定疾病类型的排他性细胞因子失衡正常化。可以使用单个菌株或其突变体或变体或选择这些菌株来实现疾病特异性疗法的定制。
肠道微生物群对肠道免疫系统的发育和正常功能很重要。在没有肠道微生物群的情况下，肠道免疫系统发育不全，正如无菌动物模型所证明的那样，某些功能参数会降低，例如巨噬细胞吞噬能力和免疫球蛋白的产生。肠道微生物群在刺激非破坏性免疫反应方面的重要性正变得越来越明显。西方世界过敏症发病率和严重程度的增加与卫生和公共卫生的程度增加有关，同时宿主遇到的感染挑战的数量和范围也在减少。这种免疫刺激的缺乏可以使宿主对非致病性但具有抗原性的物质产生反应，从而导致过敏或自身免疫。有意损耗一系列非致病性免疫调节细菌将为宿主提供必要和适当的教育刺激，以正确发生和控制免疫功能。
益生元
益生菌生物的引入是通过摄入在合适载体中的微-生物来完成的。提供促进这些益生菌菌株在大肠中生长的培养基将是有利的。加入一种或多种寡糖、多糖或其他益生元提高乳酸菌在胃肠道中的生长。益生元是指在结肠中由被认为具有积极价值的固有细菌特别发酵的任何无活力的食物组分，例如双歧杆菌、乳酸杆菌。对于罗伊乳杆菌，最有希望组合使用的益生元是棉子糖和与棉子糖相关的底物，例如AlphaGOS。益生菌菌株与一种或多种益生元化合物的组合给药可以增强所施用的益生菌在体内的生长，从而产生更显著的健康益处，并且被称为合生元。
其他活性成分
应当理解，益生菌菌株可以预防性施用或作为治疗方法单独施用或与如上所述的其他益生菌和/或益生元材料一起施用。此外，所述细菌可用作使用其他活性材料的预防或治疗方案的一部分，例如用于治疗炎症或其他疾病，尤其是免疫参与的那些病症。这种组合可以作为单一制剂施用或作为单独制剂在相同或不同时间施用及使用相同或不同施用途径施用。
药物组合物
药物组合物是包含或由治疗有效量的药物活性物质组成的组合物。所述组合物优选包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药物学领域熟知的，在例如Remington's Pharmaceutical Sciences中描述。药学载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践来选择。所述药物组合物除了载体、赋形剂或稀释剂之外，可包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包膜剂、增溶剂、推进剂。
药学上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、petroethral脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
适当时，药物组合物可以通过以下任何一种或多种方式施用：吸入，以栓剂或阴道栓剂形式，以洗剂、溶液、乳膏、软膏或撒粉剂的形式局部施用，通过使用皮肤贴剂，以含有赋形剂如淀粉或乳糖的片剂形式口服，或以单独或与赋形剂混合的胶囊或小珠形式，或以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式，或者其可以经肠胃外注射例如海绵体内(intracavernosally)、静脉内、肌肉内或皮下注射施用。对于肠胃外施用，所述组合物最好以无菌水溶液的形式使用，该水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或单糖以使溶液与血液等渗。对于口腔或舌下施用，所述组合物可以以片剂或锭剂的形式给药，其可以以常规方式配制。
鼻内施用可以使用鼻喷雾剂、鼻洗液或直接应用在鼻内完成。
施用于肺可以是干粉的形式，使用吸入装置吸入。在某些情况下，所述制剂是气雾剂的形式。气雾剂可以是溶液、悬浮液、喷雾、薄雾、蒸气、液滴、颗粒或干粉形式，例如使用包括HFA推进剂的计量剂量吸入器，无HFA推进剂的计量剂量吸入器，雾化器，加压罐，连续喷雾器。
取决于不同的递送系统，可能有不同的组合物/制剂要求。举例来说，本发明的药物组合物可配制成使用微型泵或通过粘膜途径递送，例如作为用于吸入或可摄入溶液的鼻喷雾剂或气雾剂，或其中组合物配制为可注射形式以经非肠道给药，例如通过例如静脉内、肌肉内或皮下途径递送。或者，所述制剂可以设计为通过两种途径递送。
本发明不限于上述实施方案，这些实施方案可以进行更具体的变化。
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ttgttggaga agaacgtgcg tgagagtaac tgttcacgca gtgacggtat ccaaccagaa600
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gtattcaccg cggcatgctg atccgcg507
Claims (16)
1.一种罗伊乳杆菌菌株(Lactobacillus reuteri)，其具有NCIMB保藏编号42835。
2.权利要求1的菌株，其中所述菌株是生物学纯培养物、细菌肉汤或冻干粉的形式。
3.一种分离的罗伊乳杆菌菌株，其具有NCIMB保藏编号42835。
4.权利要求1至3任一项的菌株，其是活细胞和/或非活细胞的形式。
5.一种制剂，其包含权利要求1至4任一项的菌株。
6.权利要求5的制剂，其进一步包含用于所述菌株的底物。
7.权利要求6的制剂，其中所述底物是碳水化合物。
8.权利要求6或7的制剂，其中所述底物是寡糖，所述寡糖可以是不可消化的。
9.权利要求6至8任一项的制剂，其中所述底物来源于植物源。
10.权利要求6至9任一项的制剂，其中所述底物包含棉子糖。
11.权利要求5至10任一项的制剂，其进一步包含益生元材料和/或另一种益生菌材料。
12.权利要求5至11任一项的制剂，其进一步包含可摄入的载体。
13.权利要求12的制剂，其中所述可摄入的载体包含药学上可接受的载体诸如胶囊、片剂或粉剂。
14.权利要求12的制剂，其中所述可摄入的载体是食品诸如酸化奶、酸奶、冷冻酸奶、奶粉、奶浓缩物、冰淇淋、软干酪、沙拉酱或饮料。
15.具有NCIMB保藏编号42835的罗伊乳杆菌菌株，其用于增强需要增强微生物群的个体的所述微生物群中的用途。
16.权利要求15的用于所述用途的具有NCIMB保藏编号42835的罗伊乳杆菌菌株，其中所述个体是婴儿、幼儿、孕妇或产后母亲。
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