KR20220063431A

KR20220063431A - ApoD의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지장애 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220063431A
Application number: KR1020200149271A
Authority: KR
Inventors: 조경옥; 김지은
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2022-05-17

Abstract

본 발명은 ApoD 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 인지장애의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 ApoD 억제제 처리에 따른 뇌전증 동반 인지장애 치료 효과를 구체적으로 확인하였는바, 뇌전증으로 유발된 인지장애의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

ApoD의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 인지장애 예방 또는 치료용 조성물{Composition for the prevention or treatment of cognitive impairment comprising expression or activity inhibitor of ApoD as an active ingredient}

본 발명은 인지장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 인지장애 치료물질의 스크리닝 방법 및 인지장애 진단용 조성물에 관한 것이다.

측두엽 뇌전증(temporal lobe epilepsy)은 국내 유병률이 약 19만 명에 달하는 성인에서 가장 호발하는 뇌전증으로, 약물치료에 반응하지 않는 난치성 뇌전증으로 진행하는 경우가 흔하고, 이후 인지기능 저하 등 동반 이환 질환의 발생률이 매우 높다. 뇌전증 환자들의 임상 경과에서 초기 발작 후 자발성 재발 발작이 관찰되는 만성 뇌전증 발병 전까지의 기간을 잠복기라 부르며, 이 기간 동안 해마에서 여러 변화들이 관찰되지만, 아직도 발병 기전(epileptogenesis)이 명확히 밝혀지지 않아, 뇌전증 및 동반 이환 질환의 예방 및 치료에 많은 어려움이 있다.

비정상적인 해마 신경세포의 생성이 뇌전증 발병과 인지기능 장애를 유도한다는 본 발명자들의 선행연구는, 뇌전증 발병과정에서 치아이랑에 존재하는 신경세포가 중요한 역할을 수행함을 시사한다. 특히 비정상적 신경세포생성을 단기간 억제하였을 때, 자발성 재발 발작 빈도 감소가 1년 이상 유지됨을 확인하여, 신경세포생성이 뇌전증 예방의 좋은 타겟이 될 수 있음을 보여주었고, 시기상으로도 뇌전증 치료를 만성기가 아닌 잠복기부터 시도하는 것이 적절하다는 근거를 제시하였다 (Cho KO, Lybrand ZR, Ito N, Brulet R, Tafacory F, Zhang L, Good L, Ure K, Kernie SG, Birnbaum SG, Scharfman HE, Eisch AJ, Hsieh J. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 2015 Mar 26;6:6606.). 그러나 뇌전증 발작에 의한 비정상적 신경세포생성은 다단계 과정(multi-step process)의 결과물이 혼재되어 복잡한 양상을 보이고 있기 때문에, 뇌전증 발병의 주요 인자를 찾기 위해 보다 심도 있는 접근이 필요하다.

뇌전증 발작 후 해마에서는 치아이랑문(hilus)의 이소성 과립세포(ectopic granule cell), 이끼섬유발아(mossy fiber sprouting), 기저부 가지돌기(hilar basal dendrite) 등의 변화가 관찰되며, 각각의 특징과 역할에 대한 연구가 활발하게 이뤄지고 있다. 이에 반해, 성숙 과립세포는 치아이랑의 주요 구성세포이고, 해마로 들어오는 정보를 선별하여, 과다한 흥분이 전달되는 것을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 연구방법의 한계 때문에 다른 뇌전증 발병 후보 인자들에 비해 크게 주목 받지 못한 측면이 있다. 현재까지 뇌전증 발작 후 성숙 과립세포에 대한 연구는 정상에 비해 가지돌기의 길이가 약간 짧아지고, 세포간 간격이 넓어진다는 형태학적 변화에 대한 보고 정도가 주를 이루고 있다. 그러나 치아이랑의 과립세포를 광유전학적 방법(optogenetics)으로 억제시켰을 때 자발성 재발 발작의 빈도가 감소한다는 보고 (Krook-Magnuson E, Armstrong C, Bui A, Lew S, Oijala M, Soltesz I. In vivo evaluation of the dentate gate theory in epilepsy. J Physiol. 2015;593(10):2379-2388.)와 뇌전증 발병에 중요한 역할을 하는 해마 신경세포생성이 주변의 다양한 세포들에 의해 영향을 받는다는 사실로 미루어 볼 때, 성숙 과립세포로부터 분비되는 단백질이 성체 신경세포생성에 영향을 미칠 가능성이 높다.

이에 본 발명에서는 뇌전증 및 동반 질환에 대해 직접적인 치료 효과를 얻을 수 있는 치료제를 개발하기 위해 노력하던 중 성숙 과립세포 특이 유전자를 스크리닝하여 분자생물학적 특징을 제시하고, 분비 가능한 후보 유전자 중 지질대사관련 물질로 알려져 있는 ApoD의 발현을 조절함으로써 성숙 과립세포를 통한 뇌전증 동반 인지장애 개선 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은 인지장애를 예방 또는 치료할 수 있는 조성물, 인지장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법, 인지장애 진단용 조성물, 및 인지장애를 진단을 위한 정보제공방법을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ApoD 의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 인지장애는 만성 뇌전증(epilepsy) 동반 인지장애 일 수 있다.

본 발명은 또한, ApoD 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 또한, i) ApoD 단백질을 발현하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계; ii) 상기 단계 i)에서 처리된 세포에서 ApoD 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 iii) 상기 단계 ii)에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 인지장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, ApoD, ApoE 및 LCAT으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 인지장애 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, a) 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 ApoD, ApoE 및 LCAT으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 측정한 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 인지장애 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 ApoD 억제제를 유효성분으로 포함하며, 상기 ApoD 억제제의 처리에 따른 뇌전증에 의해 유발된 인지장애 치료 효과를 확인하였는바, 인지장애의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적인 타겟 치료 방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 neurotrophin-3 (NTF3) eGFP BAC-TRAP 마우스에 필로카르핀으로 뇌전증 경련중첩이 유도시킨 동물모델의 해마 치아이랑을 관찰한 결과, 성숙한 과립세포에서 eGFP 신호가 발현되는 것을 확인한 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 도면이다. Sham: 무처리 정상대조군; SE: 경련중첩이 유도된 실험군; DCX: 미성숙 신경세포의 표지자; NeuN: 성숙 신경세포의 표지자.
도 2는 neurotrophin-3 (NTF3) eGFP BAC-TRAP 마우스에 필로카르핀으로 뇌전증 경련중첩이 유도시키고 해마 치아이랑에서 eGFP 발현 세포만을 면역 침강법으로 분리하였을 때, eGFP 발현이 면역 침강 분리 세포군(IP)에서 현저히 증가하였으며, 별아교세포(S100b), 미세아교세포(AIF1), 혈관내피세포(PECAM1), 희소돌기아교세포(MCP)의 표지자는 감소함을 나타낸 도면이다.
도 3은 뇌전증 경련중첩 후 해마에서의 대규모 유전자 발현 프로파일을 나타낸 도면이다. Sham: 무처리 정상대조군; SE: 경련중첩이 유도된 실험군.
도 4는 뇌전증 경련중첩 후 해마에서 변화하는 전체 유전자를 대상으로 조사한 유전자 온톨로지 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 뇌전증 경련중첩 후 해마에서 지질대사 관련 물질의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다. A: qPCR 분석 결과, B: 웨스턴 블랏 분석 결과.
도 6은 뇌전증 경련중첩 후 해마 및 치아이랑 과립세포에서 ApoD의 발현이 증가되는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. A: 웨스턴 블랏 분석 결과로서 상단은 전체 해마에서 확인한 결과, 하단은 치아이랑 과립세포에서 확인한 결과, B: 전체 해마에서 GAPDH 대비 ApoD 발현율을 확인한 결과, C: 치아이랑 과립세포에서 GAPDH 대비 ApoD 발현율을 확인한 결과.
도 7은 ApoD siRNA 주입에 의해 해마에서 ApoD 발현이 억제되는지 확인한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 ApoD siRNA 주입에 의해 해마 치아이랑 과립세포의 구조 변화를 확인하기 위해 면역조직화학 염색한 결과를 나타낸 도면이다. 우측 도면은 ApoD siRNA 주입에 의해 이소성 과립세포의 숫자가 감소하였음을 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 필로카르핀에 의해 뇌전증 경련중첩이 유도된 동물모델에서 NL 테스트 및 NO 테스트를 통해 인지기능 저하를 확인한 결과를 나타낸 도면이다. A: 실험과정, B: 새로운 위치에 대한 선호도(NL 테스트), C: 새로운 물체에 대한 선호도(NO 테스트), D: 총 움직인 거리.
도 10은 뇌전증 동반 인지장애가 나타난 동물모델에서 ApoD siRNA 주입에 의해 인지저하가 개선되는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다. A: 실험과정, B: NL 테스트 및 NO 테스트 방법, NB: 새로운 위치에 대한 선호도(NL 테스트), C: 새로운 물체에 대한 선호도(NO 테스트), D: 총 움직인 거리.
도 11은 필로카르핀에 의해 뇌전증 경련중첩이 유도된 동물모델에서 ApoD siRNA 주입에 의해 뇌전증 발작 빈도 및 발작 지속 시간을 비디오-뇌파 모니터링을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 원격 비디오-뇌파 모니터링을 위한 송신기 삽입 모식도이다.
도 13은 acute seizure후 ApoD, ApoE, LCAT의 일시적 발현 패턴을 확인한 결과이다.
도 14는 acute seizure후 ApoD에 대한 siRNA 투여 후, ApoD, ApoE, LCAT의 발현 패턴을 분석한 결과에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ApoD 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 ApoD 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 ApoD 단백질의 발현 억제제는 ApoD를 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 ApoD 단백질의 활성 억제제는 ApoD 유전자로부터 발현된 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, ApoD 유전자는 공지된 유전자 데이터베이스에서 그 서열 정보를 확인할 수 있고, 예를 들어, 인간 ApoD 유전자의 핵산 서열은 GenBank 등록번호 NM_001647.4 에서 확인할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 ApoD 서열의 일례로서 NCBI 참조서열 NM_007470.4 및 NP_031496.2를 제시한다.

본 발명에서, 상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다.

본 발명에서, 상기 siRNA는 ApoD 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 siRNA의 일례로서 서열번호 1으로 표시되는 siRNA를 제시한다.

본 발명에서, 상기 화합물은 ApoD 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 활성을 억제할 수 있는 임의의 화합물을 모두 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기 펩티드 모방체(Peptide mimetics)는 ApoD 단백질의 결합 도메인을 억제하여 ApoD 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 ApoD 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 또는 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다.

본 발명에서, 상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득 할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.

본 발명에서, 상기 항체는 ApoD 단백질에 특이적이고 직접적으로 결합하여 ApoD 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다.

본 발명에서, 상기 ApoD 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal)항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 ApoD 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 ApoD 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 ApoD 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내, 복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, ApoD를 억제할 경우 뇌전증 발작 후의 이소성 과립세포의 생성이 감소되므로, 만성 뇌전증 및 뇌전증에 동반되는 인지기능 저하를 예방하거나 치료하기 위한 후보 물질이 될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 뇌전증 동반 인지장애가 나타난 동물모델에서 ApoD 를 억제할 경우 인지기능 저하가 현저하게 개선되는 것을 확인하였다. 이에 상기 인지장애는 만성 뇌전증에 동반되는 인지장애 일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토오스, 전분, 셀룰로오스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 여기에 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995).

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학적 조성물의 일일 투여량은 약 0.001~1000 mg/kg이나, 임상 실험 결과에 따라 가감될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회 에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 투약 단위 형태로 제형화 될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형화된 투약 단위는 상기 유효 화합물의 1일 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 개별 투약량은 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

또한, 본 발명의 조성물은 인지장애의 예방 또는 개선에 효과적인 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 ApoD의 발현 또는 활성 억제제를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 유효성분의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제, 예컨대 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예에는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예컨대, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g이다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 ApoD 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 인지장애 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 인지장애 예방 또는 치료방법은 본 발명의 ApoD 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 개체는 인지장애가 있는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 인지장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

a) ApoD 단백질을 발현하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계;

b) 상기 a)단계에서 처리된 세포에서 ApoD 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및

c) 상기 b)단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계.

상기 방법에 있어서, b) 단계에서 유전자의 발현 수준은 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 노던 블랏(Northern blot), cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응, 및 인 시투(in situ) 혼성화 반응 등의 방법을 통해 측정할 수 있으며, 당업자에게 알려진 유전자의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법에 있어서, b) 단계에서 단백질의 발현량은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS) 등의 방법을 통해 측정할 수 있으며, 당업자에게 알려진 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서는 뇌전증 경련중첩 후 해마에서의 대규모 유전자 발현 프로파일 및 전체 유전자를 대상으로 유전자 온톨로지 분석을 수행한 후 뇌전증 경련중첩 후 해마에서 지질대사 관련 물질의 발현 변화를 확인한 결과 ApoD, ApoE 및 LCAT 단백질이 다른 지질대사 관련 단백질과 달리 유의적으로 상향 조절되는 것을 확인하였다.

이에, 또 다른 측면에서 본 발명은 ApoD, ApoE 및 LCAT으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증(epilepsy) 또는 뇌전증 동반 인지장애 진단용 조성물을 제공한다.

상기 방법에 있어서, mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 ApoD, ApoE 또는 LCAT 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 ApoD 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 발현 수준의 측정은 치아 과립세포(dentate granule cell)에서의 수준을 측정하는 것일 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 뇌전증(epilepsy) 또는 뇌전증 동반 인지장애 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:

a) 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 ApoD, ApoE 및 LCAT으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

b) 상기 a) 단계에서 측정한 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계.

상기 방법에 있어서, 상기 b) 단계에서 비교한 결과가 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나 이상에 해당되는 경우 뇌전증(epilepsy) 또는 뇌전증 동반 인지장애로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

i) ApoD 발현 수준의 상향 조절

ii) ApoE 발현 수준의 상향 조절

iii) LCAT 발현 수준의 상향 조절.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험방법]

실험동물의 준비

RNA 시퀀싱에서 세포 내 단백질 변화를 보다 정확하게 반영하기 위해 neurotrophin-3 (NTF3) BAC-TRAP 마우스를 사용하였다. NTF3 BAC-TRAP 마우스는 NTF3 프로모터 뒤에 리보솜 단백질인 L10a와 형광물질인 eGFP를 융합시킨 마우스로서, eGFP 항체를 이용하여 면역침강법(immunoprecipitation)을 시행했을 때, 폴리솜의 eGFP-L10a-mRNA 복합체에 포함된 mRNA만을 분리해낼 수 있으므로, 단백질로 활발하게 번역되고 있는 mRNA를 주로 분리하여, 일반적인 전사체 분석보다 좀 더 실제 단백질 발현과 가까운 번역체 분석 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.

과립세포에서 특이적으로 ApoD 발현을 확인하기 위해 사용할 Prox1-GFP 마우스는 미국 Salk Institute의 Dr. Fred Gage 연구팀으로부터 반입하여 C57BL/6 마우스와 교배하여 준비하였다.

siRNA의 제작

ApoD (NM_007470.4, NP_031496.2)에 대한 siRNA는 ㈜바이오니아에서 80% 이상의 넉-다운 효율이 검증된 서열(5'-UUUCGUACCAUCUUCCAAG-3'; 서열번호 1)을 주문하여 사용하였고 대조군은 스크렘블(scramble) 서열 (5'-CUUGGAAGAUGGUACGAAA-3'; 서열번호 2)을 선택하여 사용하였다.

예비실험 결과 서열번호 1로 표시되는 siRNA 투여시 80% 이상 ApoD 발현이 감소하였음을 확인하였고, 이후 상기 siRNA를 뇌정위 수술로 해마에 투여하여 siRNA 주입에 따른 뇌손상 가능성 여부를 비디오-뇌파 모니터링 및 염색으로 확인하였으며, siRNA를 투여하지 않은 군과 비교하여 큰 차이가 없는 것으로부터 뇌손상 가능성이 없는 것으로 판단하고 이후 실험을 진행하였다.

뇌전증 동물모델 및 뇌정위 수술

6주령의 C57BL/6 또는 Prox1-GFP 마우스에, 스코폴라민 메틸질산(scopolamine methyl nitrate) 2 mg/kg과 테르부탈린 헤미설페이트염(terbutaline hemisulfate) 2 mg/kg을 각 마우스의 복강 내에 투여하고, 30분 뒤 필로카르핀(285 mg/kg for male, 295 mg/kg for female)을 투여하였다. 이후 발작 유발 여부를 자세히 모니터링 하였으며, 발작단계를 Modified Racine scale에 따라 평가하여, 경련중첩을 보이는 생쥐만 선택하였다. 발작 반응을 3시간 동안 유도시킨 후, 디아제팜(diazepam) 10 mg/kg을 복강 내 투여하여 발작을 종료시켰다. 뇌전증 발작 후 4, 7, 14, 28일 째 왼쪽 해마를 분리하여 웨스턴 블랏을 시행하고, 오른쪽 해마는 4% 파라포름알데히드 용액에 담궈 면역조직화학 염색을 위한 샘플을 제작하였다.

ApoD 또는 대조군 siRNA는 50 ng/ul siRNA: 1x polybrene: 50% sucrose를 1: 2.5: 0.5의 비율로 섞어 준비한 후, 6주령의 C57BL/6 수컷 마우스에 필로카르핀 투여 1, 4, 7, 14, 28일 째, 뇌정위 기구를 이용하여 등쪽과 가쪽 해마 두 곳에 각각 0.9 ul씩 총 1.8 ul 투여함으로써, 최대한의 ApoD 발현 억제를 유도하였다(좌표: AP -0.175, ML ±0.155, DV -0.215; AP -0.275, ML ±0.285, DV -0.285).

이후 일부는 비디오-뇌파 모니터링을 시행하고 일부는 인지기능 검사를 시행하였으며, 일부는 마이크로어레이 및 조직학적 분석을 위한 샘플 제작에 사용하였다.

분자생물학적 조사 방법

필로카르핀 투여 후 6주 째, 마우스를 4% 파라포름알데히드로 관류 고정한 후 뇌를 적출하고 해마조직 절편을 제작하여 해마의 신경세포 사멸, 아교세포 활성화, 비정상 신경세포생성에 대해 조직학적 방법으로 조사하였다. 해마 신경세포 사멸은 크레실 바이올렛 염색을 통해 살아있는 세포의 숫자를 모두 세어 조사하였고, 아교세포 활성화는 GFAP, IBA1 면역조직화학염색을 이용해 별아교세포와 미세아교세포의 활성도를 ImageJ 이미지 분석 프로그램을 활용하여 정량 분석 하였다. 신경세포 생성은 Ki67 면역조직화학염색을 이용해 신경줄기세포의 분열능을 조사하였고, DCX, Prox1 면역조직화학염색을 이용해 각각 미성숙 과립세포와 성숙 과립세포의 개수를 subgranular zone과 hilus에서 조사하였다. 해마가 보이기 시작한 시점부터 12개의 coronal section마다 하나씩을 모아서 한 동물당 각각 6개의 조직절편을 염색하고 이를 정량 분석하여 전체 해마에서의 표지세포 숫자를 추정하였다. ApoD를 포함한 지질대사 관련 물질의 뇌전증 발작 후 양적 변화 및 마이크로어레이 분석을 통해 발굴한 후보 유전자들의 발현 양상 변화는 분리된 해마를 이용해 웨스턴 블랏과 qPCR로 조사하였다.

비디오-뇌파 모니터링

24시간 비디오-뇌파 모니터링을 위하여, 필로카르핀 투여 4주째 EEG 송신기(ETA-F10)를 목 아래쪽 피하공간에 삽입하고, 연결된 전선을 경막 위에 위치한 2개의 금속 나사에 고정하였다 (나사 좌표: AP +0.1, ML +0.2; AP -0.2, ML +0.22)(도 10). 송신기 삽입 1주일 후, 원격 비디오-뇌파 모니터링 시스템(Data Science International)을 이용하여, 2주간 지속적으로 뇌파를 기록하고(sampling rate: 1000 Hz), 전신 강직-간대 발작의 빈도와 기간을 분석한다. 전신 강직-간대 발작은 비디오상 발작이 관찰되면서, 뇌파 기록상 3초 이상 지속되고 3배 이상의 진폭을 보이는 3 Hz 이상의 rhythmic activity로 한정하였고, 비디오-뇌파 모니터링 종료 후, 조직학적 변화를 분석하였다.

인지기능 테스트

해마 인지기능 테스트는 만성 뇌전증 발병 시점인 필로카르핀 투여 후 4주째 오픈 필드 실험(open-field test)를 시행하여 마우스의 기본운동능력을 비교하고, 다음날 같은 모양의 물건을 오픈 필드 행동 장소(open field arena)에 위치시켜 마우스가 최대 20분간 물체를 탐색하게 하고 두 물체를 합쳐서 30초간 탐색하는 경우 세션을 종료하는 방식으로 진행하였다. 24시간 후 이중 한 물체의 위치를 움직여, 마우스가 바뀐 위치의 물건을 더 많이 탐색하는지 선호도 비율(바뀐 물체를 탐색하는 시간/두 물체를 탐색한 총 시간)을 계산 및 평가함으로써, 공간기억력을 비교하였다(NL test). 4일 뒤 새로운 물체 한 쌍을 노출시키고, 이번에는 두 물체 중 하나를 다른 물체로 교체하여 마우스가 새 물건을 알아보는지 평가하였다(NO test).

[실시예 1]

뇌전증 발작 동물모델의 해마 치아이랑에서 특이적으로 발현되는 분자 표지자 탐색

<1-1> 뇌전증 발작 동물모델 제작

세포 내 단백질 변화를 보다 정확하게 반영하기 위해 상술한 NTF3-BAC-TRAP 마우스에 스코폴라민 메틸질산(scopolamine methyl nitrate) 2 mg/kg과 테르부탈린 헤미설페이트염(terbutaline hemisulfate) 2 mg/kg을 각 마우스의 복강 내에 투여하고, 30분 뒤 필로카르핀(285 mg/kg for male, 295 mg/kg for female)을 투여하였다. 이후 발작 유발 여부를 자세히 모니터링 하였으며, 발작단계를 Modified Racine scale에 따라 평가하여, 경련중첩(status epilepticus, SE)을 보이는 마우스만 선택하였다. 선택한 마우스의 발작 반응을 3시간 동안 유도한 후, 디아제팜(diazepam) 10 mg/kg을 복강 내 투여하여 발작을 종료시켰다.

<1-2> 면역침강법(immunoprecipitation) 및 RNA 분리

경련중첩 후 8일 째 4마리의 동물로부터 8개의 해마를 분리하여 항 eGFP로 면역침강법을 수행하였다. 구체적으로, NTF3 BAC-TRAP 마우스에 경련중첩을 일으켜 뇌전증 발작 동물 모델 제작 후 8일 째 해마 조직을 수집하여 eGFP 유전자가 발현되는 세포 유형을 확인하였다. NTF3 BAC-TRAP 마우스는 NTF3 프로모터 뒤에 리보솜 단백질인 L10a와 형광물질인 eGFP를 융합시켜 형질전환 된 마우스이므로, 항-eGFP 항체가 코팅된 자기 비드를 조직 샘플에 도입하여 면역침강법(immunoprecipitation, IP)을 시행하면, 이들 비드는 eGFP-L10a-mRNA 복합체에 결합하여 단백질로 능동적으로 번역되는 mRNA를 선택적으로 분리할 수 있다. eGFP 유전자가 발현되는 세포 유형을 확인한 결과, eGFP-L10a 발현이 치아 이랑에 주로 제한된다는 것을 확인하였다. eGFP 발현 세포의 특성을 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과, 정상대조군(sham)과 경련중첩군(SE) 모두 성숙 신경세포의 표지자인 NeuN과는 중첩이 되지만, 미성숙 신경세포의 표지자인 doublecortin (DCX)과는 중첩되지 않음을 확인하였다(도 1).

상기 결과로부터, 치아이랑의 성숙한 과립세포에서 eGFP가 발현되었음을 확인하였다.

면역침강법이 제대로 수행되었는지 검증하기 위해, eGFP 항체를 이용한 분리 전, 후 샘플을 채취하여 eGFP에 대한 qPCR을 시행하였다. 구체적으로 eGFP-mRNA 복합체 분리 후 IP 샘플과 나머지 조직 균질 액을 사용하여 qPCR을 수행한 후 UB 샘플과 비교하여 IP에서 eGFP 발현의 log2 배 변화를 계산했다. 그 결과, [도 2]에 나타난 바와 같이, eGFP는 면역침강(Immunoprecipitation, IP) 샘플에서, 분리 전 샘플(unbound, UB)에 비해 16배 이상 많이 존재하였으며, 이는 정상대조군(sham)과 경련발작(SE) 군에서 차이 없이 나타남을 확인하였다. 나아가, 분리한 IP 샘플이 다른 세포의 오염이 없는 순수 신경세포임을 증명하기 위해 다양한 세포 특이 표지자를 이용하여 qPCR을 시행한 결과, 별아교세포(S100β). 미세아교세포(AIF1), 혈관내피세포(PECAM), 희소돌기아교세포(MBP) 특이 표지자들은 IP 샘플에서 UB에 비해 현저히 감소되어 있음을 확인하였다. eGFP와 마찬가지로, 각 세포의 표지자들은 뇌전증 발작 유무에 의해 변화하지 않았다.

상기 결과로부터, 면역침강법을 통해 eGFP+ 신경세포의 폴리솜에 존재하는 mRNA가 성공적으로 분리되었음을 확인하였다.

<1-3> 번역체 분석

Bioanalyzer로 검증을 통과한 RNA만을 대상으로, 라이브러리를 제작하였고, 각 군당 2개의 샘플을 제작하여 RNA 시퀀싱을 진행하였고, heatmap으로 유전자 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, cRNA를 생성하고 증폭하기 위해 Illumina TotalPrep RNA 증폭 키트와 Illumina BeadChip 어레이를 사용하였다. in vitro 전사 및 정화 후에 cRNA는 46,000 이상의 유전자를 시험할 수 있는 Mouse-6 발현 BeadChip 상에서 혼성화되고 정량화되었다. cDNA를 58℃에서 20시간 동안 배양한 후에, BeadChip을 세척, 블럭화하고, 제조자의 설명서에 따라 세척하고, 블럭화하고, 상온에서 streptavidin-Cy3 포함 용액(Illumina)과 함께 배양하였다. 형광 신호는 BeadStation 500GX 유전 분석 시스템(Illumina)으로 스캔하였으며, 이미지 등록과 데이터 추출은 BeadStudio 3.1.1(Illumina)로 자동화하였다.

그 결과, 정상대조군(sham)과 SE군의 전반적인 유전자 발현은 확연히 구분됨을 알 수 있었다(도 3). 또한, 뇌전증 발작 후 정상대조군에 비해 발현이 변화한 유전자를 대상으로 분석한 결과, 총 637개의 유전자가 뇌전증 발작 후 증가하였고, 그 중 18개의 유전자는 뇌전증 발작 후 새로 발현이 유도되었다. 반면 뇌전증 발작 후 총 937개의 유전자가 감소하는 것으로 나타나, 전체적으로 감소하는 유전자가 증가하는 유전자보다 많았다.

유전자 온톨로지 분석 결과, 신경세포체와 관련된 유전자가 가장 많이 변동되는 것으로 나타나, TRAP 방법이 성공적으로 이루어졌음을 재확인할 수 있었고, ATP, 아연/칼슘 이온 바인딩, 지질 바인딩 관련 유전자 및 항상성, 스트레스 반응, 세포 이동, 증식, 염색질 재구성 관련 유전자들이 변동이 많았음을 확인하였다(도 4).

번역체 분석 데이터를 바탕으로, 분비 가능한 지질대사관련 물질들의 발현양상을 NTF3-BAC-TRAP 마우스를 이용해 확인한 결과, ApoD, ApoE, LCAT (lecithin-cholesterol acyltransferase) 등의 mRNA 발현이 뇌전증 발작 후 유의하게 증가함을 확인하였다(도 5A). 또한 C57BL/6 마우스에 뇌전증 발작을 유도하고 8일 째 각 후보 유전자의 해마 내 단백질 양을 조사하였을 때에도 ApoD, ApoE 및 LCAT이 매우 증가하였다(도 5B).

또한, ApoD, ApoE, LCAT 의 acute seizure후 temporal expression의 결과를 도 13과 같이 확인하였다. 그 결과, 전체 해마에서 ApoD, ApoE, LCAT은 모두 sham에 비해 seizure insult 후 발현이 증가하는 패턴을 보였으며, 이는 상기 ApoD, ApoE, LCAT가 만성 뇌전증에 동반되는 인지장애에 대한 진단 마커로서 사용이 가능함을 보여주는 결과이다. (도 13)

아울러, acute seizure후 1일, 4일, 7일째 ApoD에 대한 siRNA를 뇌정위수술로 투여하고 2일 뒤인 9일째 해마의 ApoD, ApoE, LCAT의 발현을 비교하였다. ApoD의 발현이 감소된 siApoD 그룹에서, siCON 대조군에 비해 ApoE는 증가, LCAT은 감소하는 경향을 보이므로, 이들 마커는 모두 ApoD 의 발현 패턴과 연관성이 있는 것이다. 따라서, ApoD, ApoE, LCAT은 뇌전증에 동반되는 인지장애의 진단 및 이에 대한 치료 예후 등의 정보를 제공하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. (도 14)

<1-4> 뇌전증 발작 후 치아이랑 과립세포에서 ApoD 발현 증가 확인

전사체 분석 결과를 토대로 본 발명에서는 잘 알려져 있지 않은 ApoD의 기능을 조사하기 위해 C57BL/6 마우스에 필로카르핀으로 뇌전증 발작을 유도하고 시간에 따른 해마 내 ApoD 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 뇌전증 발작 후 1주일 내에 해마 ApoD의 발현이 크게 증가함을 확인하였다(도 6의 A, B).

다음으로, 치아이랑 성숙 과립세포에서 ApoD가 특이적으로 발현하는지 확인하기 위해 Prox1-eGFP 마우스를 사용했다. Prox1-GFP 마우스는 미국 Salk Institute의 Dr. Fred Gage 연구팀으로부터 반입하여 C57BL/6 마우스와 교배하여 준비하였다. 그 결과, FACS로 분류 된 GFP+ 세포에서 급성 발작(acute seizures) 4 일째와 7 일째에 ApoD의 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 6의 A, C).

상기 결과로부터, 급성 발작 후 치아이랑의 내 분자층에 ApoD 면역 반응성이 나타났으며, 치아이랑의 과립세포에서 ApoD의 발현이 두드러지게 나타나는 것을 확인하였다.

[실시예 2]

ApoD 억제제 도입에 의한 해마 내 ApoD 발현 억제 효과 확인

실시예 1-5에서 뇌전증 발작 후 치아이랑 과립세포에서 ApoD 발현이 상향 조절되었음을 확인한 후, ApoD의 발현을 억제하기 위해 다중 siRNA를 주입한 후 해마에서 ApoD 발현이 억제되는지 확인하였다. ApoD에 대한 siRNA는 바이오니아에서 80% 이상의 낙다운 효율이 검증된 서열을 주문하여 사용하였고, 이를 서열번호 1에 나타내었다. 대조군은 서열번호 2에 나타낸 스크렘블 시퀀스를 선택하여 사용하였으며, 뇌정위수술로 siRNA를 해마에 주입하였다. ApoD 또는 대조군 siRNA는 50 ng/ul siRNA: 1x polybrene: 50% sucrose를 1: 2.5: 0.5의 비율로 섞어 준비한 후, 6주령의 C57BL/6 수컷 생쥐에 필로카르핀 투여 1, 4, 7, 14, 28일 째, 뇌정위 기구를 이용하여 등쪽과 가쪽 해마 두 곳에 각각 0.9 ul씩 총 1.8 ul 투여함으로써, 최대한의 ApoD 발현 억제를 유도하였다(좌표: AP -0.175, ML ±0.155, DV -0.215; AP -0.275, ML ±0.285, DV -0.285).

그 결과, 급성 발작 후 6일 및 9일에 해마에서 ApoD 발현을 확인한 결과를 [도 7]에 나타내었으며, siRNA 주입에 따라 ApoD의 발현율이 70~80% 억제되는 것을 확인하였다.

[실시예 3]

ApoD 억제제 도입에 의한 이소성 과립세포의 생성 억제 효과 확인

siRNA로 뇌전증 발작 후 ApoD 발현을 차단하고 6주 째 해마 조직에서 과립세포의 표지자인 Prox1 면역조직화학 염색을 시행하였다(n=7 대조군, n=9 siRNA 처리군).

그 결과, 치아이랑문의 이소성 과립세포의 숫자가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(도 8).

상기 결과로부터, 뇌전증 발작에 의해 유도된 이상 해마 신경 발생이 ApoD 조절에 의해 감소될 수 있고, ApoD 억제제가 뇌전증 또는 그의 동반 장애를 치료하는 후보 물질이 될 수 있음을 확인하였다.

[실시예 4]

뇌전증 발작 동물모델에서 ApoD 억제제 도입에 의한 뇌전증 동반 인지장애 치료 효과 확인

<4-1> 뇌전증 동반 인지기능 평가방법 확립

만성 뇌전증시 자주 동반되는 인지기능 저하를 조사하기 위해 NL 및 NO 테스트를 확립하였다. NL 테스트는 위치가 변경된 물체를 더 자주 탐색하는지 조사하여 해마 관련 공간인지기능(spatial memory)을 평가하고, NO 테스트는 물체의 종류가 바뀌었을 때 새로운 물체를 인식하는지 평가하여, 대뇌 관련 인지기능을 평가하였다.

그 결과, 필로카르핀 투여 4주 후, 뇌전증 마우스는 정상 대조군에 비해 NL 테스트에서 기능저하를 보여 새로운 위치에 대한 선호도가 낮았으며, 해마 기능과 상관없는 NO 테스트에서는 두군 간에 차이가 없었다.

상기 결과로부터, NL 테스트에서 새로운 위치에 대한 선호도를 확인하면 뇌전증시 동반되는 해마 의존성 인지기능을 평가할 수 있음을 확인하였다(도 9).

<4-2> 뇌전증 동반 인지장애 개선 효과 확인

만성 뇌전증 발병 시점인 필로카르핀 투여 후 4주째에 스크램블 siRNA 또는 ApoD siRNA를 6주령의 C57BL/6 마우스에 주입하고, 5주째에 오픈 필드 실험(open-field test)를 시행하여 마우스의 기본 운동능력을 비교하고, 다음날 같은 모양의 물건을 오픈 필드 행동 장소(open field arena)에 위치시켜 마우스가 최대 20분간 물체를 탐색하게 하고 두 물체를 합쳐서 30초간 탐색하는 경우 세션을 종료하는 방식으로 진행하였다. 24시간 후 이중 한 물체의 위치를 움직여, 마우스가 바뀐 위치의 물건을 더 많이 탐색하는지 선호도 비율(reference ratio)은 '바뀐 물체를 탐색하는 시간'을 두 물체를 탐색한 총 시간으로 나누어 계산 및 평가함으로써, 공간기억력을 비교하였다(NL test). 4일 뒤 새로운 물체 한 쌍을 노출시키고, 이번에는 두 물체 중 하나를 다른 물체로 교체하여 마우스가 새 물건을 알아보는지 평가하였다(NO test).

그 결과, 잠복기 동안 ApoD siRNA를 주입하여 ApoD 발현을 감소시킨 마우스는 대조군 마우스에 비해 NL 테스트에서 높은 선호 비율을 나타내었고, 이는 ApoD 넉다운이 발작과 관련된 해마의 인지기능 저하를 정상화시킬 수 있음을 시사한다. 예상대로, NO 테스트는 대조군과 Apod 넉다운 된 마우스간에 차이가 없음을 보여 주었다. 한편, 총 이동 거리는 두 그룹간에 차이가 없었으며, 이는 운동 활성에 차이가 없음을 나타낸다.

상기 결과로부터, ApoD 억제제의 뇌전증 동반 인지장애 치료 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.

[실시예 5]

뇌전증 발작 동물모델에서 ApoD 억제제 도입에 의한 자발성 재발 발작 억제 효과 확인

6주령의 C57BL/6 마우스에, 스코폴라민 메틸질산(scopolamine methyl nitrate) 2 mg/kg과 테르부탈린 헤미설페이트염(terbutaline hemisulfate) 2 mg/kg을 각 마우스의 복강 내에 투여하고, 30분 뒤 필로카르핀(285 mg/kg for male, 295 mg/kg for female)을 투여하였다. 이후 발작 유발 여부를 자세히 모니터링 하였으며, 발작단계를 Modified Racine scale에 따라 평가하여, 경련중첩을 보이는 생쥐만 선택하였다. 발작 반응을 3시간 동안 유도시킨 후, 디아제팜(diazepam) 10 mg/kg을 복강 내 투여하여 발작을 종료시켰다. ApoD 또는 대조군 siRNA는 50 ng/ul siRNA: 1x polybrene: 50% sucrose를 1: 2.5: 0.5의 비율로 섞어 준비한 후, 6주령의 C57BL/6 수컷 마우스에 필로카르핀 투여 1, 4, 7, 14, 28일 째, 뇌정위 기구를 이용하여 등쪽과 가쪽 해마 두 곳에 각각 0.9 ul씩 총 1.8 ul 투여함으로써, 최대한의 ApoD 발현 억제를 유도하였다(좌표: AP -0.175, ML ±0.155, DV -0.215; AP -0.275, ML ±0.285, DV -0.285).

이후, 24시간 비디오-뇌파 모니터링을 위하여, 필로카르핀 투여 4주째에 대조군 마우스 8마리 및 siApoD를 주입시킨 실험군 마우스 4마리에 EEG 송신기(ETA-F10)를 목 아래쪽 피하공간에 삽입하고, 연결된 전선을 경막 위에 위치한 2개의 금속 나사에 고정하였다 (나사 좌표: AP +0.1, ML +0.2; AP -0.2, ML +0.22)(도 10). 송신기 삽입 1주일 후, 원격 비디오-뇌파 모니터링 시스템(Data Science International)을 이용하여, 2주간 지속적으로 뇌파를 기록하고(sampling rate: 1000 Hz), 전신 강직-간대 발작의 빈도(SRS Frequency)와 발작 기간(SRS duration)을 분석하였다. 전신 강직-간대 발작은 비디오상 발작이 관찰되면서, 뇌파 기록상 3초 이상 지속되고 3배 이상의 진폭을 보이는 3 Hz 이상의 rhythmic activity로 한정하였고, 비디오-뇌파 모니터링 종료 후, 조직학적 변화를 분석하였다.

그 결과, 만성 뇌전증에서 관찰되는 자발성 발작의 빈도 및 발작 기간을 확인한 결과를 [도 11]에 나타내었으며, 자발성 재발 발작의 빈도와 발작 기간은 대조군과 siApoD를 주입한 마우스에서 유의적인 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, ApoD 억제제의 뇌전증 동반 인지장애 치료 효과와는 별개로 ApoD 억제제가 만성 뇌전증에서 나타나는 자발성 발작을 억제하는 효과는 없다는 것을 확인하였다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for the prevention or treatment of cognitive impairment comprising expression or activity inhibitor of ApoD as an active ingredient <130> 1068445 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoD siRNA <400> 1 uuucguacca ucuuccaag 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scramble siRNA <400> 2 cuuggaagau gguacgaaa 19

Claims

ApoD의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 억제제는 ApoD를 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 억제제는 ApoD 유전자로부터 발현된 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인지장애는 만성 뇌전증(epilepsy) 동반 인지장애인 것인, 약학적 조성물.
ApoD 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품.
a) ApoD 단백질을 발현하는 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 처리된 세포에서 ApoD 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 발현 수준 또는 발현량이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 인지장애 예방 또는 치료용 후보물질 스크리닝 방법.
제6항에 있어서,
상기 b) 단계의 측정은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제6항에 있어서,
상기 인지장애는 만성 뇌전증 동반 인지장애인 것인, 방법.
ApoD, ApoE 및 LCAT으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌전증(epilepsy) 또는 뇌전증 동반 인지장애 진단용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 ApoD, ApoE 또는 LCAT으로 이루어진 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 ApoD 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 조성물.
제9항에 있어서,
상기 발현 수준의 측정은 치아 과립세포(dentate granule cell)에서의 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
a) 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 ApoD, ApoE 및 LCAT으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 측정한 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 뇌전증(epilepsy) 또는 뇌전증 동반 인지장애 진단을 위한 정보제공방법.
제11항에 있어서,
상기 b) 단계에서 비교한 결과가 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나 이상에 해당되는 경우 뇌전증(epilepsy) 또는 뇌전증 동반 인지장애로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 정보제공방법:
i) ApoD 발현 수준의 상향 조절
ii) ApoE 발현 수준의 상향 조절
iii) LCAT 발현 수준의 상향 조절.