KR20220063020A - 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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홍진태
전성희
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명 조성물의 유효성분 화합물은 알레르기 질환의 진행에 염증을 유발하는 것으로 알려져 있는 CHI3L1에 결합하여 그 기능을 저해시키는 저해제로서 작용하며, 아토피 피부염 유발 동물모델에서 염증세포의 침윤을 억제하고, 염증성 사이토카인 발현을 감소시키고, NF-κB의 활성을 억제하는 효과를 나타내는 등 아토피 피부염에 유효한 효과를 나타내는 바, 본 발명에 의해 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공되는 유용한 효과가 달성된다.

Description

아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of atopic dermatitis}
본 발명은 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
아토피 피부염은 소아에게 나타나고 성인이 되어서도 증상이 지속될 수 있는 만성 알레르기 염증성 피부 반응이다. 아토피 피부염은 유전적으로 다른 알레르기 질환이 있는 경우 발생할 가능성이 높고, 음식이나 실생활에서 나타나는 진드기 같은 알레르겐에 의해서 발생 할 수 있다. 또한, 급격한 실내의 온습도의 변화나 땀 그리고 피부를 자극시키는 행동이나 요인에 의해 아토피 피부염이 발생할 수 있으며, 증상을 악화시킬 수 있다.
아토피 피부염은 만성 재발성 피부염으로서 심한 소양증, 피부 병변의 특징적인 모양 및 분포, 및 개인적 또는 가족적인 아토피 병력을 갖는 유전적 소인으로 보인다. 최근에는 아토피 피부염이 음식 첨가제나 환경오염의 영향 등으로 증가하는 추세이며, 정확한 병인은 알려져 있지 않지만 유전적, 환경적 및 면역학적 요인이 복잡하게 연관되어 발병하는 것으로 추측되고 있다.
아토피 피부염의 유병율은 3%에서 15%정도 보고되고 있으며, 유아의 경우 약 10%가 아토피 피부염을 가지고 있는 것으로 보고되고 있고, 대부분의 유아는 알레르기 비염이나 천식으로 진행된다.
아토피 피부염에서는 말초혈액의 CD8+ T 임파구의 감소가 관찰되고 결과적으로 CD4:CD8 비율이 증가하게 된다. 이런 현상이 전신적인 세포매개 면역의 감소를 유도하지는 않지만 피부 면역의 저하를 초래하여 아토피 피부염 환자에게서 바이러스나 세균감염이 빈발하게 되고, 접촉 알레르겐(allergen)에 대한 반응이 저하되는 현상이 발생한다. 또한, CD4+ T 임파구 중에서 INF-γ 와 TNF-β를 분비하여 정상적인 세포매개 면역에 관여하는 Th1의 수는 감소하게 되고 IL-4를 분비하여 알러지 반응을 유발하는 IgE의 생산을 증가시키고 알러지 반응에 직접 관여하는 Th2의 수는 증가하게 된다. 또한, 아토피 피부염 환자의 80%는 혈청 IgE가 정상인에 비해 높으며, 증상이 심할수록 그 수치가 높은 경향이 있다. 또한, 아토피 환자에게서 표피 장벽의 손상이 관찰되는데, 이는 표피 각질층에서 각질 세포사이의 지질 성분인 세라마이드 (ceramide)의 부족이 아토피 피부염에서 경피 수분손실을 증가시켜 건조함을 유발하는 것으로 추정된다.
현재, 아토피 치료제로 시판되고 있는 아토피 관련제품으로는 스테로이드계 또는 식물추출물을 소재로 하고 있다. 그러나, 상기 스테로이드계는 부작용과 내성으로 소비자들이 기피하고 있는 실정이고, 대부분의 아토피관련 제품은 식물추출물을 원료로 사용하고 있으나 그 약효는 아토피 환자들을 만족시키지는 못하고 있다. 따라서 아토피 피부염의 예방, 개선, 치료에 관한 공지문헌 및 시제품이 많이 있음에도 불구하고, 여전히 아토피 피부염에 대해 효과가 높고 독성이 없는 새로운 물질 및 제제의 개발이 요구되고 있다.
상기한 배경하에, 본 발명자들은 아토피 피부염에 보다 효과적인 아토피 피부염 치료제를 개발하고자 연구를 거듭하던 중, 본 발명에 따른 화합물이 알레르기 질환의 진행에 염증을 유발하는 것으로 알려져 있는 CHI3L1 (Chitinase 3 like 1)을 효과적으로 억제할 뿐 아니라, PA (phthalic anhydride) 유도 아토피 동물 모델에서 아토피 치료효과를 나타내고, 염증세포의 침윤을 억제하며, 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키고, 염증 유전자의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 억제하는 것을 실험으로 확인하여 아토피 피부염 질환 치료효과를 확인한 바, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 아토피 피부염에 보다 효과적인 아토피 피부염 치료제를 제공하는 것으로, 알레르기 질환의 진행에 염증을 유발하는 것으로 알려져 있는 CHI3L1를 효과적으로 억제하며, 아토피 피부염과 관련하여 염증세포의 침윤을 억제하고, 염증성 사이토카인 발현을 감소시키고, NF-κB의 활성을 억제하는 효과를 나타내는 등 아토피 피부염에 예방 또는 치료의 효과를 나타내는 유효성분의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 아토피 피부염의 예방 또는 치료 약물의 제조에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명 조성물의 유효성분 화합물은 알레르기 질환의 진행에 염증을 유발하는 것으로 알려져 있는 CHI3L1에 결합하여 그 기능을 저해시키는 저해제로서 작용하며, 아토피 피부염 유발 동물모델에서 염증세포의 침윤을 억제하고, 염증성 사이토카인 발현을 감소시키고, NF-κB의 활성을 억제하는 효과를 나타내는 등 아토피 피부염에 유효한 효과를 나타내는 바, 본 발명에 의해 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공되는 유용한 효과가 달성된다.
도 1a는 PA (phthalic anhydride) 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 본 발명 화합물 처리에 마우스 등 부위 피부 변화를 관찰하여 나타낸 사진이다.
도 1b는 PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 본 발명 화합물 처리에 따른 아토피 피부염 임상 점수와 표피 두께 변화를 관찰하여 나타낸 그래프이다.
도 1c는 PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 본 발명 화합물 처리에 따른 비만 세포 수 변화를 관찰하여 나타낸 그래프이다.
도 1d는 PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 본 발명 화합물 처리에 따른 혈청 IgE 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 1e는 PA (phthalic anhydride) 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 본 발명 화합물 처리에 따른 림프절 무게 변화를 관찰하여 각각 사진과 그래프로 나타낸 것이다.
도 2a는 PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 피부 조직에서 본 발명 화합물 처리에 따라 변화되는 아토피 관련 사이토카인 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 수준을 ELISA로 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 2b는 PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 피부 조직에서 본 발명 화합물 처리에 따라 변화되는 아토피 관련 사이토카인 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 2c는 각질세포인 HaCaT 세포에서 본 발명 화합물 전처리하고 2시간 후 TNF-α 및 IFN-γ으로 추가 4시간 처리 후 측정된 아토피 관련 사이토카인 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 피부 조직에서 본 발명 화합물 처리에 따라 변화되는 아토피 관련 사이토카인 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-31, IL-33 및 CCL17의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 3b는 각질세포인 HaCaT 세포에서 본 발명 화합물 전처리하고 2시간 후 TNF-α 및 IFN-γ으로 추가 4시간 처리 후 측정된 아토피 관련 사이토카인 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 4a는 PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 피부 조직에서 본 발명 화합물 처리에 따른 NF-κB 신호 전달의 활성 변화를 관찰한 것으로, IκBα의 인산화도, p65와 p50의 핵으로의 Translocation 변화를 측정한 웨스턴블롯과 이를 정량화 하여 나타낸 그래프이다.
도 4b는 PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 피부조직에서 IHC (immunohistochemistry)를 진행하여 확인한 본 발명 화합물 처리에 따른 인산화 된 p65의 발현 변화를 나타낸 사진이다.
도 4c는 각질세포인 HaCaT 세포에서 본 발명 화합물 전처리하고 2시간 후 TNF-α 및 IFN-γ으로 추가 4시간 처리 후 NF-κB 신호 전달의 활성 변화를 관찰한 것으로, IκBα의 인산화도, p65와 p50의 핵으로의 Translocation 변화를 측정한 웨스턴블롯과 이를 정량화 하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 RHS (reconstructed human skin) 모델에서 6일 동안 AD (아토피 피부염) 칵테일 (30 ng/mL IL-4, 30 ng/mL IL-13 및 3.5 ng/mL TNF-a)로 배양한 후, 본 발명 화합물 처리에 따른 조직학적 변화를 확인하기 위하여 H&E 염색으로 표피 두께 (Epidermal thickness)를 관찰한 사진과 이를 정량화 하여 나타낸 그래프이다.
도 5b는 RHS (reconstructed human skin) 모델에서 6일 동안 AD (아토피 피부염) 칵테일 (30 ng/mL IL-4, 30 ng/mL IL-13 및 3.5 ng/mL TNF-a)로 배양한 후, 본 발명 화합물 처리에 따른 COX-2, CHI3L1, p65 및 p-IκBα의 발현 변화를 측정한 웨스턴블롯과 이를 정량화 하여 나타낸 그래프이다.
도 5c는 RHS (reconstructed human skin) 모델에서 6일 동안 AD (아토피 피부염) 칵테일 (30 ng/mL IL-4, 30 ng/mL IL-13 및 3.5 ng/mL TNF-a)로 배양한 후, 본 발명 화합물 처리에 따른 IL-1β, IL-6 및 CHI3L1의 수준 변화를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5d는 RHS (reconstructed human skin) 모델에서 6일 동안 AD (아토피 피부염) 칵테일 (30 ng/mL IL-4, 30 ng/mL IL-13 및 3.5 ng/mL TNF-a)로 배양한 후, 본 발명 화합물 처리에 따른 IL-1β, IL-6 및 CHI3L1의 수준 변화를 qPCR로 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00002
.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 2-(3-[2-(1-시클로헥센-1-일)에틸]-6,7-디메톡시-4-옥소-3,4-디히드로-2-퀴나졸리닐술파닐)-N-(4-에틸페닐)부탄아미드는 알레르기 질환의 진행에 염증을 유발하는 것으로 알려져 있는 CHI3L1에 결합하여 그 기능을 저해시키는 저해제로서 작용하며, 아토피 피부염 관련 증상인 염증세포의 침윤을 억제하고, 염증성 사이토카인 발현을 감소시키고, NF-κB의 활성을 억제하는 효과를 나타내는 바, 아토피 피부염 예방, 개선 및 치료에 유효한 효과를 나타내는 바, 이를 유효성분으로 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, PA (phthalic anhydride) 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 PA 처리된 등 부위 피부 변화를 관찰한 결과, 육안으로 보아 아토피 피부염의 증상이 현저하게 개선됨을 확인하였고, H&E 염색하여 확인한 조직학적 분석에서도 유의적으로 아토피 피부염의 증상이 개선됨이 확인되며, 비만 세포 수 역시 감소하는 것을 확인하였다(도 1a 참조).
본 발명의 다른 구체예에서, PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 아토피 피부염 임상점수, 표피 두께 및 비만 세포 수를 정량화 하여 나타낸 결과, PA로 유의적으로 높아진 수치가 본 발명 화합물 처리에 따라 임상점수, 표피 두께 및 비만 세포 수 모든 측면에서 감소되는 것을 확인하였다(도 1b 및 1c 참조).
본 발명의 또 다른 구체예에서, PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 혈청 IgE 농도 변화를 정량화 하여 나타낸 결과, PA로 유의적으로 높아진 수치가 본 발명 화합물 처리에 따라 혈청 IgE 농도가 감소하는 것을 확인하였다(도 1d 참조).
본 발명의 다른 구체예에서, PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서 피부 림프절 무게의 변화를 측정한 결과, PA 유도로 무게와 크기가 증가하였던 림프절이 본 발명 화합물 처리에 따라 크기가 확연하게 줄며, 무게도 감소되는 것을 확인하였다(도 1e 참조).
본 발명의 또 다른 구체예에서, PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 피부 조직에서 아토피 관련 사이토카인 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 수준을 ELISA와 qPCR로 확인한 결과, PA 유도로 증가되었던 수준이 본 발명 화합물 처리에 따라 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 2a, 2b 및 도 3a 참조).
본 발명의 다른 구체예에서, 각질세포인 HaCaT 세포에서 본 발명 화합물 전처리 후 TNF-α 및 IFN-γ 처리로 염증을 유발한 후 측정된 아토피 관련 사이토카인 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 결과, 본 발명 화합물 처리에 의해 염증과 관련된 사이토카인이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 2c 및 3b 참조).
본 발명의 또 다른 구체예에서, PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 피부 조직과 각질세포인 HaCaT 세포에서 본 발명 화합물 전처리 후 TNF-α 및 IFN-γ 처리로 염증을 유발한 후 NF-κB 신호 전달의 활성 변화를 관찰한 결과, PA로 상승된 IκBα의 인산화도, p65와 p50의 핵으로의 Translocation이 본 발명 화합물 처리에 따라 유의하게 감소하는 것을 확인하여 NF-κB 신호 전달의 활성화가 감소하는 것을 확인하였다(도 4a 및 4c 참조).
본 발명의 다른 구체예에서, PA 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 피부조직에서 IHC (immunohistochemistry)로 인산화 된 p65의 발현 변화를 확인한 결과, 본 발명 화합물 처리에 따라 인산화 된 p65의 발현이 감소된 것을 확인하였다(도 4b).
본 발명의 또 다른 구체예에서, AD 칵테일로 유도 된 RHS (reconstructed human skin)에서 표피 두께 변화를 관찰한 결과, AD 칵테일 처리 되어 나타난 표피 두께 대비 본 발명 화합물 처리에 따라 표피 두께가 유의하게 감소됨을 화인하였다(도 5a 참조).
본 발명의 다른 구체예에서, AD 칵테일로 유도 된 RHS에서 COX-2, CHI3L1, p65 및 p-IκBα의 발현 변화를 측정한 결과, AD 칵테일 처리에서 발현 대비 본 발명 화합물 처리에 따라 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 5b 참조).
본 발명의 또 다른 구체예에서, AD 칵테일로 유도 된 RHS에서 IL-1β, IL-6 및 CHI3L1의 수준을 ELISA와 qPCR로 확인한 결과, 본 발명 화합물 처리에 따라 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 5c 및 5d 참조).
따라서, 본 발명 화학식 1 화합물은 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 유용한 바, 이를 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 히드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노히드로겐 포스페이트, 디히드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다. 본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 입체 이성질체, 수화물 등의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 아토피 피부염의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 아토피 피부염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 아토피 피부염 예방 또는 치료 효과를 가진다고 알려진 약학적 조성물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화할 수 있다.
본 발명에 있어서, "약학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물에서 화학식 1 화합물은 약학적으로 유효한 양으로 포함될 수 있다. "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도 의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도 , 약물의 활성, 약물에 대한 민감도 , 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "개선"은 상기 조성물의 섭취로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도 를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 건강식품이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 피부외용제 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 연고, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 가질 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또한, 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등 다양한 성상으로 적용가능하다
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "대상"란 상기 아토피 피부염이 발병하였거나 발병할 가능성이 있는 포유류와 비포유류를 모두 포함하며, 예를 들어 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 바람직하게 인간이다.
본 발명에 있어서, "투여"란 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도 달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
나아가, 본 발명은 아토피 피부염의 예방 또는 치료 약물의 제조에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 2-(3-[2-(1-시클로헥센-1-일)에틸]-6,7-디메톡시-4-옥소-3,4-디히드로-2-퀴나졸리닐술파닐)-N-(4-에틸페닐)부탄아미드의 준비
ChemDiv Inc. (San Diego, CA, USA)로부터, 2-(3-[2-(1-사이클로헥센-1-일)에틸]-6,7-다이메톡시-4-옥소3,4-다이하이드로-(4-에틸페닐)부탄아미드(K284-6111)를 구입하여 사용하였다.
<실험예 1> PA 동물모델에서 아토피 피부염 증상 관찰
<1-1> PA (phthalic anhydride) 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 준비
6주령 수컷 C57BL/6j 마우스를 7일간의 적응기를 가진 후, 그룹당 6마리의 마우스로 아래와 같이 총 4개의 그룹으로 나누었다.
(1) Control group
(2) PA-유도 아토피 피부염 마우스
(3) PA-유도 아토피 피부염 마우스 + 실시예 1 화합물 (1 mg/mL)
(4) PA-유도 아토피 피부염 마우스 + 실시예 1 화합물 (2 mg/mL)
PA 용액을 각 그룹의 마우스 등쪽 피부에 4 주 동안 일주일에 3 번 국소적으로 도포했다. 한편, 본 발명 실시예 1 화합물은 표시된 용량으로 PA 용액을 도포하고 2시간 후에 도포되었다.
<마우스 모델 처리 방법>
C57BL/6J (8 주령, n = 40)는 무작위로 세 그룹으로 나누었다. 첫 번째 그룹 (PA, n = 10)에는 5 % 무수 프탈산 용액 200μl (10μl/cm2)를 등 피부에 4 주 동안 일주일에 3 번 도포하였다. 두 번째 그룹 (실시예 1 화합물, 1 mg/kg, n = 10) 및 세 번째 그룹 (실시예 1 화합물, 2 mg/kg, n = 10)은 PA를 도포하고, 3시간 후 각각 200 μl의 1 mg/ml 및 2 mg/ml의 실시예 1 화합물(10 μg/cm2 또는 20 μg/cm2)을 도포하였다. 연령대가 일치하는 C57BL/6J가 대조군으로 사용되었다 (Control, n = 10). 실험 기간이 끝나는 시점에 마우스를 희생시키고 혈액 샘플을 수집하였다.
<1-2> 실험 방법
<체중 및 림프절 무게 측정>
실험 절차 동안 체중의 변화는 전자 저울 (Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)으로 4 주 동안 일주일에 한 번씩 측정되었다. 희생 된 마우스로부터 수집 된 림프절의 무게도 동일한 방법으로 측정되었다.
<IHC 염색>
마우스에서 등 피부를 제거하고 10 % 포르말린으로 고정하고 파라핀 왁스에 묻혀 일상적으로 가공 한 다음 5μm 두께의 조각으로 절편했다. 피부 절편은 헤마톡실린과 에오신 (H&E)으로 염색되었다. 제조사의 지침에 따라 비만 세포를 톨루이딘 블루 용액으로 염색했다 (IHC World, Ellicott City, MD, USA). Leica Application Suite (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 표피의 두께를 측정했다.
<ELISA 분석>
혈청 IgE와 피부 조직의 사이토카인은 제조사의 지침에 따라 KOMA Biotech (Seoul, Korea)과 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 제공된 ELISA 키트로 측정했다. 인간 혈청 LTF 수준은 LTF ELISA 키트 (myBioSource, San Diego, CA, USA)로 분석하였다.
<세포 배양>
HaCaT 각질 세포주는 Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea)에서 구입했다. 이들 세포는 5% CO2의 가습 분위기에서 10% FBS, 페니실린 (100 units/ml) 및 스트렙토마이신 설페이트 (100 μg/ml)가 보충 된 DMEM 배지에서 37℃에서 배양하였다. 에탄올에 용해된 다양한 농도 (0.5, 1 및 2 μM)의 실시예 1 화합물 또는 양성대조군 화합물로 세포를 처리하고, 도면에 표시된 시간 동안 TNF-α 및 IFN-γ (20 μg/ml)으로 자극하였다. 사용 된 에탄올의 최종 농도는 0.05 % 미만이다. 비히클 대조군으로서 세포를 0.05 % 에탄올로 처리하였다.
<siRNA 형질감염>
HaCaT 세포는 제조사의 지침(Invitrogen)에 따라 OPTI-MEM에서 Lipofectamine 3000 (플라스미드 벡터용) 및 RNAiMAX (siRNA용) 시약을 사용하여 CHI3L1 플라스미드 벡터, CHI3L1 siRNA 또는 LTF siRNA로 형질감염 시켰다.
<웨스턴블롯 분석>
피부 문제가 있는 세포를 100 mg 또는 약 1 x 106를 준비하고, 용해 완충액으로 균질화 하였다. [용해 완충액: 50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.02% sodium azide, 0.2% SDS, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 10 μl/ml aprotinin, 1% igapel 630 (Sigma Chem. Co. St. Louis, MO, USA), 10 mM NaF, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA and 0.5% sodium deoxycholate]. 이후, 추출물은 30 분 동안 13,000g에서 원심 분리되었다. 동량의 단백질(20 μg)을 SDS/10% 폴리아크릴아미이드 겔에서 분리한 다음, 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼다. 블롯은 0.05% 트윈-20을 함유하는 Tris 완충 식염수 [10mM Tris (pH 8.0) 및 150mM NaCl] 용액 중 5% (w / v) BSA로 실온에서 1 시간 동안 차단되었다. 막은 특정 항체와 함께 실온에서 4 시간 동안 배양되었다: rabbit polyclonal antibodies against COX-2 (1:500) (Abcam), rabbit polyclonal antibodies against p65, p50, p-IκB-α, IκB-α (1:500), (Cell Signaling) 및 mouse monoclonal antibody against actin (1:500) (sigma)을 사용하였다. 이어서 블롯을 상응하는 conjugated anti-rabbit immunoglobulin G-horseradish peroxidase (Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA, USA)와 함께 배양하였다. 면역 반응성 단백질은 ECL (Enhanced chemiluminoscent) 웨스턴 블 롯팅 검출 시스템으로 검출되었다.
<통계 분석>
모든 실험은 3 회 반복되었고, 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 5 소프트웨어 (버전 5.03; GraphPad software, Inc., San Diego, CA)로 수행되었다. 그룹 차이는 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트로 분석되었다. 모든 값은 평균 ± SD로 표시된다. 유의성은 모든 테스트에 대해 p <0.05로 설정되었다.
<1-3> 실험 결과
도 1a와 같이, 실시예 1 화합물 처리에 따라 농도 의존적으로 육안으로 보아 아토피 피부염의 증상이 현저하게 개선됨을 확인하였고, H&E 염색하여 확인한 조직학적 분석에서도 유의적으로 아토피 피부염의 증상이 개선됨이 확인되며, 비만 세포 수 역시 감소하는 것을 확인하였다.
도 1b 및 1c와 같이, 실시예 1 화합물 처리에 따라 농도 의존적으로 임상점수, 표피 두께 및 비만 세포 수 모두 감소하는 유의성을 확인하였다.
도 1d와 같이, 실시예 1 화합물 처리에 따라 농도 의존적으로 혈청 IgE 농도가 감소하는 것을 확인하였다.
도 1e와 같이, 실시예 1 화합물 처리에 따라 농도 의존적으로 림프절의 크기와 무게가 확연하게 줄어드는 것을 확인하였다.
<실험예 2> PA 동물모델에서 아토피 피부염 관련 사이토카인 측정
<2-1> 실험 방법
상기 실험예 1-1에서 준비된 각각의 실험군 마우스에서 피부 조직을 채취하여 ELISA와 qPCR을 실시하여 아토피 피부염 관련 사이토카인의 변화를 관찰하고, 그 결과를 각각 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
<2-2> 실험 결과
도 2a 및 2b에서 확인되는 바와 같이, PA 유도로 증가되었던 수준이 본 발명 화합물 처리에 따라 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 염증 유도 각질세포에서 아토피 피부염 관련 사이토카인 측정
<3-1> 실험 방법
각질세포인 HaCaT 세포에서 아토피 관련 사이토카인의 변화를 확인하기 위하여 먼저 본 발명 실시예 1 화합물을 0.5, 1, 2 μM로 전처리하였고, 2 시간 후 세포를 TNF-α 및 IFN-γ 조 (20 ng/mL)으로 추가 4 시간 동안 처리했다. 이후 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 mRNA 발현을 qPCR로 분석 하였고, 그 결과를 도 2c에 나타내었다.
<3-2> 실험 결과
도 2c와 같이, TNF-α 및 IFN-γ 처리로 증가 된 아토피 피부염 관련 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 mRNA 발현 수준이 본 발명 화합물 처리에 따라 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.
<실험예 4> PA 동물모델에서 아토피 피부염 관련 사이토카인 측정
<4-1> 실험 방법
상기 실험예 1-1에서 준비된 각각의 실험군 마우스에서 피부 조직을 채취하여 ELISA와 qPCR을 실시하여 아토피 피부염 관련 사이토카인 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-31, IL-33 및 CCL17의 수준 변화를 관찰하고, 그 결과를 각각 도 3a에 나타내었다.
<4-2> 실험 결과
도 3a와 같이, PA 유도로 증가되었던 아토피 피부염 관련 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-31, IL-33 및 CCL17의 수준이 본 발명 화합물 처리에 따라 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.
<실험예 5> 염증 유도 각질세포에서 아토피 피부염 관련 사이토카인 측정
<5-1> 실험 방법
각질세포인 HaCaT 세포에서 아토피 관련 사이토카인의 변화를 확인하기 위하여 먼저 본 발명 실시예 1 화합물을 0.5, 1, 2 μM로 전처리하였고, 2 시간 후 세포를 TNF-α 및 IFN-γ 조 (20 ng/mL)으로 추가 4 시간 동안 처리했다. 이후 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 mRNA 발현을 qPCR로 분석 하였고, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.
<5-2> 실험 결과
도 3b와 같이, TNF-α 및 IFN-γ 처리로 증가 된 아토피 피부염 관련 CHI3L1, IL-1β, IL-6, TSLP의 mRNA 발현 수준이 본 발명 화합물 처리에 따라 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.
<실험예 6> PA 동물모델에서 NF-κB 활성 억제 효과
<6-1> 실험 방법
상기 실험예 1-1에서 준비된 각각의 실험군 마우스에서 피부 조직을 채취하여 염증 반응과 높은 상관관계가 있는 NF-κB 신호 전달에 대하여 웨스턴 블롯 분석하였다. 구체적으로, IκBα의 인산화도와 p50 및 p65 단백질 발현과 핵 전이를 조사하였고, 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.
<6-2> 실험 결과
도 4a에서 확인되는 바와 같이, PA 도포에 의해 증가 된 IκBα의 인산화와 p50 및 p65의 핵 전이는 본 발명 실시예 1 화합물 처리에 의해 억제되는 것이 확인되고 NF-κB 신호 전달의 활성화가 감소되는 것을 알 수 있다.
한편, 도 4b에서 확인되는 바와 같이, 피부조직의 각질세포 부분에서 본 발명 실시예 1 화합물 처리에 따라 발현 정도가 감소되는 것이 확인되었다.
<실험예 7> 염증 유도 각질세포에서 NF-κB 활성 억제 효과
<7-1> 실험 방법
각질세포인 HaCaT 세포에서 아토피 관련 사이토카인의 변화를 확인하기 위하여 먼저 본 발명 실시예 1 화합물을 0.5, 1, 2 μM로 전처리하였고, 2 시간 후 세포를 TNF-α 및 IFN-γ 조 (20 ng/mL)으로 추가 4 시간 동안 처리했다. 이후 NF-κB 신호 전달에 대하여 웨스턴 블롯 분석하였다. 구체적으로, IκBα의 인산화도와 p50 및 p65 단백질 발현과 핵 전이를 조사하였고, 그 결과를 도 4c에 나타내었다.
<7-2> 실험 결과
도 4c에서 확인되는 바와 같이, PA 도포에 의해 증가 된 IκBα의 인산화와 p50 및 p65의 핵 전이는 본 발명 실시예 1 화합물 처리에 의해 억제되는 것이 확인되고 NF-κB 신호 전달의 활성화가 감소되는 것을 알 수 있다.
<실험예 8> AD-염증 유도 RHS 모델에서 항염증 효과
<8-1> 실험 방법
AD-염증 유도 RHS (reconstructed human skin) 모델은 6일 동안 AD 칵테일 (AD cocktail consisting of 30 ng/mL of IL-4, 30 ng/mL of IL-13, and 3.5 ng/mL of TNF-a) 에 의해 배양되었다. H&E 염색은 AD-RHS의 조직학적 변화를 확인하기 위하여 수행하고 도 5a에 나타냈으며, 염증과 관련한 COX-2, CHI3L1, p65 및 p-IκBα의 발현을 웨스턴블롯 분석하여 도 5b에 나타내었고, IL-1β, IL-6 및 CHI3L1의 수준은 qPCR과 ELISA로 측정하여 도 5c 및 도 5d에 나타내었다.
<8-2> 실험 결과
도 5a와 같이, AD 칵테일 처리 되어 나타난 표피 두께 대비 실시예 1 화합물 처리에 따라 표피 두께가 유의하게 감소됨을 화인하였다.
도 5b와 같이, AD 칵테일 처리에서 증가 된 발현 대비 실시예 1 화합물 처리에 따라 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.
도 5c 및 5d에 도시된 바와 같이, AD 칵테일로 유도 된 RHS에서 IL-1β, IL-6 및 CHI3L1의 수준이 증가된 반면, 실시예 1 화합물 처리에 따라 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00003
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 CHI3L1 단백질 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 피부조직 또는 각직세포에서의 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-31, IL-33, CCL17 및 TSLP의 분비를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 NF-κB 신호 전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 피부조직 또는 각직세포에서의 IκBα의 인산화를 억제하고, p65와 p50의 핵으로의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 아토피 피부염 임상 증상을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 아토피 피부염 임상 증상은 환부의 염증, 환부의 표피 두께 증가, 비만 세포 수 증가, 또는 혈청 IgE 농도 증가인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00004
    .
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 피부외용제 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00005
    .
  10. 제9항에 있어서,
    상기 피부외용제 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 연고, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
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