KR20220059913A - 유전자 교정을 이용한 조로증 및 자연노화의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 교정을 이용한 조로증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 조로증의 원인이 되는 프로게린을 암호화하는 mRNA에 혼성화되는 sgRNA 및 이에 작용하는 Cas13 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고 있어, 치료 대상의 세포 내에 도입되어 프로게린을 암호화하는 mRNA만을 선택적으로 절단한다. 이는 종래 farnesyltransferase inhibitor(FTI)를 사용한 방법에 비하여 다른 치료제와의 복합 처방이 필요 없고, 부작용도 적다. 또한, DNA 수준에서 상동 재조합(homologous recombination, HR)을 이용한 치료보다 효율이 높고, 가역적으로 이루어질 수 있고, RNAi(RNA interference)를 이용한 표적 치료에 비해 특이적으로 적용할 수 있으면서 부작용도 적다. 또한, DNA에 직접 작용하여 비가역적이 결과를 나타내는 CRISPR/Cas9을 이용한 치료에 비해 가역적이면서 프로게린을 암호화하는 mRNA만을 선택적으로 절단할 수 있어 안전성을 확보할 수 있다.
Description
본 발명은 유전자 교정을 이용한 조로증 및 자연노화의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
조로증(HGPS: Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome)은 lamin A(LMNA) 유전좌상의 점돌연변이(p.G608G, c.C1824T)에 의한 희귀 유전질환이다. 현재까지 조사된 환자중에서 높은 비율의 환자수가 LMNA 유전자의 점 돌연변이(p.G608G, c.C1824T)를 가지고 있다. 이러한 유전자 변이는 정상적인 유전자 발현과는 달리, 선택적 스플라이싱(alternative splicing)을 유도하여 비정상적인 lamin A 단백질 (progerin, 프로게린)을 발현시키고, 핵막에 축적되고 정상적인 lamin A의 기능을 방해하여 세포의 사멸을 유도한다. 또한 정상적인 사람들이 나이가 들거나 자외선(UV)에 노출에 의해서도 프로게린이 증가되어 노화를 일으키는 원인으로 보고되는 연구들이 소개되었다[2014, Aging, Pacheco et al., 2013, J Invest Dermatol, Takeuchi et al., 2011, J Clin Invest, Cao et al.]. 이에 따라 나타나는 표현형으로 조로증이라 명명되고 있고 이를 치료하기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있다.
최근 치료제의 부작용이나 내성을 줄이고자 유전자 수준에서 변형된 단백질을 적중시키려는 시도가 있었다. 이중에 대표적인 시도가 RNAi(RNA interference) 혹은 HR(Homologous recombination)을 이용한 방법이다[2005, Hum Genet, Shurong Huang et al., 2011, Cell Stem Cell, Guang-Hui Liu et al.]. 그러나 기존 RNAi 혹은 HR을 이용한 방법들은 효율이 낮거나 특정 유전자 적중이 부정확하다는 문제점이 존재했다. 최근 CRISPR/Cas9 기술의 발달함에 따라 정교하게 프로게린을 치료하는 연구가 보고되었다[2019, Nat Med, Ergin Beyret et al., 2019 Nat Med, OlayaSantiago-Fernandez et al.]. 하지만 DNA상에서는 CRISPR/Cas9이 lamin A와 프로게린을 구분하지 못하기 때문에 HGPS 질병의 원인이 되는 프로게린만을 타겟으로 자르는 것뿐만 아니라 정상적인 lamin A도 줄어들게 되었다. 그리고 CRISPR/Cas9 시스템의 가장 큰 단점은 비특이적 타겟(off-target)에 대해서도 결합하여 자르기 때문에 이미 잘린 DNA는 다시 원래대로 수복되는 것은 불가능하기 때문에 안정성 문제가 항상 뒤따른다.
따라서 이를 극복하고자 이와 같은 비가역적인 CRISPR/Cas9의 한계를 극복하고 정확히 HGPS의 문제를 일으키는 프로게린(구체적으로, 프로게린 mRNA)만을 선별하는 RNA 유전자 적중 시스템(CRISPR/Cas13)을 도입하였다. RNA 유전자 적중 시스템(CRISPR/Cas13)은 박테리아 면역시스템의 일종으로, Cas13 라는 단백질과 표적 RNA에 상보적인 가이드 RNA를 기반으로 작동하며, 표적 RNA를 정확하게 잘라내어 발현을 조절할 수 있는 특징이 있다. 본 발명은 표적 특이적인 RNA 유전자 적중 시스템(CRISPR/Cas13)을 기반으로 조로증 유발 유전자 변이를 RNA수준에서 적중하여 비영구적이고 효과적인 치료가 가능하도록 고안하였다.
본 발명의 일 양상은 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 gRNA를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 gRNA; 및 Cas13 mRNA 또는 이로부터 유래된 Cas 13 단백질을 포함하는 프로게린 발현 저해용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상보적인 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 프로게린 발현 저해용 조성물 또는 상기 재조합 발현벡터 및 Cas13 발현벡터를 포함하는 프로게린 발현 저해용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조로증 및 자연노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 조로증 치료 및 자연노화 개선 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 일 양상은 조로증 치료 및 자연노화 개선을 위한 상기 재조합 발현벡터의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그리고, 본 발명의 다른 일 양상은 조로증 및 자연노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 상기 재조합 발현벡터의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 사용되는 용어, '프로게린'은 lamin A 단백질의 비정상적 발현 형태로서, 구체적으로 lamin A 단백질을 암호화하는 유전좌 상의 점돌연변이(p. G608G, c.C1824T)가 발생된 채 발현되는 비정상 lamin A 단백질이다. 전술한 lamin A의 유전자에 돌연변이가 발생하면 단백질 형성에 필요한 아미노산 서열을 바꾸지는 않지만, mRNA의 전사과정에서 비정상적 스플라이싱(선택적 스플라이싱, alternative splicing)이 형성되어 엑손 11 번의 COOH 말단 일부분이 결손된(150bp 결손) 형태로 비정상적 lamin A(프로게린, progerin)이 생성된다. 이렇게 형성된 프로게린은 dominant negative 한 방식으로 생체 내에서 작동하여 세포단위에서는 비정상적 핵막형성을 보이고, 개체 단위에서 조로증과 관련된 표현형(왜소증, 머리카락 빠짐, 피부질환, 몸무게 감소, 지방이상 등)이 나타난다.
본 발명에서 사용되는 용어, 'lamin A'는 라민단백질의 일종으로, 라민 단백질은 핵막의 내막에 연결된 단백질로 핵막의 필수적인 구조로서 간기의 핵 구조를 유지하는데 중요한 역할을 하는 중간섬유(intermediate filament)의 일종이다. 이들은 다른 중간 섬유처럼 작은(약 20잔기) 비-선형 아미노 말단 서열에 의해 플랭킹(flanking)되는 중심의 알파 선형 간상 도메인과 더욱 큰 카복시-말단 구형 도메인으로 구성된다. 또한, lamin A 단백질은 라민 A 유전자(LMNA)의 단일 1차 전사로부터 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 lamin C 단백질과 함께 생성된다.
본 발명에서 사용되는 용어 '프로게린 mRNA'는 전술한 프로게린, 즉 비정상적으로 발현된 lamin A 단백질을 암호화하는 mRNA를 의미하고, 구체적으로는 lamin A 단백질을 암호화하는 유전좌 상의 점돌연변이(p. G608G, c.C1824T), 구체적으로 점돌연변이(p. G608G)를 가진 체 번역된 mRNA를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, " gRNA (가이드 RNA, guide RNA) "는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, gRNA는 Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져올 수 있다. gRNA는 crRNA 및 tracrRNA일 수 있고, 또는, crRNA와 tracrRNA가 하나로 연결된 gRNA일 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 전사하여 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA가 제조될 수 있고, 상기 gRNA는 CRISRP/Cas13과 작용하여 프로게린 mRNA를 선택적으로 절단할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 염기서열을 암호화하는 뉴클레오티드로부터 전사되는 gRNA는 정상적인 lamin A 단백질을 암호화하는 mRNA 및 비특이적 타켓 (off-target)에는 결합하지 않아 더욱 정밀한 치료 및 가역적인 치료가 가능하다.
본 발명의 서열번호 1 내지 5중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열은 해당 서열 뿐만 아니라, 상기 서열과 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열로서 프로게린 mRNA 또는 LMNA 유전자의 엑손 11 및 엑손 12을 암호화하는 유전자에 혼성화 하는 gRNA를 전사할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함하며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 서열이라면 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열을 갖는 경우에도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 다른 일 양상은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 gRNA를 제공한다.
상기한 바와 같이 본 발명의 상기 gRNA는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 전사함으로써 얻어질 수 있고, 프로게린 mRNA에 혼성화한 뒤 CRISRP/Cas13과 작용하여 프로게린 mRNA를 선택적으로 절단할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 gRNA는 LMNA 유전자의 엑손 11 및 엑손 12을 암호화하는 유전자에 혼성화하는 것일 수 있다. 전술한 바와 같이 프로게린은 lamin A 단백질을 암호화하는 유전좌 상의 점돌연변이(p. G608G, c.C1824T)가 발생된 채 발현된 것으로, 프로게린을 암호화하는 mRNA는 전사과정에서 비정상적 스플라이싱으로 인해 엑손 11번의 COOH 말단 일부분이 결손된 채 생성된다(150bp 결손). 이 때 본 발명의 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA는 LMNA 유전자의 엑손 11 및 엑손 12을 암호화하는 유전자에 혼성화되고, CRISRP/Cas13과 작용하여 프로게린 mRNA를 선택적으로 절단할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 gRNA; 및 Cas13 mRNA 또는 이로부터 유래된 Cas 13 단백질을 포함하는 프로게린 발현 저해용 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 gRNA는 전술한 바와 같다.
상기 Cas13 mRNA 또는 이로부터 유래된 Cas 13 단백질은 상기 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 gRNA와 함께 CRISPR/Cas13 시스템으로서 작동한다. 구체적으로, 상기 gRNA는 LMNA 유전자의 엑손 11 및 엑손 12을 암호화하는 유전자에 혼성화되고, CRISRP/Cas13과 작용하여 프로게린 mRNA를 선택적으로 절단할 수 있다.
상기 "CRISPR/Cas13 시스템"은 Cas13 단백질과 싱글 가이드 RNA(single guide RNA)로 구성되어 있는 제 3세대 유전자가위로써, 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 인공제한효소를 말한다. 구체적으로는 박테리아의 적응면역 시스템의 하나로서, 주로 박테리아 파지의 감염에 따른 외부 유전자인 RNA를 특이적으로 제거하는 시스템이다. 주로 박테리아 게놈의 CRISPR cluster로 알려진 영역에서 작용 단백질(effector protein) Cas13과 외부 바이러스에 상보적인 염기서열을 포함한 crRNA(crisprRNA)를 발현시킨다고 알려져 있다. 이들이 결합하여 바이러스 RNA에 바인딩하여 목표물을 잘라 냄으로써 제거하는 기능을 가지고 있고, 타겟 RNA 유전자마다 다양하게 인식하여 반응하는 적응 면역시스템으로 알려져 있다. 이를 응용하여 표적하는 RNA에 상보적인 염기서열을 포함한 crRNA를 제작함으로써 CRISPR-Cas13 단백질과 같이 고등 세포 내부로 전달시키면 표적 RNA의 발현을 제어할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "Cas13 단백질"은 CRISPR/Cas13 시스템에서 필수적인 단백질 요소로써, 크게 REC 도메인(REC lobe)과 NUC 도메인 (NUC lobe)으로 구성되어 있으며 각각 표적 mRNA과의 결합, 절단에 기여한다. 특히 HEPN 도메인의 특정 아미노산 잔기는 mRNA의 핵산의 잘라지기 쉬운 결합(scissile bond)과 결합해 절단함으로써 표적 RNA를 제거한다. CRISPR-Cas13과 결합된 crRNA가 상보적으로 결합하는 표적 RNA의 특정 부분을 프로토스페이서(protospacer) 염기서열이라고 하고, 표적으로 인식되는 주요 인자이다. 표적 RNA를 정확하게 인식함에 있어서 우선 crRNA stem loop 구조는 CRISPR-Cas13 단백질의 REC lobe가 인식하여 바인딩한다. crRNA와 상보적 결합되어 이중나선을 형성한 표적 RNA 영역인 프로토스페이서(protospacer)는 나머지 NUC lobe에 인식되어 절단이 일어나게 된다. CRISPR-Cas13 계열 중에서도 CRISPR-Cas13a 유형은 고등동물 세포에서 표적 RNA 절단 효율성이 높고 비표적 절단이 없이 정확하게 작동한다는 보고가 있다[2017, Nature, Omar O. Abudayyeh et al.]. 또한, 상기 Cas13 단백질은 종래 Cas9 단백질이 가진 문제점 (DNA 상에서 lamin A 와 progerin을 구별하지 못하고, off-target에서도 결합하는 문제 및 비가역적인 문제)을 해결할 수 있다. 상기 Cas13 단백질은 Cas13a, Cas13b, Cas13c가 있으며, 본 발명에서는 구체적으로 Cas13a일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상보적인 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열은 전술한 바와 같다.
상기 "재조합 발현벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 재조합 발현 벡터는 Cas13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 Cas13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 전술한 Cas13 의 mRNA 또는 단백질을 암호화 하는 서열을 의미한다.
본 발명에서는 CRISPR/Cas13 시스템을 활용한 프로게린 mRNA에 특이적으로 작용하는 유전자가위를 이용하여 프로게린 mRNA를 제거한다. 구체적으로, 정상적인 lamin A 단백질을 암호화하는 유전자에 비하여 비정상적인 lamin A 단백질(progerin, 프로게린)을 암호화하는 유전자는 점돌연변이가 발생하여 각각 발현된 mRNA 염기서열의 엑손 11의 말단이 150bp가 제거된 상태로 엑손 12와 발현하게 된다. 이 때 프로게린의 mRNA는 엑손 11말단과 엑손 12의 경계 염기서열이 정상 mRNA와 상이하게 된다. 따라서, 변이 염기서열에 해당하는 상보적인 sgRNA를 제작하여 CRISPR/CAS13와 함께 조로증 환자의 세포 내부에 전달하였을 때, 변이 유전자에 의한 프로게린 mRNA만 선택적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 상기 발현백터는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제원점 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 프로모터는 세포, 예컨대, 진핵 세포(예컨대, 식물 세포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter(예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로 티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나 마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것일 수 있고, 본 발명의 서열번호 6 내지 10중 어느 하나의 서열은 해당 서열 뿐만 아니라, 상기 서열과 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서 실질적으로 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나의 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 서열이라면 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열을 갖는 경우에도 본 발명의 범주에 포함된다.
상기 재조합 발현 벡터는 공지의 방법을 통해 타겟 세포에 도입되고, 재조합 발현 벡터가 발현되어 프로게린 mRNA에 혼성화하는 sgRNA는 타겟 세포 내에서 발현되는 프로게린 mRNA (구체적으로 엑손 11 및 엑손 12)에 결합하고, 여기에 재조합 발현 벡터에서 발현된 Cas13 단백질이 작용하여 프로게린 mRNA를 절단함으로써 조로증을 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 발현벡터 또는 상기 재조합 발현벡터와 Cas13 발현벡터를 포함하는 프로게린 발현 저해용 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 상기 재조합 발현벡터로서 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 단독을 유효성분으로 하거나, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 및 Cas13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 유효성분으로 하거나, 재조합 발현벡터로서 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 단독으로 포함하는 재조합 발현벡터와 Cas13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 유효성분으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물을 프로게린 발현 저해의 목적을 방해하지 않는 한 공지의 물질을 더 포함 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 조로증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "조로증" 또는 "허친슨 길포드 증후군(Hutchinson Gilford progeria syndrome, HGPS)"은 어린 아이들에게 조기 노화 현상이 나타나는 치명적이고 희귀한 유전 질환으로, 구체적으로는 lamin A(LMNA) 유전좌상의 점돌연변이(p.G608G, c.C1824T)에 의한 유전질환이다.
본 발명에서 "예방"은 상기 조성물의 투여로 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 포함한다.
본 발명에서 "치료"는 상기 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕 해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성 제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형 태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 조성물을 치료 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 조로증 치료 및 자연노화 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 양상은 조로증 치료 및 자연노화 개선을 위한 상기 재조합 발현벡터의 용도를 제공한다.
그리고, 본 발명의 다른 일 양상은 조로증 및 자연노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하기 위한 상기 재조합 발현벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터 및 이를 포함하는 조로증 및 자연노화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 조로증의 원인이 되는 프로게린을 암호화하는 mRNA에 혼성화되는 sgRNA 및 이에 작용하는 Cas13 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고 있어, 치료 대상의 세포 내에 도입되어 프로게린을 암호화하는 mRNA만을 선택적으로 절단한다. 이는 종래 farnesyltransferase inhibitor(FTI)를 사용한 방법에 비하여 다른 치료제와의 복합 처방이 필요 없고, 부작용도 적다. 또한, DNA 수준에서 상동 재조합 (homologous recombination, HR)을 이용한 치료보다 효율이 높고, 가역적으로 이루어질 수 있고, RNAi(RNA interference)를 이용한 표적 치료에 비해 특이적으로 적용할 수 있으면서 부작용도 적다. 또한, DNA에 직접 작용하여 비가역적이 결과를 나타내는 CRISPR/Cas9을 이용한 치료에 비해 가역적이면서 프로게린을 암호화하는 mRNA만을 선택적으로 절단할 수 있어 안전성을 확보할 수 있다.
도 1은 조로증의 발생원인이 되는 돌연변이를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에서 이용되는 Cas13의 작용 기전을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 서열번호 1 내지 5에 의해 암호화되는 sgRNA가 혼성화 되는 프로게린 mRNA 내 위치를 나타내는 도면이다.
도 4 내지 9은 실시예 1에서 본 발명의 재조합 발현벡터에 사용된 벡터 (도4) 및 본 발명의 재조합 발현벡터(도 5 내지 도 9)를 나타내는 도면이다.
도 10 및 도 11는 실험예 2-1에 사용된 lamin A 과발현 벡터(도 10) 및 프로게린 과발현 벡터(도 11)이다.
도 12은 실험예 2-2에서 LMNA, Progerin 조건부 과발현 세포주에 이용된 벡터를 나타낸 것으로, 각각 LMNA 조건부 과발현 세포주 제작을 위해 AAVS1 all-in one, H11 all-in one, ERT2CreERT2, Conditional LMNA 벡터를 사용하였고, Progerin 조건부 과발현 세포주 제작을 위해 AAVS1 all-in one, H11 all-in one, ERT2CreERT2, Conditional Progerin 벡터를 사용하였다.
도 13은 실험예 2-2의 LMNA, Progerin 조건부 과발현 세포주 검증 삽입 모식도를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 2-2에 따라 LMNA, Progerin 조건부 과발현 세포주 내 염기서열 삽입 여부를 확인한 결과이다. 구체적으로, WT의 밴드는 외구 과발현 벡터가 삽입되지 않은 세포주이고, WT, Tg 의 2개 밴드로 나타나는 것은 한쪽 allele만 유전자가 삽입된 것을 확인하였다 Heterogeneous).
도 15은 실험예 2-2에 따라 삽입된 벡터가 조건부로 유전자를 발현하는지를 형광 또는 RT-PCR 방법을 통해 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 16는 실험예 2-2에서 LMNA semi RT-PCR primer의 유전자상에 위치를 나타내는 도면이다.
도 17는 실험예 2-2에서 Progerin semi RT-PCR primer의 유전자상에 위치를 나타내는 도면이다.
도 18은 실험예 2-3에서 LMNA 특이적 RT-PCR primer의 유전자상에 위치를 나타내는 도면이다.
도 19은 실험예 2-3에서 Progerin 특이적 RT-PCR primer의 유전자상에 위치를 나타내는 도면이다.
도 20 및 도 21은 실험예 2-3의 in vitro 결과로서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 사용하였을 때 프로게린 mRNA 및 단백질 감소효과를 확인할 수 있다.
도 22 및 도 23은 실험예 3의 결과로서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 사용하였을 때 프로게린 mRNA 및 단백질 감소효과를 확인할 수 있다.
도 24는 실험예 4-1.의 결과로서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 도입한 실험군의 형광 분석 결과를 확인할 수 있다.
도 25 및 26은 실험예 4-2.의 결과로서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 도입한 실험군에서 프로게린 및 노화 관련 유전자 발현 감소를 확인할 수 있다.
도 2는 본 발명에서 이용되는 Cas13의 작용 기전을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 서열번호 1 내지 5에 의해 암호화되는 sgRNA가 혼성화 되는 프로게린 mRNA 내 위치를 나타내는 도면이다.
도 4 내지 9은 실시예 1에서 본 발명의 재조합 발현벡터에 사용된 벡터 (도4) 및 본 발명의 재조합 발현벡터(도 5 내지 도 9)를 나타내는 도면이다.
도 10 및 도 11는 실험예 2-1에 사용된 lamin A 과발현 벡터(도 10) 및 프로게린 과발현 벡터(도 11)이다.
도 12은 실험예 2-2에서 LMNA, Progerin 조건부 과발현 세포주에 이용된 벡터를 나타낸 것으로, 각각 LMNA 조건부 과발현 세포주 제작을 위해 AAVS1 all-in one, H11 all-in one, ERT2CreERT2, Conditional LMNA 벡터를 사용하였고, Progerin 조건부 과발현 세포주 제작을 위해 AAVS1 all-in one, H11 all-in one, ERT2CreERT2, Conditional Progerin 벡터를 사용하였다.
도 13은 실험예 2-2의 LMNA, Progerin 조건부 과발현 세포주 검증 삽입 모식도를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 2-2에 따라 LMNA, Progerin 조건부 과발현 세포주 내 염기서열 삽입 여부를 확인한 결과이다. 구체적으로, WT의 밴드는 외구 과발현 벡터가 삽입되지 않은 세포주이고, WT, Tg 의 2개 밴드로 나타나는 것은 한쪽 allele만 유전자가 삽입된 것을 확인하였다 Heterogeneous).
도 15은 실험예 2-2에 따라 삽입된 벡터가 조건부로 유전자를 발현하는지를 형광 또는 RT-PCR 방법을 통해 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 16는 실험예 2-2에서 LMNA semi RT-PCR primer의 유전자상에 위치를 나타내는 도면이다.
도 17는 실험예 2-2에서 Progerin semi RT-PCR primer의 유전자상에 위치를 나타내는 도면이다.
도 18은 실험예 2-3에서 LMNA 특이적 RT-PCR primer의 유전자상에 위치를 나타내는 도면이다.
도 19은 실험예 2-3에서 Progerin 특이적 RT-PCR primer의 유전자상에 위치를 나타내는 도면이다.
도 20 및 도 21은 실험예 2-3의 in vitro 결과로서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 사용하였을 때 프로게린 mRNA 및 단백질 감소효과를 확인할 수 있다.
도 22 및 도 23은 실험예 3의 결과로서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 사용하였을 때 프로게린 mRNA 및 단백질 감소효과를 확인할 수 있다.
도 24는 실험예 4-1.의 결과로서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 도입한 실험군의 형광 분석 결과를 확인할 수 있다.
도 25 및 26은 실험예 4-2.의 결과로서, 본 발명의 재조합 발현벡터를 도입한 실험군에서 프로게린 및 노화 관련 유전자 발현 감소를 확인할 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 프로게린 mRNA에 혼성화하는 sgRNA의 선별
조로증의 원인이 되는 프로게린을 암호화하는 mRNA에 혼성화 하는 sgRNA(구체적으로 crRNA)를 선별하였다.
구체적으로, 프로게린을 타겟으로 하는 sgRNA 염기서열은 엑손(exon) 11에서 돌연변이로 인해 엑손 12와 비정상적으로 결합된 부위를 타겟으로 하여 정상적인 lamin A과 구분되는 염기서열 부분을 Cas13a에 대한 디자인을 다음과 같은 두 CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/)와 CRISPR-RT (http://bioinfolab.miamioh.edu/CRISPR-RT/interface/C2c2.php) 사이트 등에서 off-target이 없고 cleavage 효율이 높은 5개의 타겟 sgRNA를 선정하였다.
그 결과, 도 3과 같이 프로게린 mRNA 내 엑손 11 및 12에 혼성화하는 sgRNA를 선별하였고, 서열번호 1 내지 5의 뉴클레오티드 서열이 상기 sgRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열인 것을 확인하였다.
실시예 1: 재조합 발현벡터의 제조
실험예 1에서 확인된 프로게린 mRNA 내 엑손 11 및 12에 혼성화하는 sgRNA, Cas13을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하였다.
구체적으로, backbone 벡터는 Cas13a와 sgRNA가 동시에 발현하는 all-in one backbone 렌티바이러스 벡터는 각각의 필요 부위를 클로닝하여 자체적으로 재구성하여 만들었다. Backbone 벡터는 렌티바이러스용 벡터(LTR, HIV-1 Ψ, cPPT/CTS, RRE 구성 요소 이용)에 CAG(CMV enhancer/chicken β-actin promoter/chimeric intron)프로모터와 Cas13a 유전자와 U6 프로모터 그리고 BsmBI 제한효소 염기서열 및 타겟 sgRNA를 삽입하는 데 필요한 spacer 염기서열을 oligo 합성을 통해 제작하였다 (도 4 참조).
상기 backbone 벡터의 BsmBI site에 oligo 합성으로 제작한 선별된 3개의 sgRNA 염기서열들을 클로닝하여 벡터를 제작하였으며 Sanger's sequencing 방법으로 정확히 타겟 sgRNA들이 들어 갔는지 검증하였다 (도 5 내지 9 참조).
그 결과 도 5 내지 9의 재조합 발현벡터를 제조하였고 이는 서열번호 6 내지 10의 서열로 구성되어 있다.
실험예 2: 본 발명의 재조합 발현벡터의 프로게린 mRNA 및 단백질 감소효과 확인(in vitro)
실험예 2-1. 정상 lamin A 및 프로게린 과발현 벡터의 제조
조로증 치료 효과를 세포 수준에서 확인하기 위하여 정상 lamin A 및 프로게린 과발현 벡터의 제조하였다. 구체적으로, 세포에서 프로게린이 과발현될 경우 세포가 잘 자라지 않고 죽기 때문에 안정적인 세포주를 제조하기 위해 조건부 시스템(Conditional Cre-loxP)을 이용하여 4-하이드로타목시펜(4-Hydroxytamoxifen, 4-OHT)이 처리될 때만 프로게린이 발현되도록 제작하였다.
구체적으로, LMNA 과발현 벡터 및 프로게린 과발현 벡터는 조건부로 발현할 수 있도록 Loxp-RFP-2A-puro-3x poly-Loxp 염기서열을 oligo 합성하여 클로닝하였고 조건부로 타겟 유전자가 발현하였을 때 확인할 수 있도록 IRES(internal ribosome entry site)를 통해 GFP 형광이 발현하도록 고안하였으며 이렇게 자체 제작한 backbone 벡터에 유전자가 발현되는 코딩 시퀀스(CDS, coding sequence)영역의 인간의 lamin A(LMNA)과 프로게린을 클로닝하여 조건부 과발현 벡터를 제작하였다 (도 10 및 11 참조).
그 결과, 도 10 및 도 11와 같은 구조의 정상 lamin A(LMNA) 및 프로게린 과발현 벡터를 제조하였다.
실험예 2-2. 정상 lamin A 및 프로게린 과발현 세포주의 제작
본 발명의 재조합 벡터의 효과를 확인할 수 있는 실험예 2-1에서 제조된 정상 lamin A 및 프로게린 과발현 벡터를 이용하여 정상 lamin A 및 프로게린 과발현 세포주를 제작하였다 (도 13).
구체적으로, Lamin A와 프로게린이 조건부로 과발현하는 세포주 제작은 HEK293 세포에 상기에서 기술한 각각의 과발현 벡터를 AAVS1 locus에 유전자 가위(sgRNA 서열: GTGAGAGTTATCTGACCGTAAGG)를 이용하여 삽입하며 조건부로 Lamin A와 프로게린 과발현 벡터를 조절하는 ERT2CreERT2 조건부 벡터는 H11 locus에 유전자 가위(sgRNA 서열: CAAAATAGGTTAGCCTTGCGGGG)를 이용하여 삽입한 후 hygromycin, puromycin으로 selection 되어 살아 있는 세포만을 선별하여 96 well에 단일세포를 넣어 키운 후 각각의 세포를 genotyping으로 검증하여 과발현을 원하는 벡터와 조건부로 조절시키는 벡터가 삽입되었는지 검증하였다.
구체적인 검증 위하여 각각의 AAVS1, H11 locus에 대해 아래 (1), (2), (3) 프라이머 3개를 넣어주어 PCR 과정을 진행하였다.
AAVS1 WT PCR product: 339 bp (F: CCCCTATGTCCACTTCAGGA, R: AGGATCCTCTCTGGCTCCAT)
AAVS1 Progerin/LMNA product: 517 bp (F: CCCCTATGTCCACTTCAGGA, R: TGGTCATAGCTGTTTCCTGTG)
H11 WT PCR product: 221bp (F: ACTTATGGGAACCCCTTCCA, R: ATTTGTTCAGGGCTCCACAG)
ERT2CreERT2 product: HITI 방법이기 때문에 product size 가변적(F: ACTTATGGGAACCCCTTCCA, R: GATAAATCTGGAGCCGGTGA을 이용해 PCR됨)
그 결과 도 14에서 확인되는 바와 같이 유전자의 삽입을 확인하였다.
또한, 삽입된 벡터의 벡터를 이용하여 조건부로 유전자가 발현되는 것을 형광 또는 RT-PCR 방법을 통해 검증하였다.
그 결과 LMNA 또는 프로게린 (progerin)이 과발현 유전자가 발현되기 전에는 RFP가 발현되고 4-0HT(Tamoxifen)을 처리한 후 loxp-RFP-2A-Puro-3X SV40 polyA-loxp가 제거되어 RFP 형광에서 LMNA 또는 프로게린과 함께 GFP가 발현되어 조건부로 유전자가 발현됨을 검증하였다.
또한 semi RT-PCR을 통해 4-0HT 처리 후 프로게린(progerin) 유전자가 발현됨을 확인하였다. semi RT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 1과 같다.
| Gene Name | Accession No. | Primer sequence (5′→3') | Product size |
| LMNA | NM_170707.4 | F: CCTTGCTGACTTACCGGTTC R: ACATGATGCTGCAGTTCTGG |
564 bp |
| Progerin | NM_001282626.2:c.1818+6C>T | F: CCTTGCTGACTTACCGGTTC R: ACATGATGCTGCAGTTCTGG |
414 bp |
그 결과, LMNA은 564 bp가 존재하지만 프로게린(progerin)은 mutation에 의해 exon 11에 150 bp가 잘려서 414 bp의 PCR product가 생성되는 것을 확인하였다 (도 15 내지 17 참조).
상기한 결과들을 통해 정상 lamin A 및 프로게린 과발현 세포주를 제조하였다.
실험예 2-3. 본 발명의 재조합 발현벡터의 progerin mRNA 및 단백질 감소효과 확인
실험예 2-2에서 제조된 정상 lamin A 및 프로게린 과발현 세포주에 프로게린 과발현 및 본 발명의 재조합 발현벡터 처리 시 프로게린 mRNA 및 단백질 발현을 확인하였다.
구체적으로, 프로게린이 조건부로 과발현되는 HEK293 세포에 프로게린을 타겟으로 하는 #1, #2, #3의 렌티바이러스를 도입하기 24시간 전에 4-OHT를 처리하여 프로게린 유전자를 유도한 후 과발현된 프로게린 유무를 72시간이 지난 후 RT-PCR과 Western blot으로 프로게린의 감소 유무를 확인하였다.
다음 표 2 의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다 (도 18, 19).
| Gene Name | Accession No. | Primer sequence (5′→3') | Product size |
| LMNA | NM_170707.4 | F: TCTGCCTCCAGTGTCACG R: ACATGATGCTGCAGTTCTGG |
148 bp |
| Progerin | NM_001282626.2:c.1818+6C>T | F: AGCCCAGAGCCCCCAGAA R: CAAAGGGTTATTTTTCTTTGGCTTCAA |
154 bp |
| GAPDH | NM_002046.7 | F: TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG R: TCGCTGTTGAAGTCAGAGGA |
94 bp |
그 결과, 프로게린 특이적 RT-PCR primer는 mutation으로 결손된 exon 11와 exon 12가 junction된 부분에서 primer F(forward)를 디자인하였기 때문에 정상적인 LMNA에서는 발현되지 않고 비정상적인 프로게린이 존재시에만 PCR product가 나온다는 것을 확인하였다.
또한, 상기한 결과들과 도 20 및 도 21에서 확인되는 바와 같이 대조군 HEK293 세포에서는 4-OHT의 처리 유무와 관계없이 일정 수준의 Lamin A 발현이 확인되었다. 그리고 프로게린 과발현 벡터가 도입된 실험군의 경우 4-OHT 가 처리되지 않았을 때는 유의적인 변화가 없었고, 4-OHT를 처리할 경우에도 Lamin A는 발현의 유의적 변화가 없었다. 다만, 4-OHT로 인한 프로게린 벡터의 작동으로 프로게린의 발현이 높아진 것을 확인할 수 있었다. 한편, 4-OHT의 처리로 프로게린의 발현을 유도하였음에도 본 발명의 재조합 발현벡터(#1, #2 및 #3)가 도입된 경우에는 도입되지 않은 실험군과 비교하여 유의적으로 낮은 프로게린 발현을 확인할 수 있었고, Lamin A의 발현 수준은 유의적 차이가 없었다. 한편, HEK293 대조군 세포주에서는 Lamin A 단백질 발현이 확인되지 않는데 이는 HEK293 세포주의 특성에서 기인한 것으로 판단된다(Chromosoma. 2017, Aug;126(4):501-517).
상기 결과를 통해 서열번호 2에 의해 암호화되는 sgRNA의 경우 가장 우수한 프로게린 mRNA 발현수준 저감 효과를 확인하였고, 단백질 발현을 다시 확인하였을 때도 유사한 결과를 나타내었다(도 21).
실험예 3: 본 발명의 조성물의 progerin mRNA 및 단백질 감소효과 확인(in vivo)]
본 발명의 조성물이 동물에게도 효과가 있는지 확인하였다(in vivo).
실험예 3-1. 실험동물의 준비
Jackson lab에서 구입한 마우스한 Progerin [C57BL/6-Tg LMNA (G608G) HClns/J, stock #010667)] 이형 접합체(heterozygote, He) 마우스의 암, 수를 교배 과정을 통해 산자(offspring)를 확보한 후 유전형 방법(genotyping 방법)을 통해 야생형(wild-type, WT)과 이형 접합체(heterozygote, He), 동형 접합체(homozygote, Ho) 마우스를 확보하였다.
실험예 3-2. 본 발명의 조성물 도입
상기 실험예 3-1에서 확보한 이형 접합체(He) 암, 수 마우스를 서로 교배한 후 13.5일 때의 태아(fetus)로부터 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)를 제작한 후, 유전형 방법을 통해 확인한 야생형(WT)과 progerin 동형 접합체 (HO) 만을 실험예 2-3과 같은 방법으로 본 발명의 조성물(CRISPR-Cas13a #2 렌티바이러스)을 도입한 실험군(도 12의 Progeria (HO) sgRNA #2 (+))과 도입하지 않은 마우스 배아 섬유아세포 실험군(도 12의 Progeria (HO) sgRNA #2 (-))으로 제작하였다.
한편 야생형(WT) 마우스의 마우스 배아 섬유아세포에 대해서도 실험예 2-3과 같은 방법으로 본 발명의 조성물(CRISPR-Cas13a #2 렌티바이러스)을 도입한 실험군(도 20의 WT sgRNA #2 (+))과 도입하지 않은 마우스 배아 섬유아세포 실험군(도 20의 WT sgRNA #2 (-))으로 제작하였다.
실험예 3-3. 노화 관련 유전자 발현의 확인
상기 실험예 3-2에서 제작된 실험군들의 프로게린 및 노화 관련 유전자 (PAI-1, MMP3, SMP30) 발현을 확인하였다.
구체적으로, 노화 관련 유전자의 변화 관찰은 Western blot 분석방법을 통해 확인하였으며, Western blot 방법은 다음의 과정을 통해 검증하였다. 30-60μg의 protein lysates를 8-12 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels에서 분리하고 0.45μm 니트로 셀룰로스 막(nitrocellulose membranes)으로 옮겼다 (Cat # HAWP04700, EMD Millipore, Burlington, MA, USA). 멤브레인(membranes)을 10mM Tris pH 7.4, 150mM NaCl 및 0.02 % Tween-20 (TBST)에서 5 % 탈지유(skim milk, Cat # 232100, BD Biosciences) 또는 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, Cat # A9647, Sigma-Aldrich)으로 blokcing 한 후, 이들은 1 차 항체 (Lamin A/C, Cat #4777S, Cell signaling technology, 1:1000; PAI-1, Cat #ab66705, Abcam, 1:1000; MMP3, Cat #ab52915, Abcam, 1:1000; SMP30, Cat #48864S, Cell signaling technology, 1:1000; GAPDH, Cat #LF-MA0038, AB Frontier, 1:2000)와 함께 4 ºC에서 밤새 incubation 한다. 멤브레인을 TBST로 3 회 세척한 후 TBST에서 5 % 탈지유로 차단하고 horseradish peroxidase가 결합되어 있는 2차 항체를 이용하여 실온에서 1 시간 동안 incubation 한다. 블롯을 TBST로 세척한 후 제조업체의 지침에 따라 SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Cat # 34580, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 항체 결합을 확인하였다.
그 결과, 도 22에서 확인되는 바와 같이, 야생형 마우스의 마우스 배아 섬유아세포는 본 발명의 조성물(CRISPR-Cas13a #2 렌티바이러스)를 도입 유, 무와 무관하게, 유의적인 노화 관련 유전자 발현 차이를 확인할 수 없었다(도 20의 WT sgRNA #2 (-) 및 (+)). 반면, 동형 접합체 (HO)에 있어서는 본 발명의 조성물 (CRISPR-Cas13a #2 렌티바이러스)을 도입하지 않은 마우스 배아 섬유아세포 실험군 (도 20의 Progeria (HO) sgRNA #2 (-))은 프로게린 및 노화 관련 유전자(PAI-1, MMP3, SMP30) 발현이 야생형 세포주에 비해 증가한 것을 확인할 수 있다. 그리고, 본 발명의 조성물(CRISPR-Cas13a #2 렌티바이러스)을 도입한 실험군(도 20의 Progeria (HO) sgRNA #2 (+))은 프로게린 및 노화 관련 유전자(PAI-1, MMP3, SMP30) 발현이 도입하지 않은 실험군에 비하여 감소한 것을 확인할 수 있다.
실험예 3-4. 본 발명의 조성물의 투여 및 효과 검증
상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 조성물(CRISPR-Cas13a #2 렌티바이러스)을 상기 실험예 3-1의 동형유전자 마우스에 투입한 실험군(아래 표 3의 F4 #08(HO, M, male) 및 F4 #13(HO, F, female)) 및 투입하지 않은 실험군(아래 표 3의 F4 #01(HO, M) 및 F4 #21(HO, M))을 조로증의 한 지표인 체중을 기준으로 비교하였다.
구체적으로, 7개월령(출생일(DOB; date of birth) 2019.10.21일생, 바이러스 주입시기(2020.04.24일))의 progeria Ho 마우스를 가지고 1, 2차에 걸쳐 control(타겟 sgRNA 염기서열이 없는 backbone 바이러스)과 sgRNA #2으로 제작한 바이러스를 꼬리 정맥혈관(tail vein)을 통해 주입한 후 progeria에 의한 몸무게 변화 추이를 실험 시작일(2020.04.24)일부터 일정간 간격으로 측정하였다.
그 결과, 표 3에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 조성물을 투입하지 않은 실험군은 폐사되었으나, 본 발명의 조성물을 투입한 실험군은 약간의 체중 감소는 나타나지만 control에 비해 생존율이 증가함을 확인할 수 있었다.
한편, 상기 실험군들의 장기 조직(간, 폐, 신장)에서의 프로게린 및 노화 관련 유전자(PAI-1, MMP3, SMP30) 발현을 확인하였다.
구체적으로, 실험예 3-4의 마우스 개체의 간, 폐 및 신장 샘플에서 확인한 것 외에는 상기 실험예 3-3에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하였다.
그 결과, 도 23에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 조성물을 투여한 실험군에서는 투여하지 않은 실험군에 비하여, 간, 폐 및 신장에서의 프로게린 및 노화 관련 유전자(PAI-1, MMP3, SMP30) 발현이 감소한 것을 확인하였다.
실험예 4 : 프로게린 mRNA 타겟 염기서열의 유용성 확인
실험예 4-1. 형광분석
Progeria HO 마우스의 MEF에 control 및 본 발명의 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나의 재조합 발현벡터와 pMD2.G (Addgene #12259), psPAX2 (Addgene #12260) 벡터들을 이용하여 293FT(Invitrogen #R70007) 세포 도입 후 4~5일 때부터 각각 세포배양액의 상층액에 생산된 렌티바이러스들을 Progeria HO 마우스의 MEF에 2회 감염시킨 후 CRISPR-Cas13a의 발현을 GFP 형광을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 24 에서 확인되는 바와 같이 Cas13a와 fusion된 GFP 형광이 발현을 통해 재조합 렌티바이러스 (CRISPR-Cas13a #1내지 #5 렌티바이러스, 서열번호 6 내지 10)가 도입되어 발현됨을 확인하였다.
실험예 4-2. 프로게린 및 노화 관련 유전자 발현 확인
상기 실험예 2-3에서 구축한 프로게린이 조건부로 과발현되는 HEK293 세포와 상기 실험예 3-2에서 확보한 MEF에 실험예 2-3과 같은 방법으로 본 발명의 재조합 발현벡터 (CRISPR-Cas13a #1내지 #5 렌티바이러스, 서열번호 6 내지 10)를 도입하였다. 그리고, 프로게린 및 노화 관련 유전자 발현 변화를 Western blot 분석방법을 통해 확인 하였다.
그 결과 본 발명의 재조합 발현벡터를 도입한 실험군에서 도입하지 않은 세포보다 프로게린 및 노화 관련 유전자(PAI-1, MMP3, SMP30) 발현이 감소함을 확인 할 수 있다 (도 25, 26).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
<120> A COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING PROGERIA AND NORMAL
AGING BY USING GENE EDITING
<130> BPN200223-P1
<150> KR 10-2020-0145160
<151> 2020-11-03
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA (#1)
<400> 1
ctgggggctc tgggctcctg agccgctg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA (#2)
<400> 2
cagttctggg ggctctgggc tcctgagc 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA (#3)
<400> 3
gctgcagttc tgggggctct gggctcct 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA (#4)
<400> 4
gcagttctgg gggctctggg ctcctgag 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA (#5)
<400> 5
gctgcagttc tgggggctct gggctcct 28
<210> 6
<211> 11491
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCAG-LwCas13-msfGFP U6-sgProgeria #1 all-in one Lenti
<400> 6
ggaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 60
ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 120
gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt 180
tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca 240
ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc 300
ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc 360
tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc 420
tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc 480
tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 540
ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cggtaccttt 600
aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 660
actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc 720
tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 780
taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 840
ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag 900
tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag 960
tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 1020
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 1080
tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 1140
actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 1200
gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 1260
ggcctttcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 1320
tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 1380
gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 1440
gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 1500
gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 1560
ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 1620
tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 1680
acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 1740
cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 1800
catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 1860
cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 1920
ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 1980
ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 2040
ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 2100
atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 2160
gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 2220
atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 2280
tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 2340
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 2400
ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 2460
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 2520
gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 2580
ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 2640
gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 2700
acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 2760
tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 2820
gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 2880
cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 2940
cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc ctttgcttaa 3000
tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt tagcaacatg 3060
ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg tggtacgatc 3120
gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat tggacgaacc actgaattgc 3180
cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata cataaacggg tctctctggt 3240
tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 3300
aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 3360
actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 3420
cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc 3480
tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac 3540
tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat 3600
tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 3660
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 3720
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 3780
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 3840
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 3900
gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca 3960
attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac 4020
ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt 4080
tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga 4140
cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg 4200
ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg 4260
caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt 4320
gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat 4380
ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt 4440
acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac 4500
aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt 4560
ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag 4620
tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc 4680
agacccacct cccaaccccg aggggacaat tctcgacctc gagacaaatg gcagtattca 4740
tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag 4800
acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa 4860
attttcgggt ttattacagg gacagcagac atgtctcgag cggccgcccc cttcaccgag 4920
ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata 4980
attggaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag 5040
taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg 5100
cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga 5160
aacaccgaaa caccgattta gactacccca aaaacgaagg ggactaaaac ctgggggctc 5220
tgggctcctg agccgctgtt tttttgaatt ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg 5280
tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagtc ctcgagtgac attgattatt 5340
gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt 5400
ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 5460
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 5520
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 5580
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 5640
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 5700
taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 5760
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 5820
ggggggggcg cgccccaggc ggggcggggc ggggcgaagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 5880
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 5940
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgcgc 6000
ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 6060
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 6120
cgcttggttt aatgacggct cgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct taaagggctc 6180
cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt 6240
ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg 6300
gggctttgtg cgctccgcgt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt 6360
gcgggggggc tgcgagggga acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc 6420
agggggtgtg ggcgcggcgg tcgggctgta acccccccct gcacccccct ccccgagttg 6480
ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg 6540
tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg 6600
gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 6660
cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 6720
cccaaatctg tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg 6780
gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc 6840
cgcgccgccg tccccttctc cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 6900
ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 6960
cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 7020
ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattcccggg tgagccgcca ccatggctgg 7080
agctagcccc aaaaagaaga ggaaagtggg atccatgaaa gtgaccaagg tcgacggcat 7140
cagccacaag aagtacatcg aagagggcaa gctcgtgaag tccaccagcg aggaaaaccg 7200
gaccagcgag agactgagcg agctgctgag catccggctg gacatctaca tcaagaaccc 7260
cgacaacgcc tccgaggaag agaaccggat cagaagagag aacctgaaga agttctttag 7320
caacaaggtg ctgcacctga aggacagcgt gctgtatctg aagaaccgga aagaaaagaa 7380
cgccgtgcag gacaagaact atagcgaaga ggacatcagc gagtacgacc tgaaaaacaa 7440
gaacagcttc tccgtgctga agaagatcct gctgaacgag gacgtgaact ctgaggaact 7500
ggaaatcttt cggaaggacg tggaagccaa gctgaacaag atcaacagcc tgaagtacag 7560
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<211> 11491
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCAG-LwCas13-msfGFP U6-sgProgeria #2 all-in one Lenti
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ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag 900
tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag 960
tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 1020
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 1080
tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 1140
actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 1200
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ggcctttcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 1320
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gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 1440
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tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 1680
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ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 1980
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tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 2340
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 2400
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gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 2580
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gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 2880
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cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc ctttgcttaa 3000
tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt tagcaacatg 3060
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tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 3660
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attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac 4020
ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt 4080
tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga 4140
cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg 4200
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ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag 4620
tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc 4680
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ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata 4980
attggaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag 5040
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ctacatcaac aacgtgcagg aagccttcga caagctgtat aagaaagagg atatcgagaa 7740
actgtttttc ctgatcgaga acagcaagaa gcacgagaag tacaagatcc gcgagtacta 7800
tcacaagatc atcggccgga agaacgacaa agagaacttc gccaagatta tctacgaaga 7860
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gaagaaaagc caggtgttct acaagtacta cctggacaaa gaggaactga acgacaagaa 7980
tattaagtac gccttctgcc acttcgtgga aatcgagatg tcccagctgc tgaaaaacta 8040
cgtgtacaag cggctgagca acatcagcaa cgataagatc aagcggatct tcgagtacca 8100
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gaataccctg aagttttttt ggagcgtgcc caaggacaaa gaagagaagg acgcccagat 8880
ctacctgctg aagaatatct actacggcga gttcctgaac aagttcgtga aaaactccaa 8940
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ggccatcatc cagagcagag agatgatcaa caaccaggac aaagaggaaa agaataccta 9120
catcgacttt attcagcaga ttttcctgaa gggcttcatc gactacctga acaagaacaa 9180
tctgaagtat atcgagagca acaacaacaa tgacaacaac gacatcttct ccaagatcaa 9240
gatcaaaaag gataacaaag agaagtacga caagatcctg aagaactatg agaagcacaa 9300
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ttatccctac gacgtgcctg attatgcata cccatatgat gtccccgact atgcctaatg 11460
tacaaggaat tctaactaga gctcgcctgc a 11491
<210> 10
<211> 11491
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCAG-LwCas13-msfGFP U6-sgProgeria #5 all-in one Lenti
<400> 10
ggaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 60
ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 120
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tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca 240
ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc 300
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tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc 480
tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 540
ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cacctccccg cggtaccttt 600
aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 660
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tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 780
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tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 1080
tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 1140
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tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 3300
aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 3360
actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 3420
cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc 3480
tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac 3540
tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat 3600
tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 3660
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 3720
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 3780
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 3840
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 3900
gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca 3960
attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac 4020
ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt 4080
tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga 4140
cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg 4200
ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg 4260
caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt 4320
gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat 4380
ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt 4440
acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac 4500
aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt 4560
ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag 4620
tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc 4680
agacccacct cccaaccccg aggggacaat tctcgacctc gagacaaatg gcagtattca 4740
tccacaattt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag 4800
acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa 4860
attttcgggt ttattacagg gacagcagac atgtctcgag cggccgcccc cttcaccgag 4920
ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata 4980
attggaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag 5040
taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg 5100
cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga 5160
aacaccgaaa caccgattta gactacccca aaaacgaagg ggactaaaac gctgcagttc 5220
tgggggctct gggctccttt tttttgaatt ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg 5280
tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagtc ctcgagtgac attgattatt 5340
gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt 5400
ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 5460
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 5520
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 5580
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 5640
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 5700
taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 5760
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 5820
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 5880
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 5940
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct 6000
gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga 6060
ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc 6120
gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc 6180
gggagggccc tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg 6240
ggagcgccgc gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg 6300
ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt 6360
gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 6420
cagggggtgt gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg 6480
ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg 6540
tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg 6600
gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 6660
cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 6720
cccaaatctg tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg 6780
gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc 6840
cgcgccgccg tccccttctc cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 6900
ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 6960
cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 7020
ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattcccggg tgagccgcca ccatggctgg 7080
agctagcccc aaaaagaaga ggaaagtggg atccatgaaa gtgaccaagg tcgacggcat 7140
cagccacaag aagtacatcg aagagggcaa gctcgtgaag tccaccagcg aggaaaaccg 7200
gaccagcgag agactgagcg agctgctgag catccggctg gacatctaca tcaagaaccc 7260
cgacaacgcc tccgaggaag agaaccggat cagaagagag aacctgaaga agttctttag 7320
caacaaggtg ctgcacctga aggacagcgt gctgtatctg aagaaccgga aagaaaagaa 7380
cgccgtgcag gacaagaact atagcgaaga ggacatcagc gagtacgacc tgaaaaacaa 7440
gaacagcttc tccgtgctga agaagatcct gctgaacgag gacgtgaact ctgaggaact 7500
ggaaatcttt cggaaggacg tggaagccaa gctgaacaag atcaacagcc tgaagtacag 7560
cttcgaagag aacaaggcca actaccagaa gatcaacgag aacaacgtgg aaaaagtggg 7620
cggcaagagc aagcggaaca tcatctacga ctactacaga gagagcgcca agcgcaacga 7680
ctacatcaac aacgtgcagg aagccttcga caagctgtat aagaaagagg atatcgagaa 7740
actgtttttc ctgatcgaga acagcaagaa gcacgagaag tacaagatcc gcgagtacta 7800
tcacaagatc atcggccgga agaacgacaa agagaacttc gccaagatta tctacgaaga 7860
gatccagaac gtgaacaaca tcaaagagct gattgagaag atccccgaca tgtctgagct 7920
gaagaaaagc caggtgttct acaagtacta cctggacaaa gaggaactga acgacaagaa 7980
tattaagtac gccttctgcc acttcgtgga aatcgagatg tcccagctgc tgaaaaacta 8040
cgtgtacaag cggctgagca acatcagcaa cgataagatc aagcggatct tcgagtacca 8100
gaatctgaaa aagctgatcg aaaacaaact gctgaacaag ctggacacct acgtgcggaa 8160
ctgcggcaag tacaactact atctgcaagt gggcgagatc gccacctccg actttatcgc 8220
ccggaaccgg cagaacgagg ccttcctgag aaacatcatc ggcgtgtcca gcgtggccta 8280
cttcagcctg aggaacatcc tggaaaccga gaacgagaac ggtatcaccg gccggatgcg 8340
gggcaagacc gtgaagaaca acaagggcga agagaaatac gtgtccggcg aggtggacaa 8400
gatctacaat gagaacaagc agaacgaagt gaaagaaaat ctgaagatgt tctacagcta 8460
cgacttcaac atggacaaca agaacgagat cgaggacttc ttcgccaaca tcgacgaggc 8520
catcagcagc atcagacacg gcatcgtgca cttcaacctg gaactggaag gcaaggacat 8580
cttcgccttc aagaatatcg cccccagcga gatctccaag aagatgtttc agaacgaaat 8640
caacgaaaag aagctgaagc tgaaaatctt caagcagctg aacagcgcca acgtgttcaa 8700
ctactacgag aaggatgtga tcatcaagta cctgaagaat accaagttca acttcgtgaa 8760
caaaaacatc cccttcgtgc ccagcttcac caagctgtac aacaagattg aggacctgcg 8820
gaataccctg aagttttttt ggagcgtgcc caaggacaaa gaagagaagg acgcccagat 8880
ctacctgctg aagaatatct actacggcga gttcctgaac aagttcgtga aaaactccaa 8940
ggtgttcttt aagatcacca atgaagtgat caagattaac aagcagcgga accagaaaac 9000
cggccactac aagtatcaga agttcgagaa catcgagaaa accgtgcccg tggaatacct 9060
ggccatcatc cagagcagag agatgatcaa caaccaggac aaagaggaaa agaataccta 9120
catcgacttt attcagcaga ttttcctgaa gggcttcatc gactacctga acaagaacaa 9180
tctgaagtat atcgagagca acaacaacaa tgacaacaac gacatcttct ccaagatcaa 9240
gatcaaaaag gataacaaag agaagtacga caagatcctg aagaactatg agaagcacaa 9300
tcggaacaaa gaaatccctc acgagatcaa tgagttcgtg cgcgagatca agctggggaa 9360
gattctgaag tacaccgaga atctgaacat gttttacctg atcctgaagc tgctgaacca 9420
caaagagctg accaacctga agggcagcct ggaaaagtac cagtccgcca acaaagaaga 9480
aaccttcagc gacgagttgg aactgatcaa cctgctgaac ctggacaaca acagagtgac 9540
cgaggacttc gagctggaag ccaacgagat cggcaagttc ctggacttca acgaaaacaa 9600
aatcaaggac cggaaagagc tgaaaaagtt cgacaccaac aagatctatt tcgacggcga 9660
gaacatcatc aagcaccggg ccttctacaa tatcaagaaa tacggcatgc tgaatctgct 9720
ggaaaagatc gccgataagg ccaagtataa gatcagcctg aaagaactga aagagtacag 9780
caacaagaag aatgagattg aaaagaacta caccatgcag cagaacctgc accggaagta 9840
cgccagaccc aagaaggacg aaaagttcaa cgacgaggac tacaaagagt atgagaaggc 9900
catcggcaac atccagaagt acacccacct gaagaacaag gtggaattca atgagctgaa 9960
cctgctgcag ggcctgctgc tgaagatcct gcaccggctc gtgggctaca ccagcatctg 10020
ggagcgggac ctgagattcc ggctgaaggg cgagtttccc gagaaccact acatcgagga 10080
aattttcaat ttcgacaact ccaagaatgt gaagtacaaa agcggccaga tcgtggaaaa 10140
gtatatcaac ttctacaaag aactgtacaa ggacaatgtg gaaaagcgga gcatctactc 10200
cgacaagaaa gtgaagaaac tgaagcagga aaaaaaggac ctgtacatcc ggaactacat 10260
tgcccacttc aactacatcc cccacgccga gattagcctg ctggaagtgc tggaaaacct 10320
gcggaagctg ctgtcctacg accggaagct gaagaacgcc atcatgaagt ccatcgtgga 10380
cattctgaaa gaatacggct tcgtggccac cttcaagatc ggcgctgaca agaagatcga 10440
aatccagacc ctggaatcag agaagatcgt gcacctgaag aatctgaaga aaaagaaact 10500
gatgaccgac cggaacagcg aggaactgtg cgaactcgtg aaagtcatgt tcgagtacaa 10560
ggccctggaa ggaggaggtg gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gtagcgtgag 10620
taaaggtgaa gaactcttca ctggagtagt gcccattctg gtagagcttg atggagatgt 10680
aaatggacat aaattctccg tcaggggcga aggcgaaggg gacgccacga atggtaagct 10740
gactctgaaa ttcatctgta cgacgggcaa actgcccgtc ccatggccta cactcgtaac 10800
gaccctcacc tacggcgtgc aatgcttttc tcgatatccc gaccacatga aacagcatga 10860
ctttttcaag tctgcaatgc ctgaaggtta tgttcaagaa aggaccatca gctttaagga 10920
tgatggtaca tataaaaccc gagccgaggt taaatttgaa ggggacactc tggttaatcg 10980
aattgaactg aaaggtattg attttaagga ggacggtaac atactggggc acaagttgga 11040
gtacaacttt aacagccata atgtgtatat taccgctgat aagcagaaaa atgggataaa 11100
ggccaacttt aagatccgac ataatgtcga agatggtagt gttcaactgg ctgatcatta 11160
ccaacaaaat acgcccatcg gagatggacc tgtactcttg cctgacaatc attatctctc 11220
cacgcaatca aagctttcca aggacccaaa cgaaaagaga gatcacatgg tccttctgga 11280
atttgtgact gccgcaggca tcactctcgg tatggatgag ctgtacaagg gatccgaggg 11340
agctcccaag aaaaagcgca aggtaggtag ttcctaccca tacgatgttc cagattacgc 11400
ttatccctac gacgtgcctg attatgcata cccatatgat gtccccgact atgcctaatg 11460
tacaaggaat tctaactaga gctcgcctgc a 11491
Claims (10)
- 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 gRNA.
- 제2항에 있어서,
상기 gRNA는 LMNA 유전자의 엑손 11 및 엑손 12을 암호화하는 유전자에 혼성화하는 것인 gRNA.
- 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 gRNA; 및
Cas13 mRNA 또는 이로부터 유래된 Cas 13 단백질을 포함하는 프로게린 발현 저해용 조성물.
- 프로게린 mRNA에 혼성화하는 gRNA를 암호화하는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상보적인 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제5항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터는 Cas13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제5항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나의 서열로 이루어진 재조합 발현벡터.
- 제5항의 재조합 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 프로게린 발현 저해용 조성물.
- 제5항의 재조합 발현벡터 및 Cas13 발현벡터를 포함하는 프로게린 발현 저해용 조성물.
- 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 하나의 조성물을 유효성분으로 포함하는 조로증 및 자연노화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2021/015531 WO2022098014A1 (ko) | 2020-11-03 | 2021-11-01 | 유전자 교정을 이용한 조로증 및 자연노화의 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| KR20200145160 | 2020-11-03 | ||
| KR1020200145160 | 2020-11-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220059913A true KR20220059913A (ko) | 2022-05-10 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Country Status (1)
| Country | Link |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190113687A (ko) | 2018-03-27 | 2019-10-08 | (주)지플러스 생명과학 | 가이드 rna 및 엔도뉴클레아제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 |
-
2021
- 2021-10-28 KR KR1020210145418A patent/KR20220059913A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190113687A (ko) | 2018-03-27 | 2019-10-08 | (주)지플러스 생명과학 | 가이드 rna 및 엔도뉴클레아제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 |
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