KR20220059090A - 콘크리트에서 박테리아 활성화를 위한 박테리아 및 박테리아 배양액을 고정화하는 방법 - Google Patents
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Abstract
기존 망사형 흡착패드를 이용한 방법에 비해 단기간에 다공성 재료에 고정화되는 박테리아의 농도를 향상시킬 수 있으며, 고정화 과정에서 저밀도 다공성 재료의 부유 문제 및 비균질 고정화 문제를 해결할 수 있는 방법이 개시된다. 본 발명은 하부에 회전팬이 구비된 컨테이너에 박테리아 배양액을 투입 및 다공성 재료를 침지시키고, 음압 조건에서 상기 회전팬을 구동하여, 콘크리트에서 박테리아 활성화를 위한 박테리아 및 박테리아 배양액을 고정화하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 콘크리트에서 박테리아 활성화를 위한 박테리아 및 박테리아 배양액을 고정화하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다공성 재료에 박테리아 및 박테리아 배양액을 고정화하는 방법에 관한 것이다.
종래 콘크리트 배합 시 박테리아 투입을 위해서는 콘크리트 배합 과정에서 배합수의 일정 부분 또는 전체를 박테리아 배양액으로 대체하는 방법을 활용하여 투입하는 단순한 방법이었다. 이 방법에서는 콘크리트 배합 이후 경화 과정에서 시멘트 페이스트 수화에 따른 콘크리트 내 수분의 감소로 건조 환경이 되며 부피 팽창의 영향으로 박테리아의 영양분 및 생장처가 감소하게 된다.
특히, 콘크리트는 경화 시 수화열에 의해 내부 온도가 40℃ 이상으로 되며 콘크리트의 수화생성물(Ca(OH)2)에 의한 강알칼리성 환경(pH 11~12)은 박테리아의 최적 생장환경(pH 4~9) 조성에 있어 가장 큰 저해 요소가 된다. 더불어 경화된 콘크리트의 내부 공극은 대부분 마이크로 및 나노 사이즈로서 박테리아 크기보다 작아 박테리아의 생장이 어렵다.
이러한 영향으로 콘크리트 내부에서 박테리아의 생장활동은 저해되고, 약 30일 이후 콘크리트 내부에서 박테리아 대부분은 사멸하게 된다. 본 출원인은 등록특허 제10-1859211호에서 다공성 재료가 투입된 망사형 흡착패드를 미생물 배양액에 침지하여 미생물 흡착을 유도하는 방법을 제시하였으나, 미생물의 흡착 농도 향상을 위하여 침지 및 흡착을 72시간 정도 지속해야 하는 문제가 있었다.
[선행특허문헌]
- 한국 등록특허 제10-1859211호(2018.05.11.)
- 한국 등록특허 제10-0948556호(2010.03.12.)
본 발명은 기존 망사형 흡착패드를 이용한 방법에 비해 단기간에 다공성 재료에 고정화되는 박테리아의 농도를 향상시킬 수 있으며, 고정화 과정에서 저밀도 다공성 재료의 부유 문제 및 비균질 고정화 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 하부에 회전팬이 구비된 컨테이너에 박테리아 배양액을 투입 및 다공성 재료를 침지시키고, 음압 조건에서 상기 회전팬을 구동하여, 콘크리트에서 박테리아 활성화를 위한 박테리아 및 박테리아 배양액을 고정화하는 방법을 제공한다.
또한 상기 다공성 재료는 팽창질석, 우레탄, 펄라이트 및 히드로겔로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 음압 조건은 1 내지 20 torr의 음압을 30 내지 60분 동안 가하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기 회전팬은 100 내지 1,000 rpm의 속도로 구동되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 다공성 재료에 박테리아 고정 시 음압 환경 조성과 함께 회전팬을 이용한 교반을 통해 다공성 재료에 박테리아 및 박테리아 배양액이 고정되는 시간을 현저히 단축시킴과 동시에, 박테리아 및 박테리아 배양액을 다공성 재료에 고농도로 고정시키면서도 고정화 재료의 부유를 방지할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
또한 콘크리트 배합 시 콘크리트 경화 이후 박테리아의 사멸을 방지하고 지속적인 생장환경을 조성할 수 있으며, 콘크리트에서 미생물이 생장함으로써 박테리아의 효과가 지속되도록 할 수 있다.
도 1a 내지 도 1e는 각각 본 발명에 따른 박테리아 및 박테리아 배양액 고정화를 위한 멸균 컨테이너를 예시적으로 나타낸 정면도, 측면도, 상면도, 배면도 및 내부 모식도,
도 2는 비교 제조예 1에 따른 비교반형 멸균 음압 컨테이너를 나타낸 내부 모식도,
도 3은 비교 제조예 2의 기존 방식에 따른 흡착재가 침지된 통을 나타낸 내부 모식도.
도 2는 비교 제조예 1에 따른 비교반형 멸균 음압 컨테이너를 나타낸 내부 모식도,
도 3은 비교 제조예 2의 기존 방식에 따른 흡착재가 침지된 통을 나타낸 내부 모식도.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참고하여 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위하여 설명과 관계없는 부분은 생략하였고, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 부여하였으며, 본 발명의 세부구성 방향은 도면을 기준으로 하여 설명한다. 또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은 박테리아를 이용한 콘크리트 제조에 있어 콘크리트 경화 이후 박테리아의 사멸을 방지하고 지속적인 생장환경 조성을 위한 기술로서, 등록특허 제1859211호에서 소정 규격의 망사형의 흡착 패드에 흡착재를 박테리아 배양액에 침지시킴으로써 지속적인 생장환경을 조성하는 방법을 제시하였으나, 이러한 방법은 미생물의 흡착 농도 향상을 위하여 72시간 정도 지속해야 하며, 또한 박테리아 흡착을 위해 이용되는 재료는 비중이 1.0 이하로서 배양액 침지 시 부유 방지를 위해 망사형 흡착패드를 필수적으로 이용하여야 하기 때문에 침지 배양액 부피 대비 고정화 재료의 투입량이 매우 적어 대량생산 측면에서 효율성이 낮은 문제에 직시하고, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과 박테리아 고정 시 음압 환경을 조성과 함께 회전팬을 이용한 교반을 통해 다공성 재료에 박테리아 및 박테리아 배양액이 고정되는 시간을 현저히 단축시킴과 동시에, 박테리아 및 박테리아 배양액을 다공성 재료에 고농도로 고정시키면서도 고정화 재료의 부유를 방지할 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명은 하부에 회전팬이 구비된 컨테이너에 박테리아 배양액을 투입 및 다공성 재료를 침지시키고, 음압 조건에서 상기 회전팬을 구동하여, 콘크리트에서 미생물 활성화를 위한 미생물 및 미생물 배양액을 고정화하는 방법을 개시한다.
본 발명에서 미생물 고정을 위한 재료로는 다공성의 양이온 교환 능력이 우수한 다공성 재료가 사용될 수 있으며, 예컨대, 팽창질석, 우레탄, 펄라이트 및 히드로겔로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있고, 바람직하게는 팽창질석이 사용될 수 있다.
박테리아를 이용한 콘크리트 제조 시 박테리아를 단순 투입하게 되면 콘크리트 경화 후 수분이 없기 때문에 생장이 둔화되거나 사멸하게 된다. 경화된 콘크리트 내부에서도 박테리아가 생장할 수 있는 환경을 조성하기 위하여, 본 발명에서 는 무수한 기공에 의한 다공질 구조(유효 수분율 40 부피% 이상 및 공극률 50 부피% 이상)를 가져 뛰어난 수분 흡수력과 보습력을 지닌 상기 다공성 재료를 이용하여 콘크리트 투입 전에 박테리아를 흡착시키도록 한다.
본 발명에 제시된 박테리아 고정을 위한 재료들은 재료 표면에 존재하는 교환성 양이온(Mg2+, Ca2+ 등)에 의하여 유기물을 흡착하는 성질이 있어 박테리아 및 박테리아 생장에 필요한 유기성 영양분(배지 성분)을 흡수한다. 또한 pH가 6~9로서 미생물이 생장하기 위한 최적 환경 조성에 가장 이상적인 재료이다. 한편, 다공성의 코르크 등은 양이온 교환능력이 없어 본 발명에서의 박테리아 흡착재로는 바람직하지 않다.
본 발명에서 상기 다공성 재료를 이용한 박테리아의 흡착에는 침지 공정이 이용되며, 상기 침지 공정에서 박테리아의 최적 흡수 효율을 위해서는 박테리아 배양액 100 중량부에 대하여 1 내지 30 중량부, 바람직하게는 5 내지 20 중량부 함량으로 다공성 재료가 완전히 침지되도록 수행될 수 있다.
본 발명에서는 상기 침지 공정이 음압 조건에서 수행된다. 침지 공정이 음압 조건에서 수행됨으로써 다공성 재료 내부에 존재하는 공기들이 빠져나오면서 박테리아 배양액이 고정화 재료 안으로 용이하게 침투될 수 있다.
상기 음압 조건은 1 내지 20 torr의 음압을 30 내지 60분 동안 가하는 방식으로 적용될 수 있다. 이때, 습도는 50 내지 70 %RH 및 온도는 10 내지 30℃를 유지하는 것이 바람직하다.
여기서, 본 발명에서는 컨테이너에 박테리아 배양액을 투입 및 다공성 재료를 침지시키고 음압 조건에서 박테리아 배양액을 고정화하되, 상기 컨테이너 하부에 구비된 회전팬을 구동시킴으로써 배양액에 투입되어 부유될 수 있는 고정화 재료의 교반을 통해 박테리아와 배양액 영양요소가 고르게 혼합 및 고정화되도록 하게 된다.
이와 같이, 본 발명에서 박테리아 및 박테리아 배양액을 다공성 재료에 고정하는 과정은 음압 조건 및 교반 조건에서 수행되므로, 상기 과정은 교반 장치가 구비된 음압 환경을 조성할 수 있는 멸균 컨테이너 내에서 수행될 수 있다.
도 1a 내지 도 1e는 각각 본 발명에 따른 박테리아 및 박테리아 배양액 고정화를 위한 멸균 컨테이너를 예시적으로 나타낸 정면도, 측면도, 상면도, 배면도 및 내부 모식도이다.
도 1a 내지 도 1e를 참조하면, 본 발명에서 사용되는 멸균 컨테이너(100)는 박테리아 및 박테리아 배양액이 다공성 재료에 고정될 수 있도록 음압 환경 내에서도 압력의 누출 없어야 하며, 이를 위하여 멸균 컨테이너(100)의 상면에는 압력 조절 펌프와 연결되어 압력이 조절되는 압력 조절 밸브(110) 및 멸균 컨테이너(100) 내부의 압력을 확인할 수 있는 압력 지시계(120)가 설치될 수 있다.
상기 멸균 컨테이너(100)의 좌우측면에는 멸균 환경 내에서 재료의 이동 및 조작을 위한 밀폐형 글로브(130)가 설치될 수 있다. 또한 멸균 컨테이너(100) 정면에는 다공성 재료 등을 투입할 수 있는 개폐형 도어(140)가 설치될 수 있고, 개폐형 도어(140)에는 압력의 누수를 막기 위해 도어를 밀착시킬 수 있는 잠금장치가 설치되는 것이 바람직하다.
상기 멸균 컨테이너(100)의 크기는 예컨대, 실내 실험실 등 소규모 환경에서 활용되기 위하여 L3 및 L4가 각각 390 mm 및 340 mm 수준일 수 있고, 상기 도어(140)의 크기는 다공성 재료를 용이하게 투입하기 위하여 L1 및 L2가 각각 250 mm 수준일 수 있고, 또한 상기 글로브(130)의 직경(φ)은 재료의 이동 및 조작을 용이하게 하기 위하여 120 mm 수준일 수 있다. 다만, 상기 멸균 컨테이너(100), 도어(140) 및 글로브(130)의 길이(L3, L4, L1 및 L2) 및 직경(φ)은 실내 실험실 등 소규모 환경에서 활용되기 위한 하나의 예시이며, 이에 한정되지 않고 사용처의 환경에 따라 다양하게 조절할 수 있다.
상기 멸균 컨테이너(100) 내부 중앙에는 교반 장치로서 회전팬(150)이 구비되고, 회전팬(150)의 구동으로 박테리아 및 박테리아 배양액이 다공성 재료에 고농도로 고정되면서 고정화 재료의 부유를 방지하도록 한다. 회전팬(150)은 멸균 컨테이너(100) 하단의 회전모터(160)에 의해 구동될 수 있다.
여기서, 상기 회전팬(150)의 구동 속도는 다공성 재료로의 고정 농도와 재료의 부유 정도에 상당한 영향을 미친다. 본 발명에서는 직경 20 내지 25 cm 회전팬(150)의 구동 속도를 조절해 가면서 고정 효율을 확인한 결과, 100 내지 1,000 rpm, 바람직하게는 250 내지 500 rpm의 구동 속도에서 고정 효율이 가장 우수한 것을 확인하였다. 구동 속도가 느릴 경우 다공성 재료에 고정되는 시간이 길어지고 단시간에 다공성 재료에 고정시키는 효과가 나타나지 않을 수 있고, 재료의 부유 방지 효과가 미흡하며, 구동 속도가 적정 수준을 초과할 경우에는 과도한 회전력 대비 박테리아 및 박테리아 배양액의 고정 효율 향상을 기대하기 어려울 수 있다.
이와 같이, 본 발명에서 음압 환경 및 회전팬(150)을 이용한 교반을 통해 다공성 재료에 박테리아를 고정하는 방법은 다공성 재료를 박테리아 배양액에 완전히 침지시킨 후 음압 환경에서 회전팬(150)을 구동시킴으로써 박테리아 및 유기성 영양분(배지 성분)이 다공성 재료에 빠르고 고르게 흡착되도록 할 수 있다.
본 발명에서, 박테리아 및 박테리아 배양액이 고정된 다공성 재료를 콘크리트 배합, 즉, 골재, 시멘트 및 물을 포함하는 배합물에 투입하여 수행할 경우 골재 사이에 박테리아가 생장할 수 있도록 하게 되며, 이때 박테리아가 흡착된 다공성 재료의 투입은 콘크리트의 소요 휨 강도를 확보할 수 있도록 시멘트 100 중량부에 대하여 1 내지 30 중량부 함량으로 투입될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 20 중량부 함량으로 투입될 수 있다.
본 발명에 따른 박테리아 음압 교반형 고정화 방법에 사용되는 박테리아로서 음압 교반 조건에서 상기 다공성 재료를 이용한 침지 과정에 적합한 박테리아라면 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 콘크리트에 자기정화 및 자기생육 능력 부여가 가능한 호열성 및 호염기 미생물로서 고온의 환경(40~50℃) 및 알칼리성 환경(pH 4~10)에서 생장이 가능하며 수질정화 및 질소고정에 의한 유기농법도 가능한 종이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 박테리아 중 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus), 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 선택된 박테리아가 음압 교반 조건에서 다공성 재료를 이용한 침지 과정에 사용될 경우 이를 이용한 콘크리트 배합 및 경화 후 콘크리트 내에 투입된 박테리아의 사멸을 방지하고 지속적인 생장환경을 조성할 수 있음을 확인하였다.
여기서, 본 발명에서는 상기 박테리아의 최적 배양환경을 조성하기 위하여 특수한 배지 조성에 대해 연구한 결과를 토대로 각 박테리아의 특성에 따라 접종 배양 시 효율이 우수한 최적의 배지 조성과 배양 조건을 제시한다.
구체적으로, 상기 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus)는 정제수 1 ℓ 기준으로 효모 추출물(Yeast extract) 0.05 내지 1 g, 디소듐 숙시네이트(Di-sodium succinate) 0.1 내지 5 g, 구연산철 용액(Ferric citrate solution)(100 ㎖ 당 0.1 g 포함) 2 내지 10 ㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.1 내지 1 g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO47H2O) 0.1 내지 1 g, 염화나트륨(NaCl) 0.1 내지 1 g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.1 내지 1 g 및 염화칼슘이수화물(CaCl22H2O) 20 내지 100 ㎖를 포함하는 배지에서 pH 5 내지 7 조건으로 배양되는 것이 바람직하고, 효모 추출물(Yeast extract) 0.1 내지 0.3 g, 디소듐 숙시네이트(Di-sodium succinate) 0.5 내지 2 g, 구연산철 용액(Ferric citrate solution)(100 ㎖ 당 0.1 g 포함) 3 내지 7 ㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.3 내지 0.7 g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO47H2O) 0.2 내지 0.6 g, 염화나트륨(NaCl) 0.2 내지 0.6 g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.2 내지 0.6 g 및 염화칼슘이수화물(CaCl22H2O) 40 내지 60 ㎖를 포함하는 배지에서 pH 5.5 내지 6 조건으로 배양되는 것이 더욱 바람직하다.
또한 상기 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus)는 정제수 1 ℓ 기준으로 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5 내지 5 g, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5 내지 5 g, 펩톤(Peptone) 1 내지 10 g, 염화나트륨 1 내지 10 g 및 세스퀴탄산나트륨 용액(Nasesquicarbonate solution)(정제수 100 ㎖ 당 탄산수소나트륨(NaHCO3) 2 내지 6 g 및 무수탄산나트륨(Na2CO3 anhydrous) 3 내지 7 g 포함) 20 내지 200 ㎖를 포함하는 배지에서 pH 8 내지 11 조건으로 배양되는 것이 바람직하고, 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5 내지 2 g, 효모 추출물(Yeast extract) 1 내지 3 g, 펩톤(Peptone) 3 내지 7 g, 염화나트륨 3 내지 7 g 및 세스퀴탄산나트륨 용액(Na-sesquicarbonate solution)(정제수 100 ㎖ 당 탄산수소나트륨(NaHCO3) 2 내지 6 g 및 무수탄산나트륨(Na2CO3 anhydrous) 3 내지 7 g 포함) 80 내지 120 ㎖를 포함하는 배지에서 pH 9 내지 10 조건으로 배양되는 것이 더욱 바람직하다.
또한 상기 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus) 및 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus)는 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5 내지 5 g/ℓ, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5 내지 5 g/ℓ, 펩톤(Peptone) 1 내지 10 g/ℓ, 염화나트륨(Sodium chloride) 1 내지 10 g/ℓ 및 한천(agar) 5 내지 25 g/ℓ를 포함하는 영양 한천 배지에서 pH 4 내지 10 및 37 내지 80℃ 조건으로 배양된 것이 바람직하고, 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5 내지 2 g/ℓ, 효모 추출물(Yeast extract) 1 내지 3 g/ℓ, 펩톤(Peptone) 3 내지 7 g/ℓ, 염화나트륨(Sodium chloride) 3 내지 7 g/ℓ 및 한천(agar) 10 내지 20 g/ℓ를 포함하는 영양 한천 배지에서 pH 5 내지 9 및 40 내지 60℃ 조건으로 배양된 것이 더욱 바람직하다.
또한 광합성계 박테리아인 상기 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus) 및 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris)는 정제수 1 ℓ 기준으로 효모 추출물(Yeast extract) 0.1 내지 5 g, 디소듐 숙시네이트 헥사-하이드레이트(Disodium succinate hexa-hydrate) 0.1 내지 5 g, 무수에탄올(Absolute ethanol) 0.1 내지 1 ㎖, 구연산철 용액(Ferric citrate solution) 0.1 내지 5 ㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.1 내지 1 g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO47H2O) 0.1 내지 1 g, 염화나트륨(NaCl) 0.1 내지 1 g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.1 내지 1 g 및 염화칼슘이수화물(CaCl22H2O) 0.02 내지 0.1 g을 포함하는 배지에서 pH 5 내지 7 조건으로 배양된 것이 바람직하고, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5 내지 2 g, 디소듐 숙시네이트 헥사-하이드레이트(Disodium succinate hexahydrate) 0.5 내지 2 g, 무수에탄올(Absolute ethanol) 0.3 내지 0.7 ㎖, 구연산철 용액(Ferric citrate solution) 0.5 내지 1.5 ㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.3 내지 0.7 g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO47H2O) 0.2 내지 0.6 g, 염화나트륨(NaCl) 0.2 내지 0.6g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.2 내지 0.6 g 및 염화칼슘이수화물(CaCl22H2O) 0.03 내지 0.07 g을 포함하는 배지에서 pH 5.5 내지 6.5 조건으로 배양된 것이 더욱 바람직하다.
또한 상기 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 정제수 1 ℓ 기준으로 동물 조직의 펩신 소화물(Peptic digest of animal tissue) 1 내지 10 g, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5 내지 3 g, 염화나트륨(Sodium chloride) 1 내지 10 g 및 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5 내지 3 g을 포함하는 배지에서 pH 4 내지 10 조건으로 배양된 것이 바람직하고, 동물 조직의 펩신 소화물(Peptic digest of animal tissue) 3 내지 7 g, 효모 추출물(Yeast extract) 1 내지 2 g, 염화나트륨(Sodium chloride) 3 내지 7 g 및 쇠고기 추출물(Beef extract) 1 내지 2 g을 포함하는 배지에서 pH 6 내지 8 조건으로 배양된 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서 상기 박테리아에 대해서는 각 배지에 접종 후 상기 배양 조건의 인큐베이터(30 내지 40℃)에서 103 내지 1011 cell/㎖의 농도가 될 수 있도록 3 내지 12일간 배양이 수행될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 9일간 배양이 수행될 수 있다.
이상과 같이, 본 발명은 박테리아 생장처로 활용되는 다공성 재료에 박테리아 고정 시 음압 교반 조건을 이용함으로써 기존 콘크리트 배합 시 박테리아 적용 방법의 심각한 문제점인 박테리아 사멸 문제를 해결할 수 있고, 박테리아가 흡착재에 흡착되는 시간을 획기적으로 단축하면서 다공성 재료에 고정화되는 박테리아의 농도를 향상시킬 수 있으며, 고정화 과정에서 저밀도 다공성 재료의 부유 문제 및 비균질 고정화 문제를 해결할 수 있게 된다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
미생물 분리 및 배양
경기도 여주 소재 나대지 토양에서 채취된 시료 50 g을 멸균 증류수 400 ㎖에 넣고 교반한 후 10 ㎖를 취하여 TSA 배지(트립톤 15 g, 소이톤 5 g, 염화나트륨 5 g 및 아가 15 g을 증류수 1 ℓ에 녹여 pH 7로 조정한 후 120℃에서 15분간 오토클레이브 멸균 처리하고 60℃로 냉각 후 멸균된 배양 접시에 분주하여 사용)에 가하고 도말법으로 접종하였다. 접종한 박테리아를 16S rDNA 염기서열 분석법으로 분리하고 동정하였으며, 동정된 박테리아는 각각 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus)(수탁번호 KEMB(환경미생물은행(Korea Environmental Microorganisms Bank)9000-009 참조), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus)(수탁번호 KEMB9000-002 참조), 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus)(수탁번호 KEMB563-529 참조), 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus)(수탁번호 KEMB563-526 참조), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus)(수탁번호 KEMB1-2 참조), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris)(수탁번호 KEMB1-6 참조), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)(수탁번호 KEMB4-215 참조) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(수탁번호 KEMB4-218 참조)인 것을 확인하였다.
상기 분리된 박테리아 각각에 대해 다양한 조성의 배지를 이용하여 배양을 수행하였으며, 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus)의 경우 각각 하기 표 1(pH 5.5 내지 6.0) 및 표 2(pH 9.7)에 나타낸 배지 조성 및 배양 조건에서 가장 우수한 증식을 보였고, 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus) 및 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus)의 경우 하기 표 3(pH 6)에 나타낸 배지 조성 및 배양 조건에서 가장 우수한 증식을 보였고, 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus) 및 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris)의 경우 하기 표 4(pH 6)에 나타낸 배지 조성 및 배양 조건에서 가장 우수한 증식을 보였고, 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 경우 하기 표 5(pH 6)에 나타낸 배지 조성 및 배양 조건에서 가장 우수한 증식을 보여, 이후 실험에서 는 상기 조건에서 배양된 박테리아 배양액을 사용하였다.
| composition | |
| Yeast extract | 0.2 g |
| Di-sodium succinate | 1 g |
| Ferric citrate solution(0.1 g per 100 ㎖) | 5 ㎖ |
| KH2PO4 | 0.5 g |
| MgSO47H2O | 0.4 g |
| NaCl | 0.4 g |
| NH4Cl | 0.4 g |
| CaCl22H2O | 50 mg |
| Trace element solution(see below) | 1 ㎖ |
| Distilled water up to | 1 ℓ |
| Trace element solution | |
| ZnSO47H2O | 0.1 g |
| MnCl24H2O | 30 mg |
| H3BO3 | 0.3 g |
| CoCl26H2O | 0.2 g |
| NiCl26H2O | 20 mg |
| CuCl22H2O | 10 mg |
| Na2MoO42H2O | 30 mg |
| Distilled water | 1 ℓ |
| composition | |
| Beef extract | 1 g |
| Yeast extract | 2 g |
| Peptone | 5 g |
| Sodium Chloride | 5 g |
| 1M Na-sesquicarbonate solution | 100 ㎖ |
| Distilled water up to | 1 ℓ |
| 1M Na-sesquicarbonate solution | |
| NaHCO3 | 4.2 g |
| Na2CO3 anhydrous | 5.3 g |
| Distilled water up to | 100 ㎖ |
| Name | Component | |
| Nutrient agar media (pH 4~10 at 37~80℃) |
Beef extract | 1 g/ℓ |
| Yeast extract | 2 g/ℓ | |
| Peptone | 5 g/ℓ | |
| Sodium chloride | 5 g/ℓ | |
| agar | 15 g/ℓ | |
| composition | |
| Yeast extract | 1 g |
| Disodium succinate hexa-hydrate | 1 g |
| Absolute ethanol | 0.5 ㎖ |
| Ferric citrate solution(0.5 %(w/v)) | 1 ㎖ |
| KH2PO4 | 0.5 g |
| MgSO47H2O | 0.4 g |
| NaCl | 0.4 g |
| NH4Cl | 0.4 g |
| CaCl22H2O | 0.05 g |
| Trace element solution(see below) | 1 ㎖ |
| Distilled water up to | 1 ℓ |
| Trace element solution | |
| ZnSO47H2O | 0.1 g |
| MnCl24H2O | 30 mg |
| H3BO3 | 0.3 g |
| CoCl26H2O | 0.2 g |
| NiCl26H2O | 20 mg |
| CuCl22H2O | 10 mg |
| Na2MoO42H2O | 30 mg |
| Distilled water | 1 ℓ |
| composition | |
| Peptic digest of animal tissue | 5 g |
| Yeast extract | 1.5 g |
| Sodium chloride | 5 g |
| Beef extract | 1.5 g |
| Distilled water | 1 ℓ |
제조예 1 : 내부 교반형 멸균 음압 컨테이너를 이용한 박테리아가 고정된 다공성 재료 제조
내부 교반형 멸균 음압 컨테이너(도 1e 참조)에 상기 제조된 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus) 배양액을 105 cell/㎖ 농도로 투입하고, 박테리아 배양액 100 중량부에 대하여 10 중량부 함량의 팽창질석을 상기 배양액에 침지시킨 후 도어를 닫고, 약 15 torr의 음압 환경이 되도록 밸브를 조절하고, 300 rpm 속도로 회전팬을 구동하여 30분, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 흡착을 실시하였으며, 이후 박테리아가 고정된 팽창질석을 회수하였다.
제조예 2
상기 제조예 1에서 회전팬 구동 속도를 100 rpm으로 조절한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 박테리아가 고정된 다공성 재료를 제조하였다.
제조예 3
상기 제조예 1에서 회전팬 구동 속도를 200 rpm으로 조절한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 박테리아가 고정된 다공성 재료를 제조하였다.
비교 제조예 1 : 비교반형 멸균 음압 컨테이너를 이용한 박테리아가 고정된 다공성 재료 제조
비교반형 멸균 음압 컨테이너(도 2 참조) 내부에 설치된 배양액 통(200)에 상기 제조된 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus) 배양액을 105 cell/㎖ 농도로 투입하고, 박테리아 배양액 100 중량부에 대하여 10 중량부 함량의 팽창질석을 상기 배양액에 침지시킨 후 도어를 닫고, 약 15 torr의 음압 환경이 되도록 밸브를 조절하여 30분, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 흡착을 실시하였으며, 이후 배양액 통(200)으로부터 박테리아가 고정된 팽창질석을 회수하였다.
비교 제조예 2 : 박테리아가 흡착된 흡착재 제조
등록특허 제1859211호에 개시된 흡착재가 침지된 통(도 3 참조)에 상기 제조된 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus) 배양액을 105 cell/㎖ 농도로 투입하고, 박테리아 배양액 100 중량부에 대하여 10 중량부 함량의 팽창질석을 흡착 패드(망사눈의 크기 700×700 ㎛, 패드 두께 5 mm, 5단 연결)에 투입하고 배양액 통에 침지 및 부유시킨 후 뚜껑을 닫아 습도 60 %RH 및 온도 20℃의 환경에서 보관하였다. 보관 후 30분, 24시간, 48시간 및 72시간이 지난 후 배양액 통으로부터 흡착 패드를 꺼내어 개폐형 클립을 통해 박테리아가 흡착된 흡착재를 회수하였다.
실험예
상기 제조된 박테리아 고정 팽창질석 및 흡착재에서의 흡착 생균수를 하기 방법으로 측정하였고 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
[생균수 측정방법]
생균수의 측정은 생균수 측정방법(Viable cell count method)을 이용하여 수행되었다. 팽창질석 및 흡착재를 30℃ 환경의 교반기에 투입하여 3시간 동안 균을 탈착하고, 균이 탈착된 배양액을 10-6 비율로 희석한 후 한천 배지에 접종하여 3일 동안 배양하였다. 배양이 완료된 한천 배지의 박테리아 군락 형성 개수를 계수하여 흡착 생균수를 도출하였다.
| 구분 | 생균수(cell/㎖) | |||
| 30분 후 | 24시간 후 | 48시간 후 | 72시간 후 | |
| 제조예 1 (내부교반-음압컨테이너) |
1.4×109 | 1.42×109 | 1.5×109 | 1.52×109 |
| 제조예 2 (100 rpm) |
1.14×109 | 1.25×109 | 1.37×109 | 1.44×109 |
| 제조예 3(200 rpm) | 1.18×109 | 1.33×109 | 1.45×109 | 1.48×109 |
| 비교 제조예 1(음압컨테이너) | 1.2×109 | 1.22×109 | 1.25×109 | 1.3×109 |
| 비교 제조예 2(흡착패드) | 0 | 3.5×106 | 1.2×108 | 8.2×108 |
표 6을 참조하면, 본 발명에 따라 교반형 멸균 음압 컨테이너를 이용하여 다공성 재료에 고정화된 박테리아 생균수는 30분부터 72시간까지 모두 비교반형 음압 컨테이너를 활용한 경우에 비해 흡착 생균수가 증대되는 것을 알 수 있다. 다만, 시간이 지날수록 흡착 생균수의 차이가 크지 않게 되나, 초기 30분에서 1.4×109 cell/㎖로, 동일한 재령에서 1.2×109 cell/㎖의 박테리아 개체수를 보이는 비교반형 음압 컨테이너를 활용한 경우에 비해 약 17% 우수한 결과를 보여, 다공성 재료에 박테리아 및 박테리아 배양액을 고정시키는 데 소요되는 시간 단축을 극대화시킬 수 있음이 확인된다.
한편, 교반형 멸균 음압 컨테이너의 회전팬 구동 속도를 조절하여 구동 속도가 일정 수준에 미치지 못할 경우(제조예 2 및 3 참조)에는 단시간에 다공성 재료에 고정시키는 효과가 나타나지 않을 수도 있는 것으로부터 고정 효율을 극대화시킬 수 있는 회전팬의 구동 속도가 존재함을 확인할 수 있다.
다른 한편, 종래와 같이 흡착패드를 이용한 고정화 방법에서는 30분 이후에는 흡착되지 않고, 24시간 이후에서 3.5×106 cell/㎖, 72시간 경과한 이후에는 8.2×108 cell/㎖의 농도에 그쳐, 장시간 고정 이후 뿐만 아니라 단시간내 고정 효율 면에서도 본 발명에 따른 교반형 멸균 음압 컨테이너를 이용한 방법과 현저한 차이가 있음이 확인된다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
100 : 멸균 컨테이너
110 : 압력 조절밸브
120 : 압력 지시계 130 : 밀폐형 글로브
140 : 개폐형 도어 150 : 회전팬
160 : 회전모터
120 : 압력 지시계 130 : 밀폐형 글로브
140 : 개폐형 도어 150 : 회전팬
160 : 회전모터
Claims (4)
- 하부에 회전팬이 구비된 컨테이너에 박테리아 배양액을 투입 및 다공성 재료를 침지시키고, 음압 조건에서 상기 회전팬을 구동하여, 콘크리트에서 박테리아 활성화를 위한 박테리아 및 박테리아 배양액을 고정화하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 다공성 재료는 팽창질석, 우레탄, 펄라이트 및 히드로겔로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 음압 조건은 1 내지 20 torr의 음압을 30 내지 60분 동안 가하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 회전팬은 100 내지 1,000 rpm의 속도로 구동되는 것을 특징으로 하는 방법.
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