KR20220051817A - 암 및/또는 뇌질환 바이오마커인 엑스트라-도메인 b 파이브로넥틴 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents
암 및/또는 뇌질환 바이오마커인 엑스트라-도메인 b 파이브로넥틴 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDFInfo
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- G—PHYSICS
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- G—PHYSICS
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- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Abstract
본 발명은 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(extra-domain B fibronectin; EDB-FN)을 포함하는 뇌종양 예후 예측용 조성물 및 키트 등에 관한 것으로서, 상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴은 뇌종양 환자에서 과발현될 뿐만 아니라, 그 중 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)이 짧아 예후가 나쁜 뇌종양 환자에서 훨씬 발현 수준이 높으므로, 본 발명의 뇌종양 예후 예측용 조성물 및 키트, 뇌종양 예후 예측을 위한 정보제공방법은 뇌종양, 바람직하게는 다형성교모세포종과 같은 악성 뇌종양의 예후를 정확하고 신속하게 진단하는데 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(extra-domain B fibronectin; EDB-FN, CIG, ED-B, FINC, FN, FN1, FNZ, GFND, GFND2, LETS, MSF, cold-insoluble globulin, fibronectin 1, migration-stimulating factor; Entrez Gene ID: 2335, Genbank accession No. NC_000002.11, NC_000002.12 또는 NG_0.12196.1)를 포함하는 암 및/또는 뇌질환 진단용 바이오마커 및 상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴의 발현 정도에 따라 암/및 또는 뇌질환을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.
파이브로넥틴(fibronectin)은 세포외 기질(extracellular matrix) 및 원형질 막(plasma membrane)에서 주로 발견되는 당단백질(glycoprotein)이다. 이는 인테그린, 콜라겐, 및 피브린과 같은 다양한 세포외 기질 단백질에 결합하면서 세포 이동 및 부착(cell migration and adhesion)을 조절한다. 파이브로넥틴 단량체는 반복되는 유닛에 따라 세 가지 유형(type I, II 및 III)으로 분류된다. 파이브로넥틴 유전자의 세 영역에서 제조된 선택적 스플라이싱 도메인(alternative splicing domain)은 일정한 스플라이싱 패턴을 가진다. 생성된 동형 단백질(isoform)은 type III 반복 유닛에 위치한 스플라이싱 부위에 따라 명명된다: 파이브로넥틴의 엑스트라-도메인 A(extra-domain A, EDA-FN), 엑스트라-도메인 B(extra-domain B, EDB-FN), 및 type III 연결 부분(type III connecting segment, IIICS-FN). EDB-FN은 종양태아성 항원(oncofetal antigen)이다. EDB-FN은 비소세포폐암(non-small cell lung carcinoma), 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 및 전립선암(prostate cancer)과 같은 다양한 인간 암에서 과발현된다. 또한, EDB-FN은 두경부암(head and neck cancer)의 신혈관생성 마커로 활용된다. 뇌에서 파이브로넥틴의 역할에도 불구하고, EDB-FN은 환자의 주요 다형성교모세포종을 진단하기 위한 추적 도구로 활용될 수 있음은 물론, 설치류 모델에서 다형성교모세포종 치료 및 신경교종 방사면역치료(radioimmunotherapy)의 신규 표적(target)으로 제안되었다. EDB-FN에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있음에도 불구하고, EDB-FN의 역할은 여전히 밝혀지지 않았다.
종래에 모든 주요 기관의 암에서 EDB-FN 발현 수준을 비교하는 연구는 수행된 바 없으며, 생물정보학 데이터세트를 이용하여 EDB-FN 발현을 통한 예후 예측을 포함하는 연구는 아직 수행되지 않았다.
뇌종양은 뇌에서 자라는 불필요한 세포덩어리를 지칭하는 말로서 종양의 발생 위치 및 발견 시점의 종양 크기, 증상 후 진단까지의 시간, 뇌종양이 환자의 기능에 미친 영향 등에 따라 그 예후가 크게 달라지므로, 정확한 진단이 매우 중요하다.
뇌종양의 등급은 종양의 악성도를 나타내는 것으로 세계보건기구(WHO)의 분류체계에 따라 1~4등급으로 분류할 수 있다. 1~2등급은 양성 뇌종양이고, 3~4등급은 악성 뇌종양이다. 양성 종양은 종양의 성장속도가 느리고 주변부 침윤이 적은 반면에, 악성 뇌종양은 종양/암의 성장속도가 빠르고 주변부 침윤이 높아 수술적 제거 중 정상 뇌조직의 손상 발생 확률이 높아 일부 뇌 기능이 사라져 말이 어눌해지거나 한쪽 팔만 힘이 빠지는 등 이상 증상이 발생할 수 있고, 이로 인해 최대안전절제(maximal safe resection)이 수술적 치료 원칙일 수 밖에 없는 가운데 이에 따라 치료 이후에도 재발 위험성이 높다.
구체적으로, 1등급 뇌종양은 성장속도가 늦고 최소의 악성도를 보이고, 대개 비교적 장기간의 생존율을 보인다. 2등급 뇌종양은 상대적으로 성장속도가 늦고 현미경하에서 약간의 비정상적인 소견을 보이며, 주위 정상조직으로 침윤해 들어갈 수 있고, 악성으로 변환할 수 있다. 3등급 뇌종양은 활발하게 비정상적인 세포를 생산하고, 현미경하에서 비정상적인 형태를 나타내며, 주위 정상 뇌조직으로 침윤해 들어가고, 재발위험이 있으며, 대개 더 악성인 형태로 재발하는 경우가 많다. 4등급 뇌종양은 성장속도가 타 등급에 비해 매우 빠르고, 현미경하에서 매우 비정상적인 소견을 보이며, 신생혈관을 많이 형성하여 빠른 성장속도를 유지하고, 조직의 중앙에 괴사된 조직이 관찰된다.
1~2등급 뇌종양은 수술적 치료 성공 시 추적 관찰 중 재발률이 적은 경우가 많으나, 3등급과 4등급의 악성 뇌종양은 항암제와 방사선 치료를 병행하는 등 뇌종양의 등급에 따라 치료방법이 상이하다. 특히 4등급에 해당하는 교모세포종은 발병과 진단 후 암의 성장과 예후의 악화가 급속도로 진행되어 적극적으로 조치하지 않으면 여러 신경학적 장애가 발생하고 몇 달 안에 사망에 이를 수 있으므로 뇌종양의 정확한 진단은 환자의 치료 및 생존기간 연장에 있어서 매우 중요하다.
이에, 본 발명자들은 암 및/또는 뇌질환 바이오마커로서 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(EDB-FN)의 유용성은 물론, 상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴의 발현 정도에 따라 무진행 생존기간의 차이가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴을 포함하는 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물, 예측용 조성물, 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 뇌종양 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(extra-domain B fibronectin; EDB-FN Entrez Gene ID: 2335, Genbank accession No. NC_000002.11, NC_000002.12 또는 NG_0.12196.1)를 포함하는 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 바이오마커는 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)이 짧은 뇌종양 개체에서 발현량이 증가하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 뇌종양 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 뇌종양 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴과 결합하는 화합물, 항체, 앱타머, 프라이머, 및 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 뇌종양 예후 예측을 위한 진단방법 또는 정보제공방법을 제공한다:
(1) 환자의 생물학적 시료로부터 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 발현 수준에 따라 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 저발현군과 고발현군으로 분류하는 단계; 및
(3) 상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 고발현군에 해당하는 경우, 예후가 나쁜 것으로 판별하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 환자 유래의 조직, 객담, 세포, 혈액, 혈장, 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (1) 단계에서 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 발현 수준은 웨스턴블롯, 단백질 칩, 효소면역분석법(ELISA), 방사선면역분석, 면역침강법, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 보체 고정 분석법, 유세포 분석(FACS), 질량분석법 및 조직 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 생물학적 시료의 조직 마이크로어레이 측정 결과 평균 염색 강도가 140 이하인 경우, 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 저발현군으로, 평균 염색 강도가 160 이상인 경우, 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 고발현군으로 분류하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 고발현군에 해당하는 경우, 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)이 짧은 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(extra-domain B fibronectin; EDB-FN)을 포함하는 뇌종양 예후 예측용 조성물 및 키트 등에 관한 것으로서, 상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴은 뇌종양 환자에서 과발현될 뿐만 아니라, 그 중 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)이 짧아 예후가 나쁜 뇌종양 환자에서 훨씬 발현 수준이 높으므로, 본 발명의 뇌종양 예후 예측용 조성물 및 키트, 뇌종양 예후 예측을 위한 정보제공방법은 뇌종양, 바람직하게는 교모세포종과 같은 악성 뇌종양의 예후를 정확하고 신속하게 진단하는데 활용될 수 있다.
도 1은 병리학 전문의의 암맹판독으로 환자 조직 마이크로어레이를 분석하여 염색 강도와 EDB-FN 발현량간의 상관관계를 나타낸 것이다. (A)는 조직 마이크로어레이 분석 후 염색양성 컬러 이미지를 추출한 것이고, (B)는 EDB-FN 발현량과 암맹판독 염색점수 간 상관관계를 나타낸 것이다. (C)는 염색점수 각 군 간 통계학적 유의성을 나타낸 것이고, (D)는 음성군, '1+'군, '2+'군을 EDB-FN 저발현군, '3+'군, '4+'군을 EDB-FN 고발현군으로 분류한 경우, 염색점수와 통계학적 유의성을 나타낸 것이다. 이 때, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001이다.
도 2는 인간 뇌 병리학에서 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(EDB-FN)의 발현에 관한 것으로서, (A)는 EDB-FN 발현과 다형성교모세포종 환자의 예후 간 관계를 나타낸 것이다. 21개의 다형성교모세포종 데이터세트로부터 총 1,615개의 샘플을 분석하였다. 음의 Z-value는 나쁜 예후를 가리킨다. Z-value 적분값은 Lipt
k's method를 이용하여 수득하였다. 검은 원은 각 데이터세트의 Z-value를 가리키며, Kaplan-Meier 생존 곡선은 가장 많은 샘플을 가진 대표적인 PMID-18772890-TCGA 데이터세트(그래프상 빈 원)을 이용하여 그렸으며, 이 때 전체생존률(overall survival)에 관련한 Z-value는 -0.97이였다. (B)는 EDB-FN 발현과 다형성교모세포종 환자의 생존기간간 상관관계를 나타낸 것이다. 환자의 임상적 데이터와 EDB-FN 발현 수준을 통합하여 다형성교모세포종 환자 21명의 생존율 분석을 수행하였다. 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)에 있어 EDB-FN 저발현군은 301일의 중앙값은 갖는 데에 비해 EDB-FN 고발현군은 105일의 중앙값을 가졌고, 이는 EDB-FN 고발현군이 EDB-FN 저발현군에 비교하여 5.5배의 악성 뇌종양 진행 확률을 갖는 것으로 분석되었다(hazard ratio = 5.53, 95% confidence interval = 1.22-25.05). 왼쪽은 조직 마이크로어레이 분석(TMA) 결과로 크기 바 = 2 mm이며, 오른쪽은 Kaplan-Meier 생존율 곡선이다.
도 2는 인간 뇌 병리학에서 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(EDB-FN)의 발현에 관한 것으로서, (A)는 EDB-FN 발현과 다형성교모세포종 환자의 예후 간 관계를 나타낸 것이다. 21개의 다형성교모세포종 데이터세트로부터 총 1,615개의 샘플을 분석하였다. 음의 Z-value는 나쁜 예후를 가리킨다. Z-value 적분값은 Lipt
본 발명자들은 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(extra-domain B fibronectin; EDB-FN)이 뇌종양의 예후 예측을 진단할 수 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 상기 “엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(extra-domain B fibronectin; EDB-FN)”은, CIG, ED-B, FINC, FN, FN1, FNZ, GFND, GFND2, LETS, MSF, SMDCF, cold-insoluble globulin, fibronectin 1 또는 migration-stimulating factor로도 알려져 있으며, 서열정보는 Entrez Gene ID: 2335, Genbank accession No. NC_000002.11, NC_000002.12 또는 NG_0.12196.1일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(EDB-FN) 고발현군은 저발현군에 비교하여 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)에 있어 암-진행 확률이 5.5배 높은 불량한 악성 뇌종양 예후를 가짐을 확인하였다.
본 발명에서, 용어 “무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)이란, 질병이 진행되거나 환자가 악화되기 전까지 환자가 생존한 기간을 말한다. 예를 들어 어떤 환자의 PFS가 12개월이라면, 이것은 환자가 병의 진행 없이 1년을 지낼 수 있었다는 의미이다. 다시 말해 PFS가 짧다면 진단과 치료 후에도 질병의 악화가 빨랐다는 의미이다. 본 발명에서, 용어 “전체 생존기간(overall survival, OS)”이란, 환자가 진단이 된 후 생을 마감하는 순간까지의 기간을 추적한 수치를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, EDB-FN이 고발현되는 경우 무진행 생존기간(PFS)이 훨씬 짧아져 병의 예후가 좋지 않은 정보를 제공한다.
상기 결과로부터, 본 발명은 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(EDB-FN)을 포함하는 뇌종양 예후 예측용 조성물 등을 제공한다.
특히 4등급에 해당하는 교모세포종은 질병의 진단과 치료 이 후에도 급속도로 질병이 진행되어 적극적으로 조치하지 않으면 여러 신경학적 장애가 발생하고 몇 달 안에 사망에 이를 수 있는 위험한 질병이다. 본 발명의 바이오마커 조성물 등을 이용하면 뇌종양 예후 진단이 가능하므로 환자의 치료 및 생존기간 연장에 중요한 정보를 제공할 수 있다.
상기 조성물은 생물학적 시료로부터 EDB-FN의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함할 수 있으며, 상기 제제는 EDB-FN의 발현 수준을 확인함으로써 본 발명의 바이오마커인 EDB-FN의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.
본 발명에서, EDB-FN의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴과 결합하는 화합물, 항체, 앱타머, 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, EDB-FN의 검출을 용이하게 하는 당업계에 공지된 여러 도구, 시약, 예를 들어 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 안정화제 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, EDB-FN의 발현 수준을 측정하는 방법으로 단백질 수준에서는 웨스턴블롯, 단백질 칩, 효소면역분석법(ELISA), 방사선면역분석, 면역침강법, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 보체 고정 분석법, 유세포 분석(FACS), 질량분석법 또는 조직 마이크로어레이 등을 수행할 수 있다. 핵산 수준에서는 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, 실시간 중합효소연쇄반응, 뉴클레이즈 보호 분석법, 핵산 마이크로어레이, 또는 노던블롯 등을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 EDB-FN의 발현 수준을 'Fiji'(https://imagej.net/software/fiji/) 이미지 분석 프로그램을 사용하여 염색점수(staining score)를 이미지 강도(intensity) 값으로 정량화하였다. 구체적으로, 조직 염색 결과 평균 염색 강도가 131.9인 경우 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 저발현군으로, 평균 염색 강도가 163.4인 경우, 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 고발현군으로 분류하였다.
본 발명에서, 생물학적 시료는 환자 유래의 조직, 객담, 세포, 혈액, 혈장, 소변, 또는 타액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “개체”는 뇌종양의 예방, 치료, 및/또는 진단이 필요한 가축, 인간 등의 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서, 암은 뇌종양, 두경부암, 구강암, 갑상선암, 폐암, 유방암, 위암, 간암, 췌장암, 결장암, 신장암, 신세포암, 신우요관암, 자궁암, 전립선암, 또는 피부암 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 EDB-FN이 과발현되는 암일 수 있고, 그 비제한적이 예로서 뇌종양 등이 있으며, 더욱 바람직하게는 성상세포종, 다형성교모세포종, 핍지신경교종, 핍지교성상세포종, 상의세포종, 수모세포종, 혈관모세포종, 뇌수막종, 뇌하수체선종, 두개인두종, 또는 맥락총유두종일 수 있다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 유전자 발현 프로파일(gene expression profile) 및 생존 분석(survival analysis)
모든 유전자 발현 프로파일은 Oncopression으로부터 내려받았으며, EDB-FN 관련 데이터는 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(extra-domain B fibronectin; Entrez Gene ID: 2335, Genbank accession No. NC_000002.11, NC_000002.12 또는 NG_0.12196.1)을 연구함으로써 수집하였다. EDB-FN 유전자의 변이체는 ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)를 사용하여 조사했으며, 126개의 변이체가 확인되었다. 악성 뇌교종에서 발현 수준을 스크리닝하기 위해, 전사체학 데이터베이스 분석을 수행했기 때문에, 변이체의 분석은 본 발명에서 수행되지 않았다. EDB-FN의 전사체학 발현 수준은 Single Channel Array Normalization and Universal exPression Codes(SCAN,UPC) package of R로 정규화하였고, UPC 값으로 나타냈다. 보다 구체적으로, Oncopression 데이터를 위해 단일 샘플 정규화 방법(single sample normalization method)를 사용했으며, 모든 샘플은 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (GPL570 or A-AFFY-44) platform으로부터 받았다. 발현 값은 0.0 내지 1.0으로 나타냈으며, 1.0은 완전히 전사 활성화된 경우를 나타낸다. 정상세포 대비 암세포의 비율(cancer-to-normal ratio)은 암세포에서 발현 값을 정상 세포에서 평균 발현 값으로 나누어 계산하였다. 생존 분석을 위해, 발현 프로파일 및 환자 예후 정보를 포함한 뇌종양 데이터세트를 수집한 후, 30개 이하의 샘플은 분석에서 제외하였다. 모든 유전자 발현 값은 데이터세트에 의해 퀀타일 정규화(quantile normalization)되었다. Z-value는 각 데이터세트로 로그순위 검정(log-rank test)하여 계산하였고, 체중으로서 각 데이터세트의 환자 수의 제곱근을 이용하여 Lipt
k method로 평균을 계산했다.
실시예 2. 환자 조직 마이크로어레이(tissue microarray, TMA) 샘플 제조 및 해석
환자 조직 샘플은 수술 및 병리학적 진단 후 파라핀 블록(paraffin block)에 보관하였으며, 상기 환자는 성인 21명으로, 연령 18세부터 75세이며, 다형성교모세포종으로 진단받았다. 각 환자별로 3~4가지의 다른 종양 부위로부터 총 65개의 조직 샘플을 포함하는 조직 마이크로어레이 슬라이드를 제조하였다. 조직 심(tissue core)은 직경 2 mm로 각 블록별로 45개의 구멍을 포함하는 피이식자 파라핀 블록(recipient paraffin block)으로 이식되었다. 파라핀으로 채워진 상기 블록을 3 μm 두께로 잘라 슬라이드 위에 두었다. 이후 상기 조직을 염색한 후, 병리학 전문의로부터 암맹판독(blind review)을 통해 EDB-FN 존재 및 수준에 대한 판독을 받았다.
상기 암맹판독으로 수행한 염색결과는 'Fiji'(https://imagej.net/software/fiji/) 이미지 분석 프로그램을 사용하여 다음과 같은 방법으로 염색점수(staining score)를 이미지 강도(intensity) 값으로 정량 및 표준화할 수 있다. 스캔한 TMA 조직 이미지에서 조직 이외에 배경 아티팩트(artifact) 제거와 선명도 확보를 위해 'Image>Adjust>Brightness/Contrast' 알고리즘을 이용하여 'Minimum' 100, 'Maximum' 255로 이미지를 조정한 뒤 원형/타원형 조직에 맞게 관심영역(region of interest, ROI)를 추출하였다. 이 후, 'Image>Color>Colour Deconvolution'에서 'H DAB' vector 알고리즘을 이용하여 염색양성 컬러 이미지를 추출하고(도 1A), 추출한 컬러 이미지를 'Process>Binary>Make Binary' 알고리즘을 이용하여 이진법 이미지(binary image)를 형성한 뒤 'Analyze>Analyze Particles' 알고리즘을 이용하여 조직내 배경 아티팩트를 제거한 최종 관심영역을 확정하고, 'Analyze>Tools>ROI Manager'를 이용하여 'Measure'를 시행하여 최종 관심영역 내의 이미지 강도 결과를 확보한 뒤, 이에 대한 분석을 수행하였다. 염색 강도는 음성 또는 '1+'(매우 약한 양성) 부터 '4+'(매우 강한 양성)으로 나타내었다.
이후, EDB-FN 발현과 환자의 예후 예측간의 상관관계를 분석하기 위해 환자 조직 마이크로어레이에서 EDB-FN 발현 수준의 결과와 각 환자의 임상적 데이터를 연결시키는 작업을 수행하였다. 변수로서 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS) 및 전체 생존기간(overall survival, OS)을 이용하여 환자 예후를 분석하였다.
실시예 3. 세포 배양
U87MG, U251MG, U373MG, MCF-7, PC3, B16F10, 및 B16F1 세포는 American Type Culture Collection (VA, USA)에서 구매하였다. 모든 세포는 습도 5% CO2 환경에서 37 °C를 유지하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, IL, USA), 100 U/mL penicillin (Gibco), 및 100 μg/mL streptomycin (Gibco)을 첨가하여 minimal essential medium (MCF-7), RPMI (PC3, B16F10, B16F1), 또는 Dulbecco's modified Eagle's medium (U87MG, U251MG, U373MG)에서 배양하였다. 상기 모든 세포 배양 배지는 Gibco에서 구매하였다.
실시예 4.
In vitro
3D 회전 타원체 배양(spheroid culture)
3D 회전 타원체 배양을 위해, 모든 세 악성 뇌교종 세포주(U87MG, U251MG, and U373MG)를 웰(well) 당 1~5 × 103 cell로 Nunclon Sphera Microplate 96-well round bottom plate (Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다. 상기 플레이트를 2분동안 200 x g로 원심분리한 후, 37 °C, 5% CO2 배양기에 두었다. 상기 세포는 6일동안 배양하였으며, 3 일째에 배지의 절반을 변경하였다. 이미징을 위해, 형성된 회전 타원체를 4% (w/v) paraformaldehyde (Wako, VA, USA)로 고정된 8-well chambered coverglass slide (Thermo Fisher Scientific)로 옮겨 보관하였다.
실험결과 1. 다양한 기관 및 암세포에서 EDB-FN의 발현
정상 및 암환자 조직에서 EDB-FN의 발현 수준을 확인하기 위해, Oncopression을 이용하여 다양한 기관 및 뇌종양에서 정상세포 대비 암세포의 EDB-FN의 발현을 비교를 수행하였다. 다양한 기관 유래의 총 17가지 암으로부터 수득한 18,850개의 샘플과 각 기관별 4,494개의 정상 샘플의 EDB-FN 발현 수준을 비교 및 분석하였다. 15가지 암은 정상 조직과 암 조직 간 EDB-FN 발현 차이가 통계학적으로 유의한 것으로 확인되었다(표 1).
특히, 두경부암 및 뇌종양에서 정상세포 대비 암세포의 EDB-FN 발현 비율이 약 1.42 배 이상(p < 0.001)으로 가장 크게 증가하였으며, 이는 다른 암에 비해 높은 수치이다.
실험결과 2. 뇌종양에서 EDB-FN의 발현
뇌에서 EDB-FN 발현을 특이적으로 분석하기 위해, 뇌종양을 포함하여 다양한 뇌 병리학 관련 총 3,687개의 샘플을 등급 및 분자적 생물학적 상태에 따라 분석하였다(표 2).
비종양 뇌 병리학 분석 결과, 정상 뇌 조직과 파킨슨병(Parkinson's disease) 환자의 조직 간 EDB-FN 발현에 상당한 차이가 없었다. 그러나, 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia) 환자(p < 0.0001)의 조직에서 EDB-FN 발현이 상당히 감소했으며, 주요 우울증 장애 환자(p < 0.001) 및 간질 환자(epilepsy)(p < 0.05)의 조직에서는 EDB-FN 발현의 상당한 증가가 관찰되었다.
실험결과 3. 조직 마이크로어레이 결과와 EDB-FN간의 상관관계
EDB-FN의 뇌종양 예후 바이오마커로서의 유용성을 평가하기 위해, 먼저 병리학적으로 다형성교모세포종으로 진단받은 환자들로부터 조직 샘플을 수득한 후, 조직 마이크로어레이(TMA) 결과에 대하여 병리학 전문의의 암맹판독을 수행하였다.
평균 연령이 51세인 총 21명(13명의 남성, 8명의 여성)의 다형성교모세포종 환자로부터 65개의 조직 샘플을 수득하였다. 조직 마이크로어레이 결과, 염색 강도는 음성 또는 '1+'(매우 약한 양성) 부터 '4+'(매우 강한 양성)으로 표시하였다. 그 결과, 조직 샘플의 98.5%가 양성(65 중 64; 음성 염색, 1개의 샘플, 1.5%; '1+', 15개의 샘플, 23.1%; '2+', 17개의 샘플, 26.2%, '3+', 28개의 샘플, 43.1%; '4+', 4개의 샘플, 6.2%)이었으며(도 1B), 각 군별 염색 강도는 하기 표 3에 나타내었다.
| 염색 결과 | 샘플 수(개) | 강도(intensity) 평균 ± 표준편차 |
| 음성 | 1 | 94.3 ± 0.0 |
| 1+ | 15 | 128.0 ± 17.7 |
| 2+ | 17 | 137.7 ± 20.4 |
| 3+ | 28 | 161.4 ± 15.3 |
| 4+ | 4 | 177.4 ± 4.8 |
염색점수 각 군 간 통계학적 유의성 분석을 Welch's t-test를 이용하여 분석을 시행하였을 때, 1개의 샘플만이 있는 음성군과 상대적으로 낮은 발현도 군인 '1+'와 '2+'군 간 이외에 모든 군 간의 조합에서 p<0.01 미만의 통계적 유의성을 보였다(도 1C).
이 중 음성군, '1+'군, 및 '2+'군을 EDB-FN 저발현군(low-expression)군으로, '3+'군 및 '4+'군을 EDB-FN 고발현군(high-expression)군으로 분류하였다. 이 때, 저발현군은 71.4% (21명의 환자 중 15명), 고발현군은 28.6%(21명의 환자 중 6명)이었다. 양 군간 염색 강도를 비교하면, 저발현군에서는 131.9 ± 20.4, 고발현군에서는 163.4 ± 15.3의 평균 ± 표준편차 값의 결과와 함께 Welch's t-test 분석 상 p<0.001의 통계적 유의성을 가진 이미지 강도 결과값을 보였다(도 1D).
즉, 조직 마이크로어레이 염색 결과, 병리학 전문의 암맹판독 염색점수와 EDB-FN 발현량 간에 부합한 양의 상관관계를 가지며, 이는 통계적으로 유의한 결과라는 점을 알 수 있다.
실험결과 4. 뇌종양의 예후 바이오마커로서 EDB-FN
다형성교모세포종(glioblastoma multiforme, GBM)에서 높은 EDB-FN 발현 수준(4+)을 보인 바, 임상적 중요성의 추가적인 평가로서, 퀀타일 정규화를 통해 뇌종양에서 EDB-FN의 예후 바이오마커로서의 적용가능성을 분석하였다. 예후 분석을 위해, 21개의 다형성교모세포종 데이터세트로부터 총 1,615개 샘플의 EDB-FN 발현 값을 발현 평균값을 기반으로 고발현군 및 저발현군으로 분류하였고, 전체 생존기간(OS) 분석을 수행하였다(도 2A, 표 4).
다형성교모세포종에서 EDB-FN 발현의 적분 Z-값은 -0.97였으며(p<0.33), 이는 다형성교모세포종 환자의 EDB-FN 발현이 높은 경우, 전체 생존기간(OS) 예측결과가 나쁘다는 점을 암시한다(도 2A).
본 발명자들은 in silico 데이터를 자세하고 직접적으로 확인하기 위해 환자 샘플을 이용하여 TMA 분석을 수행하였다. 다형성교모세포종 조직에서 EDB-FN의 발현과 각 조직에 부합하는 환자의 전체 생존기간(OS) 및 무진행 생존기간(PFS)을 분석하였다(도 2B).
In silico Oncopression 분석 결과로서 EDB-FN 저발현군과 고발현군간 전체 생존기간(OS)의 차이는 통계학적으로 크지 않았다(p<0.36; 위험 비율(hazard ratio) = 2.12; 95% 신뢰 구간(confidence interval) = 0.42-10.78). 그러나, 양 군간 무진행 생존기간(PFS)의 중간값은 상당한 차이가 있었다(p<0.03; 저발현, 310.0 일; 고발현, 105.0 일). EDB-FN 고발현군은 저발현군 대비 진행 위험이 5.5배 증가하였다(위험 비율 = 5.53; 95% 신뢰 구간 = 1.22-25.05).
즉, 정상세포와 비교하여 뇌종양 세포에서 EDB-FN이 과발현되며, 특히 EDB-FN이 고발현되는 경우, 무진행 생존기간(PFS)이 훨씬 짧아져 예후가 좋지 않다는 점을 알 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
Claims (13)
- 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴(extra-domain B fibronectin; Entrez Gene ID: 2335, Genbank accession No. NC_000002.11, NC_000002.12 또는 NG_0.12196.1)를 포함하는 뇌종양 예후 예측용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 바이오마커는 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)이 짧은 뇌종양 개체에서 발현량이 증가하는 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
- 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 뇌종양 예후 예측용 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴과 결합하는 화합물, 항체, 앱타머, 프라이머, 및 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 조성물.
- 제4항의 조성물을 포함하는, 뇌종양 예후 예측용 키트.
- 하기 단계를 포함하는 뇌종양 예후 예측을 위한 정보제공방법:
(1) 환자의 생물학적 시료로부터 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 발현 수준에 따라 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 저발현군과 고발현군으로 분류하는 단계; 및
(3) 상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 고발현군에 해당하는 경우, 예후가 나쁜 것으로 판별하는 단계.
- 제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 환자 유래의 조직, 객담, 세포, 혈액, 혈장, 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 정보제공방법.
- 제7항에 있어서,
상기 (1) 단계에서 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 발현 수준은 웨스턴블롯, 단백질 칩, 효소면역분석법(ELISA), 방사선면역분석, 면역침강법, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 보체 고정 분석법, 유세포 분석(FACS), 질량분석법 및 조직 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제9항에 있어서,
상기 생물학적 시료의 조직 마이크로어레이 측정 결과 평균 염색 강도가 140 이하인 경우, 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 저발현군으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제9항에 있어서,
상기 생물학적 시료의 조직 마이크로어레이 측정 결과 평균 염색 강도가 160 이상인 경우, 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 고발현군으로 분류하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제7항에 있어서,
상기 엑스트라-도메인 B 파이브로넥틴 고발현군에 해당하는 경우, 무진행 생존기간(progression-free survival, PFS)이 짧은 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제7항에 있어서,
상기 뇌종양은 성상세포종(astrocytoma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 핍지신경교종(oligodendroglioma), 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 상의세포종(ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 뇌수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 및 맥락총유두종(choroid plexus papilloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
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