KR20220046643A - 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지, 세포를 배양하기 위한 방법, 그리고 세포 배양액중 재조합 단백질 적어도 1개를 발현시키기 위한 방법 - Google Patents

세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지, 세포를 배양하기 위한 방법, 그리고 세포 배양액중 재조합 단백질 적어도 1개를 발현시키기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 철 공급원으로서 철-시트르산염-이인산염 착체를 함유하는, 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 세포 1개 이상이 본 발명에 따른 세포 배양 배지에서 복제 또는 유지되는, 세포를 배양하기 위한 방법과, 재조합 단백질 적어도 1개의 생산을 유도하는 핵산이, 본 발명에 따른 세포 배양 배지에서 복제 또는 유지되는 세포에 도입되는, 세포 배양액에서 재조합 단백질 적어도 1개를 발현시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지는, 이에 함유된 철 공급원이 수용액(예를 들어 세포 배양 배지, 세포 배양 보충물 또는 물)에 매우 효율적으로, 그리고 신속하게 용해되고, 세포의 내부에 효율적으로 유입될 수 있으며, 재조합 단백질 생산 동안 세포의 생존력과 생성물 역가(생성물 농도라고도 지칭됨)의 증가를 유도하고, 비용이 매우 적게 들어간다는 점에서 유리하다.

Description

세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지, 세포를 배양하기 위한 방법, 그리고 세포 배양액중 재조합 단백질 적어도 1개를 발현시키기 위한 방법
철 공급원으로서 철-시트르산염-이인산염 착체를 포함하는, 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지가 제공된다. 뿐 아니라, 1개 이상의 세포(들)가 본 발명에 따른 세포 배양 배지에서 증식 또는 유지되는, 세포를 배양하기 위한 방법이 제공된다. 또한, 재조합 단백질 적어도 1개를 세포 배양액에서 발현시키기 위한 방법으로서, 적어도 1개의 재조합 단백질 생산을 달성하는 핵산이 본 발명에 따른 세포 배양 배지에서 증식 또는 유지된 세포에 도입되는 방법이 제공된다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지는, 자체에 포함된 철 공급원이 수용액(예컨대 세포 배양 배지, 세포 배양 보충물 또는 물)에 매우 신속하게 잘 용해되고, 세포의 세포 내부에 효율적으로 유입될 수 있으며, 재조합 단백질 생산시 생세포 수 증가 및 생성물 역가(생성물 농도라고도 지칭됨)의 증가를 달성하고, 비용면에서 매우 효율적이라는 이점을 가진다.
생물학적 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지는 철 공급원, 즉 생물학적 세포가 효율적으로 유입시킬 수 있는 철 이온의 공급원을 포함할 수 있다. 사실상 세포 배양 배지중 철 공급원의 존재는 포유동물 세포 배양에 필수이다. 철 이온의 생물학적 세포로의 유입은, 예를 들어 철의 염(예컨대 질산철(III), 황산철(II) 및/또는 염화철(III))을 포함하는 세포 배양 배지에 단백질 트랜스페린을 첨가함으로써 달성될 수 있는데, 그 이유는 트랜스페린은 철 이온과 결합하여, 생물학적 세포에 접근 가능한(유입 가능한) 방식으로 철 이온이 세포 배양 배지중에서 이용될 수 있도록 만들기 때문이다.
트랜스페린은, 일반적으로 혈장으로부터 수득되거나, 또는 재조합에 의해 제조될 뿐더러, 건조 형태로 시판되기도 한다. 시판 트랜스페린의 단점은, 값이 비싸서 산업상 규모의 세포 배양에 비경제적이라는 점이다. 게다가 시판 트랜스페린은 이미 철 이온에 의해 부분적으로 포화되어 있기 때문에, 세포 배양 배지중 철의 농도는 정확히 한정된 방식으로 조정될 수 없다. 그러므로 생물학적 세포를 배양하기 위한 무 트랜스페린 세포 배양 배지가 필요하다. 이러한 세포 배양 배지를 통해 철 이온은 생물학적 세포에 생물학상 접근 가능하도록(즉 세포의 내부로 유입될 수 있도록) 상이한 방식으로 효과적으로 제공되어야 한다.
선행 기술에는 철을, 세포 배양 배지에 효과적으로 접근 가능한 상이한 형태로 만드는 것이 공지되어 있다.
CA 2 756 247 C에는, 철 염 또는 철 착체가 무혈청 배지중 철 공급원으로서 사용될 수 있다고 개시되어 있다. 철 공급원은 인산철(III), 피로인산철(III), 질산철(III), 황산철(II), 염화철(III), 젖산철(II), 시트르산철(III), 시트르산암모늄철(II), 철 덱스트란 및 EDTA 철 나트륨 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음이 예를 통하여 언급되어 있다. 그러나 나열된 철 공급원 다수는 생물학적 세포가 용이하게 접근 가능한 방식으로 철을 이용 가능할 수 있도록 만드는데 적합하지 않으므로, 중요한 철 이온을 세포로 유입시키는 것은 어렵다. 그 결과, 세포는 더욱 천천히 생장하고, 재조합 단백질을 발현할 때 낮은 생성물 역가를 보인다. 시트르산철(II)은 언급된 철 공급원중 가장 효과적인 것이지만, 만일 건조 세포 배양 배지에 존재하게 되면 매우 천천히 용해되고, 상기 배양 배지는 세포를 배양하기 위해서 물과 함께 제조되어야 한다는 단점이 있다. 시트르산철(II)의 용해 기간이 길다는 점은, 세포 배양을 위한 세포 배양 배지를 산업상 제조함에 있어 시간상의 단점을 나타내고, 이 점은 시트르산철(II)의 사용을 비경제적으로 만든다.
WO 2016/156476 A1에는, 철-콜린-시트르산염 착체를 통해 철이 생물학적 세포에 접근 가능하도록 만드는 무 트랜스페린 세포 배양 배지가 개시되어 있다. 철-콜린-시트르산염 착체는 세포 배양액중 유의미하게 증가한 생성물 역가에 기여하므로, 이는 통상 사용되는 철 공급원, 예컨대 인산철(II), 피로인산철(III) 및 시트르산철(III)에 비해 유리한 것으로 교시되어 있다. 그러나, 철-콜린-시트르산염 착체가 세포 배양 배지에 사용될 때, 특히 세포 배양 부피가 매우 커야할 때, 상기 철 착체 및 세포 배양 배지로 말미암아 세포 배양 배지의 제조 비용이 상당히 증가하게 되므로, 비경제적이라는 단점이 있다.
그러므로 본 발명의 목적은, 트랜스페린이 존재하지 않고(또는 완전히 무혈청이고), 고 생성물 역가를 달성함과 아울러 더 신속하고 비용이 덜 들어가는(더욱 경제적인) 방법으로 세포 배양이 수행될 수 있도록 만드는 철 공급원을 포함하는 세포 배양 배지를 제공하는 것이다. 뿐 아니라, 이에 대응하는 방법들로서, 세포를 배양하기 위한 방법과, 세포 배양액에서 재조합 단백질 적어도 1개를 발현시키기 위한 방법이 제공되어야 한다.
이 목적은, 청구항 1의 특징들을 가지는 세포 배양 배지, 청구항 11의 특징들을 가지는, 세포를 배양하기 위한 방법, 청구항 13의 특징들을 가지는 세포 배양 배지에서 적어도 1개의 재조합 단백질을 발현시키기 위한 방법, 그리고 청구항 14의 특징들을 가지는 용도에 의해 달성된다. 종속항들은 유리한 개선점들을 보여준다.
본 발명에 따르면, 철-시트르산염-이인산염 착체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지가 제공된다.
“세포 배양 배지”란 용어는, 구체적으로 생물학적 세포(예를 들어 미생물, 식물, 인간 및/또는 동물 세포), 선택적으로는 바이러스의 생육 및 유지에 적합한 영양소 기질을 의미하는 것으로 이해된다. 이와 같은 “세포 배양 배지”란 용어의 이해는, "세계관세기구(World Customs Organization)" (약칭: WCO)에 의해 규정되는 소위 "신 국제통일상품분류(Harmonized Commodity Description and Coding Systems)" (약칭: HS)의 HS 코드 38210000을 기반으로 한다.
세포 배양 배지는 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/함 영양소 혼합물(Ham's nutrient mixture) F-12(DMEM/F12)를 기반으로 할 수 있다.
세포 배양 배지는, 바람직하게 원소 칼슘, 철, 코발트, 구리, 칼륨, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 나트륨, 니켈, 인산염, 셀레늄, 규소, 아연 및/또는 주석(가장 바람직하게는 이들 원소 모두)과 같은 미량 원소 및 이것들의 염을 포함할 수 있다.
더욱이, 세포 배양 배지는 필수 및 불필수 아미노산, 바람직하게는 글리신, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-시스틴, L-글루탐산, L-글루타민, L-히스티딘, L-이소루신, L-루신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및/또는 L-발린(가장 바람직하게는 이것들 모두)을 포함할 수 있다.
세포 배양 배지는 바이오틴, 콜린, 폴리닌산, 글루코스, Hepes 완충제, 하이포잔틴, 리놀레산, 리포산, 미오이노시톨, 니아신아미드, 판토텐산, 푸트레신, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 티미딘, 피루브산염 및 비타민 B12로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분 적어도 1개(바람직하게는 이것들 모두)를 포함할 수 있다. 응용예에 따라서, 중탄산나트륨 및/또는 L-글루타민이 세포 배양 배지에 존재할 수 있거나, 여기에 첨가될 수 있다. 예를 들어 분말 형태의 세포 배양 배지는, 보통 중탄산나트륨을 포함하지 않는다. 중탄산나트륨은 종종 액체 세포 배양 배지가 제조되는 동안에만 첨가된다. L-글루타민은 수용액에서 자발적으로 붕괴되므로, 액체 세포 배양 배지는 종종 자체의 유통 기한을 증가시키기 위해 L-글루타민 없이 제조된다. 이 경우, L-글루타민은 종종 사용 직전에 스톡 용액으로서 첨가된다.
세포 배양 배지에 존재하는 철-시트르산염-이인산염 착체가 수용액(예컨대 배지, 보충물 또는 물)에 매우 신속하게 잘 용해되는 관계로, 본 발명에 따른 세포 배양 배지에는 철 공급원으로서 혈청 유래 트랜스페린 또는 재조합 트랜스페린이 필요하지 않고, 비교 가능한 선행 기술의 세포 배양 배지에 비하여 고 생성물 역가로 더 신속하고 비용이 덜 들어가는(더욱 경제적인) 방식으로 세포 배양이 수행될 수 있도록 만들며, 공지된 바와 같이 세포 배양 배지에 철-콜린-시트르산염 착체가 사용될 때보다 비용이 덜 든다는 이점이 있다.
바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 용해되지 않은 형태, 바람직하게는 분말 또는 과립의 형태로 존재한다. 여기서의 이점은, 용해된 형태의 세포 배양 배지의 경우보다 세포 배양 배지의 유통 기한이 길고, 운송비가 더 적게 든다는 점이다. 세포 배양 배지는, 바람직하게 철-시트르산염-이인산염 착체를 0.16 중량% ~ 12 중량%, 바람직하게 0.22 중량% ~ 6 중량%, 특히 바람직하게 0.3 중량% ~ 2 중량%, 매우 특히 바람직하게 0.4 중량% ~ 1 중량%, 특히 0.5 중량% ~ 0.7 중량%의 양만큼 포함한다.
세포 배양 배지는 용해된 형태, 바람직하게는 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 여기서의 이점은, 물을 첨가하고 물에 세포 배양 배지를 용해하는데 소요되는 시간이 필요치 않은 관계로, 생물학적 세포의 배양이 즉시 시작될 수 있다는 점이다. 용해된 세포 배양 배지는, 바람직하게 (용해되지 않은) 철-시트르산염-이인산염 착체를 통해 설정된 세포 배양 배지내 철 농도가 범위 80 μM ~ 5800 μM, 바람직하게 100 μM ~ 3000 μM, 특히 바람직하게 150 μM ~ 1000 μM, 매우 특히 바람직하게 200 μM ~ 5000 μM, 특히 250 μM ~ 350 μM이 되도록 만드는 양만큼의 철-시트르산염-이인산염 착체를 포함한다.
구체적으로 철-시트르산염-이인산염 착체는 결합된 형태로서, 용해된 세포 배양 배지중에 존재한다[예컨대 문헌(Gupta et al., Physicochemical characterization of ferric pyrophosphate citrate, Biometals, 2018, vol. 31, pp. 1091-1099)의 p. 1097, 제1 문단 우측 컬럼 참조]. 결과적으로 철-시트르산염-이인산염 착체를 통해 설정된 철 농도는, 결합된 철-시트르산염-이인산염 착체로 말미암는 철 농도를 의미한다. 다시 말해서, 세포 배양 배지중 철-시트르산염-이인산염 착체를 통해 설정된 철 농도란, 철-시트르산염-이인산염 착체로서 착체를 형성한 채 존재하는 철 원자의 농도를 지칭하지, 세포 배양 배지에 자유 형태로서 존재하는 철 원자(예를 들어 자유 Fe2 + 이온 및/또는 Fe3 + 이온)의 농도를 지칭하는 것이 아니다. 만일 철-시트르산염-이인산염 착체가 4개의 철 원자를 가지면(예를 들어 Gupta외 다수의 문헌 도 5b 참조), 용해된 세포 배양 배지는, 세포 배양 배지의 철 농도를 상기 언급된 범위로 설정하기 위해 철-시트르산염-이인산염 착체를, 바람직하게 20 μM ~ 1450 μM, 바람직하게 25 μM ~ 750 μM, 특히 바람직하게 37.5 μM ~ 250 μM, 매우 특히 바람직하게 50 μM ~ 1250 μM, 특히 62.5 μM ~ 87.5 μM의 양만큼 포함한다.
철-시트르산염-이인산염 착체는 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체, 철-시트르산염-이인산염-칼륨 착체, 철-시트르산염-이인산염-암모늄 착체 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 철-시트르산염-이인산염 착체는, 바람직하게 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체, 특히 바람직하게 CAS No. 85338-24-5 및/또는 EC No. 286-697-4인 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체이다. 기타 착체와 비교되었을 때 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체의 이점은, 나트륨 이온이, 예컨대 암모늄과 같은 기타 양이온과는 대조적으로, 세포 배양 배지중 더 높은 농도에서도 다수의 생물학적 세포에 의해 관용된다는 점이다.
바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지에는 혈청 성분 적어도 1개가 존재하지 않고, 바람직하게는 트랜스페린 및/또는 락토페린이 존재하지 않는다.
세포 배양 배지는 2018년 8월 이래로 입수 가능한 조성물중 혈청 대체물, 바람직하게는 Ultroser G 혈청 대체물을 포함할 수 있다. 이 경우 세포 배양 배지에는, 특히 트랜스페린 및/또는 락토트렌스페린이 존재하지 않는다.
더욱이, 세포 배양 배지는 생장 인자를 포함할 수 있다. 이 경우, 세포 배양 배지에는, 특히 트랜스페린 및/또는 락토트랜스페린이 존재하지 않는다.
바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지에는 동물 또는 인간 성분이 존재하지 않는다.
세포 배양 배지에는 단백질이 존재하지 않을 수 있다.
더욱이 세포 배양 배지는 가수분해생성물이 존재하지 않을 수 있다.
또한 세포 배양 배지는 화학적으로 한정될 수 있다.
세포 배양 배지는, 아미노산(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개 포함하는 것을 특징으로 하는데, 이 아미노산(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개는, 바람직하게 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 이것들의 조합 및/또는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 세포 배양 배지는 특히 상기 아미노산 모두를 포함한다.
더욱이 세포 배양 배지는, 지질 전구체(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이 지질 전구체(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개는, 바람직하게 염화콜린, 에탄올아민, 글리세롤, 이노시톨, 리놀렌산, 지방산, 인지질, 콜레스테롤 관련 화합물, 이것들의 조합 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 세포 배양 배지는, 탄소 원자를 적어도 6개 가지는 카복실산(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이 카복실산(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개는, 바람직하게 리놀레산, 리놀렌산, 티옥트산, 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키딘산, 아라키돈산, 라우르산, 베헨산, 데칸산, 도데칸산, 헥산산, 리그노세린산, 미리스트산, 옥탄산, 이것들의 조합 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
세포 배양 배지는, 탄소 원자를 6개보다 적게 가지는 카복실산(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 적어도 카복실산은, 바람직하게 부티르산 또는 부티르산의 염이다.
유리한 구현예에서, 세포 배양 배지는 뉴클레오시드(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개를 포함하는 것을 특징으로 하는데, 이 뉴클레오시드(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개는, 바람직하게 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 티미딘, 하이포잔틴, 이것들의 조합 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 세포 배양액은 상기 뉴클레오시드 모두 및/또는 이것들의 염을 포함한다.
또한 세포 배양 배지는 탄수화물(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이 탄수화물(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개는, 바람직하게 글루코스, 갈락토스, 글루코사민, 프럭토스, 만노스, 리보스, 수크로스 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
세포 배양 배지는 완충제 성분(들) 적어도 1개, 선택적으로는 다수개를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이 완충제 성분(들) 적어도 1개, 선택적으로 다수개는, 바람직하게 ACES, HEPES, MES, MOPS, NaHCO3, PIPES, 인산염 완충제, TRIS, 이것들의 조합 및/또는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 완충제 성분(들) 적어도 1개, 선택적으로는 다수개를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 세포 배양 배지는 미량 원소(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하고, 선택적으로는 킬레이트화제, 바람직하게 EDTA를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이 미량 원소(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개는 칼슘, 코발트, 구리, 칼륨, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 나트륨, 니켈, 인산염, 셀레늄, 바나듐, 아연, 주석 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이 미량 원소는, 선택적으로 염 형태로 존재할 수 있으며, 이 세포 배양 배지는 특히 상기 미량 원소 모두를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 세포 배양 배지는 비타민(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이 비타민(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개는, 바람직하게 비오틴, 콜린, 폴리닌산, 미오이노시톨, 니아신아미드(B3), 판토텐산, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B12로 이루어진 군으로부터 선택되는 비타민(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하고, 이것들의 조합 및/또는 염을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지, 특히 바람직하게 용해되지 않은 형태의 세포 배양 배지는 철 염을 포함하지 않는다.
또한, 세포 배양 배지는 특히 바람직하게 용해되지 않은 형태일 때 시트르산철을 포함하지 않고, 바람직하게는 시트르산염을 포함하지 않으며/않거나 시트르산을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 세포 배양 배지는, 특히 바람직하게 용해되지 않은 형태일 때 이인산철을 포함하지 않고, 바람직하게는 이인산염을 포함하지 않으며/않거나 이인산을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
세포 배양 배지는 DMEM, DMEM/F12 배지, 함 F-10 배지, 함 F-12 배지, 배지 199, MEM, RPMI 1640 배지, ISF-1, 옥토메드(Octomed), 에임스(Ames) 배지, (선택적으로 Fitton-Jackson 개질 배지중) BGJb 배지, 클릭(Click) 배지, CMRL-1066 배지, 피셔(Fischer) 배지, 글래스카우 최소 필수 배지(GMEM), 이스코브(Iscove) 개질 둘베코 배지(IMDM), L-15 배지(Leibovitz), 맥코이(McCoy) 5A 개질 배지, NCTC 배지, 스윔(Swim) S-77 배지, 웨이마우스(Waymouth) 배지, 윌리엄(William) 배지 E 및 이것들의 조합, 선택적으로는 이것들의 변형예로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지를 포함하되, 각각의 세포 배양 배지는 2018년 8월 이래로 입수 가능한 조성물중의 것을 의미하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 DMEM, DMEM/F12 배지, 함 F-10 배지, 함 F-12 배지, 배지 199, MEM, RPMI 1640 배지 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지를 포함하고, 선택적으로는 이의 변형예를 포함하되, 각각의 세포 배양 배지는 2018년 8월 이래로 입수 가능한 조성물중의 것을 의미하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 하기 단계들, 즉
a) 수용액중 상기 청구항들 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지를 제공하는 단계; 및
b) 적어도 1개의 세포를 세포 배양 배지 수용액에서 증식 또는 유지시키는 단계
를 포함하는, 세포를 배양하기 위한 방법도 또한 제공된다.
이 경우, 세포는 1차 세포주 또는 연속 세포주의 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, CHO, NS0, SP2/0, 하이브리도마, HEK293, PERC-6, BHK-21 및 Vero-76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물 세포가 특히 바람직하고, CHO 세포, 특히 CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-S 및 CHO-K1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CHO 세포가 특히 바람직하다.
또한 본 발명에 따르면, 세포 배양액에서 재조합 단백질 적어도 1개를 발현시키기 위한 방법이 제공되는데, 이 경우 본 발명에 따른 세포를 배양하기 위한 방법은 핵산을 세포 적어도 1개에 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 이 핵산은 재조합 단백질 적어도 1개의 구성적 또는 유도성 생산을 유도하고, 바람직하게는 생산된 단백질의 세포 배양 배지 수용액으로의 분비를 추가로 유도하며, 재조합 단백질은, 특히 바람직하게 치료용 단백질, 항체, 융합 단백질, 효소, 백신, 바이오시밀러(biosimilar) 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 세포 배양 배지중 철-시트르산염-이인산염 착체(특히 바람직하게, CAS No. 85338-24-5 및/또는 EC No. 286-697-4인 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체)의 용도, 바람직하게는 세포 배양 배지에서 세포 적어도 1개를 배양하기 위한 세포 배양 배지중 성분으로서의 용도 및/또는 세포 배양 배지에서 세포 적어도 1개를 배양하는 동안 세포 배양 배지중 첨가제로서의 용도가 제안된다. 철-시트르산염-이인산염 착체는, 세포 배양 배지가 상기 언급된 특성들중 적어도 1가지를 가지도록 사용될 수 있다. 예를 들어 철-시트르산염-이인산염 착체는 상기 언급된 농도중 1가지의 농도로 세포 배양 배지중에 사용될 수 있다. 더욱이 철-시트르산염-이인산염 착체는 상기 언급된 세포들중 적어도 1개를 배양하기 위한 세포 배양 배지중 성분 및/또는 첨가제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 과제는 본원에 제시된 특정 구현예들에 제한되기 바라지 않으면서 이하 실시예들 및 도면들을 기반으로 더 자세히 설명될 것이다.
도 1은, 무 트랜스페린 액체 배양 배지중 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체를 통하여 설정되었던 철 농도(μM)의, 특정 단백질을 생산하도록 유전자 변형된 세포의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 영향을 보여준다. x-축은, 액체 배지중 설정된 철 농도를 나타낸다. 세포 배양 실험(유가식) 개시시로부터 10일 후 확정된 생세포 수(1 mL당 세포 수)(흰색 막대) 및 13일 후 확정된 생세포 수(검정색 막대)는 도 1a의 y-축에 도시되었다. 세포 배양 실험(유가식) 개시시로부터 10일 후 확정된 생성물 농도(역가, mg/L)(흰색 막대) 및 13일 후 확정된 생성물 농도(검정색 막대)는 도 1b의 y-축에 도시되었다. 철-시트르산-이인산염-나트륨 착체를 통해 설정된 철의 최적 농도는 대략 80 μM ~ 대략 5800 μM의 범위임이 확인될 수 있다.
도 2는 무 트랜스페린 액체 배양 배지중 철-시트르산-이인산염-나트륨 착체를 통해 설정된 철의 농도 300 μM의 특정 단백질을 생산하도록 유전자 변형된 세포의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 효과를, 동일 배지중 또 다른 철 공급원을 통해 설정된 철의 농도 300 μM의 특정 단백질을 생산하도록 유전자 변형된 세포의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 효과를 비교한 결과를 보여준다. 다시 말해서, x-축에 표시된 4개의 배지(배지 1, 2, 3 및 4)는, 철 농도를 300 μM로 설정하는데 사용된 철 공급원을 제외하고 자체의 조성에 있어서 동일하다. 배지 1에서, 철 공급원은 철-시트르산염-인산염-나트륨 착체이고; 배지 2에서, 철 공급원은 황산철(II) 7수화물이며; 배지 3에서 철 공급원은 질산철(III) 9수화물이고; 배지 4에서 철 공급원은 시트르산철(III)이다. 세포 배양 실험(유가식) 시작시로부터 10일 후 확정된 생세포 수(1 mL당 세포 수)(흰색 막대) 및 13일 후 확정된 생세포 수(검정색 막대)는 도 2a의 y-축에 도시되었다. 세포 배양 실험(유가식) 시작시로부터 10일 후 확정된 생성물 농도(역가, mg/L)(흰색 막대) 및 13일 후 확정된 생성물 농도(검정색 막대)는 도 1b의 y-축에 도시되었다. 배지 1에 존재하는 철 공급원(철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체)은 실험 개시시로부터 10일 및 13일에 확정된 생세포 수 및 생성물 농도, 즉 생산된 생성물의 양에 있어 배지 2 ~ 4에 존재하는 철 공급원에 비하여 유리한 효과를 보였음이 확인될 수 있다.
도 3은 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체가 철 공급원으로서 첨가된 분말형 무 트랜스페린 배양 배지가 물에 완전히 용해되는데 소요되는 시간을, 조성은 동일하고 철 공급원만이 상이한 배지가 물에 완전히 용해되는데 소요되는 시간과 비교한 결과를 보여준다. 다시 말해서, x-축에 도시된 4개의 배지(배지 1, 2, 3 및 4)는, 철 농도를 300 μM로 설정하는데 사용된 철 공급원을 제외하고 자체의 조성에 있어서 동일하다. 배지 1에서, 철 공급원은 철-시트르산염-인산염-나트륨 착체이고; 배지 2에서, 철 공급원은 황산철(II) 7수화물이며; 배지 3에서 철 공급원은 질산철(III) 9수화물이고; 배지 4에서 철 공급원은 시트르산철(III)이다. y-축은 처음부터 건조된 분말형이었던 배지가 물에 완전히 용해될 때까지의 소요 시간(분)을 보여주는데, 처음부터 건조된 분말형이었던 배지 2, 3 및 4를 완전히 용해하기 위해서는 360분을 초과하는 시간이 필요하였다. 철 공급원으로서 철-시트르산염-인산염-나트륨 착체를 가지는 건조된 분말형 배지 1은, 철 공급원이 상이한 배지 2, 3 및 4보다 물에 훨씬 더 빨리 용해하였음이 확인될 수 있다.
도 4는 무 트랜스페린 액체 배양 배지중 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체를 통해 설정된 철 농도 300 μM의 특정 단백질을 생산하도록 유전자 변형된 세포의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 효과를, 동일 배지중 또 다른 철 공급원을 통해 설정된 철 농도 300 μM의 특정 단백질을 생산하도록 유전자 변형된 세포의 생장 및 단백질 생산에 대한 효과와 비교하는 추가 실험 결과를 보여준다. 다시 말해서, x-축상에 도시된 5개의 배지(배지 1, 5, 6, 7 및 8)는, 철 농도를 300 μM로 조정하는데 사용된 철 공급원을 제외하고 자체의 조성에 있어서 동일하다. 세포 배양 실험(유가식) 시작시로부터 10일 후 확정된 생세포 수(1 mL당 세포 수)(흰색 막대) 및 13일 후 확정된 생세포 수(검정색 막대)는 도 4a의 y-축에 도시되었다. 세포 배양 실험(유가식) 시작시로부터 10일 후 확정된 생성물 농도(역가, mg/L)(흰색 막대) 및 13일 후 확정된 생성물 농도(검정색 막대)는 도 1b의 y-축에 도시되었다. 배지 1에 존재하는 철 공급원(철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체)은 실험 시작시로부터 10일 및 13일의 생세포 수에 있어 배지 6 ~ 8에 존재하는 철 공급원에 비하여 유리한 효과를 보였음이 확인될 수 있다. 배지 1에 존재하는 철 공급원(철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체)은 실험 시작시로부터 10일 및 13일의 생성물 농도, 즉 생산된 생성물 양에 있어 배지 5 ~ 8에 존재하는 철 공급원에 비하여 유리한 효과를 보였음이 추가로 확인될 수 있다. 이러한 실험을 통하여, 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체는 액체 배지중 자체의 개별 성분으로부터 형성되지 않음이 판명되었는데, 그 이유는, 만일 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체가 액체 배지중 자체의 개별 성분으로부터 형성되면, 배지 5 ~ 8에서 구하여진 수치들은 배지 1에 대해 구하여진 수치와 동일하여야 할 것이기 때문이다. 그러나 이는 해당 사항이 없었다. (배지 1중) 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체는, 시트르산철(III) 및 4 염기성 피로인산나트륨의 혼합물에 비하여, 제작된 생성물 수득량에 유리함도 또한 입증되었다(도 4b에 있어 배지 1 및 배지 5의 비교).
도 5는 철 공급원으로서 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체가 첨가된 분말형 무 트랜스페린 배양 배지가 물에 완전히 용해되는데 소요되는 시간을, 조성이 동일하되, 철-시트르산염-이인산염 착체의 성분들이 개별 성분들의 형태로 존재한다는 점에서만 상이한 배지가 물에 완전히 용해되는데 소요되는 시간과 비교한 결과를 보여준다. 다시 말해서, x-축에 도시된 5개의 배지(배지 1, 5, 6, 7 및 8)는 철, 시트르산염 및 피로인산염의 공급원을 제외하고 조성이 거의 동일하다. 원래 건조된 분말형이었던 배지가 물에 완전히 용해될 때까지의 소요 시간(분)은 y-축에 제시되어 있다. 건조된 분말형 배지 1(철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체 포함)은, 철-시트르산염-이인산염 착체의 개별 성분(즉 철 이온, 시트르산염 이온, 피로인산염 이온 및 나트륨 이온을 제공하기 위한 염)을 함유하는 배지 5, 6, 7 및 8에 비하여 물에 유의미하게 더욱 신속하게 용해되었음이 확인될 수 있는데, 여기서 원래 건조된 분말형이었던 배지 5, 6 및 7의 완전 용해를 달성하기 위해서는 360분을 초과하는 시간이 필요하였고, 배지 8은 완전히 용해되지 않았다.
실시예 - 본 발명에 따른 세포 배양 배지로 배양될 수 있는 생물학적 세포
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 2 - 세포 배양 배지중 철-시트르산염- 이인산염 복합체의 최적 농도 확정
세포 배양 배지중 철-시트르산염-이인산염 착체에 최적인 농도 범위를 확정하기 위해, 상이한 농도의 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체를 무 트랜스페린 세포 배양 배지에서 시험하였다.
사용한 세포 배양 배지는 둘베코 개질 이글 배지/함 영양소 혼합물 F-12(DMEM/F12-배지)를 기반으로 하였다. 상기 배지는 원소 칼슘, 철, 코발트, 구리, 칼륨, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 나트륨, 니켈, 인산염, 셀레늄, 규소, 아연 및 주석과 같은 미량 원소 및 이것들의 염을 포함하였다. 철-시트르산염-이인산염 착체를 첨가하지 않고 사용된 세포 배양 배지중 철의 농도는 0.8 μM 이하였다. 또한 사용된 세포 배양 배지는 글리신, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-시스틴, L-글루탐산, L-글루타민, L-히스티딘, L-이소루신, L-루신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린을 포함하였다. 뿐 아니라, 사용된 세포 배양 배지는 비오틴, 콜린, 폴리닌산, 글루코스, Hepes 완충제, 하이포잔틴, 리놀레산, 리포산, 미오이노시톨, 니아신아미드, 판토텐산, 푸트레신, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 티미딘, 피루브산염 및 비타민 B12를 포함하였다.
특정 단백질을 생산하도록 유전자 변형된 세포의 세포 생장을, 물에 용해하였고, 상기 언급된 DMEM/F12 배지를 기반으로 하였던 액체 세포 배양 배지중 철-시트르산-이인산염-나트륨 착체를 통해 설정된 철 농도의 함수로서 관찰하였다. 뿐만 아니라, 원하는 단백질 생성물의 생산은 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체를 통해 설정된 액체 배지중 철 농도의 함수로서 관찰하였다.
이하 표는, 액체 배지중 원하는 각각의 철 농도를 설정하는데 사용된 철-시트르산-이인산염 복합체의 각각의 중량(액체 배지 1 리터당 mg)(철-시트르산염-이인산염 착체의 농도, mg/l)을 제시한다.
표
Figure pct00003
철-시트르산염-이인산염-나트륨 복합체를 통하여 설정된 철 농도 함수로서의 세포 생장 및 단백질 생산에 관한 결과는 도 1a 및 도 1b에 도시되어 있다. 액체 배지중 최종 철 농도 범위 대략 80 μM ~ 대략 5800 μM은 세포 생장 및 단백질 생산에 최적임이 확인되었다. 철-시트르산염-이인산염 착체가 첨가되지 않고 사용된 세포 배양 배지중의 철 농도는 0.8 μM 이하였으므로, 이 최종 철 농도 범위 대략 80 μM ~ 대략 5800 μM은, 철-시트르산염-이인산염 착체의 실질적으로 대응하는 몰량(즉 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체 대략 80 μM ~ 대략 5800 μM)을 적용함으로써 달성되었다.
실시예 3 - 기타 철 공급원의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 영향과 비교되는, 철-시트르산염- 이인산염 -나트륨 착체의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 영향
사용한 철 공급원을 제외하고, 실시예 2에 나열된 무 트랜스페린 배양 배지를 기반으로 하는 관계로, 사용한 철 공급원을 제외하고 조성은 동일하였던 상이한 배지 총 4개를 대상으로 시험을 실시하였다. 사용한 철 공급원을, 액체 배지중 최종 철 농도 300 μM이 되도록 만드는 양만큼 모든 배지에 첨가하였다.
사용한 철 공급원은 이하와 같았다:
배지 1: 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체(철 농도 300 μM);
배지 2: 황산철(II) 7수화물(철 농도 300 μM);
배지 3: 시트르산철(II) 9수화물(철 농도 300 μM);
배지 4: 시트르산철(III)(철 농도 300 μM).
세포 배양 실험(유가식 배양)을 시작한지 10일 및 13일 후에, 특정 단백질을 생산하도록 유전자 변형한 배양 세포의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 영향을 관찰하였다. 그 결과들을 도 2a 및 도 2b에 도시하였다. 배지 1(철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체)에 존재하는 철 공급원은, 배지 2 ~ 배지 4에 존재하는 철 공급원에 비하여 실험을 시작한지 10일 및 13일 후 생세포 수 및 생성물 농도, 즉 생산된 생성물의 양에 대하여 유리한 효과를 보였음이 확인되었다.
실시예 4 - 기타 철 공급원을 함유하는 건조 배지의 수중 용해도에 비한, 철 공급원으로서 철-시트르산염- 이인산염 -나트륨 착체를 함유하는 건조 배지의 수중 용해도
실시예 3의 건조 분말형 배지에 물을 첨가하고 나서, 건조 분말형 배지 각각이 완전히 용해되는데 소요되는 시간을 측정하였다. 결과들을 도 3에 도시하였다. 철 공급원으로서 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체를 함유하는 건조 분말형 배지 1은, 철 공급원이 상이한 배지 2, 3 및 4에 비해 수중에서 유의미하게 더 빨리 용해되었는데, 단 처음부터 건조 분말형이었던 배지 2, 3 및 4가 완전히 용해되기 위해서는 360분을 초과하는 시간이 소요되었다.
실시예 5 - 철-시트르산염- 이인산염 -나트륨 착체의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 영향과, 철-시트르산염- 이인산염 -나트륨 착체의 개별 성분을 추가로 가지는 기타 철 공급원의 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 영향 비교
사용한 철 공급원을 제외하고, 실시예 2에 나열된 무 트랜스페린 배양 배지를 기반으로 하고, 사용한 철 공급원을 제외하고 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체의 임의의 개별 성분들의 조성은 동일하였던 상이한 배지 총 5개를 대상으로 시험을 실시하였다. 사용한 철 공급원을, 액체 배지중 최종 철 농도가 300 μM이 되도록 만드는 양만큼 모든 배지에 첨가하였다. 용해된 배지중 착체의 형성을 허용할, 배지 1의 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체의 추가 개별 성분들을 조성물인 배지 5, 6, 7 및 8에 가급적 동 몰량만큼 첨가하였다. 피로인산염과 시트르산염의 동몰량을 산정하기 위해, Gupta외 다수의 문헌(Physicochemical characterization of ferric pyrophosphate citrate, Biometals, 2018, vol. 31, pp. 1091-1099)에 따라 X-선 흡수 분광법으로 확정한 철 대 시트르산염 대 피로인산염 비 4:3:3을 적용하였다. 다시 말해서, 배지 5 ~ 배지 8중 피로인산염 및 시트르산염의 양은, 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체에 의해 제공되는 배지 1중 피로인산염 및 시트르산염의 농도와 거의 동일하도록 유지하였다. 그 목적은, 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체의 개별 성분들이 해당 착체와 거의 동일한 효과를 보이는지 여부 또는 착체가 수용액중 개별 성분으로부터 자발적으로 형성될 수 있는지 여부를 관찰하기 위함이었다.
시험된 배지 5개는 철 공급원, 피로인산염 공급원 및 시트르산염 공급원으로서, 이하의 것들을 포함하였다:
배지 1: 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체(철 농도 300 μM);
배지 5: 시트르산철(III)(철 농도 300 μM)
4염기성 피로인산나트륨(피로인산염 농도 225 μM);
배지 6: 황산철(II) 7수화물(철 농도 300 μM)
4염기성 피로인산나트륨(피로인산염 농도 225 μM)
3염기성 시트르산나트륨 2수화물(시트르산염 농도 225 μM)
배지 7: 질산철(III) 9수화물(철 농도 300 μM)
4염기성 피로인산나트륨(피로인산염 농도 225 μM)
3염기성 시트르산나트륨 2수화물(시트르산염 농도 225 μM)
배지 8: 피로인산철(III)(철 농도 300 μM)
3염기성 시트르산나트륨 2수화물(시트르산염 농도 225 μM)
(유가식) 세포 배양 실험을 시작한지 10일 및 13일 후, 특정 단백질을 생산하도록 유전자 변형된 배양 세포의, 세포 생장 및 단백질 생산에 대한 영향을 관찰하였다. 그 결과들을 도 4a 및 도 4b에 도시하였다. 생세포 배양 실험을 시작한지 10일 및 13일 후, 배지 1에 존재하는 철 공급원(철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체)은, 배지 6 ~ 배지 8에 존재하는 철 공급원에 비하여 생세포 수에 유리한 효과를 보였음이 규명되었다. 실험을 시작한 지 10일 및 13일 후, 배지 1에 존재하는 철 공급원(철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체)은, 배지 5 ~ 배지 8에 존재하는 철 공급원에 비하여 생성물 농도, 즉 생산된 생성물의 양에 유리한 효과를 보였음이 추가로 확인될 수 있었다.
실험은, 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체는 액체 배지에서 이 자체의 개별 성분들로부터 형성되지 않았고, 그렇지 않으면 배지 5 ~ 배지 8에 대한 결과들은 배지 1에 대한 결과와 동일하여야 할 것임이 증명되었다. 그러나 이는 해당 사항이 아니었다.
데이터는, 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체(배지 1)는 생산된 생성물의 수득량의 관점에서 시트르산철(III) 및 4염기성 피로인산나트륨의 혼합물(배지 5)에 비하여 유리함을 추가로 보여주었다(도 4b의 배지 1과 배지 5 비교). 배지 5는 피로인산염을 (철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체에) 착화된 형태가 아닌 자유 음이온 형태로서 포함하였으므로, 이는 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체내 세포에 결합된 피로인산염이 더 많이 접근 가능하므로(즉 자유 음이온성 피로인산염보다 더 용이하게 취하여질 수 있으므로), 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체를 통해 달성될 수 있는 세포내 피로인산염 농도가 배지중 자유 피로인산염으로 도달할 수 있는 농도보다 더 높음을 의미할 수 있었다.
철 착체는 자발적으로 형성되지 않으며, 성능상 차이가 있음을 보이기 위해, 배지 5 ~ 배지 8을 제조하였다.
실시예 6 - 철-시트르산염- 이인산염 -나트륨 착체를 함유하는 건조 배지의 수중 용해도 및 착체의 기타 개별 성분들을 함유하는(즉 철, 시트르산염 및 피로인산염을 개별 성분으로서 함유하는) 건조 배지의 수중 용해도 비교
실시예 5의 배지(건조 분말형)에 물을 첨가하고, 건조 분말형 배지 각각이 완전히 용해하는데 소요되는 시간을 측정하였다. 그 결과들을 도 5에 도시하였다. 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체를 함유하는 건조 분말형 배지 1은, 철-시트르산염-이인산염 착체의 개별 성분(즉 철 이온, 시트르산염 이온, 피로인산염 이온 및 나트륨 이온을 제공하는 염들)을 함유하는 배지 5, 6, 7 및 8에 비하여 수중에 유의미하게 더 빨리 용해되었으며, 원래 건조 분말형이었던 배지 5, 6 및 7의 완전한 용해를 달성하기 위해서는 360분을 초과하는 시간이 필요하였고, 배지 8은 완전히 용해되지 않았음이 분명하였다.

Claims (14)

  1. 철-시트르산염-이인산염 착체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 용해되지 않은 형태, 바람직하게는 분말 또는 과립의 형태로 존재하고, 바람직하게 철-시트르산염-이인산염 착체를 0.16 중량% ~ 12 중량%, 바람직하게 0.22 중량% ~ 6 중량%, 특히 바람직하게 0.3 중량% ~ 2 중량%, 매우 특히 바람직하게 0.4 중량% ~ 1 중량%, 특히 0.5 중량% ~ 0.7 중량%의 양만큼 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 용해된 형태, 바람직하게는 수용액의 형태로 존재하고, 이 용해된 세포 배양 배지는, 바람직하게 철-시트르산염-이인산염 착체를 통해 설정된 세포 배양 배지내 철 농도가 범위 80 μM ~ 5800 μM, 바람직하게 100 μM ~ 3000 μM, 특히 바람직하게 150 μM ~ 1000 μM, 매우 특히 바람직하게 200 μM ~ 5000 μM, 특히 250 μM ~ 350 μM이 되도록 만드는 양만큼의 철-시트르산염-이인산염 착체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 철-시트르산염-이인산염 착체는 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체, 철-시트르산염-이인산염-칼륨 착체, 철-시트르산염-이인산염-암모늄 착체 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 철-시트르산염-이인산염 착체는, 바람직하게 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체, 더욱 바람직하게 CAS No. 85338-24-5 및/또는 EC No. 286-697-4인 철-시트르산염-이인산염-나트륨 착체인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지에는
    i) 혈청 성분 적어도 1개가 존재하지 않고, 바람직하게는 트랜스페린 및/또는 락토트랜스페린이 존재하지 않으며/않거나;
    ii) 2018년 8월 이래로 이용 가능하게 된 조성물중 혈청 대체물, 바람직하게 Ultroser G 혈청 대체물을 포함하며/포함하거나;
    iii) 생장 인자를 포함하며/포함하거나
    iv) 동물 또는 인간 성분이 존재하지 않으며/않거나;
    v) 단백질이 존재하지 않으며/않거나;
    vi) 가수분해물이 존재하지 않으며/않거나;
    vii) 화학적으로 한정된 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는
    i) 아미노산(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개 포함하되, 이 아미노산(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개는, 바람직하게 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 이것들의 조합 및/또는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 세포 배양 배지는 특히 상기 아미노산 모두를 포함하고/포함하거나;
    ii) 지질 전구체(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하되, 이 지질 전구체(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개는, 바람직하게 염화콜린, 에탄올아민, 글리세롤, 이노시톨, 리놀렌산, 지방산, 인지질, 콜레스테롤 관련 화합물, 이것들의 조합 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고/선택되거나;
    iii) 탄소 원자를 적어도 6개 가지는 카복실산(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개를 포함하되, 이 카복실산(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개는, 바람직하게 리놀레산, 리놀렌산, 티옥트산, 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키딘산, 아라키돈산, 라우르산, 베헨산, 데칸산, 도데칸산, 헥산산, 리그노세린산, 미리스트산, 옥탄산, 이것들의 조합 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 세포 배양 배지는 특히 상기 지방산 모두 및/또는 이것들의 염을 포함하고/포함하거나;
    iv) 탄소 원자를 6개보다 적게 가지는 카복실산(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개를 포함하되, 적어도 이 카복실산은, 바람직하게 부티르산 또는 부티르산의 염이고/염이거나;
    v) 뉴클레오시드(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개를 포함하되, 이 뉴클레오시드(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개는 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 티미딘, 하이포잔틴, 이것들의 조합 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 상기 세포 배양 배지는 상기 뉴클레오시드 모두 및/또는 이것들의 염을 포함하고/포함하거나;
    vi) 탄수화물(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하되, 이 탄수화물(들) 적어도 1개, 바람직하게 다수개는, 바람직하게 글루코스, 갈락토스, 글루코사민, 프럭토스, 만노스, 리보스, 수크로스 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는
    i) 완충제 성분(들) 적어도 1개, 선택적으로는 다수개를 포함하되, 이 완충제 성분(들) 적어도 1개, 선택적으로 다수개는, 바람직하게 ACES, HEPES, MES, MOPS, NaHCO3, PIPES, 인산염 완충제, TRIS, 이것들의 조합 및/또는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되고/선택되거나;
    ii) 미량 원소(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하고, 선택적으로는 킬레이트화제, 바람직하게 EDTA를 추가로 포함하되, 이 미량 원소(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개는 칼슘, 칼륨, 코발트, 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 나트륨, 니켈, 인산염, 셀레늄, 바나듐, 아연, 주석 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 미량 원소는, 선택적으로 염 형태로 존재할 수 있으며, 상기 세포 배양 배지는 특히 상기 미량 원소 모두를 포함하고/포함하거나;
    iii) 비타민(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개를 포함하되, 이 비타민(들) 적어도 1개, 바람직하게는 다수개는, 바람직하게 비오틴, 콜린, 폴리닌산, 미오이노시톨, 니아신아미드(B3), 판토텐산, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B12, 이것들의 조합 및/또는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지, 특히 바람직하게는 용해되지 않은 형태의 상기 세포 배양 배지는
    i) 철염을 포함하지 않고/않거나;
    ii) 시트르산철, 바람직하게는 시트르산염 및/또는 시트르산을 포함하지 않고/않거나;
    iii) 이인산철, 바람직하게는 이인산염 및/또는 이인산을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 DMEM, DMEM/F12 배지, 함 F-10 배지, 함 F-12 배지, 배지 199, MEM, RPMI 1640 배지, ISF-1, 옥토메드, 에임스 배지, (선택적으로 Fitton-Jackson 개질배지중) BGJb 배지, 클릭 배지, CMRL-1066 배지, 피셔 배지, 글래스카우 최소 필수 배지(GMEM), 이스코브 개질 둘베코 배지(IMDM), L-15 배지(Leibovitz), 맥코이 5A 개질 배지, NCTC 배지, 스윔 S-77 배지, 웨이마우스 배지, 윌리엄 배지 E 및 이것들의 조합, 선택적으로는 이것들의 변형예로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지를 포함하되, 각각의 세포 배양 배지는 2018년 8월 이래로 입수 가능한 조성물중의 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 DMEM, DMEM/F12 배지, 함 F-10 배지, 함 F-12 배지, 배지 199, MEM, RPMI 1640 배지 및 이것들의 조합, 선택적으로는 이의 변형예로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지를 포함하되, 각각의 세포 배양 배지는 2018년 8월 이래로 입수 가능한 조성물중의 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  11. 세포를 배양하기 위한 방법으로서,
    a) 수용액중 상기 청구항들 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지를 제공하는 단계; 및
    b) 적어도 1개의 세포를 세포 배양 배지 수용액에서 증식 또는 유지시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포는 1차 세포주 또는 연속 세포주의 세포이고, 바람직하게는 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 세포는, 특히 바람직하게 포유동물 세포, 특히 바람직하게 CHO, NS0, SP2/0, 하이브리도마, HEK293, PERC-6, BHK-21 및 Vero-76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물 세포, 매우 특히 바람직하게는 CHO 세포, 특히 CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-S 및 CHO-K1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CHO 세포인 방법.
  13. 세포 배양액에서 재조합 단백질 적어도 1개를 생산하기 위한 방법으로서, 제11항 또는 제12항에 의한 방법은 핵산을 세포 적어도 1개에 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 이 핵산은 재조합 단백질 적어도 1개의 구성적 또는 유도성 생산을 유도하고, 바람직하게는 생산된 단백질의 세포 배양 배지 수용액으로의 분비를 추가로 유도하며, 이 재조합 단백질은, 특히 바람직하게 치료용 단백질, 항체, 융합 단백질, 효소, 백신, 바이오시밀러 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 키나아제, 호르몬, 항체, 백신, 리포터 유전자 융합 단백질 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 세포 배양 배지중 철-시트르산염-이인산염 착체의, 바람직하게는 세포 배양 배지중 세포 적어도 1개를 배양하기 위한 세포 배양 배지중 성분, 및/또는 세포 배양 배지중 세포 적어도 1개를 배양하는 동안의 세포 배양 배지중 첨가제로서의 용도.
KR1020227008257A 2019-08-16 2020-08-14 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지, 세포를 배양하기 위한 방법, 그리고 세포 배양액중 재조합 단백질 적어도 1개를 발현시키기 위한 방법 KR20220046643A (ko)

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