KR20220044581A - 유전자 및 단백질의 대량 카고를 인간 세포로 전달하기 위한 원핵-진핵 하이브리드 바이러스 벡터 - Google Patents

유전자 및 단백질의 대량 카고를 인간 세포로 전달하기 위한 원핵-진핵 하이브리드 바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

다음을 포함하는 하이브리드(hybrid) 바이러스 벡터가 포함된다: 박테리오파지 T4(bacteriophage T4)와 같은 제1 바이러스; 아비딘-비오틴 크로스-브리지(avidin-biotin cross-bridges)와 같은 크로스-브리지를 통해 제1 바이러스에 부착된 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus:AAV)와 같은 하나 이상의 제2 바이러스; 제1 바이러스에 패키지된(packaged) 하나 이상의 DNA 분자; 제2 바이러스에 패키지된 하나 이상의 핵산 분자; 및 제1 바이러스의 표면에 디스플레이된(displayed) 하나 이상의 단백질. 또한, 이러한 하이브리드 바이러스 벡터를 만들고 사용하는 방법이 설명되어 있다.

Description

유전자 및 단백질의 대량 카고를 인간 세포로 전달하기 위한 원핵-진핵 하이브리드 바이러스 벡터
서열목록에 대한 참조
본 출원에는 .txt 형식의 전자적으로 제출된 서열목록이 포함되어 있다. .txt 파일에는 2020년 8월 7일에 생성된 "109007-23530US01_ST25.txt"라는 제목의 서열목록이 포함되어 있으며 크기는 2,079바이트이다. 이 .txt 파일에 포함된 서열목록은 명세서의 일부이며 전체가 여기에 참조로 포함된다.
정부 이익 진술서
본 발명은 NIAID 및 NIH에서 부여한 승인 번호 AI111538 및 AI081726에 따라 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 단백질 및 핵산 전달 성분, 조성물, 메카니즘(mechanisms) 및 이의 전달 방법에 관한 것이다.
표적 세포에 유전자 및 단백질을 전달하는 것은 기계적(mechanistic research) 연구 및 암, 전염병 및 유전 질병과 같은 많은 인간 질병의 예방 및 치료에 필수적이다. 그러나 유전자 및 단백질을 표적 세포에 효율적이고 안전하게 전달할 수 있는 비히클(vehicle)를 만드는 것은 여전히 주요 과제이다. 본 출원은 본 명세서에 기술된 바와 같은 종래 기술의 단점을 극복한다.
요약
제1의 넓은 측면에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 하이브리드 바이러스 벡터(예: T4-AAV)를 포함하는 생성물(product)을 제공한다: 제1 바이러스(예: 박테리오파지 T4(bacteriophage T4)); 크로스-브리지(cross-bridges)(예: 아비딘-비오틴 크로스-브리지(avidin-biotin cross-bridges))를 통해 원핵(prokaryotic) 바이러스의 헤드(head)에 부착된 하나 이상의 제2 바이러스(예: 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus), AAV).
제2의 넓은 측면에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 아비딘-비오틴 크로스-브리지를 디자인하는(designing) 단계; 크로스-브리지(Soc 또는 Hoc)의 한쪽 말단을 제1 바이러스(박테리오파지 T4)에 부착하는 단계; 크로스-브리지(avidin)의 다른 쪽 말단을 제2 바이러스(AAV)에 부착하는 단계.
제3의 넓은 측면에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 방법을 제공한다: 생물학적 표본(biological specimen)의 세포를 하이브리드 바이러스 벡터(T4-AAV)에 노출시켜 벡터를 세포에 결합시키거나 하이브리드 벡터를 생물학적 표본에 투여하는 단계, 상기 벡터는 제1 또는 제2 벡터 또는 둘 모두에 패키지된 하나 이상의 핵산분자를 포함하고, 제1 바이러스의 표면에 선택적으로 하나 이상의 Soc-융합 단백질이 디스플레이되며, 상기 벡터는 세포 내에 내재화되고(internalized), 상기 세포 내 벡터의 내재화는 패키지된 핵산을 각각의 세포의 세포질 내로 방출하며, 상기 포장된 하나 이상의 핵산분자가 각각의 세포의 세포질 내로 방출되면 하나 이상의 핵산분자가 각각의 세포의 핵 내로 진입하게 되고, 상기 하나 이상의 핵산분자가 각각의 세포의 핵으로 진입하면 DNA의 전사 또는 RNA의 역전사 및 핵산에 의해 코드되는 단백질(들)의 과발현이 유발됨.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 하나 이상의 도면이 포함되어 있다. 색상 도면이 포함된 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불시 사무실에서 제공한다.
본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 예시적인 실시예를 도시하고, 위에서 주어진 일반적인 설명 및 아래에 주어진 상세한 설명과 함께 본 발명의 특징을 설명하는 역할을 한다.
도 1은 본 발명의 하나의 실시예에 따른 박테리오파지 T4의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 T4-AAV 하이브리드 바이러스 벡터의 개략도이다.
도 3은 본 발명의 하나의 실시예에 따른 T4-AAV 조립 단계를 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 Soc 단백질의 비오틴화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 Hoc에 대한 BAP의 부착을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 하나의 실시예에 따른 Hoc-BAP의 비오틴화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 하나의 실시예에 따른 T4에 대한 Soc-비오틴의 상이한 비율의 부착을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4-Soc-비오틴에 대한 아비딘의 상이한 비율의 부착을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 Hoc-BAP-비오틴에 대한 아비딘의 부착을 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4에 대한 HBBA의 상이한 비율의 부착을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV의 비오틴화를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 씹을수 있는 타블렛(chewable tablet) 형태의 상이한 AAV 대 T4 비율에서 결합되지 않은(unbounded) AAV의 양을 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV가 T4에 부착된 것을 나타내는 전자현미경 사진이다.
도 14는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4 또는 AAV에 패키지된 DNA의 개략도이다.
도 15는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4(luci)-Soc-AAV 입자를 사용하여 AAV 대 T4 비율이 증가함에 따라 루시퍼라제(luciferase) DNA 전달 및 발현이 어떻게 증가하는지를 나타내는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4-Soc-AAV 대 세포의 비율이 증가함에 따라 루시퍼라제 DNA 전달 및 발현이 어떻게 증가하는지를 나타내는 그래프이다.
도 17은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV 부착에 따라 증가된 루시퍼라제 DNA 전달 및 발현을 나타내는 그래프이다.
도 18은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4-Hoc-AAV 대 세포 비율이 증가함에 따라 루시페라제 DNA 전달 및 발현이 어떻게 증가하는지를 나타내는 그래프이다.
도 19는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 세포 내 GFP 및 mCherry DNA 전달 및 발현을 나타내는 현미경 사진이다.
도 20은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 β-gal-Soc-T4(luci)-AAV(GFP) 입자의 개략도이다.
도 21은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 β-gal-Soc-T4(luci)-AAV(GFP) 입자를 사용하여 AAV 대 T4 비율이 증가함에 따라 루시퍼라제 DNA 전달 및 발현이 어떻게 증가하는지를 나타내는 그래프이다.
도 22는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 β-gal-Soc-T4(luci)-AAV(GFP) 입자를 사용하여 AAV 대 T4 비율이 증가함에 따라 GFP DNA 전달 및 발현이 어떻게 증가하는지를 나타내는 그래프이다.
도 23은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 β-gal-Soc-T4(luci)-AAV(GFP) 입자를 사용하여 Soc-β-gal 대 T4-HocAAV 비율이 증가함에 따라 β-갈락토시다제( β-galactosidase) 단백질 전달이 어떻게 증가하는지 및 β-갈락토시다제 단백질 전달이 AAV 부착을 어떻게 향상시키는지를 나타내는 그래프이다.
도 24는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 GFP-T4(mCherry)-AAV 및 NLS-GFP-T4(mCherry)-AAV 입자를 이용한 GFP 및 NLS-GFP 단백질의 전달 및 mCherry DNA의 전달 및 발현을 나타내는 현미경 사진이다.
도 25는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4 또는 AAV에 패키지된 ITRs-Luci DNA의 개략도이다.
도 26은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV가 패키지된 DNA의 전달 및 생체내 지속성을 향상시켰음을 보여주는 마우스에서의 ITR-Luci DNA 전달 및 발현의 이미지이다.
도 27은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 마우스에서 ITRs-Luci DNA의 전달 및 발현 및 생체내 지속성을 나타내는 그래프이다.
도 28은 AAV가 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 패키지된 DNA의 전달 및 생체내 지속성을 향상시켰음을 보여주는 감소된 용량의 T4-AAV를 갖는 마우스에서의 ITRs-Luci DNA 전달 및 발현의 이미지이다.
도 29는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 감소된 용량의 T4-AAV를 갖는 마우스에서 ITRs-Luci DNA의 전달 및 발현 및 생체내 지속성을 나타내는 그래프이다.
도 30은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4 또는 AAV에 패키지된 ITRs-HA4900 DNA의 개략도이다.
도 31은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 T4에 패키지된 HA4900 DNA의 전달 및 발현을 나타내는 그래프이다.
도 32는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 TSA에 대한 AAV의 부착을 나타내는 그래프이다.
도 33은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 THA에 대한 AAV의 부착을 나타내는 그래프이다.
도 34는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 Soc 또는 Hoc에 의해 가교된(bridged) PLA2 돌연변이를 갖는 야생형 AAV 또는 AAV를 갖는 T4에 패키지된 루시퍼라제 DNA의 전달 효율을 비교하는 그래프이다.
도 35는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV가 혼합되어 있지만 부착되지 않은 T4에 패키지된 루시페라제 DNA의 전달 효율을 나타내는 그래프이다.
도 36은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 프라임-부스트 도식(prime-boost scheme)을 나타내는 그래프이다.
도 37은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV를 부착하거나 부착하지 않은 T4(HA4900)에 의해 유도된 14일째 항-HA IgG 역가(titer)를 나타내는 그래프이다.
도 38은 본 발명의 예시적인 실시예에 따은 AAV가 부착된 또는 부착되지 않은 T4(HA4900)에 의해 유도된 35일째 항-HA IgG 역가를 나타내는 그래프이다.
도 39는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV를 부착하거나 부착하지 않은 T4(HA4900)에 의해 유도된 0일부터 180일까지의 항-HA IgG 역가를 나타내는 그래프이다.
도 40은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV가 부착되거나 부착되지 않은 T4(HA4900)에 의해 유도된 0일부터 180일까지의 혈청 CXCL13을 나타내는 그래프이다.
도 41은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV 부착 여부 및 F1mutV 부착 여부에 따른 T4(HA4900)에 의해 유도된 항-HA IgG 역가를 나타내는 그래프이다.
도 42는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV가 부착되거나 부착되지 않은 F1mutV-T4(HA4900)에 의해 유도된 항-F1mutV IgG 역가를 나타내는 그래프이다.
도 43은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 AAV가 부착되거나 부착되지 않은 F1mutV-T4(HA4900) 면역 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 44는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 소프트 젤(soft gel)의 투여 형태로 제형화된 조성물을 나타낸 이미지이다.
도 45는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 하드 캡슐(hard capsule)의 투여 형태로 제형화된 조성물을 나타낸 이미지이다.
도 46은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 화합물이 다르게 코트된(coated) 하드 캡슐의 투여 형태로 제형화된 조성물을 나타낸 이미지이다.
도 47은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 타블렛(tablet)의 투여 형태로 제형화된 조성물을 나타내는 이미지이다.
도 48은 발명의 예시적인 실시예에 따른 씹을수 있는 타블렛의 투여 형태로 제형화된 조성물을 나타내는 이미지이다.
도 49는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 캐플릿(caplet)의 투여 형태로 제형화된 조성물을 나타내는 이미지이다.
도 50은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 쉘(shell)에 둘러싸인 코어(core)를 포함하는 캐플릿의 투여 형태를 나타낸다.
도 51은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 주사 가능한 약물 전달 장치 및 주사 유체를 포함하는 본 명세서에 개시된 조성물을 전달하기 위한 치료 전달 장치를 나타낸다.
도 52는 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 본 명세서에 개시된 조성물을 대상체의 체내에 전달하기 위한 경피 패치(transdermal patch)를 포함하는 치료 전달 장치를 나타낸다.
도 53은 본 발명의 예시적인 실시예에 따른 경피 패치 내에 임베디드된(embedded) 본 명세서에 개시된 조성물을 포함하는 경피 패치를 나타낸다.
정의
용어의 정의가 일반적으로 사용되는 용어의 의미와 다른 경우, 특별히 명시되지 않는 한 출원인은 아래에 제공된 정의를 활용하고자 한다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 청구된 주제가 속하는 것으로 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에서 용어에 대한 정의가 여러 개 있는 경우 이 섹션(section)의 정의가 우선한다. 여기에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 간행물 및 공개된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(예: GenBank 또는 기타 데이터베이스에서 이용 가능한 서열)은 참조로 포함된다. URL 또는 기타 이러한 식별자(identifier) 또는 주소에 대한 참조가 있는 경우 이러한 식별자가 변경될 수 있고 인터넷의 특정 정보가 왔다 갔다 할 수 있지만 인터넷 검색을 통해 동등한 정보를 찾을 수 있음을 이해한다. 이에 대한 참조는 그러한 정보의 가용성 및 공개 배포를 입증한다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며 청구된 대상을 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 출원에서, 단수의 사용은 달리 명시되지 않는 한 복수를 포함한다. 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 본 출원에서 "또는(or)"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는(and/or)"을 의미한다. 또한, "포함하는(including)"이라는 용어와 "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함된(included)"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않는다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "포함하는(comprising)", 용어 "갖는(having)", 용어 "포함하는(including)" 및 이러한 단어의 변형은 개방형으로 의도되며 나열된 요소 이외의 추가 요소가 있을 수 있음을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, "상단(top)", "하단(bottom)", "높은(upper)", "낮은(lower)", "~보다 위에(above)", "~보다 밑에(below)", "왼쪽(left)", "오른쪽(right)", "수평(horizontal)", "수직(vertical)", "위(up)", "아래(down)"와 같은 방향 용어 등은 단지 본 발명의 다양한 실시 예를 설명함에 있어 편의상 사용된 것이다. 본 발명의 실시예들은 다양한 방향으로 지향될(oriented) 수 있다. 예를 들어, 도면에 표시된 도표, 장치 등은 뒤집거나, 임의의 방향으로 90o 회전하거나, 반대로 할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 값 또는 속성은 해당 값, 속성 또는 기타 요소를 사용하여 수학적 계산 또는 논리적 결정을 수행하여 해당 값이 파생되는 경우 특정 값, 속성, 조건의 만족 또는 기타 요소를 "기반으로(based)"한다.
본 발명의 목적을 위해, 보다 간결한 설명을 제공하기 위해 여기에 제공된 일부 정량적 표현은 "약(about)"이라는 용어로 한정되지 않는다. "약"이라는 용어가 명시적으로 사용되든 아니든, 여기에서 주어진 모든 양이라는 용어가 실제 주어진 값을 의미하는지, 또한, 이러한 주어진 값에 대한 실험 및/또는 측정 조건으로 인한 근사치를 포함하여, 당업자에 기초하여 합리적으로 추론될 수 있는 그러한 주어진 값에 대한 근사치를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "결합하다(bind)", 용어 "결합한(binding)" 및 용어 "결합된(bound)"은 공유 결합, 수소 결합, 정전기 결합, 생물학적 테터(biological tethers), 막횡단 부착, 세포 표면 부착 및 발현을 포함하지만 이에 국한되지 않는 모든 유형의 화학적 또는 물리적 결합을 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "벡터(vector)", "비히클(vehicle)". 및 "나노입자(nanoparticle)"는 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 유전자 또는 단백질을 전달하는 데 사용할 수 있는 바이러스 또는 하이브리드 바이러스 입자를 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, "향성(tropism)"이라는 용어는 특정 숙주 세포 또는 조직을 감염시키는 바이러스의 경향을 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "생물학적 샘플(biological sample)" 및 용어 "생물학적 표본(biological specimen)"은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 인간, 척추 동물, 무척추 동물, 미생물 또는 식물의 일부 또는 전체를 의미한다. 이 용어는 인간, 동물, 미생물 또는 식물 조직 세션, 세포 또는 조직 배양, 인간의 현탁액, 척추 동물, 무척추 동물, 미생물 또는 식물 세포 또는 이들의 분리된 부분, 인간 또는 동물 생검, 혈액 샘플, 세포 함유 유체 및 분비물(secretion)과 같은 인간의 재료, 척추 동물, 무척추 동물, 미생물 또는 식물 기원을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "캡시드(capsid)" 및 용어 "캡시드 쉘(capsid shell)"은 단백질의 여러 구조적 서브유닛(subunits)을 포함하는 바이러스의 단백질 쉘을 지칭한다. 캡시드는 바이러스의 핵산 코어를 둘러싸고 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "핵산(nucleic acid)"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머(polymer)를 말하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 핵산분자를 형성하는 핵산 염기는 염기 A, C, G, T 및 U 뿐만 아니라 이들의 유도체일 수 있다. 이들 염기의 유도체는 당업계에 잘 알려져 있다. 용어는 뉴클레오티드 유사체(analogs)로부터 만들어진 DNA 또는 RNA의 유사체를 등가물로서 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 또한 선형 및 원형 DNA를 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 또한 상보적인 cDNA, 또는 예를 들어 역전사효소의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 복제 DNA를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "면역 반응(immune response)"은 항원 또는 면역원에 대한 생물학적 표본의 면역계의 특이적 반응을 지칭한다. 면역 반응에는 항체 생성과 세포 면역이 포함될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "면역(immunity)"은 감염 유기체(infecting organism) 또는 물질에 대한 생물학적 표본의 내성 상태를 의미한다. 감염 유기체 또는 물질은 광범위하게 정의되며 기생충, 독성 물질, 암세포 및 기타 세포뿐만 아니라 박테리아 및 바이러스를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "면역화 조건(immunization conditions)"은 생체시료에 전달되는 면역원 또는 생물학적 표본에 전달된 보조제(adjuvant)의 양 및 종류, 전달방법, 접종횟수, 접종간격, 생물학적 표본의 종류 및 상태 등 면역반응에 영향을 미치는 인자를 말한다. "백신(Vaccine)"은 면역을 유도할 수 있는 약학적 제형을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "면역화 용량(immunization dose)"은 면역 반응을 촉진하는데 필요한 항원 또는 면역원의 양을 의미한다. 이 양은 다양한 보조제의 존재 및 효과에 따라 달라질 것이다. 이 양은 생물학적 표본 및 항원, 면역원 및/또는 보조제에 따라 달라질 것이지만 일반적으로 접종당 약 0.1㎍/ml 이하 내지 약 100㎍일 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "목 단백질(neck protein)" 및 용어 "꼬리 단백질(tail protein)"은 바이러스 입자, 특히 박테리오파지의 목 또는 꼬리의 임의의 부분의 조립에 관여하는 단백질을 지칭한다. 꼬리가 달린 박테리오파지는 ㅋ카카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order)에 속하며 3개의 과(family)를 포함한다: 시포비리대(Siphoviridae)는 길고 유연한 꼬리를 가지고 있으며 꼬리가 달린 바이러스의 대부분을 구성한다. 마이오비리대(Myoviridae)는 길고 단단한 꼬리를 가지고 있으며 박테리아 숙주에 파지가 붙을 때 수축하는 꼬리 덮개가 완전히 특징된다. 꼬리가 있는 바이러스의 가장 작은 패밀리는 포도바이러스(podoviruses)(짧고 다리와 같은 꼬리가 있는 파지)이다. 예를 들어, T4 박테리오파지에서 gp10은 gp11과 결합하여 베이스플레이트(baseplate)의 꼬리 핀(tail pins)을 형성한다. 꼬리-핀 조립은 꼬리 조립의 첫 번째 단계이다. 박테리오파지 T4의 꼬리는 단단한 관을 둘러싸고 있는 수축성 외피로 구성되어 있고 다단백질(multiprotein) 베이스플레이트에서 종결되며, 여기에는 파지의 길고 짧은 꼬리 섬유가 부착되어 있다. 머리가 DNA로 패키지되면, 단백질 gp13, gp14 및 gp15는 패키지된 머리를 밀봉하는 목으로 조립되며, gp13 단백질은 DNA 포장 후 포털(portal) 단백질 gp20과 직접 상호작용하고 gp14 및 gp15는 gp13 플랫폼(platform)에서 조립된다. T4 박테리오파지의 목 및 꼬리 단백질에는 단백질 gp6, gp25, gp53, gp8, gp10, gp11, gp7, gp29, gp27, gp5, gp28, gp12, gp9, gp48, gp54, gp3, gp18, gp19, gp13, gp14, gp15 및 gp63이 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "정제된(purified)"은 비교적 순수한(pure) 상태의 구성요소를 나타낸다 - 예를 들어, 적어도 약 90% 순수한, 또는 적어도 약 95% 순수한 또는 적어도 약 98% 순수한.
설명
본 발명은 다양한 수정 및 대안적인 형태가 가능하지만, 그의 특정 실시예는 도면에서 예시로 도시되었고 이하에서 상세하게 설명될 것이다. 그러나, 본 발명을 개시된 특정 형태로 제한하려는 것이 아니라, 반대로, 본 발명은 본 발명의 사상 및 범위 내에 속하는 모든 수정, 균등물 및 대안을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
유전자와 단백질을 표적 세포 형태로 전달하는 것은 기계론적 연구와 암, 전염병 및 유전 질환과 같은 많은 인간 질병의 예방 및 치료에 필수적이다. 바이러스 벡터는 유전자와 단백질을 표적 세포로 전달하는 매개체로 이용되었다. 일반적으로 사용되는 바이러스 벡터는 진핵 바이러스 벡터 및 원핵 바이러스 벡터를 포함한다.
아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스와 같은 진핵 바이러스 벡터는 게놈(genomes)을 포유동물 세포에 효율적으로 전달하도록 자연적으로 진화하여 유전자를 인간 세포에 전달할 수 있다. 그러나, AAV와 같은 진핵 바이러스 벡터는 제한된 전달 능력 때문에 효율적인 전달 매개체가 아니다: (1) 그들은 하나 또는 두 개의 유전자와 4-8kb 크기만을 전달할 수 있다; 및 (2) 그들은 단백질을 전달하는 데 적합하지 않다. 또한 인간 세포에 대한 친화성 및 독성, 기존 면역 및 안전성 문제로 인해 광범위한 적용이 제한된다.
박테리오파지(파지) T4와 같은 원핵 바이러스 벡터는 진핵 바이러스 벡터의 단점을 극복한다. 그러나, 파지는 포유동물 세포에 들어가거나 진입 후 적절한 세포내 구획에 도달하는 자연적 메커니즘이 부족하기 때문에 효율적인 전달 수단이 아니다. 도 1, 112는 파지 T4의 구조적 모델이다. 도 1의 표면도 120에 도시된 바와 같이, T4 헤드 캡소머(capsomer)는 캡시드 단백질 gp23*("*"는 gp23의 절단된 성숙한 형태를 나타냄) 126, 및 2개의 비필수 외부 캡시드 단백질인 Soc 124 및 Hoc 122로 구성된다. Soc 및 Hoc은 짧은 폴리펩티드, 큰 도메인, 전장(full-length) 단백질 또는 멀티메릭(multimeric) 복합체를 비롯한 다양한 외래(foreign) 단백질의 표시에 사용될 수 있음이 발견되었다. 이러한 발견은 진핵 바이러스 입자가 세포 관련 생물학적 표본을 위한 보다 효율적인 전달 매개체를 만들기 위해 파지에 부착될 수 있는지에 대한 질문을 제기했다. 하나의 실시예에서, 본 발명은 유전자 및 단백질을 표적 세포 내로 고효율로 전달하도록 독특하게 설계된 하이브리드 바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 생명공학 분야에서 효과적인 백신, 유전자 요법 및 연구 도구에 사용될 수 있다.
T4- AAV 하이브리드 바이러스 벡터의 디자인 및 구축
하나의 실시예에서, 본 발명은 비오틴-아비딘 브리지(bridge)를 통해 T4 헤드에 AAV가 부착된 T4-AAV 하이브리드 바이러스 벡터를 제공한다. 도 2에 도시된 바와 같이, AAV는 두 가지 유형의 브리지(bridge) 분자인 Soc-비오틴-아비딘(SBA) 210 및 Hoc-비오틴 수용체 펩티드(BAP)-비오틴-아비딘(HBBA) 220에 의해 T4 헤드에 부착된다. Soc 212 및 Hoc 222는 T4 헤드 202에 부착되고 아비딘 206은 다른 쪽에서 비오틴화된 AAV 204에 부착된다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, Soc-브리지된(bridged) T4-AAV 하이브리드 바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공한다: (1) Soc 단백질의 비오틴화 단계; (2) 비오틴화된 Soc(Soc-비오틴) 단백질을 T4 헤드에 부착하여 T4-Soc-비오틴을 생산하는 단계; (3) T4-Soc-비오틴에 아비딘을 부착하여 T4-Soc-아비딘(TSA)을 생산하는 단계; (4) AAV의 비오틴화 단계; (5) AAV 상의 비오틴을 아비딘에 결합함으로써 비오틴화된 AAV를 TSA에 부착시키는 단계.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, Hoc-브리지된 T4-AAV 하이브리드 바이러스 벡터의 생산 방법을 제공한다: (1) 비오틴 수용체 펩티드(BAP)를 Hoc 단백질에 부착하여 Hoc-BAP를 생산하는 단계; (2) Hoc-BAP의 비오틴화를 통한 HBB를 형성하는 단계; (3) T4 헤드에 HBBA를 부착하여 THA를 생산하는 단계; (4) AAV의 비오틴화 단계; (5) AAV 상의 비오틴을 아비딘에 결합함으로써 비오틴화된 AAV를 THA에 부착시키는 단계.
TSA 생성
도 3은 Soc-비오틴을 생성하는 단계를 표시한다. Soc-비오틴 316을 생성하기 위해, 정제된 Soc 단백질 312는 먼저 비오틴-N-히드록시숙신이미드-에스테르(biotin-N-hydroxysuccinimide-ester:NHS) 314를 사용한 활성화에 의해 비오틴화되었다(도 3). 도 4에 도시된 바와 같이 Soc 412의 효율적인 비오틴화가 확인되었다.
다음으로, Soc-비오틴은 T4 헤드에 부착되어 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 비오틴화된 Soc의 결합은 Soc-비오틴 712의 양이 증가하는 것으로 나타난 바와 같이 캡시드 결합 부위에 대한 Soc-비오틴 분자의 비율이 증가함에 따라 증가한다. 30:1 비율로, T4 결합 Soc-비오틴 피크(peaks)의 상대적 강도(도 5)는 거의 모든 캡시드 결합 부위가 Soc-비오틴에 의해 점유되었음을 시사한다. 그후, Avidin은 T4-Soc-비오틴과 결합하여 TSA를 형성한다. T4-Soc-비오틴에 대한 아비딘의 결합은 또한 TSA 612에서 아비딘의 양이 증가하는 것으로 나타난 바와 같이 T4-Soc-비오틴에 대한 아비딘의 비율이 증가함에 따라 증가한다(도 6). 2:1의 비율로, T4-Soc-비오틴 결합 아비딘 피크의 상대적 강도는 거의 모든 T4-Soc-비오틴에 아비딘이 부착되어 있음을 시사한다(도 6).
THA 생성
도 3은 Hoc-비오틴을 생성하는 단계를 표시한다. Hoc 브리지를 생산하기 위해, AP 324는 먼저 Hoc 322의 N-말단에 부착된다(도 3). Hoc 712에 대한 BAP의 부착은 도 7과 같이 확인된다. 그런 다음 Hoc-BAP 326은 도 3과 같이 비오틴 리가아제(biotin ligase:BirA)를 사용하여 비오틴화된다. 도 8과 같이 Hoc-BAP 812의 비오틴화를 확인하였다.
그 후, 아비딘은 비오틴화된 Hoc-BAP(HBB) 328에 부착되어 HBBA를 형성한다. 그런 다음 HBBA는 T4에 부착되어 THA 912를 효율적으로 형성한다(도 9). HBBA의 결합은 THA 1002에서 아비딘에 대한 양이 증가하는 것으로 나타난 바와 같이 캡시드 결합 부위에 대한 HBBA 분자의 비율이 증가함에 따라 증가한다. 30:1 비율로, T4 결합 Hoc-BAP-비오틴-아비딘 피크의 상대적 강도(도 10)는 거의 모든 결합 부위가 점유되었음을 시사한다.
AAV의 비오틴화 및 부착
AAV를 T4, AAV-DJ에 부착시키기 위해, 먼저 바이러스 입자를 비오틴-NHS로 활성화시켜 비오틴화시켰다. AAV-DJ에는 3개의 AAV 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3이 포함되어 있다. 세 가지 AAV 캡시드 단백질 모두의 비오틴화는 도 11에 도시된 바와 같이 확인된다. 도 11에서, 컬럼(column) 1102는 AAV 캡시드 단백질의 검출을 나타내고 컬럼 1104는 비오틴의 검출을 나타낸다.
그런 다음 비오틴화된 AAV-DJ 입자는 AAV-DJ 입자상의 비오틴과 아비딘의 결합을 통해 TSA 및 THA 브리지에 부착된다(도 12 및 13). 도 12는 AAV 캡시드 단백질의 검출을 나타내는 컬럼 1202과 함께 TSA에 대한 AAV의 효율적인 부착을 확인한다. 도 13은 AAV 캡시드 단백질의 검출을 보여주는 컬럼 1302과 함께 THA에 대한 AAV의 효율적인 부착을 확인한다.
T4에 대한 AAV의 접합은 또한 결합되지 않은 AAV의 양을 통해 모니터된다. TSA 또는 THA에 bioAAV(GFP)의 비율을 증가시킨 후, 결합되지 않은 bioAAV(GFP)를 수집하고 HEK293 세포에 형질도입하여 bioAAV에 의해 운반되는 GFP 유전자가 발현되도록 한다. 따라서, 형광 강도는 GFP 발현의 양과 결합되지 않은 AAV의 양을 나타낸다. 도 14는 결합되지 않은 bioAAV GFP 발현의 정량화를 나타낸다. 포인트(point) 1402 및 1404에서 결합되지 않은 AAV 양의 급격한 증가는 T4에 대한 AAV의 포화 접합을 시사한다. 평균적으로 최대 4개의 AAV 입자가 TSA 브리지를 통해 하나의 T4 캡시드에 접합되는 반면 최대 2개의 AAV 입자는 THA 브리지를 통해 하나의 T4 캡시드에 접합된다(도 14). AAV를 추가로 첨가하면 관류(flow-through)에서 증가하는 양의 바이러스가 용출된다. T4-AAV의 효율적인 조립은 도 15에 도시된 바와 같이 투과전자현미경(transmission electron microscopy:TEM)에 의해서도 확인된다. 도 15에서, 파란색 화살표는 T4(1502)를 나타내고 빨간색 화살표는 T4의 표면에 부착된 AAV(1504)를 나타낸다.
유전자는 AAV가 부착될 때 T4에 의해 훨씬 더 효율적으로 전달된다
T4 헤드 단독에 의한 포유동물 세포(HEK293)로의 형질도입은 매우 비효율적임이 이전에 밝혀졌다. 본 발명은 유전자가 T4에 패키지될 때 T4 헤드를 따라와 T4-AAV의 전달 효율을 비교하였다.
하나의 실시예에서, 휘도 유전자(luminance genes)를 포함하는 플라스미드는 TSA 브릿지를 통해 부착된 AAV와 함께 T4 캡시드에 패키지되어 HEK293 세포에 전달된다. 전달 효율은 상대적인 발광 단위(luminescence unit)로 측정된다.
도 16에 도시된 바와 같이, DNA 패키징 모터를 사용하여 T4 캡시드에 패키지된 핵산은 CMV 프로모터의 제어하에 루시퍼라제(luciferase:Luci), GFP 또는 mCherry 유전자를 포함하는 3개의 다른 플라스미드를 포함한다.
하나의 바람직한 실시예에서, 루시퍼라제 DNA는 T4(luci)-Soc-AAV를 사용하여 세포로 전달된다. 전달 효율은 상대적인 발광 단위로 표시된다. 도 17은 0.5:1(1704), 1:1(1706), 2:1(1708) 및 3:1(1710)과 같이 T4에 대한 AAV의 비율이 다른 T4 헤드 단독 1702 및 T4-AAV 벡터의 상대적인 발광 단위를 나타낸다. 도 17에 도시된 바와 같이, TSA 브리지를 통해 AAV에 부착하면 형질도입 효율이 적어도 40,000배 증가한다. 또한, 루시퍼라제 활성의 양으로 표시되는 전달 효율은 세포당 첨가된 Soc-브리지된 T4-AAV 입자의 수에 비례하며, 세포당 최대 105개 입자에 도달하였다(도 18).
또 다른 바람직한 실시예에서, 루시퍼라제 DNA는 T4(luci)-Hoc-AAV를 사용하여 세포로 전달된다. 도 19는 Hoc 1904 및 Soc 1906에 의해 브리지된 T4 헤드 단독 1902 및 T4-AAV 벡터의 상대적인 발광 단위를 나타낸다. 도 19에 도시된 바와 같이, HSA 브리지를 통해 AAV에 부착하면 T4 헤드 단독에 비해 형질도입 효율이 10,000배 증가한다. 또한, 루시페라제 활성의 양으로 표시되는 전달 효율은 세포당 추가된 Hoc-브리지된 T4-AAV 입자의 수에 비례하며, 이는 세포당 최대 106개 입자에 도달하였다(도 20).
유전자는 T4와 AAV를 통해 효율적으로 전달된다
T4-AAV 하이브리드 벡터의 장점은 T4 및 AAV를 동시에 사용하여 유전자를 전달할 수 있다는 것이다. T4는 이중 가닥 DNA 형태로 유전자를 전달하는 반면, AAV는 패키지된 AAV 게놈의 자연 상태인 단일 가닥 DNA 형태로 유전자를 전달한다.
하나의 실시예에서, mCherry DNA(적색 형광)는 T4 캡시드에 패키지되고 GFP DNA(녹색 형광)는 AAV에 패키지되며, 둘 다 Soc 브리지를 통해 접합된다. 그런 다음 이러한 T4(mCherry)-AAV(GFP) 나노입자를 HEK293 세포에 첨가하여 녹색 및 적색 형광을 전달 및 발현시키고 형광 신호는 세포 전체에 고르게 분포된다(도 21의 2102). 중요하게도, 신호는 고도로 병합되어 T4-AAV 하이브리드 벡터에 의한 T4 관련 mCherry 및 AAV 관련 GFP의 공동 전달로 인해 동일한 세포에서 두 신호의 발현을 입증한다.
또 다른 실시예에서, GFP DNA(녹색 형광)는 T4 캡시드에 패키지되고 mCherry DNA(적색 형광)는 AAV에 패키지되며, 이는 Soc 브리지를 통해서도 접합되어 T4(GFP)-AAV(mCherry) 입자를 형성한다. T4(GFP)-AAV(mCherry) 입자가 HEK293 세포에 추가된 후 녹색 및 적색 형광 신호도 모두 고르게 분포되고 고도로 병합된다(도 21의 2104).
두 실시예에서, 녹색 및 적색 형광 신호의 상관 계수(correlation coefficients)는 선형 피어슨(linear Pearson, rp) 및 비선형 스피어만 순위(nonlinear Spearman’s rank, rs)를 사용하여 정량화된다. 결과는 둘 다에 대해 높은 rp 및 rs 값을 보여준다(T4(mCherry)-AAV(GFP): rp=0.881, rs=0.884; T4(GFP)-AAV(mCherry): rp=0.856, rs=0.902), T4 및 AAV에 의해 전달되는 형광 유전자의 높은 공동 발현을 입증한다.
T4- AAV는 유전자와 단백질을 동시에 효율적으로 전달한다
T4-AAV 벡터는 또한 단백질과 유전자를 모두 전달하는 능력에 유리하여 하이브리드 나노입자의 치료 가능성을 더욱 확장한다.
하나의 실시예에서, Soc(Soc-β-gal)2204에 융합된 E. coli의 116kDa β-갈락토시다아제(β-galactosidase)의 약 250개 사본은 T4 헤드(2202)에 디스플레이되고; ~6.2kb 루시퍼라제 플라스미드의 ~9개 분자(도시되지 않음)가 T4 헤드 2202에 패키지되어 있으며; GFP DNA(도시되지 않음)는 Hoc 브리지를 통해 T4에 부착된 AAV 2206에 패키지된다(도 22). 생성된 β-gal-Soc-T4(luci)-AAV(GFP) 입자는 HEK293 세포로 형질도입된다.
도 23은 T4 헤드 단독 2302에 의한 루시퍼라제 전달 결과, 전달 효율의 지표인 상대적인 발광 단위, 및 0.5:1(2304), 1:1(2306) 및 2:1(2308)과 같이 AAV 대 T4의 비율이 다른 β-gal-Soc-T4(luci)-AAV(GFP) 입자를 나타낸다. 도 23에 도시된 바와 같이, HSA 브리지를 통한 AAV 부착은 T4 헤드 단독에 비해 형질도입 효율이 10,000배 증가하는 결과를 낳는다.
도 24는, AAV 관련 GFP의 발현은 AAV 대 T4의 비율에 대한 명확한 용량 의존성을 나타내며 3:1의 비율에서 피크를 나타낸다.
T4에 의해 전달된 β-갈락토시다아제 효소의 발현은 X-Gal 기질을 사용하여 시험된다. 절단된 X-Gal 기질의 파란색의 출현은 기능성 β-갈락토시다제 효소의 성공적인 발현을 나타낸다. 도 25는 T4-Hoc-AAV 2504에 대한 Soc-β-gal의 상이한 비율로 T4 헤드 단독 2502 및 β-gal-Soc-T4(luci)-AAV(GFP) 입자에 의해 전달될 때 파란색 강도를 나타낸다. 도 25에 도시된 바와 같이, 색상의 강도는 디스플레이된 Soc-β-gal 단백질의 카피 수에 비례한다. 결과는 AAV의 부착이 또한 T4의 표면에 표시된 단백질의 향상된 전달을 유도한다는 것을 확인시켜준다.
또 다른 실시예에서, T4 캡시드는 mCherry 플라스미드 DNA로 패키지되고 AAV에 부착된 핵 국소화 신호(nuclear localization signal, NLS)에 융합된 GFP 또는 GFP와 함께 디스플레이된다. 이 T4-AAV 나노입자는 그런 다음 HEK293 세포로 형질도입된다. 도 26에 도시된 바와 같이, 녹색 형광 신호 및 mCherry 신호는 GFP-T4(mCherry)-AAV 및 NLS-GFP-T4(mCherry)-AAV 형질도입 세포 모두에서 검출되어 T4-AAV 입자에 의한 단백질 및 유전자의 효율적인 전달을 확인한다.
또한, 세포당 106개의 T4-AAV 벡터의 수준에 첨가된 경우에도 Soc-브리지 또는 Hoc-브리지 여부에 관계없이 T4-AAV 입자에 의한 형질도입 후에 세포 생존력에 대한 측정 가능한 영향이 관찰되지 않았다.
AAV를 변형(variant)으로 대체하면 전달 효율성 향상에 실패한다
하나의 실시예에서, AAV VP1 캡시드 단백질의 포스포리파제 A2(PLA2)가 돌연변이되어 AAV-PLA2 돌연변이가 생성된다. T4-AAV 나노입자는 AAV-PLA2 돌연변이를 SBA 브리지 또는 HBBA 브리지를 통해 T4에 부착함으로써 조립된다. 루시퍼라제 DNA는 T4에 패키징되어 T4(Luci)-Soc-AAV-AN 및 T4(Luci)-Hoc-AAV-AN 하이브리드 벡터를 생성하고, HEK293 세포에 전달된다. 도 27은 PLA2 돌연변이가 없는, T4(Luci)-Soc-AAV-WT 2702 및 T4(Luci)-Hoc-AAV-WT 2706와 비교한 T4(Luci)-Soc-AAV-AN 2704 및 T4(Luci)-Hoc-AAV-AN 2708의 상대적인 발광성을 보여준다. 결과는 야생형 AAV를 갖는 T4-AAV가 T4에 패키지된 전달 유전자에서 PLA2 돌연변이를 갖는 T4-AAV보다 적어도 5배 더 효율적임을 확인시켜준다. 다시 말해, T4(Luci)-Soc-AAV-AN(PLA2 돌연변이 포함)은 T4(Luci)-Soc-AAV-WT의 형질도입 효율의 20%를 보존하므로 T4 헤드 단독보다 핵산 전달에 훨씬 더 효율적이다.
비오틴- 아비딘 크로스-브리지 부재로 인해 전달 효율 향상 실패
하나의 실시예에서, T4는 비오틴-아비딘 크로스 브리지에 의해 결합 없이 AAV와 혼합된다. 그런 다음, 루시퍼라제 DNA를 T4에 패키징하여 HEK293 세포에 전달한다. 도 28은 T4 대 AAV 상이한 비율에서 T4 및 AAV 혼합물(2802)의 상대적인 발광 단위를 나타낸다. 비오틴-아비딘 크로스 브리지가 없는 경우, 결과는 T4 단독에 비해 T4 전달의 향상이 없음을 확인한다. 펩타이드 T의 부착은 T4에 의한 Luci 유전자의 전달을 향상시킨다. 그러나, 혼합물에 AAV를 첨가해도 상이한 T4 대 AAV 비율 2804에서 T4(Luci)-Hoc-T의 전달 효율이 추가로 향상되지 않는다.
상기 실시예에 따르면, T4-AAV 하이브리드 벡터 생산의 각 단계에서 작업 비율 범위 및 최적 비율은 아래 표에 요약되어 있다:
비율의 작업 범위 최적 비율
비오틴:Soc 1:1 내지 30:1 20:1
Soc - 비오틴:T4 0.5:1 내지 40:1 30:1
아비딘:T4 - Soc -비오틴 0.5:1 내지 10:1 2:1
비오틴:Hoc - BAP 1:1 내지 20:1 10:1
아비딘 : HBB 1:1 내지 10:1 3:1
HBBA:T4 1:1 내지 40:1 30:1
비오틴:AAV 10:1 내지 40:1 20:1
BioAAV:TSA 1:1 내지 5:1 4:1
BioAAV:THA 1:1 내지 5:1 2:1
DNA:T4 1:1 내지 40:1 20:1
T4- AAV 나노입자에 의한 효율적인 생체 내 유전자 전달
높은 전달 효율은 물론, 긴 생체 내 지속성은 바이러스 벡터의 또 다른 원하는 기능이다. 핵으로 들어가게 되면, 단일 가닥 AAV 게놈은 이중 가닥 AAV DNA를 생성하기 위해 복제된다. 이중 가닥 AAV DNA는 ITR에서 분자내 또는 분자간 재구성을 통해 머리-꼬리 콘카티머(concatemers)로 전환되고 장기간 트랜스진(transgene) 발현을 위한 에피솜(episomes)으로 지속되는 것으로 생각된다. 간과 근육을 포함한 다양한 AAV 형질도입 조직에 대한 연구에 따르면 콘카티머는 최대 22개월까지 장기간 지속된다. 이전 연구에서는 ITR는 T4-패키지된 DNAs의 생체 내 지속성을 크게 향상시키는 것으로 나타났다.
하나의 실시예에서, AAV 역 말단 반복(inverted terminal repeats, ITR)은 패키지된 DNAs의 트랜스진의 측면에 위치하도록 조작된다.
바람직한 실시예에서, 트랜스진은 Soc 또는 Hoc 크로스-브리지를 통해 AAV에 부착되는 T4 헤드에 포장된 ~9개의 ITR-Luci DNA 분자이다. 생성된 T4(ITRs-Luci)-Soc/Hoc-AAV(GFP) 입자는 그런 다음 마우스에 주입된다. 도 29에 도시된 바와 같이, ITR-Luci DNA 분자로 구성된 서열은 다음 순서로 연결된다: ITR 2902, CMV 프로모터(promoter) (CMVpro) 2904, 루시퍼라제 유전자 2906, 폴리(poly) A 2908, 및 ITR 2910.
하나의 실시예에서, ~2x1011 T4(ITRs-Luci)-Soc/Hoc-AAV(GFP) 입자가 근육내(intramuscularly, i.m.) 마우스에 주입된다. 마우스에서 루시퍼라제의 발현은 전신 영상화에 의해 모니터되고 60일 동안 광자 플럭스(photon flux)를 측정하여 정량화된다.
도 30에 도시된 바와 같이, 루시퍼라제 신호는 국소 주사 부위에서 검출 가능하며, T4-AAV 나노입자의 단일 주사가 마우스에서 루시페라제의 효율적이고 연장된 발현을 초래했음을 확인시켜준다. T4-Soc-AAV 입자는 AAV가 없는 T4 입자와 비교할 때 30일째에 루시퍼라제 신호의 ~25배 향상을 초래했다(도 30 및 31). 신호는 30일째에 정점에 도달했고 60일째에도 높은 수준을 유지했다. 대조적으로, 신호는 AAV가 없는 T4 입자를 받은 마우스에서 15일째에 피크에 도달하고 60일째에 거의 사라졌다(도 30 및 31). Hoc-브리지 T4-AAV 입자는 60일째에 AAV가 없는 T4보다 ~130배 더 높은 뚜렷한 루시페라제 신호를 생성했다.
하나의 실시예에서, ~5x1010 T4(ITRs-Luci)-Soc/Hoc-AAV(GFP) 입자가 근육내(i.m.) 마우스에 주입된다. 결과는 또한 접합된 T4-AAV가 T4 카고(cargo)의 마우스 세포 내로의 보다 효율적인 전달을 촉진하여 T4 단독과 비교할 때 더 긴 기간 동안 향상된 유전자 발현을 초래함을 확인하였다(도 32 및 33). 따라서 T4-AAV 하이브리드 벡터는 치료 응용 분야에 매력적인 전략을 제공할 수 있다.
T4- AAV에 의해 전달된 다가(Multivalent) DNA 백신 및 단백질 항원은 보호 면역 반응을 효율적으로 유도한다
DNA 백신은 전반적인 안전성과 손쉬운 생산으로 인해 백신 개발을 위한 매력적인 후보이다. DNA가 분해되지 않도록 보호하기 위해 DNA 백신을 공식화하고 효율적인 전달 기술을 개발하는 것은 DNA 백신의 최종 효능에 핵심적인 역할을 한다. 또한, DNA 백신에 의해 유도된 면역 반응은 상동 단백질 부스트(homologous protein boost)에 의해 극적으로 향상되었다. 따라서, 본 발명에서, T4-AAV 하이브리드 벡터는 DNA와 단백질 모두를 효율적으로 전달할 수 있고 전달된 유전자의 발현을 최대 60일까지 유지할 수 있어 다기능 유전자 및 단백질(프라임-부스트(prime-boost)) 백신 전달 플랫폼으로 사용된다.
인플루엔자 바이러스는 독감을 일으키는 병원체이다. 인플루엔자 바이러스 외피 단백질의 혈구응집소(hemagglutinin, HA) "줄기(stem)" 영역은 매우 매력적인 "보편(universal)" 백신 후보이다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 상기 HA-줄기(HA4900)을 포함하는 T4-AAV 전달 벡터를 제공한다. 이 DNA는 30:1의 패키징 비율로 캡시드당 ~10개의 분자로 T4 헤드에 패키지되었다. 도 34에 도시된 바와 같이, 패키지된 DNA 분자는 ITR 3402, CMV 프로모터 3404, HA4900 3406, 폴리 A 3408 및 ITR 3410의 순서로 서열을 포함한다. 이러한 입자의 HEK293 세포로의 형질도입은 HA4900 항원의 효율적인 발현 및 배양 배지 내로의 분비를 초래한다(도 35). 도 35에서, 로우(row) 3502는 HA4900 단백질이 세포 배양 배지에서 회수되었음을 보여준다.
하나의 실시예에서, 마우스는 외부 보조제 없이 프라임-부스트 방식을 사용하여 ~2×1011 Hoc-브리지 T4(HA4900)-AAV(VRC01) 입자로 근육내 면역화 된다. VRC-HIVMAB060-00-AB(VRC01)는 HIV 감염 환자의 B 세포에서 분리된 광범위 중화 HIV-1 단일클론항체(monoclonal antibody, mAb)이다. VRC01의 형질도입은 또한 마우스에서 검출될 수 있으며(데이터는 나타내지 않음), 이는 2개의 상이한 유전자를 패키징하고 전달하는 T4-AAV 하이브리드 벡터의 능력을 나타낸다.
도 36은 프라임-부스트 방식의 실험적 설계를 도시한다. 간단히 말해서, 프라임 주사 21일 후, 마우스는 부스트 주사를 받는다. 일부 실시예에서, 마우스는 또한 51일에 예르시니아 페스티스 ( Yersinia pestis , Y. pestis ) CO92로 챌린지된다(challenged). 병원체 DNA를 운반하는 T4-AAV 입자의 주입에 의해 유도된 면역 반응을 평가하기 위해 IgG 역가를 측정한다. 마우스에서, IgG2a 역가는 TH1(1형 T 보조(helper) 세포) 면역 반응을 반영하는 반면, IgG1 역가는 TH2(2형 T 보조 세포) 면역 반응을 반영한다.
하나의 실시예에서, 마우스는 21일째에 프라임 주사 및 부스트 주사를 받는다. IgG 역가로 나타낸 면역 반응은 14일, 35일, 60일, 120일 및 180일에 결정된다. T4(HA4900)의 단일 주사는 마우스(14일째)에서 항-HA IgG 역가를 유발했으며(도 37), 두 번째 주사(35일째)로 추가로 부스트되었다(도 38). 도 37 및 38은 각각 14일 및 35일의 IgG 역가를 나타낸다. PBS 및 T4 대조군은 면역 반응을 유도하지 않는 반면, AAV의 부착은 높은 IgG 역가를 유도하므로 AAV가 부착되지 않은 HA4900을 운반하는 T4와 비교하여 더 강한 면역 반응을 유도한다. 결과는 AAV에 대한 접합이 T4(HA4900) 전달을 유의하게 개선하여 항원 발현을 증가시키고 감염원에 대한 면역을 강화한다는 것을 확인시켜준다. 도 37 및 38은 또한 IgG 서브클래스(subclasses)인 IgG1 및 IgG2a의 역가를 나타낸다. T4(HA4900)-AAV 혈청은 ~25배 더 높은 서브클래스 IgG2a 역가를 함유한다. 도 6E는 항-HA IgG2a 역가의 내구성을 나타내며, 이는 면역화 후 6개월 후에도 안정적으로 유지된다. 또한, T4(HA4900)-AAV의 IgG 역가는 프라임 주입 후 180일 동안 T4 단독에 의해 유도된 것보다 높게 유지된다(도 39). 이러한 데이터는 T4-AAV 나노입자가 T4 헤드 단독과 비교할 때 더 강한 TH1 편향 면역 반응을 유도함을 시사한다.
강력하고 지속적인 체액성 면역 활성(humoral immune activities)은 일반적으로 배 중심(germinal center) 반응 및 수명이 긴 혈장 및 기억(memory) B 세포를 특징으로 하며 CD4+ 여포 보조 T 세포(follicular helper T cells, Tfh)의 도움에 크게 의존한다. CXCL13 [케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 13(chemokine (C-X-C motif) ligand 13)] 케모카인은 림프 조직에서 배 중심 및 Tfh 세포의 활동에 대해 알려진 혈장 바이오마커이다.
도 40은 T4-AAV 나노입자로 면역화한 후 180일 동안의 혈청 CXCL13 수준을 나타낸다. 도40에 도시된 바와 같이, T4(HA4900)-AAV 면역 마우스는 T4(HA4900) 면역 마우스와 비교할 때 CXCL13의 혈청 농도가 ~4배 더 높았으며, 이는 하이브리드 벡터에 의해 유도된 배 중심 및 Tfh 세포의 향상된 활성을 나타낸다.
Y. 페스티스 페스트(plague)를 유발하는 병원체. 페스트 항원 F1mutV는 페스트에 대한 지속적인 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 하이브리드 T4(HA4900)-AAV 나노입자를 사용하여 마우스를 면역화하는 방법을 제공한다: T4에 패키지된 ~10분자의 HA4900 DNA, ~590개의 F1mutV 분자가 Soc 융합 단백질로서 T4의 표면에 디스플레이되고, Hoc-브리지를 통해 T4에 부착된 AAV. 마우스는 프라임 주사 후 21일에 부스트 주사로 프라임 부스트 계획(scheme)에 따라 면역화된다.
도 41은 AAV의 부착이 강화된 항-HA IgG, 특히 IgG2a 역가를 유도함을 확인시켜주는 IgG 역가를 보여준다. 또한, 도 42에 도시된 바와 같이, F1mutV-T4(HA4900)-AAV는 또한 F1mutV-T4(HA4900)보다 더 높은 총 항-F1mutV IgG 역가를 자극하여 AAV의 부착이 또한 T4에 의해 전달된 단백질 항원에 대한 면역 반응을 향상시킨다는 것을 확인했다.
또 다른 실시예에서, 마우스를 프라임-부스트 계획을 사용하여 F1mutV-T4(HA4900)-AAV 벡터로 면역화한 다음, 51일째에에 가장 치명적인 Y. 페스티스 CO92의 295 LD50[1 LD50 = Balb/c 마우스에서 100 콜로니 형성 단위(CFU)] 챌린지 용량으로 챌린지한다.
도 43은 Y. 페스티스 CO92로 챌린지된 마우스의 생존율을 나타낸다. 높은 생존율은 예방 접종에 의한 보호 강화를 나타낸다. 도 43에서 도시된 바와 같이, F1mutV-T4(HA4900)-AAV 벡터는 완전한 보호를 보인 반면, 비접합 F1mutV-T4(HA4900) 벡터는 부분 67% 보호를 나타냈다. 따라서, 결과는 AAV의 부착이 T4에 의해 전달된 항원에 의해 유도된 면역 반응을 개선함을 확인시켜주었다.
또 다른 실시예에서, 마우스를 프라임-부스트 계획을 사용하여 F1mutV-T4-AAV(HA4900) 벡터로 면역화한 다음, 51일에 가장 치명적인 Y. 페스티스 CO92의 295 LD50[1 LD50 = Balb/c 마우스에서 100 콜로니 형성 단위(CFU)]의 챌린지 용량으로 챌린지한다.
그러나 AAV의 부착은 T4 헤드 단독과 비교하여 HA에 대한 면역 반응을 향상시키지 못한다(데이터는 표시되지 않음).
본 발명에 있어서, 혈청 알칼리성 인산분해효소(serum alkaline phosphatase)의 변화, 체중 감소 또는 온도 변화와 같은 부작용 또는 독성 관련 효과의 징후는 T4-AAV 나노입자로 면역화된 모든 마우스에서 명백하지 않았다.
본 발명의 많은 실시예를 상세히 설명하였지만, 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 수정 및 변형이 가능함은 자명할 것이다. 또한, 본 개시내용의 모든 예는 본 발명의 많은 실시예를 예시하지만 비제한적 예로서 제공되고, 따라서 예시된 다양한 면을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1
플라스미드 구축( Plasmid Construction)
플라스미드 pET-28b-Soc, pET-28b-Soc-β-gal, 및 pET-28b-F1mutV-Soc는 이전에 기재된 바와 같이 구축되었다. pET-28b-BAP-Hoc의 구축을 위해, 3개의 프라이머를 사용하여 BAP-Hoc을 증폭하기 위해 2회의 PCR을 수행했다: FW1=ATCGAGTGGCACGAGGGTCTTTCGATGACTTTTACAGTTGATATAACTCC (서열번호 1), FW2=TTCTAGCTAGCGGTCTTAACGACATCTTCGAGGCACAGAAGATCGAGTGGCACGAGGGTCT TCG (서열번호 2), 및 RW = ATAAAGCTTTTATGGATAGGTATAGATGATACCAGTTTC (서열번호 3). CR의 첫 번째 라운드는 FW1 및 RW 프라이머를 사용하여 BAP 서열의 일부에 Hoc을 융합하여 수행되었다.
전장 BAP-Hoc은 FW2 및 RW 프라이머를 사용한 두 번째 PCR에 의해 수득한 다음 NheI 및 HindIII로 분해되었다. 분해된 BAP-Hoc 단편을 ET-28b 벡터에 서브-클론(sub-cloned)했다. BirA 발현 플라스미드 pET-21a-BirA는 Addgene® plasmid #20857에서 구입했다. 플라스미드 pAAV-DJ, pAAV-Helper, pAAV-GFP, pAAV-luciferase 및 pAAV-mCherry는 Cell BiolabsTM에서 구입했다. DJ-H75A-D76N 돌연변이를 복제하려면, 업스트림(upstream) 단편은 프라이머 AN-F(CGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAG)(서열번호 4) 및 HD-AN-R(GTTTGCCTCGAGGGCCGCGGCGTCTGCCTC)(서열번호 5) 및 주형 pAAV-DJ를 사용하여 증폭되었고, 다운스트림(downstream) 단편은 프라이머 HD-AN-F(CCGCGGCCCTCGAGGCAAACAAAGCTACGACCGGCAGCTCGACA)(서열번호 6) 및 AN-R(GAGAACGTACGGCAGCTGGTACTCCGAGTC)(서열번호 7)을 사용하여 증폭되었다. 그런 다음 두 개의 단편을 동일한 양으로 혼합하고 프라이머 AN-F 및 AN-R을 사용하여 DJ-H75A-D76N을 증폭하기 위한 주형으로 사용했다. PCR 생성물은 후속적으로 HindIII/BsiWI 제한 부위에서 pAAV-DJ 벡터로 클로닝되어 pAAV-DJ-H75A-D76N을 구성하였다. 인플루엔자(Influenza) HA4900 DNA 단편은 최근 보고에 따라 Invitrogen®에 의해 합성된 다음 EcoRI 및 HindIII로 절단된 후 pAAV 벡터에 서브-클론되었다. 구축된 모든 플라스미드는 정확한 단편 삽입을 확인하기 위해 시퀀스되었다(Retrogen®, CA).
실시예 2
단백질 발현 및 정제
대장균( Escherichia coli , E. coli ) BL21(DE3) RIPL 세포에서 발현된 재조합 단백질을 이전에 설명된 프로토콜(protocols)에 따라 정제했다. 인플루엔자 HA4900은 이전 보고서에 따라 HEK293F 현탁 세포(Thermo Fisher Scientific®, MA)에서 정제되었다. 간단히 말해서, pAAV-ITRs-HA4900 플라스미드는 293fectin™ 형질감염 시약(Thermo Fisher Scientific®, MA)을 사용하여 FreeStyle® 293 발현 배지(Thermo Fisher Scientific®, MA)에서 유지되는 HEK293F 세포에 일시적으로 형질도입되었다. 그런 다음 세포를 37°C 및 8% CO2에서 인큐베이션하면서 130rpm에서 밤새 쉐이킹(shaking)했다. 12시간 후, 소듐 부티레이트 용액(단백질 발현 향상, 2nM 최종 농도)(Sigma-Aldrich, MO)이 보충된 동일한 부피의 새로운 배지를 세포에 첨가했다. 7일에, 순수한 상층액을 원심분리에 의해 수확하고 0.22μm 필터(Sartorius Stedim Biotech, Germany)로 여과했다. 단백질은 HisTrapHP 및 겔 여과 컬럼(GE HealthcareTM, IL)을 사용하여 정제되었다.
실시예 3
T4 헤드 및 AAV의 생산
10-amber 13-amber hoc-del soc-del T4 헤드는 이전에 설명된 프로토콜에 따라 정제되었다. 이 돌연변이로 감염된 E. coli P301(sup-) 세포(500mL)는 10μg/mL DNaseI 및 클로로포름(chloroform)(1mL)을 포함하는 40mL의 Pi-Mg 완충액(26mM Na2HPO4/68mM NaCl/22mM KH2PO4/1mM MgSO4, pH 7.5)에 용해시키고 37°C에서 30분간 배양했다. 용해물(lysate)은 2번의 저속(10분 동안 6,000 x g) 및 고속(45분 동안 35,000 x g) 원심분리를 거쳤고, 최종 헤드 펠릿(nal heads pellet)을 200μL의 Tris·Mg 완충액(10mM Tris·HCl, pH 7.5/50mM NaCl/5mM MgCl2)에 재현탁하고 CsCl 밀도 구배 원심분리로 정제했다. 5mL 기울기의 바닥에서 약 1/3에 침전된 주요 헤드 밴드를 추출하고 Tris·Mg 완충액에 대해 밤새 투석했다. 헤드는 DEAE-Sepharose 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되었다. 피크 헤드 분획(peak heads fractions)을 농축하고 -80°C에서 보관했다.
rAAV-DJ는 제조업체의 지침에 따라 삼중 플라스미드 형질감염 방법(triple-plasmid transfection method)(Cell Biolabs, CA)을 사용하여 생산되었다. 간략하게, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(pHelper), rep 및 cap을 발현하는 rep/cap 플라스미드(pAAV-DJ 또는 pAAV-DJ-H75A-D76N)를 포함하는 플라스미드, 및 AAV 트랜스진 카세트(cassette)(AAV 게놈)(pAAV-GFP, pAAV-mCherry, pAAV-루시퍼라제, pAAV-HA4900, 또는 pAAV-VRCO1)(1:1:1)를 운반하는 트랜스진 플라스미드는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)(Polysciences, PA)을 사용하여 아데노바이러스 E1a 및 E1b 단백질을 발현하는 HEK293 세포에 공동 형질감염되었다. 72시간 후, 세포를 1,140 xg에서 10분 동안 원심분리하여 수득했다. 세포 펠릿(cell pellet)을 용해 완충액(lysis buffer)(50mM Tris-HCl, pH 8.5, 0.15M NaCl)에 재현탁하고 드라이아이스-에탄올(dry ice-ethanol) 및 37°C 수조에서 3회의 동결/해동 주기로 용해시켰다. 벤조나아제(Benzonase)를 혼합물에 첨가하고(50 U/ml 최종 농도), 용해물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 3,700 x g에서 20분 동안 원심분리하여 정화하고 바이러스 함유 상등액을 조(crude) 용해물로 간주했다. 그런 다음 바이러스는 제조업체의 지침(GE HealthcareTM, IL)에 따라 HiTrap AVB Sepharose HP에 의해 4°C(Type 55 Ti 로터, Beckman, CA)에서 16시간 동안 500,000rpm에서 불연속적인 요오딕사놀 밀도 구배(discontinuous iodixanol density gradient) 원심분리에 의해 정제되었다. 피크 분획은 Slide-A-Lyzer 투석 카세트(Thermo Fisher Scientific®, MA)에서 PBS-MK 완충액(PBS, pH 7.4, 2.5mMKCl 및 1mMMgCl2)에 대해 투석되었다. 투석된 AAV 입자를 농축하고 -80°C에서 보관했다. AAV 역가는 QuickTiter AAV 정량 키트(Cell Biolabs, CA)를 사용하여 결정되었다.
실시예 4
T4 헤드의 시험관내 DNA 패키징 및 단백질 디스플레이.
시험관내 DNA 패키징 분석의 경우, 각각의 20μl 반응 혼합물은 정제된 T4 헤드(~2×1010 입자), 정제된 전장 gp17(~3μM) 및 패키징 버퍼(30mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 3mM MgCl2 및 1mM ATP)에 선형화된 DNA가 함유되어 있다. 혼합물을 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 벤조나아제 뉴클레아제(benzonase nuclease)를 첨가하고 37°C에서 20분 동안 인큐베이션하여 포장되지 않은 초과(excess) DNA를 제거했다. 캡슐화된 뉴클레아제 내성 DNA는 50mM 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 0.5μg/μl 프로테이나제(proteinase) K(Thermo Fisher Scientific®, MA) 및 0.2% SDS를 65°C에서 30분 동안 처리하여 방출되었다. 포장된 DNA를 1%(wt/vol) 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로 분석한 후 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하고 포장된 DNA의 양을 Quantity One 소프트웨어(Bio-RadTM, CA)를 사용하여 정량화했다. 패키징 효율은 T4당 패키징된 DNA 분자의 수로 정의되었다.
T4 헤드의 시험관 내 단백질 디스플레이는 이전에 설명된 공동-침강(co-sedimentation)에 의해 평가되었다. 요약하면, 상기와 같이 선형화된 DNA를 캡슐화한 후, T4 헤드를 4°C에서 45분 동안 Soc- 및/또는 Hoc-융합 단백질과 함께 인큐베이션했다. 혼합물을 30,000 x g에서 45분 동안 원심분리하여 침전시키고 상층액에서 결합되지 않은 단백질을 제거했다. PBS로 두 번 세척한 후, 펠릿을 4°C에서 밤새 인큐베이션한 다음 SDS/PAGE 분석을 위해 PBS 또는 형질도입을 위해 Opti-MEM에 재현탁했다. Coomassie BlueR250(Bio-RadTM, CA) 염색 및 탈색 후, SDS-PAGE 겔의 단백질 밴드를 스캔하고 레이저 농도계(PDSI, GE HealthcareTM, IL)로 정량화했다. Hoc, Soc 및 gp23 밴드의 밀도는 각 레인에 대해 별도로 결정되었고, 캡시드당 결합된 Hoc 또는 Soc 융합 분자의 카피 수는 gp23을 내부 대조군(캡시드당 930카피)으로 사용하여 계산되었다.
실시예 5
AAV 벡터 및 Soc 단백질의 비오틴화 .
AAV 벡터 및 Soc 단백질은 제조업체의 지침(Thermo Fisher Scientific?, MA)에 따라 EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-비오틴을 사용하여 비오틴화되었다. 정제된 AAV 벡터(1x1012 입자)를 PBS 완충액에서 2시간 동안 37°C에서 500nmol의 Sulfo-NHS-LC-비오틴과 함께 인큐베이션했다. Soc 단백질 비오틴화의 경우, 20배 몰 과량의 비오틴 시약을 사용하여 PBS 완충액에서 10mg의 Soc를 표지했다. 프리(free) 비오틴을 제거하려면, 반응 혼합물은 Slide-A-Lyzer® 투석 카세트(Thermo Fisher Scientific®, MA)의 PBS-MK 완충액에 대해 투석되었다. 투석된 bioAAV 및 bioSoc을 농축하고 -80°C에서 보관했다.
실시예 6
HBBA 생산
15-아미노산 비오틴 수용체 펩티드(BAP, GLNDIFEAQKIEWHE)(서열번호 8)를 Hoc 단백질의 N-말단에 융합시켰다. E. coli 효소 비오틴 리가아제(BirA) 서열은 비오틴을 BAP에 특이적으로 연결한다. 간단히 말해서, His6-태그(tag)가 지정된 BirA 및 Hoc-BAP를 BL21RIPL 세포에서 유도하고 HisTrapHP 컬럼 및 SEC를 통해 정제했다. Hoc-BAP 비오틴화를 위해 0.3mM 비오틴 및 5mM ATP의 존재 하에 1μM 재조합 BirA 리가아제를 30μM Hoc-BAP 단량체(PBS-MgCl2 완충액, pH 7.4)에 첨가했다. 반응은 실온(room temperature, RT)에서 3시간 동안 진행되었다. 프리 비오틴은 Zeba™ Desalt 스핀 컬럼(Thermo Fisher Scientific®, MA)으로 제거했다. 비오틴화 반응 혼합물을 조밀한 레진 베드(resin bed)의 중앙에 로딩하고 1,000 xg에서 2분 동안 원심분리하여 탈염된 샘플을 수집하였다. 정제된 Hoc-BAP-비오틴을 4°C에서 1시간 동안 1:3 비율로 아비딘(avidin)과 함께 인큐베이션했다. HBBA는 SEC에 의해 정제되었다. 피크 분획을 농축하고 -80°C에서 보관했다.
실시예 7
T4- Soc - AAV 및 T4-Hoc- AAV 벡터 생성.
니켈 비드(nickel beads)에 T4-Soc-AAV 벡터를 조립하기 위해 T4-Soc(His6)-비오틴 벡터를 Ni2 +-NTA 아가로스 비드(agarose beads)(Qiagen®,Netherlands)에 로드했다. 4°C에서 1시간 동안 배양한 후, 혼합물을 100 x g에서 30초 동안 원심분리하고 결합 완충액으로 5회 세척하였다. 그 다음, 결합 완충액에 용해된 아비딘을 비드에 첨가하였다. 4°C에서 20분 동안 배양한 후, 프리 아비딘을 세척하고 원심분리하여 제거했다. 그런 다음 비오틴화된 AAV 벡터를 T4-Soc-SBA 고정 비드에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션했다. 결합 완충액으로 5회 세척한 후, 결합된 T4-Soc-AAV 벡터를 용리 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl 및 300mM 이미다졸(imidazole))으로 용리시켰다. 니켈 비드에 T4-Hoc-AAV를 조립하기 위한 프로토콜은 T4-Soc-AAV에 사용된 프로토콜과 유사했다. 마지막으로, 용출된 벡터를 PBS-MK 완충액으로 교환하였다.
실시예 8
웨스턴 블롯 분석.
AAV 또는 T4-AAV 입자를 로딩 완충액에서 10분 동안 끓이고 12% SDS-PAGE로 분리한 다음 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막(Bio-Rad™, CA)으로 옮겼다. 5% BSA/PBS-T 완충액(PBS, pH 7.4, 0.05% Tween-20)에서 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 차단을 수행했다. 그런 다음 블롯을 PBS-T로 3회 세척했다. 1차 항체를 블롯에 첨가하고 5% BSA가 포함된 PBS에서 4°C에서 밤새 인큐베이션했다. AAV VP 단백질은 동일한 C-말단 영역을 기반으로 VP1, VP2 및 VP3을 인식하는 AAV 캡시드 단백질 특이적 항체 B1(희석 1:50, American Research Products, MA)을 사용하여 검출되었다. PBS-T로 3회 세척한 후, 이차 염소 항-마우스(secondary goat anti-mouse) HRP 결합 항체(Thermo Fisher Scientific®, MA)를 실온에서 1시간 동안 5% BSA/PBS-T에 1:2,000으로 희석한 후 PBS-T로 3회 헹구었다(rinsing). bio-AAV, bio-Soc 및 Hoc-BAP-biotin은 HRP-접합 스트렙타비딘(HRP-conjugated streptavidin)(Abcam®, UK)에 의해 직접 검출되었다. 제조업체의 지침(Bio-Rad™, CA)에 따라 Bio-Rad™ Gel Doc XR+ 시스템 및 Image Lab 소프트웨어를 사용하여 향상된 화학발광 기질(Bio-Rad™, CA)로 신호를 시각화했다.
실시예 9
T4 Capsid의 라벨링 .
아민 반응성 Alexa Fluor® 594(Thermo Fisher Scientific®, MA)로 T4 캡시드를 라벨링하려면, 펠릿화된 T4 헤드를 0.1M 탄산염 완충액(carbonate buffer), pH 9.0에 재현탁시켰다. Alexa Fluor® 594를 0.2mg/ml의 최종 농도로 첨가했다. 암실에서 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBS, pH 7.4로 완충제 교환을 통해 결합되지 않은 염료를 제거하였다.
실시예 10
TEM
T4-AAV 복합체는 실온에서 5분 동안 탄소 그리드(carbon grid)에 적용되었다. 그런 다음 그리드는 Gatan® CP3 cryo-plunger를 사용하여 액체 질소에서 동결되었다. T4, AAV 및 T4-AAVcomplex의 cryo-EM 이미지는 CCD(charge-coupled device) 카메라가 장착된 Titan Krios 현미경을 사용하여 Purdue University의 Dr. Qianglin Fang에 의해 친절하게 수집되었다. 이 실험을 위한 AAV 입자는 플로리다 대학의 Mavis Agbandje-McKenna 박사가 제공했다.
실시예 11
세포 배양
HEK293 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)(Thermo Fisher Scientific, MA), 1xHEPES(Thermo Fisher Scientific®, MA) 및 1% 항생제(Thermo Fisher Scientific®, MA)(완전한 DMEM)가 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium(DMEM, Gibco)에서 배양되었다. 세포를 80-90% 합류(confluence)에서 1:5의 계대 배양 비율로 0.05% 트립신/EDTA로 계대하고 37°C 및 5% CO2의 습한 분위기에서 배양했다.
실시예 12
세포 형질도입 및 유전자 및 단백질 전달의 검출.
HEK293 세포를 완전한 DMEM에서 웰당 2.0x105개 세포로 24-웰 플레이트에 시드(seeded)하였다. 24시간 후, 세포를 항생제가 없는 Opti-MEM의 다른 MOI에서 AAV, bio-AAV, T4 또는 T4-AAV 벡터와 함께 6시간 동안 인큐베이션했다. 그 후, Opti-MEM을 제거하고 완전한 DMEM으로 교체했다. 세포를 추가로 48시간 동안 37°C에서 추가로 인큐베이션하였다. GFP/mCherry 트랜스진 발현은 형질도입 후 48시간에 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)에 의해 관찰되었고, 평균 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어에 의해 정량화되었다. 핵은 Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific?, MA)로 염색하였다. T4 또는 T4-AAV에 의한 세포로의 루시퍼라제 유전자 전달을 분석하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 루시퍼라제 분석 시스템(Promega®, WI)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정했다. 간단히 말해서, 성장 배지를 제거하고 세포를 PBS 완충액으로 헹구었다. 세척 완충액을 제거한 후, 150 μl의 수동 용해 완충액을 각 웰에 첨가한 다음 실온에서 20분 동안 부드럽게 흔든다. 20 마이크로리터의 세포 용해물을 96-웰 흰색 불투명 플레이트에 옮기고 80 μl의 루시퍼라제 분석 시약과 혼합하고 발광 신호를 Glomax Multi Detection System(Promega®, WI)으로 기록했다. 세포에서 T4 헤드에 표시되는 Soc-β-gal 효소의 활성은 β-Galactosidase Staining kit(Sigma-Aldrich®, MO)를 사용하여 X-Gal로 염색하여 결정되었다. 각 그룹에 3회 측정을 적용했다.
실시예 13
공동- 국소화 분석(Co-localization Analysis).
Zen(Carl Zeiss, Germany) 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리했다. 2색 비교를 위한 공동-국소화의 정도를 정량화하기 위해, 녹색 및 빨간색 채널에서 형광 신호를 나타내는 픽셀(pixels)에 대한 선형 Pearson(rp) 및 비선형 Spearman의 순위(rs) 상관 계수(correlation coefficients)는 ImageJ PSC 플러그(plugin)인을 사용하여 계산되었다.
실시예 14
세포 생존력 분석.
48시간 동안 형질감염시킨 후, 제조자의 지시에 따라 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega®, WI)를 사용하여 세포 생존율을 결정하였다. 간단히 말해서, 동일한 부피의 CellTiter-Glo® 시약을 각 웰의 세포 배양에 첨가했다. 혼합물을 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에 2분 동안 놓아 세포 용해를 유도한 다음 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰으며, 이를 Glomax Multi Detection System(Promega®, WI)으로 기록했다. 무처리 세포군의 생존율은 임의로 100%로 설정하였고, 각 군에 대해 3회 측정을 적용하였다.
실시예 15
생체내 생물발광 이미징 .
생체내 생물발광 이미징은 이전에 설명한 대로 수행되었다. 구체적으로, 5×1010 및 2×1011 T4 또는 T4-AAV 입자를 BALB/c 마우스에 근육주사하였다. 투여 후 0.25일(d), 0.5일, 1일, 2일, 5일, 10일, 15일, 30일 및 60일에, 0.9% 염수(saline)에 용해된 루시퍼라제 기질인 RediJect D-Luciferin Ultra(Perkin-ElmerTM, MA) 30㎍을 복강내 주사하였다. 5분후, 마우스를 2% 이소플루란(isoflurane)으로 가볍게 마취시키고 IVIS 200 생물발광 전신 이미징 워크스테이션(workstation)(CaliperTM)에 두었다. 생물발광 방출 신호는 카메라 제어 프로그램인 Living Image 소프트웨어를 사용하여 정량화되었고 표면 복사의 물리적 단위, 스테라디안당(steradian) 제곱센티미터당 초당 광자(photons/second/cm2/sr)로 표시되었다.
실시예 16
마우스 면역화(Immunizations)
모든 동물 실험은 미국 가톨릭 대학교(Catholic University of America)(워싱턴(Washington), DC) 및 텍사스 대학교 의료 지부(University of Texas Medical Branch)(갤버스턴(Galveston), TX)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 마우스들(mice)(BALB/c, 암컷, 6-8주령, Jackson Laboratories, ME)를 무작위로 그룹화하여 7일 동안 순응시킨 후 벡터를 사용하여 뒷다리에 근육 주사(0일에 프라이밍(priming) 및 21일에 부스팅)를 실시했다. 모의 면역화된 마우스들(mock-immunized mice) 그룹(PBS만)이 음성 대조군으로 포함되었다. 0일(사전 채혈), 14, 21, 35, 60, 120 및 180일에 각 동물에서 혈액을 채취하고 분리된 혈청을 -80°C에 보관했다.
실시예 17
ELISA
ELISA 플레이트(Evergreen Scientific, CA)를 4℃에서 밤새 코팅 완충액(0.05M 탄산나트륨-중탄산나트륨, pH 9.6)에서 웰당 0.1㎍의 단백질로 코팅하였다. PBS-T 완충액으로 3회 세척한 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 PBS-3% BSA 완충액으로 차단하였다. 혈청 중 항원 특이적 IgG/G1/G2a의 농도는 PBS-1% BSA에서 초기 100배 희석으로 시작하여 5배 희석 시리즈를 사용하여 모니터링되었다. 희석된 혈청 샘플을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 PBS-T 완충액으로 5회 세척하였다. 그런 다음 이차 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체(HRP-접합 염소 항-마우스 IgG1 또는 IgG2a 이차 항체는 IgG1/IgG2a 서브타입에 사용됨, Invitrogen®)를 각 웰에 1:5,000으로 희석하여 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양한 다음 PBS-T 완충액으로 5회 세척했다. 다음으로, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)) Microwell Peroxidase Substrate System(KPL)은 암실에서 발색을 위해 적용되었다. 10분 후, TMB BlueSTOP(KPL) 용액을 첨가하여 효소 반응을 없애고, 플레이트를 ELISA 판독기(VERSA max, Molecular Devices)로 650nm에서 30분 이내에 판독했다. 종말점 역가는 분석의 평균 배경(음성 혈청)의 2배와 동일한 OD650을 초래하는 샘플 희석액으로 제시되었다. 혈청 내 CXCL13 정량화를 위해 마우스 CXCL13 ELISA 키트(Boster Biological Technology, CA)를 제조업체의 지침에 따라 사용했다.
실시예 18
알칼리성 인산분해효소(Alkaline Phosphatase , ALP) 분석.
ALP 생화학적 매개변수는 T4, AAV 또는 T4-AAV로 면역화된 마우스의 혈청에서 결정되었다. 나이브(Naive) 마우스를 대조군으로 사용하였다. ALP 수준은 제조업체의 지침에 따라 상용 ALP 분석 키트(Elabscience®, MD)를 사용하여 측정되었다.
실시예 19
마우스 첼린지 (Challenges).
순응된 마우스는 T4, AAV, F1mutV-T4(HA4900) 또는 F1mutV-T4(HA4900)-AAV(0일에 프라이밍 및 21일에 부스팅)로 뒷다리에 근육내 면역화시켰다. 면역학적 분석을 위해 0일(사전 채혈) 및 35일에 각 동물로부터 혈청을 수집하였다. 42일째, 마우스는 Y. pestis CO92 박테리아의 295 LD50로 비강내로 챌린지되었다. 동물을 모니터링하고 사망률, 체중 및 체온에 대해 기록했다.
실시예 20
통계.
모든 정량화된 데이터는 평균 ± 표준 편차(standard deviation, SD)로 표시된다. 통계 분석은 양측 스튜던트 t-테스트에 의해 수행되었다. 두 그룹 간의 상당한 차이는 *p< 0.05 또는 **p < 0.01로 표시된다.
실시예 21
유틸리티 사용.
치료적으로 효과적인 양의 하이브리드 벡터는 DNA 및 단백질 전달 도구 또는 COVID, 독감, HIV, 탄저병(anthrax) 및 흑사병(plague)과 같은 감염성 질병에 대한 백신 접종을 위해 사용된다.
투여 경로
DNA 분자 또는 단백질을 운반하는 하이브리드 벡터의 치료적으로 효과적인 양은 다양한 경로로 투여될 수 있다. COVID, 독감, HIV, 탄저병 및 페스트와 같지만 이에 제한되지 않는 감염성 질병을 예방하기 위해 대상체의 백신 접종을 수행함에 있어서, 하이브리드 벡터는 하이브리드 벡터를 유효량으로 생체이용가능하게 만드는 임의의 형태 또는 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 경구로(orally), 흡입에 의해(by inhalation), 또는 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 정맥내(intravenous), 경피(transdermal), 비강내(intranasal), 직장(rectal), 안구(ocular), 국소(topical), 설하(sublingual), 협측(buccal) 또는 기타 경로로 투여될 수 있다.
하이브리드 벡터 제조 분야의 숙련자는 선택된 하이브리드 벡터의 특정 특성, 치료할 장애 또는 상태, 장애 또는 상태의 단계 및 기타 관련 상황에 따라 적절한 형태 및 투여 방식을 쉽게 선택할 수 있다.
약학적 조성물.
약학적 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방식으로 제조되며, 여기서 약학적 조성물은 하나 이상의 DNA 분자 및 단백질을 운반하는 하이브리드 벡터의 치료적으로 효과적인 양의 조성물을 포함한다. 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)는 활성 성분에 대한 비히클(vehicle) 또는 매질로서 작용할 수 있는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 적합한 담체 또는 부형제는 당업계에 잘 알려져 있다.
약제학적 조성물은 경구 또는 비경구용으로 적합할 수 있고 타블렛(tablets), 설탕-코트된 타블렛(sugar-coated tablets), 캡슐(capsules), 지연된-방출 하드 캡슐(delayed-release hard capsules), 소프트젤(softgel), 츄어블 타블렛(chewable tablets), 젤리(gummy), 주사액(injection fluids), 캐플릿(caplets), 분말(powders), 과립(granules), 시럽(syrups), 에어로졸(aerosols), 흡입제(inhalants), 좌약(suppositories), 용액(solutions), 현탁액(suspensions), 조성물을 함유하는 카테터(catheters), 조성물을 함유하는 주사기(syringes), 조성물을 함유하는 임플란트(implants), 경피 패치(transdermal patch) 등의 투여 형태로 대상체에게 투여될 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 도 44에 도시된 바와 같이 소프트겔의 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물은 도 45에 도시된 바와 같이 하드 캡슐의 제형으로 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 또한 조성물 내의 각각의 상이한 화합물이 상이하게 코트된 경질 캡슐의 투여 형태로 제형화될 수 있다(도 46).
또 다른 실시예에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 도 47에 도시된 바와 같이 타블렛의 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물을 포함하는 정제는 도 48에 도시된 바와 같은 츄어블 타블렛일 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물은 또한 도 49에 도시된 바와 같이 캐플릿으로 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 조성물을 포함하는 캐플릿은 코어(core) 및 쉘(shell)과 같은 2개 이상의 부분을 포함하는 제어된-방출(controlled-release) 캐플릿으로 제형화될 수 있으며, 여기서 코어는 도 50에 도시된 바와 같이 쉘 내에 있다.
경구 투여용 제형의 상기 예에 더하여, 개시된 조성물은 또한 예를 들어 주사를 통해 대상체의 신체에 전달될 수 있다. 조성물은 주사액의 투여 형태로 제형화될 수 있고 대상체의 신체에 주사하기 위해 주사 가능한 장치(예: 주사기)에 로드될 수 있다. 도 51은 주사 가능한 약물 전달 장치(5112) 및 주사 유체(5114)의 투여 형태로 본원에 개시된 조성물을 포함하는 치료 전달 장치(5110)의 예시이다. 본 명세서에 개시된 조성물은 대상체의 피부(5120)를 통한 주사를 통해 전달되어 대상체의 체내(5122)로 들어갈 수 있다. 일부 실시예에서, 주사 가능한 약물 전달 장치는 대상체의 신체 외부(5124)에 머무를 수 있다.
도 51은 대상체의 신체로 전달하기 위한 조성물의 단지 하나의 예시적인 실시예를 나타낸다. 전달 기구는 주사기형 장치에 국한되지 않을 수 있다. 당업자는 개시된 생성물(들) 또는 환자의 신체 작용제를 전달하기에 적합한 임의의 주사 가능한 장치가 본 발명의 측면에 따라 이용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
일부 실시예에서, 본원에 개시된 조성물은 예를 들어 경피 패치를 통해 대상체의 신체 내로 전달될 수 있다. 도 52는 본 명세서에 개시된 조성물을 포함하는 경피 패치(5214)를 예시한다. 경피 패치(5214)는 피험자의 피부(5212)에 배치하기 위한 접착 패치 및 접착 패치에 매립된 하나 이상의 활성층을 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 활성층은 치료적으로 효과적인 양으로 본원에 개시된 조성물을 포함한다. 경피 패치(5214)는 접착 패치에 내장된 조성물이 대상의 혈류로 전달될 수 있도록 대상의 신체에 배치될 수 있다.
일부 실시예에서, 도 53에 도시된 바와 같이, 경피 패치(5300)에서, 하이브리드 벡터의 치료적으로 효과적인 양의 조성물은 하나 이상의 활성층(예를 들어, 5312 및 5314)으로 제형화되고 불투과성 지지층(5310) 아래에 매립된다. 도 52 및 도 53은 경피 패치를 통해 대상체의 신체 내로 개시된 조성물의 예시적인 전달의 예시적인 표현일 뿐이다. 당업자는 본 발명에 기술된 개시된 제품을 전달하기에 적합한 임의의 종류의 경피 패치가 이용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
용량
조성물은 잠재적인 독성 또는 원치 않는 효과를 최소화하면서 최적의 약리학적 효과를 얻기 위해 일상적인 테스트에 의해 정의된 적절한 투여량으로 사용될 수 있다.
효과적인 양은 통상의 기술을 사용하고 유사한 상황에서 얻은 결과를 관찰함으로써 당업자로서 담당 진찰 전문 의사(diagnostician)가 용이하게 결정할 수 있다. 하이브리드 벡터의 유효량, 용량을 결정할 때 담당 진찰 전문 의사는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 요인을 고려한다: 투여될 벡터; 종 - 크기, 나이 및 일반적인 건강; 관련된 특정 장애; 관련 정도 또는 장애의 심각성; 개별 주제의 응답; 관리 방식; 투여된 제제의 생체이용률 특성; 선택된 용량 요법; 다른 병용 약물의 사용; 및 기타 관련 상황.
투여되는 특정 용량은 각 상황을 둘러싼 특정 상황에 의해 결정될 수 있다. 특정 상황은 다음을 포함할 수 있다: 투여 경로, 받는자(recipient)의 이전 병력, 치료 중인 증상, 치료 중인 증상의 중증도, 및 받는자의 나이. 받는자의 주치의는 관련 상황에 비추어 투여되는 치료 용량을 결정해야 한다.
또한, 정확한 용량은 받는자 "용량 적정(dose titrating)"의 의료 분야의 표준 관행에 따라 결정될 수 있음을 이해해야 한다; 즉, 초기에 저용량의 화합물을 투여하고 원하는 치료 효과가 관찰될 때까지 용량을 점진적으로 증가시킨다.
투여 요법은 다양한 인자에 따라 선택될 수 있음이 추가로 이해되어야 한다. 여기에는 대상체의 유형, 종, 연령, 체중, 성별, 식단 및 의학적 상태; 치료할 상태의 심각성; 투여 경로; 대상의 신장 및 간 기능; 관리 시간; 배설 속도; 및 사용된 특정 하이브리드 벡터가 포함된다. 숙련된 의사는 치료 중인 질병 또는 장애의 진행을 예방, 반대 또는 저지하는 데 필요한 약물의 효과적인 양을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다.
하나의 실시예에서, 이 생성물은 1일 1회 투여 및/또는 1일 다중 투여 중 하나 이상에서 선택된 투여 간격을 갖는 연속 일정에 따라 투여를 위해 사용될 수 있다. 하나의 실시예에서, 이 생성물은 만성적으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 본 발명을 수행하기 위해 고려되는 본 명세서에 개시된 특정 실시예로 제한되지 않고, 본 발명은 청구범위의 범위 내에 속하는 모든 실시예를 포함할 것으로 의도된다. 본 출원에 인용된 모든 문서, 특허, 저널 기사 및 기타 자료는 참고로 여기에 포함된다.
본 발명의 많은 특징 및 이점은 상세한 명세서로부터 명백하며, 따라서, 첨부된 청구범위에 의해 본 발명의 진정한 정신 및 범위에 속하는 본 발명의 이러한 모든 특징 및 이점을 포함하도록 의도된다. 또한, 많은 수정 및 변형이 당업자에게 용이하게 일어날 것이기 때문에, 본 발명을 예시 및 설명된 정확한 구성 및 작동으로 제한하는 것은 바람직하지 않으며, 따라서 본 발명의 범위 내에서 모든 적절한 수정 및 균등물이 이용될 수 있다.
참고문헌
다음 참고문헌은 위에서 언급되었으며 참조로 여기에 포함된다:
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Claims (34)

  1. 다음을 포함하는 생성물(product):
    제1 바이러스 벡터;
    제2 바이러스 벡터; 및
    진핵(eukaryotic) 바이러스 벡터를 원핵(prokaryotic) 바이러스 벡터에 연결하는 크로스-브리지(cross-bridge).
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 바이러스 벡터는 람다 파지(Lambda phage), 바실러스 파지 Phi29(Bacillus phage Phi29), 대장균 파지 T2(Escherichia coli phages T2), T3, 및 T7, 엔테로박테리아파지 P22(Enterobacteriaphage P22), 파지 SPP1, 헤르페스바이러스(Herpes viruses) 및 아데노바이러스(adenoviruses)로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 생성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated viruses, AAV), 레트로바이러스(retroviruses), 렌티바이러스(lentiviruses) 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 생성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 크로스-브리지는 SBA, HBBA 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 생성물.
  5. 제1항에 있어서, 제1 바이러스 벡터에 패키지된(packaged) 하나 이상의 DNA 분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 DNA는 이중가닥인 것을 특징으로 하는 생성물.
  7. 제1항에 있어서, 제2 바이러스 벡터에 패키지된 하나 이상의 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 핵산분자는 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 생성물.
  9. 제1항에 있어서, 제1 바이러스 벡터에 패키지된 하나 이상의 이중가닥 DNA 분자 및 제2 바이러스 벡터에 패키지된 하나 이상의 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  10. 제1항에 있어서, 제1 바이러스 벡터의 표면에 디스플레이된(displayed) 하나 이상의 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생성물이 생물학적 표본(biological specimen)의 세포에 노출될 때, 생성물은 생물학적 표본의 세포내로 핵산을 전달하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 생성물이 생물학적 표본의 세포에 노출될 때, 생성물은 생물학적 표본의 세포내로 단백질을 전달하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  13. 제1항에 있어서, 생물학적 표본이 투여될 때, 면역 반응은 생물학적 표본에서 유도되는 것을 특징으로 하는 생성물.
  14. 다음을 포함하는 생성물:
    T4 헤드 캡시드(T4 head capsid);
    비오틴화된(biotinylated) AAV; 및
    비오틴-아비딘(biotin-avidin) 크로스-브리지
    여기서 비오틴-아비딘 크로스-브리지는 Soc-비오틴-아비딘(Soc-biotin-avidin, SBA) 또는 Hoc-BAP-비오틴-아비딘(Hoc-BAP-biotin-avidin, HBBA)이고;
    여기서 크로스-브리지의 아비딘은 비오틴화된 AAV의 비오틴에 부착되며 Hoc 또는 Soc는 T4에 부착됨.
  15. 제14항에 있어서, T4에 패키지된 하나 이상의 DNA 분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 DNA는 이중가닥인 것을 특징으로 하는 생성물.
  17. 제14항에 있어서, AAV에 패키지된 하나 이상의 DNA 분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 DNA는 단일가닥인 것을 특징으로 하는 생성물.
  19. 제14항에 있어서, T4에 패키지된 하나 이상의 이중 가닥 DNA 분자 및 AAV에 패키지된 하나 이상의 단일 가닥 DNA 분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  20. 제14항에 있어서, T4의 표면에 디스플레이된 하나 이상의 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  21. 제14항에 있어서, 상기 생성물이 생물학적 표본의 세포에 노출될 때, 생성물은 생물학적 표본의 세포내로 DNA를 전달하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  22. 제14항에 있어서, 상기 생성물이 생물학적 표본의 세포에 노출될 때, 생성물은 생물학적 표본의 세포내로 단백질을 전달하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  23. 제14항에 있어서, 생물학적 표본에 투여될 때, 생물학적 표본에서 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 생성물.
  24. 다음을 포함하는 생성물:
    제1 바이러스 벡터;
    제1 바이러스 벡터에 패키지된 하나 이상의 DNA 분자;
    제2 바이러스 벡터;
    제2 바이러스 벡터에 패키지된 하나 이상의 핵산분자 및
    제2 바이러스 벡터를 제1 바이러스 벡터에 연결하는 크로스-브리지.
  25. 제24항에 있어서, 상기 DNA 분자는 핵산분자와 동일한 것을 특징으로 하는 생성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 DNA 분자는 이중가닥인 것을 특징으로 하는 생성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 핵산분자는 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 및 RNA로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 생성물.
  28. 제24항에 있어서, 생물학적 표본에 투여될 때, 면역 반응은 생물학적 표본에서 유도되는 것을 특징으로 하는 생성물.
  29. 다음을 포함하는 생성물:
    제1 바이러스 벡터;
    제1 바이러스 벡터에 패키지된 하나 이상의 이중가닥 DNA 분자;
    제2 바이러스 벡터;
    제2 바이러스 벡터에 패키지된 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA 또는 RNA를 포함하는 하나 이상의 핵산분자; 및
    제2 바이러스 벡터를 제1 바이러스 벡터에 연결하는 크로스-브리지.
  30. 제29항에 있어서, 생물학적 표본에 투여될 때, 면역 반응은 생물학적 표본에서 유도되는 것을 특징으로 하는 생성물.
  31. 다음을 포함하는 생성물:
    제1 바이러스 벡터;
    제1 바이러스 벡터의 표면에 디스플레이된 하나 이상의 단백질;
    제2 바이러스 벡터; 및
    제2 바이러스 벡터를 제1 바이러스 벡터에 연결하는 크로스-브리지
    여기서 생성물은, 생물학적 표본의 세포에 노출될 때, 생물학적 표본의 세포 내로 단백질을 전달함.
  32. 다음을 포함하는 방법:
    SBA 또는 HBBA 크로스-브리지를 디자인하는(designing) 단계;
    크로스-브리지의 Soc 또는 Hoc 말단을 T4에 부착하는 단계;
    AAV를 비오틴화하는(biotinylating) 단계; 및
    크로스-브리지의 아비딘 말단을 AAV에 부착하는 단계.
  33. 다음을 포함하는 방법:
    크로스-브리지를 디자인하는 단계;
    크로스-브리지의 한쪽 말단을 제1 바이러스에 부착하는 단계; 및
    크로스-브리지의 다른쪽 말단을 제2 바이러스에 부착하는 단계.
  34. 다음을 포함하는, 생물학적 표본의 치료방법:
    생물학적 표본에 제1 바이러스 벡터;
    제2 바이러스 벡터; 및
    제2 바이러스 벡터를 제1 바이러스 벡터에 연결하는 크로스-브리지를 투여하는 단계
    여기서 투여 경로는 다음으로 구성된 군에서 선택됨: 혼합(mixing), 경구 섭취(orally ingesting), 흡입으로(by inhalation), 피하 이동(subcutaneous migration), 근육 주사(intramuscular injection), 정맥 주사(intravenous injection), 경피 이동(transdermal migration), 비강 흡입(intranasal inhalation), 직장 삽입(rectal insertion), 안구(ocular), 국소 이동(topical migration), 설하(sublingual), 또는 협측(buccal).

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