KR20220044150A

KR20220044150A - Manf를 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220044150A
Application number: KR1020210129149A
Authority: KR
Inventors: 김윤희; 이혜미; 권혁만
Original assignee: (주)세포바이오
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2022-04-06
Also published as: CN116437942A; JP2023544325A; US20230363418A1; EP4223307A1; WO2022071752A1; EP4223307A4

Abstract

본 발명은 중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic growth factor; mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor; MANF) 또는 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 MANF 투여는 기억 손상 및 자폐증 모델에서 기억 손상 및 자폐증 모델에서 콜린성 및/또는 가바(γ-aminobutyric acid, GABA)성 신경세포의 분화를 촉진하여 신경 재생을 유도하고, 기억력 증진 및 정서 불안 개선 효과를 나타내며, 사회적 인식, 사교성 및 사회적 성적 선호도 저하를 개선하는 바, 자폐증, ADHD, 정신지체장애, 발달장애 등의 신경정신질환의 예방 또는 치료용 조성물로 제공될 수 있다.

Description

MANF를 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 치료용 조성물{A Composition for preventing or treating Neurological disorders comprising mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor}

본 발명은 중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic growth factor; mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor; MANF) 또는 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 신경정신질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

신경정신질환(neuropsychologic disease)이란 뇌 신경전달물질의 불균형과 유전·사회적·환경적 요인이 복합적으로 작용해 사고와 감정, 행동에 이상이 생긴 상태를 의미하며, 우울증, 불안장애, 조현병, 의존증, 뇌전증, 자폐스텍트럼장애 (Autism spectrum disorder; ASD; 자페증), ADHD(Attention Deficit Hyperactivity Disorder), 발달장애, 정신지체장애 등이 주요 신경정신질환에 해당한다. 이 중에서 자폐증은 부계의 스트레스, 음주, 고령 임신 등에 의한 생식세포의 유전자 돌연변이에 의해 발병하는 것으로 알려져 있다. 현재 발병율은 1.5%로 보고되었으나 세계적으로 발병율이 증가하는 추세이며 특히 한국에서는 2.6%까지 증가하였다는 보고가 있다. 이와 더불어 ADHD, 정신지체장애 등의 신경정신질환도 증가 추세에 있으며 이들 질환은 출산 후 초기에서 3년 이내 진단되므로 발병 초기에 치료가 필요한 실정이다.

특히, 자폐증, ADHD, 조현병, 뇌전증을 포함하는 신경정신과 질환은 많은 유전자의 복합적 문제로 일어나나 대부분의 뇌질환에서 특정 신경세포의 사멸과 시냅스 형성 문제, 그에 따른 신경전달물질의 불균형, 억제성 가바(γ-aminobutyric acid, GABA) 부족, 시냅스 발생의 조절과 pruning 등이 원인으로 주목되고 있으며, 이의 근원적 치료는 신경재생 촉진, 신경줄기세포 증식 및 가바성 신경세포의 분화를 촉진시키는 것이나, 아직까지 이러한 근원적 치료를 위한 치료제는 연구 개발된 바가 거의 없다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 뇌혈관세포가 신경줄기세포에 분비하는 16개 이상의 성장인자 중 하나인 중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic growth factor; mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor; MANF)가 기억손상을 동반하는 자폐증, ADHD, 정신지체장애, 발달장애 등의 뇌질환에 대해 개선 효과가 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. Abeysinghe, H.C.S., et al. Stem Cell Res Ther 6, 186 (2015).

본 발명의 하나의 목적은 (a) 중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic growth factor; mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF); 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) MANF; 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) MANF; 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 한편, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 (a) 중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic growth factor; mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF); 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어, "신경정신질환(neuropsychologic disease)"은 뇌 신경전달물질의 불균형과 유전·사회적·환경적 요인이 복합적으로 작용해 사고와 감정, 행동에 이상이 생긴 상태를 의미하며, 신경정신질환에 속하는 우울증, 불안장애, 조현병, 의존증, 뇌전증, 자폐스텍트럼장애 (Autism spectrum disorder; ASD; 자페증), ADHD(Attention Deficit Hyperactivity Disorder), 발달장애, 정신지체장애 등이 주요 신경정신질환에 해당한다.

본 발명에 있어서, 상기 신경정신질환은 자폐증, ADHD, 정신지체장애 및 발달장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 신경정신질환은 기억 손상을 동반하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic growth factor, mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor; MANF)"는 뇌혈관세포가 신경줄기세포에 분비하는 16개 이상의 성장인자 중 하나로서, 중뇌성장인자와 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 MANF는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지거나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI 진뱅크(Genbank)에서 그 서열을 확인할 수 있다.

구체적으로, 상기 MANF는 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 70% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 MANF에 상응하는 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 MANF도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 당해 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 포함하는 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.

본 발명에서 용어, "MANF 유래 펩티드"는 MANF를 구성하는 펩티드 중에서 선택되는 어느 펩티드라도 제한 없이 포함될 수 있으며, 구체적으로 상기 MANF 유래 펩티드는 2개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 것일 수 있고, 이의 단편도 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, (a) MANF 또는 (b) MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 MANF의 폴리펩티드 서열 또는 이의 단편; 상기 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편; 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태로 상기 조성물에 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 MANF를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하거나, 가지거나, 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2의 염기 서열은 공지의 데이터 베이스인 진뱅크에서 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 기능을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드 집합체인 경우 유전자로 기재될 수 있다. 본 출원에서 폴리뉴클레오티드와 유전자는 혼용될 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 MANF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 MANF를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 당해기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ΥSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1ΥSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ΥSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 당해기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참고).

본 출원에서 용어, "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당해 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)으로 결정될 수 있다.

본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능하면서 유전자 치료용으로 사용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대, 유전자 치료용으로 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 들 수 있다. 구체적인 예를 들어, 바이러스 벡터로는 아데노바이러스(Adenovirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 아데노부속바이러스(Adeno-Associated Virus, AAV), 종양 살상 바이러스(Oncolytic Virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus) 벡터 등을 사용할 수 있으며, 비바이러스성 벡터로는 플라스미드(Plasmid)와 리포좀(Liposome) 등이 있다. 구체적으로, 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 유전자 치료용 바이러스 벡터로써 AAV 벡터일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것이 아니며, 공지된 유전자 치료용 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

상기 유전자 치료용 바이러스 벡터는 바이러스 감염 시 한번만 감염되며 바이러스를 증식시키지 못하는 벡터이므로 주변 세포가 감염되지 않으며 안전하게 사람에 치료용으로 사용되고 그 중에도 AAV는 사람에 임상적으로 치료에 사용할 때 가장 안정한 형태의 벡터로 인정받고 있으며, 현재 세계적으로 유전자 치료 임상에서 가장 많이 사용되고있는 벡터이다. 본 출원에서는 펩티드 형태의 바이러스 벡터도 포함될 수 있으며, MANF 서열의 일부를 포함하는 MANF 유래 펩티드 형태의 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터를 포함하는 다양한 DNA 벡터의 형태를 제한 없이 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현되는 것을 의미한다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현조절영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 "목적 단백질"은 MANF 또는 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편일 수 있다.

본 발명의 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 MANF의 폴리펩티드 서열 또는 이의 단편; 상기 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편; 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터;의 형태로 약학적 조성물에 포함됨으로써, 상기 조성물이 투여된 개체 내의 MANF의 수준을 증가시켜 신경정신질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 신경정신질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 신경정신질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여 하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 해마에서 신경세포의 재생을 촉진할 수 있다.

본 발명의 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 신경세포의 분화를 촉진하는 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 콜린성 신경세포 및/또는 가바(γ-aminobutyric acid, GABA)성 신경세포의 분화를 촉진하여 신경세포의 재생을 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명에서는 이보텐산(Ibotenic acid, IBO)에 의해 유도되는 기억 손상 및 자폐증 모델을 제작하였다.

상기 IBO는 쥐의 뇌내에 주입시 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 형성, 흑질(substantia nigra) 및 조롱박피질(piriform cortex)의 뉴런을 손상시키는 화합물로써, 구체적인 실험에서는 이를 entorhinal cortex 내 3개 부위에 주입 투여함으로써 해마의 등측과 배측에 신경 손상을 유도하여 기억 손상 및 자폐증을 유도할 수 있다(Miyuki Sadamatsu, Congenital Anomalies 2006; 46, 1-9, Review of animal models for autism: implication of thyroid hormone).

이에 따라, 본 발명의 기억 손상 및 자폐증 모델은 IBO가 투여됨에 따라 불안과 사회성 행동 영역인 배측 해마(ventral Hippocampus) 부위의 콜린성 신경세포의 분화가 감소되었으나, 본 발명의 일 구현예에서는 MANF 투여시 콜린성 신경세포의 분화가 증가하였다(도 16).

한편, 주의력 행동 결핍장애, 뇌졸중, 조현병, 자폐증 등의 질병은 흥분성 세포와 가바성 신경세포의 불균형에 의해 나타난다고 알려져 있으며, 이를 개선하기 위해 신호전달체계가 복잡한 흥분성 신호전달물질보다 억제성 신호전달물질인 가바의 생성 또는 분화를 촉진하는 것이 필요하다. 가바성 신경세포로의 분화에 관여하는 유전자 중에서 GAD(Glutamic acid decarboxylase) 유전자는 글루타메이트의 탈카르복실화를 촉매하는 효소로서 이 과정을 통해 억제성 신경전달물질인 가바를 합성하는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명의 다른 일 구현예에서는 MANF가 1차 신경전구세포의 신경세포 분화 과정에서 가바성 신경세포로의 분화를 촉진하는지를 확인한 결과, 1차 신경전구세포 분화 과정에서 MANF를 30 ng/ml의 농도로 처리해주었을 때 NeuN의 수는 크게 변화가 없었지만, Con 군에 비해 GFP 양성 세포들이 증가하여, MANF가 신경세포 분화 과정에서 가바성 신경세포로의 분화를 촉진함을 보여주었다(도 6).

본 발명의 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 기억력을 개선하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, IBO가 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 하여 Y형 미로 측정법, 수동 회피 검사와 모리스 수중 미로 검사를 통해 기억 능력을 측정한 결과 모두 기억력 향상을 나타냈다(도 8A-C).

본 발명의 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 불안 장애를 개선하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, IBO가 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 하여 높은 십자형 미로 실험 및 열린 공간 행동 검사를 통해 불안행동을 측정한 결과, MANF 투여군이 IBO군 또는 양성 대조군에 비해 불안행동이 감소하여(도 8D-E), 불안 장애가 개선되었다.

본 발명의 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 사교성 또는 사회적 인지 능력을 개선하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, IBO가 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 하여 행동 실험을 통해 MANF 투여에 따른 사회적 행동, 사회적 인식, 사교성 및 사회적 성적 선호도의 회복 여부를 조사한 결과, MANF 투여군이 IBO군 또는 양성 대조군에 비해 사회적 행동, 사회적 인식, 사교성 및 사회적 성적 선호도가 회복되는 것을 볼 수 있었다(도 9-12).

본 발명의 다른 일 구현예에서 상기 행동 실험 후 기억 손상 및 자폐증 모델의 뇌 조직을 분석한 결과, IBO 투여군에서는 세포 사멸이 유의하게 증가하였으나, MANF-AAV-hMSC 투여군은 IBO 투여군 및 GFP-AAV-hMSC 투여군에 비해 세포 사멸이 현저히 억제되어, MANF는 기억 손상 및 자폐증 모델에서 뇌신경세포의 사멸을 억제하고, 생존을 증가시킴을 알 수 있다(도 13).

또한, 본 발명의 또 다른 일 구현예에서 상기 행동 실험 후 기억 손상 및 자폐증 모델의 뇌 조직을 분석한 결과, MANF 투여군은 신경줄기세포(Sox2+)의 증식(BrdU+, Ki67)과 이동(DCX)을 촉진하여 신경 재생을 증진시키며(도 14), 새로 증식한 BrdU 염색된 신경전구세포의 성숙한 신경세포(NeuN), 희소돌기신경교(oligodendrocyte) (CNPase), 가바성 신경세포(GAD)로의 분화가 증가하였다(도 15).

이와 같이, 본 발명은 MANF가 기억 손상 및 자폐증 모델에서 기억 손상 및 자폐증 모델에서 콜린성 및/또는 가바성 신경세포의 분화를 촉진하여 신경 재생을 유도하고, 기억력 증진 및 불안 장애 개선 효과를 나타내며, 사회적 인식, 사교성 및 사회적 성적 선호도 저하를 개선함으로써 신경정신질환, 특히 자폐증, ADHD, 정신지체장애, 발달장애 등의 신경정신질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 최초로 밝힌 것에 의의가 있다.

아울러, 상기 MANF로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편도 전술한 바와 같이 MANF와 동일한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경정신질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개체"는 신경정신질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 제외한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물을 신경정신질환의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 신경정신질환의 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 약학적 조성물은 신경정신질환을 예방 또는 치료 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) MANF; 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개선"은 상기 조성물을 이용하여 신경정신질환의 의심 및 발명 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있으며, 상기 식품학적으로 허용 가능한 염은 품학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 유용하다. 하나의 예로, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 상기 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함할 수 있는 성분으로는, 필수 성분으로 유효성분을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물에서 유효성분의 함량은 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량% 를 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 건강보조식품은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함할 수 있다.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물을 포함하는 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) MANF; 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 사료 조성물은 포유류, 가금류, 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료에 적용할 수 있다. 구체적으로, 상업용으로 중요한 돼지, 소, 염소 등의 포유류, 코끼리, 낙타 등의 동물원 동물, 개, 고양이 등의 가축에게 사용할 수 있다. 상업적으로 중요한 가금류에는 닭, 오리, 거위 등이 포함되며, 송어와 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류를 포함 할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 투여를 위해서 MANF, MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편 이외에 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.

상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.

본 발명의 사료 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체형 담체의 경우에는 정제, 산제, 토로키제 등의 투여 형태일 수 있으며 액체형 담체의 경우에는 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀젼제, 용액제 등의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 질환의 예방, 치료 또는 개선상 유용한 물질을 함유할 수도 있다.

본 발명에 따른 중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic growth factor; mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor; MANF) 또는 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편의 투여는 기억 손상 및 자폐증 모델에서 콜린성 및/또는 가바(γ-aminobutyric acid, GABA)성 신경세포의 분화를 촉진하여 신경 재생을 유도하고, 기억력 증진 및 불안 장애 개선 효과를 나타내며, 사회적 인식, 사교성 및 사회적 성적 선호도 저하를 개선하는 바, 자폐증, ADHD, 정신지체장애, 발달장애 등의 신경정신질환의 예방 또는 치료용 조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 MANF의 신경분화를 촉진하는 최적 용량을 결정하기 위해 성숙한 뉴런의 핵을 표지하는 NeuN 항체, 가바성 신경세포를 표지하는 GAD65/67(Glutamic acid decarboxylase)과 vGAT(vesicular GABA transferase) 항체를 사용하여 면역블로팅 방법으로 분석한 결과이다.
도 2는 MANF의 신경줄기세포 증식과 초기 분화(neurogenesis)를 촉진하는 최적 용량을 결정하기 위해 신경전구세포 증식과 초기 분화를 Type1 신경전구세포 표지자인 Sox2와 이동하면서 분화를 시작하는 Type 3 신경전구세포 표지자인 DCX 항체를 사용하여 면역블로팅 방법으로 분석한 결과이다.
도 3은 MANF에 의한 신경전구세포의 증식 촉진 여부를 조사하고자 증식하는 세포 표지자인 Ki67 항체로 염색되는 세포와 신경전구세포 표지자인 nestin 항체로 염색되는 신경전구세포를 면역형광염색 방법으로 분석한 결과이다.
도 4는 MANF에 의한 신경전구세포의 분화 촉진 여부를 조사하고자 미성숙신경표지자 TuJ1, 성숙한 신경표지자 NeuN 항체를 사용하여 면역형광염색 방법으로 분석한 결과이다.
도 5는 MANF에 따른 신경세포 증식 및 분화 효과를 증명하기 위해 MANF 수용체 mRNA에 대한 siRNA를 제작하여 신경전구세포에 처리하고 증식하는 Ki67 염색된 세포와 분화를 시작하는 신경전구세포 표지자인 DCX 항체를 사용하여 면역형광염색 방법으로 분석한 결과이다.
도 6은 가바(γ-aminobutyric acid, GABA)성 신경세포 마커인 GAD(Glutamic acid decarboxylase) 유전자 프로모터에 형광단백질인 GFP(green fluorescent protein)를 재조합한 플라스미드를 1차 배양한 신경전구세포에 도입하여 MANF의 가바성 신경세포 분화 촉진 효과를 증명한 결과이다.
도 7은 기억 손상 및 자폐증 동물 모델에 MANF 발현 벡터(MANF-AAV)를 도입한 사람 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell, hMSC)를 뇌이식하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 8은 해마에 MANF-AAV가 도입된 hMSC를 이식한(PLGF-AAV-hMSC) 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 기억 능력을 측정하는 Y 자형 미로 실험(A), 수동 회피 실험(Passive avoidance test) (B), 모리스 수중 미로 실험(Moris Water maze) (C), 불안 장애를 측정하는 높은 십자형 미로 실험(D) 및 열린 공간 행동 검사(E)를 수행한 결과이다.
도 9는 해마에 MANF-AAV-hMSC가 이식된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 사회성 능력(Sociability)을 측정하는 사회적 열린 필드(Social open field) 검사를 수행한 결과이다.
도 10은 해마에 MANF-AAV-hMSC가 이식된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 사회성(세션 I)을 측정하는 3 개의 방 측정법을 사용하여 행동실험한 결과이다.
도 11은 해마에 MANF-AAV-hMSC가 이식된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 사회적 인식(세션 II)을 측정하는 3 개의 방 측정법을 사용하여 행동실험한 결과이다.
도 12는 해마에 MANF-AAV-hMSC가 이식된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 성적 선호도(세션 III)를 측정하는 3 개의 방 측정법을 사용하여 행동실험한 결과이다.
도 13은 행동실험 후 MANF-AAV-hMSC를 이식한 기억 손상 및 자폐증 모델의 뇌 조직에서 TUNEL 염색을 통해 뇌신경세포의 사멸을 염색한 결과이다.
도 14는 행동실험 후 MANF-AAV-hMSC를 이식한 기억 손상 및 자폐증 모델의 뇌 조직에서 신경줄기세포(Sox2+)의 증식(BrdU+, Ki67)과 이동(DCX) 여부를 면역형광염색 방법으로 분석한 결과이다.
도 15는 행동실험 후 MANF 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델의 뇌 조직에서 새로 증식하여 BrdU 염색된 신경전구세포가 성숙한 신경세포(NeuN), 희소돌기신경교(oligodendrocyte) (CNPase), 가바성 신경세포(GAD)로의 분화 촉진 여부를 조사한 결과이다.
도 16은 행동실험 후 MANF-AAV-hMSC를 이식한 기억 손상 및 자폐증 모델의 뇌 조직에서 불안과 사회성 행동 영역인 배측 해마(ventral Hippocampus) 부위를 염색하여 가바성 신경세포와 콜린성 신경세포의 분화 촉진을 보여준 결과이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신경세포 분화 과정에서 중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic growth factor; mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor; MANF)의 최적 용량 조사

신경전구세포에서 분화표지자 발현을 촉진하는 MANF의 최적 용량(optimum doze)를 결정하기 위해, 성숙한 뉴런의 핵을 표지하는 NeuN 항체, 가바성 신경세포를 표지하는 GAD65/67(Glutamic acid decarboxylase)과 vGAT(vesicular GABA transferase)를 이용하여 면역블로팅 실험을 수행하였다.

구체적으로, 해마 유래 신경줄기세포는 E16 쥐 배아의 뇌로부터 분리하였다. 해마의 융기는 해부현미경의 아래에서 무균 상태의 가는 핀셋을 사용하여 E16 쥐의 배아 전뇌로부터 잘게 절단하였다. 이 조직들을 모아서 Ca²⁺/Mg²⁺-freeHBSS(인비트로젠)용액에서 피펫을 사용하여 기계적으로 분리하고, 15 μg/ml 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithine)과 1 μg/ml 피브로넥틴(fibronectin, 시그마)으로 미리 코팅된 35 mm 배양접시에 19,000 세포/cm²로 심었다. 세포들은 3일 동안 5% CO₂의 조건에서 10ng/mL bFGF(basic fibroblast growth factor, Invitrogen)이 첨가된 혈청이 없는 N2 배지(증식용 배지)를 사용하여 배양하였다. 이후, 0.05% 트립신(trypsin)/EDTA(ethylene-diamine-tetraacetic acid)을 사용해 세포를 떼어내고, 면역염색을 위해서는 12 mm 유리 커버글라스(벨코)에, 면역 블로팅을 위해서는 100 mm 디쉬에 신경전구세포를 심어서 1일 동안 bFGF를 포함한 증식용 N2 배지에서 배양하였다. 이후, 증식조건에서는 bFGF를 계속 포함하는 배지에 MANF를 표시한 농도로 처리하고 2-3일간 배양하고, 분화조건에서는 bFGF를 포함하지 않는 분화용 배지에 MANF를 첨가하고 3-7 일간 배양하였다. 대조군(vehicle)에는 MANF 대신 생리식염수를 동일 부피로 첨가하였다.

상기에서 배양된 신경줄기세포를 분화 3-7일 후 배지를 모두 제거하고 PBS(Phosphate-buffered saline)로 1회 세척하였다. 그 다음, 프로테아제 억제제(protease inhibitor)가 첨가된 용해 버퍼(lysis buffer)를 이용하여 세포를 모두 용해하였다. 상기 용해물을 10% 겔에 동일 부피로 로딩 후 PVDF(Polyvinylidene Fluoride) 막으로 옮기고 2% BSA in TBST 또는 5% skim milk in TBST로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체는 rb-GAD65/67(1:1000), mo-NeuN(1:1000), mo-Vgat(1:700), mo-actin(1:2000)를 사용하였고, 2% BSA in TBST에 1차 항체를 희석하여 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 1X TBST로 세척하였다. 2차 항체는 mo-HRP(1:5000), rb-HRP(1:5000)를 사용하고, 2% skim milk in TBST 또는 2% BSA in TBST에 2차 항체를 희석하여 1 시간 반응한 후 필름에 현상하였다. 대조군 항체는 mo-tubulin(Millipore, 05-661, 1:2000), mo-actin(Santa cruz, SC-47778, 1:2000)을 사용하였다.

그 결과, MANF를 10-50 ng/ml 처리하였을 때 30ng에서 NeuN은 1.6배 증가하였고, GAD65/67과 vGAT 단백질 양은 약 2.5배 증가하였으며, NeuN, GAD65/67 및 vGAT 단백질 모두 30 ng/ml 농도에서 가장 많이 증가하였다(도 1).

다음으로, 증식하는 신경전구세포에 대해 Type1 신경전구세포 표지자인 Sox2(mo-Sox2: R&D system, MAB2018, 1:1000), Type 3 분화를 시작하는 이동하는 신경전구세포 표지자인 DCX(goat-DCX: Santa cruz, SC-8066, 1:1000)을 면역블로팅한 결과, MANF를 20-500 ng/ml로 첨가하였을 때 모두 유사하게 증가하는 경향을 나타내었다(도 2). 구체적으로, 20 ng/ml에서 Sox2와 DCX 모두 크게 증가하였다.

이에, 이하 실시예에서는 상기 실험 결과로부터 도출된 MANF의 최적 용량인 30 ng/ml 농도를 사용하여 실험하였다.

실시예 2. MANF의 신경세포 증식 및 분화 촉진 효과 조사

2-1. 면역염색 기법을 통한 신경세포 증식 및 분화 과정에서의 MANF의 효과

MANF에 의한 신경전구세포의 증식 촉진 여부를 조사하기 위해 1차 배양한 신경전구세포에 MANF를 처리한 후 Ki67 항체로 증식하는 세포, Nestin 항체로 신경전구세포, TuJ1으로 미성숙 신경세포, NeuN 항체로 성숙한 신경세포를 형광염색하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 신경전구세포를 배양하고, 배지를 모두 제거한 후 PBS로 1회 세척하였다. 4% PFA(Paraformaldehyde) in PBS로 15분간 고정을 한 뒤 다시 PBS로 2회 세척하였다. 세포가 붙어있는 커버 슬립을 PBST로 씻어낸 후 0.5% Triton X-100-PBST를 넣어 10분간 반응시켰다. 다시 2% BSA in PBST 또는 5% 정상 혈청(Normal donkey serum: Jackson lab, 017-000-121, Normal horse serum: Sigma, H0146)으로 블로킹하고, 1차 항체로 rb-Ki67(Abcam, AB15580, 1:500), mo-NeuN(Millipore, MAB377B, 1:500), mo-Tuj1(Sigma, T8660, 1:3000), mo-Flag(Sigma, F1804, 1:500), mo-Nestin(Millipore, MAB353, 1:200)를 2% BSA in PBS에 넣고 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 다음날, 이를 PBST로 씻어낸 후 2차 항체로 mo-Alexa 488(Invitrogen, A21202, 1:700), mo-Cy3(Jackson lab, 715-165-151, 1:500), rb-Alexa 488(Jackson lab, 711-546-152, 1:700)를 PBST에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. DAPI(1 μg/mL, Sigma)로 세포 핵을 염색하고 슬라이드에 올려서 공초점 레이저 현미경으로 스캔하고 사진을 찍었다. 상기 방법은 Heo SR et al.(2009) 및 Han AM t al.(2012)를 참고하였다.

세포 수의 확인 및 데이터 분석의 경우, DAPI로 표지된 세포 핵 수를 세고 각 분화 표지자로 염색된 세포 수를 세어 각 분화 표지자의 수를 세포 핵 수로 백분율로 나타내었다. 이 때 모양과 위치가 정확히 일치되고 신경세포의 모양을 하고 있는 세포 수를 세었다. 예로 NeuN 세포 수 측정은 핵 모양으로 둥근 형태를 띠고 있으며 DAPI와 염색이 겹치는 세포 수를 세었고, 슬라이드의 가장자리 부분에서 나타나는 비특이적 신호는 포함하지 않았다. 데이터분석은 일원배치분산분석(Anova)을 통하여 대조군과 실험군을 비교하였다. 자료의 통계학적 의의는 p<0.05로 하였다.

그 결과, 대조군에 비해 Ki67 염색되는 증식하는 세포와 nestin 염색되는 신경전구세포가 유의하게 증가하였다(도 3). 미성숙 신경세포(TuJ1)와 성숙한 신경세포(NeuN)도 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않았다(도 4).

2-2. siRNA knock down을 통한 신경세포 증식 과정에서의 MANF의 효과

MANF의 신경줄기세포 증식효과를 증명하기 위해 MANF 수용체 mRNA에 대한 siRNA를 제작하여 1차 배양한 신경전구세포(A)와 흰쥐 해마에 주입하고(B) DCX와 Ki67 발현세포를 조사하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 신경전구세포를 배양하고 3일 뒤 트립신 처리하고 세포를 모아서 siRNA를 처리한 후 커버 슬립당 8X10⁴로 세포를 시딩하였다. 3 종류의 MANF 수용체 동형 단백질(isoform)에 대한 siRNA를 10, 30 nM씩, 총 30, 90 nM로 처리하였다. 여기에서 사용된 siRNA는 다음과 같다: Negative control scrambled sequence와 MANF receptor 1 antisense sequence: UAGAGUGUACGGUAGACAC(서열번호 4)), MANF receptor 2 antisense sequence: AUGGUGUUAGAGUGUAGUC(서열번호 5)), MANF receptor 3 antisense sequence: AUCGGAAGAGGUUCAUGAC(서열번호 6)). siRNA 처리 후 1.5일째 되는 날 고정하여 염색을 진행하였다.

그 결과, 대조군으로 scrambled RNA를 처리한 경우(siCON) 대비 siRNA를 처리한 경우에는 증식하는 Ki67 염색된 세포와 분화하는 신경세포 표지자인 DCX가 염색된 세포 수가 유의하게 감소하여, MANF가 신경줄기세포의 증식과 분화를 촉진함을 증명하였다(도 5A).

MANF 수용체 siRNA를 흰쥐 해마의 hillus 부위에 주입하고 1,5일 후에 쥐의 뇌조직을 얻어 Ki67, DCX 항체로 염색한 결과 scrambled RNA 주입군에 비교하여 siRNA 주입군에서 Ki67, DCX 염색된 세포 수가 각각 약 50%가 감소하였다 (도5B).

실시예 3. MANF의 가바(γ-aminobutyric acid, GABA)성 신경세포 분화 촉진 효과 조사

MANF에 의한 1차 신경전구세포의 가바성 신경세포로의 분화를 효율적으로 조사하기 위해 사람 GAD 유전자의 프로모터 부위에 형광단백질인 GFP(green fluorescent protein)를 재조합하여 육안으로 간편하고 효과적으로 가바성 신경세포로의 분화 여부를 관찰 및 검출할 수 있는 플라스미드(GAD-GFP)를 사용하였다. 상기 프로모터의 활성이 증가하는 경우 가바성 신경세포로의 분화가 촉진되고, 프로모터의 활성 증가 여부는 이에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현량에 의해 모니터링이 가능한 바, 리포터 유전자의 발현량이 증가하는 경우 가바성 신경세포로의 분화가 촉진되는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 프로모터에 결합하는 전사인자를 사용하여 가바성 신경세포의 분화를 쉽게 관찰할 수 있다.

구체적으로, 1차 신경전구세포 배양 후 3일 뒤에 0.05% 트립신으로 세포를 디쉬에서 분리하여 subculture 후 모든 군에 GAD-GFP DNA를 트랜스펙션하였다. 세포를 24웰 플레이트에 시딩하고 10ng/mL bFGF를 포함하는 N2 배지에서 24시간 동안 배양하였다. bFGF가 없는 분화용 N2 배지에 MANF를 30 ng/ml의 농도로 처리하고 3일과 5일 후에 고정하고 염색하였다.

그 결과, MANF를 30 ng/ml의 농도로 처리해주었을 때 NeuN 염색된 세포의 수는 3일 후 10%에서 5일 후에 50%로 증가하였으나 MANF 처리군에서 더 큰 증가는 없었고, Con 군에 비해 GFP 양성 세포들이 증가하여, MANF가 신경세포 분화 과정에서 가바성 신경세포로의 분화를 촉진함을 알 수 있다(도 6).

실시예 4. MANF 발현 재조합-AAV(Adeno-Associated Virus) 벡터 제작

AAV2(Adeno-Associated Virus 2) 벡터에 MANF 유전자(서열번호 2)를 삽입하여 MANF 발현 벡터(MANF-AAV)를 제작하고, 이를 재조합 바이러스로 제조 및 증폭하여 10^12-13 vg/ml로 농축한 후 사람 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell, hMSC)에 MOI 10⁴으로 처리하였다. 사람 중간엽 줄기세포는 가톨릭대학교에서 제조한 골수 유래 MSC 세포주를 사용하였고, 10% FBS 배지 또는 MSC GM(Cambrix) 배지를 사용하여 배양하였다.

또한, 대조군으로 AAV2 벡터에 GFP 유전자(서열번호 3)를 삽입한 GFP 발현 벡터(GFP-AAV)를 포함하는 재조합 GFP-AAV를 대조군 바이러스로 제작하고, 10^12-13 vg/ml로 농축한 후 MSC에 MOI 10⁴으로 처리하였다.

상기 MANF-AAV-hMSC는 뇌에 주입 전 트립신 처리하여 배양디쉬에서 분리한 후 트립신 억제제(300 mg/60ml N2 media)를 처리하였다. trypan blue를 사용하여 살아있는 세포 수를 정확히 센 후 7.5X10⁴/㎕으로 맞추어 주입 배지(0.7%p/s, 20mM HEPES(pH7.2), 0.5% glucose in saline)에 현탁하여 뇌에 2ul를 주입하였다.

실시예 5. 이보텐산(Ibotenic acid, IBO)에 의해 유도되는 기억 손상 및 자폐증 모델 제작

6주령 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐(200~250 g)는 오리엔트 동물 사육 센터(경기도 찰스 리버 연구소)에서 구입하였다. 쥐는 사회적 스트레스를 피하기 위해 우리당 2~3 마리씩 무작위로 수용하였다. 사육 조건은 일정한 온도 범위(23 ± 2℃), 습도(60 ± 10 %) 및 12 시간의 명암주기를 유지하였으며 물과 사료에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다.

상기 쥐의 내후각 피질에, 내후각 피질에서 입력되는 신경 신호를 수신하는 치아 이랑(dentate gyrus, DG)의 과립 세포와 해마 피라미드 세포를 파괴하는 IBO을 투여하여 기억 손상 및 자폐증 모델을 제작하였다. 구체적으로, 마우스를 에퀴텐신(equitensin)(350mM 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium), 250mM 염소 수화물(chloral hydrate), 85 mM MgSO 및 40 % 프로필렌 글리콜(propylene glycol)을 포함하는 10 % 에탄올)로 마취시켰다. 정위 장치(stereotaxic device, Stoelting Co., U.S.A.)의 절치대(incisor bar)를 이간선(interaural line) 아래 3.4 mm에 배치하고 주사 바늘 각도를 시상면(sagittal) 중앙에서 오른쪽으로 10 위치에 고정하였다. 정위 장치를 사용하여 쥐에 IBO(1 mg/ml) 1.5 ul를 내후각 피질(entorhinal cortex)에 주입하였다. IBO은 첫 번째, AP : -8.4, ML : -4.8, DV : -4.6; 두 번째, AP; -8.4, ML : -4.8, DV : 2.3; 세 번째, AP : -8.8, ML :- 3.65, DV : -3.4의 3 개 위치에 주입되었다(도 7).

상기 2-3 번의 IBO 주입 후 무작위로 IBO 투여군(음성대조군), 대조군으로 GFP-AAV-hMSC 투여군(GFP-AAV), MANF-AAV-hMSC 투여군(PLGF-AAV)으로 각 군을 분류하였다. 일주일 동안의 휴식 기간이 제공되었다. 정상 쥐로 이루어진 Con 군(Control, 양성대조군)에는 어떤 약물도 투여하지 않고, IBO 투여군에는 식염수(saline)를 투여하였으며, GFP-AAV-hMSC 투여군에는 상기 실시예 4의 방법으로 GFP-AAV를 도입한 MSC를 투여하였으며(GFP-AAV), MANF-AAV-hMSC 투여군에는 상기 실시예 4의 방법으로 MANF-AAV를 도입한 MSC를 투여하였다(MANF-AAV).

실시예 6. MANF 투여에 따른 기억 능력 증진 및 불안 장애 개선 효과 조사

상기 실시예 5와 같이 제작한 IBO가 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 하여 MANF 투여에 따른 기억 능력 증진 및 불안 장애 개선 효과를 조사하였다.

6-1. Y 자형 미로 실험

Y자형 미로 실험은 행동실험 중 가장 먼저 수행하였다(Con 군 n=8, IBO 투여군 n=7, GFP-AAV 투여군 n=8, MANF-AAV 투여군 n=7). 실험 방법은 Heo H et al.(2009)에 기재된 내용에 따라 수행하였다. 천장에 조명과 Cam을 설치하고 커튼으로 주변을 가린 상태에서 각 arm의 끝에 visual cue를 설치한 Y형 미로에서 쥐가 각 arm에 들어가는 것을 체크하였다(8, 10, 12분 체크함). 성공 확률을 수식화하는 식은 3개씩 각기 다른 arm에 들어간 횟수를 총 arm에 들어간 횟수-2로 나누어 %화하여 데이터화 하였다. 모든 결과들은 ANOVA test를 이용해서 통계처리하였다.

6-2. 수동 회피 실험(Passive avoidance test)

상기 실시예 6-1의 각 군과 같은 수의 쥐를 대상으로 Heo Het al.(2009)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 이 실험은 셔틀방과 함께 반자동의 시스템으로 이루어져 있다. 이 쥐들은 빛이 켜질 때 아크릴 문을 통해 어두운 방으로 들어가서 빛을 피하도록 훈련받았다. 이 훈련은 3~4일 동안 쥐가 20초 내에 어두운 방으로 들어갈 때까지 하루에 3회 반복하였다(적응). 모든 쥐는 마지막 훈련하는 날 20초 내에 어두운 방으로 들어가는 훈련을 성공적으로 했다. 훈련 마지막 날 적응 훈련을 수행한 후 쥐는 밝은 방에 놓였고 어두운 방으로 들어갔을 때 문을 손으로 닫고 전기 충격(1mA, 300g 기준)을 석쇠를 통해 3초 동안 발에 주었다. 정확히 적응 훈련 24시간 후에 쥐는 다시 밝은 방에 놓이고 어두운 방에 들어가는 대기 시간(latency time)을 720초 동안 측정하였다(감금 실험).

6-3. 모리스 수중 미로 실험(Moris Water maze)

상기 실시예 6-1의 각 군과 같은 수의 쥐를 대상으로 둥글고 녹슬지 않고 내부 표면이 하얀 수영장(지름 160cm; 높이 60 cm)에서 모리스 수중 미로 실험을 수행하였다. 수영장은 50cm 깊이로 물(23.0 ± 1.0℃ 유지)을 채웠으며, 눈에 보이지 않는 플랫폼(15 cm, 둥글고 흰색)은 물표면 1.0cm 아래에 숨겨졌고 북동 사분면의 중앙에 놓였다. 각각의 쥐는 숨겨진 플랫폼을 찾도록 4일 동안 하루에 한 번씩 훈련을 하였다. 훈련은 쥐를 무작위로 4개의 사분면 중 하나의 수영장 벽을 마주보도록 물속에 두면서 시작하였다. 각각의 훈련 동안 쥐를 최대 60초 동안 플랫폼을 찾도록 하였고 플랫폼을 찾은 후 1분 동안 휴식시켰다. 4개의 사분면 테스트의 평균 시간은 훈련하는 날 군당 탈출 대기 시간으로 정의하였다. 최종 실험은 플랫폼을 제거한 후 쥐가 60초 동안 플랫폼이 있었던 곳에서 머무는 시간을 측정하였다(프로브 시험: probe trial). 수영 시간과 훈련 길이는 비디오 카메라를 통해서 추적 및 기록하였다. 추적은 하얀 배경의 검은 점으로 지시된 쥐의 궤적을 따라 수행하였다. 캡쳐된 비디오 사진은 비디오 추적 시스템(Ethovision 수중 미로 프로그램, Noldus 정보 기술, 워게닌겐, 네덜란드)으로 분석하였다. 분석된 정보는 타겟 사분면에서 수영한 시간과 제거된 플랫폼을 찾기 위해 가상의 플랫폼을 건너는 횟수를 포함하였다.

실시예 6-1 내지 6-3의 실험 결과, 도 8A-C에서 보는 바와 같이 MANF 투여한 동물들은 기억 능력을 측정하는 Y형 미로 측정법, 수동 회피 검사와 모리스 수중 미로 검사에서 모두 기억력 향상을 나타내었다.

6-4. 높은 십자형 미로 실험

상기 실시예 6-1의 각 군과 같은 수의 쥐를 대상으로 불안행동을 측정하기 위해 공중에서 높게 떠올라 있고, 십자형 미로의 2개의 closed arm과 2개의 open arm으로 구성된 행동실험 장치를 사용하였다. 십자형 미로의 중간에서 open arm 방향을 보도록 놓여진 쥐는 10분 동안 자유롭게 미로를 탐색하였다. 쥐의 불안 장애는 노출되어 있는 open arm을 기피하고 closed arm에 머무르는 경향으로서 검증하였다. 비디오 추적 시스템(Ethovision EPM 프로그램, Noldus 정보 기술, 워게닌겐, 네덜란드)으로 분석하였다.

그 결과, MANF-AAV 투여군에서 IBO 투여군에 비해 open arm에서 보낸 시간이 증가하여, 불안 장애가 개선된 것을 알 수 있다(도 8D).

6-5. 열린 공간 행동 검사

상기 실시예 6-1의 각 군과 같은 수의 쥐를 대상으로 불안행동을 측정하기 위해 까만 아크릴로 구성된 100cm*100cm 공간에 20cm*20cm의 정사각형을 바닥에 나눠 공간을 나눠주고, 중앙 9칸을 중앙존(Center zone)으로 설정하고 그 외 지역을 가장자리존(Border zone)으로 설정하였다. 중앙 9칸에는 조금 더 밝은 빛을 쬐어 주어 상대적으로 밝은 중앙존과 어두운 가장자리존에 있는 시간을 측정하였다.

그 결과, IBO 군에서는 중앙에 있는 시간이 감소하였으나 MANF 군에서는 IBO 군에 비해 확연히 중앙에 있는 시간이 증가하였고, MSC 군에 비해서도 증가하여 대조군(Con)과 유사한 수준으로 불안 장애가 해소되었다(도 8E).

실시예 7. MANF 투여에 따른 사회적 열린 필드(Social open field)에서의 사회적 행동 회복 조사

상기 실시예 5와 같이 제작한 IBO가 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델의 사회성 능력(Sociability)의 결함과 MANF-AAV-hMSC을 투여했을 때 이러한 결함이 회복될 수 있는지를 행동 실험을 통해 측정하였다.

구체적으로, 사회적 열린 필드(Social open field)에서 사교성을 실험하였다. 쥐를 30 분 동안 기록 환경에 적응시킨 후, 10 분 동안 블랙 아크릴로 구성된 사회적 열린 필드 공간에 적응시켰다. 낯선 쥐를 후각과 최소한의 접촉을 허용하는 원통형 우리에 넣고 경기장 가장자리의 중앙에 배치하였다. 시험 대상 쥐의 움직임을 10 분 동안 기록하고 ethovision 3.1 프로그램으로 분석하였다. 그리고 낯선 쥐가 놓인 원통 주변 10cm를 설정하여 사교성을 나타낸 범위를 분석하였다.

그 결과, 목적 구역에서 보내는 시간과 대상 개체에 관심을 보이는 시간(sniffling)은 IBO 투여군과 GFP-AAV-hMSC 투여군에서 유사하게 정상쥐보다 짧았고, MANF-AAV-hMSC 투여군에서는 현저히 길어졌으므로(도 9), MANF 투여는 사회적 행동을 회복시키는 결과를 보여주었다.

실시예 8. MANF 투여에 따른 3 개의 방에서의 사회적 행동 회복 조사

상기 실시예 5와 같이 IBO가 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델에 MANF-AAV-hMSC을 투여했을 때 사회적 인식, 사교성 및 사회적 성적 선호도가 회복되는지 보기 위해 3 개의 방 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실험 장소는 투명한 아크릴 벽으로 이루어지고 작은 문이 있는 3 개의 방으로 구성되었으며, 각 방은 길이 50cm x 폭 100cm x 높이 50cm이었다. 원통형 우리를 통해 시험 대상 쥐의 낯선 쥐에 대한 후각 및 최소 접촉을 허용하였다. 시험 전에 시험 대상 쥐는 중간 방에 배치되었고 양쪽 문을 닫고 5 분 동안 적응시켰다. 테스트는 하기 세션 I, II 및 III으로 나누어 수행하였다.

<세션 I> 아무도 없음(none) vs 낯선 쥐(stranger)

사교성을 측정하기 위해, 두 개의 원통형 우리를 각 가장자리 방에 배치하되, 하나는 낯선 쥐가 있고 다른 하나는 비어 있도록 하였다. 시험 대상 쥐는 중간 방에 배치되었고 3 개의 방에서 자유롭게 이동하였으며 10 분 동안 2 개의 우리에 접근할 수 있었다. 쥐의 움직임은 기록되어 ethovision 3.1프로그램을 통해 없음 및 낯선 쥐1영역으로 분석하였다.

<세션 II> 익숙한 쥐(familiar) vs 낯선 쥐(stranger)

새로운 대상에 대해 새로운 사회성를 구축하고 이미 사회성을 형성한 대상에 대한 사회적 인식을 분석하기 위해, 세션 I에서 새로웠던 우리에 새로운 쥐(낯선 쥐)를 추가하였다. 시험 대상 쥐가 세 개의 방에 모두 접근할 수 있도록 두 개의 문을 모두 연 후, 시험 대상 쥐를 중간 방에 배치하여 10 분 동안 자유롭게 움직이도록 하였다. 쥐의 움직임은 기록되어 ethovision 3.1프로그램을 통해 익숙한 쥐 및 낯선 쥐 영역으로 분석하였다.

<세션 III> 성적 선호도

암컷 쥐에 대한 접촉을 분석하여 성적 선호와 사회적 인식 정도를 측정하기 위해, 암컷 및 수컷 쥐를 각 방의 원통형 우리에 배치하고 시험 대상 쥐가 더 자주 접촉하는 우리 및 시간을 측정하였다. 쥐의 움직임은 기록되어 ethovision 3.1 프로그램을 통해 세션별 각 우리에 대한 접근 시간 및 빈도로 분석하였다.

그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이 세션 I에서 빈 영역과 낯선 쥐를 포함하는 영역으로 나누어 각 영역에서 보낸 시간으로 분석한 결과, 목적 구역에서 보낸 시간은 GFP-AAV-hMSC 투여군이 IBO 투여군보다 더 짧았고 MANF-AAV-hMSC 투여군에서는 IBO 투여군 또는 GFP-AAV 투여군에 비해 현저히 길어지는 것을 확인하였다. 한편, 대상 쥐가 없는 빈 구역에서 보낸 시간은 GFP-AAV-hMSC 투여군에서 가장 길었고 MANF-AAV-hMSC 투여군은 정상군과 유사한 수준으로 회복되었다.

도 11에 도시된 바와 같이 세션 II에서 한 방에서 익숙한 쥐와 다른 방에서 낯선 쥐를 인식하여 새로운 대상과 사교성을 형성함으로써 쥐가 이미 사교성을 얼마나 잘 형성했는지를 조사한 결과, 낯선 쥐 구역에서 보낸 시간은 정상군에 비해 IBO 투여군에서 유의하게 감소하였고, GFP-AAV-hMSC 투여군은 IBO 투여군보다 더 짧았으나, MANF-AAV-hMSC 투여군에서는 IBO 투여군과 유사한 정도로 길어지는 경향을 보였으나 유의하지 않았고 GFP-AAV-hMSC 투여군에 비해서는 현저히 길어졌다..

또한, 도 12에 도시된 바와 같이 세션 III에서 사회적 성 선호도를 확인한 결과, 암컷 쥐 구역에서 보낸 시간은 IBO 투여군에서 감소 경향을 보였으나 GFP-AAV-hMSC 투여군 및 PLGF-AAV-hMSC 투여군은 둘 다 정상군과 유사한 수준으로 회복되었다 한편, 수컷 쥐 구역에서 보낸 시간은 IBO 투여군을 제외하고는 Con 군, GFP-AAV 투여군 및 MANF-AAV 투여군에서 모두 유사한 수준으로 짧았다.

이를 통해, MANF 투여는 사회적 인식, 사교성 및 사회적 성적 선호도를 회복시키는 것을 알 수 있다.

실시예 9. 면역학적 조직 염색 실험

상기 실시예 8의 행동 실험 후 면역조직화학 분석을 위해 각 군당 4마리 이상의 쥐 뇌조직을 얻어 뇌 절편을 면역염색하였다.

9-1. 면역 조직 화학 분석- TUNEL

실험 방법은 Heo et al.(2009)에 기술한 것을 수정하여 사용하였다. 쥐를 4% PFA in PBS로 경심 관류(perfused)하고, 4시간 동안 4% PFA in PBS로 담가 고정한 후에 뇌 조직을 30 % 수크로오스 in PBS에서 비냉동화한 뒤 최적의 절단 온도(OCT) 혼합물로 얼리고 -80℃에서 보관하였다. 뇌 조직 절편을 35㎛ 두께의 관상면을 통해 차가운 곳에서 절단하였다. 뇌 조직 절편은 저장 용액(30 % 글리세롤, 30 % 에틸렌글리콜 in PBS)에 담가 4℃에서 보관하였다.

이후, 뇌신경세포의 사멸 정도를 분석하기 위해서 TUNEL 어세이를 진행하였다. 보관된 뇌 조각을 4% 파라포름 알데하이드를 사용하여 상온에서 10분 고정한 후, PBS로 두 번 씻어내고 TUNEL 어세이 키트(Roche, 11684795910)의 프로토콜에 따라 습도를 유지해준 37℃ 항온기에서 1시간 동안 효소 반응을 진행하였다. 이후 PBS로 3회 세척하고, 세포 핵은 1ug/ml 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide, 시그마, P4864, 1:3000)로 표지하여 세포 사멸을 분석하였다.

그 결과, 도 13에 도시한 바와 같이 4주에 비교하여 8주 후에 IBO 투여군에서는 세포 사멸이 유의하게 증가한 후 감소하지 않았으나, AAV-MANF-hMSC 투여군은 GFP-AAV-hMSC군보다 더 감소하였고 8주 후에는 더 크게 감소하여 유의성이 커졌다. 이는, MANF는 기억 손상 및 자폐증 모델에서 뇌신경세포의 사멸을 억제하고, 생존을 증가시키는 것으로 보인다.

9-2. 면역 조직 화학 분석- BrdU, SOX2, DCX, NeuN, vGluT1, GAD67, CNPase

상기 실시예 9-1의 면역염색과 동일한 방법으로 보관되었던 뇌 조직을 PBS를 사용해 2회 세척하고, 0.5 % 트리톤 X-I00에서 20분 동안 투과하고, 37℃에서 30분 동안 2N HCl에서 배양하였다. 그 후, 15% 표준 혈청, 3% 소 혈청 알부민(bio-WORLD, 더블린, OH, USA) 및 0.1% 트리톤 X-100에서 2시간 동안 자유롭게 떠있는 상태로 블로킹하였다. 상기 조직을 16시간 동안 4℃에서 1차 항체인 BrdU(abcam, 1:700) 항체와 SOX2(R&D system, MAB2018, 1:2000), DCX(Santacruz, sc8066, 1:1000), NeuN(Millipore, MAB377B, 1:700), CNPase(Abcam, ab6319, 1:700), vGluT1(Millipore, MAB5502, 1:700), GAD67(Millipore, MAB5406, 1:2000)를 사용하여 이중으로 염색하였다. 2차 항체로는 mo-Alexa 488(Invitrogen, A21202, 1:700), mo-Cy3(Jackson lab, 715- 165-151, 1:500), rb-Alexa 488(Jackson lab, 711-546-152, 1:700), rat-Alexa 488(Abcam, ab6326, 1:700) 등을 사용하였다. 면역 염색된 조직은 공초점 현미경(LSM510, LSM800 칼자이스, 오버코헨, 독일)로 스캔하였다.

이중(double), 삼중(triple) 촬영한 슬라이드에서 DAPI로 표지된 세포 수를 계수하고 각 분화 표지자인 NeuN, CNPase, GAD, vGluT1를 형광으로 표지하여 표식된 각각의 세포 수를 계수하여 각 실험동물의 해마 내 분화 표지자의 수를 나타내었다. 이때 모양과 위치가 정확히 일치되고 세포의 모양을 하고 있는 2차 항체로 표지된 수를 계수하였다.

그 결과, 도 14에 도시한 바와 같이 MANF는 신경줄기세포(Sox2+)의 증식(BrdU+, Ki67)과 이동(DCX)을 촉진하여 신경 재생을 증진하였다.

도 15에 도시한 바와 같이 MANF 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델 쥐 조직에서는 새로 증식한 (BrdU 염색된) 신경전구세포의 성숙한 신경세포(NeuN), 희소돌기신경교(oligodendrocyte) (CNPase), 가바성 신경세포(GAD)로의 분화가 증가하였다.

실시예 10. MANF 투여에 따른 배쪽(ventral) 해마의 콜린성 뉴런(cholinergic neuron)의 변화 조사

상기 실시예 5와 같이 제작한 IBO가 투여된 기억 손상 및 자폐증 모델을 대상으로 면역염색을 이용하여 MANF-AAV-hMSC을 투여했을 때 콜린성 뉴런의 변화를 조사하였다.

구체적으로, 쥐를 4% PFA in PBS로 관류하고 뇌를 적출하였다. 뇌를 4℃에서 4 시간 동안 고정시킨 후 4℃에서 48 시간 동안 30 % 수크로스를 포함하는 PBS를 이용하여 탈수시켰다. 그런 다음 뇌를 블록 형태로 냉동하고 최적 온도의 화합물을 사용하여 -80℃에서 보관하였다. 조직을 30um 두께의 관상 절편으로 제작하고 저장 용액(30 % 글리세롤(glycerol), 30 % 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)을 포함하는 PBS)에서 4℃로 보관하였다. 이후, 0.5 % Triton X-100-PBS에 20 분 동안 투과시키고, 10 % 일반 혈청과 3 % BSA, 0.1 % Triton X-100-PBS에서 1 시간 동안 실온에서 차단한 후, ChAT(Millipore, AB144p, 1:200)의 1차 항체를 사용하여 면역염색 및 계수하였다. 상기 면역염색은 등쪽 해마(ventral hippocampal regions, vHP)에서 각각의 뇌 절편 AP -4.0~ -5.2mm 에서 0.3mm 마다 수행되었다.

그 결과, 도 16에 도시한 바와 같이 배측 해마 CA3의 ChAT 양성 세포의 수는 IBO 투여군에서 가장 낮았고 GFP-AAV-hMSC 투여군에서 다소 회복되었으나, MANF-AAV-hMSC 투여군에서는 정상쥐와 유사한 수준으로 콜린성 뉴런의 수가 회복되었으며 가바성 신경세포도 유의성은 낮으나 다소 증가하였다. 또한, 배측 해마(ventral Hippocampus)는 정서불안과 사회성 행동과 관련된 영역이며 배측 이 부위의 가바성 신경세포와 콜린성 신경세포의 분화가 증가하였으므로, MANF 투여에 의해 콜린성 및 가바성 신경세포가 재생되는 것으로 보인다.

상기 실시예들의 결과에 따라, MANF 투여는 기억 손상 및 자폐증 모델에서 콜린성 및/또는 가바성 신경세포의 분화를 촉진하여 신경 재생을 유도하고, 기억력 증진 및 불안 장애 개선 효과를 나타내며, 사회적 인식, 사교성 및 사회적 성적 선호도 저하를 개선하는 바, 자폐증, ADHD, 정신지체장애, 발달장애 등의 신경정신질환의 예방 또는 치료용 조성물로 제공될 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University Hankuk University OF Foreign Studies Research and Business Foundation <120> A Composition for preventing or treating Neurological disorders comprising mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor <130> KPA201191-KR-P1 <150> KR 10-2020-0127087 <151> 2020-09-29 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 182 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> MANF amino acid <400> 1 Met Arg Arg Met Trp Ala Thr Gln Gly Leu Ala Val Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ser Val Leu Pro Gly Ser Arg Ala Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val 20 25 30 Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp 35 40 45 Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys 50 55 60 Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala 65 70 75 80 Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu 85 90 95 Ala His His Ile Pro Val Glu Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys 100 105 110 Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser 115 120 125 Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu 130 135 140 Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr 145 150 155 160 Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala 165 170 175 Ser Ala Arg Thr Asp Leu 180 <210> 2 <211> 909 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> MANF nucleotide <400> 2 agtcggtcgg cggcggcagc ggaggaggag gaggaggagg aggatgagga ggatgaggag 60 gatgtgggcc acgcaggggc tggcggtggc gctggctctg agcgtgctgc cgggcagccg 120 ggcgctgcgg ccgggcgact gcgaagtttg tatttcttat ctgggaagat tttaccagga 180 cctcaaagac agagatgtca cattctcacc agccactatt gaaaacgaac ttataaagtt 240 ctgccgggaa gcaagaggca aagagaatcg gttgtgctac tatatcgggg ccacagatga 300 tgcagccacc aaaatcatca atgaggtatc aaagcctctg gcccaccaca tccctgtgga 360 gaagatctgt gagaagctta agaagaagga cagccagata tgtgagctta agtatgacaa 420 gcagatcgac ctgagcacag tggacctgaa gaagctccga gttaaagagc tgaagaagat 480 tctggatgac tggggggaga catgcaaagg ctgtgcagaa aagtctgact acatccggaa 540 gataaatgaa ctgatgccta aatatgcccc caaggcagcc agtgcacgga ccgatttgta 600 gtctgctcaa tctctgttgc acctgagggg gaaaaaacag ttcaactgct tactcccaaa 660 acagcctttt tgtaatttat tttttaagtg ggctcctgac aatactgtat cagatgtgaa 720 gcctggagct ttcctgatga tgctggccct acagtacccc catgagggga ttcccttcct 780 tctgttgctg gtgtactcta ggacttcaaa gtgtgtctgg gattttttta ttaaagaaaa 840 aaaatttcta gctgtccttg cagaattata gtgaatacca aaatggggtt ttgccccagg 900 aggctccta 909 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> GFP nucleotide <400> 3 ttacttgtac agctcgtcca tgccgagagt gatcccggcg gcggtcacga actccagcag 60 gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta 120 gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc 180 ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 240 gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 300 gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 360 cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 420 gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 480 cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca ctgcacgccg taggtcaggg tggtcacgag 540 ggtgggccag ggcacgggca gcttgccggt ggtgcagatg aacttcaggg tcagcttgcc 600 gtaggtggca tcgccctcgc cctcgccgga cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcgcc 660 gtccagctcg accaggatgg gcaccacccc ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat 720 720 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MANF receptor 1 antisense <400> 4 uagaguguac gguagacac 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MANF receptor 2 antisense <400> 5 augguguuag aguguaguc 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MANF receptor 3 antisense <400> 6 aucggaagag guucaugac 19

Claims

(a) 중뇌성상세포 유래 신경성장인자(mesencephalic, astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF); 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 신경정신질환은 자폐증, ADHD, 정신지체장애 및 발달장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (a) MANF 또는 (b) MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 MANF의 폴리펩티드 서열 또는 이의 단편; 상기 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편; 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (a) MANF 또는 (b) MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 해마에서 신경세포의 재생을 촉진하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (a) MANF 또는 (b) MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 해마에서 신경세포의 분화를 촉진하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (a) MANF 또는 (b) MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 기억력을 개선하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (a) MANF 또는 (b) MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 불안 장애를 개선하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 (a) MANF 또는 (b) MANF 유래 펩티드 또는 이의 단편은 사교성 또는 사회적 인지 능력을 개선하는 것인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 치료 방법.
(a) MANF; 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
(a) MANF; 또는 (b) 이로부터 유래하는 펩티드 또는 이의 단편;을 유효성분으로 포함하는 신경정신질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.