KR20220042651A - 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법 - Google Patents

맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법 Download PDF

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KR20220042651A
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Abstract

본원은 유산균을 배양하는 단계; 상기 배양된 유산균으로부터 복수의 대사체를 추출하는 단계; 상기 추출된 복수의 대사체를 다중 질량 분광법을 이용하여 분석하는 단계; 상기 다중 질량 분광법을 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환하는 단계; 상기 수치에 다변량 통계 분석을 적용하여 상기 복수의 대사체를 그룹화하는 단계; 및 상기 그룹화된 대사체의 표현형(phenotype)을 분석하는 단계;를 포함하는 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법{SCREENING METHOD FOR CUSTOMIZED POSTBIOTICS}
본원은 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법에 관한 것이다.
섭취한 음식물은 위에서 소화 과정을 거쳐 장으로 이동한다. 장은 소화된 음식물을 흡수하고 분해해 몸 밖으로 배출하는 역할을 함과 동시에 면역세포 70% 이상이 분포된 기관으로 신체의 면역기능과 밀접한 관련을 맺고 있다.
약 100 조 이상의 균이 살고 있는 장에는 유익균과 유해균이 함께 존재한다. 유익균이 많아 정상세균 총의 균형을 유지하면 건강한 장 내 환경을 유지할 수 있지만, 노화나 불균형한 식습관 등으로 인해 장내 유해균이 증가하게 되면 장 기능 저하와 함께 면역력 저하를 초래할 수 있다.
따라서, 장 건강에 도움을 주는 식품으로 유산균 섭취를 권장하고 있다. 꾸준한 유산균 섭취는 장내 유익균을 늘리고 유해균을 줄여 장내 환경을 건강한 상태로 유지할 수 있다.
프로바이오틱스는 유산균을 비롯해 몸속에서 유익한 효과를 내는 모든 균을 의미한다. 장뿐만 아니라 면역질환 등 다양한 신체 기능에 관여한다. 최근에는 프로바이오틱스가 내놓는 대사산물인 ‘포스트바이오틱스’가 치료제나 질병 진단에 효율적이라는 주장이 주목 받고 있다.
포스트바이오틱스란 프로바이오틱스가 먹이인 프리바이오틱스를 먹고 만들어내는 대사산물이다. 즉, 유산균이 만들어내는 유기산, 즉 박테이로신, 뷰틸레이트, 효소, 아미노산, 펩타이드 등 유산균 대사산물이 대표적이다.
최근 세계적으로 장내 미생물 연구가 활발히 진행되면서 우리 몸에 실제로 유익한 역할을 하는 건 유산균 자체보다는 유산균의 대사산물이자 균체 성분인 포스트바이오틱스라는 다수의 연구 결과가 발표되면서 포스트바이오틱스가 주목받고 있다.
장내 세균총의 비율이 정상이라면 장내 유익균들이 충분한 포스트바이오틱스를 생산하기 때문에 건강한 장을 유지할 수 있다. 그러나 현대인의 장내 환경은 대부분 장내 유익균이 부족하고 유해균의 비중이 높아서 유익균의 대사산물이 생성되기까지 시간이 많이 걸리고 충분한 양의 포스트바이오틱스를 만들지 못한다. 먹는 생균 또한 장을 통과하는 통과성 세균으로 충분한 양의 포스트바이오틱스를 생산하지 못한다.
따라서, 개인별, 질환별 맞춤형 포스트바이오틱스의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본원의 배경이 되는 기술인 한국 등록특허공보 제 10-2124474 호는 PMAS방법을 이용한 개인 맞춤형 장내 환경 개선 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 특허는 장내 환경 개선물질 스크리닝용 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 그러나, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법에 대해서는 언급하지 않고 있다.
본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본원은 상기 스크리닝 방법으로 스크리닝된 맞춤형 포스트바이오틱스를 포함하는 포스트바이오틱스 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본원은 상기 제조 방법에 의해 제조된 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은, 유산균을 배양하는 단계; 상기 배양된 유산균으로부터 복수의 대사체를 추출하는 단계; 상기 추출된 복수의 대사체를 다중 질량 분광법을 이용하여 분석하는 단계; 상기 다중 질량 분광법을 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환하는 단계; 상기 수치에 다변량 통계 분석을 적용하여 상기 복수의 대사체를 그룹화하는 단계; 및 상기 그룹화된 대사체의 표현형(phenotype)을 분석하는 단계;를 포함하는 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 그룹화하는 단계는 균주별 또는 배양 환경별로 차이를 나타내는 대사체를 그룹화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 표현형(phenotype)을 분석하는 단계는 질병 특이적인 표현형을 분석하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 애니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum). 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 및 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 스트렙토코쿠스 서모필루스(Streptococcus thermophilus) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균을 배양하는 단계는 배양 시간, 배양 온도, pH, 광량, 영양분, 기체상 환경, 혐기성 조건, 일부 혐기성 조건, 호기성 조건, 무산소성 조건 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양 환경을 변화시키면서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 대사체는 아미노산, 탄수화물, 지질, 벤제노이드, 펩타이드, 비타민, 유기산, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 페닐프로파노이드, 유기 화합물, 핵산, 지방산 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다중 질량 분광법은 액체크로마토그래피-질량분석(LC/MS), 기체크로마토그래피-질량분석(GC/MS), 역상액체크로마토그래피-질량분석(RPLC/MS), 친수성상호작용크로마토그래피-질량분석(HILIC/MS), 모세관 전기이동 질량 분석(CE-MS) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다변량 통계 분석은 부분최소자승판별분석(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA), 계층적 군집분석(hierarchical clustering analysis, HCA), 주성분분석(principal component analysis, PCA), PCA 유래 스코어 플롯(score plot)분석, 부분최소제곱회기(partial least squares, PLS)분석 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 그룹화된 대사체의 표현형을 분석하는 단계는 시험관 내 시험(in vitro test), 동물시험, 기관시험, 세포시험, 생체 내 시험(in vivo test) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 스크리닝 방법으로 스크리닝된 맞춤형 포스트바이오틱스를 포함하는 포스트바이오틱스 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물 제조 방법을 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 방법으로 제조된 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 담체, 부형제 및 희석제는, 각각 독립적으로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 4 측면은, 복수의 유산균을 배양하는 단계; 상기 배양된 유산균으로부터 복수의 사균체를 수득하는 단계; 상기 복수의 사균체를 다중 질량 분광법을 이용하여 분석하는 단계; 상기 다중 질량 분광법을 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환하는 단계; 상기 수치에 다변량 통계 분석을 적용하여 상기 복수의 사균체를 그룹화하는 단계; 및 상기 그룹화된 사균체의 표현형(phenotype)을 분석하는 단계;를 포함하는 맞춤형 사균체 스크리닝 방법을 제공한다.
본원의 제 5 측면은, 본원의 제 4 측면에 따른 방법으로 스크리닝된 맞춤형 사균체를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 맞춤형 사균체 조성물 제조 방법을 제공한다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 유산균의 대사체를 그룹화하여 표현형을 분석함으로써, 개인별 또는 질환별 맞춤형 포스트바이오틱스를 스크리닝 할 수 있다. 이에, 상기 스크리닝된 포스트바이오틱스를 활용하여 개인별 또는 질환별로 맞춤화된 최적의 조합을 만들 수 있다.
또한, 종래의 포스트바이오틱스의 경우 박테리오신, SFA, 아연, 올리고당, 특정 균주 추출물 등을 사용함으로써, 타겟 질환에 관계없이 일반적인 유산균주들의 배양만을 촉진하는 한계점이 있었다. 반면, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 유산균 대사체를 그룹화하여 표현형을 분석함으로써 타겟 질환과 직접적인 관련이 있는 유산균 또는 대사체를 선택하여 제공할 수 있기 때문에, 종래의 포스트바이오틱스의 한계점을 극복한 개인별 또는 질환별 맞춤형 포스트바이오틱스를 제공할 수 있다.
또한, 종래의 프로바이오틱스의 경우, 유산균의 장내 기능에 대해 아직 정확한 기작 규명이 부족한 상황에서, 우리 몸에서 실제로 유익한 역할을 하는 물질이 아닌 균주 의존적인 접근법을 사용하는 한계점이 있었다. 반면, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 우리 몸에서 실제로 유익한 역할을 하는 유산균 대사체를 그룹화하여 표현형을 분석함으로써, 기존의 균주 의존적인 한계를 극복하고 실제 생리적인 활성과 직접적인 관련이 있는 포스트바이오틱스를 질환별 또는 개인별 맞춤형 최적의 조합으로 설계할 수 있는 데이터를 제공할 수 있다.
또한, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 GC/MS, RPLC/MS 및 HILIC/MS 를 기반으로 한 교차 플랫폼 접근 방식을 적용함으로써, 표적 분석과 비표적 분석의 포괄적인 프로파일링 결합 교차 플랫폼을 제공하는 장점이 있다.
또한, 종래의 프로바이오틱스 조성물의 경우 균주 의존적으로 조성물을 제조하였기 때문에 실제 생리적인 활성과 상관 관계가 떨어지므로 개인별 또는 질환별 맞춤형 조성물을 제공하기 어렵다는 한계점이 있었다. 반면, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물 제조 방법은 기존의 균주 의존적인 한계를 극복하고 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 활용함으로써 실제 생리적인 활성과 직접적인 관련이 있는 포스트바이오틱스를 질환별 또는 개인별 맞춤형 최적의 조합으로 설계하여 개인별 또는 질환별 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물을 제조할 수 있다.
또한, 종래의 프로바이오틱스의 경우, 장 점막에 부착하여 유해균을 제거하는데 일정한 시간이 필요하다는 문제점이 있었다. 반면, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물은 프로바이오틱스가 내놓는 대사산물인 포스트바이오틱스를 직접적으로 제공함으로써, 장 점막 부착의 과정을 생략할 수 있으며, 유해균을 직접 사멸하고 장 점막 면역을 빠르게 활성화시킬 수 있는 장점이 있다.
또한, 종래의 프로바이오틱스의 경우, 위산과 담즙산에 사멸하고, 대사산물의 생산 과정을 거치기 때문에, 많은 양을 투여해야 하는 문제점이 있었다. 반면, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물은 위산과 담즙산에 사멸하지 않아 많은 양이 필요 없고, 대사산물의 생산 과정 없이 곧바로 간, 심장, 세포 등으로 전달되기 때문에 효능이 상대적으로 빠르고 효과도 크다는 장점이 있다.
또한, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물은 질병의 예방 또는 치료를 위한 식품, 건강기능성 식품 및 의약품 등 다양한 분야에서 응용이 가능하다.
다만, 본원에서 얻을 수 있는 효과는 상기된 바와 같은 효과들로 한정되지 않으며, 또 다른 효과들이 존재할 수 있다.
도 1 은 본원의 일 구현예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2 는 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법의 제조 공정 모식도이다.
도 3 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 유사한 대사체를 가지는 유산균을 분류한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4 는 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 복수의 대사체의 HCA 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5 는 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 복수의 대사체의 HCA 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 6 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 복수의 대사체의 HCA 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 복수의 대사체의 PLS-DA 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 8 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법의 대사체 분석을 위한 추출 용매 및 분석 방법에 따른 9 가지 데이터 세트의 정보를 나타낸 이미지이다.
도 9 는 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 추출 용매 및 분석 방법에 따른 대사체 수를 나타낸 이미지이다.
도 10 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 대사체의 분석 방법을 나타내는 대사 경로의 개략도이다.
도 11 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 분석 방법에 따른 대사체 수를 나타낸 이미지이다.
도 12 는 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 분석 방법에 따른 대사체 수를 나타낸 이미지이다.
도 13 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 분석 방법에 따른 대사체 수를 비교한 결과를 나타낸 이미지이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하에서는 본원의 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
도 1 은 본원의 일 구현예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 나타낸 순서도이고, 도 2 는 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법의 제조 공정 모식도이다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은, 유산균을 배양하는 단계; 상기 배양된 유산균으로부터 복수의 대사체를 추출하는 단계; 상기 추출된 복수의 대사체를 다중 질량 분광법을 이용하여 분석하는 단계; 상기 다중 질량 분광법을 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환하는 단계; 상기 수치에 다변량 통계 분석을 적용하여 상기 복수의 대사체를 그룹화하는 단계; 및 상기 그룹화된 대사체의 표현형(phenotype)을 분석하는 단계;를 포함하는 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 그룹화하는 단계는 균주별 또는 배양 환경별로 차이를 나타내는 대사체를 그룹화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 표현형(phenotype)을 분석하는 단계는 질병 특이적인 표현형을 분석하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 유산균의 대사체를 그룹화하여 표현형을 분석함으로써, 개인별 또는 질환별 맞춤형 포스트바이오틱스를 스크리닝 할 수 있다. 이에, 상기 스크리닝된 포스트바이오틱스를 활용하여 개인별 또는 질환별로 맞춤화된 최적의 조합을 만들 수 있다.
맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 수행하기 위해, 먼저 유산균을 배양하는 단계를 수행한다(S100).
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 애니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum). 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 및 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 스트렙토코쿠스 서모필루스(Streptococcus thermophilus) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유산균에서 가장 큰 속인 락토바실러스에 속하는 락토바실러스 플란타럼은 식품의 발효 및 보존 과정뿐만 아니라 프로바이오틱스로 널리 사용되는 주요 기능성 미생물이다. 빠른 적응성과 다양한 대사 경로로 인해 식물 및 동물의 내장과 같은 다양한 자연 환경에서 발견된다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균을 배양하는 단계는 배양 시간, 배양 온도, pH, 광량, 영양분, 기체상 환경, 혐기성 조건, 일부 혐기성 조건, 호기성 조건, 무산소성 조건 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양 환경을 변화시키면서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 유산균은 혐기성 조건, 일부 혐기성 조건, 호기성 조건의 배양 환경에서 각각 배양되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유산균의 배양 환경에 따라 생성되는 대사체가 다르기 때문에, 본원의 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 통해 배양 환경별로 그룹화된 유산균 대사체 리스트를 제공할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 배양 환경별로 그룹화된 유산균 대사체의 표현형을 분석하여 상관관계를 해석하면 개인별 또는 질환별 유효한 유산균 및 대사체 리스트를 확보할 수 있고, 이를 바탕으로 개인별 또는 질환별 맞춤형 활성 균주 추출물의 조합 또는 포스트바이오틱스의 조합을 제공할 수 있다.
이어서, 상기 배양된 유산균으로부터 복수의 대사체를 추출하는 단계를 수행한다(S200).
대사체학(Metabolomics)은 미생물, 조직 및 체액과 같은 생물학적 샘플에서 내인성 및 외인성 작은 크기의 대사 산물을 포괄적으로 분석하는 것을 의미한다. 대사체학은 임상 질병 진단, 식물 화학, 인간 영양, 식품 품질 및 환경 과학과 같은 많은 연구 분야에서 활용되고 있다.
미생물학에서 대사 산물은 세포 내 대사 산물과 세포 외부에서 분비되는 세포 외 대사 산물로 나눌 수 있다. 이러한 대사 산물은 세포의 성장 단계에 따라 생성되는 대사 산물에 변화가 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 대사체는 아미노산, 탄수화물, 지질, 벤제노이드, 펩타이드, 비타민, 유기산, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 페닐프로파노이드, 유기 화합물, 핵산, 지방산 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이어서, 상기 추출된 복수의 대사체를 다중 질량 분광법을 이용하여 분석하는 단계를 수행한다(S300).
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다중 질량 분광법은 액체크로마토그래피-질량분석(LC/MS), 기체크로마토그래피-질량분석(GC/MS), 역상액체크로마토그래피-질량분석(RPLC/MS), 친수성상호작용크로마토그래피-질량분석(HILIC/MS), 모세관 전기이동 질량 분석(CE-MS) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 다중 질량 분광법은 액체크로마토그래피-질량분석(LC/MS) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
기체크로마토그래피-질량분석(GC/MS)은 대사체학에서 일반적으로 사용되는 플랫폼이며 지방산 및 유기산과 같은 휘발성 화합물의 측정에 장점이 있다. 그러나, GC/MS 는 고온의 열을 사용하기 때문에 분석물이 열적으로 안정적이고 휘발성이 있어야 한다는 제한이 있으며, 분석할 수 있는 질량 범위가 제한적이라는 한계점이 있다.
GC/MS 에 비해 액체크로마토그래피-질량분석(LC/MS)으로 더 광범위한 화학 종을 분석할 수 있다. 역상액체크로마토그래피-질량분석(RPLC/MS)은 가장 널리 사용되는 분리 기술이며 비극성 및 약극성 화합물을 분리하는데 장점이 있다. 그러나, 높은 친수성, 이온성 및 극성 분자의 분석에는 한계점이 있다.
또한, 친수성상호작용크로마토그래피-질량분석(HILIC/MS)은 극성 대사 산물 분석을 위한 RPLC 의 대안으로 대두되고 있다.
대사체학은 포괄적인 대사 프로파일링을 목표로 하지만 전체 대사 산물을 분석하는 단일 분석 방법은 없는 실정이다. 이에, 최근 신진 대사 물리학에서 크로스 플랫폼 접근 방식이 적용되었으며, 보완 플랫폼의 데이터를 결합하여 대사체 커버리지를 확장하기 위해 하나 이상의 분석 플랫폼 조합을 이용하는 방법이 주목받고 있다.
본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 GC/MS, RPLC/MS 및 HILIC/MS 를 기반으로 한 교차 플랫폼 접근 방식을 적용함으로써, 표적 분석과 비표적 분석의 포괄적인 프로파일링 결합 교차 플랫폼을 제공하는 장점이 있다. 이에 따라, 분석되는 대사체 범위를 최대화 할 수 있는 장점이 있다.
이어서, 상기 다중 질량 분광법을 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환하는 단계를 수행한다(S400).
이어서, 상기 수치에 다변량 통계 분석을 적용하여 상기 복수의 대사체를 그룹화하는 단계를 수행한다(S500).
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 다변량 통계 분석은 부분최소자승판별분석(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA), 계층적 군집분석(hierarchical clustering analysis, HCA), 주성분분석(principal component analysis, PCA), PCA 유래 스코어 플롯(score plot)분석, 부분최소제곱회기(partial least squares, PLS)분석 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
종래의 포스트바이오틱스의 경우 박테리오신, SFA, 아연, 올리고당, 특정 균주 추출물 등을 사용함으로써, 타겟 질환에 관계없이 일반적인 유산균주들의 배양만을 촉진하는 한계점이 있었다.
본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 유산균 대사체를 그룹화하여 표현형을 분석함으로써 타겟 질환과 직접적인 관련이 있는 유산균 또는 대사체를 선택하여 제공할 수 있기 때문에, 종래의 포스트바이오틱스의 한계점을 극복한 개인별 또는 질환별 맞춤형 포스트바이오틱스를 제공할 수 있다.
이어서, 상기 그룹화된 대사체의 표현형(phenotype)을 분석하는 단계를 수행한다(S600).
본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법에 따라 그룹화된 유산균 대사체의 표현형을 분석하여 상관관계를 해석하면 개인별 또는 질환별 유효한 유산균 및 대사체 리스트를 확보할 수 있다. 이를 바탕으로 개인별 또는 질환별 맞춤형 활성 균주 추출물의 조합 또는 포스트바이오틱스의 조합을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 그룹화된 대사체의 표현형을 분석하는 단계는 시험관 내 시험(in vitro test), 동물시험, 기관시험, 세포시험, 생체 내 시험(in vivo test) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
종래의 프로바이오틱스의 경우, 유산균의 장내 기능에 대해 아직 정확한 기작 규명이 부족한 상황에서, 우리 몸에서 실제로 유익한 역할을 하는 물질이 아닌 균주 의존적인 접근법을 사용하는 한계점이 있었다.
본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 우리 몸에서 실제로 유익한 역할을 하는 유산균 대사체를 그룹화하여 표현형을 분석함으로써, 기존의 균주 의존적인 한계를 극복하고 실제 생리적인 활성과 직접적인 관련이 있는 포스트바이오틱스를 질환별 또는 개인별 맞춤형 최적의 조합으로 설계할 수 있는 데이터를 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 스크리닝 방법으로 스크리닝된 맞춤형 포스트바이오틱스를 포함하는 포스트바이오틱스 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물 제조 방법을 제공한다.
본원의 제 2 측면에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물 제조 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
종래의 프로바이오틱스 조성물의 경우 균주 의존적으로 조성물을 제조하였기 때문에 실제 생리적인 활성과 상관 관계가 떨어지므로 개인별 또는 질환별 맞춤형 조성물을 제공하기 어렵다는 한계점이 있었다.
본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물 제조 방법은 기존의 균주 의존적인 한계를 극복하고 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 활용함으로써 실제 생리적인 활성과 직접적인 관련이 있는 포스트바이오틱스를 질환별 또는 개인별 맞춤형 최적의 조합으로 설계하여 개인별 또는 질환별 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물을 제조할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 방법으로 제조된 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물을 제공한다.
본원의 제 3 측면에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물에 대하여, 본원의 제 1 측면 및 제 2 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면 및 제 2 측면에 기재된 내용은 본원의 제 3 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
종래의 프로바이오틱스의 경우, 장 점막에 부착해 유해균을 제거하는 데 일정한 시간이 필요하다는 문제점이 있었다.
본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물은 프로바이오틱스가 내놓는 대사산물인 포스트바이오틱스를 직접적으로 제공함으로써, 장 점막 부착의 과정을 생략할 수 있으며, 유해균을 직접 사멸하고 장 점막 면역을 빠르게 활성화시킬 수 있는 장점이 있다.
또한, 종래의 프로바이오틱스의 경우, 위산과 담즙산에 사멸하고, 대사산물의 생산 과정을 거치기 때문에, 많은 양을 투여해야 하는 문제점이 있었다.
본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물은 위산과 담즙산에 사멸하지 않아 많은 양이 필요 없고, 대사산물의 생산 과정 없이 곧바로 간, 심장, 세포 등으로 전달되기 때문에 효능이 상대적으로 빠르고 효과도 크다는 장점이 있다.
또한, 본원에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물은 질병의 예방 또는 치료를 위한 식품, 건강기능성 식품 및 의약품 등 다양한 분야에서 응용이 가능하다는 장점이 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 담체, 부형제 및 희석제는, 각각 독립적으로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 약효가 충분히 발휘될 수 있도록 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 이러한 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 비강흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
본원의 제 4 측면은, 복수의 유산균을 배양하는 단계; 상기 배양된 유산균으로부터 복수의 사균체를 수득하는 단계; 상기 복수의 사균체를 다중 질량 분광법을 이용하여 분석하는 단계; 상기 다중 질량 분광법을 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환하는 단계; 상기 수치에 다변량 통계 분석을 적용하여 상기 복수의 사균체를 그룹화하는 단계; 및 상기 그룹화된 사균체의 표현형(phenotype)을 분석하는 단계;를 포함하는 맞춤형 사균체 스크리닝 방법을 제공한다.
본원의 제 4 측면에 따른 맞춤형 사균체 스크리닝 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 4 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
본원의 제 5 측면은, 본원의 제 4 측면에 따른 방법으로 스크리닝된 맞춤형 사균체를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 맞춤형 사균체 조성물 제조 방법을 제공한다.
본원의 제 5 측면에 따른 맞춤형 사균체 조성물 제조 방법에 대하여, 본원의 제 4 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 4 측면에 기재된 내용은 본원의 제 5 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
50 ml 의 MRS 브로쓰 배지에서 혐기성 조건, 일부 혐기성 조건, 호기성 조건의 배양 환경에 따라 각각 독립적으로 유산균(Bifidobacterium animalis subsp. animalis, Bifidobacterium animalis subsp. Lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium longum subsp. longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium thermophilum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei,Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus sakei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium (Lactobacillus faecium), Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. Lactis, Pediococcus acidilatici (Lactobacillus acidilactici), Pediococcus acidilactici, Streptococcus thermophiles) 을 배양하였다.
구체적으로, 1,000 mL 삼각 플라스크에 500 mL의 MRS 브로쓰를 5% 박테리아 현탁액(O.D 600 nm 1.0)으로 접종하고 MRS 브로쓰에서 37℃, 200 rpm 에서 12 시간 동안 배양하였다.
이어서, 배양 환경별로 배양된 유산균에서 각각 독립적으로 80% 유기 용매 (MeOH : ACN : H2O (2 : 2 : 1 (v / v / v)) 혼합물을 이용하여 세포 내 샘플(I) 및 세포 외 샘플(E1)을 추출하고, 에틸 아세테이트 용매를 이용하여 세포 외 샘플(E1)을 추출하였다.
이어서, GC-TOF-MS 및 UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS 를 이용하여 각각 대사체 프로파일링을 수행하였다.
구체적으로, GC-TOF-MS analysis 의 경우, 건조된 샘플에 피리딘 20 mg / L 에 40 ㎕ 의 methoxyamine hydrochloride 를 첨가하여 oximation 을 수행하고 반응 혼합물을 30 ℃ 에서 90 분간 배양하였다. 이어서, 반응 혼합물에 40 ㎕ 의 MSTFA 를 첨가하여 실릴화를 수행 한 후 37℃ 에서 30 분간 배양 하였다. 유도체화된 샘플의 최종 농도는 5,000 ppm(50 mg / mL)의 세포 내 추출물과 20,000 ppm (200 mg / ml)의 세포 외 추출물로 설정되었으며, 추가된 내부 표준 물질로 2-클로로-페닐알라닌(0.5 mg / mL)을 사용하였다(IS). 모든 샘플은 기기 분석에 앞서 Millex GP 0.22 ㎛ 필터(Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 여과되었다. 이어서, Agilent 7693 자동 시료 주입기 및 Pegasus HT TOF-MS와 함께 Agilent 7890A GC 시스템을 사용하여 GC-TOF-MS 분석을 수행하였다. Rtx-5MS 모세관 컬럼(30 m x 0.25 mm x 0.25 μm 입자 크기, Restek Corp., Bellefonte, PA)은 1.5 mL / min의 헬륨의 일정한 흐름과 함께 사용되었다. 전면 입구 및 이송 라인 온도는 각각 250℃ 와 240℃ 로 설정되었다. 오븐 온도를 75℃ 에서 2 분 동안 유지 한 다음 300℃ 에서 2 내지 17 분, 15℃ /분 유지 및 최종 유지를 3 분 동안 유지하였다. 전자 이온화는 70 eV 로 설정되었고 질량 스펙트럼은 m / z 50 내지 600 범위에서 기록되었다. 총 1 μL 의 유도체화된 샘플을 20 : 1 의 분할 비율로 GC-TOF-MS 에 주입하였다.
UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS 의 경우, RPLC-MS 분석을 위해 Phenomenex KINETEX® C18 컬럼(100 mm X 2.1 mm, 1.7 ㎛ 입자 크기; Torrance, CA, USA)에서 크로마토 그래피 분리를 수행하였다. 이동상, 물(A)에서 0.1% v / v 포름산 및 아세토 니트릴(B)에서 0.1% v / v 포름산은 ESI 네거티브 모드에서 사용되었다. 구배 매개 변수는 다음과 같이 설정되었다: 5% 용매 B 를 처음에 1 분 동안 유지 한 다음 9 분에 걸쳐 100% 용매 B 로 선형 증가시킨 다음 1 분 동안 100% 용매 B 에서 유지하고 5% 용매 B 로 3 분 동안 점진적으로 감소시켰다. HILIC-MS 분석을 위해 샘플을 Luna Aminopropyl, 3 μm, 150 mm × 1.0 mm I.D 로 분리하였다. 이동상은 ESI 음성 모드에서 95% 물(A) 및 95% 아세토 니트릴(B)에서 20 mM 암모늄 아세테이트 및 20 mM 수산화 암모늄으로 구성되었다. 100% B 용매(0분 내지 2.5 분)에서 100% A 용매(22.5 분 내지 25 분)까지 선형 구배 용리를 적용하였다. 두 LC 접근법 모두 컬럼 온도는 40℃, 유속은 0.3 mL / min, 주입량은 5 ㎕ 로 설정하였다. MS 데이터는 HESI-II 프로브와 결합된 이온 트랩 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 결합된 Orbitrap Velos ProTM 시스템을 사용하여 RPLC-MS 의 경우 100 m/z 내지 1500 m/z, HILIC-MS 의 경우 50 m/z 내지 1000 m/z (음이온 및 양이온 모드)에서 수집되었다. 프로브 히터 및 모세관 온도는 각각 300℃ 및 350℃ 로 설정되었다. 모세관 전압은 네거티브 모드(포지티브 모드, 3.7 Kv)에서 2.5 kV 로 설정되었다.
이어서, 상기 LC/MS 를 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환한 후, 상기 수치에 HCA 및 PLS-DA 를 적용하여 상기 복수의 대사체를 그룹화하였다.
[실험예 1]
도 3 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 유사한 대사체를 가지는 유산균을 분류한 결과를 나타낸 이미지이다.
이를 통하여, 본원의 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 기존의 균주 의존적인 한계를 극복하고 실제 생리적인 활성과 직접적인 관련이 있는 대사체에 따라 유산균을 분리하였음을 확인할 수 있었다. 이는 그룹화된 유산균 대사체의 표현형을 분석하여 상관관계를 해석하면 개인별 또는 질환별 유효한 유산균 및 대사체 리스트를 확보할 수 있음을 시사하는 것이다. 이를 바탕으로 개인별 또는 질환별 맞춤형 활성 균주 추출물의 조합 또는 포스트바이오틱스의 조합을 제공할 수 있다.
또한, 대장균의 경우 비교예로서 사용되었으며, 이를 통하여 본원의 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 사용하는 경우, 장내 유산균은 장내 유산균 이외의 균과 다르게 분류된다는 것을 확인할 수 있었다.
도 4 내지 도 6 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 복수의 대사체의 HCA 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 복수의 대사체의 PLS-DA 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
구체적으로, 도 4 및 도 7 의 (A) 는 혐기성 환경에서, 도 5 및 도 7 의 (B) 는 일부 혐기성 환경에서, 도 6 및 도 7 의 (C) 는 호기성 환경에서 각각 독립적으로 배양된 유산균의 세포 내 샘플에서 추출한 대사체를 LC/MS 를 이용하여 분석한 결과를 HCA 및 PLS-DA 를 적용하여 그룹화한 결과를 나타낸 이미지이다.
이를 통하여, 다양한 균주에서 배양 환경별로 다르게 추출되는 대사체를 확인할 수 있었다. 이에 따라, 본원의 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법을 통해 배양 환경별로, 각각 독립적으로, 그룹화된 유산균 대사체 리스트를 확인할 수 있었다. 이는 배양 환경별로, 각각 독립적으로, 그룹화된 유산균 대사체의 표현형을 분석하여 상관관계를 해석하면 개인별 또는 질환별 유효한 유산균 및 대사체 리스트를 확보할 수 있음을 시사하는 것이다. 이를 바탕으로 개인별 또는 질환별 맞춤형 활성 균주 추출물의 조합 또는 포스트바이오틱스의 조합을 제공할 수 있다.
[실험예 2]
도 8 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법의 대사체 분석을 위한 추출 용매 및 분석 방법에 따른 9 가지 데이터 세트의 정보를 나타낸 이미지이다.
구체적으로, 본원의 실시예에 따라 추출된 유산균의 세포 내(I) 및 세포 외 샘플(E1, E2)을 기체크로마토그래피-질량분석(GC/MS, G), 역상액체크로마토그래피-질량분석(RPLC/MS, LR) 및 친수성상호작용크로마토그래피-질량분석(HILIC/MS, LH)을 이용하여 분석하였다.
도 9 는 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 추출 용매 및 분석 방법에 따른 대사체 수를 나타낸 이미지이다.
구체적으로, 본원의 실시예에 따라 추출된 유산균의 I, E1 및 E2 샘플에서 총 263 개의 대사체가 추출되었다.
도 9 의 (A) 를 참조하면, 상기 추출된 대사체에는 73 개의 지방산, 42 개의 아미노산, 18 개의 탄수화물, 14 개의 뉴클레오 사이드, 10 개의 유기산, 9 개의 벤제노이드, 5 개의 페닐프로파노이드 및 15 개의 다양한 유기 화합물이 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.
도 9 의 (B) 를 참조하면, 32 개의 세포 내 특이적 화합물 및 144 개의 세포 외 특이적 화합물이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
도 9 의 (C) 를 참조하면, 68 개의 GC 특이적 화합물 및 168 개의 LC 특이적 화합물이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
도 10 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 대사체의 분석 방법을 나타내는 대사 경로의 개략도이다.
구체적으로, 12 시간 동안 세포 내 샘플의 대사체를 분석하였다.
이를 통하여, 아미노산, 비극성 지방산, 글리세롤 지질은 주로 GC/MS 및 RPLS/MS 에서 검출되고, 극성 지질의 경우 HILIC/MS 에서 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 GC/MS 는 대부분의 아미노산을 분석할 수 있어 표적 분석에 적합하며, HILIC/MS 의 경우, 분석 시간이 길기 때문에 아미노산을 포함한 비표적 분석에 적합함을 시사하는 것이다.
도 11 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 분석 방법에 따른 대사체 수를 나타낸 이미지이다.
구체적으로, 본원의 실시예에 따라 추출된 유산균의 세포 내 샘플(I)에서 119 개의 대사체가 추출되었다.
이를 통하여, 상기 세포 내 샘플(I)에서 추출된 대사체에는 27 개의 지방산, 24 개의 아미노산, 14 개의 탄수화물, 12 개의 뉴클레오 사이드, 7 개의 유기산, 4 개의 벤제노이드, 2 개의 페닐프로파노이드 및 5 개의 다양한 유기 화합물이 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 각 분석법에 대한 커버리지 비율은 G(52.1 %) > LR(41.7 %) > LH(33.1 %) 임을 확인할 수 있었고, 두 가지 방법을 결합하면 G + LR(86.6 %) 의 가장 높은 커버리지, G + LH(72.3 %) 및 LR + LH(59.7 %) 의 커버리지를 확인할 수 있었다.
그러나, 플랫폼이 G + LR 로 구성된 경우 글루코네이트, UMP, 구아닌, 하이포크 산틴과 같은 탄수화물 및 뉴클레오티드 화합물이 누락될 수 있으므로, 커버리지를 최대화하려면 세 가지 조합이 필요하다는 것을 시사하는 것이다.
도 12 는 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 분석 방법에 따른 대사체 수를 나타낸 이미지이다.
구체적으로, 본원의 실시예에 따라 추출된 유산균의 세포 외 샘플(E1, E2)에서 226 개의 대사체가 추출되었다. E1(도 12 의 (A) 및 (B)) 의 경우, 세포 외 샘플에 포함된 배양 배지의 설탕, 지질, 물 등 매트릭스를 포함하는 샘플이고, E2(도 12 의 (C) 및 (D)) 의 경우, 세포 외 샘플에서 액체-액체 분리를 이용하여 매트릭스를 제거한 샘플이다.
도 12 의 (A) 및 (B) 를 참조하면, 상기 세포 외 샘플(E1)에서 추출된 대사체에는 27 개의 지방산, 31 개의 아미노산, 16 개의 탄수화물, 12 개의 뉴클레오사이드, 9 개의 유기산, 4 개의 벤제노이드, 3 개의 페닐프로파노이드, 9 개의 다양한 유기 화합물이 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 각 분석법에 대한 커버리지 비율은 LH(45.8 %) > G(41.7 %) > LR(37.5 %) 임을 확인할 수 있었고, 두 가지 방법을 결합하면 G + LR(75.7 %) 의 가장 높은 커버리지, G + LH(74.3 %) 및 LR + LH(72.2 %) 의 커버리지를 확인할 수 있었다.
그러나, 플랫폼이 G + LR 로 구성된 경우 아미노산, 지방산, 탄수화물 및 핵산과 같은 광범위한 화합물이 누락될 수 있으므로, 커버리지를 최대화하려면 세 가지 조합이 필요하다는 것을 시사하는 것이다.
도 12 의 (C) 및 (D) 를 참조하면, 상기 세포 외 샘플(E2)에서 추출된 대사체에는 54 개의 지방산, 15 개의 아미노산, 3 개의 탄수화물, 9 개의 뉴클레오사이드, 8 개의 유기산, 9 개의 벤제노이드, 5 개의 페닐프로파노이드, 11 개의 다양한 유기 화합물이 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 각 분석법에 대한 커버리지 비율은 LH(54.9 %) > LR(53.5 %) > G (33.1 %) 임을 확인할 수 있었고, 두 가지 방법을 결합하면 LR + LH(83.8 %) 의 가장 높은 커버리지, G + LR(81.0 %)과 G + LH(71.8 %) 의 커버리지를 확인할 수 있었다.
이를 통하여, HILIC/MS 가 E2 에 대한 커버리지를 최대화하는 방법이라는 것을 확인할 수 있었다.
도 13 은 본원의 일 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법으로 분석한 분석 방법에 따른 대사체 수를 비교한 결과를 나타낸 이미지이다.
구체적으로, a, d, e 는 기체크로마토그래피-질량분석(GC/MS), b, c, af 는 역상액체크로마토그래피-질량분석(RPLC/MS), c, ef, g 는 친수성상호작용크로마토그래피-질량분석(HILIC/MS)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이를 통하여, 세포 내 샘플(I)에서 대사체를 추출하는 능력은 G(2,008) > LH(1,031) > LR(610) 임을 확인할 수 있었고, 세포 외 샘플(E1)에서 대사체를 추출하는 능력은 G(5,470) > LH(2,386) > LR(1,146) 임을 확인할 수 있었으며, 세포 외 샘플(E2)에서 대사체를 추출하는 능력은 LH(3,997) > G(2,643) > LR(2,191) 임을 확인할 수 있었다.
이는 본원의 실시예에 따른 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법은 GC/MS, RPLC/MS 및 HILIC/MS 를 기반으로 한 교차 플랫폼 접근 방식을 적용함으로써, 표적 분석과 비표적 분석의 포괄적인 프로파일링 결합 교차 플랫폼을 제공하는 장점이 있음을 시사하는 것이다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 유산균을 배양하는 단계;
    상기 배양된 유산균으로부터 복수의 대사체를 추출하는 단계;
    상기 추출된 복수의 대사체를 다중 질량 분광법을 이용하여 분석하는 단계;
    상기 다중 질량 분광법을 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환하는 단계;
    상기 수치에 다변량 통계 분석을 적용하여 상기 복수의 대사체를 그룹화하는 단계; 및
    상기 그룹화된 대사체의 표현형(phenotype)을 분석하는 단계;
    를 포함하는 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 그룹화하는 단계는 균주별 또는 배양 환경별로 차이를 나타내는 대사체를 그룹화하는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 표현형(phenotype)을 분석하는 단계는 질병 특이적인 표현형을 분석하는 것을 포함하는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 애니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum). 비피도박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 써모필룸 (Bifidobacterium themophilum), 및 비피도박테리움 아돌센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 스트렙토코쿠스 서모필루스(Streptococcus thermophilus) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균을 배양하는 단계는 배양 시간, 배양 온도, pH, 광량, 영양분, 기체상 환경, 혐기성 조건, 일부 혐기성 조건, 호기성 조건, 무산소성 조건 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양 환경을 변화시키면서 수행되는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 대사체는 아미노산, 탄수화물, 지질, 벤제노이드, 펩타이드, 비타민, 유기산, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 페닐프로파노이드, 유기 화합물, 핵산, 지방산 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 다중 질량 분광법은 액체크로마토그래피-질량분석(LC/MS), 기체크로마토그래피-질량분석(GC/MS), 역상액체크로마토그래피-질량분석(RPLC/MS), 친수성상호작용크로마토그래피-질량분석(HILIC/MS), 모세관 전기이동 질량 분석(CE-MS) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 다변량 통계 분석은 부분최소자승판별분석(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA), 계층적 군집분석(hierarchical clustering analysis, HCA), 주성분분석(principal component analysis, PCA), PCA 유래 스코어 플롯(score plot)분석, 부분최소제곱회기(partial least squares, PLS)분석 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    그룹화된 대사체의 표현형을 분석하는 단계는 시험관 내 시험(in vitro test), 동물시험, 기관시험, 세포시험, 생체 내 시험(in vivo test) 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 스크리닝 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 스크리닝 방법으로 스크리닝된 맞춤형 포스트바이오틱스를 포함하는 포스트바이오틱스 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물 제조 방법.
  11. 제 10 항에 따른 방법으로 제조된 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가 포함하는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 담체, 부형제 및 희석제는, 각각 독립적으로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가 포함하는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태로 투여되는 것인, 맞춤형 포스트바이오틱스 조성물.
  15. 복수의 유산균을 배양하는 단계;
    상기 배양된 유산균으로부터 복수의 사균체를 수득하는 단계;
    상기 복수의 사균체를 다중 질량 분광법을 이용하여 분석하는 단계;
    상기 다중 질량 분광법을 이용한 분석 결과를 통계 가능한 수치로 변환하는 단계;
    상기 수치에 다변량 통계 분석을 적용하여 상기 복수의 사균체를 그룹화하는 단계; 및
    상기 그룹화된 사균체의 표현형(phenotype)을 분석하는 단계;
    를 포함하는 맞춤형 사균체 스크리닝 방법.
  16. 제 15 항에 따른 스크리닝 방법으로 스크리닝된 맞춤형 사균체를 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 맞춤형 사균체 조성물 제조 방법.
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