KR20220039647A - 골격근 줄기세포 생성 및 질환 치료를 위한 방법, 조성물 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는, 특히 근원성 전구 세포의 집단을 생성하기 위한 방법, 조성물 및 키트, 및 이로부터 유래된 세포 집단을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 대상체의 근육 질환 또는 장애(예를 들어, 뒤센느 근육퇴행위축(DMD))을 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 포함된다.

Description

골격근 줄기세포 생성 및 질환 치료를 위한 방법, 조성물 및 키트

관련 출원의 상호 참고문헌

본 출원은 2019년 4월 3일 출원된 미국 가출원 제 62/828,973 호를 기초로 우선권을 주장한다. 이 출원의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.

정부 지원

본 발명은 국립 건강 연구소(NIH, National Institute of Health)에서 수여한 보조금 번호 R01AR070751에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.

본 발명은 근원성 전구 세포(myogenic progenitor cells)의 집단을 생성하는 것을 포함하는 골격근 세포 대체 요법에 관한 것이다.

골격근 세포 대체 요법의 주요 장애물은 손상 부위에 이식된 골격근 세포의 통합이 제한된다는 것이다. 대부분의 세포 이식은 환자가 살아 있는 동안 새로운 세포를 지속적으로 필요로 하기 때문에 여러 번 세포를 주사할 필요가 있다. 따라서, 근육 질환 및 증후군을 표적으로 하는 치료법을 제공하는 새로운 방법이 필요하다.

발명의 개요

본 발명에서는 특히 근원성 전구 세포의 집단 및 이의 유래된 자손을 생성하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 또한, 대상체에서 근육 질환 또는 장애(예를 들어, 뒤센느형 근육퇴행위축(DMD, Duchenne muscular dystrophy))을 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 포함된다.

시험관 내에서 다능성(pluripotent) 줄기세포로부터 유래된 근원성 전구 세포가 근육내 이식 시에 근육 줄기세포 기생 위치(niche)에 존재할 수 있고, 정지 상태(quiescent)가 되어 인간의 근육 줄기세포와 유사한 분자 발현 프로파일을 변화시킬 수 있다는 것이 본 발명에서 처음으로 입증되었다. 따라서, 그러한 근원성 전구 세포는 퇴행성 근육 소모성 질환(degenerative muscle wasting disease) 또는 병태를 치료하는 것과 같은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 세포의 적어도 30%가 생체 외 다능성 줄기세포로부터 유래된 PAX7+ 근원성 전구 세포(MPC)인 포유동물 세포의 집단이 제공된다.

일부 실시형태에서, PAX7+ MPC는 하나 이상의 콜린성 수용체 니코틴성 알파 1 (CHRNA1, Cholinergic receptor nicotinic alpha 1), 뉴로텐신 수용체 1 (NTSR1, Neurotensin receptor 1) 또는 프리즐드 부류 수용체 1 (FZD1, Frizzled class receptor 1)을 발현하고, 하나 이상의 프리즐드 부류 수용체 5 (FZD5), G 단백질 결합 수용체 37 (GPR37) 또는 G 단백질 결합 수용체 27 (GPR27)를 발현하지 않는다.

일부 실시형태에서, 다능성 줄기세포는 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 또는 배아 줄기세포(ESC), 특히 인간 다능성 줄기세포이다.

다른 실시형태는 이를 필요로 하는 환자에서 퇴행성 근육 소모성 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 본 발명의 세포 집단을 환자에게 주입하는 것을 수반한다. 퇴행성 근육 소모성 질환 또는 병태의 예로는 근육퇴행위축(예를 들어, 뒤센느형 근육퇴행위축(DMD)), 근병증(myopathy), 미토콘드리아 질환, 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 이온 채널 질환, 악액질(cachexia) 및 근육감소증(sarcopenia)이 있다.

또한, 근원성 전구 세포(MPC) 집단을 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 글리코겐 합성효소 키나제 3(GSK-3)의 선택적 억제제를 포함하는 배지에서 복수의 다능성 줄기세포를 분화시켜 분화된 세포를 수득하는 단계; 분화된 세포를 노치(Notch) 신호전달의 억제제로 처리하는 단계; 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)로 분화된 세포를 확장하여 PAX7(짝지어진 박스 단백질(paired box protein))을 발현하는 MPC 집단을 수득하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명에서는 근원성 전구 세포(MPC) 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 양태에서, 상기 방법은 대상체로부터 세포 집단을 수득하는 단계; 세포 집단으로부터 다능성 줄기세포(PSC) 집단을 생성하는 단계(여기서, 다능성 줄기세포 집단은 배아 줄기세포(ESC) 집단임); 및 다능성 줄기세포 집단으로부터 근원성 전구 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다.

실시형태에서, 본 발명의 방법은 다능성 줄기세포 집단이 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2) 및/또는 섬유아세포 성장 인자 8을 포함하는 세포 배양 배지에서 배양되는 것을 제공한다.

실시형태에서, 본 발명에 따른 방법의 근원성 전구 세포는 근원성 마커를 발현하며, 근원성 마커는 짝지어진 박스 단백질(PAX7) 또는 MyoD를 포함한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현한다.

다른 실시형태에서, 본 발명에 제공된 방법은 근원성 전구 세포 집단의 세포에서 PAX7 발현을 증가시키는 데 효과적인 세포 집단을 생성한다.

실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 생체 외에서, 예를 들어 적어도 약 30일 동안 배양 및 확장되는 다능성 줄기세포 집단을 생성한다. 다른 실시형태에서, 다능성 줄기세포 집단은 약 5일, 약 10일, 약 20일, 약 30일, 약 40일, 약 50일, 약 60일 또는 그 이상 동안 생체 외에서 배양된다.

다른 실시형태에서, 다능성 줄기세포 집단은 그들의 수를 확장하기 위해 생체 외에서 배양된다.

실시형태에서, 본 발명의 방법은 다능성 줄기세포 집단이 대상체로부터 수득된 세포 집단으로부터 생성되는 것을 제공한다.

다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 다능성 줄기세포 집단은 유도 다능성 줄기(iPS) 세포 집단이다.

추가 실시형태에서, 세포 집단은 대상체(예를 들어, 인간 대상체)로부터 수득된다. 추가 실시형태에서, 세포 집단은 생검(biopsy)을 통해 수득된다.

특정 양태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 근원성 전구 세포의 집단은 근육 질환 또는 장애(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서)를 치료 또는 예방하는데 사용된다. 본 발명의 양태에서, 방법은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 근원성 전구 세포 집단의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

실시형태에서, 근육 질환은 뒤센느형 근육퇴행위축(DMD)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 근육 장애는 근육 소모 장애를 포함하고, 예를 들어 근육 소모 장애는 악액질을 포함할 수 있다.

실시형태에서, 세포는 대상체에서 근육 질환이 시작되기 전에 단리된다. 다른 실시형태에서, 세포는 대상체에서 근육 질환이 시작된 후에 단리된다.

실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 다능성 줄기세포 집단은 대상체에게 투여되기 전에 그 수를 확장하기 위해 배양된다.

실시형태에서, 본 발명에서는 이를 필요로 하는 대상체에서 초기 근원성 마커의 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 근원성 전구 세포 집단의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명에서는 근원성 전구 세포를 생성하기 위한 키트도 제공하고, 키트는 세포 배양 배지 또는 세포 배양 배지들을 포함하고, 세포 배양 배지는 다능성 줄기세포(PSC) 집단을 배양하는 데 적합하다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키트는 무혈청 세포 배양 배지인 세포 배양 배지를 포함한다.

특허 또는 출원 파일은 칼라로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 칼라 도면이 포함된 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 특허청에서 제공될 것이다.
도 1a-1e는 인간 다능성 줄기세포(hPSC)로부터 유래된 PAX7::MPC가 생체 외에서 유지될 수 있고 근육 재생에 참여할 수 있음을 보여준다. 도 1a는 PAX7::GFP hPSC로부터 PAX7::GFP MPC로의 근원성 분화 계획을 보여주는 개략도이다. 도 1b는 근원성 분화 30일 후의 PAX7::GFP 인간 배아 줄기세포(hESC), H9 ESC 유래 근모세포(myoblastoma)(GFP 대조군 없음) 및 2회 계대된 후의 PAX7GFP MPC의 유세포 분석을 도시한다. GFP 발현 세포를 게이팅(gate)하였다. 도 1c는 세포 이식 계획을 보여주는 개략도를 도시한다. 도 1d는 PAX7::GFP hESCs 근원성 계통 분화 배양으로부터 4주 후 선별 및 확장 또는 비선별 세포에서의 huDYSTROPHIN 양성 섬유 및 huLAMINA/C 핵으로 표지된 인간 세포를 나타내는 TA의 단면의 대표적인 이미지를 도시한다. 도 1e는 전체 TA 영역 중 huDYSTROPHIN 섬유 양성 영역의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 2a 내지 2g는 PAX7::GFP 자손이 단리될 수 있고, 세포 레벨에서 정지 근육 줄기세포를 모방할 수 있음을 보여준다. 도 2a는 선별되지 않거나 선별되고 확장된 세포 이식 4주 후에 PAX7::GFP+ 세포 단리의 FAC 플롯의 이미지를 나타낸다. 대조군은 벡터 배지를 주입한 TA를 사용하였다. 도 2b는 단일 마우스로부터 단리된 모든 단핵 세포 (n(대조군)=4, n(선별 및 확장)=14, n(비 선별)=8) 중에서 PAX7::GFP 세포의 % 정량화 그래프를 도시한다. 도 2c 및 2d는 확장 전 및 후(B.E 및 P.E) 뿐만 아니라 이식 4주 후(생체 내) 근원성 분화 후 PAX7::GFP 세포로부터 단리된 세포의 단일 세포 Q PCR을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 2e는 PAX7::GFP MPC 이식 4주 후 이미지를 도시하고, TA는 절편(section)이었고, PAX7::GFP MPC 자손은 huLAMINA/C 및 PAX7 단백질의 이중 표지에 의해 식별될 수 있었다. 그들은 기저층(노란색 화살표) 아래에 위치하였다. 도 2f는 생체 내에서의 PAX7::MPC의 Pyronin Y 및 Hoescht 세포 주기 분석 뿐만 아니라 생체 내 PAX7::MPC가 낮은 DNA 및 RNA 함량을 가짐을 보여주는 생체 외 배양을 도시한다. 도 2g는 생체 내 Pax7::GFP 및 생체 외 PAX7::GFP MPC로부터 상이한 세포 주기에서 세포의 백분율을 나타내는 파이(pie) 그래프이다.
도 3a-3f는 이식 전 세포와 비교하여 생체 내에서 PAX7::GFP+ MPC의 단일 세포 RNA 시퀀싱을 보여준다. GFP 신호에 의해 단리된 세포. 도 3a는 생체 내, 이식전의 생체 외, 1개월 간 생체 외에서 배양된 PAX7::GFP+ MPC, 및 OCT4::GFP+ hESCs의 RNA 함유량의 그래프를 나타낸다. 도 3b는 시험관내, 생체 외에서의 PAX7::GFP+ MPC와 OCT4::GFP+ hESC 사이의 독특한 발현 RNA 발현 프로파일을 보여주는 PCA 플롯을 도시한다. 그러나, 1개월 간의 생체 외 배양은 유전자 발현 프로파일을 변경하지 않았다. 도 3c는 이식 전 생체 내 및 생체 외에서의 PAX7::GFP MPC에 비해 대부분의 유전자가 하향 조절되었고, 일부 유전자가 상향 조절되었음을 보여주는 화산 플롯(volcano plot)을 도시한다. 도 3d는 기능별로 클러스터링된 상향 및 하향 조절된 유전자의 이미지를 도시한다. 도 3e 및 3f는 상향 및 하향 조절된 유전자의 유전자 온톨로지(ontology) 농축을 보여주는 클러스터 분석의 이미지를 도시한다.
도 4a-4e는 PAX7::GFP MPC의 재손상(reinjury) 및 연속 이식의 이미지를 나타낸다. 도 4a는 재손상 실험의 계획을 도시한다. 도 4b는, 이식된 PAX7::MPC의 근육 재생 참여를 측정하기 위해, 2차 손상 후 4주째에 TA를 절단하고, huDYSTROPHIN 및 LAMINA/C로 염색한 것을 보여주는 이미지를 도시한다. 도 4c는 2차 손상 후 4주째 전체 TA 영역 중 huDYSTROPHIN 양성 영역의 정량화 그래프를 도시한다. 도 4d는 연속 이식의 계획을 도시한다. 도 4e는 PAX7::GFP+ MPC가 1차 수용 마우스로부터 단리되어 2차 수용 마우스에 이식되었음을 보여주는 이미지를 도시한다. 2차 수용 마우스의 TA를 절단하고 PAX7 및 huLAMINA/C를 사용하여 이식된 세포를 추적하였다. 공동 표지된 세포는 기저판(basal lamina)(화살표) 아래에 있는 것으로 밝혀졌다.
도 5a-5d는 PAX7::GFP MPC의 특성화를 도시한다. 도 5a는 CRISPR Cas9에 의한 PAX7::GFP hESC의 생성의 예시도이다. 도 5b는 확장 전(B.E.) 및 비-근모세포에서 확장 후(P.E) PAX7::GFP+ MPC로부터 PAX7, MYOD, GFP 및 NEUROGENIN의 상대적인 유전자 발현을 보여주는 막대 그래프이다. 도 5c는 PAX7::GFP MPC 생체 외 확장 배양에서 PAX7, MYOD 및 GFP 단백질 발현의 면역세포화학 사진을 도시하는 이미지이다. 도 5d는 PAX7::GFP MPC가 분화 조건 하에서 MyHC 및 DESMIN 항체에 의해 표지된 근관(myotubes)을 형성할 수 있음을 보여주는 이미지이다.
도 6은 이식 연구의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 마우스에 이식한 뒤 뒤센느의 생체 내 모델에서 트레드밀(treadmill) 연구의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a 및 8b는 이식 후 PAX7::GFP+ 세포의 인간 기원을 나타내는 오점 및 일련의 그래프를 나타낸다. 도 8a: 주사된 TA로부터 단리된 PAX7::GFP+ 세포의 기원을 결정하기 위해 인간 특이적 프라이머를 사용하여 게놈 PCR을 수행하였다. 도 8b: 단일 세포 RNA-seq 결과의 서열 비교는 주입된 TA로부터 단리된 PAX7::GFP+ 세포의 대부분이 인간 세포임을 나타낸다.
도 9는 이식된 세포가 생체 내 이식 4주 후에 정지 세포가 됨을 입증하는 플롯이다. 결과는 다음과 같이 표시된다: 마우스에 주사 후 1주; 마우스에 주사 후 2주; 마우스에 주사 후 3주; 및 마우스에 주사 후 4주. PAX7::GFP+ 세포를 이식 후 1주, 2주, 3주 및 4주에 수집하였다. SNE 플롯으로부터, 이식 후 1주차부터 PAX7::GFP+ 세포의 전사체는 시간이 지남에 따라 크게 변하지 않음을 알 수 있다.

본 발명에서는 특히 근원성 전구 세포의 집단, 및 제조된 근원성 전구 세포의 집단을 생성하기 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 또한 대상체의 근육 질환 또는 장애(예를 들어, 뒤센느형 근육퇴행위축(DMD)을 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 포함된다. 또한 본 발명에서는 소모성 장애, 암, 운동 제한이 있는 환자 및 운동선수의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

본 발명의 양태에서, 근육 소모 장애, 심장 질환, 운동 유발성 근력 약화, 또는 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 양태에서, 용도에는 골격근 강도의 개선이 유익할 수 있는 질병 또는 병태가 포함될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 질환 또는 병태는 AIDS로 인한 근육 소모, 연령 관련 근육감소증, 암 악액질, 쿠싱(Cushing) 증후군, 진성 당뇨병(diabetes mellitus) 및 패혈증(sepsis)을 포함할 수 있다. 추가로, 근육위축성 측삭 경화증(ALS, amytrophic lateral sclerosis) 및 뒤센느형 근육퇴행위축(DMD)을 앓고 있는 환자의 근력 향상이 고려되고 있다. 본 발명의 추가 양태에서, 본 발명에서 제공된 방법은, 예를 들어 걷기 또는 달리기 속도를 증가시키는 것과 같은 신체 활동을 증가시키기 위해 건강한 환자에서 이용될 수 있다.

골격근 세포 대체 요법의 주요 장애물은 손상 부위에 이식된 골격근 세포의 통합이 제한되는 것이다. 마우스 골격근 줄기세포를 이식하면 운동 기능이 향상되지만, 인간 배아 PAX7+ 세포가 기능을 할 수 있고, 출생 후 생체 내 환경에서 연속적으로 재확장하고, 세포 성숙 단계를 전환할 수 있는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

본 발명에서는, 생체 내 환경의 기생 위치 영역에서 정지 및 기능적 국소 골격근 줄기세포로서 생존할 수 있는 인간 PAX7::GFP+ 세포를 생성하기 위한 신규한 접근법을 제공한다. 본 발명에서, hPSC는 근원성 계통으로 직접 분화되었고 근원성 전구 세포(PAX7::GFP MPC)를 발현하는 PAX7::GFP를 단리하였다.

또한, 이들 세포가 생체 외에서 유지되고 확장될 수 있다는 것이 제공된다. 생체 내 이식 시에, 그들은 근섬유에 융합될 뿐만 아니라 기저층(basal lamina) 아래에 있는 단핵 PAX7 발현 세포가 되어 근육 재생에 참여할 수 있다. PAX7::GFP MPC의 자손을 추적하고 GFP 발현으로 단리하였다. 단일 세포 RNA 서열 및 세포 측정과 함께, 이들 세포로부터 독특한 정지 근육 줄기세포 유전자 특성이 관찰되었다. 재손상 및 연속 이식 실험을 통해, 자가 재생 및 재생 능력이 더욱 확인되었다. 본 발명에서는 단일 세포 실험 접근법을 이용하여 생체 내에서 hPSC 유래 근원성 전구 세포로부터 정지 근육 줄기세포로의 전환을 입증하였다.

일반 정의

다음 정의는 본 발명 대상을 이해하고 첨부된 특허 청구범위를 구성할 목적으로 포함된다. 본 명세서에 사용된 약어는 화학 및 생물 분야 내에서 통상적인 의미를 갖는다.

본 발명의 다양한 실시형태 및 양태가 본 명세서에 도시되고 설명되지만, 그러한 실시형태 및 양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 이루어질 수 있을 것이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다.

본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직화를 위한 것이며 설명된 발명 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특허, 특허 출원, 기사, 책, 매뉴얼 및 논문을 포함하되 이에 국한되지 않는 출원에서 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 명시적으로 통합된다.

본 명세서에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는, 달리 정의되지 않는 한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 싱글톤(Singleton)등, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 제2 판, J. Wiley & Sons(New York, NY 1994); 삼브룩(Sambrook) 등, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, NY 1989)을 참조한다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 하기 정의는 본 명세서에서 자주 사용되는 특정 용어의 이해를 돕기 위해 제공된 것으로, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

실시형태에서, "근육 질환" 또는 "근육 증후군" 또는 "근육 병태" 또는 "근육병증(myopathy)"은 시간이 지남에 따라 골격근의 약화 및 파괴를 증가시키는 장애이다. 예를 들어, 근육퇴행위축(MD)은 일반적으로 9개의 주요 범주 또는 유형으로 분류되는 적어도 30가지의 서로 다른 유전적 장애를 포함한다. MD는 점진적인 근력 약화, 근육 단백질 결함, 시간 경과에 따른 근육 섬유 및 조직 파괴를 특징으로 하는 유전성, 진행성, 퇴행성 장애 그룹을 지칭한다. 많은 경우에, 조직학적 사진은 섬유 크기, 근육 세포 괴사 및 재생, 그리고 종종 결합 및 지방 조직의 증식 변화를 보여준다. 질병은 주로 골격근 또는 수의근(voluntary muscles)을 표적으로 한다. 그러나 심장 근육 및 기타 비자발적 근육도 특정 형태의 근육퇴행위축에 영향을 받는다.

MD의 가장 흔한 유형은 일반적으로 4세 전후로 시작하는 남성에게 영향을 미치는 뒤센느 근육퇴행위축(DMD)이다. 다른 유형에는 베커(Becker) 근육퇴행위축, 안면견갑상완(facioscapulohumeral) 근육퇴행위축 및 근육긴장퇴행위축(myotonic dystrophy)이 있다. 이는 근육 단백질을 만드는 데 관여하는 유전자의 돌연변이 때문이다. 이것은 부모로부터 결함을 물려받거나 초기 발달 중에 발생하는 돌연변이로 인해 발생할 수 있다. 장애는 X-연관 열성, 상염색체 열성 또는 상염색체 우성일 수 있다. 근육퇴행위축의 추가적인 예로는 뒤센느 근육퇴행위축, 베커 근육퇴행위축, 사지 연결(limb-girdle) 근육퇴행위축, 안면견갑상완 근육퇴행위축, 안인두(Oculopharyngeal) 근육퇴행위축, 에머리-드라이푸스(Emery-Dreifuss) 근육퇴행위축, 후쿠야마형(fukuyama-type) 선천성 근육퇴행위축, 미요시(Miyoshi) 근육퇴행위축, 울리히(Ullrich) 선천성 근육퇴행위축, 슈타이너트(Steinert) 근육퇴행위축이 있다.

뒤센느 근육퇴행위축(DMD)은 3,000명의 남성 중 약 1명에게 영향을 미치는 가장 흔한 유전성 치명적인 아동기 근육퇴행위축이다. DMD가 있는 어린이는 일반적으로 11세 또는 12세에 휠체어에 의존하게 되며 영향을 받은 개인은 일반적으로 생후 2~30세에 사망한다. DMD는 X 염색체(Xp21)에 위치한 디스트로핀 유전자의 돌연변이로 인해 발생하며, 이에 수반되는 근섬유 파괴와 함께 디스트로핀 단백질이 손실된다. 골격 근섬유 무결성을 유지하는 데 디스트로핀 단백질의 역할은 일반적으로 잘 알려져 있지만, 근섬유 파괴 및 근육위축성 근육 손실을 초래하는 정확한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 디스트로핀 유전자의 발견과 단백질 생성물의 후속적인 특성화는 근섬유 분절(sarcomere)과 세포골격을 주변 세포외 기질에 연결하는 통합 근육속막(sarcolemmal) 단백질로서 디스트로핀을 확립하였다. 디스트로핀의 국소화는 근육의 완전성을 유지하는 것과 동의어이며, 그것의 부재(DMD에서 입증됨)는 막 취약성, 수축 유도 근섬유 손상 및 사망으로 이어진다.

현재 DMD 치료

DMD에 대한 알려진 치료법은 없으며, 진행 중인 의학적 필요성이 규제 당국에 의해 인식되고 있다. 치료는 일반적으로 특정 설문지를 사용하여 측정할 수 있는 삶의 질을 최대화하기 위해 증상의 발병을 제어하는 것을 목표로 하며 다음을 포함한다.

프레드니솔론(prednisolone) 및 데플라자코르트(deflazacort)와 같은 코르티코스테로이드는 최대 2년까지 근력과 기능을 단기적으로 개선한다. 코르티코스테로이드는 또한 보행을 연장하는 데 도움이 되는 것으로 보고되었다.

근력을 증가시키지만 질병 진행을 변경하지 않는 β2 작용제(예를 들어, β2 작용제인 살부타몰(예를 들어, 알부테롤)이 사용될 수 있음).

수영과 같은 부드럽고 자극적이지 않은 신체 활동이 권장된다. 비활동(침대 휴식 등)은 근육 질환을 악화시킬 수 있다.

물리 치료는 근력, 유연성, 및 기능을 유지하는 데 도움이 된다.

교정기 및 휠체어와 같은 정형외과 기기는 이동성과 자가 관리 능력을 향상시킬 수 있다. 잠자는 동안 발목을 제자리에 고정하는 형태에 맞는 탈착식 다리 받침대는 구축(contractures)의 발병을 지연시킬 수 있다.

질병이 진행됨에 따라 적절한 호흡 지원이 중요하다.

심장 문제는 심박 조율기가 필요할 수 있다.

아탈루렌과 같은 약물도 제공될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "소모 증후군"은 근육량 및/또는 근력의 손실을 초래하거나, 이를 특징으로 하거나, 동반하는 질환 또는 병태이다. 그러한 질병의 예로는 AIDS; 암; 근육 위축을 초래하는 탈수초(demyelinating) 장애(예를 들어, 다발성 경화증, 근육위축성 측삭 경화증, 페닐케톤뇨증, 테이-삭스(Tay-Sachs)병, 헐러 증후군(Hurler's syndrome) 및 백색질형성 장애와 같은 선천성 대사 장애, 감염 후(postinfections) 뇌척수염, 바이러스성 뇌염, 무균성 뇌수막염 및 HTLV-관련 척수병증); 비정상 조직(dystrophic) 질환(예를 들어, 근육퇴행위축, 뒤센느 이상증, 란도우지-데제린 (Landouzy-Dejerine) 근육퇴행위축, 및 사지 연결 근육퇴행위축); 전신 및 국소 근 긴장이상; 섭식 장애(예를 들어, 거식증 및 폭식증); 만성 질환으로 인한 악액질 또는 소모; 및 혈관 장애(예를 들어, 경색)가 있다. 근육량 및/또는 근력의 손실은 특정 유형의 화학요법을 받는 대상체에서 또는 노화, 영양실조 또는 근육 약화(deconditioning)의 결과로 발생할 수도 있다. 근육 약화는 우주 공간과 같은 무중력 환경에서 장기간을 경험하거나, 장기간 침대에 누워 있거나, 깁스와 같이 특정 근육이나 근육 그룹이 고정된 개인에서 일반적으로 발생한다. 장기간의 침상 안정이 필요한 개인은 만성 질환이 있는 사람과 이를테면 혈종이나 압박 등으로 인한 척수 손상에 의한 일시적인 마비가 있는 사람을 포함한다. 실시형태에서, 소모성 장애는 악액질(예를 들어, 화학요법 유발 악액질), 노화 관련 악액질 또는 스포츠 의학 관련이다.

"악액질"은 질병에 의해 또는 질병의 부작용으로 야기되는 쇠약 및 체중 감소이다. 심장 악액질, 즉 심장 및 골격근 모두의 근육 단백질 소모는 울혈성 심부전의 특징이다. 암 악액질은 고형 종양 및 혈액 악성 종양(hematological malignancies)이 있는 환자에서 발생하는 증후군으로, 지방 조직(adipose tissue)과 제지방(lean) 근육량의 대량 감소와 함께 체중 감소로 나타난다. 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS). 악액질은 AIDS의 비교적 흔한 임상 증상인 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 관련 근육병 및/또는 근병증/소모이다. HIV 관련 근병증 또는 근육 약화 또는 소모가 있는 개인은 일반적으로 상당한 체중 감소, 전신 또는 근위 근육 약화, 압통 및 근육 위축을 경험한다.

본 명세서에 기재된 "샘플", "환자 샘플", "생물학적 샘플" 등은 환자, 개인 또는 대상체로부터 얻어진 다양한 샘플 유형을 포함하며, 진단, 예후 및/또는 모니터링 분석 진단에 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 생물학적 샘플은 세포, 단백질 또는 세포의 막 추출물, 혈액 또는 복수액 또는 뇌액(예를 들어, 뇌척수액)과 같은 생물학적 유체를 포함할 수 있다. 고형 생물학적 샘플의 예로는 중추신경계, 뼈, 유방, 신장, 자궁경부, 자궁내막, 두경부, 담낭, 이하선, 전립선, 뇌하수체, 근육, 식도, 위, 소장, 결장, 간, 비장, 췌장, 갑상선, 심장, 폐, 방광, 지방, 림프절, 자궁, 난소, 부신, 고환, 편도선, 흉선 및 피부의 조직으로부터 채취한 샘플, 또는 종양에서 채취한 샘플이 있으나 이들에 국한되지 않는다. "체액 샘플"의 예로는 혈액, 혈청, 정액, 전립선액, 정액, 소변, 대변, 타액, 가래, 점액, 골수, 림프 및 눈물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

환자 샘플은 건강한 대상체, 질병에 걸린 환자 또는 대상체의 근육 질환 또는 장애(예를 들어, 뒤센느 근육퇴행위축(DMD))의 관련 증상이 있는 환자로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상체로부터의 "샘플"(예를 들어, 시험 샘플)은 근육 질환 또는 장애가 있는 대상체에서 본 발명의 단백질 마커의 상승된 수준을 함유할 것으로 예상될 수 있는 샘플을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "제공된" 샘플은 분석을 수행하는 사람(또는 기계)에 의해 수득될 수 있거나, 다른 사람이 수득하여 분석을 수행하는 사람(또는 기계)에게 이전될 수 있다.

특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 자가(autologous), 동종이계(allogeneic), 일배체형(haplotype) 일치, 일배체형 불일치, 일배체-동일, 이종(xenogeneic), 세포주 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 공급원으로부터 수득된다.

또한, 환자로부터 채취한 샘플을 분할하여 일부만을 진단에 사용할 수도 있다. 또한, 샘플 또는 그 일부는 추후 분석을 위해 샘플을 유지하는 조건에서 보관할 수 있다. 그 정의는 구체적으로 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액체 샘플(말초혈액, 혈청, 혈장, 제대혈, 양수, 뇌척수액, 소변, 타액, 대변 및 활액(synovial fluid)을 포함하나 이에 국한되지 않음), 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 이로부터 유래된 세포와 같은 고형 조직 샘플 및 이들의 자손을 포함한다. 특정 실시형태에서, 샘플은 골수 또는 혈액 샘플을 포함한다.

"샘플"의 정의는 또한 특정 세포 집단에 대해 원심분리, 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피, 시약 처리, 세척 또는 농축과 같은 조달 후 임의의 방식으로 조작된 샘플을 포함한다. 용어는 임상 샘플을 추가로 포함하고, 또한 배양 중인 세포, 세포 상청액, 조직 샘플, 기관 등을 포함한다. 샘플은 또한 면역조직화학에 의한 병리학적 분석 또는 연구를 위해 준비된 임상 또는 병리학적 생검으로부터 제조된 블록과 같은 신선 동결 및/또는 포르말린 고정, 파라핀 포매(embedded) 조직 블록을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 "마커"는 세포의 특징 및/또는 표현형(phenotype)을 설명하는 데 사용된다. 마커는 관심 특성을 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있다. 마커는 특정 세포에 따라 달라진다. 마커는 특정 세포 유형의 세포 또는 세포 유형에 의해 발현되는 분자의 형태학적, 기능적 또는 생화학적(효소적) 특성 여부에 무관한 특성이다. 바람직하게는, 이러한 마커는 단백질이고, 보다 바람직하게는 항체 또는 당업계에서 이용 가능한 다른 결합 분자에 대한 에피토프를 보유한다. 그러나, 마커는 단백질(펩티드 및 폴리펩티드), 지질, 다당류, 핵산 및 스테로이드를 포함하지만 이에 국한되지 않는 세포에서 발견되는 임의의 분자로 구성될 수 있다. 형태학적 특징 또는 특성의 예에는 모양, 크기, 핵 대 세포질 비율이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 기능적 특성 또는 특성의 예에는 특정 기질에 부착하는 능력, 특정 염료를 포함하거나 배제하는 능력, 특정 조건에서 이동하는 능력, 특정 계통을 따라 분화 또는 역분화하는 능력이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 마커는 당업자에게 이용 가능한 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 마커는 형태학적 특징이 없거나 단백질, 지질 등이 없을 수도 있다. 마커는 폴리펩티드의 존재 및 부재 및 기타 형태학적 특성의 고유한 특성 패널의 조합일 수 있다.

실시형태에서, 근육 장애는 "근육감소증"이다. 근육감소증은 노인 및 만성 질환 환자를 괴롭히는 쇠약하게 하는 질병이며 근육량과 기능의 손실을 특징으로 한다. 합성대사(anabolic) 스테로이드는 연령, 질병 및 외상 손상과 관련된 제지방 체중 감소(골격 근육량 감소)를 예방 및/또는 역전시킬 수 있다는 것이 입증되었다. 또한, 증가된 제지방 체중은 특정 근육 소모 장애에 대한 이환율(morbidity) 및 사망률 감소와 관련이 있다.

본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 "근육 소모" 또는 "근육성 소모"라는 용어는 근육량의 점진적인 손실 및/또는 근육의 점진적인 약화 및 퇴화를 의미하며, 여기에는 운동을 조절하는 골격근 또는 수의근, 심장을 조절하는 심장 근육과 평활근이 포함된다.

본 명세서에 사용된 근육위축(muscular atrophy)은 근육량의 부분적 또는 완전한 손실을 지칭한다. 근육퇴행위축은 진행성 근육 약화 및 위축과, 근육 세포 및 조직의 죽음을 수반하는 근육 질환이다. 근육위축은 예를 들어 근육위축을 수반하는 근력 약화, 특히 근위 근육의 근육량 감소 또는 근력 약화, 근육 기능 감소, 근육량 감소 등을 수반하는 질병 또는 병태를 포함할 수 있다. 근육위축 또는 근육퇴행위축은 장기간의 침상 안정으로 인한 근육위축, 치료용 보조 기구로 인한 근육위축, 또는 악액질, 근육위축성 측삭 경화증, 척추 진행성 근육위축, 근육퇴행위축 또는 이들의 조합으로 인한 근육위축일 수 있다.

"근육 줄기세포"는 세포간 융합을 통해 다핵 근섬유를 형성하도록 수임된(committed), 자손 단핵 근모세포로서 생성하는 자가 재생 단핵 세포를 의미한다. 본 명세서에서는 골격근, 평활근 또는 심장근을 생성하는 근육 줄기세포가 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "근육 세포"는 근육 조직에 기여하는 임의의 세포를 지칭한다. 근모세포, 위성 세포, 근관 및 근원섬유 조직은 모두 "근육 세포"라는 용어에 포함되며, 이들 모두는 본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있다. 근육 세포 효과는 골격, 심장 및 평활근 내에서 유도될 수 있다. 성체 척추동물의 근육 조직은 "위성 세포"라고 불리는 예비 근모세포에서 재생된다. 위성 세포는 근육 조직 전체에 분포되어 있으며, 부상이나 질병이 없는 경우 유사분열적으로(mitotically) 정지한다. 근육 손상 후 또는 질병에서 회복하는 동안, 위성 세포는 세포 주기에 다시 들어가 증식하고, 1)기존 근육 섬유로 들어가거나, 또는 2)새로운 근육 섬유를 형성하는 다핵 근관으로 분화된다. 근모세포는 궁극적으로 대체 근육 섬유를 생성하거나 또는 기존 근육 섬유와 융합하여 수축 장치 구성 요소의 합성에 의해 섬유 둘레를 증가시킨다. 이 과정은 예를 들어 유도된 근섬유 퇴화 후에 포유동물에서 발생하는 거의 완전한 재생으로 설명된다. 근육 전구 세포는 증식하고 함께 재생하는 근육 섬유를 융합한다.

본 명세서에 사용된 "근육 성장"은 섬유 크기의 증가 및/또는 섬유 수의 증가에 의해 발생할 수 있는 근육의 성장을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 근육의 성장은 A) 습윤 중량의 증가, B) 단백질 함량의 증가, C) 근섬유 수의 증가, 또는 D) 근섬유 직경의 증가에 의해 측정될 수 있다. 근섬유의 성장 증가는 직경이 단면의 타원의 단축으로 정의되는 직경의 증가로 정의될 수 있다.

본 명세서에 기재된 "근원성" 세포는 근육 세포 또는 섬유의 기원과 관련된 세포이다. 다양한 분자 마커는 근육 분화의 중기 및 후기 단계에 특이적인 것으로 알려져 있다. 예를 들어, C2C12 세포에서 미오신(myosin)과 MRF4는 근형성의 후기 단계를 표시하고 주로 근관에 국한되는 반면, 미오제닌(myogenin)과 네스틴(nestin)은 근형성의 중간 단계를 표시하고 모든 근관과 많은 수임된 근모세포에서 발견된다.

본 명세서에 사용된 "위성 세포" 또는 "근위성 세포"는 성숙한 근육에서 발견되는 세포질이 거의 없는 작은 다능성 세포를 지칭한다. 위성 세포는 골격근 세포의 전구체이며, 골격근 세포를 발생시키는 위성 세포 또는 근모세포를 발생시킬 수 있다. 그들은 부모 근육 섬유에 추가 근핵(myonuclei)을 제공하거나 정지 상태로 복귀할 가능성이 있다. 활성화되면 위성 세포는 세포 주기에 다시 들어가 근모세포로 증식하고 분화할 수 있다. 위성 세포는 내인성 위성 세포와 공유될 수 있는 하나 이상의 기능을 나타낼 수 있으며, 여기에는 위성 세포 기생위치를 다시 채우는 능력, 근육 재생을 유도하는 능력, 유전자 마커의 적절한 발현, 당단백질의 적절한 발현, 배양의 확장성을 포함하지만 이들에 국한되지 않는다.

본 명세서에 사용된 근육의 "위축" 또는 "소모"는 근섬유 둘레에서의 상당한 손실을 지칭한다. 현저한 위축이란 질병이 없거나, 손상되지 않았거나, 일반적으로 사용되는 조직에 비해 질병이 있거나 손상되었거나 사용되지 않은 근육 조직에서 근섬유 직경이 10% 감소하는 것을 의미한다.

"질병"이라는 용어는 포유동물의 정상적인 건강에서 벗어난 모든 일탈을 말하며, 질병 증상이 존재하는 병태뿐만 아니라 일탈(예를 들어, 근육 기능 장애 또는 근육 장애)이 발생한 병태를 포함하지만, 아직 증상이 나타나지 않은 것을 지칭한다.

"환자" 또는 "필요로 하는 대상체"는 나타낸 장애로 고통 받거나 고통 받을 수 있는 동물계의 살아있는 구성원을 지칭한다. 실시형태에서, 대상체는 자연적으로 질병의 고통 받을 수 있는 개인을 포함하는 종의 구성원이다. 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 포유동물의 비제한적인 예로는 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트), 영장류(예를 들어, 여우원숭이, 부시베이비, 원숭이, 유인원 및 인간), 토끼, 개(예를 들어, 반려견, 안내견 또는 경찰견, 군견, 경주용 견 또는 쇼견과 같은 작업견), 말(예를 들어, 경주마 및 작업마), 고양이(예를 들어, 길들여진 고양이), 가축(예를 들어, 돼지, 소, 당나귀, 노새, 들소, 염소, 낙타, 양), 및 사슴을 포함한다. 실시형태에서, 대상체는 인간이다.

용어 "대상체", "환자", "개인" 등은 제한하려는 것이 아니며, 일반적으로 호환적일 수 있다. 즉, "환자"로 기술된 개인이 반드시 특정 질병을 갖고 있는 것은 아니며 단지 의학적 조언을 구하는 것일 수 있다.

"함유하는", "포함하는" 또는 "~을 특징으로 하는"과 동의어인 이행적(transitional) 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 개방형 표현이며, 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 대조적으로, 이행 문구 "구성된"은 청구범위에 명시되지 않은 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "본질적으로 구성되는"이라는 이행 문구는 청구된 발명의 "기본적이고 새로운 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는" 특정 재료 또는 단계에 대한 청구 범위를 제한한다.

본 명세서 및 청구범위의 설명에서, "~중 적어도 하나" 또는 "~중 하나 이상"과 같은 문구는 요소 또는 특징의 접속 목록이 뒤따를 수 있다. "및/또는"이라는 용어는 2 이상의 요소 또는 기능의 목록에서도 나타날 수 있다. 그것이 사용되는 문맥에 의해 암시적으로 또는 명시적으로 모순되지 않는 한, 그러한 문구는 나열된 요소 또는 특징 중 하나를 개별적으로 또는 인용된 요소 또는 특징을 다른 인용된 요소 또는 특징과 조합하여 의미한다. 예를 들어 "A와 B 중 적어도 하나", "A와 B 중 하나 이상" 및 "A 및/또는 B"는 각각 "A 단독, B 단독 또는 A 및 B 모두"를 의미한다. 3개 이상의 항목을 포함하는 목록에도 유사한 해석이 적용된다. 예를 들어, "A, B, C 중 적어도 하나", "A, B 및 C 중 하나 이상" 및 "A, B 및/또는 C"는 각각 "A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 모두, A 및 C 모두, B 및 C 모두, 또는 A 및 B 및 C 모두"를 의미한다. 또한, 상기 및 청구범위에서 용어 "기반하여"의 사용은 인용되지 않은 특징 또는 요소도 허용되도록 "적어도 부분적으로 기반하여"를 의미한다.

파라미터 범위가 제공되는 경우, 그 범위 내의 모든 정수 및 이의 1/10도 본 발명에 의해 제공되는 것으로 이해된다. 예를 들어, "0.2 내지 5 mg"은 5.0 mg 이하의 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg 등을 개시한다.

본 명세서의 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, "a", "an" 및 "the"의 의미는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 병태, 질병 또는 장애 또는 병태, 질병 또는 장애와 관련된 증상의 "치료하는" 또는 "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는, 하나 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선; 병태, 장애 또는 질병의 정도 감소; 병태, 장애 또는 질병 병태의 안정화; 병태, 장애 또는 질병의 발병 예방; 병태, 장애 또는 질병의 확산 방지; 병태, 장애 또는 질병 진행의 지연 또는 감속; 병태, 장애 또는 질병 발병의 지연 또는 감속; 병태, 장애 또는 질병 상태의 개선 또는 완화: 및 부분적이거나 전체적이거나 무관하게 진정을 포함하나 이들에 국한되지 않는다. "치료하는"은 또한 병태, 장애 또는 질병의 진행을 억제하고, 병태, 장애 또는 질병의 진행을 일시적으로 늦추는 것을 의미할 수 있지만, 일부 경우에는 병태, 장애 또는 질병의 진행을 영구적으로 중단시키는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료하다" 및 "예방하다"라는 용어는 절대적인 용어로 의도되지 않는다. 실시형태에서, 치료는 확립된 질병, 병태, 또는 질병 또는 병태 증상의 중증도의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소를 지칭할 수 있다. 실시형태에서, 질병을 치료하는 방법은 대조군과 비교하여 대상체에서 질병의 하나 이상의 증상이 10% 감소하는 경우 치료인 것으로 간주한다. 따라서 감소는 기본 또는 병태 수준에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 10%와 100% 사이의 임의의 백분율 감소일 수 있다. 치료가 반드시 질병, 상태, 또는 질병 또는 병태 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하는 것은 아님을 이해해야 한다. 실시형태에서, 완화, 감소 또는 억제에 대한 기준은 대조군 수준과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 변화를 포함하고, 이러한 용어는 완전한 제거를 포함할 수 있지만 반드시 포함하지는 않는다. 실시형태에서, 질병의 중증도는, 예를 들어 투여 전의 개체 또는 치료를 받지 않은 대조군 개체와 비교하여 적어도 10% 이상 감소된다. 일부 양태에서, 질병의 중증도는 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 또는 90% 감소되거나, 일부 경우에는 표준 진단 기술을 이용하여 더 이상 검출할 수 없게 된다.

용어 "유효량", "유효 용량" 등은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 원하는 효과를 달성하기에 충분한 제제의 양을 지칭한다. 실시형태에서, 세포 또는 치료 화합물의 양을 언급할 때 "유효한"이라는 용어는 본 발명의 방식으로 사용될 때의 합리적인 이익/위험에 비례한, 과도한 부작용(예를 들어, 독성, 자극, 또는 알레르기 반응) 없이 개선 또는 원하는 치료 반응을 나타내기에 충분한 세포 또는 화합물의 양을 의미할 수 있다. 실시형태에서, 원하는 세포 집단의 생성을 언급할 때의 용어 "유효한"은, 특히 하나 이상의 화합물이 결여된 배양 조건과 비교하여, 원하는 세포 집단 구성원의 생성을 초래하거나 촉진하기에 충분한 하나 이상의 화합물의 양을 지칭할 수 있다.

근형성 및 골격근

근 형성은 특히 배아 발달 동안 근육 조직의 형성이다. 근육 섬유는 일반적으로 근관이라고 불리우는 다핵 섬유로 근모세포의 융합을 형성한다. 배아의 초기 발달에서 근모세포는 증식하거나 근관으로 분화할 수 있다. 생체 내에서 이 선택을 제어하는 것은 일반적으로 불분명하다. 세포 배양에 놓이면, 충분한 섬유아세포 성장 인자(FGF) 또는 다른 성장 인자가 세포를 둘러싼 배지에 존재하는 경우 대부분의 근모세포는 증식한다. 성장 인자가 고갈되면, 근모세포는 분열을 멈추고 근관으로의 최종 분화를 야기한다. 근모세포 분화는 단계적으로 진행된다. 제1 단계는 세포 주기 종료와 특정 유전자의 발현 시작을 포함한다. 분화의 제2 단계는 근모세포가 서로 정렬되는 것을 포함한다. 연구에 따르면, 래트와 병아리의 근모세포도 서로를 인식하고 정렬할 수 있으며, 이는 관련된 메커니즘의 진화적 보존을 시사한다. 제3 단계는 실제 세포 융합 자체이다. 이 단계에서 칼슘 이온의 존재가 중요하다. 마우스에서, 융합은 멜트린(meltrins)이라고 하는 일 세트의 금속단백분해효소(metalloproteinase)와 아직 조사 중인 다양한 다른 단백질의 도움을 받는다. 융합은 원형질막으로 액틴을 모집한 다음, 밀접하게 배치되고 이후에 빠르게 넓어지는 기공의 생성을 포함한다.

배 발생(embryogenesis) 동안, 몸분절(somites) 중의 피부근육 분절(dermomyotome) 및/또는 근육분절(myotome)은 예상되는 골격근으로 진화할 근원성 전구 세포를 함유한다. 피부근육 분절 및/또는 근육분절의 결정은 T-box 계열의 구성원인 tbx6, ripply1 및 mesp-ba를 포함하는 유전자 조절 네트워크에 의해 조절된다. 골격 근육 형성은 근원 전구 세포를 근섬유로 분화시키기 위해 다양한 유전자 서브세트의 엄밀한 규제에 의존하고 있다. 기본 나선-루프-나선(bHLH, basic helix-loop-helix) 전사 인자인 MyoD, Myf5, 미오게닌(myogenin) 및 MRF4는 이의 형성에 중요하다. MyoD 및 Myf5는 근원성 전구체 근모세포로, 그 다음 미오게닌으로 분화시키게 하고, 이는 근모세포를 근관으로 분화시킨다. MRF4는 근육 특이적 프로모터의 전사를 차단하는 데 중요하여, 골격근 전구세포가 분화되기 전에 성장하고 증식할 수 있다.

근원성 전구세포

성체 포유동물 종의 골격근은 성장, 훈련 및 부상과 같은 생리학적 요구에 적응하는 능력을 나타낸다. 이러한 적응이 발생하는 과정은 성체 골격근에 상주하고 위성 세포라고 하는 소수의 단핵 세포 집단에 기인한다. 골격근 섬유는 최종적으로 분화되며 이러한 다핵 세포의 핵은 DNA 합성 또는 유사분열을 할 수 없다. 근섬유 수 또는 근섬유 핵 수의 증가는 "근모세포"로 알려진 근육 전구체 세포의 증식 및 후속 분화로 인한 것이다. 성체에서, 근모세포는 유사분열적으로 정지된 예비 전구체 집단으로 남아 있으며, 이는 근육 손상 시 세포 주기에 다시 진입하고, 여러 차례의 증식을 겪으며 후속적으로 분화하고 세포 주기로부터 영구적으로 나갈 수 있다. 분화 시에, 분화된 근모세포는 서로 융합하거나 기존의 근육 섬유와 융합하는 능력을 획득하고, 또한 근육 특이적 근원섬유 및 수축성 단백질 세트의 발현을 시작한다. 정지 근원성 전구 세포는 근육속막(sarcolemma)과 기저 판 사이의 함입부(indentation)에 상주하기 때문에 성체 근섬유와 물리적으로 구별된다. 근육 손상의 경우, 이러한 세포 중 일부는 전구 세포로 남아 있는 반면, 다른 세포는 새로운 근육 섬유로 분화된다. 근외상(myotrauma)과 같은 자극에 응답하여, 근원성 전구 세포는 활성화되고, 증식하고, 근원성 마커를 발현한다. 궁극적으로 이러한 세포는 기존의 근섬유와 융합하거나 손상된 골격근이 재생되는 동안 새로운 근섬유를 형성하기 위해 융합된다.

근원성 전구 세포( MPC ) 집단의 생성 방법

본 발명에서는 근원성 전구 세포(MPC)의 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 MPC 집단을 생성하기 위해 적합한 조건 하에 다능성 줄기세포(PSC) 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, PSC는 대상체로부터 단리된 세포로부터 제조(예를 들어, 역분화)될 수 있다.

다능성 줄기세포

상기 다능성 줄기세포는 제한 없이 유도 다능성 줄기(iPS) 세포 또는 배아 줄기(ES) 세포일 수 있다. 특정 실시형태에서, 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 비-인간 ES 세포이다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 유도 다능성 줄기(iPS) 세포이다. 일 실시형태에서, 유도 다능성(iPS) 세포는 섬유아세포로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 유도 다능성(iPS) 세포는 인간 섬유아세포로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 조혈(hematopoietic) 줄기세포(HSC)이다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 신경 줄기세포(NSC)이다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 외배엽(epiblast) 줄기세포이다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 발달적으로 제한된 전구 세포이다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 설치류 다능성 세포이다. 일 실시형태에서, 설치류 다능성 세포는 래트(rat) 다능성 세포이다. 일 실시형태에서, 래트 다능성 세포는 래트 ES 세포이다. 일 실시형태에서, 설치류 다능성 세포는 마우스 다능성 세포이다. 일 실시형태에서, 다능성 세포는 마우스 배아 줄기(ES) 세포이다.

특정 실시형태에서, hPSC는 영양 세포를 사용하지 않고 접착 배양에 의한 세포 배양을 위한 단일 세포로서 플레이팅된다. 배양을 위해, 접시, 플라스크, 마이크로플레이트와 같은 배양 용기 또는 Geltrex(Gibco), OptiCell(Nalge Nunc International)과 같은 세포 배양 시트가 사용된다. 배양 용기는 세포에 대한 접착력(친수성)을 향상시키기 위해 표면 처리되거나, 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 라미닌, 피브로넥틴, 마트리겔(Matrigel)(예를 들어, BD Matrigel(Becton Dickinson)) 또는 비트로넥틴과 같은 셀 접착을 위한 기질로 코팅된다. 배양 용기는 I형 콜라겐, 마트리겔, 피브로넥틴, 비트로넥틴 또는 폴리-D-라이신으로 코팅될 수 있다. 배양 배지에는 마우스 배아 섬유아세포 조절 배지의 사용이 포함된다.

특정 실시형태에서, 세포는 성장 인자, 예를 들어 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2) 및 ROCK 억제제, 예를 들어 Y-27632를 포함하는 배지에서 배양된다. "ROCK 억제제"라는 용어는 Rho 키나제를 억제하는 물질(ROCK: Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제)를 의미하며, ROCK I 및 ROCK II 중 어느 하나를 억제하는 물질일 수 있다. ROCK 억제제는 ROCK 억제제가 상술한 기능을 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. 사용할 수 있는 ROCK 억제제의 예로는, N-(4-피리디닐)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르복사미드(Y-27632), 파수딜(HA1077), (2S)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐]술포닐]헥사히드로-1-H-1,4-디아제핀(H-1152), 4β-[(1R)-1-아미노에틸]-N-(4-피리딜)벤젠카르복사미드(Wf-536), N-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4PER(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-카르복사미드(Y-30141), N-(3-{[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일]옥시}페닐)-4-{[2-(4-모르폴리닐)에틸]-옥시}벤즈아미드(GSK269962A) 및 N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-6-메틸-2-옥소-4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]--3,4-디히드로-1H-피리딘-5-카르복사미드(GSK429286A); ROCK에 대한 항체(기능적 단편 포함), 안티센스 핵산 및 siRNA; ROCK 길항제 및 우성 음성 형태; 및 당업계에 공지된 다른 ROCK 억제제가 있다.

GSK - 3β 억제제와의 분화

다능성 줄기세포는 근원성 전구 세포(MPC)로 분화되도록 유도될 수 있다. 예시적인 과정에서, 글리코겐 합성효소 키나제 3(GSK-3)의 예는 CHIR99021의 선택적 억제제이다. GSK3β(글리코겐 합성효소 키나제 3)는 글리코겐 생성, 세포자멸사, 줄기세포 유지 등에 관여하는 많은 신호 경로에 참여하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. GSK3에는 α와 β의 2가지 동형 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, GSK3β 억제제는 GSK3β 억제제이다. GSK3β 억제제의 용도는 GSK3β 억제제가 GSK3β 억제 활성을 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. GSK3β 억제제는 GSK3β 억제 활성 외에 GSK3α 억제 활성을 갖는 물질일 수 있다.

GSK3β 억제제의 예로는, CHIR98014(2-[[2-[(5-니트로-6-아미노피리딘-2-일)아미노]에틸]아미노]-4-(2,4-디클로로프에닐)-5-(1H-이미다졸-1-일)피리미딘), CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미딘-일]아미노]에틸]아미노]니코티노니트릴), 켄폴론(Kenpaullone), AR-A0144-18, TDZD-8(4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온), SB216763(3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), BIO(6-브로모인디루빈-3-옥심), TWS-119(3-[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일옥시]페놀) 및 SB415286(3-[(3-클로로-4-히드록시페닐)아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-e-2,5-디온)이 있다. 또한, GSK3β mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등은 GSK3β 억제제로 사용될 수 있으며, 상업적으로 이용 가능하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다.

특정 실시형태에서, GSK3β 억제제는 CHIR99021, SB216763, SB415286, BIO 또는 그의 염을 포함한다.

특정 실시형태에서, 세포는 GSK3β 억제제를 포함하는 배양 배지에서 적어도 6시간 동안, 또는 적어도 12시간 동안, 또는 적어도 18시간 동안, 또는 적어도 24시간 동안, 또는 적어도 48시간 동안, 또는 적어도 72시간 동안 또는 적어도 96시간 동안 배양된다. 특정 실시형태에서, 세포는 제한 없이 1 내지 8일, 2 내지 7일, 3 내지 6일, 3 내지 5일, 3 내지 4일, 또는 4 내지 5일 동안 GSK3β 억제제를 포함하는 배양 배지에서 배양된다.

일부 실시형태에서, GSK3β 억제제(예를 들어, CHIR99021)의 농도는 적어도 0.2μM, 0.5μM, 1μM, 1.5μM, 2μM, 2.5μM, 또는 3μM일 수 있다. 일부 실시형태에서, GSK3β 억제제(예를 들어, CHIR99021)의 농도는 3μM, 3.5μM, 4μM, 4.5μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 15μM, 20μM, 30μM 또는 40μM 이하일 수 있다. 일부 실시형태에서, GSK3β 억제제(예를 들어, CHIR99021)의 농도는 제한 없이 0.2-10μM, 0.5-8μM, 1-7μM, 2-5μM, 또는 2-4μM일 수 있다.

노치 신호 억제제를 사용한 치료

GSK3β 억제제를 사용하여 세포를 배양한 후, 일부 예에서, 이어서 세포를 γ-세크레타제(secretase) 억제제 및/또는 노치 신호전달 억제제와 함께 배양한다. γ-세크레타제 억제제의 예는 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신-t-부틸 에스테르(DAPT)이다. DAPT는 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 분해 절단을 촉매화하여, 가족성 알츠하이머병(AD)의 조기 발명과 관련된 아밀로이드-β(Aβ) 펩타이드의 축적을 초래하는 다량체 막 단백질 복합체인 노치 신호전달을 차단하는 γ-세크레타제의 강력하고 특이적인 억제제이다. 이는, γ-세크레타제의 촉매 중심인 프레세닐린(PS)의 C-말단 단편에 직접 결합하고, 특히 막 관통 도메인 7 이상의 C-말단 영역 내에서 결합하여 광활성화 가능한 DAPT 유도체를 합성한다. DAPT는 γ-세크레타제의 기질인 노치를 간접적으로 억제한다.

노치 신호전달 억제제는 노치 신호전달 경로를 억제하는 작용제, 예를 들어 화학적 화합물 또는 항체이다. 예를 들어, γ-세크레타제에 대한 억제제는 노치 신호전달 경로를 억제할 수 있다. 이러한 γ-세크레타제 억제제는 예를 들어 본질적으로 펩티드성 또는 비-펩티드성 또는 반-펩티드성이며, 바람직하게는 소 분자이다. 예로는 DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로페닐아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신-t-부틸 에스테르)가 있다. 또한 화학 분류 AS(아릴설폰아미드), DBZ(디벤자제핀(DBZ), BZ(벤조디아제핀), LY-411,575 및 기타 많은 분류의 화합물들이 γ-세크레타제 억제 활성에 대해 시험되었다. γ-세크레타제 억제제는 설폰마이드/설폰 및 벤조디아제핀/벤조락탐으로 나뉜다. 이러한 γ-세크레타제 억제제 중 일부는 이미 임상 1상 및 2상 시험에 있다.

특정 실시형태에서, 세포는 적어도 약 1일 동안, 또는 적어도 약 2일 동안, 또는 적어도 약 3일 동안, 또는 적어도 약 4일 동안, 또는 적어도 약 5일 동안, 또는 적어도 약 6일 동안, 또는 적어도 약 7일 동안, 또는 적어도 약 8일 동안 적어도 노치 신호전달 억제제(예, DAPT)를 포함하는 배지에서 배양된다. 특정 실시형태에서, 세포는, 제한 없이, 1 내지 20일, 2 내지 15일, 3 내지 12일, 4 내지 11일, 5 내지 10일, 6 내지 9일, 7 내지 9일, 7 내지 8일 또는 8 내지 10일 동안 적어도 노치 신호전달 억제제(예를 들어, DAPT)를 포함하는 배지에서 배양된다.

선별 및 확장

GSK3β 억제제 및 노치 신호전달 억제제를 사용하여 치료한 후, 일부 실시형태에서, 세포는 수일 동안 (작용제가 배지로부터 제거된 후) 추가로 분화되도록 한다. 일부 실시형태에서, 추가 분화는 적어도 약 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 20일, 25일 또는 30일 지속될 수 있다.

일부 실시형태에서, 분화된 PAX7+ 세포는 선별(농축) 및 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 선별된 후 확장된다. 일부 실시형태에서, 세포를 확장한 후 선별한다.

분화된 세포의 선별은 PAX7+ MPC를 인식하는 제제로 수행될 수 있다. 이러한 제제의 예로는 세포 표면 마커에 특이적인 항체가 있다. PAX7+ 근원성 전구 세포는 다능성 세포 및 아직 분화 중인 세포와 같은 기타 세포로부터 농축될 수 있다. 예를 들어, 항체는 FACS 또는 자기 비드(bead)에서 사용되어 전구 세포를 선별, 단리 및 정제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 NCAM+, HNK1-, PAX7+, MyoD+, CD54+, 인테그린 α9β1+ 및 SDC2+(Syndecan2)와 같은 표적 근원성 전구 세포의 마커 패널에 특이적으로 사용된다.

PAX7+ 근원성 전구 세포의 확장은 FGF2(염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 FGF-β로도 알려짐) 또는 FGF8, 또는 이들의 조합, 선택적으로 FBS가 보충된 배지에서 수행될 수 있다.

생체 내 재생 및 생착이 가능한 MPC 집단

실험예에 나타난 바와 같이, 풍부하고 확장된 PAX7+ MPC는 우수한 재증식(repopulation) 및 생착 능력을 갖는다. 본 발명자들은 생체 외에서 다능성 줄기세포로부터 유래된 근원성 전구 세포가 근육내 이식 시에 근육 줄기세포 기생 위치에 존재할 수 있고, 정지 상태가 되어 인간 근육 줄기세포와 유사한 분자 발현 프로파일을 변화시킬 수 있는 것은 처음이라고 믿는다.

또한, 실시예에 나타난 바와 같이, PAX7+MPC의 재생 및 생착(engraftment) 능력은 최소 세포 농도를 필요로 한다. 나타낸 바와 같이, PAX7+ MPC의 농도가 15% 미만인 경우, 재생 및 생착은 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 세포의 적어도 30%가 시험관 내 또는 생체 외에서 다능성 줄기세포로부터 유래된 PAX7+ 근원성 전구 세포(MPC)인 세포 집단(예를 들어, 포유동물 세포, 또는 보다 구체적으로 인간 세포)이 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포 집단은 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% PAX7+MPC를 포함한다.

일부 실시형태에서, 세포 집단은 적어도 100, 1000, 10,000, 100,000, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 또는 1x10⁹ 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 집단의 세포의 실질적인 부분은 분화 동안 PAX7+MPC와 함께 배양되었다. 예를 들어, 집단의 세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%가 분분화 중에 PAX7+ MPC와 함께 배양되었다.

본 기술에 의해 수득된 PAX7+ MPC는 천연 근원성 전구 세포와 상이한 것으로 여겨진다. PAX7+, NCAM+, HNK1-, PAX7+, MyoD+, CD54+, 인테그린 α9β1+ 및 SDC2+ 외에도, 다음 세포 표면 마커 중 하나 이상으로 특성화할 수 있다: CHRNA1+, NTSR1+, FZD1+, FZD5-, GPR37- 및 GPR27-. 일부 실시형태에서, 유도된 PAX7+ MPC는 CHRNA1+, NTSR1+, FZD1+, FZD5-, GPR37- 및 GPR27- 중 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개를 특징으로 한다.

일부 실시형태에서, 적어도 2개는 CHRNA1+ 및 NTSR1+, CHRNA1+ 및 FZD1+, CHRNA1+ 및 FZD5-, CHRNA1+ 및 GPR37-, CHRNA1+ 및 GPR27-, NTSR1+ 및 CHRNA1+, NTSR1+ 및 FZD1+, NTSR1+ 및 FZD5-, NTSR1+ 및 GPR37-, NTSR1+ 및 GPR27-, FZD1+ 및 CHRNA1+, FZD1+ 및 NTSR1+, FZD1+ 및 FZD5-, FZD1+ 및 GPR37-, FZD1+ 및 GPR27-, FZD5- 및 CHRNA1+, FZD5- 및 NTSR1+, FZD5- 및 FZD1+, FZD5- 및 GPR37-, FZD5- 및 GPR27-, GPR37- 및 CHRNA1+, GPR37- 및 NTSR1+, GPR37- 및 FZD1+, GPR37- 및 FZD5-, GPR37- 및 GPR27-, GPR27- 및 CHRNA1+, GPR27- 및 NTSR1+, GPR27- 및 FZD1+, GPR27- 및 FZD5-, 또는 GPR27- 및 GPR37-이다.

일부 실시형태에서, 유도된 PAX7+ MPC는 CHRNA1+, NTSR1+, FZD1+, FZD5-, GPR37- 및 GPR27- 중 적어도 3개를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 유도된 PAX7+ MPC는 CHRNA1+, NTSR1+, FZD1+, FZD5-, GPR37- 및 GPR27- 중 적어도 4개를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 유도된 PAX7+ MPC는 CHRNA1+, NTSR1+, FZD1+, FZD5-, GPR37- 및 GPR27- 중 적어도 5개를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 유도된 PAX7+ MPC는 CHRNA1+, NTSR1+, FZD1+, FZD5-, GPR37- 및 GPR27- 모두를 특징으로 한다.

세포 표면 단백질이 양성(+) 또는 음성(-)인지 여부는 항체와 같은 마커를 인식하는 제제에 의해 평가될 수 있다. 숙련된 기술자는 이러한 양수 및 음수가 절대적이지 않을 수 있다는 것을 용이하게 이해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 양성인 마커는 참조 세포에서보다 세포 상에서 더 높은 발현을 갖는 것이다. 일부 실시형태에서, 음성인 마커는 참조 세포에서보다 세포 상에서 더 낮은 발현을 갖는 것이다. 예를 들어, 참조 세포는 다능성 줄기세포와 유사하게 분화된 세포이지만, 생체 내에서 근육 조직을 재생할 수 없다.

MPC 집단을 생성하는 방법은 MPC 집단의 세포에서 PAX7 발현을 증가시키는데 효과적이다. 예를 들어, 발현은 기준에 비해 적어도 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200%까지 증가할 수 있다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 PAX7 발현은 적어도 100% 증가한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 PAX7 발현 수준은 적어도 125% 증가한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 PAX7 발현 수준은 적어도 150% 증가한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 PAX7 발현 수준은 적어도 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1,000%, 1,100% 또는 1,200%까지 증가한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 PAX7 발현 수준은 약 50% 내지 약 1,200% 증가한다.

인간 PAX7에 대한 아미노산 서열은 수탁 번호 NP_002575.1(SEQ ID NO: 1)로 NCBI GenBank 데이터베이스에서 공개적으로 이용 가능하며 다음과 같다:

1 MAALPGTVPR MMRPAPGQNY PRTGFPLEVS TPLGQGRVNQ LGGVFINGRP LPNHIRHKIV

61 EMAHHGIRPC VISRQLRVSH GCVSKILCRY QETGSIRPGA IGGSKPRQVA TPDVEKKIEE

121 YKRENPGMFS WEIRDRLLKD GHCDRSTVPS GLVSSISRVL RIKFGKKEEE DEADKKEDDG

181 EKKAKHSIDG ILGDKGNRLD EGSDVESEPD LPLKRKQRRS RTTFTAEQLE ELEKAFERTH

241 YPDIYTREEL AQRTKLTEAR VQVWFSNRRA RWRKQAGANQ LAAFNHLLPG GFPPTGMPTL

301 PPYQLPDSTY PTTTISQDGG STVHRPQPLP PSTMHQGGLA AAAAAADTSS AYGARHSFSS

361 YSDSFMNPAA PSNHMNPVSN GLSPQVMSIL GNPSAVPPQP QADFSISPLH GGLDSATSIS

421 ASCSQRADSI KPGDSLPTSQ AYCPPTYSTT GYSVDPVAGY QYGQYGQSEC LVPWASPVPI

481 PSPTPRASCL FMESYKVVSG WGMSISQMEK LKSSQMEQFT.

인간 PAX7을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 데이터베이스에서 수탁 번호 NM_002584.2(SEQ ID NO: 2)로 공개적으로 이용 가능하며 다음과 같다(시작 및 종료 코돈은 볼드체 및 밑줄로 표시):

1 gaaagctggt gtggagggag aagcgagtgt ggtccggaga aagaaggcgt ggagaagagg

61 gagggagcga gagcgagaga ataaatatat aaataaatac gagaacgaaa tccactccgc

121 agtctccggg ctcggaaact ttggccccga gcgccagagc gccagagcgc gagagcgcgg

181 cgctcgccac tctgaggctg gcggcctcga ttccggccgc gttcccccgg cccccctccg

241 ccgcggggcc tggtctccgg gttctgccag gcgcatcagc ccgcacaact tctggccgag

301 gccagccggc agaggcggac ttggggttgg agtgtttgtt tgtttgaact tcctcgtcgt

361 cgccaccttc cctcccccca acctccaccc cacctcaccc ccctccccag cttctggacg

421 cgtttgactg cagccagggg tggggggtgg gggtagggag tgtgtgtgga ggggagggag

481 aagaggttaa aaaaaagaag acgaagaaga cggaaagaaa gagatcgcag caggggtgaa

541 gggagcggac gggaagcgat ttttgccgac tttggattcg tccccggcgt gcgcaaga at

601 g gcggccctt cccggcacgg taccgagaat gatgcggccg gctccggggc agaactaccc

661 ccgcacggga ttccctttgg aagtgtccac cccgcttggc caaggccggg tcaatcagct

721 gggaggggtc ttcatcaatg ggcgacccct gcctaaccac atccgccaca agatagtgga

781 gatggcccac catggcatcc ggccctgtgt catctcccga cagctgcgtg tctcccacgg

841 ctgcgtctcc aagattcttt gccgctacca ggagaccggg tccatccggc ctggggccat

901 cggcggcagc aagcccagac aggtggcgac tccggatgta gagaaaaaga ttgaggagta

961 caagagggaa aacccaggca tgttcagctg ggagatccgg gacaggctgc tgaaggatgg

1021 gcactgtgac cgaagcactg tgccctcagg tttagtgagt tcgattagcc gcgtgctcag

1081 aatcaagttc gggaagaaag aggaggagga tgaagcggac aagaaggagg acgacggcga

1141 aaagaaggcc aaacacagca tcgacggcat cctgggcgac aaagggaacc ggctggacga

1201 gggctcggat gtggagtcgg aacctgacct cccactgaag cgcaagcagc gacgcagtcg

1261 gaccacattc acggccgagc agctggagga gctggagaag gcctttgaga ggacccacta

1321 cccagacata tacacccgcg aggagctggc gcagaggacc aagctgacag aggcgcgtgt

1381 gcaggtctgg ttcagtaacc gccgcgcccg ttggcgtaag caggcaggag ccaaccagct

1441 ggcggcgttc aaccaccttc tgccaggagg cttcccaccc accggcatgc ccacgctgcc

1501 cccctaccag ctgccggact ccacctaccc caccaccacc atctcccaag atgggggcag

1561 cactgtgcac cggcctcagc ccctgccacc gtccaccatg caccagggcg ggctggctgc

1621 agcggctgca gccgccgaca ccagctctgc ctacggagcc cgccacagct tctccagcta

1681 ctctgacagc ttcatgaatc cggcggcgcc ctccaaccac atgaacccgg tcagcaacgg

1741 cctgtctcct caggtgatga gcatcttggg caaccccagt gcggtgcccc cgcagccaca

1801 ggctgacttc tccatctccc cgctgcatgg cggcctggac tcggccacct ccatctcagc

1861 cagctgcagc cagcgggccg actccatcaa gccaggagac agcctgccca cctcccaggc

1921 ctactgccca cccacctaca gcaccaccgg ctacagcgtg gaccccgtgg ccggctatca

1981 gtacggccag tacggccaga gtgagtgcct ggtgccctgg gcgtcccccg tccccattcc

2041 ttctcccacc cccagggcct cctgcttgtt tatggagagc tacaaggtgg tgtcagggtg

2101 gggaatgtcc atttcacaga tggaaaaatt gaagtccagc cagatggaac agttcacc ta

2161 a aatgacact gagttgggca aaacccagga catctcctgg ctaagcctct gcttccgtac

2221 tatggctcca acagaaataa aatacacaac acaaatatca aaaaaaaaaa a.

마우스 PAX7에 대한 아미노산 서열은 수탁 번호 NP_035169.1(SEQ ID NO: 3)로 NCBI GenBank 데이터베이스에서 공개적으로 이용 가능하며 다음과 같다:

1 MAALPGAVPR MMRPGPGQNY PRTGFPLEVS TPLGQGRVNQ LGGVFINGRP LPNHIRHKIV

61 EMAHHGIRPC VISRQLRVSH GCVSKILCRY QETGSIRPGA IGGSKPRQVA TPDVEKKIEE

121 YKRENPGMFS WEIRDRLLKD GHCDRSTVPS VSSISRVLRI KFGKKEDDEE GDKKEEDGEK

181 KAKHSIDGIL GDKGNRLDEG SDVESEPDLP LKRKQRRSRT TFTAEQLEEL EKAFERTHYP

241 DIYTREELAQ RTKLTEARVQ VWFSNRRARW RKQAGANQLA AFNHLLPGGF PPTGMPTLPP

301 YQLPDSTYPT TTISQDGGST VHRPQPLPPS TMHQGGLAAA AAAADTSSAY GARHSFSSYS

361 DSFMNPGAPS NHMNPVSNGL SPQVMSILSN PSAVPPQPQA DFSISPLHGG LDSASSISAS

421 CSQRADSIKP GDSLPTSQSY CPPTYSTTGY SVDPVAGYQY SQYGQTAVDY LAKNVSLSTQ

481 RRMKLGEHSA VLGLLPVETG QAY.

마우스 PAX7을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 데이터베이스에서 수탁 번호 NM_011039.2(SEQ ID NO: 4)로 공개적으로 이용 가능하며 다음과 같다(시작 및 종료 코돈은 볼드체 및 밑줄로 표시):

1 agagacgcca agaggtttat ccagccgact ctggattcgt ctccagcgtg cgcagga atg

61 gcggcgctgc ccggcgcggt ccccaggatg atgagacccg gcccggggca gaactacccg

121 cgcaccggct tccccctgga agtgtccacc cctcttggcc aaggccgggt caatcagctt

181 ggtggggtct tcatcaacgg tcgacccctg ccgaaccaca tccgtcacaa gatagtggaa

241 atggcccacc atggcatccg gccctgcgtc atctcccgtc agctccgtgt ttcccatggt

301 tgtgtctcca agattctgtg ccgatatcag gagactgggt ccatccggcc cggggctatc

361 ggaggcagca agcccagaca ggtggcgact ccggatgtgg agaaaaagat tgaggagtat

421 aagagagaga accccgggat gttcagctgg gaaatccggg accggctgct gaaggacggt

481 cactgcgacc gaagcacggt gccctcagtg agttcgatta gccgagtgct cagaatcaag

541 ttcgggaaga aagaggacga cgaggaagga gacaagaaag aagaagatgg cgagaagaaa

601 gccaaacaca gcatcgatgg catcctgggc gacaaaggga accgtctgga tgagggctca

661 gatgtggaat cagaacccga cctccccctg aagcgcaagc agcgccgcag tcggaccacg

721 ttcacagccg agcagctgga ggagctggag aaggccttcg agaggaccca ctacccggac

781 atctacaccc gggaggagct ggcacagagg accaagctca cggaggcacg cgtccaggtc

841 tggttcagta accggcgtgc ccgctggcgt aagcaggcag gagctaacca gctggccgcc

901 ttcaaccacc ttctgccggg aggtttccca cccaccggca tgcccacgct gccaccctac

961 cagctgccgg actctaccta ccccaccacc accatctccc aagatggagg cagcacagta

1021 cacaggcccc agccccttcc gccatcaacc atgcatcagg gtgggctggc tgcggccgct

1081 gcagcagcgg acaccagctc tgcctacgga gcccgccaca gcttctccag ctactctgac

1141 agcttcatga accctggggc tccctccaac cacatgaacc ctgtcagcaa tggcctgtct

1201 cctcaggtca tgagcatcct tagcaacccg agtgccgtgc ctccacagcc ccaggccgac

1261 ttctccatct ccccgctgca tggaggcctg gactcggctt cctccatctc agccagctgc

1321 agccaacggg ccgactccat caagccagga gacagcttgc ccacgtccca gtcttactgc

1381 ccacccacct acagcaccac tggctacagt gtggaccctg tggctggcta ccagtacagc

1441 cagtatggcc aaactgctgt tgattacctg gccaaaaacg tgagcctgtc cacacagcgc

1501 cgtatgaagc ttggggaaca ctccgctgtg ctgggacttc ttcctgtgga aacgggacaa

1561 gcctac tag g gtccctgggg caacttgccc catccagtgg cccagccaac ccttcccaag

1621 ccctgagtct cctcacctca gtccccttat ccccctgggg ttgcaggaga ccaagggaaa

1681 aaaacccttt cccttcctac aggaaaccct ctggagacgg aaaaccagtg tgccatctac

1741 ccatgcttag tgacccagag tggccccttg ccttcccctc tttcttcaga ggggttccta

1801 ggcatcctgc agtgacctcc agctcacatc caccttctct gtatcgtggc ctcggtcctg

1861 tctcagtgca gagattgagg ctcaatttga accaagcacc tagttatcag aagaaaatgg

1921 tgccaaagac aaggccctgg agtccttgac ctctgagtcg tgggtgccct ggctatgggt

1981 gtaggtggag cccatgggtg tcctcagtca cagagctggg agctctctct cgctcgcttg

2041 gcatcaggac tgcagcctct ttcactggac actgagatga gtccccaggg tgttcccagg

2101 ggagaaagca ggtaacatcc cagctttacc taggaatcca gaggacttta ggactgtccc

2161 tatgcaccct gcagggcatc aggagaccag gaagggattc tagcagaggg tagggggcac

2221 agaggcagag ctgattgccc atgggctatc ccagaatgcc tggtcctgaa tctagcatca

2281 ggaggtgcag gattcctagg ctgcaatctg acagaggctt gcccactgtg tcaggcctgg

2341 gcagcccaca gaacctgtca ctctcctcaa ttggtaggag aagaggtctt gaggtgacag

2401 gaggcagaag gcaggctcag acagtcagag agcaccaagc tttcaagtcc gcacccctgg

2461 ggttcggcat accatcttgc tggcagctgg aaacctggtt ccctgaaagg gggcctccat

2521 cctccagaat gtaaggctct tgatgccacc ggatgcagag agccttctcg ggccagacaa

2581 aattgctgct ccaccccaga gaagatgttc cagccttctt ggcatcttag aggaaggcca

2641 tgtcgctgtc cttttcagag tagcatattt ttcagtgatg gctgctcagt caggaggctt

2701 ctgtcgcctt acaaagcaca gtgcgctctg ggcactgttt ctaagccacc ccatcccacc

2761 cccacccccg ccaccccggg gacagaggaa gatgctaaaa gtcccagcaa agaggacaaa

2821 gcacctttct taagcactcc agagtcttcc ttgtaccccg ccctctctta gagctgggtc

2881 ttttgaggga aacggattgc tgagccctcc ccccccccca atcctctcct ctgtggagct

2941 gtttatcatc ctctatttat caaaatcgca tccatcttta ccctctcctt cgctatagcc

3001 tacttctgga tcaccctcat ccagtgctgg taccccacag cactaaatcc aggaaccctg

3061 ggcttgatca cctgttgcca cctgtacaca tgaaaccacc tgctggcccg gcccatgtct

3121 cctgccctca gccagcaaga cattcctaga gagaggaact atgggcttaa aagccccaac

3181 tgacttcctt ttgcctgggg acctgaaccg acaagacacc agggacactt gtctacatga

3241 acatgtgacc aatgtacacc gatttctcat ctctagacct attatctgaa gcctgtcccg

3301 ggccatgact agaatggctt gtatctgtgg tttagagaag tctaataata actgagggca

3361 aactgactct ctggtagcat ggagcaccag gcggatggag ctcaccagct ctgtccaggt

3421 ttcaaaggag gagactgttg ggctcttcaa ggtctggaca agaggaaagc cacattgccc

3481 ccttgggaac ccaggttctc cttttgaact tctcacagct gcaagcaccc ctttcaaaga

3541 ccaaatgcat cctcctccac attccttgct ccctggaggc ctggctctgg atacacctga

3601 gtcttcgttc acctactaca ctttaggagc aggaacttca agcaggtgac atccacaggg

3661 cccagtccca gccaagggag caacattcca acgcttggac caatcataat gatctgcccg

3721 tgagggtaac cgcaactaga gacctgcttg ggagaaaaca aaatgacttc tcattccatg

3781 ccatgcctct gaatgctccc ccaagctgcc atcttggtat aaaatgggac ttgtgttgtg

3841 gggaacccct tgaccccaac aggttttccc aactgtctca tgcttttgtg aatctgtctg

3901 ctttgatctg taaaactcag ccttgtttgg gcagcttgta atttcaacag tgaggcgaca

3961 tcgattagat gagaggcacc aggcctctcc gccgccgtcc ctctgtggcc gtccctctgg

4021 ggttgagcag aacctagaag aaggccgatt tccagtggcc agactggacc agaaacagcc

4081 cccaccccaa tccctgtaaa tagagtcaat agcaaaataa gaggggcgcc ctccatgtca

4141 cctcaagtag ctactggttc ttctgtggag gcccctctga actcattgtc tggtagttga

4201 aaatgtgatg ttgtgctgtt tgtttataga acattggctt tttatatata aatctatata

4261 cttaaaaaca aaaac.

MPC 집단을 생성하는 방법은 MPC 집단의 세포에서 MyoD 발현을 증가시키는데 효과적이다. 예를 들어, 발현은 기준에 비해 적어도 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200% 까지 증가할 수 있다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 MyoD 발현은 적어도 100% 까지 증가한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 MyoD 발현의 수준은 적어도 125% 증가한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 MyoD 발현 수준은 적어도 150% 까지 증가한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 MyoD 발현 수준은 적어도 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1,000%, 1,100% 또는 1,200% 까지 증가한다. 실시형태에서, 근원성 전구 세포 집단에서 MyoD 발현 수준은 약 50% 내지 약 1,200% 까지 증가한다.

인간 MyoD에 대한 아미노산 서열은 NCBI GenBank 데이터베이스에서 수탁 번호 NP_002469.2(SEQ ID NO: 5)로 공개적으로 이용 가능하며 다음과 같다:

1 MELLSPPLRD VDLTAPDGSL CSFATTDDFY DDPCFDSPDL RFFEDLDPRL MHVGALLKPE

61 EHSHFPAAVH PAPGAREDEH VRAPSGHHQA GRCLLWACKA CKRKTTNADR RKAATMRERR

121 RLSKVNEAFE TLKRCTSSNP NQRLPKVEIL RNAIRYIEGL QALLRDQDAA PPGAAAAFYA

181 PGPLPPGRGG EHYSGDSDAS SPRSNCSDGM MDYSGPPSGA RRRNCYEGAY YNEAPSEPRP

241 GKSAAVSSLD CLSSIVERIS TESPAAPALL LADVPSESPP RRQEAAAPSE GESSGDPTQS

301 PDAAPQCPAG ANPNPIYQVL.

인간 MyoD를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 데이터베이스에서 수탁 번호 NM_002478.5(SEQ ID NO: 6)로 공개적으로 이용 가능하며 다음과 같다(시작 및 종료 코돈은 볼드체 및 밑줄로 표시):

1 aggggtgagg aagccctggg gcgctgccgc cgctttcctt aaccacaaat caggccggac

61 aggagaggga ggggtggggg acagtgggtg ggcattcaga ctgccagcac tttgctatct

121 acagccgggg ctcccgagcg gcagaaagtt ccggccactc tctgccgctt gggttgggcg

181 aagccaggac cgtgccgcgc caccgccagg at atg gagct actgtcgcca ccgctccgcg

241 acgtagacct gacggccccc gacggctctc tctgctcctt tgccacaacg gacgacttct

301 atgacgaccc gtgtttcgac tccccggacc tgcgcttctt cgaagacctg gacccgcgcc

361 tgatgcacgt gggcgcgctc ctgaaacccg aagagcactc gcacttcccc gcggcggtgc

421 acccggcccc gggcgcacgt gaggacgagc atgtgcgcgc gcccagcggg caccaccagg

481 cgggccgctg cctactgtgg gcctgcaagg cgtgcaagcg caagaccacc aacgccgacc

541 gccgcaaggc cgccaccatg cgcgagcggc gccgcctgag caaagtaaat gaggcctttg

601 agacactcaa gcgctgcacg tcgagcaatc caaaccagcg gttgcccaag gtggagatcc

661 tgcgcaacgc catccgctat atcgagggcc tgcaggctct gctgcgcgac caggacgccg

721 cgccccctgg cgccgcagcc gccttctatg cgccgggccc gctgcccccg ggccgcggcg

781 gcgagcacta cagcggcgac tccgacgcgt ccagcccgcg ctccaactgc tccgacggca

841 tgatggacta cagcggcccc ccgagcggcg cccggcggcg gaactgctac gaaggcgcct

901 actacaacga ggcgcccagc gaacccaggc ccgggaagag tgcggcggtg tcgagcctag

961 actgcctgtc cagcatcgtg gagcgcatct ccaccgagag ccctgcggcg cccgccctcc

1021 tgctggcgga cgtgccttct gagtcgcctc cgcgcaggca agaggctgcc gcccccagcg

1081 agggagagag cagcggcgac cccacccagt caccggacgc cgccccgcag tgccctgcgg

1141 gtgcgaaccc caacccgata taccaggtgc tc tga gggga tggtggccgc ccacccgccc

1201 gagggatggt gcccctaggg tccctcgcgc ccaaaagatt gaacttaaat gcccccctcc

1261 caacagcgct ttaaaagcga cctctcttga ggtaggagag gcgggagaac tgaagtttcc

1321 gcccccgccc cacagggcaa ggacacagcg cggttttttc cacgcagcac ccttctcgga

1381 gacccattgc gatggccgct ccgtgttcct cggtgggcca gagctgaacc ttgaggggct

1441 aggttcagct ttctcgcgcc ctcccccatg ggggtgagac cctcgcagac ctaagccctg

1501 ccccgggatg caccggttat ttgggggggc gtgagaccca gtgcactccg gtcccaaatg

1561 tagcaggtgt aaccgtaacc cacccccaac ccgtttcccg gttcaggacc actttttgta

1621 atacttttgt aatctattcc tgtaaataag agttgctttg ccagagcagg agcccctggg

1681 gctgtattta tctctgaggc atggtgtgtg gtgctacagg gaatttgtac gtttataccg

1741 caggcgggcg agccgcgggc gctcgctcag gtgatcaaaa taaaggcgct aatttatacc

1801 gcc.

마우스 MyoD에 대한 아미노산 서열은 수탁 번호 NP_034996.2(SEQ ID NO: 7)로 NCBI GenBank 데이터베이스에서 공개적으로 이용 가능하며 다음과 같다:

1 MELLSPPLRD IDLTGPDGSL CSFETADDFY DDPCFDSPDL RFFEDLDPRL VHMGALLKPE

61 EHAHFPTAVH PGPGAREDEH VRAPSGHHQA GRCLLWACKA CKRKTTNADR RKAATMRERR

121 RLSKVNEAFE TLKRCTSSNP NQRLPKVEIL RNAIRYIEGL QALLRDQDAA PPGAAAFYAP

181 GPLPPGRGSE HYSGDSDASS PRSNCSDGMM DYSGPPSGPR RQNGYDTAYY SEAARESRPG

241 KSAAVSSLDC LSSIVERIST DSPAAPALLL ADAPPESPPG PPEGASLSDT EQGTQTPSPD

301 AAPQCPAGSN PNAIYQVL.

마우스 MyoD를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 GenBank 데이터베이스에서 수탁 번호 NM_010866.2(SEQ ID NO: 8)로 공개적으로 이용 가능하며, 다음과 같다(시작 및 종료 코돈은 볼드체 및 밑줄로 표시):

1 aggggccagg acgccccagg acacgactgc tttcttcacc actcctctga caggacagga

61 cagggaggag gggtagagga cagccggtgt gcattccaac ccacagaacc tttgtcattg

121 tactgttggg gttccggagt ggcagaaagt taagacgact ctcacggctt gggttgaggc

181 tggacccagg aactgggat a tg gagcttct atcgccgcca ctccgggaca tagacttgac

241 aggccccgac ggctctctct gctcctttga gacagcagac gacttctatg atgacccgtg

301 tttcgactca ccagacctgc gcttttttga ggacctggac ccgcgcctgg tgcacatggg

361 agccctcctg aaaccggagg agcacgcaca cttccctact gcggtgcacc caggcccagg

421 cgctcgtgag gatgagcatg tgcgcgcgcc cagcgggcac caccaggcgg gtcgctgctt

481 gctgtgggcc tgcaaggcgt gcaagcgcaa gaccaccaac gctgatcgcc gcaaggccgc

541 caccatgcgc gagcgccgcc gcctgagcaa agtgaatgag gccttcgaga cgctcaagcg

601 ctgcacgtcc agcaacccga accagcggct acccaaggtg gagatcctgc gcaacgccat

661 ccgctacatc gaaggtctgc aggctctgct gcgcgaccag gacgccgcgc cccctggcgc

721 cgctgccttc tacgcacctg gaccgctgcc cccaggccgt ggcagcgagc actacagtgg

781 cgactcagat gcatccagcc cgcgctccaa ctgctctgat ggcatgatgg attacagcgg

841 ccccccaagc ggcccccggc ggcagaatgg ctacgacacc gcctactaca gtgaggcggc

901 gcgcgagtcc aggccaggga agagtgcggc tgtgtcgagc ctcgactgcc tgtccagcat

961 agtggagcgc atctccacag acagccccgc tgcgcctgcg ctgcttttgg cagatgcacc

1021 accagagtcg cctccgggtc cgccagaggg ggcatcccta agcgacacag aacagggaac

1081 ccagaccccg tctcccgacg ccgcccctca gtgtcctgca ggctcaaacc ccaatgcgat

1141 ttatcaggtg ctt tga gaga tcgactgcag cagcagaggg cgcaccaccg taggcactcc

1201 tggggatggt gtccctggtt cttcacgccc aaaagatgaa gcttaaatga cactcttccc

1261 aactgtcctt tcgaagccgt tcttccagag ggaagggaag agcagaagtc tgtcctagat

1321 ccagccccaa agaaaggaca tagtcctttt tgttgttgtt gttgtagtcc ttcagttgtt

1381 tgtttgtttt ttcatgcggc tcacagcgaa ggccacttgc actctggctg cacctcactg

1441 ggccagagct gatccttgag tggccaggcg ctcttccttt cctcatagca caggggtgag

1501 ccttgcacac ctaagccctg ccctccacat ccttttgttt gtcactttct ggagccctcc

1561 tggcacccac ttttccccac agcttgcgga ggccactcag gtctcaggtg taacaggtgt

1621 aaccataccc cactctcccc cttcccgcgg ttcaggacca cttatttttt tatataagac

1681 ttttgtaatc tattcgtgta aataagagtt gcttggccag agcgggagcc ccttgggcta

1741 tatttatctc ccaggcatgc tgtgtagtgc aacaaaaact ttgtatgttt attcctcaag

1801 cgggcgagcc tcgaggctcg ctcgctcagg tgttggaaat aaagacgcta attt.

다른 양태에서, MPC 집단을 생성하는 방법은 세포 집단이 적어도 30일 동안 배양되고 생체 외에서 확장되는 것을 포함한다. 다른 양태에서, 세포 집단은 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일 동안 생체 외에서 배양되고 확장된다.

본 발명의 양태에서, 세포 집단은 그들의 수를 확장시키기 위해 배양된다. 예를 들어, 그 수는 적어도 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200% 까지 증가할 수 있다. 실시형태에서, 그 수는 적어도 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1,000%, 1,100%, 또는 1,200% 까지 증가할 수 있다. 실시형태에서, 세포 집단은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 까지 배양되고 확장된다.

추가의 예에서, MPC 집단은 대상체로부터 얻어진 세포 집단, 예를 들어 골격 세포로부터 생성된다. 다른 예에서, PSC 집단은 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포 집단이다.

추가 양태에서, 세포 집단은 생검을 통해 대상체로부터 수득된다.

본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 근원성 전구 세포의 집단이 또한 제공된다.

근육 질환 또는 장애 치료 방법

본 명세서에는 이를 필요로 하는 대상체에서 근육 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다. 추가 실시형태에서, 이 방법은 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 근원성 전구 세포 집단의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 근원성 전구 세포는 생물학적 샘플의 세포로부터 제조된 다능성 줄기세포로부터 유래/분화될 수 있다.

생물학적 샘픔

특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 자가, 동종이계, 일배체형 일치, 일배체형 불일치, 일배체-동일, 이종, 세포주 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 공급원으로부터 수득된다.

따라서, 일부 실시형태에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플은 조직, 체액 및 대상체로부터 직접 채취한 기타 샘플뿐만 아니라 분리, 원심분리, 유전 공학(예를 들어, 바이러스 벡터를 사용한 형질도입), 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 처리 단계로부터 생성된 샘플을 포함한다. 생물학적 시료는 생물학적 공급원에서 직접 얻어진 샘플 또는 처리된 시료일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 조직 및 기관 샘플, 이들로부터 유래된 처리된 샘플을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.

골격근(SkM) 재생은 근섬유의 기저판 아래에 있는 근원성 전구세포의 활동에 의존한다. 근모세포 증식, 분화 및 융합의 변화는 많은 신경근 질환이 공유하는 특징이며, 세포 기반 및 약리학적 요법을 분석하는 데 사용될 수 있다. 인간의 골격근 생검, 특히 질병의 영향을 받는 조직은 종종 지방세포 및 섬유아세포와 같은 비근원성 세포의 광범위한 집단을 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 샘플은 근육 조직 또는 골 조직이다.

일부 양태에서, 세포가 유래되거나 단리된 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분채집(apheresis) 또는 백혈구 성분채집(leukapheresis) 생성물이거나 그로부터 유래된다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선(thymus), 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관, 및/또는 이로부터 유래된 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법, 예를 들어 입양(adoptive) 세포 요법의 맥락에서 자가 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플을 포함한다.

일부 실시형태에서, 세포는 세포주로부터 유래된다. 일부 실시형태에서 세포는 이종 공급원, 예를 들어 마우스, 래트, 비인간 영장류 또는 돼지로부터 수득된다.

일부 실시형태에서, 세포의 단리는 하나 이상의 조제 및/또는 비친화성 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예에서, 세포는 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션되어, 예를 들어 원하지 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 풍부하게 하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거한다. 일부 예에서, 세포는 밀도, 부착 특성, 크기, 감도 및/또는 특정 구성 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성을 기반으로 분리된다.

일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는, 예를 들어 성분채집 또는 백혈구 성분채집에 의해 수득된다. 일부 양태에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구 세포, 적혈구 세포 및/또는 혈소판을 포함하는 림프구를 함유하고, 일부 양태에서는 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.

일부 실시형태에서, 예를 들어 혈장 분획물을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 넣기 위해 대상체로부터 수집된 혈핵 세포를 세척한다. 일부 실시형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 실시형태에서, 세척 용액에는 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여되어 있다. 일부 양태에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 "관류(flow-through)" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter)로 수행된다. 일부 양태에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 접선 유동 여과(TFF)에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 세포는 예를 들어 Ca++/Mg++ 유리 PBS와 같은 세척 후 다양한 생체적 합성 완충액에 재현탁된다. 특정 실시형태에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 세포가 배양 배지에 직접 재현탁된다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 적혈구를 용해시키고 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리에 의한 말초혈액(peripheral blood)으로부터 백혈구의 제조와 같은 밀도 기반 세포 분리 방법을 포함한다.

일부 실시형태에서, 세포 집단의 단리 방법은 표면 마커, 예를 들어, 표면 단백질, 세포내 마커, 또는 핵산 등과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 마커에 기초한 분리를 위한 임의의 공지된 방법이 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분리는 친화성 또는 면역친화성 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 양태에서 단리는, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션 후에, 일반적으로 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포의 세척 단계 및 분리에 의해 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준 또는 세포의 발현에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함한다.

이러한 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 유지되는 음성 선택을 기반으로 할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획물은 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 양태에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 없는 경우에 유용할 수 있으므로, 분리가 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커를 기반으로 수행될 수 있다.

분리가 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 특정 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현하는 세포의 양성 선택 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 특정 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현하는 세포의 음성 선택, 제거, 또는 고갈은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하지만, 그러한 모든 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다.

일부 예에서, 여러 횟수의 분리 단계가 수행되며, 여기서 한 단계로부터의 양성 또는 음성으로 선택된 분획물은 후속적인 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는, 예를 들어 음성 선택을 위해 표적화된 마커에 대해 각각 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 다중 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다수의 세포 유형은 다양한 세포 유형에 발현된 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 동시에 양성적으로 선택될 수 있다.

본 발명의 양태에서, 세포는 대상체에서 근육 질환(예를 들어, 뒤센느 근육퇴행위축)이 시작되기 전에 단리된다. 다른 양태에서, 세포는 대상체에서 근육 질환(예를 들어, 뒤센느 근육퇴행위축)이 발생한 후에 단리된다.

본 발명의 양태에서, 세포는 대상체에게 투여되기 전에 세포의 수를 확장하도록 배양된다. 본 발명의 양태에서, 세포 집단은 그들의 수를 확장하기 위해 배양된다. 예를 들어, 그 수는 적어도 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 또는 200% 까지 증가할 수 있다. 실시형태에서, 그 수는 적어도 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1,000%, 1,100%, 또는 1,200% 까지 증가할 수 있다. 실시형태에서, 세포 집단은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 까지 배양되고 확장된다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 세포, 예를 들어, 근원성 전구 세포(MPC)의 집단은 이식 가능하고 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 집단이 투여되는 대상체는 세포 집단이 수득된 동일한 대상체이다(예를 들어, 자가 세포 요법의 경우). 일부 실시형태에서, 대상체는 서로 다른 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 근육 손상을 당하고 있거나 정상적인 대상체이다. 예를 들어, 이식을 위한 세포(예를 들어, 근성원 전구 세포(MPC)의 집단을 포함하는 조성물은 이식에 적합한 형태일 수 있다.

치료

하기에 예시된 것과 같이, 퇴행성 근육 소모성 질환 또는 병태를 치료하기 위한 조성물, 용도, 치료법, 약제 및 방법이 또한 제공된다.

근육퇴행위축

근육퇴행위축은 진행성 약화 및 근육량 손실을 유발하는 유전성 질환의 군이다. 근육퇴행위축에서, 비정상적인 유전자(돌연변이)는 건강한 근육을 형성하는 데 필요한 단백질 생성을 방해한다. 대부분의 경우, 근육퇴행위축 환자의 위성 세포에는 근육 생성에 필요한 단백질이 부족하다. 본 발명에서 개발된 위성 세포(예를 들어, 다능성 줄기세포로부터 시험관 내에서 얻은 PAX7+ MPC)는 완전히 기능적이고 건강하다. 그들은 비대칭 세포 분열을 겪을 수 있고, 손상된 근육을 복구하고 새로운 근육을 생성하기 위해 숙주 근모세포와 융합할 근모세포를 생성할 수 있다. 실험 데이터는 이것이 지속적인 근육 재생에 장기적인 치료 효과가 있음을 뒷받침한다.

근병증

근병증은 근육 기능 및 근력의 상실과 연관된 유전성 근육 질환의 군이다. 그러나, 염증성 근병증을 일으키는 원인은 알려져 있지 않지만, 면역 체계에 이상이 생겨 근육 세포가 공격을 받는 것으로 믿어진다. 원인으로는 감염, 약물로 인한 근육 손상, 근육 기능에 영향을 미치는 유전 질환, 전해질 수치 장애, 갑상선 질환 등이 있다. 면역 체계를 회피할 수 있는 근육을 생성할 수 있는 위성 세포를 설계할 수 있다. 따라서, 근원성 전구 세포는 면역계의 표적이 될 수 없으며, 그에 따라 환자의 근육 기능과 근력을 복구할 수 있을 것으로 믿어진다.

미토콘드리아 질환

미토콘드리아 질환은, 신체가 제대로 기능하기 위한 충분한 에너지를 미토콘드리아가 생성하지 못하여 질병이 발생하는 유전성 질환의 군이다. 결과적으로, 이는 근육 약화, 근육통 및 낮은 근육 긴장도를 유발한다. 본 위성 세포는 근육 기능과 근력을 회복시켜 근력 약화를 줄이는 데 도움이 되기 때문에 미토콘드리아 질환으로 고통 받는 환자의 삶의 질을 크게 향상시킬 수 있다고 믿어진다.

연조직 육종

연조직 육종(sarcomas)은 국소 연조직 암의 군이다. 예를 들어, 횡문근육종(rhabdomyosarcoma, RMS)은 완전히 분화하지 못한 골격(가로무늬) 근육 세포에서 발생하는 공격적이고 매우 악성인 암이다. 일반적으로 수술과 화학 요법을 통해 치료되며 높은 생존율을 보이는 경향이 있다. 그러나, 수술 후 제거되거나 국소 방사선 요법에 의해 손상되기 때문에 환자는 환부에 매우 약한 근육을 남긴다. 위성 세포의 주입은 이러한 질병에서 살아남은 환자의 근육 영역에서 근육 재생을 회복하는 데 도움이 될 수 있다고 믿어진다.

이온 채널 질병

이온 채널 질환은 일반적으로 근육 약화, 근육 긴장도 결여 또는 일시적인 근육 마비를 특징으로 하는 이온 채널 결함과 관련된 질병 군이다. 위성 세포는 이러한 환자의 기능적 근육을 회복시키는 데 도움이 될 수 있다고 믿어진다.

악액질

악액질은 신체 구성(근육 손실을 통해), 삶의 질, 수행 상태, 이환율 및 사망률을 변화시키는 병태생리학적 변화를 특징으로 하는 복합적이고 다인성 장애로 암 환자의 최대 절반이 악액질로 사망하고 최대 그들 중 20%는 사망 원인으로 악액질을 가지고 있다. 증가된 유병률의 관점에서, 악액질은 암 동반 질환으로 제안되었다. 위성 세포는 근육 재생을 회복하는 데 도움이 되기 때문에 악액질로 고통 받는 환자의 삶의 질을 크게 향상시킬 수 있다고 믿어진다.

근육감소증

근육감소증은 골격근 양과 기능의 상실을 특징으로 하는 병태이다. 주로 노인의 질병이지만, 그 발달은 노인에게서만 볼 수 없는 병태와 관련될 수 있다. 근육감소증은 골격근량 및 근력의 점진적이고 일반적인 손실을 특징으로 하는 증후군이며, 신체 장애, 열악한 삶의 질 및 사망과 엄밀히 관련이 있다. 시간 외의 위성 세포 손실은 근육감소증의 주요 원인 중 하나로 믿어진다. 위성 세포의 주입은 근육감소증의 진행을 상당히 늦출 수 있다고 믿어진다.

퇴행성 근육 소모 병태의 비 제한적인 예는 다음을 포함한다:

근육퇴행위축:

- 사지 연결 근육퇴행위축(LGMD)

- 베커 근육퇴행위축(BMD)

- 선천성 근육퇴행위축(CMD)

o 베들렘 CMD

o 후쿠야마 CMD

o 근육-눈-뇌 질환(MEB)

o 경직된 척추 증후군

o 울리히 CMD

o 워커-바르부르크 증후군(WWS)

- 뒤센느 근육퇴행위축(DMD)

- 에머리-드라이푸스(Emery-Dreifuss) 근육퇴행위축(EDMD)

- 안면견갑상완 근육퇴행위축(FSHD)

- 근긴장성 근육퇴행위축(DM)

- 안인두 근육퇴행위축(OPMD)

근병증:

- 선천성 근병증

o 모자 근병증

o 중심핵 근병증

o 섬유 유형 불균형이 있는 선천성 근병증

o 핵심 근병증

o 중추핵 질환

o 멀티미니코어 근병증

o 미오신(Myosin) 저장 근병증

o 근 세관성 근병증

o 네말린(Nemaline) 근병증

- 원위부 근병증

o GNE 근병증/노나카 근병증/유전성 봉입체(inclusion-body)

근병증(HIBM)

o 원위부(Laing distal) 근병증

o 마르케스버그-그릭스(Markesberg-Griggs) 후기 발병

원위 근육병증

o 미요시 근병증

o 우드(Udd) 근병증/경골 근육퇴행위축

o VCP 근병증/IBMPFD

o 성대 및 인두 원위 근병증

o 웰랜더(Welander) 원위 근병증

- 내분비 근병증

o 갑상선 기능 항진증 근병증

o 갑상선 기능 저하증 근병증

- 염증성 근병증

o 피부근염

o 봉입체 근염

o 다발성 근염

- 대사성 근병증

o 산성 말타아제 결핍증(AMD, 폼페(Pompe)병)

o 카르니틴 결핍증

o 카르니틴 팔미틸 전이효소 결핍증

o 데브란처(Debrancher) 효소 결핍증(코리병, 포브스병)

o 젖산 탈수소효소 결핍증

o 미오아데닐레이트 데아미나제 결핍증

o 포스포프룩토키나아제 결핍증(타루이병)

o 포스포글리세레이트 키나아제 결핍증

o 포스포글리세레이트 뮤타제 결핍증

o 포스포릴라아제 결핍증(맥아들(McArdle 병)

- 근원섬유 근병증(MFM)

- 견갑골 근병증

미토콘드리아 질환:

- 프리드라이히 운동실조(FA)

- 미토콘드리아 근병증

o 컨스-세이어(Kearns-Sayre) 증후군(KSS)

o 리(Leigh) 증후군(아급성 괴사성 뇌근병증)

o 미토콘드리아 DNA 고갈 증후군

o 미토콘드리아 뇌근병증, 젖산증 및

뇌졸중 유사 에피소드(MELAS)

o 미토콘드리아 신경위장관 뇌근육병증(MNGIE)

o 불규칙한 적색 섬유가 있는 간대성 근간대성 간질(MERRF)

o 신경병증, 운동실조 및 색소성 망막염(NAP)

o 피어슨 증후군

o 진행성 외안근 마비(PEO)

연조직 육종:

- 혈관육종

- 피부섬유 육종 돌기

- 상피양 육종

- 위장관 기질 종양(GIST)

- 카포시 육종

- 평활근 육종

- 지방 육종

- 악성 말초신경초 종양

- 점액섬유 육종

- 다형성 육종

- 횡문근 육종

- 단독 섬유성 종양

- 활액 육종

- 미분화 다형성 육종

이온 채널 질병:

- 안데르센-타윌(Andersen-Tawil) 증후군

- 고칼륨혈증 주기성 마비

- 저칼륨혈증 주기성 마비

- 선천성 근긴장증

o 베커 근긴장증

o 톰슨(Thomsen) 근긴장증

- 선천성 이상근긴장증

- 칼륨 악화 근긴장증

악액질

근육감소증

실시형태에서, 퇴행성 근육 소모성 질환은 근육퇴행위축 또는 근육 소모성 질환이다. 예시적인 근육퇴행위축은 뒤센느 근육퇴행위축, 베커 근육퇴행위축, 사지 연결 근육퇴행위축, 안면견갑상완 근육퇴행위축, 안인두 근육퇴행위축, 에머리-드라이푸스 근육퇴행위축, 후쿠야마형 선천성 근육퇴행위축, 미요시 근병증, 울리히 선천성 근육퇴행위축, 스타이너트(Steinert) 근육퇴행위축이다.

실시형태에서, 근육퇴행위축은 뒤센느 근육퇴행위축(DMD)을 포함한다.

본 방법은 세포를, 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 포유동물 대상체, 이를테면 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포의 공급원은 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다. 세포의 공급원 또는 수용자는 또한 비인간 대상체, 예를 들어 동물 모델일 수 있다. "포유동물"이라는 용어는 마우스, 래트, 소, 양, 돼지, 토끼, 염소, 말, 원숭이, 개, 고양이 및 인간을 포함하는 유기체를 포함한다. 마찬가지로, 이식 가능한 세포는 인간이 아닌 형질전환 유기체를 포함하여 이들 유기체 중 어느 것에서도 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 이식 가능한 세포는 유전적으로 조작되고, 예를 들어 세포는 외인성 유전자를 포함하거나 또는 내인성 유전자를 불활성화시키거나 변경하도록 유전적으로 조작된다.

근원성 전구 세포(MPC) 집단을 포함하는 조성물은 이식 가능한 장치를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 이식 가능한 장치 및 관련 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기술된 화합물 또는 조성물의 연속 또는 서방성 전달이 요구되는 전달 시스템으로서 유용하다. 또한, 이식 가능한 장치 전달 시스템은 화합물 또는 조성물 전달의 특정 지점(예를 들어, 국소 부위, 장기)을 표적화하는 데 유용하다.(Negrin 등, Biomaterials, 22(6):563 (2001)). 대체 전달 방법을 포함하는 서방(timed-release) 기술도 이용할 수 있다. 예를 들어, 중합체 기술, 서방 기술 및 캡슐화 기술(예를 들어, 중합체, 리포솜)을 기반으로 하는 서방형 제형이 또한 본원에 기술된 화합물 및 조성물의 전달에 이용될 수 있다.

실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 초기 근육형성 마커의 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 추가 실시형태에서, 이 방법은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 근원성 전구 세포 집단의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

다른 실시형태에서, 근육 질환 또는 근육퇴행위축(예를 들어, 뒤센느 근육퇴행위축)을 치료하는 방법은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 근원성 전구 세포 집단을, 증상의 시작을 제어하는 방법과 병용하여 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특히, 병용 치료는 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론 및 데플라자코르트), β2 작용제(예를 들어, 살부타몰(예를들어, 알부테롤))의 투여를 포함할 수 있다. 또한, 병용 치료법에는 거슬리지 않는 신체 활동(예를 들어, 수영 포함), 물리 치료, 정형외과 기구(예를 들어, 보조기 및 휠체어), 적절한 호흡 지원이 포함될 수 있다.

실시형태에서, 병용 요법은 아탈루렌(PTC124)(IUPAC명: 3-[5-(2-플루오로페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]벤조산)과 함께, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 근원성 전구 세포의 투여를 포함할 수 있으며, 상기 아탈루렌의 구조는 하기에 제공된다:

기술된 세포는 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 함유하는 약제학적 또는 생리학적으로 허용되는 제제 또는 조성물로서 투여될 수 있고, 인간 및 비인간 동물을 포함하는 관심 수용 유기체의 조직에 투여될 수 있다.

MPC 집단(예를 들어, MPC 집단을 포함하는 조성물)은 멸균 생리 식염수 또는 기타 생리학적으로 허용되는 주사 가능한 수성 액체와 같은 적합한 액체 또는 용액에 세포를 재현탁시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 조성물에 사용되는 성분의 양은 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.

실시예에서, 주사 가능한 투여를 위해, 조성물(예를 들어, MPC 집단을 포함하는 조성물)은 멸균 용액 또는 현탁액에 있거나 약학적으로 및 생리학적으로 허용되는 수성 또는 유지성 비히클에 재현탁될 수 있으며, 이는 보존제, 안정화제 및 용액 또는 현탁액을 수용자의 체액(즉, 혈액)과 등장성으로 만들기 위한 물질을 함유할 수 있다. 사용에 적합한 부형제의 비 제한적인 예는 물, 인산염 완충 식염수, pH 7.4, 0.15M 염화나트륨 수용액, 덱스트로스, 글리세롤, 묽은 에탄올 등, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 예시적인 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜, 단백질, 당류, 아미노산, 무기산 및 유기산이며, 이들은 단독으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다. 이용된 투여 경로뿐만 아니라 양은 개별적으로 결정되며, 당업자에게 공지된 유사한 유형의 적용 또는 적응증에 사용된 양에 해당한다.

본 발명에 따르면, MPC 집단은 근육을 포함하는 신체 조직에 투여될 수 있다. MPC 현탁액의 세포 수와 투여 방식은 치료할 부위와 병태에 따라 다를 수 있다. 다수의 MPC가 본 발명에 따라 투여될 수 있다.

실시형태에서, 인간의 치료 유효량의 조성물(예를 들어, MPC 집단을 포함하는 조성물)이 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물(예를 들어, MPC 집단을 포함하는 조성물)은 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 14일 동안(1일 4회, 1일 3회 또는 1일 2회, 또는 1일 1회) 투여되고, 3주 주기로 7일 휴지기, 최대 5 내지 7일(매일 4회, 1일 3회 또는 2회 또는 1일 1회)동안 및 3주 주기로 14 내지 16일 휴지기, 또는 2일에 1회, 또는 1주일에 1회 또는 매 2주에 1회 주 또는 매 3주에 1회 투여된다.

일 실시형태에서, 조성물(예를 들어, MPC 집단을 포함하는 조성물)은 적어도 1주 동안, 일부 실시형태에서는 1 내지 4주, 2 내지 6주, 2 내지 8주, 2 내지 10주, 또는 2 내지 12주, 2 내지 16주, 또는 그 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 36, 48주 이상) 동안, 주 1회, 또는 2주 마다 1회, 또는 3주마다 1회 또는 4주마다 1회 적어도 1주 동안 투여된다.

약제학적 조성물 및 제형

본 발명은 유효량의 조성물(예를 들어, MPC 집단을 포함하는 조성물) 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 유효량은 본 발명의 방법과 관련하여 상기 기재된 바와 같다.

일 실시형태에서, 조성물(예를 들어, MPC 집단을 포함하는 조성물)은 단일 투여 형태로 적어도 하나의 추가 치료제와 추가로 조합된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론 및 데플라자코르트), β2 작용제(예를 들어, 알부테롤 같은 살부타몰, 또는 아탈루렌(PTC124))(IUPAC명: 3-[5-(2-플루오로페닐)-1,2,4-옥사디아졸-3-일]벤조산)을 포함한다.

용어 "약제학적으로 허용되는"은, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 사람 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 담체 및/또는 투여 형태를 의미한다.

"약제학적으로 허용되는 부형제"는 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 생물학적으로나 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제를 의미하며, 수의학적 용도 및 인간 약제학적 용도에 허용되는 부형제를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예로는 멸균 액체, 물, 완충 식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 오일, 세제, 현탁제, 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 락토스, 수크로스 또는 덱스트란), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산 또는 글루타티온), 킬레이트제, 저분자량 단백질, 또는 이들의 적합한 혼합물이 있으나, 이들에 국한되지 않는다.

약제학적 조성물은 벌크 또는 투여 단위 형태로 제공될 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 약제학적 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 용어 "투여 단위 형태"는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위, 즉 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 발휘하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유하는 각 단위를 지칭한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 효과에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다. 투여 단위 형태는 앰플, 바이알, 좌약, 당의정, 정제, 캡슐, IV 백 또는 에어로졸 흡입기의 단일 펌프일 수 있다.

치료적 적용에서, 투여량은 선택된 투여량에 영향을 미치는 다른 요인 중에서 약제, 연령, 체중 및 수용 환자의 임상 상태, 치료제를 투여하는 임상의 또는 개업의의 경험 및 판단에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 투여량은 치료 유효량이어야 한다. 투여량은 mg/kg/day 측정 단위로 제공될 수 있다(이는 환자의 체중(kg), 체표면적(m²), 연령(년)에 따라 조정될 수 있음). 근육 질환 또는 장애를 치료하는 방법에서 조성물에 대한 예시적인 용량 및 용량 요법은 본 명세서에 기재되어 있다.

약제학적 조성물은 임의의 원하는 경로(예를 들어, 폐, 흡입, 비강내, 경구, 협동맥, 설하, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 흉막내, 경막내, 경피, 경점막, 직장 등)로 투여하기 위한 임의의 적절한 형태(예를 들어, 액체, 에어로졸, 용액, 흡입제, 미스트, 스프레이; 또는 고체, 분말, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 패치 등)를 가질 수 있다. 약제학적 조성물은 임의의 원하는 경로에 의한 투여를 위한 임의의 적합한 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 흡입 또는 통기법(입 또는 코를 통해)에 의한 에어로졸 투여를 위한 수용액 또는 분말 형태; 경구 투여용 정제 또는 캡슐 형태; 직접 주사에 의한 투여 또는 정맥내 주입을 위한 멸균 주입 유체에 첨가에 의한 투여에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액 형태; 또는 경피 또는 경점막 투여를 위한 로션, 크림, 폼, 패치, 현탁액, 용액 또는 좌제의 형태일 수 있다.

실시형태에서, 약제학적 조성물은 주사 가능한 형태를 포함한다.

제약 조성물은 캡슐, 정제, 버컬제(buccal form), 트로키, 로젠지, 및 에멀젼, 수성 현탁액, 분산액 또는 용액 형태의 경구 액체를 포함하는 경구 허용되는 투여 형태의 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 캡슐은 본 발명의 화합물과 약제학적으로 허용되는 전분(예를 들어, 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 설탕, 인공 감미제, 분말 셀룰로오스, 예를 들어 결정질 및 미정질 셀룰로오스, 밀가루, 젤라틴, 검 등과 같은 불활성 충전제 및/또는 희석제의 혼합물을 함유할 수 있다.

약제학적 조성물은 비경구 투여에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 '비경구'는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

약제학적 조성물은 직접 주사 또는 정맥내 주입을 위한 멸균 주입 유체에 첨가에 의한 투여에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태일 수 있고, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적합한 혼합물, 또는 하나 이상의 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매체를 포함한다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 본 발명의 화합물의 용액 또는 현탁액은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 적합한 계면활성제의 예는 아래에 나와 있다. 분산액은 또한 예를 들어 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 오일 중 이들의 혼합물에서 제조될 수 있다.

계면활성제는 일반적으로 지방산과 같은 하나 이상의 긴 지방족 사슬을 갖고 있어, 약물 침투 및 흡수를 향상시키기 위해 세포의 지질 구조에 직접 삽입할 수 있다. 계면활성제의 상대적인 친수성과 소수성을 특성화하기 위해 일반적으로 사용되는 경험적 파라미터는 친수성-친유성 균형("HLB" 값)이다. HLB 값이 낮은 계면활성제는 더욱 소수성이며 오일에 더 큰 용해도를 갖는 반면, HLB 값이 더 높은 계면활성제는 더 친수성이며 수용액에서 더 큰 용해도를 갖는다. 따라서, 친수성 계면활성제는 일반적으로 HLB 값이 약 10보다 큰 화합물로 간주되고, 소수성 계면활성제는 일반적으로 HLB 값이 약 10 미만인 화합물로 간주된다. 그러나 이러한 HLB 값은 많은 계면활성제의 경우 HLB 값을 결정하기 위해 선택한 경험적 방법에 따라 HLB 값이 약 8 HLB 단위만큼 다를 수 있기 때문에 단지 지침일 뿐이다.

본 명세서에 사용된 모든 백분율 및 비율은 달리 명시되지 않는 한 중량 기준이다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 상이한 실시예로부터 명백하게 나타나 있다. 제공된 실시예는 본 발명을 실시하는데 유용한 상이한 구성요소 및 방법론을 예시한다. 실시예는 청구범위의 발명을 제한하지 않는다. 본 발명의 개시내용에 기초하여, 숙련된 기술자는 본 발명을 실시하는데 유용한 다른 구성요소 및 방법론을 식별하고 이용할 수 있다.

근원성 전구 세포 생성용 키트

본 발명의 양태에서, 근원성 전구 세포를 생성하기 위한 키트가 제공된다. 실시형태에서, 키트는 세포 배양 배지(들)을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지는 다능성 줄기세포(PSC) 집단을 배양하는데 적합하다.

다양한 대체 시약(예를 들어, 코팅, 해리제, 자극 시약, 분화 시약 및 배지와 같은 배양 시약)이 본 명세서의 실시형태에서 사용될 수 있다. 예를 들어, PSC, ES 세포 및 iPSC의 배양에는 특정 시약 세트가 필요하지 않다. 그러나 비제한적인 예가 아래에 제공된다.

실시형태에서, 키트는 인간 iPS 및 hES 세포의 성장 및 확장을 위한 배지를 포함한다. 실시형태에서, 배지는 DMEM/F12, 20% 녹아웃 혈청 대체물, 1mM의 L-글루타민, 100mM의 MEM 비필수 아미노산, 및 0.1mM의 β-메르캅토에탄올을 포함한다. 실시형태에서, 10ng/mL의 FGF-2가 멸균 여과 후에 첨가될 수 있다.

실시형태에서, 키트는 ES 및/또는 iPS 세포 선택 및/또는 계대를 위한 시약을 포함한다. 실시형태에서, 시약은 ReLeSRTM 계대 시약(Stemcell Technologies, Vancouver Canada, 카탈로그 번호 05872 또는 05873)이다. 실시형태에서, 시약은 mTeSRTM1(Stemcell Technologies, Vancouver Canada, 카탈로그 번호 85850 또는 85857)이다. 실시형태에서, 시약은 Vitronectin XFTM(Stemcell Technologies, Vancouver Canada, 카탈로그 번호 07180 또는 07190)이다. 실시형태에서, 시약은 Gentle Cell Dissociation Reagent(Stemcell Technologies, Vancouver Canada, 카탈로그 번호 07174)이다. 많은 플레이트 코팅 시약 및 ES/iPSC 매질이 상업적으로 입수 가능하고 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 실시형태에서, 임의의 플레이트 코팅 시약이 이용될 수 있다. 실시형태에서, 코팅 시약은 Gibco 사의 GelTrex(Invitrogen, A1413302)이다. 다른 실시형태에서, 세포는 6 U/mL 디스파제(Invitrogen, 17105041)를 사용하여 또는 기계적으로 매주 계대될 수 있다.

실시형태에서, 키트는 하나 이상의 세포 해리 효소를 포함하는 시약을 포함한다. 실시형태에서, 시약은 TrypLETM 세포 해리 시약(ThermoFisher 카탈로그 번호: A1285901)이다. 실시형태에서, 시약은 TrypLETM Express(Thermo Fisher SKU 번호 12604-013)이다. 실시형태에서, 시약은 StemProTM AccutaseTM 세포 해리 시약(Thermo Fisher 카탈로그 번호 A1110501)이다. 다양한 해리 시약은 당업계에 공지되어 있는 것이 사용될 수 있다. 실시형태에서, 세포는 배양 표면(예를 들어, 플레이트)에서 물리적으로 긁어낼 수 있다. 실시형태에서, 해리 시약은 EDTA 4Na 1X(Invitrogen, 25200114)과 함께 트립신 EDTA 0.25% 트립신을 포함하거나, 또는 다른 실시형태에서, Accutase(Invitrogen, S-1100-1, AT-104)를 포함한다. 실시형태에서, 키트는 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGF2) 및/또는 섬유아세포 성장 인자 8을 포함한다.

실시형태에서, 키트의 세포 배양 배지는 PSC 집단을 배양하는 데 적합하다.

실시형태에서, 키트의 세포 배양 배지는 약 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1% 또는 0.5% 혈청을 포함한다. 실시형태에서, 키트는 약 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1% 또는 0.5% 의 혈청을 사용하도록 구성된다.

실시형태에서, 키트의 세포 배양 배지는 무혈청 세포 배양 배지이다.

실시형태에서, 키트는 혈청을 포함하지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물을 포함하는 포장 및 키트를 제공한다. 키트는 병, 바이알, 앰플, 블리스터 팩 및 주사기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 질병, 병태 또는 장애(예를 들어, 근육퇴행위축)을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 하나 이상의 설명서, 하나 이상의 주사기, 하나 이상의 어플리케이터, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 재구성하기에 적합한 멸균 용액을 추가로 포함할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 특정 실시형태를 예시하고, 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.

본 명세서의 실시형태는 하기 실시예 및 상세한 프로토콜에 의해 추가로 예시된다. 그러나, 실시예는 단지 실시형태를 예시하기 위한 것이며, 본 명세서의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌 및 공개된 특허 및 특허 출원의 내용은 여기에 참조로 포함된다.

실시예 1: 인간 다능성 줄기세포( hPSC ) 로부터 유래한 PAX7 :: MPC는 생체 외에서 유지되고, 근육 재생에 참여할 수 있다.

PAX7은 근육 발달 중 근육 계통과 성체 근육 줄기세포에서 특이적으로 발현된다⁷. 자가 재생 능력으로 인해, 마우스 근육 줄기세포는 근모세포에 비해 더 바람직한 이식 결과를 달성하였다^{2 ,8}. 인간에서 잠재적인 근육 줄기세포 이식 요법을 연구하도록 전구 세포 집단을 얻기 위해, CRISPR-Cas9 기술을 이용하여 PAX7::GFP hESC 리포터 세포주를 얻었다(도 5a).

hPSC 6으로부터의 근원성 유도 과정 동안(도 1A), PAX7::GFP 발현 세포는 18일째에 검출될 수 있고, 세포 수는 18일 내지 30일째 사이에 점진적으로 증가할 수 있다. 30일째에 수집할 때 GFP 발현 세포의 비율은 5 내지 10%에 도달할 수 있다(도 1b). FACS에 의해 단리되고 배양물에서 생체 외에서 유지된 후, 그들은 급속히 확장되었고, 약 30-40%의 세포가 염기성-fgf2 및 fgf8이 첨가된 배지에서 배양될 때 유세포 분석기(flowcytometer) 및 IF에 의해 검출된 GFP 발현을 유지하였다(도 1b 및 도 5c). 이러한 세포를 PAX7::GFP 근원성 전구 세포(PAX7::GFP MPC)라고 지칭한다. PAX7::GFP MPC의 근육성 능력을 확인하기 위해, GFP+ 세포가 PAX7::GFP MPC 생체 외 배양에서 초기 근원성 마커인 PAX7 및/또는 MYOD도 발현하는 것으로 관찰되었다(도 5b-c). 그리고 이들 PAX7::GFP MPC는 중간 정도의 혈청 제거 후에 근관에 융합될 수 있었다(도 5c).

실시예 2: PAX7 :: GFP MPC의 근원성 재생 능력

이들 세포의 근원성 재생 능력을 조사하기 위해, Pax7::GFP hESC 근원성 유래 배양물(비 선별) 및 생체 외에서 확장한 Pax7::GFP MPCs (선별 및 확장)에 직접 유래하는 비 션별 세포를 면역 부전(immunodeficient) 마우스(NSG)로 이식하고, 이식 계획을 비교하였다(도 1b). 이들 마우스의 전방 경골(TA, tibialis anterior) 중 하나에 방사선을 조사하여 위성 세포를 고갈시키고, 근육 섬유를 1.2% BaCl₂에 의해 손상시켜 이식된 세포로부터 새로운 섬유를 형성할 수 있도록 하였다. TA는 이식 4주 후에 수집되었다(도 1c). 선별 및 확장된 PAX7::GFP MPC는 인간 특이적 DYSTROPHIN 항체에 의해 검출된 근섬유로 분화되고 융합되었다(도 1d-1e). 반대로, 선별되지 않은 세포는 조직화된 근섬유로 재생하는 데 실패했으며, 대신 대부분의 세포가 근관을 형성하지 않고, 섬유아세포로 전환 분화될 수 있다(도 1d-1e). 제한된 소량의 DYSTROPHIN 양성 근섬유만 검출되었으며, 이는 근육 줄기세포 치료의 임상적 성공을 억제하는 제한 요소이었다^{9 -13}. 세포는 정제 없이 배양물로부터 직접 해리될 수 있었으며, 따라서 뉴런 및 섬유아세포와 같은 다른 세포 유형을 함유할 수 있었다¹⁴.

다음 연구에서는 선별 및 확장된 PAX7::GFP+ MPC 세포를 사용하였다. 위의 증거는 PAX7::GFP MPC가 근육 재생에 참여하고, 근섬유를 발현하는 huDYSTROPHIN을 형성하는 숙주 근육에 융합될 수 있음을 뒷받침한다.

실시예 3: PAX7 :: GFP MPC의 재증식 및 생착 분석 및 이들의 근원성 전구 특성 분석

PAX7::GFP MPC의 재확장 및 생착 능력을 더 잘 이해하고 이들의 근원성 전구 특성을 추가로 확인하기 위해, GFP 신호가 있는 이식된 MPC의 파멸(fate)은 NSG 마우스의 TA에 생체 내 이식 후 추적되었다. 이식 4주 후, 세포를 TA로부터 단리하고 단핵 세포를 수집하였다. 단핵 세포의 총 수로부터 회복된 이식 후 4주 동안 여전히 GFP를 발현하는 세포의 백분율은, 단일 TA로부터 분리된 경우 최대 0.025%, 또는 4개의 TA가 함께 폴링된 경우 0.09%에 도달할 수 있다(도 2a 및 2b). TA로부터 단리된 PAX7::GFP MPC(PAX7::MPC 생체 내)의 상태를 확인하기 위해, 단일 세포 QPCR은, TA로부터 단일 세포를 발현하는 단리된 GFP에서 PAX7 및 GFP의 발현 수준이, 이식 전의 PAX7::GFP+ MPC(확장 후: PE)와 비교하여, 확장 전의 수준(BE)과 유사하게 높았다는 것을 검출하였다(도 2C-2D).

그 다음, PAX7::GFP+ 세포의 위치를 생체 내에서 조사하였다. PAX7 및 huLAMINA/C 이중 표지를 사용하여 PAX7::GFP+ MPC의 자손을 추적하였다. 모든 인간 세포 중에서, 일부 세포는 성체 근육 줄기세포가 위치하는 기저판 아래에 존재하는 것으로 밝혀졌다(도 2e). 그리고 이들 세포를 단리했을 때, PAX7::GFP 양성인 세포는 정지 줄기세포의 특징인 세포 주기의 G0 기(phase)에 있는 것으로 검출되었다(도 2f-2g).

요약하면, 이식된 PAX7::GFP MPC는 근육 재생에 참여할 뿐만 아니라 이식된 PAX7::GFP+ MPC로 지칭되는 근육 줄기세포 기생위치 영역에 숨어 있는 PAX7 발현 세포가 되었다.

그 다음, 이 실시예는 IF 섹션으로 이식에 사용된 세포 수에 대해 이식 후 기생위치 영역에 위치한 세포의 백분율을 추가로 정량화하였다. 세포를 시험관 내에서 확장하고 마우스에 이식하였다. 4주 후, 이들 초대 마우스로부터 세포를 단리하고 20마리의 다른 마우스에 이식하였다. 결과(도 6)로부터, 세포가 생체 내에서 효율적으로 생착할 수 있음을 입증하였다. 기생 위치 영역에 위치한 세포의 백분율은 IF 섹션으로부터 이식에 사용된 세포 수에 대해 이식 후 정량화되었다.

실시예 4: PAX7 :: GFP + 이식 세포 및 "성체 위성 세포" 특성 분석

그 다음, PAX7::GFP+ 이식된 세포가 "성체 위성 세포" 특성을 갖는지 여부를 결정하였다. 단일 세포 RNA-seq는 PAX7::GFP MPC가 PAX7::GFP 이식된 세포가 되는 전이 과정 동안 전사 프로파일 변화를 분석하고 해석하는 데 사용되었다. 한편, 시험관 내에서 분화되지 않은 OCT4::GFP+ hESC 및 확장된 Pax7::GFP MPC를 한 달 동안 포함시켰다.

먼저 Pax7GFP+ 이식된 세포가 Pax7GFP MPC보다 RNA 함량이 낮음을 알 수 있었다(도 3a). 이 현상은 활성화된 위성 세포와 비교할 때 정지된 위성 세포에서 발견되었다^{15 ,16}. 주성분 분석(PCA)에 의해, hESC, 주입 및 확장된 세포(1주 및 1개월 시험관 내 확장)가 자체 유형의 세포와 함께 밀접하게 클러스터화 되었음이 입증되었다. PCA의 또 다른 관찰에 의해, 생체 외 1개월 확장은 전사 방식으로 PAX7::GFP MPC 특성을 변경하지 않았다.

PAX7::GFP 생착 과정에서 발생한 변화를 이해하기 위해, PAX7::GFP MPC와 생착된 PAX7::GFP MSC 간의 전사 프로파일 변화를 비교하였다. 이식된 PAX7::GFP MSC에서 PAX7::GFP+ MPC와 비교하여 490개의 유전자가 상향 조절되었고 11,336개의 유전자가 하향 조절되었다(도 3c). 세포 주기 진행을 조절하는 유전자는 하향 조절되어, 생착된 세포가 생체 내에서 마우스 위성 세포에서 관찰된 세포 주기를 종료했음을 나타낸다. 하향 조절된 유전자 중에서, 위성 세포가 정지 상태¹⁷로 돌아갈 때 손실되는 것으로 보고된 MyoD1은 생착 과정에서 억제되는 것으로 밝혀졌다. 발현이 근육 줄기세포 분화를 마킹하는 또 다른 2개의 전사 인자 MEF2C 및 Myogenin이 발현을 감소시켰다¹⁸. 고도로 상향 조절된 전사체에는 세포 분화를 부정적으로 조절하는 세포 외 기질 관련 유전자(COL1A1 및 LAMA4) 및 노치 신호전달 관련 유전자(NOTCH3 및 HEYL)가 포함된다(도 3d).

정지 상태로의 전환 타임라인을 추가로 이해하기 위해, 이 실시예에서는 이식 후 각각 1주, 2주, 3주 및 4주 시점에 TA로부터 단리된 PAX7::GFP+ 세포에서 단일 세포 RNA-seq를 수행하였다. 이 실시예에서는, 스크랜(scran)을 사용하여 두 가지 시퀀싱 연구의 결과를 비교하려고 하였다. 흥미롭게도, PAX7::GFP+ 세포의 전사체 변화는 이식 첫 주 내에 발생하였으며, 첫 주 이후에는 크게 변하지 않았다는 것이 밝혀졌다(도 9). 이 현상은 PAX7:GFP+ 세포가 정지된 근육 줄기세포 상태로의 전환이 근육 복구에 비해 상대적으로 빠르게 발생함을 시사한다.

실시예 5: 자가 재생을 위한 PAX7 :: GFP + 이식된 세포의 분석

근육 줄기세포의 또 다른 특징은 줄기세포의 기능적 생착의 핵심인 자가 재생 능력이다. 최초의 PAX7::GFP+ MPC 이식 후의 TA가 최초 손상 4주 후에 재손상한 경우, 재손상 실험이 먼저 수행되었다(도 4a). 2 회째 손상 후, 최초 손상이 남긴 후에 형성된 인간 기원의 근섬유가 남아 있지 않았다(도 4b). 그리고 재손상 4주 후, huDYTROPHIN으로 표지된 PAX7::MPC의 자손으로부터, 강력한 새로운 근육 재생이 관찰되었으며, 이는 이식된 PAX7::GFP MPC가 근육 재생에 참여할 수 있음을 나타낸다(도 4b). 또한, 이식된 PAX7::GFP MPC 세포를 단리하고, 두 번째 수용자 마우스에 이식한 경우, 이러한 세포가 근섬유를 형성할 수 있을 뿐만 아니라 성체 근육 줄기세포와 유사한 방식으로 기생위치 영역에 존재하는 PAX7 발현 세포가 될 수 있다(도 4d-e).

이식 후 PAX7::GFP+ 세포의 인간 기원의 확인은 도 8a 및 8b에서 추가로 나타나 있다. 도 8a 및 8b는 이식 후 PAX7::GFP+ 세포의 인간 기원을 나타내는 오점 및 일련의 그래프를 나타낸다. 도 8a: 주입된 TA로부터 단리된 PAX7::GFP+ 세포의 기원을 결정하기 위해 인간 특이적 프라이머를 사용하여 게놈 PCR을 수행하였다. 도 8b: 단일 세포 RNA-seq 결과의 서열 비교는 주입된 TA로부터 단리된 PAX7::GFP+ 세포의 대부분이 인간 세포임을 나타낸다.

실시예 6: 동물 운동 시험

이 실시예에서, PAX7::GFP MPC를 NSG-MDX 마우스(면역 시스템이 저하된 DMD 마우스 모델)에 주사하였다. 그 다음, 러닝 머신 실행 테스트가 수행되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 결과는 대조군과 비교하여 이들 마우스 개선의 증가를 나타낸다.

실시예 7: 확장된 PAX7 :: GFP + MPC 세포의 특성화

상기 실시예는 hPSC로부터 유래된 PAX7::GFP+ MPC 세포가 우수한 재증식 및 생착 능력을 갖는다는 것을 입증하였다. 이 실시예는 분자 서명, 특히 세포 표면 마커와 관련하여 세포를 특성화하였다.

단일 세포 RNA 발현 분석에 의해, 이러한 PAX7::GFP+ MPC 세포에 대한 세포 표면 마커의 독특한 특징이 밝혀졌다. 아래 표에 요약된 바와 같이, 특징에는 CHRNA1+, NTSR1+, FZD1+, FZD5-, GPR37- 및 GPR27-이 포함되어 있다.

실시예 2는 선별 및 확장된 PAX7::GFP MPC가 생체 내에서 분화되고 근섬유로 융합될 수 있는 반면, 선별되지 않은 세포는 조직화된 근섬유로 재생하는데 실패했음을 입증하였다. 이 실시예는 또한 생착을 위한 최소 PAX7+ 세포 농도를 추가로 조사하였다.

세포 집단에서 PAX7+ 세포가 약 5% 또는 10%만 존재할 때, 집단은 생착에서 무시할만한 활성을 가졌다. PAX7+ 집단이 적어도 30%, 보다 명백하게는 35% 내지 40%일 때, 효율적인 생착 및 조직 재생 능력을 나타냈다.

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실시예 8: 재료 및 방법

동물 및 세포 이식 전략

모든 동물 실험은 존스 홉킨스 대학교, 의과대학(메릴랜드주, 볼티모어)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다. NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, Jackson Lab) 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근하면서 12시간 광주기(오전 7시 - 오후 7시)로 유지되었다. 마우스의 좌측 TA는 50㎕ 1.2% BaCl₂ 손상 72시간 전에 조사(18g)되었다. 1백만 PAX7::GFP MPC를 락(rock) 억제제가 보충된 50μl 배양 배지에 재현탁하고 TA에 주입되었다.

근세포 유래 및 세포 배양:

근원성 계통 유도를 위해,

hPSC (H9 세포주)(인간 배아 줄기 세포주, Coriell에서 구입) 및 GM01582iPSC(재 프로그래밍된 인간 유도 다능성 줄기 세포주, 원래 섬유아세포주는 Coriell에서 구입)는 10ng/ml의 FGF-2(PeproTech) 및 10μM의 Y-27632(Cayman)를 포함하는 MEF-컨디셔닝된 N₂ 배지의 존재 하에 24웰 플레이트에서 웰당 1.5 x 10⁵개의 세포 밀도로 Geltrex(Gibco) 처리 접시에 단일 세포로 플레이팅하였다. 세포는 글리코겐 합성효소 키나제 3(GSK-3)의 선택적 억제제, 예를 들어 CHIR99021(Tocris, 미네소타주 미니애폴리스 소재 Bio-Techne Corporation)(3μM)를 N₂ 배지에서 4일 동안 추가한 다음, 이어서 8일 동안 DAPT(10μM)를 첨가함으로써 근모세포로 분화하도록 유도하였다. 세포는 다음 13일 동안 N₂ 배지에서 계속 분화하고 성숙하였다. 근모세포는 선택 마커 NCAM+/HNK1-(NCAM:5.1H11, DSHB; HNK1: C6680, Sigma)를 사용하여 FACS에 의해 단리되었다. PAX7::GFP+ 세포는 GFP 신호가 있는 FAC에 의해 단리되었다.

NCAM+/HNK1-근모세포는 37℃에서 5% CO₂를 함유하는 가습 인큐베이터에서 유지되었고, 10% FBS로 보충된 N₂ 배지에서 성장하였다. PAX7::GFP MPC는 20% FBS, b-FGF2 및 FGF8로 보충된 N₂ 배지에서 유지되었다. 근관 형성을 유도하기 위해, 확장된 근세포를 융합(confluence)될 때까지 플레이팅하고 혈청이 없는 N₂ 배지로 전환하였다.

근육으로부터 단핵 세포의 단리 및 Pyronin Hoechst 세포 주기 분석:

2 mg/ml 콜라게나제 A(Roche), 2.4 U/ml Dispase II(Roche), 10 ㎍/ml DNase I(Roche) 및 0.38mM CaCl₂를 함유하는 PBS를 사용하여 TA 근육으로부터 단핵 세포를 단리하였다. 분해(digested)된 세포를 FAC 분석을 위해 2% FBS 및 DNaseI를 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 세포 주기 분석을 위해, 세포를 37℃에서 15분 동안 1% PFA에 고정하고 -20℃에서 밤새 100% 메탄올에 투과처리화였다. 다음날, 세포를 세척하고 차단 완충액(PBS 중 0.75% 사포닌, 1% FBS, 1% BSA)에서 차단하였다. 1차 GFP 항체(Invitrogen) 및 2차 항체(염소 안티 치킨 488)를 실온에서 30분 동안 염색하였다. 그 다음, 세포를 DNA 및 RNA 결합을 위해 Hoechst 33342(2μg/mL) 및 Pyronin-Y(4μg/mL)를 함유하는 차단 완충액에 30분 동안 현탁하였다. 마지막으로, 세포는 유세포 분석을 위해 파이로닌-Y(2μg/mL)를 함유하는 FAC 완충액에 현탁되었다.

면역세포화학 및 면역조직화학

근육 조각을 수집하고 -60℃의 이소펜탄을 사용하여 동결시켰다. 동결된 근육을 8μm 섹션으로 동결절단하였다. 동결 절편을 차가운 메탄올로 고정한 후, PBS로 세척한 다음, 20% 정상 염소 혈청(Vector Laboratories) 및 2% 소 혈청 알부민(Sigma Aldrich)에서 차단하였다. 인간 라민 A+C(마우스 IgG2b, 1:100, Leica), 범종 Pax7(IgG1, 1:1, DSHB) 및 인간 라미닌(IgG2a, 1:100, DSHB)에 대한 1차 항체를 4℃의 슬라이드에서 밤새 배양하였다. 디스트로핀을 검출하기 위해, 인간 디스트로핀(Millipore, 1:200)에 대한 1차 항체와 인간 라민 A+C의 조합물을 4℃의 슬라이드에서 밤새 배양한 다음, 실온에서 1 시간 동안 마우스 항-마우스 이차 항체와 함께 배양하였다. DAPI(Vector Laboratories)가 구비된 Vecta Shield 봉입제(mounting medium)를 사용하여 섹션을 봉입하고, 형광 현미경(Zeiss)을 사용하여 이미지화 하였다.

단일 세포 RNA 시퀀싱

Sony SH800 선별기를 사용하여 96-웰 또는 384-웰 캡처 플레이트에서 단일 세포로서 Pax7-GFP+ 세포를 형광 활성화 세포 선별(Fluorescence-Activated Cell Sorting)에 의해 선별하였다. 캡처 플레이트 웰은 5㎕의 캡처 용액(1:500 Phusion High-Fidelity Reaction Buffer, New England Biolabs; 1:250 RnaseOUT Ribonuclease Inhibitor, Invitrogen)을 함유하였다. 그 다음, 이전에 설명한 SCRB-seq 프로토콜을 사용하여 단일 세포 라이브러리를 조제하였다^{1 -2}. 간단히 말해서, 세포를 단백질분해효소 K 처리한 후, RNA 건조를 수행하여 반응 부피를 줄였다. RNA는 이후 맞춤형 템플릿 전환 프라이머와 바코드 어댑터 프라이머를 사용하여 역전사되었다. 맞춤형 SCRB-seq 바코드 프라이머는 고유한 6개 염기쌍 세포별 바코드와 10개 염기쌍 고유 분자 식별자(UMI)를 포함한다. 전사된 생성물은 통합되지 않은 바코드 프라이머로 풀링(pool)되고 농축되었으며, 이후 엑소뉴클레아제 처리를 이용하여 분해되었다. cDNA는 Terra PCR Direct Polymerase(Takara Bio)를 사용하여 PCR 증폭되었다. 최종 라이브러리는 앞서 설명한 맞춤형 P5 프라이머를 사용하여 Nextera XT 키트(Ilumina)와 함께 라이브러리당 1ng의 cDNA를 사용하여 조제되었다. 풀링된 라이브러리는 16 염기쌍 바코드 읽기, 8 염기쌍 i7 인덱스 읽기, 및 66 염기쌍 cDNA 읽기 디자인으로 Illumina NextSeq500의 2개 고출력 레인에서 시퀀싱되었다.

시퀀싱 데이터를 분석하기 위해, 기본 설정과 목록으로 제공되는 바코드를 사용하고, zUMI 2.2.3³을 사용하여 읽기를 매핑하고 계수하였다. zUMI는 STAR(2.5.4b)⁴를 이용하여 읽기를 입력 참조 게놈에 매핑하고, Rsubread(1.28.1)를 통해 카운트를 기능시켜 카운트 및 UMI 테이블을 표로 만들었다. ERCC 스파이크-인(spike-in) 참조와 연결된 Ensembl의 GRCh38이 참조 게놈 및 유전자 주석에 사용되었다. 차원 삭감 및 클러스터 분석은 Seurat(2.3.4)⁶에서 수행되었으며, 차등(differential) 유전자 발현 분석은 Monocle(2.4.0)⁷에서 수행되었다. GO 농축 분석은 Gene Ontology Consortium tool^{8 -10}을 통해 차등적으로 발현된 유전자에 대해 수행되었으며, REVIGO¹¹을 사용하여 농축 용어 및 경로를 시각화하였다.

참고문헌

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3. Parekh S, Ziegenhain C, Vieth B, Enard W, Hellmann I. ZUMIs - A fast and flexible pipeline to process RNA sequencing data with UMIs. Gigascience 2018, 7(6).

4. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, Chaisson M, Gingeras TR. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 2013, 29(1):15-21.

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7. Qiu X, Mao Q, Tang Y, Wang L, Chawla R, Pliner HA, Trapnell C. Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories. Nat Methods,　2014, 14:979-982.

8. Gene Ontology Consortium et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet, 2000, 25(1):25-29.

9. Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology Resource: 20 years and still Going strong. Nucleic Acids Res, 2019, 47(D1):330-338.

10. Mi H, Huang X, Muruganujan A, Tang H, Mills C, Kang D, Thomas PD. PANTHER version 11: expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acid Res, 45(D1):183-189.

11. Supek F, Bosnjak M, Skunca N, Smuc Tomislav. REVIGO Summarizes and Visualizes Long Lists of Gene Ontology Terms. PLOS One, 2011.

기타 실시형태

본 발명이 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이지 제한하기 위한 것은 아니다. 다른 양태, 이점 및 수정은 다음 청구 범위 내에 있다.

본 명세서에 언급된 특허 및 과학 문헌은 당업자가 이용할 수 있는 지식을 확립한다. 참고문헌, 예를 들어 미국 특허, 미국 특허출원 공보, 미국을 지정하는 PCT 특허출원, 공개된 외국 특허 및 본 명세서에 인용된 특허출원은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 인용된 수탁 번호로 표시된 Genbank 및 NCBI 제출물은 참조로 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 인용된 다른 모든 출판된 참고문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌은 참조로 본 발명에 포함된다. 충돌하는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 것이 아니다.

본 발명이 바람직한 실시양태를 참조하여 구체적으로 표현되고 설명되었지만, 본 기술분야의 숙련자라면 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 첨부된 청구범위에 의해 형태 및 세부 사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY <120> METHODS, COMPOSITIONS, AND KITS FOR PRODUCING SKELETAL MUSCLE STEM CELLS AND TREATING DISORDERS <130> 048317-563001WO <140> PCT/US2020/026603 <141> 2020-04-03 <150> 62/828,973 <151> 2019-04-03 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 520 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Leu Pro Gly Thr Val Pro Arg Met Met Arg Pro Ala Pro 1 5 10 15 Gly Gln Asn Tyr Pro Arg Thr Gly Phe Pro Leu Glu Val Ser Thr Pro 20 25 30 Leu Gly Gln Gly Arg Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Ile Asn Gly 35 40 45 Arg Pro Leu Pro Asn His Ile Arg His Lys Ile Val Glu Met Ala His 50 55 60 His Gly Ile Arg Pro Cys Val Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His 65 70 75 80 Gly Cys Val Ser Lys Ile Leu Cys Arg Tyr Gln Glu Thr Gly Ser Ile 85 90 95 Arg Pro Gly Ala Ile Gly Gly Ser Lys Pro Arg Gln Val Ala Thr Pro 100 105 110 Asp Val Glu Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Lys Arg Glu Asn Pro Gly Met 115 120 125 Phe Ser Trp Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Lys Asp Gly His Cys Asp 130 135 140 Arg Ser Thr Val Pro Ser Gly Leu Val Ser Ser Ile Ser Arg Val Leu 145 150 155 160 Arg Ile Lys Phe Gly Lys Lys Glu Glu Glu Asp Glu Ala Asp Lys Lys 165 170 175 Glu Asp Asp Gly Glu Lys Lys Ala Lys His Ser Ile Asp Gly Ile Leu 180 185 190 Gly Asp Lys Gly Asn Arg Leu Asp Glu Gly Ser Asp Val Glu Ser Glu 195 200 205 Pro Asp Leu Pro Leu Lys Arg Lys Gln Arg Arg Ser Arg Thr Thr Phe 210 215 220 Thr Ala Glu Gln Leu Glu Glu Leu Glu Lys Ala Phe Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Tyr Pro Asp Ile Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Gln Arg Thr Lys Leu 245 250 255 Thr Glu Ala Arg Val Gln Val Trp Phe Ser Asn Arg Arg Ala Arg Trp 260 265 270 Arg Lys Gln Ala Gly Ala Asn Gln Leu Ala Ala Phe Asn His Leu Leu 275 280 285 Pro Gly Gly Phe Pro Pro Thr Gly Met Pro Thr Leu Pro Pro Tyr Gln 290 295 300 Leu Pro Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Thr Thr Ile Ser Gln Asp Gly Gly 305 310 315 320 Ser Thr Val His Arg Pro Gln Pro Leu Pro Pro Ser Thr Met His Gln 325 330 335 Gly Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Thr Ser Ser Ala Tyr 340 345 350 Gly Ala Arg His Ser Phe Ser Ser Tyr Ser Asp Ser Phe Met Asn Pro 355 360 365 Ala Ala Pro Ser Asn His Met Asn Pro Val Ser Asn Gly Leu Ser Pro 370 375 380 Gln Val Met Ser Ile Leu Gly Asn Pro Ser Ala Val Pro Pro Gln Pro 385 390 395 400 Gln Ala Asp Phe Ser Ile Ser Pro Leu His Gly Gly Leu Asp Ser Ala 405 410 415 Thr Ser Ile Ser Ala Ser Cys Ser Gln Arg Ala Asp Ser Ile Lys Pro 420 425 430 Gly Asp Ser Leu Pro Thr Ser Gln Ala Tyr Cys Pro Pro Thr Tyr Ser 435 440 445 Thr Thr Gly Tyr Ser Val Asp Pro Val Ala Gly Tyr Gln Tyr Gly Gln 450 455 460 Tyr Gly Gln Ser Glu Cys Leu Val Pro Trp Ala Ser Pro Val Pro Ile 465 470 475 480 Pro Ser Pro Thr Pro Arg Ala Ser Cys Leu Phe Met Glu Ser Tyr Lys 485 490 495 Val Val Ser Gly Trp Gly Met Ser Ile Ser Gln Met Glu Lys Leu Lys 500 505 510 Ser Ser Gln Met Glu Gln Phe Thr 515 520 <210> 2 <211> 2271 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaaagctggt gtggagggag aagcgagtgt ggtccggaga aagaaggcgt ggagaagagg 60 gagggagcga gagcgagaga ataaatatat aaataaatac gagaacgaaa 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Lys Ile Leu Cys Arg Tyr Gln Glu Thr Gly Ser Ile 85 90 95 Arg Pro Gly Ala Ile Gly Gly Ser Lys Pro Arg Gln Val Ala Thr Pro 100 105 110 Asp Val Glu Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Lys Arg Glu Asn Pro Gly Met 115 120 125 Phe Ser Trp Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Lys Asp Gly His Cys Asp 130 135 140 Arg Ser Thr Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Ser Arg Val Leu Arg Ile 145 150 155 160 Lys Phe Gly Lys Lys Glu Asp Asp Glu Glu Gly Asp Lys Lys Glu Glu 165 170 175 Asp Gly Glu Lys Lys Ala Lys His Ser Ile Asp Gly Ile Leu Gly Asp 180 185 190 Lys Gly Asn Arg Leu Asp Glu Gly Ser Asp Val Glu Ser Glu Pro Asp 195 200 205 Leu Pro Leu Lys Arg Lys Gln Arg Arg Ser Arg Thr Thr Phe Thr Ala 210 215 220 Glu Gln Leu Glu Glu Leu Glu Lys Ala Phe Glu Arg Thr His Tyr Pro 225 230 235 240 Asp Ile Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Gln Arg Thr Lys Leu Thr Glu 245 250 255 Ala Arg Val Gln Val Trp Phe Ser Asn Arg Arg Ala Arg Trp Arg Lys 260 265 270 Gln Ala Gly Ala Asn Gln Leu Ala Ala Phe Asn His Leu Leu Pro Gly 275 280 285 Gly Phe Pro Pro Thr Gly Met Pro Thr Leu Pro Pro Tyr Gln Leu Pro 290 295 300 Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Thr Thr Ile Ser Gln Asp Gly Gly Ser Thr 305 310 315 320 Val His Arg Pro Gln Pro Leu Pro Pro Ser Thr Met His Gln Gly Gly 325 330 335 Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Ala 340 345 350 Arg His Ser Phe Ser Ser Tyr Ser Asp Ser Phe Met Asn Pro Gly Ala 355 360 365 Pro Ser Asn His Met Asn Pro Val Ser Asn Gly Leu Ser Pro Gln Val 370 375 380 Met Ser Ile Leu Ser Asn Pro Ser Ala Val Pro Pro Gln Pro Gln Ala 385 390 395 400 Asp Phe Ser Ile Ser Pro Leu His Gly Gly Leu Asp Ser Ala Ser Ser 405 410 415 Ile Ser Ala Ser Cys Ser Gln Arg Ala Asp Ser Ile Lys Pro Gly Asp 420 425 430 Ser Leu Pro Thr Ser Gln Ser Tyr Cys Pro Pro Thr Tyr Ser Thr Thr 435 440 445 Gly Tyr Ser Val Asp Pro Val Ala Gly Tyr Gln Tyr Ser Gln Tyr Gly 450 455 460 Gln Thr Ala Val Asp Tyr Leu Ala Lys Asn Val Ser Leu Ser Thr Gln 465 470 475 480 Arg Arg Met Lys Leu Gly Glu His Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Pro 485 490 495 Val Glu Thr Gly Gln Ala Tyr 500 <210> 4 <211> 4275 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 agagacgcca agaggtttat ccagccgact ctggattcgt ctccagcgtg cgcaggaatg 60 gcggcgctgc ccggcgcggt ccccaggatg atgagacccg gcccggggca gaactacccg 120 cgcaccggct tccccctgga agtgtccacc cctcttggcc aaggccgggt caatcagctt 180 ggtggggtct tcatcaacgg tcgacccctg ccgaaccaca tccgtcacaa gatagtggaa 240 atggcccacc atggcatccg gccctgcgtc atctcccgtc agctccgtgt ttcccatggt 300 tgtgtctcca agattctgtg ccgatatcag gagactgggt ccatccggcc cggggctatc 360 ggaggcagca agcccagaca ggtggcgact ccggatgtgg agaaaaagat tgaggagtat 420 aagagagaga accccgggat gttcagctgg gaaatccggg accggctgct gaaggacggt 480 cactgcgacc gaagcacggt gccctcagtg agttcgatta gccgagtgct cagaatcaag 540 ttcgggaaga aagaggacga cgaggaagga gacaagaaag aagaagatgg cgagaagaaa 600 gccaaacaca gcatcgatgg catcctgggc gacaaaggga accgtctgga tgagggctca 660 gatgtggaat cagaacccga cctccccctg aagcgcaagc agcgccgcag tcggaccacg 720 ttcacagccg agcagctgga ggagctggag aaggccttcg agaggaccca ctacccggac 780 atctacaccc gggaggagct 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Ala Ala Ala 165 170 175 Ala Phe Tyr Ala Pro Gly Pro Leu Pro Pro Gly Arg Gly Gly Glu His 180 185 190 Tyr Ser Gly Asp Ser Asp Ala Ser Ser Pro Arg Ser Asn Cys Ser Asp 195 200 205 Gly Met Met Asp Tyr Ser Gly Pro Pro Ser Gly Ala Arg Arg Arg Asn 210 215 220 Cys Tyr Glu Gly Ala Tyr Tyr Asn Glu Ala Pro Ser Glu Pro Arg Pro 225 230 235 240 Gly Lys Ser Ala Ala Val Ser Ser Leu Asp Cys Leu Ser Ser Ile Val 245 250 255 Glu Arg Ile Ser Thr Glu Ser Pro Ala Ala Pro Ala Leu Leu Leu Ala 260 265 270 Asp Val Pro Ser Glu Ser Pro Pro Arg Arg Gln Glu Ala Ala Ala Pro 275 280 285 Ser Glu Gly Glu Ser Ser Gly Asp Pro Thr Gln Ser Pro Asp Ala Ala 290 295 300 Pro Gln Cys Pro Ala Gly Ala Asn Pro Asn Pro Ile Tyr Gln Val Leu 305 310 315 320 <210> 6 <211> 1803 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aggggtgagg aagccctggg gcgctgccgc cgctttcctt aaccacaaat caggccggac 60 aggagaggga ggggtggggg acagtgggtg ggcattcaga ctgccagcac tttgctatct 120 acagccgggg ctcccgagcg gcagaaagtt ccggccactc tctgccgctt gggttgggcg 180 aagccaggac cgtgccgcgc caccgccagg atatggagct actgtcgcca ccgctccgcg 240 acgtagacct gacggccccc gacggctctc tctgctcctt tgccacaacg gacgacttct 300 atgacgaccc gtgtttcgac tccccggacc tgcgcttctt cgaagacctg gacccgcgcc 360 tgatgcacgt gggcgcgctc ctgaaacccg aagagcactc gcacttcccc gcggcggtgc 420 acccggcccc gggcgcacgt gaggacgagc atgtgcgcgc gcccagcggg caccaccagg 480 cgggccgctg cctactgtgg gcctgcaagg cgtgcaagcg caagaccacc aacgccgacc 540 gccgcaaggc cgccaccatg cgcgagcggc gccgcctgag caaagtaaat gaggcctttg 600 agacactcaa gcgctgcacg tcgagcaatc caaaccagcg gttgcccaag gtggagatcc 660 tgcgcaacgc catccgctat atcgagggcc tgcaggctct gctgcgcgac caggacgccg 720 cgccccctgg cgccgcagcc gccttctatg cgccgggccc gctgcccccg ggccgcggcg 780 gcgagcacta cagcggcgac tccgacgcgt ccagcccgcg ctccaactgc tccgacggca 840 tgatggacta cagcggcccc ccgagcggcg cccggcggcg gaactgctac gaaggcgcct 900 actacaacga ggcgcccagc gaacccaggc ccgggaagag tgcggcggtg tcgagcctag 960 actgcctgtc cagcatcgtg gagcgcatct ccaccgagag ccctgcggcg cccgccctcc 1020 tgctggcgga cgtgccttct gagtcgcctc cgcgcaggca agaggctgcc gcccccagcg 1080 agggagagag cagcggcgac cccacccagt caccggacgc cgccccgcag tgccctgcgg 1140 gtgcgaaccc caacccgata taccaggtgc tctgagggga tggtggccgc ccacccgccc 1200 gagggatggt gcccctaggg tccctcgcgc ccaaaagatt gaacttaaat gcccccctcc 1260 caacagcgct ttaaaagcga cctctcttga ggtaggagag gcgggagaac tgaagtttcc 1320 gcccccgccc cacagggcaa ggacacagcg cggttttttc cacgcagcac ccttctcgga 1380 gacccattgc gatggccgct ccgtgttcct cggtgggcca gagctgaacc ttgaggggct 1440 aggttcagct ttctcgcgcc ctcccccatg ggggtgagac cctcgcagac ctaagccctg 1500 ccccgggatg caccggttat ttgggggggc gtgagaccca gtgcactccg gtcccaaatg 1560 tagcaggtgt aaccgtaacc cacccccaac ccgtttcccg gttcaggacc actttttgta 1620 atacttttgt aatctattcc tgtaaataag agttgctttg ccagagcagg agcccctggg 1680 gctgtattta tctctgaggc atggtgtgtg gtgctacagg gaatttgtac gtttataccg 1740 caggcgggcg agccgcgggc gctcgctcag gtgatcaaaa taaaggcgct aatttatacc 1800 gcc 1803 <210> 7 <211> 318 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Glu Leu Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ile Asp Leu Thr Gly Pro 1 5 10 15 Asp Gly Ser Leu Cys Ser Phe Glu Thr Ala Asp Asp Phe Tyr Asp Asp 20 25 30 Pro Cys Phe Asp Ser Pro Asp Leu Arg Phe Phe Glu Asp Leu Asp Pro 35 40 45 Arg Leu Val His Met Gly Ala Leu Leu Lys Pro Glu Glu His Ala His 50 55 60 Phe Pro Thr Ala Val His Pro Gly Pro Gly Ala Arg Glu Asp Glu His 65 70 75 80 Val Arg Ala Pro Ser Gly His His Gln Ala Gly Arg Cys Leu Leu Trp 85 90 95 Ala Cys Lys Ala Cys Lys Arg Lys Thr Thr Asn Ala Asp Arg Arg Lys 100 105 110 Ala Ala Thr Met Arg Glu Arg Arg Arg Leu Ser Lys Val Asn Glu Ala 115 120 125 Phe Glu Thr Leu Lys Arg Cys Thr Ser Ser Asn Pro Asn Gln Arg Leu 130 135 140 Pro Lys Val Glu Ile Leu Arg Asn Ala Ile Arg Tyr Ile Glu Gly Leu 145 150 155 160 Gln Ala Leu Leu Arg Asp Gln Asp Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala 165 170 175 Phe Tyr Ala Pro Gly Pro Leu Pro Pro Gly Arg Gly Ser Glu His Tyr 180 185 190 Ser Gly Asp Ser Asp Ala Ser Ser Pro Arg Ser Asn Cys Ser Asp Gly 195 200 205 Met Met Asp Tyr Ser Gly Pro Pro Ser Gly Pro Arg Arg Gln Asn Gly 210 215 220 Tyr Asp Thr Ala Tyr Tyr Ser Glu Ala Ala Arg Glu Ser Arg Pro Gly 225 230 235 240 Lys Ser Ala Ala Val Ser Ser Leu Asp Cys Leu Ser Ser Ile Val Glu 245 250 255 Arg Ile Ser Thr Asp Ser Pro Ala Ala Pro Ala Leu Leu Leu Ala Asp 260 265 270 Ala Pro Pro Glu Ser Pro Pro Gly Pro Pro Glu Gly Ala Ser Leu Ser 275 280 285 Asp Thr Glu Gln Gly Thr Gln Thr Pro Ser Pro Asp Ala Ala Pro Gln 290 295 300 Cys Pro Ala Gly Ser Asn Pro Asn Ala Ile Tyr Gln Val Leu 305 310 315 <210> 8 <211> 1854 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 aggggccagg acgccccagg acacgactgc tttcttcacc actcctctga caggacagga 60 cagggaggag gggtagagga cagccggtgt gcattccaac ccacagaacc tttgtcattg 120 tactgttggg gttccggagt ggcagaaagt taagacgact ctcacggctt gggttgaggc 180 tggacccagg aactgggata tggagcttct atcgccgcca ctccgggaca tagacttgac 240 aggccccgac ggctctctct gctcctttga gacagcagac gacttctatg atgacccgtg 300 tttcgactca ccagacctgc gcttttttga ggacctggac ccgcgcctgg tgcacatggg 360 agccctcctg aaaccggagg agcacgcaca cttccctact gcggtgcacc caggcccagg 420 cgctcgtgag gatgagcatg tgcgcgcgcc cagcgggcac caccaggcgg gtcgctgctt 480 gctgtgggcc tgcaaggcgt gcaagcgcaa gaccaccaac gctgatcgcc gcaaggccgc 540 caccatgcgc gagcgccgcc gcctgagcaa agtgaatgag gccttcgaga cgctcaagcg 600 ctgcacgtcc agcaacccga accagcggct acccaaggtg gagatcctgc gcaacgccat 660 ccgctacatc gaaggtctgc aggctctgct gcgcgaccag gacgccgcgc cccctggcgc 720 cgctgccttc tacgcacctg gaccgctgcc cccaggccgt ggcagcgagc actacagtgg 780 cgactcagat gcatccagcc cgcgctccaa ctgctctgat ggcatgatgg attacagcgg 840 ccccccaagc ggcccccggc ggcagaatgg ctacgacacc gcctactaca gtgaggcggc 900 gcgcgagtcc aggccaggga agagtgcggc tgtgtcgagc ctcgactgcc tgtccagcat 960 agtggagcgc atctccacag acagccccgc tgcgcctgcg ctgcttttgg cagatgcacc 1020 accagagtcg cctccgggtc cgccagaggg ggcatcccta agcgacacag aacagggaac 1080 ccagaccccg tctcccgacg ccgcccctca gtgtcctgca ggctcaaacc ccaatgcgat 1140 ttatcaggtg ctttgagaga tcgactgcag cagcagaggg cgcaccaccg taggcactcc 1200 tggggatggt gtccctggtt cttcacgccc aaaagatgaa gcttaaatga 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Claims (21)

1. 세포의 적어도 30%가 생체 외 다능성 줄기세포로부터 유래된 PAX7+ 근원성 전구 세포(MPC)인 포유동물 세포의 집단.
2. 제1항에 있어서,
   적어도 10,000개의 세포를 포함하는 포유동물 세포의 집단.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   PAX7+ MPC가 CHRNA1(콜린성 수용체 니코틴성 알파 1), NTSR1(뉴로텐신 수용체 1) 또는 FZD1(프리즐드 부류 수용체 1) 중 하나 이상을 발현하는 포유동물 세포의 집단.
4. 제3항에 있어서,
   PAX7+ MPC가 CHRNA1, NTSR1 및 FZD1 중 적어도 2개를 발현하는 포유동물 세포의 집단.
5. 제3항에 있어서,
   PAX7+ MPC가 CHRNA1, NTSR1, 및 FZD1을 발현하는 포유동물 세포의 집단.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   PAX7+ MPC가 FZD5(프리즐드 부류 수용체 5), GPR37(G 단백질 결합 수용체 37) 또는 GPR27 G(단백질 결합 수용체 27) 중 하나 이상을 발현하지 않는 포유동물 세포의 집단.
7. 제6항에 있어서,
   PAX7+ MPC가 FZD5, GPR37 또는 GPR27 중 어느 하나를 발현하지 않는 포유동물 세포의 집단.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   PAX7+ MPC가 NCAM을 발현하고, HNK1을 발현하지 않는 포유동물 세포의 집단.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   세포의 적어도 35%가 PAX7+ MPC인 포유동물 세포의 집단.
10. 제9항에 있어서,
    세포의 적어도 40%가 PAX7+ MPC인 포유동물 세포의 집단.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기세포가 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 또는 배아 줄기세포(ESC)인 포유동물 세포의 집단.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 인간 세포인 포유동물 세포의 집단.
13. 퇴행성 근육 소모성 질환 또는 병태의 치료가 필요한 환자에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 집단을 주입하는 것을 포함하는, 퇴행성 근육 소모 질환 또는 병태의 치료 방법.
14. 제13항에 있어서,
    퇴행성 근육 소모성 질환 또는 병태가 근육퇴행위축, 근병증, 미토콘드리아 질환, 연조직 육종, 이온 채널 질환, 악액질 및 근감소증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 퇴행성 근육 소모 질환 또는 병태의 치료 방법.
15. 제14항에 있어서,
    퇴행성 근육 소모성 질환 또는 병태가 뒤센느 근육퇴행위축(DMD)인, 퇴행성 근육 소모 질환 또는 병태의 치료 방법.
16. 글리코겐 합성효소 키나제 3(GSK-3)의 선택적 억제제를 포함하는 배지에서 복수의 다능성 줄기 세포를 분화시켜 분화된 세포를 수득하는 단계;
    분화된 세포를 노치 신호전달의 억제제로 처리하는 단계; 및
    섬유아세포 성장인자(FGF)로 분화된 세포를 확장하는 단계,
    그에 의해 PAX7(짝지어진 박스 단백질)을 발현하는 MPC의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 근원성 전구 세포(MPC) 집단의 생성 방법.
17. 제16항에 있어서,
    MPC를 농축하는 단계를 추가로 포함하는, 근원성 전구 세포(MPC) 집단의 생성 방법.
18. 제17항에 있어서,
    수득된 집단이 적어도 30%의 PAX7+ MPC를 포함하는, 근원성 전구 세포(MPC) 집단의 생성 방법.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택적 GSK-3 억제제가 CHIR99021, SB216763, SB415286, BIO, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 근원성 전구 세포(MPC) 집단의 생성 방법.
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    노치 신호전달 억제제가 DAPT인, 근원성 전구 세포(MPC) 집단의 생성 방법.
21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    FGF가 FGF-2 및 FGF-8인, 근원성 전구 세포(MPC) 집단의 생성 방법.

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