KR20220034857A - 알츠하이머병의 치료를 위한 중화 항-아밀로이드 베타 항체 - Google Patents

알츠하이머병의 치료를 위한 중화 항-아밀로이드 베타 항체 Download PDF

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KR20220034857A
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데이비드 레젝
데니스 셀코에
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Abstract

고전적인 단량체성, 원시섬유성 또는 원섬유성 Αβ에 결합하지 않고 가용성, AD 뇌-유래 시냅스독성 아밀로이드 베타(Αβ)의 하나 이상의 종에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 및 이의 항원-결합 단편)가 제공된다. 가용성, 시냅스독성 Αβ의 하나 이상의 종에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 가용성, 시냅스독성 Αβ의 하나 이상의 종에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다. 가용성, 시냅스독성 Αβ의 하나 이상의 종에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 사용하여 알츠하이머병을 치료하는 방법이 제공된다. 가용성, 시냅스독성 Αβ의 하나 이상의 종에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 사용하여 알츠하이머병의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법이 제공된다.

Description

알츠하이머병의 치료를 위한 중화 항-아밀로이드 베타 항체
관련 출원
본 출원은 2019년 7월 16일에 출원된 미국 가출원 제62/874,724호의 우선권 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 가용성 아밀로이드 베타에 특이적으로 결합하는 신규한 결합 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에서 제공되는 신규한 결합 폴리펩티드를 사용하여 알츠하이머병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병은 가장 일반적인 유형의 치매이다. 이는 세계적으로 수천만 명의 사람들에서 발병 중이며, 그 수치는 크게 증가하고 있다. 아밀로이드 가설(Haass and Selkoe (1993) Cell 75:1039; Glenner and Wong (2012) Biochem Biophys Res Commun 425:534; 및 Selkoe and Hardy (2016) EMBO Mol Med 8:595)은 아밀로이드 베타(Aβ)를 질환의 주요 원인으로 제안하며, 세포외 Aβ 단백질의 미스폴딩이 노인반에서 축적되었고(Bloom (2014) JAMA Neurol. 71:505) 신경원섬유 매듭에서 미스폴딩된 타우 단백질의 세포내 침적이 기억 손실 및 비정상적인 집행 기능을 야기하며 시간 경과에 따라 인지 및 행동 감퇴를 초래함을 제시한다. 축적된 Aβ 펩티드는 노인(아밀로이드)반의 주요 성분이며 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로 명명된 더 큰 당단백질의 단백분해 절단으로부터 유래된다(Chen et al. (2017) Acta Pharmacologica Sinica 38:1205; Liu et al. (2019) J. Cell Biol. 218:644).
Aβ 단량체는 올리고머, 원시섬유 및 아밀로이드 원섬유를 포함하는, 다양한 유형의 어셈블리로 응집된다. 아밀로이드 원섬유는 크고 불용성이며, 아밀로이드반으로 추가로 어셈블링될 수 있는 반면, 아밀로이드 올리고머는 수용성이고 뇌에 걸쳐 확산될 수 있다. Aβ는 37개 내지 49개 잔기 크기의 범위의 펩티드 그룹을 포괄한다. 주요 성분으로서 Aβ를 갖는 아밀로이드반은 알츠하이머병 환자의 뇌의 변연 및 신피질에서 가장 일반적으로 확인된다. Aβ(1 내지 42)는 알츠하이머병에서 아밀로이드 침적물의 주요 단백질성 성분이다.
아밀로이드 원섬유는 더 크고, 불용성이며, 알츠하이머병의 특징인 조직학적 병소를 형성하는 섬유성 아밀로이드반으로 응집하는 반면, Aβ 올리고머는 가용성이고 뇌에 걸쳐 확산될 수 있다. Aβ 올리고머의 크기 분포는 이종성이다. 시험관내의 상대적으로 생리적인 조건 하에서 대략 100 kDa 내지 200 kDa의 가용성 고분자량 종의 우선적 축적에 대해서는 광범위한 의견 일치가 존재한다(Goldsbury et al. (2000) J. Struct. Biol. 130:217; Nichols et al. (2002) Biochemistry 41:6115; Lashuel et al. (2003) J. Mol. Biol. 332:795; Walsh et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:22364; Soreghan et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:28551). Aβ 단량체는 이량체, 삼량체 및 사량체가 포함되는 저분자량 올리고머부터, 육량체 및 십이량체가 포함되는 중간 범위 분자량 올리고머, 가용성 원시섬유 및 불용성 원섬유에 이르는 고수준 어셈블리를 형성할 수 있다(Chen et al., 상기 문헌).
아밀로이드 β-단백질(Aβ)을 표적화하기 위해 모노클로날 항체를 사용하는 접근법은 알츠하이머병(AD)을 치료하기 위한 가장 크고 가장 진보된 치료 시도를 구성한다(Liu et al. (2016) Drugs Aging 33:685; Golde (2014) Alzheimer's Res. Ther. 6:3; van Dyck (2017) Biol. Psychiatry 83:311). 전임상 마우스 모델에서의 일반적으로 우수한 결과에도 불구하고, 항-Aβ 면역치료법은 인간에서 제한된 성공을 거뒀다(Golde, van Dyck, 상기 문헌). 인간 치료법으로의 전임상 선도 항체의 불량한 이식을 설명하기 위해 제공되는 설명에는 불완전한 시험 설계, 이미 상당한 신경 손실이 존재하는 질환 단계에서의 개입, 및 사용된 항체의 부적절한 표적 선택성이 포함된다(Golde, 상기 문헌; Kohyama and Matsumoto (2015) Immunotargets Ther. 4:27; Selkoe and Hardy, 상기 문헌).
따라서, 알츠하이머병의 치료를 위한 대안적 치료용 모노클로날 항체에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 수용성, AD 뇌-유래 시냅스독성 Aβ의 하나 이상의 종의 에피토프에 특이적으로 결합하는 신규한 항-아밀로이드 베타(Aβ) 결합 단백질(예를 들어, 항체)의 발견에 기반한다.
따라서, 소정 양태에서, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 결합 폴리펩티드는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 서열 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 26, 27, 28, 32, 33, 34, 38, 39, 40, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 56, 57, 58, 62, 63, 및 64로 구성되는 군으로부터 선택되고, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 17, 18, 19, 23, 24, 25, 29, 30, 31, 35, 36, 37, 41, 42, 43, 47, 48, 49, 53, 54, 55, 59, 60 및 61로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 결합 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열을 포함한다. 소정 구현예에서, HCVR 서열은 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16으로 구성되는 군으로부터 선택되고, LCVR 서열은 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 결합 폴리펩티드는 HCVR / LCVR 서열 쌍을 포함한다. 소정의 구현예에서, HCVR / LCVR 쌍은 SEQ ID NO: 2/1, 4/3, 6/5, 8/7, 10/9, 12/11, 14/13 및 16/15로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, SEQ ID NO: 20, 21 및 22의 HCDR 서열, 및 SEQ ID NO: 17, 18 및 19의 LCDR 서열을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 2 및 1의 HCVR / LCVR 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 66 및 65의 전체 중쇄 / 경쇄 서열 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, SEQ ID NO: 26, 27 및 28의 HCDR 서열, 및 SEQ ID NO: 23, 24 및 25의 LCDR 서열을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 4 및 3의 HCVR / LCVR 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 68 및 67의 전체 중쇄 / 경쇄 서열 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, SEQ ID NO: 32, 33 및 34의 HCDR 서열, 및 SEQ ID NO: 29, 30 및 31의 LCDR 서열을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 6 및 5의 HCVR / LCVR 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 70 및 69의 전체 중쇄 / 경쇄 서열 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, SEQ ID NO: 38, 39 및 40의 HCDR 서열, 및 SEQ ID NO: 35, 36 및 37의 LCDR 서열을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 8 및 7의 HCVR / LCVR 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 72 및 71의 전체 중쇄 / 경쇄 서열 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, SEQ ID NO: 44, 45 및 46의 HCDR 서열, 및 SEQ ID NO: 41, 42 및 43의 LCDR 서열을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 10 및 9의 HCVR / LCVR 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 74 및 73의 전체 중쇄 / 경쇄 서열 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, SEQ ID NO: 50, 51 및 52의 HCDR 서열, 및 SEQ ID NO: 47, 48 및 49의 LCDR 서열을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 12 및 11의 HCVR / LCVR 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 76 및 75의 전체 중쇄 / 경쇄 서열 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, SEQ ID NO: 56, 57 및 58의 HCDR 서열, 및 SEQ ID NO: 53, 54 및 55의 LCDR 서열을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 14 및 13의 HCVR / LCVR 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 78 및 77의 전체 중쇄 / 경쇄 서열 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, SEQ ID NO: 62, 63 및 64의 HCDR 서열, 및 SEQ ID NO: 59, 60 및 61의 LCDR 서열을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 16 및 15의 HCVR / LCVR 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다. 소정 양태에서, SEQ ID NO: 80 및 79의 전체 중쇄 / 경쇄 서열 쌍을 포함하는, 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, 가용성 아밀로이드 베타(Aβ)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 결합 폴리펩티드는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 서열 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 서열을 포함하며, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 50, 51, 52, 44, 45, 46, 26, 27, 28, 62, 63, 및 64로 구성되는 군으로부터 선택되고, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 17, 18, 19, 47, 48, 49, 41, 42, 43, 23, 24, 25, 59, 60 및 61로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는, 선택적으로 인간이고/이거나 선택적으로 IgG1인 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(HCVR) / 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열 쌍을 포함한다: SEQ ID NO: 2 및 1; SEQ ID NO: 10 및 9; SEQ ID NO: 4 및 3; SEQ ID NO: 12 및 11; 및 SEQ ID NO: 16 및 15.
소정의 예시적인 구현예에서, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 20, 21 및 22를 포함하며, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 17, 18 및 19를 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 44, 45 및 46을 포함하며, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 41, 42 및 43을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 26, 27 및 28을 포함하며, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 23, 24 및 25를 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 50, 51 및 52를 포함하며, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 47, 48 및 49를 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 62, 63 및 64를 포함하며, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 59, 60 및 61을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, HCVR / LCVR 서열 쌍은 SEQ ID NO: 2 및 1이다. 소정의 예시적인 구현예에서, HCVR / LCVR 서열 쌍은 SEQ ID NO: 10 및 9이다. 소정의 예시적인 구현예에서, HCVR / LCVR 서열 쌍은 SEQ ID NO: 4 및 3이다. 소정의 예시적인 구현예에서, HCVR / LCVR 서열 쌍은 SEQ ID NO: 12 및 11이다. 소정의 예시적인 구현예에서, HCVR / LCVR 서열 쌍은 SEQ ID NO: 16 및 15이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정 양태에서, 가용성 아밀로이드 베타(Aβ)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 여기서 결합 폴리펩티드는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 서열 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 서열을 포함하며, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 50, 51, 52, 44, 45, 46, 26, 27, 28, 62, 63, 및 64로 구성되는 군으로부터 선택되고, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 17, 18, 19, 47, 48, 49, 41, 42, 43, 23, 24, 25, 59, 60 및 61로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 대상체에 유효량의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 알츠하이머병을 치료하는 방법이 제공된다.
소정 양태에서, 가용성 아밀로이드 베타(Aβ)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 여기서 결합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 및 1; SEQ ID NO: 10 및 9; SEQ ID NO: 4 및 3; SEQ ID NO: 12 및 11; 및 SEQ ID NO: 16 및 15로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(HCVR) / 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열 쌍을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 시냅스독성이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 Aβ 시냅스독성을 중화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는다.
소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합은 면역흡착이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 가용성 Aβ는 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 대상체에 유효량의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 알츠하이머병을 치료하는 방법이 제공된다.
소정 양태에서, 가용성 아밀로이드 베타(Aβ)에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 약학적으로 허용 가능한 담체가 제공되며, 여기서 결합 폴리펩티드는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 서열 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 서열을 포함하며, 3개의 HCDR 서열은 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 50, 51, 52, 44, 45, 46, 26, 27, 28, 62, 63, 및 64로 구성되는 군으로부터 선택되고, 3개의 LCDR 서열은 SEQ ID NO: 17, 18, 19, 47, 48, 49, 41, 42, 43, 23, 24, 25, 59, 60 및 61로 구성되는 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 벡터가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 장점은 첨부 도면과 함께 예시적인 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 보다 충분히 이해될 것이다.
도 1은 융합물 A(FusA), B(FusB) 및 C(FusC)에 대해 선택된 마우스의 융합-전 역가를 그래프로 도시한다. FusA, 인간 알츠하이머병(AD) 뇌로부터의 초음파분쇄된 아밀로이드반; FusB, 응집된 합성 아밀로이드 베타(Aβ); FusC, AD-아밀로이드-반 씨드접종된 합성 Aβ.
도 2a 및 도 2b는 올리고머성 Aβ 대 단량체성 Aβ에 대한 선택성을 나타내는 카운터-스크리닝을 그래프로 도시한다.
도 3은 합성 Aβ-유래 확산성 리간드(ADDL)(1 μg/ml, 4℃에서 하룻밤 동안)에 기반하여 ELISA에 의해 수득된 결과를 나타내는 응집된 합성 Aβ 코호트 2에 대한 5회 면역접종-후 역가를 그래프로 도시한다. 하이브리도마 세포를 생산하기 위해 마우스 M13이 사용되었다(역가, 3X 면역접종-전 배경).
도 4는 FusB 결과의 요약을 나타내는 표를 도시한다.
도 5는 정제된 FusB 클론의 선택 절대 크기 배제 크로마토그래피(aSEC) 프로필을 그래프로 도시한다.
도 6은 원시섬유(PF)에 대해 적정된 FusB 클론에 대한 간접적 ELISA 결과를 그래프로 도시한다. 코팅: 1 μg/ml PF, 4℃에서 하룻밤 동안.
도 7a 내지 도 7j는 Aβ 1 내지 42 단량체에 대한 정제된 FusB 클론의 오프율(off-rate) 평가를 나타내는 단량체에 대한 카운터 스크리닝의 비아코어(BIAcore) 분석을 도시한다.
도 8a 내지 도 8d는 Aβ 1 내지 40 단량체의 Octet 분석 대 선택된 클론과의 PF 동력학을 도시한다.
도 9는 Aβ 1 내지 40 단량체의 Octet 동력학 대 대조군과의 PF 동력학을 나타내는 표를 도시한다.
도 10은 클론 B24, B28, B51, B54, B90, C11 및 B73과 원섬유를 사용하는 카운터-스크리닝을 도시한다.
도 11은 FusB 클론과 원섬유를 사용하는 카운터-스크리닝을 그래프로 도시한다.
도 12는 FusB 클론과 응집된 알파-시누클레인을 사용하는 카운터-스크리닝을 그래프로 도시한다.
도 13은 FusB 클론과 응집된 알파-시누클레인을 사용하는 카운터-스크리닝을 그래프로 도시한다.
도 14는 FusB 클론과 응집된 알파-시누클레인을 사용하는 카운터-스크리닝을 그래프로 도시한다.
도 15a 및 도 15b는 500 ng/ml 내지 0.5 ng-ml에서 FusB 클론의 SOD-1 카운터-스크리닝을 그래프로 도시한다.
도 16a 및 도 16b는 10,000 ng/ml 내지 100 ng-ml에서 FusB 클론의 SOD-1 카운터-스크리닝을 그래프로 도시한다.
도 17은 예시적 FusB 클론에 대한 VH 영역의 서열 정렬을 나타내는 표이다.
도 18은 ADDL(1 μg/ml, 4℃에서 하룻밤 동안)에 기반하여 ELISA에 의해 수득된 결과를 나타내는 아밀로이드반-씨드접종된 Aβ 코호트 3에 대한 5회 면역접종-후 역가를 그래프로 도시한다. 하이브리도마 세포를 생산하기 위해 마우스 M23이 사용되었다(역가, 3X 면역접종-전 배경).
도 19는 예시적 FusC 클론의 특징을 나타내는 표이다.
도 20은 FusC 클론에 대한 ELISA 스크리닝 데이터를 나타내는 표이다.
도 21a 내지 도 21f는 선택 정제된 FusC 클론의 aSEC 프로필을 그래프로 도시한다.
도 22a 및 도 22b는 ADDL에 대한 FusC 클론 상청액의 ELISA 결과를 그래프로 도시한다. 약한 결합 내지 결합의 부재가 ELISA에 의해 합성 Aβ ADDL에 대해 관찰되었다.
도 23은 PF에 대한 정제된 FusC 클론의 적정 ELISA 결과를 그래프로 도시한다. 정제된 클론 C10도 클론 C11도 ELISA에 의해 합성 Aβ PF에 대한 인식 가능한 결합을 나타내지 않았다.
도 24는 합성 ADDL 대 합성 PF에 대한 정제된 C10 및 정제된 C11 클론의 반복 적정 ELISA 결과를 그래프로 도시한다. ADDL 또는 PF에 대한 결합은 정제된 클론 C10 또는 정제된 클론 C11에 대해 관찰되지 않았다.
도 25a 내지 도 25d는 Aβ 1 내지 42 단량체에 대해 선택된 정제된 FusC 클론에 대한 오프율 데이터를 그래프로 도시한다.
도 26은 정제된 클론 C11에 대한 원섬유 상의 카운터-스크리닝 결과를 그래프로 도시한다.
도 27은 정제된 클론 C11에 대한 원섬유 카운터-스크리닝 결과를 그래프로 도시한다.
도 28은 정제된 클론 C11에 대한 응집된 알파-시누클레인 카운터-스크리닝 결과를 그래프로 도시한다.
도 29는 융합물 D 및 E 클론(10,000 ng/ml 내지 100 ng/ml)에 대한 SOD-1 카운터-스크리닝 결과를 그래프로 도시한다. 클론 C10 및 C11은 동일한 가변 영역을 가졌으며 이후 실험에서 C11로 나타내었다.
도 30은 세포 신경돌기 보호 iN 검정(수행 #1)에서 하이브리도마-정제 mAb 시험을 도시한다. iN 배양(iPSC로부터 유래된 뉴로제닌-유도 인간 뉴런)을 시험 항체(하이브리도마 정제된 조제물)의 존재 또는 부재 하에 72시간 동안 가용성 AD 뇌 추출물과 인큐베이션하였다. 신경돌기 길이 및 분기점을 Incucyte 라이브 현미경에서 2시간마다 정량하였다. 막대 그래프는 각각의 웰에 대해 기준선에서의 신경돌기 길이로 표준화된, 마지막 3개 시점의 신경돌기 길이 평균을 나타낸다. AD 추출물은 신경돌기 길이의 50% 손실을 유도하였고, 이는 뇌 추출물(ID)로부터의 Aβ의 사전-면역고갈 또는 대조군 항체 3D6(C1)와의 공동-인큐베이션에 의해 보호되었으나, 본원에서 기재된 일부 신규한 시험 항체뿐만 아니라 무관한 항체(C2)에 의해서는 보호되지 않았다.
도 31a 내지 도 31c는 세포 신경돌기 보호 iN 검정에서 재조합 rB24 및 rB75의 시험을 도시한다. iN 배양을 시험 항체(재조합 rB24 및 rB75 조제물)의 존재 또는 부재 하에 72시간 동안 AD 뇌 추출물과 인큐베이션하였다. 신경돌기 길이 및 수를 Incucyte 라이브 현미경에서 2시간마다 정량하고, 각각의 웰에 있어서 기준선 값에 대해 표준화하였다. 표준화된 신경돌기 길이의 전체 시간 경과 분석을 제시하여 AD 뇌 추출물의 시간-의존적 신경돌기독성, 및 재조합 항체(rB24(a) 및 rB75(b))에 의해 제공되는 농도-의존적 보호를 예시한다. 마지막 3개 시점의 평균을 사용함으로써, 참조 항체 1C22(C)와 비교하여 50% 신경돌기독성 보호 농도(EC50)를 각각의 항체에 대해 결정하였다.
도 32a 내지 도 32c는 세포 신경돌기 보호 iN 검정에서 재조합 rB24 및 rC11의 시험을 도시한다. iN 배양을 시험 항체(재조합 rB24 및 rC11 조제물)의 존재 또는 부재 하에 72시간 동안 AD 뇌 추출물과 인큐베이션하였다. 신경돌기 길이 및 수를 Incucyte 라이브 현미경에서 2시간마다 정량하고, 각각의 웰에 있어서 기준선 값에 대해 표준화하였다. 표준화된 신경돌기 길이의 전체 시간 경과 분석을 제시하여 AD 뇌 추출물의 시간-의존적 신경돌기독성, 및 재조합 항체(rB24(a), rC11(b))에 의해 제공되는 농도-의존적 보호를 예시한다. 마지막 3개 시점의 평균을 사용함으로써, 참조 항체 1C22(C)와 비교하여 50% 신경돌기독성 보호 농도(EC50)를 각각의 항체에 대해 결정하였다.
도 33a 내지 도 33c는 세포 신경돌기 보호 iN 검정에서 재조합 rB73 및 rB28의 시험을 도시한다. iN 배양을 시험 항체(재조합 rB73 및 rB28 조제물)의 존재 또는 부재 하에 72시간 동안 가용성 AD 뇌 추출물과 인큐베이션하였다. 신경돌기 길이 및 수를 Incucyte 라이브 현미경에서 2시간마다 정량하고, 각각의 웰에 있어서 기준선 값에 대해 표준화하였다. 표준화된 신경돌기 길이의 전체 시간 경과 분석을 제시하여 AD 뇌 추출물의 시간-의존적 신경돌기독성, 및 재조합 항체(rB73(a), rB28(b))에 의해 제공되는 농도-의존적 보호를 예시한다. 마지막 3개 시점의 평균을 사용함으로써, 참조 항체 1C22(C)와 비교하여 50% 신경돌기독성 보호 농도(EC50)를 각각의 항체에 대해 결정하였다.
도 34a 및 도 34b는 기저 상태에서 설치류 뇌 슬라이스의 전기생리 기록에 대한 선택된 항체의 효과를 도시한다. 시냅스 전파(fEPSP 기울기)를 기준선에서, 그리고 고주파 자극(화살표) 후 야생형 뇌 슬라이스에서 기록하였고, 모든 값을 기준선 전파에 대해 표준화하였다. 선택된 항체를, 두 번째 농도도 시험된 B73을 제외하고, 5 μg/ml의 최종 농도로 뇌 슬라이스에 첨가하였다. (a) 조건 별로 평균한 전체-시간 기록. 4개 조건을 도면의 왼쪽 및 오른쪽 패널 둘 모두에 제시하였다. (b) 상이한 조건 하에 종결점(HFS-후 60분)에서의 시냅스 전파 분석. 조건 당 기록된 슬라이스의 수는 하기와 같았다: ACSF(n=8), C11(n=6), B24(n=7), B28(n=6), B73(5 μg/ml에서 n=6 및 3 μg/ml에서 n=7) 및 B75(n=6). 군 간 차이를 본페로니(Bonferroni) 포스트-혹 시험 또는 스튜던트 t-시험으로 이원 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 시험하였다. ## p< 0.01.
도 35a 및 도 35b는 야생형 마우스 뇌 슬라이스에서 시냅스 가소성에 대한 AD 뇌 추출물의 억제 효과를 중화하는 선택된 항체의 능력을 도시한다. 시냅스 전파(fEPSP 기울기)를 기준선에서, 그리고 고주파 전기 자극(화살표) 후 뇌 슬라이스에서 기록하였고, 모든 값을 기준선 전파에 대해 표준화하였다. AD 뇌 추출물을 단독으로 또는 3 μg/ml로 사용된 B73을 제외하고, 5 μg/ml의 최종 농도로 선택된 mAb와 사전-인큐베이션한 후, 뇌 슬라이스에 첨가하였다. (a) 조건 별로 평균한 전체-시간 기록은 LTP의 유도에 대한 AD 추출물의 강력한 억제 효과를 나타내었다. (b) 상이한 조건 하에 종결점(HFS-후 60분)에서의 시냅스 전파 분석. 상이한 항체와 AD 뇌 추출물의 사전-인큐베이션은 매우 유의미하게 증가한 fEPSP 강화가 ACSF 단독의 값으로 되돌아가게 했다(도 x+1, a 및 b). 주목할 만한 것은, 5 μg/ml의 B75 및 3 μg/ml의 B73 둘 모두가, LTP에 대한 AD 뇌 추출물 억제 효과의 완전 구제를 야기하였다는 점이었다. 조건 당 기록된 슬라이스의 수는 하기와 같았다: AD 뇌 추출물(n=6), AD 추출물 + C11(n=9), + B24(n=7), B28(n=8), B73(3 μg/ml에서 n=6) 및 + B75(n=6). 군 간 차이를 본페로니 포스트-혹 시험 또는 스튜던트 t-시험으로 이원 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 시험하였다. #p<0.05, ## p< 0.01, 및 ### p< 0.001.
도 36a 및 도 36b는 더 낮은 농도에서 뇌 슬라이스에서의 시냅스 가소성에 대한 AD 뇌 추출물의 억제 효과를 중화하는 선택된 항체의 능력을 도시한다. 시냅스 전파(fEPSP 기울기)를 기준선에서, 그리고 고주파 자극 후 뇌 슬라이스에서 기록하였고, 모든 값을 상술된 바와 같이 기준선 전파에 대해 표준화하였다. a) 시험된 항체(2 μg/ml) 중 어느 것도 기저 시냅스 전파 및 기저 상태에서의 LTP의 유도에 대해 임의의 효과를 갖지 않았다. b) 항체를 AD 뇌 추출물의 존재 하에(상술된 바와 같이 사전-인큐베이션 후) 시험하였다. B73은 AD 뇌 추출물 효과의 거의 완전한 방지를 보유하였다(p 값 0.05 미만). C11도 족히 50% 넘게 AD 뇌 추출물 효과를 유의미하게 방지하였으며(p 값 0.01 미만) 둘 모두 참조 항체 1C22에 비해 우수하였다. B75는 이러한 더 낮은 농도에서 유의미하게 효과적이지 않았다.
도 37은 융합물 B 스크리닝을 요약한다.
도 38은 융합물 C 스크리닝을 요약한다.
도 39a 및 도 39b는 mAb B24, B28, B73, B75 및 C11 및 단백질-A 비드를 사용하는 4개 인간 뇌 추출물의 면역침전을 도시한다. a) 인간 뇌 추출물의 면역침전 워크-플로우를 도식적으로 도시한다. b) 1% SDS(상단 그래프) 및 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드(하단 그래프)에 의한 뇌 추출물 4개의 면역침전물의 순차적 용출의 Aβ x-42 ELISA 분석을 나타낸다(n=3, 평균 ± SD). 면역침전에 대해 1C22를 양성 대조군으로 사용하였고 인간 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 40a 및 도 40b는 단백질-A 친화도 칼럼에 대한 mAb B28, B75 및 C11을 사용하는 2개의 인간 뇌 추출물의 면역흡착을 도시한다. a) 인간 뇌 추출물의 면역흡착 워크-플로우를 도식적으로 도시한다. b) 뇌 추출물 2개로부터의 면역흡착의 글리신 용출의 Aβ x-42 ELISA 분석을 도시한다(n=2, 평균 ± SD). 인간 IgG를 면역흡착에 대한 음성 대조군으로 사용하였다.
도 41의 a 및 도 41의 b는 mAb B28 및 C11을 사용하는 인간 뇌 추출물로부터 면역포획된 물질의 초미세구조 분석을 도시한다. a) 인간 뇌 추출물로부터의 면역흡착 워크-플로우를 도식적으로 도시한다. b) B28(상단 이미지) 또는 C11(하단 이미지)을 사용하여 인간 뇌 추출물로부터 면역흡착된 물질의 음성-염색 투과 전자 현미경 이미지를 도시한다.
도 42의 a 및 도 42의 b는 mAb B24, B28, B73, B75 및 C11을 사용하는 뇌 절편의 광학 현미경 면역조직학을 도시한다. B28만 파라핀-포매 PFA-고정 뇌 절편 상 염색을 나타내었다. a) 파라핀-포매 PFA-고정 뇌 절편 상의 B28의 면역조직화학을 도시한다. 다른 4개의 mAb는 이러한 절편 상에서 음성이었다(나타내지 않음). b) 비-고정 뇌 냉동-절편 상에서 mAb B24, B28, B73, B75 및 C11의 면역조직화학을 도시한다. 1C22을 양성 대조군으로 사용하였다.
본 개시는 가용성, 시냅스독성 Aβ의 하나 이상의 종에 존재하는 에피토프에 결합하는 신규한 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체)를 제공한다. 중요하게는, 본원에서 기재되는 신규한 결합 폴리펩티드는 당분야에 알려진 항체에 비해 Aβ, 원시섬유성 Aβ 및/또는 원섬유성 Aβ에 대해 감소된 결합을 갖거나 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 및/또는 원섬유성 Aβ에 결합하지 않는다.
소정 구현예에서, 본원에서 기재되는 신규한 결합 폴리펩티드는 Aβ의 고차원, 시냅스독성 형태, 예컨대 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 및 원섬유성 Aβ의 형성을 방지하거나 감소시킨다. 소정 구현예에서, 본원에서 기재되는 신규한 결합 폴리펩티드는 가용성, 시냅스독성 Aβ가 Aβ의 고차원, 시냅스독성 형태, 예컨대 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 및/또는 원섬유성 Aβ를 형성하는 것을 방지하거나 감소시킨다.
본 개시에서 기재되는 방법은 본원에서 개시되는 특정 방법 및 실험 조건이 변할 수 있으므로 이러한 방법 및 조건에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기재하려는 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다.
또한, 본원에서 기재되는 실험은, 달리 시사되지 않는 한, 당분야의 기술 범위 내의 통상적인 분자 및 세포 생물학 및 면역학 기법을 사용한다. 이러한 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008)(모든 증보판 포함), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) by MR Green 및 J. Sambrook and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2nd edition)]을 참고한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 임의의 잠재적인 모호성이 있는 경우, 본원에서 제공되는 정의가 임의의 사전적 또는 외부 정의보다 우선한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어에는 복수형이 포함될 것이고 복수형 용어에는 단수형이 포함될 것이다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함되는(including)"뿐만 아니라 "포함되다(includes)" 및 "포함된(included)"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적인 것이 아니다.
일반적으로, 본원에서 기재되는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 그리고 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화에 관해 사용되는 명명법은 당분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다. 본원에서 제공되는 방법 및 기법은 일반적으로, 당분야에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 시사되지 않는 한 본 명세서에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기법은 당분야에서 일반적으로 성취되거나 본원에서 기재된 바와 같이, 제조업자의 사양에 따라 수행된다. 본원에서 기재되는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학에 관해 사용되는 명명법, 및 이의 실험실 절차 및 기법은 당분야에서 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학 제조, 제형화, 및 전달, 그리고 환자의 치료를 위해 표준 기법이 사용된다.
본 개시가 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 선택된 용어들이 아래에서 정의된다.
용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 임의의 중합체성 사슬을 나타내며 맥락상 달리 모순되지 않는 한, 천연 또는 인공 단백질, 폴리펩티드 유사체 또는 단백질 서열의 변이체, 또는 이의 단편을 포괄한다. 폴리펩티드는 단량체성 또는 중합체성일 수 있다. 폴리펩티드 단편은, 예를 들어, 적어도 약 5개의 인접한 아미노산, 적어도 약 10개의 인접한 아미노산, 적어도 약 15개의 인접한 아미노산, 또는 적어도 약 20개의 인접한 아미노산을 포함한다.
용어 "단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩티드"는 이의 기원 또는 유래 원천으로 인해, 그 천연 상태에서 수반되는 자연적으로 연관된 성분과 연관되지 않거나; 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없거나; 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나; 자연에서 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 자연적으로 유래되는 세포와는 상이한 세포계에서 합성되는 단백질 또는 폴리펩티드는 이의 자연적으로 연관된 성분으로부터 "단리될" 것이다. 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 당분야에 잘 알려진 단백질 정제 기법을 사용하여, 단리에 의해 자연적으로 연관된 성분이 실질적으로 없도록 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 단백질" 또는 "결합 폴리펩티드"는 관심 표적 항원(예를 들어, 인간 표적 항원)으로의 선택적 결합에 관여되는 적어도 하나의 결합 부위를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 면역부착소)를 나타낸다. 예시적 결합 부위에는 항체 가변 도메인, 수용체의 리간드 결합 부위, 또는 리간드의 수용체 결합 부위가 포함된다. 소정 양태에서, 결합 단백질 또는 결합 폴리펩티드는 다수의(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상의) 결합 부위를 포함한다. 소정 양태에서, 결합 단백질 또는 결합 폴리펩티드는 치료용 효소가 아니다.
용어 "리간드"는 또 다른 성분에 결합할 수 있거나, 결합될 수 있는 임의의 성분을 나타낸다. 유사하게, 용어 "항원"은 항체가 생성될 수 있는 임의의 성분을 나타낸다. "항원"은 일반적으로 항체 결합 기질에 관하여 사용되고, "리간드"는 대개 수용체 결합 기질을 나타낼 때 사용되지만, 이들 용어는 서로 구별되는 것이 아니며, 광범위한 중복 화학 엔티티를 포괄한다. 의혹을 방지하기 위해, 항원 및 리간드는 본원에 걸쳐 상호 교환적으로 사용된다. 항원/리간드는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 압타머, 다당류, 당 분자, 탄수화물, 지질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 합성 분자, 무기 분자, 유기 분자, 및 이의 임의의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다"는 최대 약 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M 이하의 해리 상수(Kd)로 항원에 결합하고/하거나 비특이적 항원에 대한 친화도보다 적어도 약 2배 더 큰 친화도로 항원에 결합하는 항체 또는 면역부착소의 능력을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 관심 항원(예를 들어, 종양 연관 항원)에 대한 유의미한 알려진 특이적 면역반응 활성을 갖는 어셈블리(예를 들어, 온전한 항체 분자, 면역부착소, 또는 이의 변이체)를 나타낸다. 항체 및 면역글로불린은 경쇄와 중쇄 사이에 사슬간 공유 결합을 갖거나 갖지 않는, 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 척추동물계에서 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "다중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 결합 특이성을 포함하는 항체를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 본원에서 기재되는 다중특이적 항체는 2개의 상이한 항원에 대해 특이적이며, 예를 들어, 혈액 뇌 장벽(BBB) 수용체 및 가용성 아밀로이드 베타(Aβ)에 대해 특이적이다.
본원에서 사용되는 용어 "단일특이적 항체"는 각각 동일한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타내며, 즉, 단일특이적 항체는 단일 항원, 예를 들어, 가용성 아밀로이드 베타(Aβ)에 결합한다.
아래에서 보다 상세히 논의될 바와 같이, 일반 용어 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 항체의 5개의 구별되는 클래스를 포함한다. 항체의 모든 5개의 클래스는 본 개시의 범위 내에 명확히 속하며, 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 대한 것일 것이다. IgG에 관해, 면역글로불린은 대략 분자량 23,000 달톤의 2개의 동일한 경쇄, 및 분자량 53,000 내지 70,000의 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 4개 사슬은 "Y" 구성으로 디설피드 결합에 의해 연결되며 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역에 걸쳐 계속 중쇄를 감싼다.
면역글로불린의 경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 함께 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되고, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포, 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우에 공유 디설피드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구성의 갈라진 단부에 있는 N-말단으로부터, 각각의 사슬의 하단에 있는 C-말단으로 이어진다. 당업자는 중쇄가 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 또는 엡실론(ε)과 이들 중 일부 하위클래스(예를 들어, γ1 내지 γ4)로 분류됨을 이해할 것이다. 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 결정하는 것이 이러한 사슬의 성질이다. 면역글로불린 이소형(isotype) 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등)는 잘 특성규명되어 있으며 기능적 특화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 이소형 각각의 변형된 버전은 본 발명의 개시에 비추어 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있으며, 이에 따라, 본 개시의 범위 내에 있다.
경쇄 및 중쇄 둘 모두는 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 구분된다. 용어 "영역"은 면역글로불린 또는 항체 사슬의 부분 또는 일부를 나타내며 불변 영역 또는 가변 영역뿐만 아니라 상기 영역의 보다 구별되는 부분 또는 일부가 포함된다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역에는 본원에서 정의된 바와 같은 "프레임워크 영역" 또는 "FR" 사이에 산재된 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이 포함된다.
면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 영역은 "불변 영역"의 경우 다양한 클래스 구성원의 영역 내의 서열 변화의 상대적 결여, 또는 "가변 영역"의 경우 다양한 클래스 구성원의 영역 내의 유의미한 변화에 기반하여 "불변"(C) 영역 또는 "가변"(V) 영역으로 정의될 수 있다. 용어 "불변 영역" 및 "가변 영역"은 또한 기능적으로 사용될 수 있다. 이에 관해, 면역글로불린 또는 항체의 가변 영역이 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것이 이해될 것이다. 반대로, 면역글로불린 또는 항체의 불변 영역은 중요한 효과기 기능, 예컨대 분비, 태반경유 이동, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 및 가변 영역은 도메인으로 폴딩된다. 용어 "도메인"은, 예를 들어, β-주름 시트(β-pleated sheet) 및/또는 사슬내 디설피드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프를 포함하는(예를 들어, 3 내지 4개의 펩티드 루프를 포함하는) 중쇄 또는 경쇄의 구형 영역을 나타낸다. 면역글로불린의 경쇄 상의 불변 영역 도메인은 "경쇄 불변 영역 도메인", "CL 영역" 또는 "CL 도메인"으로 상호 교환적으로 나타낸다. 중쇄 상의 불변 도메인(예를 들어, 힌지, CH1, CH2 또는 CH3 도메인)은 "중쇄 불변 영역 도메인", "CH" 영역 도메인 또는 "CH 도메인"으로 상호 교환적으로 나타낸다. 경쇄 상의 가변 도메인은 "경쇄 가변 영역 도메인", "VL 영역 도메인" 또는 "VL 도메인"으로 상호 교환적으로 나타낸다. 중쇄 상의 가변 도메인은 "중쇄 가변 영역 도메인", "VH 영역 도메인" 또는 "VH 도메인"으로 상호 교환적으로 나타낸다.
관례상, 가변 불변 영역 도메인의 아미노산의 넘버링은 이들이 항원-결합 부위 또는 면역글로불린 또는 항체의 아미노-말단으로부터 더 멀어질수록 증가한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬의 N-말단은 가변 영역이며 C-말단은 불변 영역이다. CH3 및 CL 도메인은 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단을 포함한다. 따라서, 경쇄 면역글로불린의 도메인은 VL-CL 배향으로 배열되는 반면, 중쇄의 도메인은 VH-CH1-힌지-CH2-CH3 배향으로 배열된다.
각각의 가변 영역 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991]의 정의에 따라 이루어진다. Kabat은 또한 상이한 중쇄 가변 영역 간 또는 상이한 경쇄 가변 영역 간 대응하는 잔기에 동일한 번호가 할당되는 널리 사용되는 넘버링 관례(Kabat 넘버링)를 제공한다. VL 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본원에서, 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 나타낸다. VH 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본원에서, 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 나타낸다. 이와 같이 주지되는 경우, CDR의 할당은 Kabat 대신 IMGT®(Lefranc et al., Developmental & Comparative Immunology 27:55-77; 2003)에 따라 이루어질 수 있다. 중쇄 불변 영역의 넘버링은 Kabat(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)에 나타낸 바와 같은 EU 인덱스를 통해 이루어진다.
본원에서 사용되는 용어 "VH 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인이 포함되고, 용어 "VL 도메인"에는 면역글로불린 경쇄의 아미노 말단 가변 도메인이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "CH1 도메인"에는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템에서 약 위치 114 내지 223(EU 위치 118 내지 215)에 걸쳐 있는 면역글로불린 중쇄의 첫 번째(가장 아미노 말단)의 불변 영역 도메인이 포함된다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접해 있으며, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단에 있고, 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 부분을 형성하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "힌지 영역"에는 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 일부가 포함된다. 힌지 영역은 대략 25개의 잔기를 포함하고 가요성이므로, 2개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직이는 것을 가능하게 한다. 힌지 영역은 3개의 구별되는 도메인: 상부, 중간, 및 하부 힌지 도메인으로 세분될 수 있다(Roux et al. J. Immunol. 1998, 161 :4083).
본원에서 사용되는 용어 "CH2 도메인"에는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템에서 약 위치 244 내지 360(EU 위치 231 내지 340)에 걸쳐 있는 중쇄 면역글로불린 분자의 일부가 포함된다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬은 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재되어 있다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 IgG1 분자(예를 들어, 인간 IgG1 분자)로부터 유래된 CH2 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "CH3 도메인"에는, 예를 들어, Kabat 넘버링 시스템의 약 위치 361 내지 476(EU 위치 341 내지 445)의, CH2 도메인의 N-말단으로부터의 약 110개의 잔기에 걸쳐 있는 중쇄 면역글로불린 분자의 일부가 포함된다. CH3 도메인은 전형적으로 항체의 C-말단 부분을 형성한다. 그러나, 일부 면역글로불린에서, 추가 도메인은 CH3 도메인으로부터 연장되어 분자의 C-말단 부분(예를 들어, IgM의 μ 사슬 및 IgE의 e 사슬 내 CH4 도메인)을 형성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 IgG1 분자(예를 들어, 인간 IgG1 분자)로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "CL 도메인"에는, 예를 들어, 약 Kabat 위치 107A 내지 약 Kabat 위치 216에 걸쳐 있는 면역글로불린 경쇄의 불변 영역 도메인이 포함된다. CL 도메인은 VL 도메인에 인접해 있다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 카파 경쇄(예를 들어, 인간 카파 경쇄)로부터 유래된 CL 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG 내의 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기는 114로 간주함)의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하여 항체의 C-말단에서 종료되는 중쇄 불변 영역의 일부로 정의된다. 따라서, 완전한 Fc 영역은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "천연 Fc" 또는 "야생형 Fc"는 단량체 형태이든 다량체 형태이든 항체의 소화로부터 생성되거나 다른 수단에 의해 생산된 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자를 나타내며, 힌지 영역을 함유할 수 있다. 천연 Fc의 원래의 면역글로불린원은 전형적으로 인간 기원이며, 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG1 및 IgG2일 수 있다. 천연 Fc 분자는 공유(즉, 디설피드 결합) 및 비-공유 회합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체성 폴리펩티드로 구성된다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 디설피드 결합의 수는 클래스(예를 들어, IgG, IgA, 및 IgE) 또는 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, 및 IgGA2)에 따라 1개 내지 4개의 범위이다. 천연 Fc의 한 예는 IgG의 파파인 소화로부터 생성되는 디설피드-결합 이량체이다. 본원에서 사용되는 용어 "천연 Fc"는 단량체, 이량체, 및 다량체 형태의 일반명이다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 변이체" 또는 "변형된 Fc"는 천연/야생형 Fc로부터 변형되지만 FcRn에 대한 결합 부위를 여전히 포함하는 분자 또는 서열을 나타낸다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-인간 천연 Fc로부터 인간화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 또한, 천연 Fc는 제거될 수 있는 영역을 포함하는데, 이는 상기 영역이 본원에서 기재되는 항체-유사 결합 폴리펩티드에 필요하지 않은 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문이다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기를 결여하거나 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함하고, 이는 하기에 영향을 미치거나 관여된다: (1) 디설피드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 비상용성, (3) 선택된 숙주 세포에서 발현 시 N-말단 이종성, (4) 당화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 재생 수용체 이외의 Fc 수용체로의 결합, 또는 (7) 항체-의존적 세포독성(ADCC).
본원에서 사용되는 용어 "Fc 도메인"은 상기 정의된 바와 같은 천연/야생형 Fc 및 Fc 변이체 및 서열을 포괄한다. Fc 변이체 및 천연 Fc 분자와 같이, 용어 "Fc 도메인"에는 전체 항체로부터 소화되든 다른 수단에 의해 생산되든 간에 단량체 또는 다량체 형태의 분자가 포함된다.
상기 시사된 바와 같이, 항체의 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 그에 특이적으로 결합하는 것을 가능하게 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인은 조합되어 3차원 항원 결합 부위를 정의하는 가변 영역(Fv)을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각각의 아암(arm) 단부에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각 상의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 정의된다. 본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 부위"에는 항원(예를 들어, 세포 표면 또는 가용성 항원)에 특이적으로 결합(그와 면역반응)하는 부위가 포함된다. 항원 결합 부위에는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 포함되고, 이들 가변 영역에 의해 형성된 결합 부위는 항체의 특이성을 결정한다. 항원 결합 부위는 항체마다 다양한 가변 영역에 의해 형성된다. 본 개시의 변경된 항체는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함한다.
소정 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 결합 폴리펩티드와 선택된 항원의 회합을 제공하는 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인이 동일한 면역글로불린 분자로부터 유래될 필요는 없다. 이에 관해, 가변 영역은 체액성 반응을 개시하고, 요망되는 항원에 대한 면역글로불린을 생성하기 위해 유도될 수 있는 임의의 유형의 동물의 가변 영역일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 이와 같이, 결합 폴리펩티드의 가변 영역은, 예를 들어, 포유류 기원일 수 있고, 예를 들어, 인간, 쥣과, 래트, 염소, 양, 비-인간 영장류(예를 들어, 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey), 짧은 꼬리 원숭이(macaque) 등), 이리, 또는 낙타과(예를 들어, 낙타, 라마 및 관련 종) 기원일 수 있다.
자연 발생 항체에서, 각각의 단량체 항체 상에 존재하는 6개의 CDR은 특이적으로 배치되어 항체가 수성 환경에서 이의 3차원 구성을 띰에 따라 항원 결합 부위를 형성하는 짧은, 비연속적 아미노산 서열이다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 나머지는 아미노산 서열에 있어서 더 적은 분자간 변동성을 나타내며, 프레임워크 영역으로 명명된다. 프레임워크 영역은 주로 β-시트 입체형태를 채택하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 이들 프레임워크 영역은 사슬간 비-공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 6개의 CDR의 배치를 제공하는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프와 상보적인 표면을 정의한다. 이러한 상보적 표면은 면역반응성 항원 에피토프로의 항체의 비-공유 결합을 촉진한다.
예시적 결합 폴리펩티드에는 항체 변이체가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 변이체"는 항체가 자연 발생이 아니도록 변경된 항체의 합성 및 조작된 형태, 예를 들어, 적어도 2개의 중쇄 부분을 포함하나, 2개의 완전한 중쇄를 포함하지는 않는 항체(예컨대, 도메인 결실된 항체 또는 미니바디(minibody)); 2개 이상의 상이한 항원 또는 단일 항원 상의 다양한 에피토프에 결합하도록 변경된 다중특이적 항체(예를 들어, 이중-특이적, 삼중특이적 등); scFv 분자에 연결된 중쇄 분자 등을 포함한다. 또한, 용어 "항체 변이체"에는 다가 항체(예를 들어, 동일 항원의 3개, 4개 이상의 카피에 결합하는 3가, 4가 항체 등이 포함된다. "항체 변이체"는 다중특이적이고/이거나 다가일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합가"는 폴리펩티드 내의 잠재적 표적 결합 부위의 수를 나타낸다. 각각의 표적 결합 부위는 하나의 표적 분자 또는 표적 분자 상의 특정 부위에 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드가 1개 초과의 표적 결합 부위를 포함하는 경우, 각각의 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들어, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다). 본 발명의 결합 폴리펩티드는 전형적으로 인간 항원 분자에 특이적인 적어도 하나의 결합 부위를 갖는다.
용어 "특이성"은 주어진 표적 항원(예를 들어, 인간 표적 항원)에 특이적으로 결합(예를 들어, 그와 면역반응)하는 능력을 나타낸다. 결합 폴리펩티드는 단일특이적이고 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 함유할 수 있거나, 폴리펩티드는 다중-특이적이고, 동일하거나 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 함유할 수 있다. 소정 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 동일 표적의 2개의 상이한(즉, 중첩되지 않는) 부분에 특이적이다. 소정 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 1개 초과의 표적에 특이적이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 본원에서 기재되는 결합 펩티드(예를 들어, 항체)는 Aβ의 하나 이상의 시냅스독성 형태에 특이적으로 결합한다. 소정의 예시적인 구현예에서, Aβ의 하나 이상의 시냅스독성 형태에 특이적으로 결합하는 본원에서 기재되는 결합 펩티드(예를 들어, 항체)는 단량체성 Aβ, 원섬유성 Aβ, 또는 원시섬유성 Aβ 중 하나 또는 이의 임의의 조합에 대해 특이성을 갖지 않는다. 소정의 예시적인 구현예에서, Aβ의 하나 이상의 시냅스독성 형태에 특이적으로 결합하는 본원에서 기재되는 결합 펩티드(예를 들어, 항체)는 하나 이상의 비-Aβ 응집물, 예컨대, SOD-1 및/또는 응집된 시누클레인에 대해 특이성을 갖지 않는다.
소정의 예시적인 구현예에서, Aβ의 하나 이상의 시냅스독성 형태에 특이적으로 결합하는 본원에서 기재되는 결합 펩티드(예를 들어, 항체)는 AD와 연관된 하나 이상의 증상을 방지하고/하거나 감소시킨다. 본원에서 사용된 바와 같은 "알츠하이머병과 연관된 증상" 또는 "AD와 연관된 증상"은 임의의 전임상, 경도, 중등도 또는 중증 단계의 AD와 연관된 징후를 나타낸다. AD와 연관된 증상에는 비제한적으로 하기가 포함되는 하나 이상의 신체적 변화, 예를 들어, 뇌 내 변화가 포함된다: 예를 들어, 내후각 피질, 해마 또는 대뇌 피질에서의 신경독성 및/또는 시냅스독성; 신경아교세포의 축적; Aβ의 축적; 타우의 축적; Aβ 올리고머의 형성; Aβ 부핵의 형성; Aβ 원시섬유의 형성; 성숙 Aβ 원섬유의 형성; 아밀로이드반의 형성; 신경원섬유 매듭의 형성; 만성 염증; 뇌로의 감소된 혈류; BBB의 파괴; 뇌 위축 등.
경도 AD와 연관된 증상에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 기억 손실; 잘못된 결정을 야기하는 불량한 판단; 자발성 및 주도적 감각의 손실; 정상 일과 업무를 완료하기 위해 보다 긴 시간이 소요됨; 질문 반복; 돈을 다루고 요금을 지불하는 데 어려움이 있음; 방황 및 길 잃음; 물건을 잃어버리거나 이를 이상한 위치에 잘못배치; 기분 및 인간성 변화; 불안 및/또는 공격성 증가 등.
중등도 AD와 연관된 증상에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 증가된 기억 손실 및 혼동; 새로운 것의 학습 불능; 언어 상 어려움 및 독서, 작문, 및 숫자 작업에 관한 문제; 생각을 조직하고 논리적으로 생각하는 데 있어서의 어려움; 주의 집중시간의 단축; 새로운 상황에 대한 대처의 어려움; 다단계 업무 수행, 예컨대 의복 착용의 어려움; 가족 및 친구 인식에 관한 문제; 환각, 망상, 및 편집증; 충동적 행동, 예컨대 부적절한 시간 또는 장소에서의 탈의 또는 저속한 언어의 사용; 부적절한 분노 폭발; 차분하지 못함, 동요, 불안, 울기, 방황(특히 오후 늦게 또는 저녁에); 반복 진술 또는 움직임, 가끔 일어나는 근육 경련 등.
중증 AD와 연관된 증상에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 기억 손실; 잘못된 결정을 야기하는 불량한 판단; 자발성 및 주도적 감각의 손실; 정상 일과 업무를 완료하기 위해 보다 긴 시간이 소요됨; 질문 반복; 돈을 다루고 요금을 지불하는 데 어려움이 있음; 방황 및 길 잃음; 물건을 잃어버리거나 이를 이상한 위치에 잘못배치; 기분 및 인간성 변화; 불안 및/또는 공격성 증가 등.
본원에서 사용된 바와 같은 "아밀로이드 베타의 시냅스독성 형태", "Aβ의 시냅스독성 형태" 또는 "시냅스독성 Aβ"는 AD 뇌로부터의 가용성 뇌 추출물에 존재하고 시냅스 손실과 연관되는 Aβ의 형태를 나타낸다. 시냅스독성 Aβ는 약 8 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 가지며 불안정하다.
소정 양태에 따르면, 시냅스독성 Aβ에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 본원에서 기재되는 예시적 결합 펩티드의 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
예시적 결합 펩티드의 전장 중쇄 서열 및 경쇄 서열.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
본원에서 기재되는 예시적 결합 펩티드의 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열 및 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열을 표 2에 나타낸다.
[표 2]
예시적 결합 펩티드의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
본원에서 기재되는 예시적 결합 펩티드의 경쇄 프레임워크(LFW) 서열 및 중쇄 프레임워크(HFW) 영역을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
예시적 결합 펩티드의 경쇄 프레임워크 서열 및 중쇄 프레임워크 서열.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
본원에서 기재되는 예시적 결합 펩티드의 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 표 4에 나타낸다.
[표 4]
예시적 결합 펩티드의 중쇄 CDR 서열 및 경쇄 CDR 서열.
Figure pct00012
Figure pct00013
본원에서 사용되는 용어 "항원" 또는 "표적 항원"은 결합 폴리펩티드의 결합 부위에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 나타낸다. 표적 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 약 20% 이내, 예컨대 약 10% 이내, 약 5% 이내, 또는 약 1% 이하의 이내를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "투여하다" 또는 "투여"는, 예컨대 비제한적으로 폐(예를 들어, 흡입), 점막(예를 들어, 비강내), 피내, 정맥내, 근육내 전달 및/또는 본원에서 기재되거나 당분야에 알려진 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해, 신체 밖에 존재하는 물질(예를 들어, 본원에서 제공되는 단리된 결합 폴리펩티드)을 환자 내로 주사하는 행위 또는 달리 물리적으로 전달하는 행위를 나타낸다. 질환 또는 이의 증상이 관리 또는 치료되고 있을 때, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발병 후에 일어난다. 질환, 또는 이의 증상이 방지되고 있을 때, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발병 전에 일어나며 질환-연관 증상의 출현 또는 크기를 연기하거나 감소시키기 위해 만성적으로 계속될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "조성물"은, 선택적으로, 명시된 양으로 명시된 성분(예를 들어, 본원에서 제공되는 단리된 결합 폴리펩티드)을 함유하는 제품뿐만 아니라, 선택적으로, 명시된 양으로 명시된 성분들의 조합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생성되는 임의의 제품을 포괄하는 것으로 의도된다.
"유효량"은 제제를 필요로 하는 개체에서 요망되는 생리적 결과를 달성하기 충분한 활성 약학 제제(예를 들어, 본 개시의 단리된 결합 폴리펩티드)의 양을 의미한다. 유효량은 치료받을 개체의 건강 및 신체 상태, 치료받을 개체의 분류학적 그룹, 조성물의 제형, 개체의 의학적 질병의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 개체 간에 다를 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호 교환적으로 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 대상체는 포유류, 예컨대 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간)일 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 척추동물, 예컨대 포유류를 나타낸다. 포유류에는 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 야생 동물, 길들여지지 않은 동물, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 애완동물이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료법"은 질환 또는 이와 관련되는 증상의 방지, 관리, 치료 및/또는 완화에서 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 제제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 용어 "치료법"은 대상체에서 감염 또는 이와 관련되는 증상에 대한 면역 반응의 조절에서 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 제제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 용어 "치료법들" 및 "치료법"은 당업자, 예컨대 의료인에게 알려져 있는 질환 또는 이와 관련되는 증상의 방지, 관리, 치료 및/또는 완화에 유용한 생물학적 치료법, 지지 치료법 및/또는 다른 치료법을 나타낸다. 다른 구현예에서, 용어 "치료법들" 및 "치료법"은 당업자, 예컨대 의료인에게 알려져 있는 대상체에서의 감염 또는 이와 관련되는 증상에 대한 면역 반응의 조절에 유용한 생물학적 치료법, 지지 치료법 및/또는 다른 치료법을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 치료법의 시행(비제한적으로 하나 이상의 예방제 또는 치료제, 예컨대 본원에서 제공되는 단리된 결합 폴리펩티드의 투여가 포함됨)으로 인한, 질환 또는 이와 관련되는 증상의 진행, 중증도, 및/또는 지속기간의 감소 또는 완화를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은 또한 치료받는 대상체의 치료 경과의 변경을 나타낼 수 있다. 치료의 치료적 효과에는 비제한적으로 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상(들)의 경감, 질환의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감퇴, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 고식, 및 관해 또는 개선된 예후가 포함된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 본원에서 기재되는 결합 폴리펩티드는 알츠하이머병의 하나 이상의 증상을 치료한다.
결합 폴리펩티드
하나의 양태에서, 본 개시는, Aβ에 결합하고 알츠하이머병의 하나 이상의 증상을 치료하는 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체, 면역부착소, 항체 변이체, 및 융합 단백질)를 제공한다. 본원에서 개시되는 결합 폴리펩티드는 변형된 Fc 도메인을 포함하는 임의의 결합 폴리펩티드를 포괄한다. 소정 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 항체, 또는 이의 면역부착소 또는 유도체이다. 임의의 원천 또는 종으로부터의 임의의 항체가, 본원에서 개시되는 결합 폴리펩티드에서 이용될 수 있다. 적합한 항체에는 비제한적으로 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체가 포함된다. 적합한 항체에는 비제한적으로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 전장 항체, 또는 단일쇄 항체가 포함된다.
임의의 면역글로불린 클래스(예를 들어, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE) 및 종으로부터의 Fc 도메인이, 본원에서 개시되는 결합 폴리펩티드에 사용될 수 있다. 상이한 종 또는 Ig 클래스로부터의 Fc 도메인의 일부를 포함하는 키메라 Fc 도메인도 이용될 수 있다. 소정 구현예에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 "LALA" 돌연변이를 함유하는 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 종 및/또는 Ig 클래스 또는 이소형의 Fc 도메인의 경우, 당업자는 본원에서 기재되는 임의의 아미노산 치환이 그에 알맞게 응용될 수 있음을 이해할 것이다. 소정 구현예에는, 대략 동일한 면역원성의 변경되지 않은 항체 전체 등과 비교되는 경우 요망되는 생화학적 특징, 예를 들어 효과기 기능의 감소 또는 증강, 비-공유적으로 이량체화되는 능력, 종양 부위에 편재되는 능력의 증가, 혈청 반감기의 감소, 혈청 반감기의 증가 등을 제공하기 위해 결실되거나 달리 변경된 하나 이상의 불변 영역 도메인 중 적어도 하나의 아미노산 및/또는 하나 이상의 가변 영역 도메인 중 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 항체가 포함된다.
소정의 다른 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 상이한 항체 이소형으로부터 유래되는 불변 영역(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 2개 이상으로부터의 불변 영역)을 포함한다. 다른 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 키메라 힌지(즉, 다양한 항체 이소형의 힌지 도메인, 예를 들어, IgG4 분자로부터의 상부 힌지 도메인 및 IgG1 중간 힌지 도메인으로부터 유래된 힌지 부분을 포함하는 힌지)를 포함한다.
소정 구현예에서, Fc 도메인은 당분야에 알려진 기법을 사용하여 효과기 기능을 증가시키거나 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 Fc 도메인을 포함하는 본 개시의 결합 폴리펩티드는 Fc 수용체에 대해 변경된 결합 친화도를 갖는다. Fc 수용체들에는, 이들이 인식하는 항체 유형에 기반하여 분류되는 몇몇 상이한 유형이 존재한다. 예를 들어, Fc-감마 수용체(FcγR)는 IgG 클래스 항체에 결합하며, Fc-알파 수용체(FcαR)는 IgA 클래스 항체에 결합하고, Fc-엡실론 수용체(FcεR)는 IgE 클래스 항체에 결합한다. FcγR은 몇몇 구성원, 예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb가 포함되는 패밀리에 속한다. 일부 구현예에서, 변형된 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드에 비해, 변경된 FcγRIIIa 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드에 비해, 감소된 FcγRIIIa 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드에 비해, 증강된 FcγRIIIa 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드에 비해, 대략 동일한 FcγRIIIa 결합 친화도를 갖는다.
다른 구현예에서, 본원에서 기재되는 결합 폴리펩티드는 당화를 감소시키거나 제거하기 위해 변경되는 불변 영역, 예를 들어, IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는다. 예를 들어, 변형된 Fc 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 면역부착소)는 항체 Fc의 당화를 변경하는 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 변형된 Fc 도메인은 감소된 당화(예컨대, N- 또는 O- 연결된 당화)를 가질 수 있다.
감소되거나 변경된 당화를 부여하는 예시적인 아미노산 치환은 그 전문이 본원에 참조로 포함된 국제 PCT 공개 제WO 2005/018572호에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 당화를 제거하도록 변형된다. 이러한 결합 폴리펩티드는 "어글리(agly)" 결합 폴리펩티드(예를 들어, "어글리" 항체)로 나타낼 수 있다. 이론에 구애받지 않으면서, "어글리" 결합 폴리펩티드는 개선된 생체 내 안전성 및 안정성 프로필을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 어글리 결합 폴리펩티드는 임의의 이소형 또는 이의 하위클래스, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4일 수 있다. 여러 당분야에서-인식된 방법이 "어글리" 항체 또는 변경된 글리칸을 갖는 항체를 제조하기 위해 이용 가능하다. 예를 들어, 변형된 당화 경로(예를 들어, 글리코실-트랜스퍼라제 결실)를 갖는 유전적으로 조작된 숙주 세포(예를 들어, 변형된 효모, 예를 들어, 피치아(Picchia), 또는 CHO 세포)가 이러한 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.
소정 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 하나 이상의 효과기 기능을 매개하는 항체 불변 영역(예를 들어, IgG 불변 영역, 예를 들어, 인간 IgG 불변 영역, 예를 들어, 인간 IgG1 불변 영역)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 불변 영역에 대한 C1-복합체의 결합은 보체 시스템을 활성화할 수 있다. 보체 시스템의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에서 중요하다. 보체 시스템의 활성화는 또한 염증성 반응을 자극하고 자가면역 과민증에도 관여될 수 있다. 또한, 항체는 Fc 도메인(세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위)을 통해 다양한 세포 상의 수용체에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(엡실론 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)이 포함되는 상이한 클래스의 항체에 대해 특이적인 여러 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 항체 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅 입자의 포획 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해(항체-의존적 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC로 불림), 염증성 매개체의 방출, 태반 이동 및 면역글로불린 생산의 제어가 포함되는 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 유발한다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 면역부착소)는 Fc-감마 수용체에 결합한다. 대안적 구현예에서, 결합 폴리펩티드는, 하나 이상의 효과기 기능(예를 들어, ADCC 활성)이 없고/없거나 Fcγ 수용체에 결합할 수 없는 불변 영역을 포함할 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 항체의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 결합하거나 항원 결합(즉, 특이적 결합)에 대해 온전한 항체(즉, 이들이 유래되는 온전한 항체)와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 나타낸다. 항원-결합 단편은 당분야에 잘 알려진 재조합 또는 생화학적 방법에 의해 생산될 수 있다. 예시적 항원-결합 단편에는 Fv, Fab, Fab', 및 (Fab')2가 포함된다.
일부 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 단일쇄 가변 영역 서열(ScFv)을 포함한다. 단일쇄 가변 영역 서열은 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들어, 가요성 링커에 의해 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 갖는 단일 폴리펩티드를 포함한다. ScFv 분자는 VH-링커-VL 배향 또는 VL-링커-VH 배향으로 작제될 수 있다. 항원 결합 부위를 구성하는 VL 및 VH 도메인을 연결하는 가요성 힌지에는 약 10개 내지 약 50개의 아미노산 잔기가 포함된다. 연결 펩티드는 당분야에 알려져 있다. 결합 폴리펩티드는 적어도 하나의 scFv 및/또는 적어도 하나의 불변 영역을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 변형된 Fc 도메인에 연결되거나 융합된 적어도 하나의 scFv를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 항체를 인코딩하는 DNA 서열과 ScFv 분자(예를 들어, 변경된 ScFv 분자)를 융합함으로써 생산되는 다가(예를 들어, 4가) 항체이다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 이들 서열은 ScFv 분자(예를 들어, 변경된 ScFv 분자)가 그 N-말단 또는 C-말단에서 가요성 링커(예를 들어, gly/ser 링커)를 통해 항체의 Fc 단편에 연결되도록 조합된다. 또 다른 구현예에서 본 개시의 4가 항체는 변형된 Fc 도메인에 융합된 연결 펩티드에 ScFv 분자를 융합하여 ScFv-Fab 4가 분자를 작제함으로써 제조될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 변경된 미니바디이다. 본 개시의 변경된 미니바디는 각각 연결 펩티드를 통해 변형된 Fc 도메인에 융합되는 ScFv분자를 포함하는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 이량체 분자이다. 미니바디는 당분야에 기재된 방법(예를 들어, 미국 특허 제5,837,821호 또는 제WO 1994/009817호 참고)을 사용하여 ScFv 구성요소를 작제하고 펩티드 구성요소를 연결함으로써 제조될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 4가 미니바디가 작제될 수 있다. 4가 미니바디는 2개의 ScFv 분자가 가요성 링커를 사용하여 연결되는 것을 제외하고는 미니바디와 동일한 방식으로 작제될 수 있다. 연결된 scFv-scFv 작제물은 이후 변형된 Fc 도메인에 연결된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 디아바디를 포함한다. 디아바디는, 각각 scFv 분자와 유사한 폴리펩티드를 갖지만, 보통 두 가변 도메인 모두를 연결하는 짧은(10개 미만, 예를 들어, 약 1개 내지 약 5개) 아미노산 잔기의 링커를 갖고, 그에 따라 동일 폴리펩티드 사슬 상의 VL 및 VH 도메인이 상호작용할 수 없는 이량체성, 4가 분자이다. 대신, 하나의 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 두 번째 폴리펩티드 사슬 상의 VH 및 VL 도메인과 (각각) 상호작용한다(예를 들어, 제WO 02/02781호 참고). 본 개시의 디아바디는 변형된 Fc 도메인에 융합된 scFv-유사 분자를 포함한다.
다른 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 동일 폴리펩티드 사슬 상에 하나 이상의 가변 도메인을 연속하여 포함하는 다중-특이적 또는 다가 항체, 예를 들어, 직렬 가변 도메인(tandem variable domain(TVD)) 폴리펩티드를 포함한다. 예시적 TVD 폴리펩티드에는 미국 특허 제5,989,830호에 기재된 "이중 헤드" 또는 "이중-Fv" 구성이 포함된다. 이중-Fv 구성에서, 2개의 상이한 항체의 가변 도메인은 2개의 별개의 사슬(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄) 상에서 직렬 배향으로 발현되고, 여기서 하나의 폴리펩티드 사슬은 펩티드 링커에 의해 분리된 2개의 VH 도메인을 연속하여 가지며(VH1-링커-VH2), 다른 하나의 폴리펩티드 사슬은 펩티드 링커에 의해 연속하여 연결된 상보적 VL 도메인으로 구성된다(VL1-링커-VL2). 교차하는 이중 헤드 구성에서, 2개의 상이한 항체의 가변 도메인은 2개의 별개의 폴리펩티드 사슬(하나의 중쇄 및 하나의 경쇄) 상에서 직렬 배향으로 발현되고, 여기서 하나의 폴리펩티드 사슬은 펩티드 링커에 의해 분리된 2개의 VH 도메인을 연속하여 가지며(VH1-링커-VH2), 다른 하나의 폴리펩티드 사슬은 반대 배향으로 펩티드 링커에 의해 연속하여 연결된 상보적 VL 도메인으로 구성된다(VL2-링커-VL1). "이중-Fv" 포맷에 기반하는 추가적인 항체 변이체에는 이중-가변-도메인 IgG(DVD-IgG) 이중특이적 항체(미국 특허 제7,612,181호 참고 및 TBTI 포맷(미국 제2010/0226923 A1호 참고)이 포함된다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 변형된 Fc 도메인에 융합된 동일 폴리펩티드 사슬 상에 하나 이상의 가변 도메인을 연속하여 포함하는 다중-특이적 또는 다가 항체를 포함한다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 면역부착소이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "면역부착소"는 면역글로불린 불변 도메인(즉, Fc 영역)에 연결된 하나 이상의 (예를 들어, 수용체, 리간드, 또는 세포-부착 분자로부터의) 결합 도메인을 포함하는 결합 폴리펩티드를 나타낸다(예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는, Ashkenazi et al. 1995, Methods 8(2): 104-115, 및 Isaacs (1997) Brit. J. Rheum. 36:305 참고). 면역부착소는 이의 국제 비전매명(INN)에서 접미사 "-셉트"로 확인된다. 항체와 마찬가지로, 면역부착소는 긴 순환 반감기를 가지며, 친화도-기반 방법에 의해 용이하게 정제되고, 2가에 의해 부여되는 결합력 장점을 갖는다. 예시적인 상업적으로 이용 가능한 치료용 면역부착소에는 에타너셉트(ENBREL®), 아바타셉트(ORENCIA®), 릴로나셉트(ARCALYST®), 애플리버셉트(ZALTRAP®/EYLEA®), 및 벨라타셉트(NULOJIX®)가 포함된다.
소정 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 면역글로불린-유사 도메인을 포함한다. 적합한 면역글로불린-유사 도메인에는 비제한적으로 피브로넥틴 도메인(예를 들어, 그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95-109 참고), DARPin(예를 들어, 그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701 참고), 단백질 A의 Z 도메인(그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76 참고), 리포칼린(Lipocalin)(예를 들어, 그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83 참고), 아필린(Affilins)(예를 들어, 그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85 참고), 아피틴(Affitin)(예를 들어, 그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68 참고), 아비머(Avimer)(예를 들어, 그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61 참고), 파이노머(Fynomer)(예를 들어, 그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204 참고), 및 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드(예를 들어, 그 전문이 참조로 본원에 포함되는 Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8 참고)가 포함된다.
본 개시의 결합 폴리펩티드 및 면역부착소의 경우, 비제한적으로 표적 항원의 단백질, 서브유닛, 도메인, 모티프, 및/또는 에피토프를 포함하는 실질적으로 모든 항원이 결합 폴리펩티드에 의해 표적화될 수 있고, 이는 가용성 인자, 예컨대 사이토카인 및 막-결합 인자, 및 막통과 수용체 둘 모두를 포함한다.
소정 구현예에서, 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 소정 구현예에서, 이중특이적 항체는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 횡단하기 위해 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기법에는 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현(Milstein, C. and Cuello, A. C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참고), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참고)이 포함된다. 다중-특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기적 스티어링 효과의 조작(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교(예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호, 및 Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83 참고); 이중-특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어, Kostelny, S. A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참고; 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술의 사용(예를 들어, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참고); 및 단일쇄 Fv(scFv) 이량체의 사용(예를 들어 Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참고); 및 예를 들어, 문헌[Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
하나의 구현예에서 이중특이적 항체의 중쇄의 CH3 도메인은, 예를 들어 문헌[WO 96/027011, WO 98/050431, Ridgway J. B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, Merchant, A. M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681]에서의 몇몇 실시예와 함께 상세히 기재되는 "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 기술에 의해 변경된다. 이러한 방법에서, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 상기 2개의 CH3 도메인을 함유하는 두 중쇄 모두의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. (2개의 중쇄의) 2개의 CH3 도메인 각각은 "노브"일 수 있는 반면, 다른 하나는 "홀"이다. 디설피드 가교의 도입이 이종이량체를 안정화하기 위해(Merchant, A. M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 뿐만 아니라 수율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 다른 하나의 중쇄의 CH3도메인이 각각 항체 CH3 도메인 간 원래 계면을 포함하는 계면에서 만나는 것을 특징으로 하며, 여기서 상기 계면은 이중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되고, 변경은 하기를 특징으로 한다: a) 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되어, 이중특이적 항체 내에서 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 원래 계면과 만나는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 원래 계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내 캐비티(cavity)에 배치될 수 있는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내 융기부를 생성하고; b) 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되어, 이중특이적 항체 내의 제1 CH3 도메인의 원래 계면과 만나는 제2 CH3 도메인의 원래 계면 내에서 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제1 CH3 도메인의 계면 내 융기부가 배치될 수 있는 제2 CH3 도메인의 계면 내 캐비티를 생성한다.
하나의 구현예에서 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 CH3 도메인 둘 모두는 CH3 도메인 둘 모두 사이에 디설피드 가교가 형성될 수 있도록 각 CH3 도메인의 대응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인(C)을 도입함으로써 추가로 변경된다.
예시적인 구현예에서, 다중특이적 항체는 "노브 사슬의 제1 CH3 도메인에 아미노산 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬"의 제2 CH3 도메인에 아미노산 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 또한 CH3 도메인 사이의 추가적인 사슬간 디설피드 가교가, 예를 들어, "홀 사슬의 CH3 도메인 내로 아미노산 Y349C 돌연변이 및 "노브 사슬"의 CH3 도메인 내로 아미노산 E356C 돌연변이 또는 아미노산 S354C 돌연변이를 도입함으로써 사용될 수 있다(Merchant, A. M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681).
하나의 구현예에서 이중특이적 항체는 두 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 두 CH3 도메인 중 다른 하나에 E356C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서 이중특이적 항체는 두 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 두 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다(하나의 CH3 도메인에서 추가적인 Y349C 돌연변이 및 다른 하나의 CH3 도메인에서 추가적인 E356C 또는 S354C 돌연변이는 사슬간 디설피드 가교를 형성함)(Kabat의 EU 인덱스에 따른 넘버링; (Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))). EP 1 870 459 A1에 기재된 바와 같은 추가의 노브-인-홀 기술이 대안적으로 또는 추가적으로 사용될 수 있다. 따라서, 이중특이적 항체에 대한 또 다른 예는 "노브 사슬"의 CH3 도메인에서 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 사슬"의 CH3 도메인에서 D399K, E357K 돌연변이이다(Kabat의 EU 인덱스에 따른 넘버링; (Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
하나의 구현예에서 이중특이적 항체는 "노브 사슬"의 CH3 도메인에서 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬"의 CH3 도메인에서 T366S, L368A, Y407V 돌연변이, 그리고 추가적으로 "노브 사슬"의 CH3 도메인에서 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 사슬"의 CH3 도메인에서 D399K, E357K 돌연변이를 포함한다.
핵산 및 발현 벡터
하나의 양태에서, 본 발명은 본원에서 개시되는 결합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단계를 포함하는, 결합 폴리펩티드를 제조하는 방법도 제공된다.
본원에서 개시되는 결합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 요망되는 양의 청구된 항체, 또는 면역부착소를 생산하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포로의 도입을 위한 발현 벡터에 삽입된다. 따라서, 소정 양태에서, 본 발명은 본원에서 개시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 이들 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는, 세포 내의 요망되는 유전자 내에 도입되고 이를 발현하는 데 사용되는 벡터를 의미하기 위한, 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 본원에서 사용된다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성되는 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 벡터는 선택 마커, 요망되는 유전자의 클로닝을 촉진하기 위한 적절한 제한 부위, 및 진핵 또는 원핵 세포에 진입하고/하거나 상기 세포에서 복제되는 능력을 포함할 것이다.
여러 발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 클래스의 벡터는 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래되는 DNA 요소를 이용한다. 다른 것들에는 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 시스템의 사용이 관여된다. 추가적으로, 형질감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써, DNA가 세포의 염색체 내로 통합된 세포를 선택할 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 원영양체를 제공하거나, 살생물제 내성(예를 들어, 항생제), 또는 중금속, 예컨대 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접적으로 연결되거나 공동-형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 또한 추가적인 요소가 mRNA의 최적 합성을 위해 필요할 수 있다. 이러한 요소에는 신호 서열, 스플라이스 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서 클로닝된 가변 영역 유전자는 위에서 논의된 바와 같이 합성되는 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(예컨대 인간 유전자)와 함께 발현 벡터 내에 삽입된다.
다른 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같은 결합 폴리펩티드는 폴리시스트론 작제물을 사용하여 발현될 수 있다. 이러한 발현 시스템에서, 다수의 관심 유전자 산물, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄가 단일 폴리시스트론 작제물로부터 생산될 수 있다. 유리하게는, 이러한 시스템은 진핵 숙주 세포 내에서 비교적 높은 수준의 폴리펩티드를 제공하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용한다. 상용성 IRES 서열은 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 당업자는 이러한 발현 시스템이 본 출원에 개시된 전체 범위의 폴리펩티드를 효과적으로 생산하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
보다 일반적으로, 일단 본 개시의 결합 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 즉, 숙주 세포가 형질전환될 수 있다. 숙주 세포 내로의 플라스미드의 도입은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기법에 의해 성취될 수 있다. 이들에는 비제한적으로 형질감염(전기영동 및 전기천공이 포함됨), 원형질 융합, 인산칼슘 침전, 엔벨로핑된(enveloped) DNA와의 세포 융합, 미세주입, 및 온전한 바이러스를 이용한 감염이 포함된다. 예를 들어, 문헌[Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, MA 1988)]을 참고한다. 형질전환된 세포는 경쇄 및 중쇄를 생산하기에 적절한 조건 하에 성장하고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 평가된다. 예시적인 분석 기법에는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 또는 형광-활성화 세포 선별기 분석(FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환"은 유전형을 변화시키고 결과적으로 수혜 세포의 변화를 초래하는 수혜 숙주 세포로의 DNA의 도입을 나타내기 위해 넒은 의미로 사용되어야 한다.
같은 방식으로, "숙주 세포"는, 재조합 DNA 기법을 사용하여 작제되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 인코딩하는 벡터로 형질전환된 세포를 나타낸다. 재조합 숙주로부터 폴리펩티드를 단리하기 위한 공정의 기술에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양"은 명확하게 달리 명시되지 않는 한, 항체의 원천을 나타내기 위해, 상호 교환적으로 사용된다. 환언하면, "세포"로부터의 폴리펩티드의 회수는 전체 세포 스핀 다운, 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 모두를 함유하는 세포 배양으로부터의 회수를 의미할 수 있다.
하나의 구현예에서, 결합 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 진핵생물 또는 원핵생물 기원이다. 하나의 구현예에서, 결합 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 박테리아 기원이다. 하나의 구현예에서, 결합 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포주는 포유류 기원이며; 당업자는 숙주 세포주에서 발현될 요망되는 유전자 산물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 결정할 수 있다. 예시적인 숙주 세포주에는 비제한적으로 DG44 및 DUXB11(차이니즈 햄스터 난소주, DHFR 음성), HELA(인간 경부암종), CVI(원숭이 신장주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(차이니즈 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장주), SP2/O(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), 293(인간 신장)이 포함된다. 하나의 구현예에서, 세포주는 세포주(예를 들어, PER6TM(Crucell) 또는 FUT8-녹-아웃 CHO 세포주(POTELLIGENTTM 세포)(Biowa, Princeton, NJ))로부터 발현되는 항체의 변경된 당화, 예를 들어, 비푸코실화를 제공한다. 하나의 구현예에서, NS0 세포가 사용될 수 있다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스인 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 이용 가능하다.
시험관 내 생산은 많은 양의 요망되는 결합 폴리펩티드를 제공하기 위한 스케일-업(scale-up)을 가능하게 한다. 조직 배양 조건 하에서의 포유류 세포 배양을 위한 기법은 당분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 공기부양 반응기 또는 연속 교반 반응기 중에서의 균질한 현탁 배양, 또는, 예를 들어, 중공 섬유, 마이크로캡슐 내, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서의 고정되거나 포획된 세포 배양(entrapped cell culture)을 포함한다. 필요하고/하거나 요망되는 경우, 폴리펩티드의 용액은 통상적인 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 상에서의 크로마토그래피 및/또는 (면역-) 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
결합 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 또한 비-포유류 세포, 예컨대 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 이에 관해, 다양한 단세포 비-포유류 미생물, 예컨대 박테리아; 즉, 배양에서 성장시킬 수 있거나 발효시킬 수 있는 것들도 형질전환될 수 있음이 이해될 것이다. 형질전환되기 쉬운 박테리아에는 장내세균과, 예컨대 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella) 균주; 간균과, 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus), 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)의 구성원이 포함된다. 박테리아에서 발현되는 경우, 폴리펩티드가 봉입체의 일부가 될 수 있음이 추가로 이해될 것이다. 폴리펩티드는 단리되고, 정제된 후 기능성 분자로 어셈블링되어야 한다.
원핵생물에 부가하여, 진핵 미생물도 사용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 빵 효모가 진핵 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용되지만, 다수의 다른 균주가 일반적으로 이용 가능하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현을 위해, 예를 들어, 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980))이 일반적으로 사용된다. 이미 이러한 플라스미드는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 함유한다(Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서의 trpl 병소의 존재는 이후에 트립토판의 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
치료 방법
하나의 양태에서, 본 발명은 본원에서 개시되는 유효량의 결합 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병의 하나 이상의 증상의 치료를 필요로 하는 환자에서 알츠하이머병의 하나 이상의 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 본 개시는 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 포유류 대상체에서 알츠하이머병의 치료를 위한 키트 및 방법을 제공한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 개시되는 결합 폴리펩티드는 국소 또는 전신 치료가 요망되는지 여부 및 치료될 영역에 따라 여러 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비제한적으로 정맥내 점적 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 척추강내 투여, 또는 심실내(예를 들어, 뇌실내) 투여가 포함되는 비경구일 수 있다. 소정의 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 본원에서 기재되는 다양한 적합한 조성물 및 방법을 사용하여 혈액-뇌 장벽(BBB)을 횡단하여 전달된다.
알츠하이머병으로 진단되거나 이를 갖는 것으로 추정되는 대상체에는 뇌 내로(예를 들어, 창백핵 또는 기저핵의 줄무늬체 내로, 그리고 줄무늬체의 중간 가시 뉴런 근처에) 결합 폴리펩티드가 직접적으로 투여될 수 있다. 결합 폴리펩티드에 부가하여, 환자에는 제2 치료법, 예를 들어, 고식적 치료법 및/또는 질환-특이적 치료법이 시행될 수 있다. 이차 치료법은, 예를 들어, 증상성(예를 들어, 증상 경감을 위해), 신경보호성(예를 들어, 질환 진행의 지연 또는 정지를 위해), 또는 수복성(예를 들어, 질환 과정의 역전을 위해)일 수 있다. 알츠하이머병의 치료를 위해, 예를 들어, 증상성 치료법에는 약물 Razadyne®(갈란타민), Exelon®(리바스티그민), Aricept®(도네페질), Namenda®(메만틴), 또는 Namzaric®(메만틴 및 도네페질)이 포함될 수 있다. 다른 치료법에는 정신치료법, 물리치료법, 언어 치료법, 커뮤니케이션 및 기억 보조, 사회적 지원 서비스, 및 식이 권고가 포함될 수 있다.
결합 폴리펩티드는 뇌의 신경 세포로 전달될 수 있다. BBB를 횡단하는 조성물의 통과를 필요로 하지 않는 전달 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 결합 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물은 질환-이환 세포(disease-affected cell)를 함유하는 영역 내로 직접적으로 주사에 의해 환자에게 전달될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 뇌 내로 직접적으로 주사에 의해 전달될 수 있다. 주사는 뇌의 특정 영역 내로의 정위 주사(예를 들어, 뇌실, 흑색질, 피질, 해마, 선조체, 또는 창백핵)에 의해 이루어질 수 있다. 결합 폴리펩티드는 중추 신경계의 다수의 영역 내로(예를 들어, 뇌의 여러 영역 내로 및/또는 척추 내로) 전달될 수 있다. 결합 폴리펩티드는 뇌의 확산 영역 내로 전달될 수 있다(예를 들어, 뇌의 피질로의 확산 전달).
하나의 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 하나의 단부가 조직, 예를 들어, 뇌, 예를 들어, 뇌의 흑색질, 피질, 해마, 선조체 또는 창백핵에 임플란트된 캐뉼라 또는 다른 전달 장치에 의해 전달될 수 있다. 캐뉼라는 결합 폴리펩티드의 저장소에 연결될 수 있다. 흐름 또는 전달은 펌프, 예를 들어, 삼투 펌프 또는 미니펌프, 예컨대 Alzet 펌프(Durect, Cupertino, CA)에 의해 매개될 수 있다. 하나의 구현예에서, 펌프 및 저장소는 조직으로부터 먼 영역, 예를 들어 복부에 임플란트되고, 전달은 펌프 또는 저장소로부터 방출 부위로 이어지는 도관에 의해 매개된다. 뇌로의 전달을 위한 장치는, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 제6,093,180호 및 미국 제5,814,014호에 기재되어 있다.
당업자는, 악성종양을 치료하기 위해, 변형된 결합 폴리펩티드의 효과적인 무독성 양이 얼마일지 일상적인 실험에 의해 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 개시의 결합 폴리펩티드의 치료 활성량은 질환 단계(예를 들어, 전임상 알츠하이머병, 경도 인지 기능 장애, 경도 치매, 중등도 치매 또는 중증 치매), 대상체의 연령, 성별, 의학적 합병증(예를 들어, 면역억제된 질병 또는 질환) 및 체중, 그리고 대상체에서 요망되는 반응을 유발하는 변형된 항체의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 투여량 요법은 최적 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 분할 용량이 매일, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다 등으로 투여될 수 있고/있거나, 용량이 치료 상황의 긴박함에 의해 시사되는 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다.
약학 조성물
본 개시의 결합 폴리펩티드를 제조하고 대상체에게 투여하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있거나 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 본 개시의 결합 폴리펩티드의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 비경구에는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여가 포함된다. 모든 이들 형태의 투여가 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 명확히 고려되나, 투여를 위한 형태는 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적을 위한 주사용수일 것이다. 보통, 주사에 적합한 약학 조성물은 완충액(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트, 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예컨대, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 유해한 세포 모집단 부위로 직접적으로 전달됨으로써 치료제에 대한 이환 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 조제물에는 멸균 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수성 담체는, 식염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올 용액/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 본 개시의 조성물 및 방법에서, 약학적으로 허용 가능한 담체에는 비제한적으로 0.01 M 내지 0.1 M, 예를 들어 0.05 M 포스페이트 완충액, 또는 0.8% 식염수가 포함된다. 다른 일반적인 비경구 비히클에는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거액, 또는 고정유가 포함된다. 정맥내 비히클에는 링거 덱스트로스에 기반하는 것들과 같은 전해질 보충물, 유체 및 영양 보충물 등이 포함된다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제도 존재할 수 있다. 더 구체적으로, 주사제 용도에 적합한 약학 조성물에는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 이러한 경우에, 조성물은 반드시 멸균성이어야 하고, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도의 유체여야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하고, 전형적으로 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호될 것이다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 조성물에 포함될 것이다. 주사제 조성물의 흡수 연장은 조성물 내에 흡수를 지연하는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기될 있다.
좌우간, 멸균 주사액은 본원에서 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합을 갖는 적절한 용매에 필요량의 활성 화합물(예를 들어, 변형된 결합 폴리펩티드 자체 또는 다른 활성제와의 조합)을 혼입시킨 후, 필요 시 여과 멸균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 성분으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는, 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 예시적인 제조 방법에는 활성 성분 + 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 요망되는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결-건조가 포함된다. 주사용 조제물은 당분야에 알려진 방법에 따라 무균 조건 하에서 가공되고, 용기, 예컨대 앰풀, 백, 병, 시린지 또는 바이알 내로 충전되고, 밀봉된다. 또한, 조제물은 패키징되어 키트의 형태로 판매될 수 있다. 이러한 제조 물품은 전형적으로 연관된 조성물이 자가면역 또는 신생물성 장애를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체의 치료에 유용함을 시사하는 표지 또는 패키지 인서트를 가질 것이다.
상기 기재된 질병의 치료를 위한 본 개시의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부가 포함되는 많은 다양한 요인에 따라 변한다. 대개, 환자는 인간이지만, 형질전환 포유류가 포함되는 비-인간 포유류도 치료받을 수 있다. 안전성 및 효능을 최적화하기 위해, 당업자에게 알려진 일상적인 방법을 사용하여 치료 투여량이 적정될 수 있다.
본 개시의 결합 폴리펩티드는 다수의 기간에 투여될 수 있다. 단회 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서의 변형된 결합 폴리펩티드 또는 항원의 혈중 수준을 측정하여 시사되는 바에 따라 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1 μg/ml 내지 1000 μg/ml 및 일부 방법에서 약 25 μg/ml 내지 300 μg/ml의 혈장 변형된 결합 폴리펩티드 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 결합 폴리펩티드는 서방출 제형으로서 투여될 수 있으며, 이러한 경우 투여 빈도를 줄일 필요가 있다. 항체에 대해, 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간화 항체는 더 긴 반감기를 나타내고, 키메라 항체 및 비-인간 항체가 그 뒤를 잇는다.
투여량 및 투여의 빈도는 치료가 예방적인지 치료적인지 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적인 적용에서, 본 항체 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 환자의 내성을 증강시키기 위해 아직 질환 상태가 아닌 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효 용량"으로 정의된다. 이러한 용도에서, 정확한 양은, 다시, 환자의 건강 상태 및 일반적인 면역성에 좌우되지만, 일반적으로 용량 당 약 0.1 mg 내지 약 25 mg, 특히 용량 당 약 0.5 mg 내지 약 2.5 mg의 범위이다. 긴 기간에 걸쳐 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 투여될 수 있다. 일부 환자는 그들의 남은 일생 동안 치료를 받는 것을 계속한다. 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 전체적 완화를 나타낼 때까지, 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량(예를 들어, 용량 당 약 1 mg/kg 내지 400 mg/kg의 항체)이 때때로 요구된다. 이후, 환자에게는 예방적 요법이 시행될 수 있다.
본 개시에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한, 무독성, 멸균 담체, 예컨대 생리 식염수, 무독성 완충액, 보존제 등을 포함할 수 있다. 본 출원의 적용의 목적을 위해, 치료제에 컨쥬게이션되거나 컨쥬게이션되지 않은 결합 폴리펩티드, 면역부착소 또는 이의 재조합체의 약학 유효량은 항원으로의 효과적인 결합을 달성하고, 이점을 달성하기에, 예를 들어, 알츠하이머병의 하나 이상의 증상을 완화하기에 충분한 양을 의미하도록 유지될 것이다. 본 개시의 약학 조성물은 약학 유효량의 결합 폴리펩티드를 제공하기 위해 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
본 개시의 범위와 일치하게, 본 개시의 결합 폴리펩티드는 치료 또는 예방 효과를 생산하기에 충분한 양으로 상기 언급된 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 본 개시의 결합 폴리펩티드는 알려진 기법에 따라 본 개시의 항체와 통상적인 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 조합함으로써 제조된 통상적 투여형으로 이러한 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 당업자는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수들에 의해 좌우된다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 본 개시에 기재된 결합 폴리펩티드의 하나 이상의 종을 포함하는 칵테일이 특히 효과적임을 입증할 수 있음을 추가로 이해할 것이다.
본원에서 언급되거나 인용되는 물품, 특허, 및 특허 출원, 그리고 모든 다른 문서 및 전자적으로 이용 가능한 정보의 내용은 각각의 개별 문헌이 참조로 포함됨을 구체적이고 개별적으로 나타낸 바와 동일한 정도로 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 출원인은 임의의 이러한 물품, 특허, 특허 출원, 또는 다른 물리적 및 전자적 문서로부터 모든 자료 및 정보를 본 출원 내에 물리적으로 포함시킬 권리를 보유한다.
본 발명은 이의 구체적 구현예를 참조하여 기재되었으나, 당업자는 다양한 변화가 제조될 수 있고 균등물이 본 발명의 실제 정신 및 범위를 벗어나지 않고 치환될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에서 개시된 구현예의 범위를 벗어나지 않고 본원에서 기재된 방법의 다른 적합한 변형 및 응용은 적합한 균등물을 사용하여 제조될 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 또한, 많은 변형이 특정 상황, 물질, 합성물(composition of matter), 공정, 공정 단계 또는 단계를 본 발명의 목적, 정신 및 범위에 적합하게 만들기 위해 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본원에 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 소정 구현예를 상세히 설명하였지만, 이는 예시의 목적으로만 포함되고 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 참조하여 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가의 제한으로 간주되어서는 안 된다.
실시예 1: Aβ 모노클로날 항체 발견 과정의 간략한 개요
트리안니(Trianni) 마우스를 초음파분쇄된 인간 알츠하이머병(AD) 뇌 아밀로이드반(FusA), 응집된 합성 Aβ(FusB), 또는 인간 AD 뇌 아밀로이드반-씨드접종 합성 Aβ(FusC)로 면역접종하였다(도 1). 주지할 것은, Fc 도메인은 마우스 도메인이었지만, Fv 도메인은 대부분의 경우 인간 도메인이었다는 점이다.
합성 Aβ 원시섬유(PF)에 대해 우수-내지-중등도 결합을 갖는 하이브리도마를 선택하였다. 단량체성 Aβ에 대해 고친화도 및 다른 유형의 응집된 단백질(예를 들어, 시누클레인 및 SOD)에 대해 낮은 친화도로 결합된 항체를 카운터-선택하였다. 마지막으로, 쥣과 IgG 항체를 "세포 iN 검정"(아래에서 추가로 설명됨)을 사용하여 스크리닝하였고 여기서 올리고머성 Aβ(oAβ)의 AD-뇌 시냅스독성 형태에 대한 신경보호를 평가하였다. Aβ 원시섬유 및 원섬유성 Aβ 둘 모두에 대해 낮은 결합을 갖는 활성 항체를 선택하였다. 유망한 항체를 클로닝하고 인간 IgG1 LALA Fc 도메인 내로 재포맷화하였다.
재포맷화된, 인간 IgG1 모노클로날 항체(mAb)의 결합 특성을 단량체 Aβ에 대한 선택성뿐만 아니라 Aβ PF 및 원섬유성 Aβ로의 낮은 결합에 대해 평가하였다. Aβ PF에 대해(다른 형태에 대해서도) 유의미한 결합을 나타내지 않은 확인된 인간 mAb 중 2개를 iN 세포 검정에서 재시험하여 신경-보호성인 것으로 결정하였다.
다른 응집된 단백질에 결합하지 않은 인간 mAb(hIgG)를 iN 검정을 사용하여 평가하였고, EC50을 수득하고, 결과를 재현하였다. 5개의 hIgG를 아래에서 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 제2 기능 검정인 전기생리 LTP 검정에서 시험하였다.
실시예 2: 트리안니 마우스 면역접종 및 하이브리도마 생성
면역접종
인간 IgG 중쇄 및 카파 경쇄에 대해 트랜스제닉인 트리안니 마우스를 이전에 보고된 바와 같이 응집된[인용문을 제공해주십시오] 합성 Aβ 1 내지 42 펩티드, 또는 초음파분쇄된 인간 AD-뇌 유래 아밀로이드반 단편의 스캐폴드 상에 씨드접종되고 응집된 합성 Aβ 1 내지 42 펩티드로 면역접종하였다. 마우스를 2주마다 이들 단백질로 3 내지 5회 추가접종하였다.
아데노신 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT)가 결핍된 마우스 골수종 세포(센다이(Sendai) 바이러스와 융합된 BALB/c B-림프모구 세포주, SP2/0 유래)와, 면역접종된 마우스로부터의 비장 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 제조하였다. 하이포잔틴, 아자세린, 및 티미딘(HAT) 선택 및 연속 희석을 수행하여 단세포 클론화를 달성하였다.
스크리닝
스크리닝 및 카운터-스크리닝 검정을 위해 간접적 ELISA를 이용하였다. 표면 플라즈마 공명(SPR) 오프율 분석을 수행하여 결합 친화도를 결정하였다. 분석을 Biacore T100 상에서 HBS-EP 및 러닝 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P20)으로 수행하였다. 시리즈 A 단백질 A 센서 칩을 분석을 위해 사용하였다. 항체를 HBS-EP+ 중 5 μg/ml로 희석하였다. 단량체성 Aβ1 내지 42 펩티드(SEC 정제됨)를 HBS-EP+ 중 1000 μM(4.5 mg/ml)로 희석한 후 총 6개 농도에 대해 2배씩 연속 희석하였다. Aβ1 내지 42 PF를 HBS-EP+ 중 100 nM(66 μg/ml)로 희석한 후 총 6개 농도에 대해 2배씩 연속 희석하였다. 항체를 10 μl/분으로 60초 동안 단백질 A 표면 상에서 Fc 도메인을 통해 포획한 후 Aβ 펩티드 용액(단량체성 또는 PF)을 30 μl/분으로 180초 동안 표면 상으로 주입하였고, 360초 해리가 이어졌다. 단백질 A 표면을 10 mM 글리신-HCl, pH 1.7의 60초 주입으로 재생시켰다. 생성된 센서그램을 이중-참조하고 1:1 결합 모델에 피팅하여 ka, kd 및 KD를 결정하였다.
Octet 오프율 및 동력학 분석을 OctetRed96(Forte Bio), PBS 러닝 완충액 및 단백질 A 센서 팁을 사용하여 수행하였다. 항체를 각각 PF 또는 단량체에 대한 결합 평가를 위해 PBS 중 1 μg/mL 또는 5 μg/mL로 희석하였다. 항원을 1 μM(Aβ1 내지 40) 또는 30 nM(PF)로 희석한 후, 총 3개 농도에 대해 1:3으로 연속 희석하였다. 항체를 센서 팁 상에서 1 nm 부하(Aβ1 내지 40) 또는 0.2 nm 부하(PF)로 포획한 후 이를 300초 동안 항원 내로 침지시키고, 이어서 PBS 중에서 360초 동안 해리시켰다. 데이터를 이중 참조하고 1:1 결합 모델로 피팅하였다.
스크리닝 및 카운터-스크리닝 워크플로우를 하기와 같이 수행하였다. 마우스 혈청 역가의 분석을 위해, 간접적 ELISA를 Aβ 원시섬유 또는 Aβ-유래 확산성 리간드, 즉 합성 Aβ 올리고머(ADDL) 및/또는 Aβ 1/2tmax 상에서 수행하였다. 일차 스크리닝을 위해, 간접적 ELISA를 Aβ PF 및/또는 ADDL 상에서 수행하였다. 카운터-스크리닝을 위해, 올리고머성 Aβ 대 단량체성 Aβ를 선택하여, 단량체 형태에 강력히 결합된 클론을 제거하였다. 오프율을 Biacore 또는 간접적 ELISA(도 1a 및 도 1b)를 사용하여 평가하였다. 대안적인, 표적을-벗어난 아밀로이드 구조에도 결합된 클론을 제거하기 위해, 간접적 ELISA를 사용하여 응집된 알파 시누클레인 및 응집된 SOD를 확인하였다.
이차 스크리닝을 위해, 시험관내, 세포-기반 검정을 사용하여 iN 세포 상에서 AD-뇌 추출물의 신경돌기독성 효과를 중화할 수 있는 클론을 확인하였다.
삼차 스크리닝을 위해, 시험관내, 기능적 LTP 검정을 사용하여 뇌 슬라이스에서 측정된 바와 같이 LTP 상에서 AD-뇌 추출물의 억제 효과를 중화할 수 있는 클론을 확인하였다.
하이브리도마 스크리닝 요약
대략 4400개 클론을 일차 ELISA 스크리닝에 투입하였다. 3개의 상이한 면역접종 전략을 이용하였고, 5개 융합을 수행하였다. 일차 ELISA 스크리닝을 Aβ 1 내지 42-유래 원시섬유 및/또는 Aβ 1 내지 42-유래 ADDL 상에서 수행하였다.
대략 80개 클론을 카운터-스크리닝에 의해 평가하여, 표적을 벗어난 엔티티, 예를 들어, Aβ 1 내지 40 단량체 및/또는 Aβ 1 내지 42 단량체, Aβ 1 내지 42 원섬유, 시누클레인 원섬유, 및 응집된 SOD-1에 대한 최소 결합을 갖거나 결합을 갖지 않는 클론을 확인하였다.
대략 50개 클론을 세포-기반 기능적 스크리닝(예를 들어, iN 세포 검정)을 사용하여 이차 스크리닝에 의해 평가하였다. 다중 검정 수행을 원래 하이브리도마를 사용하여 수행하였다. 추가적으로, 클로닝되고, 재포맷화되고 재조합적으로 생산된 IgG1 LALA 버전의 상위 후보도 시험하였다. 올리고머성 Aβ 시냅스독성을 가장 잘 중화할 수 있는 것들에 따라 클론의 순위를 매기기 위해 상위 클론에 대해 EC50 데이터를 수득하고 복제하였다.
4개 클론을 하나 이상의 농도에서 삼차 LTP 기능적 스크리닝에 의해 평가하고, LTP를 구제하는 이의 상대적 능력에 따라 순위를 매겼다.
선도 클론(들)을 iN 및 LTP 검정 둘 모두에서 우수한 결합 선택성 및 기능적 활성의 보존에 기반하여 선택하였다.
실시예 3: 융합물 B(FusB) 요약
응집된 합성 Aβ를 Sigma 아주반트를 사용하여 트리안니 마우스에 투여하였다. 면역접종을 총 200 μl(50 μg 항원)/주사를 사용하여 i.p.로 수행하였다. ½ tmax(4 μg/mL 코팅) 또는 ADDL(1 μg/mL 코팅) 상에서 5회 면역접종 후 평가된 역가를 평가하였다(도 3). 이들 데이터에 기반하여, 마우스 M13은 최종 추가접종 및 융합 전에 휴식을 취하게 하였다.
마우스 M13(역가 대략 1 : 600,000)
대략 670개 클론을 ADDL 상의 일차 스크리닝을 위해 확인하였다. 90개의 양성 클론을 ADDL에 대한 ELISA에 의해 최초로 확인하였다. 90개 양성 클론을 24-웰 스크리닝으로 이동시켰으며, 그 중 17개는 결합을 손실하였거나 충분한 세포를 갖지 않았다. 따라서, 73개 클론을 6-웰 단계로 이동시켰다. 6-웰 단계부터, 15개 클론을 생산을 위해 스케일-업하였고(그룹 1), 13개의 느린 성장체를 이후 스케일-업하였다(그룹 2). 종합하면, 28개 클론을 생산을 위해 이동시켰고, 단백질 메이커(Protein Maker)에 의해 정제하였다. 4개의 클론을 기능적 스크리닝으로 이동시켰다. FusB 스크리닝을 도 37에 요약한다. 선도 FusB 클론의 결합 및 특성규명 데이터를 도 4 내지 도 18에 도시한다.
2개의 클론은 2개의 이소형으로 확인되었고 재-클로닝하였다. 하나의 클론 B47-6으로 계속 진행하였고 이를 융합물 C 클론과 함께 정제하였다.
실시예 4: 융합물 C(FusC) 요약
AD-뇌 아밀로이드반-씨드접종 합성 Aβ를 Sigma 아주반트를 사용하여 트리안니 마우스에 투여하였다. ½ tmax(4 μg/mL 코팅) 또는 ADDL(1 μg/mL 코팅) 상에서 5회 면역접종 후 역가를 평가하였다(도 18). 이들 데이터에 기반하여, 마우스 M23은 최종 추가접종 및 융합 전에 휴식을 취하게 하였다.
대략 750개 클론이 ADDL 상에서 일차 스크리닝을 거쳤다. 29개의 약한 양성체가 최초로 확인되었고 이를 스케일-업하였다(96w-24w-6w-T150). 6개 클론은 스케일-업에 걸쳐 매우 약한 양성을 보유하였다. 2개의 약하게 양성인 클론을 카운터-스크리닝으로 이동시켰다. 2개 클론은 동일하였고, 이에 따라 나머지 클론을 재포맷화하고 hIgG1 LALA와 같이 재조합적으로 생산한 후, 재-스크리닝하고 재-카운터-스크리닝하였다. FusC 스크리닝을 도 38에 요약한다. 선도 FusC 클론의 결합 및 특성규명 데이터를 도 19 내지 도 29에 도시한다.
1개의 클론을 기능적 스크리닝으로 이동시켰다.
실시예 5: 세포 iN 검정
인간 AD 뇌로부터의 수성 추출물의 제조
냉동 뇌 조직은 University of Miami Miller School of Medicine(Miami, FL) 및 Manchester Brain Bank of the Medical Research Council at University of Manchester(Manchester, UK)에서 제공받았다. 뇌 조직을 경도 내지 중등도 단계 AD로 사망한 2명의 환자로부터 수득하였다. 수성 추출물을 전술된 바와 같이 제조하였다(Jin et al. (2018) Nature Biotech. 9:2676). 간략하게, 20 그램의 측두 피질 회색질을 프로테아제 억제제(5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1 mM 에틸렌글리콜테트라아세트산, 5 μg/mL 류펩틴, 5 μg/mL 아프로티닌, 2 μg/mL 펩스타틴, 120 μg/mL 페파블록(Pefabloc) 및 5 mM NaF)가 보충된 5배 부피의 빙냉 인공 뇌척수액 기본 완충액(aCSF-B)(124 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, pH 7.4) 중에 Dounce-균질화하였다. 생성된 균질액을 SW41 Ti 로터(Beckman Coulter, Fullerton, CA)에서 110분 동안 200,000 g 및 4℃에서 원심분리하고 상청액의 상위 80%를 제거하고 72시간의 기간에 걸쳐 24시간마다 3회 완충액을 교체하면서, 신선 aCSF-B에 대해 투석하였다. 이어서 뇌 추출물을 2개 부분으로 나누었다: 1개 부분은 4℃에서 항-Aβ 항체, S97, + 단백질 A 세파로스(PAS) 비드와 3회 12시간 인큐베이션에 의해 Aβ를 면역고갈시켰다(ID). 두 번째 부분은 면역-전 혈청 + PAS 비드로 동일한 방식으로 처리하였다. Aβ가 고갈된 추출물은 ID-AD로 나타내며 면역-전 혈청으로 처리된 추출물은 모의(mock)-AD로 나타낸다. 샘플에서 비드를 제거하고, 0.5 mL씩의 분취물을 저단백질 결합 에펜도르프 튜브(Eppendorf, Hamburg, Germany)로 제거하여 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. 샘플은 한 번 해동한 후 사용하였다. 두 상이한 케이스 AD10/27 및 AD10/14로부터의 뇌 추출물을 기능 검정에서 사용하였다.
iPSC-유래 인간 뉴런(iN)
뉴로제닌 2(Ngn2)-유도 인간 뉴런(Zhang et al., 2013)을 전술된 바와 같이 제조하였다(Hong et al., 2018; Jin et al., 2018). 간략하게, YZ1 iPSC를 DMEM/F12, 녹아웃 혈청 대체물, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, MEM-NEAA, 및 2-메르캅토에탄올(모두 Invitrogen, Carlsbad, CA) + 10 μg/mL bFGF (Millipore, Billerica, MA)를 함유하는 배지 중에 유지하였다. 이어서 iPSC를 하기 농도로 바이러스 감염을 위해 95,000 세포/cm2의 밀도로 플레이트접종하였다: pTet-O-NGN2-puro: 0.1 μL/50,000 세포; Tet-O-FUW-eGFP: 0.05 μL/50,000 세포; Fudelta GW-rtTA: 0.11 μL/50,000 세포(Alstem, Richmond, CA). 뉴로제닌 2 발현을 유도하기 위해, 독시사이클린을 "iN 제1일"에 2 μg/mL의 농도로 첨가하였고, 퓨로마이신을 iN 제2일에 10 mg/mL로 첨가하고, 이후 항상 배지 중에 유지하였다. iN 제4일에, 세포를 매트리겔(Matrigel)(BD Biosciences, San Jose, CA) 코팅된 Greiner 96웰 마이크로클리어 플레이트 상에 5,000 세포/웰로 플레이트접종하고, 신경기저 배지(Neurobasal medium)(Gibco), 글루타맥스(Glutamax), 20% 덱스트로스, MEM-NEAA 및 B27과 각각 10 ng/mL 농도의 BDNF, CNTF, GDNF(PeprpTech, Rocky Hill, NJ)로 구성되는 배지 중에 유지하였다. 신경돌기 수 및 신경 마커의 발현은 iN 제14일까지 최대 수준에 도달하였고 iN은 iN 제21일까지 완전 성숙하였다. 신경돌기 온전성에 대한 AD 뇌 추출물의 효과를 연구하기 위해, 세포를 iN 제21일에 사용하였다.
샘플 첨가 및 라이브-세포 조영
유도-후 제21일에, 뉴런을 사용하여 Incucyte 라이브-조영 판독기를 사용하여 신경돌기 온전성에 대한 샘플의 효과를 연구하였다. 샘플 첨가 전 대략 7시간째에, 총 6시간 동안 2시간마다 웰 당 4개 필드로부터 이미지를 수집하고, 기준선 신경돌기 길이 및 분기점을 계산하였다. 마지막 간격 시간 동안, 뇌 샘플을 PD MidiTrap G-25 칼럼(GE Healthcare Life Science, Milwaukee, WI)을 사용하여 B27/글루타맥스가 보충된 신경기저 배지로 교체하였다. 6시간의 기간의 기준선 조영 후, 배지의 절반을 각각의 웰로부터 제거하고(약 100 μL을 남김) 50 μL의 교체된 추출물 또는 비히클을 50 μL의 신선 배지와 함께 첨가하였다. 이후, 적어도 72시간 동안 2시간마다 웰 당 4개 필드로부터 이미지를 수집하였다. IncuCyte Zoom 2016A 소프트웨어(Essen Bioscience, Ann Arbor, MI)를 사용하여 위상 대조 이미지 세트를 분석하였다. 위상 대조 이미지에 기반하여 신경돌기 및 세포체를 자동 정의하기 위해, 분석 업무 Neural Track을 사용하였다. 전형적인 설정은 하기와 같았다: 분절화 모드-밝기; 분절화 조정-1.2; 세포체 클러스터 필터-최소 500 μm2; 신경돌기 필터링-최상; 신경돌기 민감도-0.4; 신경돌기 폭-2 μm. 전체 신경돌기 길이(밀리미터 단위) 및 분기점의 수를 정량하고 샘플 첨가 전 6시간의 기간 동안 측정된 평균 값에 대해 표준화하였다. AD 뇌 추출물(+/- 면역고갈)을 뉴런 +/- 시험 mAb에 첨가하였다.
72시간의 기간의 종료 시 신경돌기 길이를 마지막 3개 시점에 걸쳐 평균하고 a) 항체 비함유 조건(AD) 및 b) 면역고갈된 뇌 추출물(ID-AD) 대비 보호%를 각각의 농도에서 계산하였다. 50% 신경돌기독성 보호 농도(EC50)를 계산하였다.
데이터 분석 및 통계적 시험
라이브-세포 조영 실험을 위해, 샘플 및 처리를 코드화하고 맹검 방식으로 시험하였다. 군 간 차이를 본페로니 포스트-혹 시험 또는 스튜던트 t-시험으로 이원 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 시험하였다. #p<0.05, ## p< 0.01, 및 ### p< 0.001.
세포 iN 검정에서 하이브리도마-정제 mAb의 기능적 효과
하이브리도마-정제 mAb를 세포 iN 검정에서 시험하여, 가용성 AD-뇌 추출물에 의해 유도된 독성에 대한 신경돌기 길이의 보호를 평가하였다. 인간 뉴런 iN 배양에서, AD 뇌 추출물(AD10/27)에 대한 연속 노출은 3일 후 측정된 바와 같이 대략 50%만큼 인간 뉴런의 감소를 야기하였다(도 30에서 AD 샘플 대 배지 또는 ID 샘플 참고). AD 추출물(샘플 ID)로부터의 Aβ의 사전-면역고갈은 신경돌기독성을 방지하여, AD 뇌 추출물이 이전에 실증된 바와 같이 Aβ-의존적 신경돌기 독성 활성을 함유함을 검증하였다(Jin et al 2012; 2018). 검정의 추가검증은 이전에 실증된 바와 같이(Shankar et al., 2008; Jin et al., 2011) 신경돌기독성 뇌 추출물을 중화할 수 있는 3 μg/ml의 양성 대조군 Aβ-유도 항체 3D6(도 30에서 코드 C1)에 의해 제공되었다. 3D6은 Aβ 서열의 N-말단 자유 단부에 결합하며 모든 입체형태의 Aβ를 인식한다. 추가적인 양성 대조군 1C22(단량체성 Aβ가 아닌 다수의 올리고머성 형태의 Aβ를 인식함, Jin et al 2018)도 다른 실험에서 사용하였다(표 3 참고). AD 뇌 추출물에서 독성 Aβ 함유 엔티티의 정확한 성질이 아직 특성규명되지 않았으므로, 단량체성 Aβ에는 결합하지 않지만 가용성 원시섬유성 및 응집된 Aβ에 광범위한 친화도를 갖는 면역접종 캠페인으로부터의 대규모 mAb 패널을 선택하기 위해 주의를 기울였다. 이는 단지 사용되는 독특한 세포 기능적 iN 검정(다중웰 MW96 포맷)의 우수한 능력/처리량에 기인할 가능성이 있다. 동일한 케이스 AD10/27의 2개의 상이한 조제물로부터의 뇌 추출물(AD10/27 1st, 2nd로 주지됨)을 사용하였다. 몇몇 하이브리도마-정제 mAb는 PF Aβ 형태에 대해 중등도-친화도를 갖는 mAb(예컨대 B73 또는 B24)부터 PF에 대해 높은-친화도를 갖는 mAb, 예컨대 B51 또는 B90에 이르기까지, 양성 대조군과 유사한 신경보호를 실증하였다(도 30). 그러나, B35 및 B61(PF Aβ 형태에 대해 중등도 친화도를 가짐)은 iN 검정에서 비활성인 반면, B8, B30 또는 B60은 Aβ에 대해 매우 높은 친화도를 가졌으므로, 생화학적 결합 프로필이 iN 검정에서의 활성을 예측하지는 않았다.
[표 5]
iN 신경돌기독성 보호 검정에서 상이한 모노클로날 항체의 활성 요약.
Figure pct00014
따라서, AD 뇌 추출물을 사용하는 iN 기능 검정은, 크게 관련된 생물학적 활성을 갖는 신규한 Aβ mAb를 특성규명하고 선택하기 위한 독특한 도구를 제시한다. iN 검정의 민감도로 인해, 추가적인 융합으로부터 발생한 항체를 사용하는 실험이 포함되는 몇몇 독립 실험을 수행하여 데이터를 확인하였다(표 5 참고).
상이한 항체에 의한 신경보호 효과는, 부분적으로, 하이브리도마로부터 정제되는 항체 배치의 중등도 안정성 또는 세포 생존력을 손상시킨 iN 세포의 배지 중 제한된 희석만을 야기한 이들 항체의 제한된 스톡 농도에 기인하여, 실험 간에 다소 가변적이었다. 일부 경우, 독립적 항체 생산 배치를 생성해야 했다. 예를 들어, 하이브리도마 B28은 수행 #3에서는 유일하게 중등도 활성이 있었고, 잠재적으로 안정성 문제로 인해, 수행 #4 및 5b에서는 음성이었다. 또한, 첫 번째 하이브리도마 생산으로 iN 수행에서는 처음에 음성이었으나, 두 번째 제조에 있어서는 수행 #4 및 5b에서 매우 유의미한 활성을 제공한 클론 B73도 예상치 못한 것이었다.
동일한 IgG1 LALA 프레임워크에 대한 모든 mAb의 전달을 가능하게 하고 보다 제어되는 생산 조건을 가능하게 하는 하이브리도마 클론의 재조합 버전을 이용한 추가 분석을 위해, 적어도 하나의 iN 실험 수행에서 신경보호를 제공하였으나, 합성 Aβ 형태이성질체(conformer)에 대해 다양한 친화도를 갖는 클론, 특히 원시섬유성 및 완전 응집된 합성 Aβ 조제물에 대해 낮은 친화도를 갖는 것을 (단량체성 Aβ에 대해 낮은 친화도를 갖는/친화도를 갖지 않는 것에 부가하여) 선택하였다.
세포 iN 검정에서 재조합 mAb의 기능적 효과
선택된 mAb의 재조합 버전을 높은 스톡 농도(2 mg/ml 초과)로 생산하고 세포 iN 검정에서 시험하였다. 각각의 mAb에 있어서, 뇌 추출물 AD10/27을 사용하여, 하나의 mAb 농도(웰 내 3 μg/ml)에서 첫 번째 시험을 수행하여 하이브리도마-정제 버전으로 이전에 관찰된 신경돌기 보호를 확인하였다(표 5, 수행 #6, 8 및 9). 생화학적 결합 프로필의 고유성(고전적인 합성 형태의 Aβ에 대해 가능한 한 낮은 친화도, 그러나 Aβ Ad 뇌 추출물에 대해 매우 유의미한 보호)에 기반하여, 가장 흥미로운 mAb에 있어서, 전체 농도 반응 곡선을 별개의 뇌 추출물 AD10/14를 사용하여 수행하였다. 또한 mAb의 신경보호 활성이 별개의 AD 추출물에서 관찰될 수 있음을 확립하는 것이 중요하였다. mAb를 0.75 μg/ml에서 최대 6 μg/ml 또는 12 μg/ml까지의 범위의 농도로 시험하였다. 일례로서, 양성 대조군 1C22 대비 mAb rB24 및 rB75의 전체 시간-경과 결과를 도 31, 상부 및 중간 패널에 각각 예시하며, 각각 rB24 및 rB75에 의한 AD 뇌 추출물 AD10/14에 의해 유도된 신경돌기 손실에 대한 농도-의존적 보호를 실증한다. 50% 신경돌기독성 보호 농도(EC50)는 양성 대조군 1C22에 대한 1,049 대비 각각 rB24 및 rB75에 대해 2,528 ng/ml 및 2,111 ng/ml로 결정되었다(도 31, 하부 패널). 비슷한 데이터가 도 32에서 쌍 rC11 및 rB24에 제공되고, 도 33에서 쌍 rB73 및 rB28에 제공된다.
항상 양성 대조군 1C22와 비교하여 다수의 실험을 2개 내지 3개의 mAb로 수행하였고, EC50 결과를 표 6에 요약한다. 선택된 재조합 mAb 모두는 1C22 활성의 2배 수준 이내였다.
[표 6]
iN 세포 검정(EC50 값은 ng/ml로 표현됨)에서 선택된 재조합 항체의 신경보호 활성.
Figure pct00015
실시예 6: 가용성 AD 뇌 추출물에 대한 보호를 실증하기 위한 장기 강화 전기생리 기능 검정
인간 AD 뇌로부터의 수성 추출물의 제조
인간 AD 뇌로부터의 수성 추출물의 제조를 기능적 세포 iN 검정에 대해 상술된 바와 같이 수행하였다. 샘플은 한 번만 해동한 후 사용하였다. AD 케이스 AD10/14로부터의 뇌 추출물을 장기 강화(LTP) 검정에서 사용하였다.
전기생리 기록 및 항체에 의한 보호 시험
해마 LTP 기록을 성체 마우스(2개월령 내지 3개월령, 두 성별 모두) 뇌 슬라이스(350 μm 두께)를 사용하여 이전 방법과 유사하게 수행하였다(Shankar et al. (2008) Nat. Med. 14(8):837-842; Li et al. (2011) J. Neurosci. 31(18):6627-6638; Li et al. (2018) Acta Neuropathol. Commun. 6(1):121). 기록을 해마 CA1 영역의 방사상층에 대해 수행하고, 자극 전극을 마이크로전극 어레이(MEA)를 사용하여 샤퍼(Schaffer) 곁가지 상에 배치하였다. MED64 기록 시스템(Alpha MED Scientific, Japan)을 세포외 필드 전위 기록을 위해 사용하였다. 150 μm의 극간 거리를 두고, 8 × 8 패턴으로 배열된, MED64 탐침(P515A) 내 64개의 평면형 마이크로전극 어레이가 존재하였다(Liu et al. (2011) Brain Res. 1382:57). 항체(C11, B24, B28, B73, 및 B75)를 5 μg/ml의 농도로 관류 인공 뇌척수액(ACSF)에 첨가하였다. AD 추출물을 시험하는 경우, 임의의 슬라이스 품질 문제를 방지하기 위해 대조군, AD 추출물 군 및 항체 + AD 추출 조건을 무작위 선택하였다. 각각의 마우스를 매일 기록을 위해 체크하여 모든 뇌 슬라이스가 항체 또는 AD 추출물에 잘 반응함을 확인하였다. 슬라이스가 시험 조건에서 작은 LTP를 나타내거나 LTP를 나타내지 않은 경우, 그 마우스로부터의 데이터는 사용하지 않을 것이다. 1) 항체 단독 조건의 경우, 항체를 적어도 30분 동안 기록하면서, 10 mL 관류 ACSF에 첨가하여 기준선이 안정하도록 보장하였고, 이어서 고주파 자극(HFS)을 가하였다. 자극 후, 추가로 60분 동안 계속 기록하였다. 2) 항체 + AD 추출물 실험의 경우, 항체 및 AD 추출물(AD10/14, 희석도 1/20) 둘 모두를 실온에서 해동한 후, 온화하게 볼텍싱하였다. 각각의 항체를 AD 추출물 분취물(0.5 ml)과 혼합하고 60분 동안 온화하게 진탕한 후 9.5 mL 관류 ACSF에 첨가하였다(총 부피를 10 mL로 만들었음).
데이터 분석 및 통계적 시험
샘플 및 처리를 코드화하고 맹검 방식으로 시험하였다. HFS-후 60분째에 EPSP 기울기 값을 뇌 절편 당 기준선에 대해 정량하고 각각의 항체에 대해 평균을 계산하였다(항체 당 뇌 슬라이스의 수/도면 주석 내의 조건). 군 간 차이를 본페로니 포스트-혹 시험 또는 스튜던트 t-시험으로 이원 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 시험하였다. #p<0.05, ## p< 0.01, 및 ### p< 0.001.
전기생리 검정에서 선택된 인간 재조합 mAb의 시험
기억 암호화(memory encryption)를 나타내는 것으로 여겨지는 모델인, 해마 장기 강화(LTP) 기록을 수행하여 뇌 절편에서 시냅스 가소성을 분석하였다. AD 가용성 뇌 추출물이 설치류 뇌 슬라이스에서 HFS에 의한 LTP의 유도를 강력히 억제하는 Aβ-의존적 활성을 함유한다는 것이 이전에 나타났다(Shankar, G.M. et al. 2008, Hong, W. et al., 2018). 첫 번째로, 기저 LTP 상에서 선택된 항체(C11, B24, B28, B73 및 B75)의 효과를 연구하였다. 항체를 ACSF 중 5 μg/ml 최종 농도의 농도로 관류 ACSF에 첨가하였다. 이러한 농도에서, C11, B24, B28 및 B75는 기저 전파 또는 HFS에 의한 LTP 유도에 영향을 미치지 않은 반면(도 34a, 도 34b), B73은 이를 유의미하게 감소시켰다. 3 μg/ml의 더 낮은 농도의 B73은 LTP 유도에 영향을 미치지 않았고, 이후 이를 사용하였다.
다음으로 상이한 항체들을 시험하여(3 μg/ml의 B73을 제외하고 5 μg/ml) 이들이 LTP의 유도에 대한 AD 뇌 추출물의 억제 효과를 방지할 수 있는지 여부를 분석하였다. 도 35a 및 도 35b에서 관찰할 수 있는 바와 같이, AD 뇌 추출물 AD10/14의 존재 하에서, HFS-후 1시간째의 EPSP의 강화는 ACSF 단독일 시의 150%와 비교했을 때 기준선의 120%에 지나지 않았으며(도 34), 이로써 AD 뇌 추출물의 억제 활성이 확인되었다. 상이한 항체와 AD 뇌 추출물의 사전-인큐베이션은 매우 유의미하게 더 높은 EPSP 강화 수준이 ACSF 단독 값으로 되돌아가게 했다(도 35a, 도 35b, p 값 0.05 미만). 가장 주목할 만한 것은, 5 μg/ml의 B75 및 3 μg/ml의 B73 둘 모두가, LTP에 대한 AD 뇌 추출물 억제 효과의 완전 구제를 야기하였다는 점이었다. 따라서, 본원에서 기재되는 항체는 인간 뉴런 배양에서 관찰된 이의 보호 효과에 부가하여, AD 뇌 추출물에 존재하는 LTP 억제 활성을 중화할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.
다음으로 최적 수행 항체, B73, B75 및 C11을 2 μg/ml의 더 낮은 농도에서 시험하고, 참조 항체 1C22와 비교하였다(도 36a 및 도 36b). 본 실험을 위해 새로운 배치의 B73을 사용하였다. 이러한 낮은 농도에서, 어느 항체도 기저 전파 또는 HFS에 의한 LTP 유도에 영향을 미치지 않음이 확인되었다(도 36a). 다음으로 항체를 LTP 유도에 대한 AD 뇌 추출물의 억제 효과의 방지에 대해 (2 μg/ml에서) 시험하였다. 이러한 농도에서, B73은 LTP에 대한 AD 뇌 추출물 효과의 거의 완전한 방지를 보유하였다(도 36b, p 값 0.05 미만), 이는 3 μg/ml로 수득된 이전 데이터와 일맥상통하였다. C11도 족히 50% 넘게 AD 뇌 추출물 효과를 유의미하게 방지하였으며(p 값 0.01 미만), 둘 모두 참조 항체 1C22에 비해 우수하였다. B75는 이러한 더 낮은 농도에서 유의미하게 효과적이지 않았다. 이들 데이터는 상기 논의된 전기생리 결과를 확인시켜주고 부연한다.
실시예 7: 항체가 AD 뇌로부터의 Aβ를 포획할 수 있지만 AD 뇌 절편에서 아밀로이드 침적물에 결합하지 않음
인간 AD 뇌 추출물의 비드-기반 면역침전을 사용하는 B24, B28, B73, B75 및 C11 mAb 상의 생화학적 데이터: B75 및 C11이 AD 뇌로부터 Aβ x-42 펩티드를 면역침전시킴
B24, B28, B73, B75 및 C11 mAb를 시험하기 위해, 인간 뇌 추출물로부터의 면역침전을 통상적인 자기 비드 방법을 사용하여 수행하였다(도 39a). 1% SDS에 이어 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드(GnCl)를 사용하는 순차적 용출을 Aβ x-42 ELISA에 의해 측정하였다. 음성 대조군(인간 IgG) 및 양성 대조군(1C22)에 비해, B28 및 B73은 이의 광범위한 Aβ 결합 특성과 일관되게, 시험된 4개의 뇌 모두로부터의 Aβ 1 내지 42-함유 종을 유의미하게 면역침전시킬 수 있었다. 다소 더 적은 정도기는 하지만, B75 및 C11도 4개 중 2개의 뇌로부터의 Aβ 1 내지 42-함유 종을 유의미하게 면역침전시킬 수 있었던 반면, B24는 시험된 모든 뇌로부터의 Aβ 1 내지 42-함유 종을 면역침전시키지 못했다(도 39b). 이들 데이터는 B75 및 C11이 AD 뇌에서 Aβ 1 내지 42-함유 물질에 결합하지만, 상술된 바와 같이 상이한 합성 Aβ 조제물에는 결합하지 않음을 확립시켜준다.
인간 AD 뇌 추출물의 칼럼 면역흡착을 사용하는 생화학적 데이터: C11 및 B28이 인간 AD 뇌에서 Aβ-함유 종에 결합함
대안적 방법을 설계하여 B24, B75 및 C11을 재시험하였고, 이는 통상적인 자기 비드 방법에 의해 Aβ-함유 종에 대한 중등도 친화도를 나타내었다. 대신에 단백질-A 스핀 칼럼(도 40a)을 사용하여, 약한 항체-항원 회합을 손상시킬 절차, 예컨대 회전 또는 장동을 제거하였다. 이러한 대안적 방법을 통해, C11은 2개의 인간 뇌 추출물로부터의 B28(양성 대조군)과 같이 많은 Aβ 1 내지 42-함유 종을 포획하는 것으로 나타난 반면(도 40b), B75는 활성이 더 낮아서, 상이한 항체 특성이 대안적 기법에 의해 드러날 수 있음을 강조하였다.
또한, 이러한 스핀 칼럼과 함께, 항원-항체 상호작용을 탈안정화하는 한편 비드 면역침전 실시예에서 수행된 SDS 또는 구아니딘 세척에 비해 항원 구조에 대한 보다 온건한 영향을 갖는 것으로 여기지는 산-세척을 사용하여 용출을 수행하였다. 이에 따라, 면역포획된 물질의 잠재적 구조를 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 평가하였다(도 41의 a). B28 및 C11에 의해 정제된 음성-염색된 물질은 TEM에 의해 다형태성인 것으로 결정되었다(도 41의 b). B28-정제 물질은 상이한 크기를 갖는 주로 구형인 구조를 보유하였다. C11 정제된 물질은 보다 다양한 형태를 보유하였다.
면역조직학: C11은 광학 현미경 면역조직학에 의해 평가된 바와 같이 인간 AD 뇌에서 Aβ-침적물에 결합하지 않았음
면역조직화학 기법을 사용하여, 고정되거나 신선-냉동된 인간 AD 뇌 절편에 대한 상이한 항체의 결합 패턴을 비교하였다. 처음에, 5개의 mAb 모두를 표준 파라핀-포매, PFA-고정 AD 뇌 절편 상에서 면역조직화학에 의해 평가하였다. B28만 임의의 염색을, 즉 전형적인 AD 아밀로이드반 및 뇌 아밀로이드 혈관병증을 생성하는 것으로 결정되었다(도 42의 a). B24, B28, B73, B75 및 C11 mAb를 AD 뇌에서 보다 천연 입체형태일 수 있는 Aβ 어셈블리를 나타내는, 비-고정 뇌 냉동-절편 상에서 면역조직화학에 의해 추가로 시험하였다. 1C22(양성 대조군)에 비해, B28, B73 및 B75는 아밀로이드반을 강력히 염색하였고, B24는 중등도로 염색하였으며, C11은 염색하지 못했다(도 42의 b).
물질 및 방법
인간 뇌 추출물의 면역침전(비드) 및 면역흡착(칼럼)
비드: 800 μl TBS 뇌 추출물을 10 μg mAb 및 단백질-A 자기 비드와 혼합하고, 12시간 동안 4℃에서 회전시켰다. 이어서 자기 비드를 PBS로 3회, 각각 4℃에서 30분 세척하였다. 세척된 자기 비드를 PBS 중 1% SDS에 이어 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 의해 순차적으로 용출하였다.
칼럼: 800 μl TBS 뇌 추출물을 10 μg mAb와 혼합하고, 12시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 혼합물을 사전-습윤 단백질-A 칼럼에 첨가하고 1분 동안 1,000 g에서 스핀시켰다. 플로우-쓰루를 동일한 칼럼에 첨가하고 1분 동안 1,000 g에서 스핀시켰다. 칼럼을 PBS로 3회 세척하고 1분 동안 1,000 g에서 스핀시켰다. 0.1 M 글리신-HCl(pH 2.3)을 칼럼에 첨가하고 5분 동안 인큐베이션한 후, 1분 동안 1,000 g에서 스핀시켰다.
Aβ x-42 ELISA
Aβ 1 내지 42에 대한 MSD ELISA를 당분야에-알려진 방법(Liu et al., 2019)에 따라 수행하였다. 코팅되지 않은 96-웰 멀티-어레이 플레이트(Meso Scale Discovery, #L15XA-3)의 각각의 웰을 3 μg/mL의 266 포획 항체(Elan)를 함유하는 30 mL의 PBS 용액으로 코팅하고, 하룻밤 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 266 에피토프는 Aβ 서열의 영역 13 내지 25에 있다. 검출 항체 용액을 세척 완충액 중에 희석된 Aβ 1 내지 42의 C-말단 잔기에 대한 바이오틴화된 모노클로날 항체(21F12), 100 ng/mL 스트렙타비딘 설포-TAG(Meso Scale Discovery, #R32AD-5), 및 1% BSA로 제조하였다. 하룻밤 동안의 인큐베이션 후, 50 μL/웰의 샘플, 이어서 25 μL/웰의 검출 항체 용액을 300 rpm 초과로 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션 사이에 웰을 세척 완충액으로 세척하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 플레이트를 판독하고 분석하였다.
음성 염색된 샘플의 투과 EM 분석
TEM 시편 제조를 위해, 5 μL의 샘플 용액(면역흡착된 물질의 글리신 용출액(상기 참고))을 글로우-방출, 포름바(formvar)/탄소 코팅된 그리드 상에 배치하였다. 샘플을 실온에서 20초 동안 그리드 상에서 인큐베이션하였다. 과량의 용매를 여과지(Whatman)로 흡수시켜 제거하였다. 그리드를 10 μL 물로 3회 세척하고 10 μL의 수중 1%(w/v) 우라닐 아세테이트로 3회 염색하였다. 건조된 그리드를 80 kV에서 작동하는 AMT 2k CCD 카메라가 구비된 JEM-1200EX TEM(JEOL)에서 검사하였다.
면역조직화학
파라핀-포매, PFA-고정 뇌 절편: 재수화된 파라핀 절편을 0.2% Triton X-100을 함유하는 PBS 중 0.3% H2O2로 처리하였다. 절편을 하룻밤 동안 4℃에서 일차 항체와 인큐베이션하고, 이어서 1시간 동안 바이오틴화된 이차 항체와 인큐베이션하였다. 가시화를 위해, 절편을 아비딘-바이오틴 복합체(Vector), 및 그 이후 니켈 암모늄 설페이트 함유 3,3'-디아미노벤지딘으로 처리하였다.
비-고정 뇌 냉동-절편: 신선 또는 해동된 뇌 조직을 O.C.T. 화합물(Sakura) 용액 내로 포매한 후 각각 12시간 동안 -80℃ 및 -20℃에서 인큐베이션하였다. 냉동 블록을 크라이오스탯(Leica)을 사용하여 20 내지 30 μm 간격으로 절편화하였다. 절편을 면역조직화학을 위해 부착 현미경 글래스 슬라이드(Matsunami) 상에 직접 실장하였다. 이어서 절편을 0.2% Triton X-100을 함유하는 PBS 중 0.3% H2O2로 처리하였다. 절편을 하룻밤 동안 4℃에서 일차 항체와 인큐베이션하고, 이어서 1시간 동안 바이오틴화된 이차 항체와 인큐베이션하였다. 가시화를 위해, 절편을 아비딘-바이오틴 복합체(Vector), 및 그 이후 니켈 암모늄 설페이트 함유 3,3'-디아미노벤지딘으로 처리하였다. 현미경 사진을 DMi8 광시야 현미경(Leica)으로 촬영하였다.
SEQUENCE LISTING <110> JIN, MING PRADIER, LAURENT RECZEK, DAVID SELKOE, DENNIS TRAVALINE, TARA WALSH, DOMINIC <120> NEUTRALIZING ANTI-AMYLOID BETA ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE <130> 706560: SA9-259PC <140> PCT/US2020/042161 <141> 2020-07-15 <150> 62/874,724 <151> 2019-07-16 <160> 146 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Asn Leu Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 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Claims (30)

  1. 가용성 아밀로이드 베타(Aβ)에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 폴리펩티드로서, 결합 폴리펩티드가 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 서열 및 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 서열을 포함하며,
    3개의 HCDR 서열이 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 50, 51, 52, 44, 45, 46, 26, 27, 28, 62, 63, 및 64로 구성되는 군으로부터 선택되고,
    3개의 LCDR 서열이 SEQ ID NO: 17, 18, 19, 47, 48, 49, 41, 42, 43, 23, 24, 25, 59, 60 및 61로 구성되는 군으로부터 선택되는, 결합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간인, 항체.
  4. 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 IgG1인, 인간 항체.
  5. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 2 및 1; SEQ ID NO: 10 및 9; SEQ ID NO: 4 및 3; SEQ ID NO: 12 및 11; 및 SEQ ID NO: 16 및 15로 구성되는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(HCVR) / 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열 쌍을 포함하는 결합 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 3개의 HCDR 서열이 SEQ ID NO: 20, 21 및 22를 포함하며, 3개의 LCDR 서열이 SEQ ID NO: 17, 18 및 19를 포함하는, 결합 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 3개의 HCDR 서열이 SEQ ID NO: 44, 45 및 46을 포함하며, 3개의 LCDR 서열이 SEQ ID NO: 41, 42 및 43을 포함하는, 결합 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 3개의 HCDR 서열이 SEQ ID NO: 26, 27 및 28을 포함하며, 3개의 LCDR 서열이 SEQ ID NO: 23, 24 및 25를 포함하는, 결합 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 3개의 HCDR 서열이 SEQ ID NO: 50, 51 및 52를 포함하며, 3개의 LCDR 서열이 SEQ ID NO: 47, 48 및 49를 포함하는, 결합 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, 3개의 HCDR 서열이 SEQ ID NO: 62, 63 및 64를 포함하며, 3개의 LCDR 서열이 SEQ ID NO: 59, 60 및 61을 포함하는, 결합 폴리펩티드.
  11. 제5항에 있어서, HCVR / LCVR 서열 쌍이 SEQ ID NO: 2 및 1인, 결합 폴리펩티드.
  12. 제5항에 있어서, HCVR / LCVR 서열 쌍이 SEQ ID NO: 10 및 9인, 결합 폴리펩티드.
  13. 제5항에 있어서, HCVR / LCVR 서열 쌍이 SEQ ID NO: 4 및 3인, 결합 폴리펩티드.
  14. 제5항에 있어서, HCVR / LCVR 서열 쌍이 SEQ ID NO: 12 및 11인, 결합 폴리펩티드.
  15. 제5항에 있어서, HCVR / LCVR 서열 쌍이 SEQ ID NO: 16 및 15인, 결합 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 Aβ가 시냅스독성인, 결합 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 폴리펩티드가 Aβ 시냅스독성을 중화하는, 결합 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 Aβ가 약 20 kD 내지 약 100 kD의 분자량을 갖는, 결합 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 폴리펩티드가 단량체성 Aβ, 원시섬유성 Aβ 또는 원섬유성 Aβ에 특이적으로 결합하지 않는, 결합 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 폴리펩티드가 단백질 응집물에 특이적으로 결합하지 않는, 결합 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 폴리펩티드가 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌에 존재하는 아밀로이드반에 특이적으로 결합하지 않는, 결합 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 폴리펩티드가 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ에 특이적으로 결합하는, 결합 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 결합이 면역흡착인, 결합 폴리펩티드.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 가용성 Aβ가 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌로부터 수득되는 하나 이상의 가용성 분획에 존재하는, 결합 폴리펩티드.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 폴리펩티드가 알츠하이머병을 갖는 대상체로부터 유래되는 뇌의 가용성 Aβ의 시냅스독성을 중화하는, 결합 폴리펩티드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 결합 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  27. 대상체에 유효량의 제26항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 알츠하이머병을 치료하는 방법.
  28. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 결합 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  29. 제28항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  30. 제28항의 폴리뉴클레오티드 또는 제29항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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