KR20220034646A - 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법 및 이러한 방법으로 제조된 세포외소포체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 열민감성 하이드로겔과 이온 용액 및 세포를 포함하는 액적을 이온가교형 하이드로겔에 디스펜싱하여 in-situ로 코어-쉘 구조체를 형성하여, 구조체 내부에서 세포 응집체를 제조하는 방법 및 이러한 방법으로 제조되는 세포 응집체에 관한 것으로, 반복 재현성이 우수하여 품질 관리 및 신속한 대량 생산이 가능한 장점이 존재한다.
Description
본 발명은 열민감성 하이드로겔과 이온 용액 및 세포를 포함하는 액적을 이온가교형 하이드로겔에 디스펜싱하여 in-situ로 코어-쉘 구조체를 형성하여, 구조체 내부에서 세포 응집체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
인간 및 동물 신체를 구성하는 대부분의 세포 구조물은 3차원 형태로 조직된다. 이러한 세포의 3차원 구조는, 2차원 단층 세포 배양물이 모방하기 곤란한 복잡한 세포들 사이의 상호작용을 초래한다.
세포는 3차원 환경에서 배양될 때 더 자연적으로 거동하게 되지만, 3차원 세포 배양물의 형성은 대부분 어렵고, 비용이 많이 드는 문제점이 존재한다. 기존의 시험관내 세포 배양은 전형적인 2차원 세포 배양 모델만을 제공할 수 있을 뿐이다.
세포 응집체(cellular spheroid)는, 전형적인 3차원 세포 배양 모델의 한 예이며, 기초 연구 및 임상 약리학에 적용되고 있다. 이러한 세포 응집체는 약 수백 마이크로미터의 직경을 갖는 응집된 세포 클러스터를 의미한다.
기존의 세포 응집체의 형성 방법으로, 현적(hanging drop) 방법 또는 회전식 교반과 같은 동적 배양 방법이 존재하지만, 이러한 방법에 따른 세포 응집체의 배양은 약 4일 정도까지의 시간이 소요될 수 있고, 성공률 역시 약 50% 정도에 머무르고 있으며, 세포 배양액을 교환하기 어려워 교환 과정에서 세포 손실이 발생하는 문제점이 존재한다.
기존의 세포 응집체를 제조하는 여러 방법으로, 세포 응집체를 제조 할 수 있는 스캐폴드 디시(dish)를 사용하거나, 시험관 내에서 세포를 응집시킬 수 있으며, 현적(hanging drop) 방법으로도 세포 응집체를 제조할 수 있다. 또한, 기존의 다른 세포 응집체의 제조 방법으로, 세포가 부착될 수 없는 마이크로웰에 세포를 주입한 후, 주입된 세포들의 응집을 유도함으로써 세포 응집체를 제조하는 방법이 존재한다.
그러나, 이러한 방법의 경우에는, 마이크로웰을 제작하기 위해서 포토리소그래피(Photolithography)와 소프트리소그래피(Soft-lithography)를 동반하는 복잡하고 긴 미세 가공 공정이 요구된다.
이러한 마이크로웰을 사용한 세포 응집체의 제조 방법 역시, 세포 응집체 크기의 조절이 어려우며, 제조된 세포 응집체를 회수 혹은 수확하는 과정이 곤란한 문제점이 여전히 존재한다.
앞서 살펴본 종래 기술의 문제점들을 효과적으로 해결하기 위해 본 발명은, 이온 용액에 용해된 열민감성 하이드로겔 및 세포를 포함하는 제1 조성물을 제2 하이드로겔로 토출시키고, 상기 제2 하이드로겔 내에서 토출된 제1 조성물의 외주면을 따라 제2하이드로겔이 상기 이온 용액과 반응하여 가교된 하이드로겔 막(shell)을 형성한 후, 상기 가교된 하이드로겔 막의 내부에서 세포들이 침전되어 응집되도록 함으로써, 세포 응집체를 연속적으로 제조하는 방법과 이러한 방법으로 제조되는 세포 응집체를 제공한다. 또한, 이러한 연속적으로 제조되어 회수된 세포 응집체로부터 엑소좀(세포외소포체)을 얻는 방법을 추가로 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 세포 응집체를 제조하는 방법은, 이온 용액에 용해된 열민감성 하이드로겔 및 세포를 포함하는 제1 조성물을 준비하는 단계; 상기 제1 조성물을 제2 하이드로겔로 토출시키는 디스펜싱 단계; 상기 제2 하이드로겔 내에서 토출된 제1 조성물의 외주면을 따라 제2하이드로겔이 상기 이온 용액과 반응하여 가교된 하이드로겔 막(shell)을 형성하는 단계; 및 상기 가교된 하이드로겔 막의 내부에서 세포들이 침전되어 응집되는 세포 응집체 형성 단계;를 포함한다.
상기 열민감성 하이드로겔은, 젤라틴, Pluronic F127 또는 Poly(N-isoprolylacrylamide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 제2 하이드로겔은, 알지네이트 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 상기 이온 용액은, 칼슘 및 칼륨으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 세포 응집체 형성 단계는, 가교된 하이드로겔 막(shell) 내의 열민감성 하이드로겔의 상(phase)이 변화되도록 온도가 변화될 수 있으며, 상기 디스펜싱 단계에서, 토출되는 제1 조성물의 크기는, 토출 조건의 변화를 통해 제어되는 것이 바람직한데, 상기 토출 조건은, 토출 시간 혹은 토출 부피일 수 있다.
상기 세포 응집체 형성 단계 이후, 가교된 하이드로겔 막(shell)을 분해시켜, 세포 응집체를 회수하는 회수 단계;가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태로, 이러한 방법으로 제조된 세포 응집체를 들 수 있으며, 이러한 세포 응집체로부터 엑소좀을 수득하는 방법도 포함될 수 있다.
이렇게 세포 응집체로부터 엑소좀을 수득하는 방법을 좀 더 자세히 설명하면, 이온 용액에 용해된 열민감성 하이드로겔 및 세포를 포함하는 제1 조성물을 준비하는 단계; 제2 하이드로겔 내로 상기 제1 조성물을 드랍 형태로 토출시키는 디스펜싱 단계; 상기 제2 하이드로겔 내로 토출된 제1 조성물 드랍의 외주면을 따라 제2하이드로겔이 상기 이온 용액과 반응하여 가교된 하이드로겔 막(shell)을 형성하여, 중공(hollow) 구조체를 형성하는 단계; 상기 중공 구조체 내부의 열민감성 하이드로겔을 겔상(gel phase)에서 액상(liquid phase)로 변화되도록 온도를 변화시키는 단계; 중공 구조체 내부가 액상으로 변화되어, 상기 세포들이 침전되고, 침전된 세포들이 응집되는 세포 응집체 형성 단계; 및 상기 세포 응집체로부터 엑소좀을 수득하는 단계;를 포함한다.
상기 열민감성 하이드로겔은, 젤라틴, Pluronic F127 또는 Poly(N-isoprolylacrylamide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상을 포함할 수 있고, 상기 제2 하이드로겔은, 알지네이트 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 이온 용액은, 칼슘 및 칼륨으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 이온을 포함할 수 있으며, 상기 디스펜싱 단계에서, 토출되는 제1 조성물의 크기는, 토출 조건의 변화를 통해 제어되는 것이 바람직하다. 상기 토출 조건은, 토출 시간 혹은 토출 부피일 수 있다.
상기 세포 응집체 형성 단계와 엑소좀을 수득하는 단계 사이에, 중공(hollow) 구조체로부터 세포 응집체를 회수하는 회수 단계;를 더 포함하할 수 있는데, 상기 회수 단계는, 효소, 열, 전기장 및 자기장 중에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시 형태로 이러한 방법으로 제조된 세포외소포체를 들 수 있다.
본 발명에 따른 세포 응집체의 제조 방법은, 기존의 작업자별 변동성이 높고, 노동 집약적이며, 시간이 오래 걸리는 문제점과 품질 관리의 어려움으로 인해 대량 생산이 곤란한 세포 응집체의 제조 방법에 비해, 반복 재현성이 우수하여 품질 관리 및 신속한 대량 생산이 가능한 장점이 존재한다.
또한, 가교된 하이드로겔 막(shell) 내의 빈 공간에서 세포들이 응집됨으로써, 토출되는 조성물의 양을 조절함으로써, 얻어지는 세포 응집체의 크기를 제어할 수 있을 뿐만 아니라, 세포의 오염을 효과적으로 방지할 수 있으며, 손상이 없는 안정적인 세포 응집체를 수득할 수 있는 효과가 존재한다.
본 발명에 따른 세포 응집체의 제조 방법을 통해 높은 수율로 균일하고 안정적인 세포 응집체를 대량으로 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 세포 응집체로부터 엑소좀을 효과적을 수득할 수 있는 정점이 존재한다.,
아울러 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포 응집체는, 신약 개발을 위한 약물 검사 칩, 조직 재생을 위한 각종 인공 조직 모사체 제작 등 다양한 바이오 산업에 활용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 응집체를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따은 제조 과정 중에서 토출 부피에 따른 가교된 하이드로겔 막(shell)이 형성된 중공(hollow) 구조체 형태의 비드의 크기 변화를 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조 방법으로 실제 세포 응집체를 얻는 과정을 차례로 관찰한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따은 제조 과정 중에서 토출 부피에 따른 가교된 하이드로겔 막(shell)이 형성된 중공(hollow) 구조체 형태의 비드의 크기 변화를 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제조 방법으로 실제 세포 응집체를 얻는 과정을 차례로 관찰한 결과이다.
본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서의 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다. 또한, 본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 세포 응집체를 제조하는 방법은, 이온 용액에 용해된 열민감성 하이드로겔 및 세포를 포함하는 제1 조성물을 준비하는 단계; 상기 제1 조성물을 제2 하이드로겔로 토출시키는 디스펜싱 단계; 상기 제2 하이드로겔 내에서 토출된 제1 조성물의 외주면을 따라 제2하이드로겔이 상기 이온 용액과 반응하여 가교된 하이드로겔 막(shell)을 형성하는 단계; 및 상기 가교된 하이드로겔 막의 내부에서 세포들이 침전되어 응집되는 세포 응집체 형성 단계;를 포함한다(도 1 참조).
상기 이온 용액은 열민감성 하이드로겔이 쉽게 녹을 수 있으며, 제2 하이드로겔을 가교시킬 수 있는 이온 용액이라면 특별히 제한되지 않으며, 칼슘 및 칼륨으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 바람직하고, 염화칼슘 수용액이 사용될 수 있다.
상기 제1 조성물은, 열민감성 하이드로겔이 용해된 이온 용액에 살아있는 세포가 균일하게 혼합된 것으로, 약 103 ~ 108의 살아있는 세포가 포함될 수 있으며, 이온 용액에 포함되는 이온 농도는 약 10~700 mM의 범위로 포함될 수 있는데, 이온 농도가 너무 낮을 경우에는 후속 공정에서 형성되는 하이드로겔 막이 형성되지 않을 수 있으며, 너무 높을 경우에는 형성되는 쉘의 두께가 너무 두꺼워져 내부에세포 응집체가 형성될 공간이 부족해지거나, 쉘 두께가 불균일하게 형성되는 문제점이 발생할 수 있다.
열민감성 하이드로겔은 이온 용액의 100 중량부를 기준으로 약 1 ~ 10 중량부의 범위로 용해될 수 있으며, 상기 조성 범위를 벗어날 경우, 후속 단계인 디스펜싱 단계에서 토출이 곤란하거나, 토출된 형상이 균일하지 않을 수 있다.
디스펜싱 단계에서는, 이러한 조성 성분과 조성 범위를 갖는 제1 조성물이 피펫, 디스펜서 혹은 3D 프린터를 통해 제2 하이드로겔이 저장된 저장조로 토출된다. 이러한 디스펜싱 단계는 제1 조성물이 일정한 양으로 균일하게 토출되는 것이 바람직한데, 이는 후속 단계에서 형성되는 세포 응집체의 균일성 및 이러한 세포 응집체로부터 생산되는 엑소좀의 생성 속도에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
이렇게 제2 하이드로겔이 저장된 저장조로 토출된 제1 조성물이 제2 하이드로겔과 접촉할 경우, 제1 조성물 내에 포함된 이온 용액과 제2 하이드로겔이 in-situ로 반응하여 가교됨으로써, 토출된 제1 조성물의 외주부에 하이드로겔 막(shell)이 형성된다.
상기 토출된 제1 조성물의 외주면을 따라 형성되는 하이드로겔 막은, 제2 하이드로겔이 이온 용액에 의해 순간적인 가교 반응이 수행됨으로써 형성되므로, 내부는 살아있는 세포와 열민감성 하이드로겔 및 하이드로겔 막(shell)의 형성에 참여하지 못한 이온 용액이 존재하는 중공조(hollow structure)가 형성된다.
이러한 열민감성 하이드로겔은 젤라틴, Pluronic F127 또는 Poly(N-isoprolylacrylamide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상이 사용될 수 있고, 상기 제2 하이드로겔로는, 알지네이트 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 사용될 수 있다.
이러한 열민감성 하이드로겔은 후술되는 세포 응집체 형성 단계에서, 온도 변화를 통해 상(phase)이 변화될 수 있으며, 예를 들어, 제2 하이드로겔이 저장된 저장조의 온도를 약 30도 이상으로 승온시킴으로써, in-situ로 형성된 중공구 형태로 형성된 하이드로겔 막(shell)의 내부에 존재하는 열민감성 하이드로겔의 겔 상(gel phase)을 액상(liquid phase)으로 변화시킬 수 있다.
상기 열민감성 하이드로겔은, 젤라틴, Pluronic F127 또는 Poly(N-isoprolylacrylamide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 제2 하이드로겔은, 알지네이트 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 상기 이온 용액은, 칼슘 및 칼륨으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
이렇게 하이드로겔 중공 막(shell)의 내부에 존재하는 열민감성 하이드로겔의 상을 변화시킴으로써, 하이드로겔 중공 막(shell)의 내부에 열민감성 하이드로겔과 함께 존재하는 세포들이 중력에 의해 자연스헙게 하이드로겔 중공 막(shell)의 내부 아래쪽으로 침강한다.
이렇게 침강된 세포들이 상기 세포 응집체 형성 단계를 거치게 되는데, 가교된 하이드로겔 막(shell) 내의 열민감성 하이드로겔의 상(phase)이 변화되도록 온도를 변화시킴으로써, 하이드로겔 중공 막(shell)의 내부에서 세포의 침전에 따른 세포들이 서로 자연스럽게 세포 응집체를 형성하게 된다.
따라서 상기 디스펜싱 단계에서, 토출되는 제1 조성물의 크기는, 토출 조건의 변화를 통해 제어되는 것이 바람직하며, 토출 시간 혹은 토출 부피 등을 통해서, 세포 응집체를 형성하는 공간인 하이드로겔 중공 막(shell)의 크기가 결정되기 때문이다.
이렇게 세포 응집체가 하이드로겔 중공 막(shell) 내에서 형성되면, 가교된 하이드로겔 막(shell)을 분해시켜, 세포 응집체를 회수하는 회수 단계;가 더 수행될 수 있다. 이러한 가교된 하이드로겔 막(shell)을 분해시키는 과정은 기존의 공지된 다양한 방법을 통해서 수행될 수 있는데, 예를 들어 효소를 사용한 분해, 열, 전기장, 자기장 등 세포 응집체에 영향을 주지 방법을 적절히 혼합하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태로, 이러한 과정 들을 거쳐 제조된 3차원 세포 응집체를 들 수 있는데, 본 발명에 따른 3차원 세포 응집체는 기존의 2차원 배양을 통해 얻어진 세포 응집체에 비해 실제 세포 응집체와 가장 유사한 특징을 가지며, 별도의 외부 자극 혹은 조건을 가하지 아니하더라도 다량의 엑소좀을 보다 수월하게 수득할 수 있는 장점이 존재한다.
따라서 본 발명의 또 다른 실시 형태는 이러한 세포 응집체의 제조 방법으로 얻어진 세포 응집체로부터 엑소좀을 수득하는 방법 및 이러한 방식으로 얻어진 엑소좀을 포함한다.
이하에서는, 본 발명의 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 구체적인 작용과 효과를 설명하고자 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로서 제시된 것으로, 실시예에 따라 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1: 제1혼합물의 제조]
세포 배양을 통해 6 x 105의 세포 (ex. MIN-6 cell)를 준비하고 1 ml의 culture media에 세포를 서스펜션 시킴으로써, 배양액 내에 세포가 균일하게 분포되도록 하였다.
젤라틴 파우더(cold water fish, or porcine skin)를 증류수에 녹여 10wt%의 젤라틴 용액 1ml를 준비한 후, CaCl2 (Calcium chloride, Molecular Weight: 111.0, Sigma Aldrich)를 500mM의 농도가 되도록 상기 젤라틴 용액에 추가로 혼합하여, 5wt% 젤라틴 및 세포를 포함하는 바이오잉크(제1 혼합물)를 제조하였다.
[제조예 2]
5% Alginate 용액을 준비하여 상부가 개방된 용기에 채운 후, 용기를 용적 계량식 정밀 디스펜서 아래에 위치시키고, 제조예 1에서 준비된 바이오잉크(제1 혼합물)를 용적 계량식 정밀 디스펜서용 시린지에 옮겨 담은 후, 시린지 및 용적 계량식 정밀 디스펜서 내부의 잔여 버블을 제거하였다.
내경 200 ㎛노즐의 디스펜서에서 미리 설정된 토출 부피 (100nl ~ 700nl의 범위) 및 토출 시간 (shot 당 1초) 조건으로 토출한다. 이때 디스펜서와 연동된 x-y-z 스테이지의 구동제어를 통해 토출된 바이오잉크(제1 혼합물) 토출물이 서로 서로 겹치지 않고 일정 간격을 유지할 수 있도록 위치 조절을 수행하였다.
이렇게 토출된 바이오 잉크 내에 포함된 칼슘 이온이 용기를 채운 알지네이트 용액이 접촉함에 따라 in-situ로 이온 경화되며, 제1혼합물인 바이오 잉크는 중공(hollow) 형태의 비드를 형성하게 된다.
이때 토출되는 바이오 잉크의 부피를 변화시켜 가면서 생성되는 중공(hollow) 형태의 비드의 크기를 확인하였으며, 그 결과를 다음의 표 1과 도 2로 정리하였다.
| 바이오 잉크 토출 부피 [nl] | 100 | 200 | 700 |
| 토출 시간 [sec] | 1 | ||
| 노즐 크기 [㎛] | 200 | ||
| 중공 형태의 비드 지름 [mm] |
1 | 1.4 | 2 |
| 도 3 | (a) | (b) | (c) |
상기 표 1 및 도 2의 결과에서 확인되듯이, 바이오 잉크(제1 혼합물)의 토출 부피를 제어함으로써, in-situ로 생성되는 중공 형태의 비드 지름이 효과적으로 조절되는 것을 알 수 있었다.
이러한 토출 과정은 상온에서 수행되었으며, 필요에 따라 디스펜서 시린지의 외주면을 따라 온도 조절 기능을 갖는 펠티어 냉각 시스템을 추가하는 것도 가능하다.
[제조예 3]
제조예 1 및 2와 동일한 방법으로 바이오 잉크 200nl를 토출하였으며, 중공 형태의 비드 내에서 세포의 응집 과정을 관찰하기 위해 형광 염색을 수행하였다.
Cell tracking dye는, non-fluorescent dye이지만 살아있는 세포 안으로 들어가면 형광을 발광하는 hydrophobic한 물질로, 살아있는 세포에 쉽게 투과가 가능하고 세포 분열 후에도 형광 물질이 남아 있어 증식중인 세포에서도 확인이 가능한 장점이 있다.
본 제조예예서는 cell tracking dye kit를 이용하여 MIN-6 세포를 형광 염색함. 5 x 106개의 live한 cell을 준비하고, 1x PBS로 washing 후 tracking dye green working solution을 넣어주고, 약 37℃에서 약 30분간 반응시켰다. HHBS로 3번 washing 후 centrifuge를 이용하여 세포를 펠렛 상태로 만든 후, 1ml DMEM을 추가하여 cell suspension을 만들었으며, 이후 하이드로겔과 혼합하여 제조예 1 및 제조예 2의 과정을 동일하게 거친 후, 490/525 nm의 파장에서 형광 염색된 세포를 확인하였고, 그 결과를 도 3에 과정별도 도시하였다.
도 3의 결과에서 확인되듯이, 용적 계량식 정밀 디스펜서를 사용하여 바이오 잉크를 토출함으로써, 알지네이트 용액 내에 중공(hollow) 구조체 형태의 비드를 형성하였으며, 중공(hollow) 구조체 형태의 비드 내에 살아있는 세포들의 세포 응집체를 확인할 수 있었다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
10: 노즐
100: 열민감성 하이드로겔
200: 이온 300: 세포
350: 제1 조성물 400: 제2 하이드로겔
500: 하이드로겔 막 600: 침전된 세포들
700: 세포 응집체
200: 이온 300: 세포
350: 제1 조성물 400: 제2 하이드로겔
500: 하이드로겔 막 600: 침전된 세포들
700: 세포 응집체
Claims (9)
- 이온 용액에 용해된 열민감성 하이드로겔 및 세포를 포함하는 제1 조성물을 준비하는 단계;
제2 하이드로겔 내로 상기 제1 조성물을 드랍 형태로 토출시키는 디스펜싱 단계;
상기 제2 하이드로겔 내로 토출된 제1 조성물 드랍의 외주면을 따라 제2하이드로겔이 상기 이온 용액과 반응하여 가교된 하이드로겔 막(shell)을 형성하여, 중공(hollow) 구조체를 형성하는 단계;
상기 중공 구조체 내부의 열민감성 하이드로겔을 겔상(gel phase)에서 액상(liquid phase)로 변화되도록 온도를 변화시키는 단계;
중공 구조체 내부가 액상으로 변화되어, 상기 세포들이 침전되고, 침전된 세포들이 응집되는 세포 응집체 형성 단계; 및
상기 세포 응집체로부터 엑소좀을 수득하는 단계;를 포함하는, 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
열민감성 하이드로겔은, 젤라틴, Pluronic F127 또는 Poly(N-isoprolylacrylamide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 하이드로겔은, 알지네이트 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 이온 용액은, 칼슘 및 칼륨으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 이온을 포함하는, 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 디스펜싱 단계에서, 토출되는 제1 조성물의 크기는, 토출 조건의 변화를 통해 제어되는, 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 토출 조건은, 토출 시간 혹은 토출 부피인 것을 특징으로 하는, 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 세포 응집체 형성 단계와 엑소좀을 수득하는 단계 사이에, 중공(hollow) 구조체로부터 세포 응집체를 회수하는 회수 단계;를 더 포함하는, 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 회수 단계는, 효소, 열, 전기장 및 자기장 중에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 세포응집체를 사용하여 세포외소포체를 제조하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 얻어진 세포외소포체.
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